JPS5917354A - アフイニテイ−クロマトグラフイ−用吸着体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生体免疫機能に起因する各種疾患と密接な関
係をもつと考えられている免疫グロブリン、自己抗体、
免疫複合体の分離、精製用吸着体に関する。

血清中に発現する自己抗体および／または免疫複合体は
、慢性関節リウマチ、全身性エリトマト−デス、重症筋
無力症等の自己免疫疾患あるいは悪性腫瘍の原因あるい
は進行と密接な関係を持っていると考えられている。

これらの免疫疾患に関係した自己抗体および／または免
疫複合体を単離、精製し、得られた標品を用いて免疫疾
患と悪性物質の関連を握把することは、大きな意義をも
つと考えられる。

従来、このような目的に供し得る分離材としてｉｆ、Ｄ
ＥＡＥ−セルロース、ＣＭ−セルロース等ノイオン交換
１（ｊｌ　、セフ了デツクス、セファロース等のゲル濾
過用の支持体、高液液体クロマトグラフィー用の硬質微
粒子支持体、および蛋白質との特異的親和力を利用した
アフイニテイクロマトグラフイー用の吸着体等がある。

しかしながら、イオン交換樹脂は蛋白質の電気的相互作
用を利用したものであシ、ゲル濾過用の支持体および高
速液体クロマトグラフィー用の支持体は、蛋白質分子の
大きさの差に依存したものであり、血液中の種々の電気
的相互作用や分子の大きさの類似した成分中から目的と
する自己抗体および／または免疫複合体を分離、精製す
ることは非常に困難である。

抗原と抗体またはホルモンと受容体の間に存在するよう
な特異的親和力を利用した了フイニテイクロマトグラフ
イー用の吸着体は、目的蛋白質と吸着体間の特異性の萬
さ、アフィニティーの強さの点から、自己抗体や免疫複
合体のような生体中の微量成分を比較的簡単に、短時間
で高純度で分離、精製することができる。慢性関節リウ
マチのりウマチ因子分１ｍ精製用のヒト変性ＩｇＧを１
Ｊガントとして固定した変性ＩｇＧ−了ガロースがその
例である。

しかしながら、これらのアフィニティークロマトグラフ
ィー用吸着体は、リガンドとして目的物質に対する抗原
（抗体）、すなわち蛋白質を用いるため、長期安定性に
欠け、固定化する１」ガントの確保が困難な場合もある
。また、リガンドとして分離、精製する物質に応じた抗
原（抗体）を選択しなければならない、さらには目的物
質と吸着体とのアフィニティーが非常に強いために、溶
離、脱着が困難となり、目的物質の変性が起きる場合も
ある。

本発明の目的は、上記の如き従来技術に基づく自己抗体
、免疫複合体の分離、精製用の吸着体の問題点に鑑み、
簡単な操作で、短時間に高純度で分離、精製でき、安定
に使用可能な了フイニディークロマトグラフイー用吸着
体を提供せんとするものである。

本発明者らは、上記目的に沿って鋭意研死した結果、各
種の化合物を不溶性担体に結合し、自己抗体および免疫
複合体に対する結合活性を評価したところ、実に驚くべ
きことには、不溶性担体に結合した疎水性化合物が、極
めて特異的に自己抗体および免疫複合体と強いアフィニ
ティーを有することを見い出し、さらに、比較的生理的
な条件で溶離、脱着が可能であることを確認し、本発明
を完成するに至った。

すなわち、本発明は、不溶性担体に疎水性化合物を含有
する有機低分子化合物が結合されていることを特徴とす
る自己抗体および／または免疫複合体分離、精製用の吸
着体に関する。

本発明で対象とする物質は、自己抗体および／または免
疫複合体であるが、より詳細に説明すると、リウマチ因
子、抗核抗体、抗ＤＮＡ抗体、抗リンパ球抗体、抗赤血
球抗体、抗血小板抗体、抗アセチルコリンレセプター抗
体、血清脱髄抗体、抗サイログロブリン抗体、抗マイク
ロシーム抗体、抗太膓抗体等の自己抗体、免疫グロブ１
７７間または免疫グロブリンと他の物質、特に抗原およ
び抗原様物質との複合体等である。これらの中でも特に
本発明の対象とする物質として好ましいものは、自己免
疫疾患の原因および進行と深い係わシをもつ自己抗体お
よび免疫複合体である。

本発明に用いる疎水性化合物とは、対生理食塩水溶解度
１００ミリモル／ｄｉ以下（２５℃）、より好−ましく
は３０ミリモル／ｄ７！以下の化合物をいう。対生理食
塩水溶解度が１００　ミリモル／ｄｌＶより大きい化合
物は、親水性が高くなりすぎ、グロブリン系化合物に対
する親和力φｉ低下する結果、自己抗体や免疫複合体に
対する親和力が極端に低下する。また、より親水的なア
ルブミンに対する親和力が生じるようになり好ましくな
い。

疎水性化合物の中では、少なくとも１つの芳香族環を有
する化合物が、特に好ましい結果を与える。芳香族環と
は、芳香族性を持った環状化合物を意味し、いずれも有
用に用い得るか、ベンゼン、ナフタレン、フェナントレ
ン等のベンゼン系芳香族環、ピリジン、キノリン、アク
リジン、イソキノリン、フェナントレン等の含窒素６員
堀、インドール、カルバソール、イソインドール、イン
ドリジン、ポルフィリン、２＋３＋２．３−ピロロピロ
ール等の含窒素５員環、ピリダジン、ピリミジン、ｓｙ
ｍ−）リアジン、ｓｙｍ−テトラジン、キナゾリン、１
，５−ナフチリジン、プテリジン、フェナジン等の多価
含窒素６員堀、ピラゾール、イミナゾール、１，２．４
−　）り了ゾール、１，２．３−）リアゾ−ル、テトラ
ゾール、ペンズイミナゾール、イミダゾール、プリン等
の多価含窒素５員環、ノルハルマン域、ペリミジン環、
ベンゾフラン、イソベンゾフラン、ジベンドフラン等の
含酸素芳香族場、ペンドチオフェン、チェノチオフェン
、チェピン等の含イオウ芳香族環、オキサゾール、イン
オキサゾール、　１．２．５−オキサダイア−ゾル、ベ
ンズオキサゾール等の含酸素複累芳香場、チアゾール、
インチ了ゾール、　１．３，４−チアダイアゾール、ペ
ンジチアゾール等の含イオウ複素芳香堀などの芳香族環
およびその誘導体を少なくとも１つ有する疎水性化合物
が好ましい結果を与える。中でもトリプタミン等のイン
ドール環を含む化合物は、特に好ましい結果を与える。

また、本発明者らは、さらに鋭意研究の結果、疎水性ア
ミノ酸およびその誘導体が極めて高率かつ特異的に自己
抗体および／または免疫複合体を吸着することを見い出
した。

疎水性アミノ酸およびその誘導体とは、’ｌ’ａｎｆｏ
ｒｄ、Ｎｏｚａｋｉ　（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、　５ｏｃ
−、１８４４２４０（１９６２）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｍ、２４６　２２１１（１９７１））（タンフォード
、ノザキ（ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・
ソサエティ、１８４．４２４０（１９６２）、ジャーナ
ルーオプ・バイオロジカル・ケミストリイ２４６，２２
１１（１９７１））により定義された疎水性尺度でみて
、ｌ　５　Ｑ　Ｑ　ｃａｌ　／ｍｏ１以上のアミノ酸お
よびその誘導体で、対生理食塩水溶解度１ｏ。

ミ’Ｊモル／ｄ７！以下の化合物を意味する。例えば、
リシン、バリン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニ
ン、インロイシン、トリプトファンおよびその誘導体等
である。これらの疎水性アミノ酸およびその誘導体の中
では、トリプトファン、フェニルアラニンおよびその誘
導体が特に良好な結果を与える。また、アミノ酸はｔ、
ｄの立体配座を特に限定することなく使用することがで
きる。

本発明で用いられる不溶性担体は、親水性担体、疎水性
担体いずれも使用できるが、疎水性担体を用いる場合に
は、時に担体へのアルブミンの非特異的吸着が生じるた
め、親水性担体の万が好ましい結果を与える。

不溶性担体の形状は、粒子状、繊維状、中空糸状、膜状
等いずれの公知の形状も用いうるが、疎水性化合物の保
持量、クロマトグラフィー用吸着体としての取扱い性よ
りみて、粒子状、のものが好ましい。

粒子状担体としては、平均粒径２５００μ以下の範囲に
あることが好ましい。平均粒径はＪＩＳ　−Ｚ−８８０
１に規定されるフルイを用いて流水中で分級した後、各
級の上限粒径と下限粒径の中間値を各級の粒径とし、そ
の重量平均として平均粒径を算出する。また、粒子形状
は球形が好ましいが、特に限定されるものではない。平
均粒径が２５００μ以上では、自己抗体および／または
免疫複合体の吸着量および吸着速度が低下する。使いう
る粒子状担体としては、アガロース系、デキストラン系
、セルロース系、ポリアクリルアミド系、ガラス系、活
性炭系の担体であるが、ゲル構造を有する親水性担体が
良好な結果を与える。また、通常固定化酵素、アフイニ
テイクロマトグラフイに用いられる公知の担体は、特別
な限定なく使用することができる。

粒子状担体としては、多孔性粒子、特に多孔性重合体を
用いることもできる。本発明で用いられる多孔性重合体
粒子は、その表面に疎水性化合物を同定化しうるもので
あり、平均孔系３００Ｘないし９ｏｏｏＡの範囲にある
ものである。重合体組成ハ、ポリ了ミド系、ポリエステ
ル系、ポ１１ウレタン系、ビニル化合物の重合体等、多
孔性構造をとすうる公知の重合体を用いることができる
が、特に親水性モノマーにより親水化したビニル化合物
系多孔性重合体粒子が好普しい結果を与える９、該多孔
性構造は、平均孔径ａｏｏＸないし９０００又の範囲に
あるのが好ましいが、平均孔径が小さすぎる場合には、
吸着される自己抗体および／または免疫複合体の童が少
なく、大きすぎる場合には、重合体粒子の強度が低下し
、かつ表面積が減少するため実用的ではない。

平均孔径の態別は水銀圧入式ポロシメーターによった。

この方法は、多孔性物質に水銀を圧入してゆき、投入し
た水銀禁から気孔倉を、圧入に四する圧力から孔径を求
める方法であり、４ｏＸ以上の孔を測定することができ
る。本発明の孔とは、孔径が４０重以上の表面からの連
通孔と定義する。

平均孔径は、孔径をｒ、ポロシメーターで測定した累積
気孔量をＶとしたとき、ｄＶ／ｄｌｏｇｒＯ値が最大と
なるときの「の値とする。

疎水性化合物を不溶性担体の表面に固定する方法ｄ゛、
共有結合、イオン結合、物理吸着、包埋あるいは重合体
表面への沈澱不溶化等あらゆる公知の方法を用いること
ができる。通常固定化酵素、了フイニティクロマトグラ
フイで用いられる公知の不溶性担体の活性化方法および
有機低分子化合物との共有結合力法を用いることができ
る。また、必要に応じて不溶性担体と有機低分子化合物
の間に任意の長さの分子（スペーサー）を導入して使用
することもできる。例えば、アガロースのヒドロキシル
基とへギサメチレンジイソシアナートの片側のインシア
ナート基を反応、結合させ、残ったイソシアナート基と
疎水性化合物の了ミノ基、ヒドロキシル基、スルフヒド
リル基、カルボキシできる。スペーサー長さとしては、
スペーサーのないものから、その中に含まれる原子数で
２０までが特に好ましい結果を与える。

本発明で不溶性担体に結合している疎水性化合物の量は
、不溶性担体１１１Ｉ７！当、ｐ　Ｏ，Ｉ　Ｉｌｌない
し３０■の範囲である。よ如好ましくは０．５■々いし
１５〜の組曲である。保持量が０．１■／ｄを下まわる
と自己抗体および／または免疫複合体の吸着量が極度に
低下するし、３０■／−を上まわると吸着特異性が低下
し好ましくない。

本発明の吸着体を自己抗体および／または免疫複合体の
分離、精製に用いる場合の方法としては、生理食塩水で
平衡化した吸着体に、自己抗体および／または免疫複合
体を含む血漿または血清を添加して充分な吸着を行わせ
しめ、吸着成分を溶離しない溶液、例えば塩析効果の高
い硫酸アンモニウム塩（０，３Ｍ）等で非吸着成分を洗
浄した後、吸着成分を溶離する溶液、例えば低濃度の硫
酸アンモニウム塩溶液（０，００５Ｍ）もしくは塩化ナ
トリウム塩溶液（０，ＯＩＭ）等を使用して溶出操作を
行い、目的物質を得る。

以上述べたように、本発明の吸着体は、自己抗体および
／また祉免疫複合体の分離、精製を簡単な操作で、短時
間に高純度で得られるメリットをもっている。

以下実施例により、本発明の吸着体を利用した自己抗体
および／また紘免疫複合体の分離、精製について詳述す
る。

実施例１ 酢酸ビニル１００２、トリアリルインシアヌレ−）６４
．３ｆ（Ｘ＝０．４０　）、酢酸エチル１００２、ヘプ
タン１００　Ｆ、ポリ酢酸ビニル（重合度５００）７．
５９および２，２−７ゾビスイソブチロニトリル３，８
ｆよりなる均一混合液と、ポリビニルアルコール１重量
係、リン酸二水素ナトリウム二水和物０．０５重を係お
よびリン酸水累二ナトＩＪウムー二水和物１．５重量％
を溶解した水４０〇−とをフラスコに入れ、十分攪拌し
たのち６５℃で１８時間、さらに７５℃で５時間加熱撹
拌して懸濁重合を行ない、粒状共重合体を得た。濾過水
洗、ついでアセトン抽出後、カセイソーダ４６．５？お
よびメタノール２ｔよシカる溶液中で４０℃で１８時間
、共重合体のエステル交換反応を行なった。

得られたゲルの平均粒径は１５０μｍ、単位重量アタシ
のビニルアルコール単位（ｑα−Ｉ）は９．Ｑ　ｍｅｃ
４／ｙ、比表面積は６０　ｔｒ？／ｌ、デキストランに
よる排除限界分子量は６　Ｘ　１０’であった。

次に、得られたゲル１０ｔ（乾燥重量）をジメチルスル
ホキシド１２〇−中に懸濁し、これにエピクロルヒドリ
ン７８．３ｒｄ、３０％水酸化ナトリウム１０−を加え
、３０℃で５時間攪拌しながら活性化反応を行なった。

反応後ジメチルスルホキシドで洗浄し、水洗し、吸引脱
水した。次にこの活性化ゲルをトリプトファン１．６３
Ｐｋ含ｔｒＯ，１Ｍ炭酸ナトリウムバッファー（Ｐ）１
９．８）１６０−中に懸濁した。５０℃で１４時間、攪
拌しながら固定化反応を行ない、その後６０．６■／ｍ
ｅのトリス（ヒドロキシエチル）アミノメタン溶液３３
−を加え、さらに５０℃５時間、攪拌しながらプロ・ツ
キング反応（残存活性基をブロックする）を行った。こ
の後、充分水洗して自己抗体および／または免疫接合体
分離、精製用吸着体を得た。この吸着体に固定されたト
１ｊプトフ了ンの量は４００４ｍｏｌ／　ｆ　（乾燥重
賞）（８ｙｖ／＊）であった。

該吸着体５献をクロマトグラフィー用カラムに充填し、
生理食塩水で平衡化した後、２０ｍのヒト慢性関節リウ
マチ患者血漿（ＲＡＨＡ　Ｔｉｔｅｒ　６４０、免疫複
合体１２．０μＶ／−）を吸着させた。吸着操作は、定
流艶ポンプを用いて血漿をカラム内滞留時間１５分で２
時間潅流させた。

非吸着成分の洗浄ｉｉ０．３　Ｍ　’ａｍアンモニウム
塩浴液で溶出液中の紫外吸収（２８０ｎｍ）が観察され
なくなるまで行った。この洗浄過程で、血漿中の了ルプ
ミン、免疫グロブリンの大部分は溶出した。

リウマチ因子および免疫複合体の溶出操作は、硫酸アン
モニウム濃度をグラジェント溶離によシ低くしでやるこ
とにより、０．００３Ｍで溶離した。

これらの溶出画分には、リウマチ因−子ｌ込ＨＡ　Ｔｉ
ｔｅｒ６４０、免疫複合体１８．０μｆ／ｒａｔのもの
が得られた。

慢性関節リウマチの悪性物ｒ・債であるリウマチ因子（
自己抗体−）、免疫複合体の測定は、受身感作血球凝集
テスト（Ｗｄａｌｅｒ　−ＩＬｏｓｅ法Ｉ（ＡＦ−ＩＡ
富士臓器製薬■）およびＣＩＱ−固相法ＥＩＡにより行
った。

実施例２ ｋＭ水性アミノ酸として、フェニル了うニンヲ実施例１
で使用したビニルアルコール系ゲルに結合せしめた吸着
体を使用したこと、およびヒト重症筋無力症患者の血漿
（抗アセチルコリンレセプター抗体濃度１５．５　μｍ
ｏｌ／ｇ７Ｂ　）を用いｉこと以外は、実施例１と同様
にしてクロマトグラフィーの操作を行った。

非吸着成分の洗ＰＩｋを０．３　Ｍ　＊　酸アンモニウ
ムで充分に行った。溶出操作は溶離液を０．００５Ｍ値
酸ア７モニウム溶液に交換することによって、重症筋無
力症の悪性物質である抗アセチルコリンレセプター抗体
（３２，０μ１ｎｏ１／ｄ　）　カｉＪ　出ｔ、　タ。

ξの溶出画分をシングルラジアルイムノディフュージョ
ン（ａｌｔＩＤ）にて免疫グロブリンクラス別および了
ルプミンの検出を行ったところ、免疫グロブリンは検出
限界以下（０，３■／ｍ／　）、了ルプミンについては
検出されなかった。

抗アセチルコリンレセプター抗体の定量ハ１２５　Ｉ標
識α−プンガロトキシンを結合させたアセチルコリンレ
セプターに対して結合する抗アセチルコリンレセプター
抗体を抗ヒトＩｇＧ法によるイムノプリシビテイション
了ツセイ法で行った。

手続補正書 昭和５７年８月６１日 特許庁長官　若杉和夫　殿 １　事件の表示 特願昭５７−１２６８２１号 ２　発明の名称 自己抗体および／または免疫複合体分離、’Ｍｍ用ｏｖ
Ｎ体　　　　（今回の補正にょシ名称変更）３　補正を
する考 事件との関係・特許出願人 （００３）旭化成工業株式会社 ４代理人 東京都港区虎ノ門−丁目２番２９号虎ノ門産業ビル５階
６　補正の内容 明細書の記載を次のとおり補正する。

ｉｌｌ、発明の名称を 「自己抗体および／または免疫複合体分離、精製用の吸
着体」と補正する、 （２１、第２頁９行の 「単離」ヲ「分離」と補正する。

（３１、第２頁１０行の 「握把する」會「把握する」と補正する。

（４１，第８頁１５行と１６行の間に下記の記載を挿入
する。

［本発明に用いる疎水性化合物を含有する有機低分子化
合物とは、有機低分子化合物の一部も【〜くけ全てが疎
水性化合物から成っている物質を示すもので、分子量は
１万以下、好ましくは１０００以下のものをいう。例え
ば、本発明に使用可能な疎水性化合物を含有する有機低
分子化合物は、疎水性化合物の共重合、または疎水性化
合物と他の化合物との共重合によって得らｌｈルｅ　ツ
４　リ、）リブトファン、フェニルアラニンなどの疎水
性アミノ酸と親水性アミノ酸もしくはペプチドとの縮重
合物、トリプトファン、−フェニルアラニンなど疎水性
アミノ酸どうしの縮重合物がその例である。また、疎水
性アミノ酸単独でも該有機低分子化合物に包含される、
」（５）、第９頁２〜３行、第１０頁４行、第１１頁７
行、第１１頁１９行、第１２頁５〜６行の「疎水性化合
物」を「疎水性化合物を含有する有機低分子化合物」と
補正する、 （６１、第１１頁１２〜１′５行、第１１頁１４行の「
有機低分子化合物」を［疎水性化合物を含有する有機低
分子化合物」と補正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、不溶性担体に疎水性化合物を含有する有機低分子化
   合物が結合されていることを特徴とする自己抗体および
   ／または免疫複合体分離、Ｍｊ１１！用の吸着体。 ２、疎水性化合物が少なくとも一つの芳香族環を含む化
   合物である特許請求の範囲第１項記載の吸着体。 ３、疎水性化合物が疎水性アミノＭまたはその誘導体で
   ある特許請求の範囲第１項記載の吸着体。 ４、疎水性アミノ酸またはその誘導体がトリプトファン
   またけフェニルアラニンまたはそれらの誘導体である特
   許請求の範囲第３項記載の吸着体。