【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
−本発明は新規多糖類さらに詳しくは、エンテロ７バク
ター属（Ｒｔｎｔｓｒｏｂａｃｔｅｒ）に属する細菌か
ら産生される新規な多−Ｓｔ類に関する。
本発明者らは微生物による多糖類の生呟について研究を
璽ねた結果、エンテロバクタ−属に属する細−が極めて
水溶性であり、塩の存在下においにも粘−が低下しな゛
いという興味のある多糖類を産生ずることを見出し、本
発明ど完成した。
本発明の多糖類は、たとえば次のような方法で製造する
ことができ、る。
ニジテロバクター属に属し、該多糖類を生産する能力を
有する細菌を栄養培地に培養し、そのろ液から、生成し
た多糖類を常法に従って沈澱、精製して製造することが
で舎る。
本発明におい薔用いることのできる微生物さしては、エ
ンテロバクタ−・ニチデニス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃ ’
ｔａｒ ｎ１ｏｈｉｄａｎｉｓ） （微工研菌受理番号
５９２８号）が、典型的な例として挙’４７られる。上
記°の、微工研菌受理番号は工業技術院微生物工業技術
研究所の受理′一番号を表わす。
ホーの菌学的法質・は以下のとおりである。
ｆ形態的性質 ′
形態 ：・単桿麹 胞、子を形成しない運動性； あ
り
大き″さ；１．θ〜１．５ Ｘ １．５〜２．ＯＰダラ
ム染色： 陰性
抗酸性 〜： ＃に性
鞭毛 ： 周毛
２各培地における生育状態
（１）肉汁液体培養 白濁する- The present invention relates to novel polysaccharides, and more particularly to novel poly-Sts produced from bacteria belonging to the genus Enterobacter. The present inventors conducted research on the production of polysaccharides by microorganisms and found that bacteria belonging to the genus Enterobacter are extremely water-soluble and do not lose their viscosity even in the presence of salt. The present invention has been completed based on the discovery that polysaccharides of interest can be produced. The polysaccharide of the present invention can be produced, for example, by the following method. Bacteria belonging to the genus Nidterobacter and capable of producing the polysaccharide can be cultured in a nutrient medium, and the resulting polysaccharide can be produced from the filtrate by precipitation and purification according to conventional methods. Among the microorganisms that can be used in the present invention, Enterobacter
tar n1 ohidanis) (Feikoken Bacteria Accession No. 5928) is cited as a typical example. The Microbiological Research Institute's reception number in the above column represents the reception number of the Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology. Ho's mycological properties are as follows. f Morphological properties ′ Morphology: Single rod koji, motile without forming spores or spores; Size: 1.θ~1.5 x 1.5~2.OP Durham staining: Negative acid-fast ~: # Sexual flagella: Pericyria 2 Growth status in each medium (1) Meat juice liquid culture becomes cloudy
【２】リドマ
スミルク 赤変する（３）肉汁寒天培地
平滑、円形、白色（４）グルコース肉汁寒天培地
平滑、円形、白色（５）ゼラチン穿刺培養 液
化せず３生理学的性質
（１）最適生育温度 ３７″Ｃ
（２）生育ＰＨ５〜１０ 最適生育ｐＨ７〜８（３）酸
°素要求性 通性−嫌気的
（４）インドール生成 陰性
（５）硫化水素生成 陰性
（６）硝酸塩の還元 陽性
（７）脱窒反応 陽性
（８）メチルレッド試験 陰性
（９） Ｖ −Ｐ 反応 陽性（１０）で
んぷんの分解 陰性（ｌｌ）カタラーゼ
陽性（１２）オキシダーゼ 陰性（
１３）クエン酸の利用 陽性（１４）無機窒素
源の利用 （Ｎ〜入５ｏ４１．ＮａＮ０．・を利用する
（１５）リレアーゼ 陽性（１６）Ｏ−Ｆ
テスト 醗酵的
（１７）色素の生成 キングＡ培地で色素生成せずキン
グＢ培地で蛍光色素生成せず
（１８）炭素化合物の利用 マンノース（＋）、ラムノ
ース（＋）、ソルビット（＋）、フラクトース（＋）、
マルトース（ト）、ラフィノース（＋） 、グリセリン
（′＋） 、、キシロース（＋）、でんぷん（＋）、ガ
ラクト、−ス（＋）、アラとノース（＋）、グルコース
（＋） ！、リボース（＋）、ショ糖（ト）・、乳糖（
＋） 、マンニット←）、マロツ酸←）（＋ｊ生ｆする
。
酸・ガス発生する、−：生育せず）
（１９）フェニルアラニン脱アミノ反応 陰性（２０
）Ｋ ＣＮ存在下の生育 陰性本菌株はダ
ラム陰性桿菌０発酵的、カタラー、ゼ陽性、オキシダ、
−ゼ陰性、硝酸塩の還元陽性よ的エンテロバクテリ、ア
シー科（Ｉｎ’ｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｅｅａｅ）に
属する。
さらにメチルレッド陰性、ｖ−ｐ反応陽性、フェニルア
ラニン脱アミノ反応陰性、硝酸塩の還元陽性、ウレアー
ゼ陽性、最適生育温度３７″ｃ、 ＫＣＮ存在下の生育
陰性、である特徴を有する。これらの特徴をすべて満足
する族はないがＫＣＮ存在下の生育を除き、ｈａクレブ
シラエ（Ｋｌｅｂｓｉｓｌｌｅａｅ）に合致する。来園
が族■に包含されるものとして検索を行なうと、来園と
もっとも近い性質を有する属は、運動性あり、ソルビッ
ト利用陽性、赤色色素の生成陰性などの性質からエンテ
ロバクタ−属と考えられる。
以上述べた通り、来園はエンテロバクタ−属の既知権お
よびその他の既知権とも重要な細菌学的性質において異
なる。よって来園はエンテロバクタ−楓の新株として認
めることか妥当であり、ニチデニス（Ｎｔｃｈｉｄｅｎ
ｉｓ）という種形容名を与える。
来園を培養する場合、栄養培地の炭素源としては一般に
用いられている物質（たとえばグルコース、シ冒糖、で
ん粉分解物など）を約２０〜１００ｇ／１％窒素源とし
ては、酵母エキス、ペプトン、ディスティチーズソルブ
ル。硫酸アンモニウム、硝酸ナト１１ウムなどを窒素源
として約１〜１０ｇ／！、さらに、無機塩類としてリン
酸塩源約０．３〜２ｇ／へマグネシウム源約０．１〜２
ｇ／へカリウム源約０．３〜２ｇ／４カルシウム源約０
．０５〜１０ｇ／／、硫酸塩源約０．１〜２ｇ／ｌ
を処方する。これらの無機塩類の例としてはＫＨ，ＰＯ
４Ｉ、 −ＨＰＯ４ｒ 、 Ｍｇ５Ｑｐ、 ＣａＣＯ３
などが挙げられる。これら・成分を水道水１こ加えてな
る培地に上記微生物を接種し、常法により好気的に！ｌ
嗅培養する。
培査終了後、蓄積された多糖類は使用目的により権々の
方法で採取することができる。例えば、培誉液をラタ過
あるいは遠心分離などして菌体を分離し、その５戸液か
らインプロパノールのようなアルコール添加により生成
した多糖類を沈澱させ、これを水に溶、解後、第４級ア
ンモニウム塩による再沈澱、イオン某換樹脂による吸着
のような方法で精製して目的とする多＃Ｉｔ類を得る。
エンテロバクテリアシー科に属するい゛くっかの細菌が
多糖類を産生ずることが知られてぶり、渡辺敏幸・瀬口
正晴等（昭和４５年日本農芸化学会大会要旨集（１９７
０） ２８１頁）は、エシェリヒア（Ｐｔｓｈｓｒｉｃ
ｈｉａ）がグル：ｌ−７，：マンノース：ラムノース＝
５：３：２（モル比）からなる多糖類を産生ずることを
報告している。また三崎旭等（生化学。
３９巻（１９６７年）５４２頁）はアエロバクタ−（Ａ
ｅｒｏｂａｃｔｏｒ）がガラクトース：グルクロンｔｍ
：マンノース＝ ２．５ ： ０．８ ： １ （モル
比）からなる多糖類を産生ずることを報告している。
本発明の多糖類は構成糖、化学的物理的性質において、
これら公知の多糖類と異なりっきの特徴をｎする。
（１）ｍ 酸糖ｉｔ ’Ｉシルコース。ンノース、グル
クロン酸およびマンヌロン酸でその組成比０モル比）は
グルコース：マンノース：グルクロン酸：マンヌロン酸
＝ １ ： ０．７〜１．０ ： ０．５〜０．７ ：
０．１〜０．３である。
（２）アセチル化度的０−；、、１．０でアセチル化さ
れており、加水分解物のエーテル抽出物をガスクロマト
グラフィーに付して仔機酸の分析を行うと酢酸か検出さ
れる。
（３）、ゲルが適法による分子量測定でｌ〆〜ｔｏ７の
分子−をホす。
（４）モーリレシュ反応、フェノール硫酸反応、アンス
ロン硫酸反応の各呈色反応において陽性を示す。
（５）メタノール、エタノール、アセトーン、エーテル
などの有機溶媒には不溶、水にはロエｊ、ｔｇ（この水
溶液は無色透明である）である。
（６）皮膜法により赤外吸収スペクトルを測定すると、
添付の＠１図に示すごとき赤外吸収スペクトルを示す。
（７） ５４ｓ ｗ／ｖ水溶液の３０でｌζおける帖麿
はＢＭ型粘度計＊ ３０ ｒ−ｐ、ｍ にて測定した
場合、１０”〜１〆ａｐである。
（８）１０ ％ ｗ／ｖ 塩化ナトリウム、又は１０４
ｗ／ｖ塩４化カルシウム水溶液の存在下において、粘度
は低下しない。粘度計セよび測定条件は（７）のものと
同じである。
本発明の多糖類は食品および工業用途の各種分野におい
て、増結剤、賦型剤、ゲル化剤、エマルジョン安定剤、
捺染用糊剤、サイジング用糊剤。
凝集剤などとして広く利用することができる。
つぎに実施例を挙げて、本発明をさらに詳°シ＜説明す
る。
実施例１
培地１１当りシｔｘ糖５０ｇ、＃母エキス５ ｇ 。
Ｋ、ＨＰＯｙ ０．５ ｇ 、 ＫＨ，ＰＱ、ｐ Ｏ，
５ｇ 、 Ｍｇ５Ｑ、−７Ｈ，Ｑ Ｏ，３ｇ。
ＣａＣも、１ ｇを含む液体培地（ＰＨ７，０オートク
レブ中、１２０℃２０分′間滅ｆｌｉ ） １００ ｍ
／を入れた５００ ｍｌ坂ロフラスコにエンテロバタタ
一二チデニス（微工研菌受理番号第５９２８号）を１白
金耳接種し、軌・道シェーカー上、 ２００ ｒ、ｐ、
ｍ、でｌ！！％し、３７℃テ９６時間培養した。培養終
了後、培養液を遠心分離して菌体を除去しくれにインプ
ロパノ、−ルを加えて沈でんを生じさせた。沈澱を炉取
し、１０５℃で２４時間乾燥して、多糖８ ｇ／／を得
た。
上記多ｌｊ類を、９０％ギ酸にて１００″ｃ１６時間加
水分解し、さらに２Ｎ）リフルオロ酢酸にて１００℃′
５時間加水分解して得た糖をペーパクロ槃トゲラフ −
およびガスクロマトグラフィ−に付したとイ
ころ、そのＲｆ値および保持時間から、構成糖は、ゲル
コース：マンノース：グルクロン酸：マンヌロン酸＝１
： ０．７３ ： ０．６５ ： ０．．１３であっ
た。またアセチル化腿は０、ゲルザ適法による分子皺は
ｌ♂であった。
実施例２
培地１１当杓シａ［５０ｇ、ポリペプトン２Ｓ。
Ｋ工ＨＰＯゲ ０．５ ｇ 、 ＫＨ２Ｆ０，０
．５ ｇ 、 Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈよｏ ｏＱ
ｇ。
ＣａＣｏ３１ ｇを含む液体培地（ｐＨ７，０オートク
レーブ中、１２０″ｃ、２０分間滅菌）３／を入れた５
１容ジヤーフアーメンクーにエンテロバクターニチデニ
ス（微工研受理番号５９２８号）を無菌的に播種し、温
度３７’Ｃ，回転数６００ｒ、ｐ、’ｍ、 、通気輸Ｉ
ＶＶＭ ノ通気撹拌条件下で９６時間好気培養を行っ
た。培養中、培地のｐＨをｌ Ｎ ＮａＯＨの添加によ
′って７．０に保持した。
培養後、実施例１と同様にして多糖２０ｇ／／を得た。
上記多糖類を実施例１と同様にして加水分解して得た糖
をペーパークロマトグラフ −ｉよびガイ
スクロマトグラフイーに付したところ、その構成糖はグ
、ルコース：マンノース：グルクロン酸：マンヌロン＠
＝ １． ： ０．９４ ： ０．５３ ： ０．２
７でアセチル化度はｏ、ｓ６、分子轍は１０りであった
。
特許出願人 日鍛化半株式会社
昭和５６年１２月２８日
１ 事件の表示
事件との関係 特許出願人
４ 補正命令の８附
自発゛
（１）明細書第２頁６〜７行目「エンテロバクタ−・ニ
チデニス（Ｂｎｔｅｒｏｂａａｔｅｒ ｎ１ｃｈｉｄｓ
ｎｉｓ ） Ｊとあるを「エンテロバクタ−・ニチデニ
イ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｎ１ｃｈｉｄｅｎｉｉ
） Ｊと補正する（添付の菌株名豐更届に示すように
曲名を変更しました）。
（２）同書第５頁１５〜１６行目「ニチデニス（Ｎ１ｃ
ｈｉｄｅｎｉｓ ） Ｊとあるを［ニチデニイ（Ｎ１ｃ
ｈｉｄｅｎｉｉ ） Ｊと補正する。
（３）同４Ｉ第９頁１８行目および＠１０頁２０行〜第
１１頁１行目「二↑デニス」とあるを「ニチデニイ」と
補正する。
７、添付蓄類の目録
（１）菌株名変更届 写 １通
昭和ｔ７年／月ｊρ日
隻
１ 事件の表示 。
事件との関係 ７特許Ｊｔ１ｍ人
４ 補正命令の８附
昭和５７年１月５日
明細書第１１頁１３行目の次に、「４、図面の簡単な説
明」という項目を設け、「第１図は本発明の多糖類の赤
外線吸収スペクトルである、 」と記載する。[2] Lidomus milk turns red (3) Meat juice agar medium
Smooth, round, white (4) Glucose broth agar medium Smooth, round, white (5) Gelatin puncture culture No liquefaction 3 Physiological properties (1) Optimal growth temperature 37″C (2) Growth pH 5-10 Optimum growth pH 7- 8 (3) Oxygen requirement Facultative-anaerobic (4) Indole production Negative (5) Hydrogen sulfide production Negative (6) Nitrate reduction Positive (7) Denitrification reaction Positive (8) Methyl red test Negative (9 ) V-P reaction Positive (10) Decomposition of starch Negative (ll) Catalase
Positive (12) Oxidase Negative (
13) Utilization of citric acid Positive (14) Utilization of inorganic nitrogen source (Using N ~ 5o41.NaN0.. (15) Release Positive (16) O-F
Test Fermentative (17) Pigment production No pigment produced in King A medium, no fluorescent pigment produced in King B medium (18) Utilization of carbon compounds Mannose (+), rhamnose (+), sorbitol (+), fructose ( +),
Maltose (T), raffinose (+), glycerin ('+), xylose (+), starch (+), galacto, -su (+), ara and north (+), glucose (+)! , ribose (+), sucrose (g), lactose (
+), mannitol ←), malotsic acid ←) (+j grows. Acid/gas generated, -: No growth) (19) Phenylalanine deamination reaction Negative (20
) K Growth in the presence of CN Negative This strain has 0 fermentative bacteria, Katara, Zeta positive, Oxida,
-se negative, nitrate reduction positive enterobacteria, belonging to the family Interobacteriaeeae. Furthermore, it has the following characteristics: methyl red negative, v-p reaction positive, phenylalanine deamination reaction negative, nitrate reduction positive, urease positive, optimal growth temperature 37''c, and growth negative in the presence of KCN.All of these characteristics. There is no satisfying family, but except for growth in the presence of KCN, it matches the ha Klebsislleae.If you search for Arashi as being included in group ■, the genus with the properties closest to Arashi is: It is thought to belong to the genus Enterobacter based on its properties such as being motile, positive for sorbitol use, and negative for red pigment production.As mentioned above, visiting the zoo is important for bacteriological research, as well as for the known rights of the genus Enterobacter and other known rights. Therefore, it is appropriate to recognize the plant as a new strain of Enterobacter maple.
is). When culturing Oriental orchards, approximately 20 to 100 g of commonly used substances (e.g., glucose, lactose, starch decomposition products, etc.) are used as carbon sources in the nutrient medium; yeast extract, peptone are used as nitrogen sources. , Desti Cheese Soluble. Approximately 1-10g/! using ammonium sulfate, 11um sodium nitrate, etc. as a nitrogen source! , furthermore, as inorganic salts, about 0.3 to 2 g of a phosphate source to about 0.1 to 2 of a magnesium source.
g/he potassium source approx. 0.3 to 2 g/4 calcium source approx. 0
．． 05-10g//, sulfate source approx. 0.1-2g/l
Prescribe. Examples of these inorganic salts are KH, PO
4I, -HPO4r, Mg5Qp, CaCO3
Examples include. Inoculate the above microorganisms into a medium prepared by adding 1 cup of tap water to these ingredients, and use the standard method aerobically! l
Cultivate the smell. After completion of the culture, the accumulated polysaccharides can be collected by any appropriate method depending on the intended use. For example, bacterial cells are separated by filtration or centrifugation of the culture solution, and polysaccharides produced from the solution are precipitated by adding alcohol such as inpropanol, which is dissolved in water and dissolved. Purification is performed by methods such as reprecipitation with a quaternary ammonium salt and adsorption with a certain ion exchange resin to obtain the desired multi-It compound. It has been known for some time that a number of bacteria belonging to the Enterobacteriaceae family produce polysaccharides, and Toshiyuki Watanabe, Masaharu Seguchi, et al.
0) p. 281) is by Escherichia (Ptshsric
hia) is glu:l-7,:mannose:rhamnose=
It has been reported that a polysaccharide having a molar ratio of 5:3:2 is produced. In addition, Asahi Misaki et al. (Biochemistry. Vol. 39 (1967), p. 542)
erobacter) is galactose: glucurontm
:Mannose = 2.5:0.8:1 (molar ratio) is reported to be produced. The polysaccharide of the present invention has constituent sugars, chemical and physical properties,
It has different characteristics from these known polysaccharides. (1) m acid sugar it'I sylcose. The composition ratio of mannose, glucuronic acid and mannuronic acid (0 molar ratio) is glucose: mannose: glucuronic acid: mannuronic acid = 1: 0.7-1.0: 0.5-0.7:
It is 0.1-0.3. (2) It is acetylated with a degree of acetylation of 0-, 1.0, and when the ether extract of the hydrolyzate is subjected to gas chromatography and the parent acid is analyzed, acetic acid is detected. . (3) The gel shows the molecular weight of l〆~to7 by measuring the molecular weight by a proper method. (4) Shows positivity in each of the color reactions of Maurylesch reaction, phenol sulfuric acid reaction, and Anthrone sulfuric acid reaction. (5) It is insoluble in organic solvents such as methanol, ethanol, acetone, and ether, and has Loe j, tg in water (this aqueous solution is colorless and transparent). (6) When measuring the infrared absorption spectrum using the film method,
The infrared absorption spectrum shown in the attached Figure @1 is shown. (7) The viscosity of a 54s w/v aqueous solution at 30 lζ is 10" to 1ap when measured with a BM type viscometer * 30 r-p, m. (8) 10% w/v Sodium chloride, or 104
In the presence of w/v calcium tetrachloride aqueous solution, the viscosity does not decrease. The viscometer and measurement conditions were the same as in (7). The polysaccharides of the present invention can be used as thickeners, excipients, gelling agents, emulsion stabilizers, and in various fields of food and industrial applications.
Paste for textile printing, paste for sizing. It can be widely used as a flocculant. Next, the present invention will be explained in further detail with reference to Examples. Example 1 50 g of Citx sugar and 5 g of #mother extract per 11 medium. K, HPOy 0.5 g, KH, PQ, p O,
5g, Mg5Q, -7H,QO, 3g. 100 m of a liquid medium containing 1 g of CaC (in a pH 7.0 autoclave, incubated at 120°C for 20 minutes)
One platinum loopful of Enterobata chinensis (Feikoken Bacteria Receipt No. 5928) was inoculated into a 500 ml Sakaro flask containing 200 r, p, on an orbital shaker.
m, de l! ! % and cultured at 37°C for 96 hours. After the cultivation was completed, the culture solution was centrifuged to remove the bacterial cells, and Impropanol was added to the suspension to form a sediment. The precipitate was collected in an oven and dried at 105°C for 24 hours to obtain 8 g of polysaccharide. The above polylj was hydrolyzed with 90% formic acid at 100°C for 16 hours, and then with 2N) refluoroacetic acid at 100°C.
The sugar obtained by hydrolyzing for 5 hours is processed into paper clover.
When subjected to gas chromatography, the Rf value and retention time revealed that the constituent sugars were gelose: mannose: glucuronic acid: mannuronic acid = 1
: 0.73 : 0.65 : 0. ．． It was 13. Furthermore, the number of acetylated thighs was 0, and the number of molecular wrinkles determined by the Gelza method was 1♂. Example 2 Medium 11 ladle a [50 g, polypeptone 2S. K-HPOge 0.5 g, KH2F0,0
．． 5 g, Mg5O,・7Hyo o oQ
g. A liquid medium containing 31 g of CaCo (pH 7,0 in an autoclave, 120″C, sterilized for 20 minutes) was placed in a 3/5
Enterobacter chinensis (FEI accession number 5928) was aseptically sown in a 1-volume JAF Amenku, and the temperature was 37'C, the number of revolutions was 600r, p, 'm, and aeration was carried out.
Aerobic culture was carried out for 96 hours under VVM aeration and stirring conditions. During the cultivation, the pH of the medium was maintained at 7.0 by addition of 1N NaOH. After culturing, 20 g of polysaccharide was obtained in the same manner as in Example 1. When the sugar obtained by hydrolyzing the above polysaccharide in the same manner as in Example 1 was subjected to paper chromatography-i and Geiss chromatography, the constituent sugars were glucose: mannose: glucuronic acid: mannuron@
= 1. : 0.94 : 0.53 : 0.2
7, the degree of acetylation was o, s6, and the molecular track was 10. Patent Applicant Nittan Kahan Co., Ltd. December 28, 1980 1 Relationship between the case and the indicated case Patent Applicant 4 Attachment 8 of the amendment order (1) Page 2 of the specification, lines 6-7 “Entero Bnterobaater n1chids
Enterobacter nichidenii (Enterobacter nichidenii)
) amended to J (the song title has been changed as shown in the attached strain name notification). (2) Same book, page 5, lines 15-16 “Nichidenis (N1c
hidenis) J and certain [Nichidenii (N1c)
Hidenii) Correct as J. (3) 4I, page 9, line 18, and @page 10, line 20 to page 11, line 1, ``2↑Dennis'' is corrected to ``Nichideni''. 7. Inventory of attached materials (1) Notification of change of bacterial strain name (1 copy) Showa t7/Month/day 1 Indication of incident. Relationship to the case 7 Patent Jt1m Person 4 Next to page 11, line 13 of the specification dated January 5, 1982, attached to 7 Patent Jt1m Person 4, an item ``4. Brief explanation of drawings'' is added, and ``No. 1 The figure is an infrared absorption spectrum of the polysaccharide of the present invention.''