JPH10510433A - Oligonucleotides with high chiral purity phosphorothioate linkages - Google Patents

Oligonucleotides with high chiral purity phosphorothioate linkages

Info

Publication number
JPH10510433A
JPH10510433A JP9501254A JP50125497A JPH10510433A JP H10510433 A JPH10510433 A JP H10510433A JP 9501254 A JP9501254 A JP 9501254A JP 50125497 A JP50125497 A JP 50125497A JP H10510433 A JPH10510433 A JP H10510433A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
oligonucleotide
oligonucleotides
phosphorothioate
seq
rna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP9501254A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
クック，フィリップ・ダン
ホーク，グレン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ionis Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Isis Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/469,851 external-priority patent/US5587361A/en
Priority claimed from US08/467,597 external-priority patent/US5607923A/en
Priority claimed from US08/466,692 external-priority patent/US5654284A/en
Priority claimed from US08/471,967 external-priority patent/US5599797A/en
Priority claimed from US08/471,966 external-priority patent/US5661134A/en
Priority claimed from US08/468,569 external-priority patent/US5620963A/en
Priority claimed from US08/468,447 external-priority patent/US5576302A/en
Priority claimed from US08/470,129 external-priority patent/US5635488A/en
Application filed by Isis Pharmaceuticals Inc filed Critical Isis Pharmaceuticals Inc
Publication of JPH10510433A publication Critical patent/JPH10510433A/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C12N15/1132—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses against retroviridae, e.g. HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C12N15/1133—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses against herpetoviridae, e.g. HSV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

(57)【要約】 実質的にすべてＳｐのまたは実質的にすべてＲｐのホスホロチオエート糖間結合のいずれかにより一緒に結合したヌクレオシドユニットを含む配列特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが提供される。そのような実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有する配列特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、酵素的または化学合成により製造される。   (57) [Summary] Provided are sequence-specific phosphorothioate oligonucleotides comprising nucleoside units joined together by either substantially all Sp or substantially all Rp phosphorothioate intersugar linkages. Such sequence-specific phosphorothioate oligonucleotides having substantially chirally pure intersugar linkages are produced by enzymatic or chemical synthesis.

Description

【発明の詳細な説明】 高いキラル純度のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチド関連出願のクロスリファレンス 本出願は、１９９４年８月２９日に出願された、米国特許出願０８／２９７， ７０３の一部継続出願であり、これは、１９９１年１０月１６日に出願され、取 り下げられた米国特許出願０７／７７７，００７の継続出願である。本出願はま た、１９９３年５月５日に出願された米国特許出願０８／０５８，０２３の一部 継続出願であり、これは、１９９１年１０月１５日に出願された米国特許出願０ ７／７７７，６７０（米国特許５，２１２，２９５として１９９３年５月１８日 に発行）の分割出願であり、これは、米国特許出願０７／７７７，００７の一部 継続出願である。上述の各特許出願は、本発明の譲受人にともに譲渡されており 、各出願の全開示を本明細書の一部としてここに引用する。発明の分野 本発明は、糖間結合により結合したヌクレオシドを含む配列特異的ホスホロチ オエートオリゴヌクレオチド、およびそれらの合成および使用に関する。より詳 細には、本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオシドをつなぐ糖間結合は、実質 的に純粋なすべてＳｐのまたはすべてＲｐのキラルホスホロチオエート結合であ る。そのようなオリゴヌクレオチドは、化学的または酵素的合成により製造され る。これらは、診断、治療および研究試薬として特によく適している。発明の背景 オリゴヌクレオチドは一本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズする ことが知られている。ハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチドの塩基の 標的ＲＮＡまたはＤＮＡの塩基への配列特異的塩基対水素結合である。そのよう な塩基対は互いに相補的であるといわれる。 オリゴヌクレオチドの相補的核酸へのハイブリダイゼーションの程度の決定に おいては、オリゴヌクレオチドが相補的核酸と結合する相対的能力を、特定のハ イブリダイゼーション複合体の融解温度を測定することによって比較することが できる。融解温度（Ｔｍ）は、二重らせんに特徴的な物理学的性質であり、らせ ん形（ハイブリダイズしている）対コイル形（ハイブリダイズしていない）が５ ０％の比率で存在する温度（℃）を表す。Ｔｍは、ＵＶスペクトルを用いてハイ ブリダイゼーション複合体の形成および崩壊（融解）を判定することにより測定 される。ハイブリダイゼーションの間に生ずる塩基のスタッキングは、ＵＶ吸収 の減少（淡色化）を伴う。したがって、ＵＶ吸収の減少はより高いＴｍを示す。 Ｔｍがより高くなればなるほど、鎖の間の結合強度はより大きくなる。 オリゴヌクレオチドを用いて、細胞内酵素ＲＮａｓｅ Ｈを用いる標的ＲＮＡ の酵素的切断を行うことができる。そのようなＲＮａｓｅ Ｈ切断のメカニズム は、２’−デオキシリボフラノシルオリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡにハイブリ ダイズすることを必要とする。得られるＤＮＡ−ＲＮＡデュープレックスはＲＮ ａｓｅ Ｈ酵素を活性化し、活性化された酵素はＲＮＡ鎖を切断する。ＲＮＡ鎖 の切断は、標的ＲＮＡの正常な機能を破壊する。ホスホロチオエートオリゴヌク レオチドはこのタイプのメカニズムにより作用する。しかし、ＤＮＡオリゴヌク レオチドがＲＮａｓｅ Ｈの細胞性活性化に有用であるためには、オリゴヌクレ オチドは、ＲＮａｓｅ Ｈ活性化に十分な時間細胞内で生き残るため、ヌクレア ーゼに対して適度に安定でなければならない。非細胞的な用途、例えばオリゴヌ クレオチドの研究試薬としての使用においては、そのようなヌクレアーゼ安定性 は必要ではないだろう。 Ｗａｌｄｅｒらのいくつかの刊行物は、ＲＮａｓｅ Ｈとオリゴヌクレオチド との相互作用を記載する。特に興味深いものは以下のものである：（１）Ｄａｇ ｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９ ０，１８，４７５１；（２）Ｄａｇｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １９９１，１，１１；（ ３）Ｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１，２６６，６ ４７２；および（４）Ｄａｇｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９１，１９，１８０５。これらの刊行物によれば、未 修飾ホスホジエステルヌクレオシド間結合と修飾ホスホロチオエートヌクレオシ ド間結合との両方を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドは、細胞性ＲＮａｓｅ Ｈ の基質である。これらは基質であるため、ＲＮａｓｅ Ｈによる標的ＲＮＡの 切断を活性化する。しかし、著者はさらに、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕ ｓ）胚において、ホスホジエステル結合およびホスホロチオエート結合の両方が エキソヌクレアーゼ分解をも受けることに注目している。そのようなヌクレアー ゼ分解は、ＲＮａｓｅ Ｈ活性化に利用可能なオリゴヌクレオチドを急速に枯渇 させるため、有害である。 文献（１）、（２）および（４）に記載されるように、なおＲＮａｓｅ Ｈ活 性化を与えたままオリゴヌクレオチドをヌクレアーゼ分解に対して安定化させる ために、ホスホルアミデート、アルキルホスホネートまたはホスホトリエステル 結合の区域の間に配置されたホスホジエステル結合ヌクレオチドの短い区域を有 する２’−デオキシオリゴヌクレオチドが構築された。ホスホルアミデート含有 オリゴヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼに対して安定化されていたため、文 献（４）においては、著者はそれぞれのホスホルアミデート結合が、ホスホルア ミデート含有オリゴヌクレオチドの測定Ｔｍ値において１．６℃の低下をもたら したことに注目している。このようなＴｍ値の低下は、オリゴヌクレオチドとそ の標的核酸鎖との間のハイブリダイゼーションの減少を示している。 診断、研究試薬、および治療剤としてのオリゴヌクレオチドの適用には、オリ ゴヌクレオチドが細胞膜を越えて移送されることまたは細胞により取り込まれる こと、標的ＲＮＡまたはＤＮＡに適切にハイブリダイズすること、および続いて 核酸機能を停止または破壊することが必要である。これらの必須の機能は、部分 的には、ヌクレアーゼ分解に対するオリゴヌクレオチドの初期の安定性に依存す る。さらに、これらの機能は、標的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子に対するオリゴヌク レオチドの特異性に依存する。 オリゴヌクレオチドのこれらの目的に関する深刻な欠陥は、細胞内および細胞 外に存在しうる偏在する種々のヌクレアーゼによる酵素的分解に対して感受性で あることである。未修飾の、”野生型”オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼに より急速に分解されるため、治療剤としては有用ではない。したがって、ヌクレ アーゼ耐性を付与するためのオリゴヌクレオチドの修飾は、オリゴヌクレオチド 治療および診断の開発をめざす研究の主要な焦点であった。 オリゴヌクレオチドを修飾してヌクレアーゼ耐性を増強させることは、一般に 糖−リン酸主鎖において、特にリン原子上で行われてきた。ホスホロチオエート は、ヌクレアーゼに耐性を示すことが報告されている。さらに、ホスホロチオエ ートオリゴヌクレオチドは一般に、天然のホスホジエステルオリゴヌクレオチド より化学的により安定である。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはまた、 水性媒体中での溶解性を示す。さらに、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド −ＲＮＡヘテロデュープレックスは、外来ＲＮａｓｅ Ｈのための基質として働 くことができる。さらに、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、高い熱力 学的安定性を示す。しかし、オリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡまたはＤＮＡに確 実性をもって結合する能力は、標的ＲＮＡまたはＤＮＡへのハイブリダイゼーシ ョンにとって重要であるが、オリゴヌクレオチドのリン原子における修飾は、種 々の程度のヌクレアーゼ耐性を示すものの、一般に劣ったハイブリダイゼーショ ン特性という欠点を有する［Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｅｄ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃ ｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎ ｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔ ｏｎ，ＦＬ，１９８９］。 この劣ったハイブリダイゼーションの理由は、リン原子のプロキラルな性質で あろう。修飾されたリンのオリゴヌクレオチドの内部リン原子における修飾は、 ＲｐおよびＳｐ立体異性体を生ずる。 現在までに得られた、得られる分子が非対称の置換基を有する修飾リンオリゴ ヌクレオチドは、２n個（ｎはオリゴヌクレオチド中のホスホロチオエート糖間 結合の数と等しい）の異性体を有するラセミ混合物であった。したがって、１４ 個の非対称中心を含む１５−ｍeｒホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、 ２14すなわち１６，３８４個のジアステレオマーを含む。この観点から、ラセミ 混合物においては、少ないパーセントのオリゴヌクレオチドのみが、十分な親和 性をもって標的ｍＲＮＡまたはＤＮＡに特異的にハイブリダイズするようである 。 キラル的に純粋な糖間結合を有する化学的に合成されたホスホロチオエートオ リゴヌクレオチドは、これまでのところ、１つまたは２つのジアステレオマー性 糖間結合のみを有する分子に限定されている。キラル的に純粋な糖間結合を有す るオリゴヌクレオチドの合成は、自動化合成によってはまだ達成されていないた め、配列特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの化学的に合成されたラ セミ混合物に導入されたキラル性の効果は最近まで評価されなかった。これは、 自動化合成の間にイオウが非立体特異的に取り込まれるためである。例えば、Ｓ ｔｅｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，３２６：２６３（ １９８５）は、ラセミ糖間結合を有するある種のオリゴヌクレオチドホスホロチ オエートを合成したが、１つまたは最大でも２つのジアステレオマー性リン糖間 結合を有するある種の小さいオリゴマーのジアステレオマーを解明することがで きたのみである。 しかし、Ｓｔｅｃ ｅｔ ａｌ．［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９：５８８３（１９９１）］は続いてオリゴヌクレオチドの自動化立体制御合 成を報告した。上述の文献に記載される方法は、５価のホスホロチオイル中心に おける、塩基により触媒される求核置換を利用する。 酵素的方法を用いる、すべてＲｐの糖間結合を有するホスホロチオエートの合 成は、何人かの著者により研究されてきた［Ｂｕｒｇｅｒｓ ａｎｄ Ｅｃｋｓ ｔｅｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５４：６８８９ （１９７９）；Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６ ：７６８９（１９８２）；Ｂｒｏｄｙ ａｎｄ Ｆｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ，２０：１２４５（１９８１）；およびＥｃｋｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｊｏｖｉ ｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２：４５４６（１９８３）］。Ｂｒｏｄｙら（ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２１：２５７０（１９８２）］、およびＲｏｍａｎ ｉｕｋおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：７６８４ （１９８２）］は、ポリＴｐＡおよびポリＡｐＴホスホロチオエートを酵素的に 合成した。ＢｕｒｇｅｒｓおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：４７９８（１９７８）］は、ポリＵｐＡホ スホロチオエートを酵素的に合成した。Ｃｒｕｓｅら［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ，１９２：８９１（１９８６）］は、３つのジアステレオマー性ＲｐのＧｐＣホ スホロチオエートダイマーを天然のホスホジエステル結合により結合させてヘキ サマーとした。 オリゴヌクレオチドが相補的核酸に結合する相対的能力は、特定のハイブリダ イゼーション複合体の融解温度を測定することによって比較することができる。 融解温度（Ｔｍ）は、二重らせんに特徴的な物理学的性質であり、らせん形対コ イル形（ハイブリダイズしていない）が５０％で存在する温度（℃）を表す。Ｔ ｍは、ＵＶスペクトルを用いてハイブリダイゼーションの形成および崩壊（融解 ）を判定することにより測定される。ハイブリダイゼーションの間に生ずる塩基 のスタッキングは、ＵＶ吸収の減少（淡色化）を伴う。したがって、ＵＶ吸収の 減少はより高いＴｍを示す。Ｔｍがより高くなればなるほど、鎖の間の結合強度 はより大きくなる。非ワトソン−クリック塩基対は、Ｔｍに対して強い不安定化 効果を有する。 予備的報告［Ｓｔｅｃ，Ｊ．Ｗ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓ ｓｉｏｎ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍｅｅｔｉｎ ｇ ａｂｓｔｒａｃｔｓ，Ｊｕｎｅ １８−２１，１９８９］においては、天然 のホスホジエステル結合により結合した２つのチミジンメチルホスホネート４量 体ジアステレオマーから、糖間結合に１つを除いてすべて修飾リン酸結合を有す るチミジンホモポリマー８量体（”１つ以外”）のＲｐ立体コンフィギュレーシ ョンまたは”１つ以外”Ｓｐ立体コンフィギュレーションが形成された。１つを 除きすべてＲｐの糖間結合を有するＲｐ”１つ以外”メチルホスホネート配列非 特異的チミジンホモ８量体、すなわち（ｄＴ）8は、１５量体デオキシアデノシ ンホモポリマー、すなわち（ｄＡ）15と、”１つを除く”Ｓｐコンフィギュレー ションメチルホスホネート結合を有する同様のチミジンホモポリマー、すなわち １つを除きすべてＳｐの糖間結合を有するｄ（Ｔ）15とｄ（Ａ）15により形成さ れたハイブリッド（Ｔｍ＜Ｏ℃）よりも、熱力学的により安定なハイブリッド（ Ｔｍ ３８℃）を形成したことに注目されたい。天然のホスホジエステル結合を 有する（ｄＴ）8、すなわちオクタチミジル酸とｄ（Ａ）15との間のハイブリッ ドは、１４℃のＴｍを有することが報告されている。 より最近では、Ｕｅｄａら［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ，１９：５４７（１９９１）］は、翻訳系において用いるための、Ｒｐジアステ レ オマー性ホスホロチオエート結合を断続的に取り込んだｍＲＮＡを酵素的に合成 した。Ｕｅｄａらは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのための１７のプロモーターおよ び１つの停止部位を有するＴ７コリファンＤＮＡを用いた。Ｔ７ＲＮＡポリメラ ーゼによるインビトロ合成は、数百から数万個のヌクレオチドを有するｍＲＮＡ を生成した。 主鎖キラル性はまた、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド−ＲＮＡヘテロ デュープレックスのＲＮａｓｅ Ｈ活性に対する感受性に影響を与えるであろう 。ＲＮａｓｅ ＨがＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドヘテロデュープレックス 中のＲＮＡ成分の切断を引き起こすことが示唆されているため、ＲＮａｓｅ Ｈ のためのテンプレートとして働く能力は著しい治療的意味を有する。Ｒｐおよび Ｓｐ糖間結合のラセミ混合物を含むオリゴヌクレオチドについては、すべてのホ スホロチオエートオリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ Ｈの基質として同等に機能 しうるか否かはわかっていない。種々の触媒反応について、核酸のホスホジエス テル主鎖の加水分解は、立体特異的メカニズム（インラインメカニズム）および コンフィギュレーションの反転により進行する。したがって、ラセミ混合物には 、最大のハイブリダイゼーション効率および翻訳の停止のための正しいキラル性 を含むオリゴヌクレオチドは少ないパーセンテージでのみ存在するであろう。す なわち、ヘテロデュープレックス中でＲＮａｓｅ Ｈのための基質として働くこ とができるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのパーセンテージを増加させ ることは、アンチセンス療法のためのより有効な化合物につながるであろう。 ハイブリダイゼーションの確実性を増強させるために、実質的にキラル的に純 粋な糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが非常に望まれて いる。さらに、そのような実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロ チオエートオリゴヌクレオチドは、より有効な治療化合物につながるであろう。 しかし、これまでのところ、そのような分子の合成にはほとんど成功していない 。したがって、実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチオエート オリゴヌクレオチドを合成する簡単な方法が非常に望まれている。 オリゴヌクレオチド治療の開発においてオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐 性およびハイブリダイゼーションの確実性が非常に重要であることが認識されて きた。ヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチドはまた、研究試薬および診 断薬としても望まれている。発明の概要 本発明にしたがえば、すべてのヌクレオシドユニットが実質的にすべてＳｐの ホスホロチオエート糖間結合または実質的にすべてＲｐのホスホロチオエート糖 間結合のいずれかにより一緒に連結されているホスホロチオエートオリゴヌクレ オチドが提供される。好ましくは、本発明のホスホロチオエートオリゴヌクレオ チドは、標的ＲＮＡまたはＤＮＡの配列の少なくとも一部に相補的である。 さらに、本発明にしたがえば、実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有する配 列特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを合成する化学的および酵素的 方法が提供される。ここで、前記ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、実 質的にすべてＲｐのまたは実質的にすべてＳｐの糖間結合のいずれかにより一緒 に連結された、少なくとも１０ヌクレオシドユニットからなる。好ましくは、ホ スホロチオエートオリゴヌクレオチドは、実質的にキラル的に純粋な糖間結合に より連結された約１０から約５０ヌクレオシドユニットからなる。より好ましく は、前記ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、実質的にキラル的に純粋な 糖間結合により連結された約１５から約３０ヌクレオシドユニットからなる。最 も好ましくは、前記ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、実質的にキラル 的に純粋な糖間結合により連結された約１７から２１ヌクレオシドユニットから なる。前記方法は、配列プライマー、テンプレート、および過剰量の４つすべて のキラル的に純粋なヌクレオシド５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）を組 み合わせることを含む。前記方法はさらに、ポリメラーゼの付加およびそれに続 く相補的オリゴヌクレオチドからのプライマーの切断により、相補的オリゴヌク レオチドを合成することを含む。さらに、前記方法は、前記相補的オリゴヌクレ オチドを前記テンプレートから解離させることを含む。 実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有する配列特異的ホスホロチオエートオ リゴヌクレオチドを合成する本発明の方法の別の態様においては、配列プライマ ー、テンプレートおよびヌクレオシド５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェート） のラセミ混合物を組み合わせる。実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有し、テ ンプレートに相補的であるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、ポリメラ ーゼおよび選択された金属イオンを添加することにより合成する。このようにし て合成されたオリゴヌクレオチドを、テンプレートおよびプライマーから解離さ せる。 実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレ オチドは、標的ＲＮＡおよびＤＮＡとともに形成されたヘテロデュープレックス の熱力学的安定性を増加させ、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を引き出すのに有用である。 さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡの活性を調節するのに有用であ る。発明の詳細な記載 オリゴヌクレオチドのホスホジエステル結合中のリン原子は、”プロキラル” であるということができる。ホスホジエステル結合の非結合酸素原子が置換また は修飾されると、キラルな糖−リン酸結合が生成する。得られる糖間結合は、Ｓ ｐ糖間結合またはＲｐ糖間結合のいずれかである。天然のホスホジエステル結合 の非結合酸素原子をイオウで置換してホスホロチオエート結合を得ると、キラル 中心が生成し、ＳｐおよびＲｐジアステレオマーが生ずる。糖主鎖中のリン原子 の実質的にすべてがＳｐまたはＲｐである分子は、本明細書においてキラル的に 純粋であると称される。 リボヌクレオシド−５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）（ＮＴＰαＳ） および２’−デオキシリボヌクレオシド−５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェー ト）（ｄＮＴＰαＳ）は、ＬｕｄｗｉｇおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ［Ｊ．Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．，６３１（１９８９）］の方法論を用いて、ＳｐおよびＲｐのラセミ 混合物として合成された。この例示的合成スキームにおいては、非保護ヌクレオ シドを、２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オン と反応させ、これは５’−ヒドロキシル基をホスフィチル化する。続くピロホス フェートとの反応により、イオウに対して反応性である環状トリホスフェート誘 導体が生成し、ＲｐおよびＳｐヌクレオシド５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェ ート）、すなわち、α−チオトリホスフェートの混合物が得られる。生成物を、 例えば、ＤＥＡＥ−セファデックスクロマトグラフィーにより精製し、ＮＭＲ分 光分析法を用いて（特徴的なＲｐまたはＳｐ化学シフトにより）同定することが できる。 以下の実施例で示されるように、純粋なＲｐおよびＳｐヌクレオシド−５’− Ｏ−（１−チオトリホスフェート）ジアステレオマーは、例えば、逆相ＨＰＬＣ クロマトグラフィーを用いて製造規模で容易に単離することができる。このよう なＨＰＬＣで単離されたヌクレオチドジアステレオマーは、そのようなＲｐおよ びＳｐヌクレオシド５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）ジアステレオマー の市販試料との分析ＨＰＬＣ比較により、さらに特性決定することができる。 配列特異的な天然のオリゴヌクレオチド、すなわち天然のホスホジエステルオ リゴヌクレオチドの酵素的合成は、テンプレートおよびプライマーの存在下で適 当なヌクレアーゼを用いることにより行うことができる。同様に、キラル的に混 合された糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのラセミ混合 物を合成することができる。本発明にしたがえば、そのような酵素的合成は、配 列特異的テンプレートおよびプライマーの存在下に、鏡像異性体に関して純粋な すべてＳｐのまたはすべてＲｐのヌクレオシド５’−Ｏ−（１−チオトリホスフ ェート）を適当なヌクレアーゼの基質として用いることにより、実質的にキラル 的に純粋な糖間結合を有する配列特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド の合成を含むようにさらに発展させることができる。例えば、市販のＤＮＡポリ メラーゼであるシークエナーゼTM（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ． ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を用いることにより、ホスホジエステルオリゴヌ クレオチドテンプレートおよびラセミ体のホスホロチオエートオリゴヌクレオチ ドプライマーを用いてホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを合成することが できる。このポリメラーゼを用いることにより、ホスホジエステルおよびホスホ ロチオエートプライマーの両方を伸長することができる。 酵素的に合成されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの収量は、テンプ レートおよびプライマーを繰り返し添加することにより、ポリメラーゼを繰り返 し添加することにより、ヌクレオシド三リン酸を繰り返し添加することにより、 またはこれらのいくつかまたはすべてを組み合わせることにより最適化すること ができる。例えば、テンプレートおよびプライマーの繰り返し添加により、酵素 的カスケードによる収量は最大化する。さらなる最適化は、テンプレートとプラ イマーとを系の緩衝液中で一緒にプレハイブリダイゼーションし、つづいて冷却 し、ヌクレオシド三リン酸およびポリメラーゼを加えることにより行うことがで きる。 適当なポリメラーゼを選択して、ＤＮＡまたはＲＮＡホスホロチオエートオリ ゴヌクレオチドを生成することができる。このようなポリメラーゼとしては、Ｔ ７ＤＮＡポリメラーゼ、修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、例えば上記に論及したシ ークエナーゼTM、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリクレノーフラ グメントポリメラーゼ、Ｍ．ルテウス（ｌｕｔｅｕｓ）ポリメラーゼ、Ｔ４バク テリオファージポリメラーゼ、修飾Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＲＮＡポリメ ラーゼおよびＥ．ｃｏｌｉ ＲＮＡポリメラーゼが挙げられるが、必ずしもこれ らに制限されない。 酵素的合成は、リン原子のキラル中心のまわりでのコンフィギュレーションの 反転を伴って進行する。すなわち、すべてＳｐのα−チオトリホスフェートの使 用により、実質的にすべてＲｐのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが生じ 、すべてＲｐのα−チオトリホスフェートの使用により、実質的にすべてＳｐの ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが生じる。本発明の別の態様においては 、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、金属イオンを反応溶液中で用いて 一方または他方のキラルα−チオトリホスフェートを優先的に取り込むことを促 進することにより、ヌクレオシド−５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）の ラセミ混合物から合成することができる。上述したように、ホスホロチオエート オリゴヌクレオチドのポリメラーゼ合成は、前駆体ヌクレオシド−α−チオトリ ホスフェートのキラル中心のまわりでのコンフィギュレーションの反転を伴って 達成される。理論に拘束されることを望むものではないが、すべてＲｐのコンフ ィギュレーションの最適化は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼを用いる反応 緩衝液中に高濃度のマグネシウムイオンを加えることにより達成することができ ると考えられる。同様に、再度理論に拘束されることを望むものではないが、す べてＳｐのコンフィギュレーションは、反応緩衝液中において高いマンガンイオ ン濃度を用いることによって得られると考えられる。 本発明にしたがえば、”実質的にすべての”とは、少なくとも７５％の糖間結 合がキラル的に純粋であるすべてのオリゴヌクレオチドを含むことを意味する。 より好ましくは、約８５％から約１００％のキラル的に純粋な糖間結合を有する オリゴヌクレオチドは、実質的にキラル的に純粋である。最も好ましくは、約９ ５％から約１００％のキラル的に純粋な糖間結合を有するオリゴヌクレオチドは 、実質的にキラル的に純粋である。 本発明の分脈において、用語”ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド”は、 天然に生ずる塩基、糖およびホスホロチオエート結合から形成されるホスホロチ オエートオリゴヌクレオチドを含む。天然に生ずる塩基には、アデニン、グアニ ン、シトシン、チミンおよびウラシルが含まれる。天然の糖には、β−Ｄ−リボ フラノシルおよびβ−Ｄ−２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシルが含ま れる。”ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド”はまた、ヌクレオシド−５’ −Ｏ−（１−チオトリホスフェート）類似体が適当なポリメラーゼのための基質 である程度まで、オリゴヌクレオチドのホスホロチオエートヌクレオチドユニッ ト中に取り込まれた修飾された塩基または修飾された糖を含む。本発明のオリゴ ヌクレオチドの修飾された塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル 、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、２ −プロピルおよび他のアルキル−アデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシ ン、６−アザウラシル、６−アザシトシンおよび６−アザチミン、シュードウラ シル、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオー ルアデニン、８−チオールアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニンおよび 他の８−置換アデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオール グアニン、８−チオールアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニンおよび他 の８−置換グアニン、他のアザおよびデアザウラシル、他のアザおよびデアザチ ミジン、他のアザおよびデアザシトシン、他のアザおよびデアザアデニン、他の アザおよびデアザグアニン、５−トリフルオロメチルウラシルおよび５−トリフ ルオロシトシンが含まれる。糖成分は、デオキシリボースであってもリボースで あってもよい。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、修飾された核塩基または本 発明の精神に合致する他の修飾、特に、治療、診断または研究試薬としての使用 を容易に するため、そのヌクレアーゼ耐性を増加させる修飾を有する核塩基を含んでいて もよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、診断、治療および研究試薬として使用 することができる。これらは、有効量の本発明のオリゴヌクレオチドを適当な薬 学的に許容しうる希釈剤または担体に加えることにより、医薬組成物中で使用す ることができる。これらはさらに、蛋白質の望ましくない生成により特徴づけら れる疾患を有する生物を治療するために用いることができる。生物を、望ましく ない蛋白質をコードする標的核酸の鎖と特異的にハイブリダイズしうる配列を有 する本発明のオリゴヌクレオチドと接触させることができる。 治療組成物の処方およびその続いての投与は、当業者の技術の範囲内であると 考えられる。一般に、治療のためには、そのような治療を必要とする患者に本発 明にしたがうオリゴヌクレオチドを、通常は薬学的に許容しうる担体中で、処置 される患者の年齢および疾患状態の重篤度に依存して、体重１ｋｇあたり０．０ １μｇから１００ｇの範囲の用量で投与する。さらに、治療計画は、特定の疾患 の特性、その重篤度、および患者の全体的状態に依存して変わるであろう期間継 続し、１日に１回から数年に１回まで拡張することができる。処置後、患者をそ の状態の変化についておよび疾患状態の症状の緩和について監視する。患者が現 在の用量レベルに有意に応答しない場合には、オリゴヌクレオチドの用量を増加 することができ、または疾患状態の症状の緩和が観察された場合、または疾患状 態が除去された場合には、用量を低下させることができる。 場合により、他の伝統的な治療モダリティーと組み合わせて、本発明のオリゴ ヌクレオチドで患者を処置することがより有効であろう。 用量は、治癒が行われるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで、数日 から数ヶ月の処置過程で、治療すべき病状の重篤度および応答性に依存する。最 適用量スケジュールは、患者の体内での薬剤の蓄積の測定から計算することがで きる。当業者は、最適用量、投与法および反復率を容易に決定することができる 。最適用量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的効力に依存して変化し、一般 に、インビトロおよび動物モデルのインビボで有効であることが見いだされたＥ Ｃ50に基づいて見積もることができる。一般に、用量は体重１ｋｇあたり０．０ １μｇから１００ｇであり、１日に１回またはそれ以上、１週間に１回、１ヶ月 に 一回または１年に１回、または数年に１回、与えられる。 治療の成功に続き、疾患状態の再発を防ぐため、オリゴヌクレオチドを体重１ ｋｇあたり０．０１μｇから１００ｇ、１日に１回またはそれ以上から数年に１ 回の範囲の維持用量で患者に投与する維持療法を行うことが望ましいであろう。 本発明の医薬組成物は、局所または全身の処置が望まれているか、および処置 されるべき領域に依存して、多くの方法により投与することができる。投与は、 局所的に（点眼、膣内、直腸内、鼻孔内を含む）、経口で、または非経口で行う ことができる。非経口投与には、静脈内点滴、皮下、腹腔内または筋肉内注射、 または髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）または脳室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒ ｉｃｕｌａr）投与が含まれる。 局所投与のための処方には、経皮パッチ、軟膏、ローション剤、クリーム剤、 ゲル剤、滴剤、座剤、スプレー剤、水剤および散剤が含まれるであろう。通常の 医薬担体、水性、粉末または油性基剤、粘稠化剤などが必要かまたは望ましいで あろう。被覆されたコンドーム、手袋等もまた有用であろう。 経口投与のための組成物には散剤、顆粒剤、水または非水性媒質中の懸濁化剤 または液剤、カプセル剤、サッシェ剤、または錠剤が含まれる。粘稠化剤、芳香 剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が望まれるであろう。 髄腔内または脳室内投与のための組成物には、緩衝液、希釈剤およびその他の 適切な添加剤を含んでいてもよい無菌水溶液が含まれる。 非経口投与のための処方には、緩衝液、希釈剤およびその他の適切な添加剤を 含んでいてもよい無菌水溶液が含まれる。 本発明のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション 、ヌクレアーゼ耐性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性に及ぼすそれらの影響に関して、 天然のホスホジエステルオリゴヌクレオチドおよびラセミ体ホスホロチオエート ヌクレオチドの両方と比較することができる。同様に、実質的にキラル的に純粋 な糖間結合を有する純粋なホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、インビボ 試験系において治療の有効性を増加させる能力について評価することができる。 そのような治療の有効性の増加には、薬物動態学または代謝、毒性学、配剤（す なわち吸収および分布）、および種比較等の特性が含まれる。 すべてＲｐのまたはすべてＳｐの糖間結合を有するホモポリマーは、安定性お よび他の特性の最初の研究には有用であった。しかし、これらのオリゴヌクレオ チドは、標的分子に特異的ではないため、治療的にはほとんど用途はない。標的 核酸に特異的にハイブリダイズするためには、特異的配列を有するホスホロチオ エートオリゴヌクレオチドが必要である。 実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有する配列特異的ホスホロチオエートオ リゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡおよびＤＮＡとのヘテロデュープレックスの熱 力学的安定性を増加させ、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を付与するのに有用である。 放射性標識を用いて、実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチ オエートオリゴヌクレオチドの同定を助けることができる。自動化合成機で合成 されたラセミ体ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドについては、合成機から 得られた水素ホスホネートオリゴマーの酸化反応のために［35Ｓ］（放射性標識 された元素イオウ）を用いることができる。酵素的に合成されたホスホロチオエ ートオリゴヌクレオチドの標識は、［α−32Ｐ］ＡＴＰおよびリガーゼにより、 またはポリメラーゼ反応において［α−35Ｓ］ＡＴＰを用いて行うことができる 。また、放射性標識ヌクレオシドトリホスフェートを、プローブおよび配列決定 分析において用いることができる。オートラジオグラムは標準的な方法で作成さ れる。 本発明のテンプレートは、疾患増強性蛋白質の合成を指令する核酸配列の領域 であることが最も好ましい。前記テンプレートオリゴヌクレオチドの領域に対し て塩基対を形成する短いオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼによるオリゴヌク レオチド合成の出発点を形成するプライマーとして作用する。 実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレ オチドは、ヌクレアーゼ切断、例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断に感受性で ある部位をその上に有するように選択されたプライマーを用いて合成することが できる。前記切断部位は、前記プライマーの３’末端に位置していてもよい。適 当な制限エンドヌクレアーゼによる前記部位における切断により、最初の５’末 端ヌクレオシドを前記プライマーから得るオリゴヌクレオチドが得られる。本発 明の前記ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの別のヌクレオシドは、酵素的 手段により付加されたヌクレオシドキラルチオトリホスフェートである。 選択されたプライマーとともに適当な制限ヌクレアーゼを選択することにより 、所望のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの種々の５’−末端ヌクレオシ ドをホスホロチオエートヌクレオチドの５’末端に適切に配置させることができ る。すなわち、互い違いの切断によりプライマーからの１つのヌクレオシドが新 たに合成された本発明の配列特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの最 初の５’ヌクレオシドとなる限り、任意のエンドヌクレアーゼ認識部位を設計す ることができる。このことにより、本発明の酵素的に合成されたホスホロチオエ ートオリゴヌクレオチドの５’末端において各種のヌクレオシドが生成する。 所望の配列の適当なテンプレート上での前記プライマーの酵素的伸長を完了し たら、適当なヌクレアーゼを用いることにより、本発明のホスホロチオエートオ リゴヌクレオチドを前記プライマーから脱離させることができる。例えば、所望 のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの５’末端にグアノシンヌクレオシド を取り込ませるために、３’末端に配列ＣＴＧＣＡＧを有するプライマーを用い ることができる。次に、Ｐｓｔ１制限ヌクレアーゼを用いることにより、Ａ−Ｇ 結合を切断することができる。したがって、このＡ−Ｇ結合のグアノシンヌクレ オシド成分は、所望のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレ オシドとして取り込まれることができる。他の制限エンドヌクレアーゼとしては 、制限されないが、ＢａｍＨ１、ＳｍａｌおよびＨｉｎＤ ＩＩＩ制限エンドヌ クレアーゼがある。 前記テンプレートとなお会合したオリゴヌクレオチドは、前記テンプレートか ら解離させ、次に、例えば、ゲル電気泳動および／またはクロマトグラフィーに よって精製することができる。例えば、適当な精製は、ＳｅｐＰａｃ（Ｍｉｌｌ ｉｐｏｒｅ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）クロマトグラフィーと組み合わせた標準的 なポリアクリルアミド／尿素ゲル電気泳動を用いて行うことができる。使用しう る他の有用なクロマトグラフィー技術は、ＨＰＬＣクロマトグラフィーである。 本発明のキラルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはまた、Ｓｔｅｃ ｅ ｔ ａｌ．［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：５８８３（１９９ １）］およびＳｔｅｃ ａｎｄ Ｌｅｓｎｉｋｏｗｓｋｉ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ，Ｅｄ．，Ｖｏ ｌｕｍｅ ２０，ｐ．２８５，１９９３］に記載されるように、１，３，２−オ キサチアホスホラン中間体を介して化学的に合成することができる。 本発明の方法にしたがって合成される実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有 するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、多くの方法によって分析するこ とができる。例えば、得られる実質的にキラル的に純粋なすべてＳｐのまたはす べてＲｐの糖間結合を有する配列特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド のコンフィギュレーション分析は、［31Ｐ］ＮＭＲ化学シフトを用いて判定する ことができる。このような化学シフトは、ホスホロチオエートジヌクレオチドの Ｒｐエピマーを同定するのに使用されている（Ｌｕｄｗｉｇ ａｎｄ Ｅｃｋｓ ｔｅｉｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６３１−６３５（１９８９）］。 本発明のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの配列の正確さは、Ｓ１ヌク レアーゼに対するヘテロデュープレックスの感受性を使用して判定することがで きる。 ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの配列は、ホスホロチオエートオリゴ ヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基を〔α−32Ｐ〕コルジセピントリホスフェ ート（すなわち、３’−デオキシアデノシン−５’−トリホスフェート）で標識 することによって、さらに確証を高めることができる。得られたオリゴヌクレオ チドを酵素的分解に供することもできる。 実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレ オチドが相補的鎖に結合する相対的能力は、実質的にキラル的に純粋な糖間結合 を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドとその相補的鎖とのハイブリダ イゼーション複合体の融解温度を測定することによって比較することができる。 融解温度（Ｔｍ）は、二重らせんに特徴的な物理学的性質であり、らせん形対コ イル形（ハイブリダイズしていない）が５０％の比率で存在する摂氏温度を意味 している。Ｔｍは、ＵＶスペクトルを用いてハイブリダイゼーションの形成およ び崩壊（融解）を測定することによって測定される。ハイブリダイゼーションの 間に生ずる塩基のスタッキングは、ＵＶ吸収の減少（淡色化）を伴う。結果的に 、ＵＶ吸収の減少はより高いＴｍを示す。Ｔｍが高くなればなるほど、鎖の結合 強 度はより大きくなる。非ワトソン−クリック塩基対は、Ｔｍに対して強い不安定 化効果を有する。したがって、オリゴヌクレオチドのその標的ＲＮＡへの最適の 結合を得るためには、塩基対ができるだけ最適に近い正確さであることが望まし い。 本発明のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはさらに、種々のエキソヌク レアーゼおよびエンドヌクレアーゼの分解能力に対する抵抗性に関して評価する ことができる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドをヌクレアーゼで処理し 、次に、例えばポリアクリルアミドゲルによる電気泳動（ＰＡＧＥ）を行い、そ して適切な染色剤〔例えばＳｔａｉｎｓ ＡｌｌTM（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃ ｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｉｓ，ＭＯ）〕を使用して染色することによって分析すること ができる。分解生成物は、レーザー・デンシトメトリーを使用して定量化するこ とができる。 ウシ胎児血清およびヒト血清を使用して、実質的にキラル的に純粋な糖間結合 を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに対する核酸分解（ｎｕｃｌｅ ｏｌｙｔｉｃ）活性を評価することができる。例えば、実質的にすべてＲｐの糖 間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドをこのような仕方で評価 することができる。３’または５’末端がキャップされた分子（１キャップ当た り１つまたはいくつかのホスホロチオエート結合を有する）の組み合わせに関す る試験を使用して、最も大きなヌクレアーゼ安定性を生じる組み合わせを求める ことができる。キャッピングは、精製されたＲｐモノマーを使用して配列のキャ ップ部分を化学的に合成し、次いで前記キャップをＤＮＡ合成機上のオリゴヌク レオチド中に取り込ませることによって行うことができる。キャッピングに関す る分析により、核酸分解安定性に及ぼすキラル性の重要性および、最大の安定性 を得るのに必要とされる結合の数を決定することができる。 ＲＮａｓｅ Ｈの触媒活性に対するホスホロチオエートオリゴヌクレオチド− ＲＮＡヘテロデュープレックスの感受性も評価することができる。ホスホロチオ エートオリゴヌクレオチドを、種々のハイブリダイゼーション温度で、放射性標 識した標的ｍＲＮＡ（例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼを介して合成）と共にイン キュベートすることができる。次に、Ｍｉｎｓｈｕｌｌ ａｎｄ Ｈｕｎｔ［Ｎ ｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，６４３３（１９８６））に記載の方法にしたがって 、ヘテロデュープレックスをＥ．ｃｏｌｉからのＲＮａｓｅ Ｈとともに３７℃ でインキュベートすることができる。次に、生成物をノザンブロット分析法によ りＲＮａｓｅ Ｈ活性に関して評価することができる。この方法においては、生 成物を１．２％アガロース／ホルムアルデヒドゲルで電気泳動し、ニトロセルロ ースに移す。次に、標的ｍＲＮＡに相補的なランダムプライマー〔32Ｐ〕−標識 ｃＤＮＡを用いてフィルターを探索し、オートラジオグラフィーによって定量化 する。各種のホスホロチオエート類似体を比較することにより、ＲＮＡと複合体 を形成したときにＲＮａｓｅ Ｈに対する基質として作用しうる能力に及ぼすキ ラル性の影響を調べることができる。 Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ Ｈおよび哺乳動物ＲＮＡｓｅ Ｈの触媒作用に対 するヘテロデュープレックスの感受性の比較を行うことができる。ヘテロデュー プレックスを、翻訳の条件下にてラビットの網状赤血球溶解物中でインキュベー トし、内在ＲＮａｓｅ ＨによるｍＲＮＡの触媒切断に関して、ノザンブロット 分析によりアッセイすることができる。このことにより、哺乳動物ＲＮＡｓｅ Ｈ活性に及ぼすキラル性の影響を調べることができる。 実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレ オチドはまた、細胞培養のモデルシステムにおける遺伝子発現の阻害に関して評 価することができる。実質的に純粋なキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホ ロチオエートオリゴヌクレオチドが遺伝子発現のより強力なまたはより特異的な 阻害剤であるか否かを調べるために、レポーター遺伝子を標的とするよう設計さ れた、実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌ クレオチドを合成し、遺伝子発現の細胞培養モデルにおいて試験することができ る。ベクターｐＳＶ２ＣＡＴを用いて遺伝子発現に及ぼすアンチセンスの影響を 調べることが前に記載されている［Ｈｅｎｔｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：６３４２（１９８８）］ 。このベクターは、ＳＶ４０プロモーターの調節制御下の細菌クロラムフェニコ ールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含有する。ＣＡＴ ｍＲＮＡの翻訳開 始に相補的な配列の、すべてＲｐの糖間結合を有する１５−ｍｅｒホスホロチオ エ ートオリゴヌクレオチドを用いて、ｐＳＶ２ＣＡＴをＨｅＬａ細胞にトランスフ ェクトし、次にすべてＲｐの糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレ オチドで細胞を４８時間処理して、細胞内のＣＡＴ活性をアッセイすることがで きる。次に、実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチオエートの 遺伝子発現の阻害における活性を、ジアステレオマー性糖間結合を有する化学的 に合成したランダムホスホロチオエート、および同じ配列の天然ホスホジエステ ルオリゴヌクレオチドと直接比較することができる。 ベクターｐＳＶ２ＡＰＡＰ［Ｍａｒｃｕｓ−Ｓｅｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎ ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：５７４９（１９８７）］ は、哺乳動物胎盤アルカリホスファターゼ遺伝子（ＰＡＰ）を含む。これはまた 、遺伝子発現に及ぼすアンチセンスの影響を測定するためのレポーターとして使 用することもできる。ＰＡＰは、イントロンおよび他のＲＮＡプロセシング信号 を含む細菌遺伝子ではなく哺乳動物遺伝子であるという点において、レポーター 遺伝子としてはＣＡＴを凌ぐ利点を有する。現時点では、ＰＡＰの発現は、天然 の哺乳動物遺伝子の発現における事象をより近似して模倣すると考えられている 。ＣＡＴ ｍＲＮＡに関して前述したような、実質的にキラル的に純粋な糖間結 合を有する１５−ｍｅｒホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、類似の配列 を有する化学合成したラセミ体ホスホロチオエートおよび天然のホスホジエステ ルオリゴヌクレオチドと平行して調べることができる。ＰＡＰおよびＣＡＴレポ ーター構築物を、遺伝子発現に及ぼす非特異的影響を調べるための繰り返し実験 における対照として用いる。 さらに、実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチオエートオリ ゴヌクレオチドは、インビボでＲＮＡ翻訳の阻害剤として作用するその能力につ いて評価することができる。種々の治療分野が本発明のオリゴヌクレオチドによ るそのような操作の標的とすることができる。１つの治療分野はＣ型肝炎ウイル ス（ＨＣＶ）により引き起こされる肝炎である。以下のホスホロチオエートオリ ゴヌクレオチドは、ＨＣＶ肝炎の治療に適用を有する：オリゴ＃２５９、CCTTTC GCGACCCAACACTA（配列番号１）、オリゴ＃２６０、GCCTTTCGCGACCCAACACT（配列 番号２）、オリゴ２７０、GTACCACAAGGCCTTTCGCG（配列番号３）、オリゴ ＃３３０、GTGCTCATGGTGCACGGTCT（配列番号４）およびオリゴ＃３４０、TTTAGG ATTCGTGCTCATGG（配列番号５）。別の治療分野は、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ− １）により媒介される炎症性疾患である。炎症性疾患の治療に適用を有するオリ ゴヌクレオチドには、ＩＳＩＳ−２３０２、GCCCAAGCTGGCATCCGTCA（配列番号６ ）が含まれる。別の治療分野には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）により引き 起こされる感染が含まれる。ＩＳＩＳ−２９２２は、ＣＭＶ網膜炎の治療に適用 を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであり、配列GCGTTTGCTCTTCTTC TTGCG（配列番号７）を有する。別の治療分野には、蛋白質キナーゼＣ−α（Ｐ ＫＣ−α）により媒介される癌が含まれる。ＩＳＩＳ−３５２１は、そのような 癌の治療に適用を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであり、配列GT TCTCGCTGGTGAGTTTCA（配列番号８）を有する。さらに別の治療分野には、Ｃ−ｒ ａｆキナーゼ媒介性癌が含まれる。ＩＳＩＳ−５１３２は、そのような癌の治療 に適用を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであり、配列TCCCGCCTGT GACATGCATT（配列番号９）を有する。さらに別の治療分野は、Ｈａ−ｒａｓまた はＫｉ−ｒａｓにより媒介される癌を含む。以下のホスホロチオエートオリゴヌ クレオチドは、そのような癌の治療に適用を有する：ＩＳＩＳ−２５０３、TCCG TCATCGCTCCTCAGGG（配列番号１０）、ＩＳＩＳ−２５７０、CCACACCGACGGCGCCC （配列番号１１）、およびＩＳＩＳ−６９５７、CAGTGCCTGCGCCGCGCTCG（配列番 号１２）。別の治療分野にはＨＩＶにより媒介されるＡＩＤＳおよび他の関連す る感染が含まれる。ＩＳＩＳ−５３２０は、ＡＩＤＳの治療に適用を有するホス ホロチオエートオリゴヌクレオチドであり、配列TTGGGGTT（配列番号１７）を有 する。上述の配列において、オリゴヌクレオチドの個々のヌクレオチドユニット は左から右へ５’から３’方向に表記される。 本発明の分脈において、”ハイブリダイゼーション”とは、相補的ヌクレオチ ドユニット間の水素結合を意味し、これはワトソン−クリック、フーグスティー ンまたは逆フーグスティーン水素結合であってもよい。例えば、アデニンとチミ ンとは、水素結合の形成によって対合する相補的核塩基である。本明細書におい て用いる場合、”相補的”とは、２つのヌクレオチドユニット間の配列相補性を も表す。例えば、オリゴヌクレオチドのある位置にあるヌクレオチドユニットが ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の同一の位置のヌクレオチドユニットと水素結合するこ とができる場合、オリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡとはその位置におい て互いに相補的であると考えられる。オリゴヌクレオチドとそのＤＮＡまたはＲ ＮＡとは、それぞれの分子中の十分な数の対応する位置が互いに水素結合しうる ヌクレオチドユニットにより占められる場合、互いに相補的である。すなわち、 ”特異的にハイブリダイズしうる”および”相補的”とは、オリゴヌクレオチド と標的ＲＮＡまたはＤＮＡとの間に安定かつ特異的な結合が生ずるような十分な 程度の相補性を示すために用いられる用語である。オリゴヌクレオチドが特異的 にハイブリダイズしうるためには、その標的ＤＮＡ配列に１００％相補的である 必要はないことが理解されるであろう。オリゴヌクレオチドの標的ＲＮＡまたは ＤＮＡ分子への結合が標的ＲＮＡまたはＤＮＡの正常な機能を妨害し、かつ特異 的結合が望まれる条件、例えば、インビボアッセイまたは治療処置の場合には生 理学的条件下で、またはインビトロアッセイの場合にはアッセイを行う条件下で 、オリゴヌクレオチドの非標的配列に対する非特異的結合を回避するのに十分な 程度の相補性がある場合、オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズするこ とができる。 特に、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の米国特許出願（本発明の譲受人 に譲渡されている）中に明記されているように、治療において、診断として、お よび研究のために用いることができる。これらの出願は次の表題を有する：Ｃｏ ｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｏｄｕｌａｔｉｎ ｇ ＲＮＡ Ａｃｔｉｖｉｔｙ、１９９０年１月１１日出願の第４６３，３５８ 号；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｉｎｈｉｂｉｔ ｏｒｓ ｏｆ Ｐａｐｉｌｌｏｍａ Ｖｉｒｕｓ、１９８９年１２月４日出願の 第４４５，１９６号；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｆｏｒ Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ、１９９０年２月２６日出願の第４８５，２９７号；Ｒｅａｇｅｎｔ ｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｅｘ ｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｈｒｏｕｇｈ ＲＮＡ Ｍｉｍｉｃｒｙ、１９９０年３月 ２１日出願の第４９７，０９０号；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｏｄｕ ｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、，１９９０年４月３ ０日出願の第５１６，９６９号；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏ ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，１９９０年８月１６日出願の第５６８，３ ６６号；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａ ｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ、１９９０年５月１１日出 願の第５２１，９０７号；Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｐｙｒｉｍ ｉｄｉｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、１９９０年７ 月２７日出願の第５５８，８０６号；Ｎｏｖｅｌ Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ Ｃｏｎ ｊｕｇａｔｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９０年７月２７日出 願の第５５８，６６３号；Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅ ｓｓｉｏｎ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ＲＮＡ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１９９０年５月４日出願の第５１８ ，９２９号；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ、１９９０年８月１４日出願の第５６７，２８６号 ；Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ、１９９ ０年８月１４日出願の第５６７，２８７号；Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａ ｎｄｉｄａ、１９９０年８月１６日出願の第５６８，６７２号；およびＡｎｔｉ ｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ、１９９０年１２月３日出願のＰＣＴ／ＵＳ９０ ／０７０６７号。これらの特許出願は、オリゴヌクレオチドの相互作用によりＲ ＮＡおよびＤＮＡの活性の改良された調節を行うことのできる多くの手段を開示 している。上記特許出願中に開示される特定の配列を本発明とともに使用しうる 点において、上記米国特許出願の開示内容を本明細書の一部としてここに引用す る。 以下の実施例は例示であり、本発明を限定するものではない。実施例１ すべてＳｐのまたはすべてＲｐの５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）ヌク レオシドの単離 ５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）デオキシヌクレオシドおよびリボヌ クレオシドは、ＯＤＳ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ（Ｓｈａｎｄｏｎ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ，Ｒｕｎｃｏｎ，ＵＫ）を充填したカラムを用い、溶媒Ａ（５ｍＭのテトラブチ ルアンモニウムイオンを含む３０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０）および溶媒 Ｂ（５ｍＭ水酸化テトラブチルアンモニウムのメタノール溶液）のアイソクラチ ック混合物で溶出するＣ−１８逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に より単離される。あるいは、２０分間で０％から１５％のアセトニトリルの直線 濃度勾配変化を含む１００ｍＭ炭酸水素トリエチルアンモニウム、ｐＨ７．５、 を用いると効果的な分離が達成される。 そのようなＨＰＬＣで分離したエナンチオマーの純度を確認するため、ＨＰＬ Ｃで分離されたＳｐおよびＲｐデオキシヌクレオチドエナンチオマーを、Ｅ．Ｉ ．Ｄｕｐｏｎｔ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥから市販品として入手可能なデオ キシヌクレオシド５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）類と比較する。実施例２ ラセミ体ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの実質的にすべてＲｐの糖間結 合を有するホスホロチオエート伸長物の合成 ラセミ体ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドプライマーのすべてＲｐのホ スホロチオエート伸長物の酵素的合成は、修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼＩ，シー クエナーゼ（ＳｅｑｕｅｎａｓｅTM）（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃ ｏｒｐ．Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を用いて行う。このＴ７ＤＮＡポリメラー ゼを用いて、２１ｍｅｒの天然のホスホジエステルオリゴヌクレオチドにハイブ リダイズした１８ｍｅｒホスホロチオエートオリゴヌクレオチドプライマーを伸 長させる。３０ピコモル（ｐｍｏｌ）のプライマーおよびテンプレートを含む１ ＸシークエナーゼTM反応緩衝液（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）（最終用量１０μｌ）を９５℃で５分間加熱し 、室温までゆっくり冷却する。１８０ｐｍｏｌのデオキシ５’−［α−35Ｓ］シ チジントリホスフェートおよびシークエナーゼTM酵素（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を加え、３７℃で２０分 間インキュベートする。生成物を、２０％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿 素変性ゲルを用いるポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分析す る。生成物のオートラジオグラフをプライマー／テンプレートなしの対照反応と 比較する。最終生成物を、例えば、酵素的分解によりさらに特性決定する。その ような分解の１つは、ヘビ毒ホスファターゼ分解である。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ ポリメラーゼＩを用いて合成したジヌクレオシドモノホスホロチオエートのヘビ 毒ホスファターゼ分解は、ジヌクレオシドがＲｐコンフィギュレーションである ことを示す。実施例３ 実質的に純粋なＲｐ糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチド CGACTATGCAAGTAC（配列番号１３）の合成 配列特異的なすべてＲｐのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの大規模な 酵素的合成は、５５ｍｅｒの天然ホスホジエステルテンプレートおよび４１ｍｅ ｒの天然ホスホジエステルプライマーを用いて行った。テンプレート配列は： GTACTTGCATAGTCGATCGGAAAATAGGGTTCTCATCTCCCGGGATTTGGTTTGAG （配列番号１４）であった。プライマー配列は、 CTCAACCAAATCCCGGGAGATGAGAACCCTATTTTCCGATC （配列番号１５）であった。テンプレートは所望の特異的配列 CGACTATGCAAGTAC（配列番号１３）に相補的な配列を有するように選択された。 ５×から１×に希釈されたシークエナーゼTM緩衝液（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を使用した。テンプレート およびプライマーを両方とも２０ｎＭの濃度で４０μＬのこの緩衝液に加えた。 テンプレートおよびプライマーを９５℃で５分間ハイブリダイズさせ、室温まで 冷却した。緩衝液を冷却後、緩衝液を７ｍＭＤＴＴに調整した。次に、２０μＬ の１：８希釈シークエナーゼTM酵素および各々３２０μＭのＳｐのＧＴＰαＳ， ＣＴＰαＳ，ＡＴＰαＳおよびＴＴＰαＳを加えた。反応溶液はＨ2Ｏにより１ ４０μＬに調整した。反応液を３７℃で１８時間インキュベートした。反応溶液 を常法通り等量のフェノールで２回抽出し、常法通り−２０℃で２．５容量の１ ００％エタノールで処理することにより沈殿させ、ペレット化し、５００μＬの ７０％エタノールで洗浄し、再びペレット化して乾燥した。沈殿を３０分間２０ μＬのＨ2Ｏに懸濁し、次に４０μＬのＨ2Ｏ中１ｍＭ ＣａＣｌ2，２５ｍＭト リスＨＣｌ，ｐＨ８．０に調整した。この溶液を９５℃に５分間維持し、急冷し た（すなわち、氷で非常に急速に冷却した）。４．６μＭ ＤＮａｓｅ Ｉを加 え、３７℃で１０分間インキュベートすることにより、合成されたオリゴヌクレ オチドからテンプレートおよびプライマーを除去した。反応混合物をフェノール で２回抽出し、上記のごとくエタノールで沈殿させた。沈殿をＨ2Ｏに再懸濁し 、ＳｅｐＰａｋTMクロマトグラフィー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｍｉｌｆｏｒｄ， ＭＡ）と組み合わせた２０％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲル電気泳動を用い て精製した。 別の合成法においては、ＰｓｔＩ制限ヌクレアーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、プライ マー結合ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを制限部位で切断した。所望の ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドCGACTATGCAAGTAC（配列番号１３）は、 ＳｅｐＰａｋTMクロマトグラフィー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍ Ａ）と組み合わせたポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲル電気泳動を用いて精製し た。反応を通しての反復テンプレート−プライマー付加により影響される酵素的 カスケードを用いて、収率を最適化した。カスケード増加合成により２０ｍｌの 反応液から７５ Ａ260単位のすべてＲｐのコンフィギュレーションホスホロチ オエートオリゴヌクレオチドCGACTATGCAAGTAC（配列番号１３）を得た。実施例４ 自動化ＤＮＡ合成を用いての、糖間結合のラセミ体混合物を有するホスホロチオ エートオリゴヌクレオチドの合成 オリゴヌクレオチドは、常法により水素ホスホネート化学を用いる自動化ＤＮ Ａ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ モデル３８０Ｂ）で合成し た［Ａｇｒａｗａｌｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ． Ｓ．Ａ．，８５：７０７９（１９８８）］。最終カップリング工程後、結合オリ ゴマーを二硫化炭素／トリエチルアミン／ピリジン中イオウで酸化することによ りホスホロチオエート結合を発生させた。イオウ酸化後、水酸化アンモニウムに よる標準脱保護法を使用して支持体からオリゴヌクレオチドを解離させ、塩基保 護基を除去した。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチ ド精製カラム（ＯＰＣ；ＡＢＩ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）クロマトグラフ ィーおよびＨＰＬＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ ＨＰＬＣを用 いて）により精製した。ＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドは、続いてエタノール で沈殿させ、２０％アクリルアミド／７Ｍ尿素上のゲル電気泳動または分析用Ｈ ＰＬＣにより最終純度を評価した。オリゴヌクレオチド配列の確実性は、ピリジ ン／水中でのヨウ素酸化および標準配列決定法により評価した。これらのオリゴ ヌクレオチドは、各々のリン結合において全ての可能なＲｐおよびＳｐ異性体の 組合せの混合物を含む。実施例５ 熱力学的および速度論的ハイブリダイゼーション分析のためのＴ７ＲＮＡポリメ ラーゼを用いる相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の合成 天然ホスホジエステル結合の短い相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドの合成は、 ＡＢＩモデル３８０ＢＤＮＡ合成機による標準自動化合成を利用して実施した。 正しい長さのオリゴヌクレオチドをＨＰＬＣにより精製し、標準技術により配列 決定した。 Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ハイブリダイゼーション分析のための短 い相補的ＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。短いＲＮＡを合成するのに必要 とされる多くのサイクルの開始のために高濃度で多量のＴ７ ＲＮＡポリメラー ゼが必要であった。この必要性のため、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ Ｒ ＮＡポリメラーゼ発現ベクター、ＢＬ２１／ｐＡＲ１２１９を含む大腸菌株（Ｂ ｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕｐｔｏｎ， ＮＹから入手された）から得た。２Ｌの細胞からの単離により約３００，０００ から５００，０００単位のＴ７ＲＮＡポリメラーゼが得られた。吸光度値＝１． ２Ａ600。これを短い（１０−３０ヌクレオチド）ＲＮＡ種の合成のため十分に 濃縮した。合成のため、ＡＢＩ合成機（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ ）を用いてＴ７プロモーター、および相補的標的配列およびＴ７プロモーターハ イブリダイゼーション配列を含むテンプレートを合成した。テンプレートおよび プロモーターをＨＰＬＣにより精製し、酵素的合成のために正しい化学種が存 在することを確実にした。合成された生成物を２０％ポリアクリルアミド／８Ｍ 尿素ゲル上で精製し、常法により配列決定した。実施例６ 熱変性 オリゴヌクレオチド（本発明のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたは その他のもの）は、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドとともに、各 々のオリゴヌクレオチドに対し４μＭの標準濃度で１００ｍＭのイオン強度緩衝 液（８９．８ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．０，０．２ ｍＭ ＥＤＴＡ）中でインキュベートした。試料を９０℃に加熱し、Ｇｕｉｌｆ ｏｒｄ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ＩＩ分光光度計（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて最初の 吸光度を測定した。次に試料を徐々に１５℃まで冷却し、熱変性過程の間２６０ ｎｍで吸光度の変化をモニターした。温度を１度ずつ上げて吸光度を読み、融解 曲線の一次導関数をとって変性プロフィールを分析した。データはまたＴｍおよ びデルタＧを決定するため２相線形回帰分析を用いて分析した。これらの試験の 結果は表１に示されている。 実施例７ 放射性標識オリゴヌクレオチドの合成 種々のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの結合ストリンジェンシーを定 量するため、フィルター結合アッセイを利用した。すなわち、これらがＤＮＡま たはＲＮＡとハイブリダイズして、ヘテロデュープレックスを形成する傾向を定 量した。これらのアッセイは放射性標識オリゴヌクレオチドを必要とする。 すべてＲｐの糖間結合を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓ ｐモノマーから精製された［35Ｓ］−モノマーから酵素的方法により合成した。 キラル混合糖間結合を含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの自動合成の ために、水素ホスホネートを含むオリゴヌクレオチドを合成し、次にピリジン／ 二硫化炭素混合物中で元素状［35Ｓ］存在下で硫化した。得られた放射性標識ホ スホロチオエートオリゴヌクレオチドはＯＰＣクロマトグラフィーおよびＨＰ ＬＣにより精製することができる。標的ｍＲＮＡをニトロセルロースフィルター に適用し、８０℃で２時間焼き、ブロッキングし、続いて放射性標識ホスホロチ オエートオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた。結合ストリンジェンシー は、温度を高くした後または溶出緩衝液（例えばトリスＮａＣｌ緩衝液）のイオ ン強度を増加させた後にフィルターから溶出された放射性標識オリゴヌクレオチ ドを定量することにより評価した。溶出されたオリゴヌクレオチドはまた、アイ ソクラチックリン酸緩衝液を利用したアニオン交換ＨＰＬＣプロトコールにおけ るそれらの移動度によっても評価した。結果を、糖間結合のラセミ体混合物を有 するように製造された標準オリゴヌクレオチドの移動度と比較した。実施例８ ヌクレアーゼ消化 １０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む培地中でのホスホロチオエートオリゴヌ クレオチドのヌクレアーゼ分解速度の決定は、１０％熱不活性化ＦＣＳを含むダ ルベッコ改良必須培地（ＤＭＥＭ）中で実施した。培地に添加する前に５５℃で １時間ＦＣＳの熱不活性化を実施した。ラセミ体およびキラル的に純粋な糖間結 合を有するオリゴヌクレオチドについて、別々にヌクレアーゼ消化に対する耐性 を試験した。各々６６μｇ／ｍｌのオリゴヌクレオチドを別々に培地に添加し、 表２に示した時間間隔で３７℃でインキュベートした。１５μｌのアリコートを とり、１５μｌの９Ｍ尿素を含む０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），０． １Ｍホウ酸および２ｍＭＥＤＴＡに加えた。アリコートをボルテックスにより混 合し、−２０℃で保存した。２０％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素スラブゲル上 でポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析を行った。電気泳動後“Ｓ ｔａｉｎｓ Ａｌｌ”（Ｓｉｇｍａ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍ Ｏ）を用いてゲルを染色した。脱染色後、ゲルをＵｌｔｒａＳｃａｎ ＸＬ装置 （Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｕｐｐｓａｌａ ，Ｓｗｅｄｅｕ）を用いたレーザーデンシトメトリーにより分析した。積分を実 施し、データはインキュベーション前の完全長（ｎ）からｎ−１へのパーセント 減少値として表した。Ｒｐのキラル的に純粋な糖間結合を有するオリゴヌクレオ チド配列CGACTATGCAAGTAC（配列番号６）についての結果を表２に示す。 表２から明らかなように、実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホ ロチオエートオリゴヌクレオチドは、ラセミ体糖間結合を有するホスホロチオエ ートオリゴヌクレオチドよりもより高いヌクレアーゼ消化耐性を示した。実施例９ ＲＮａｓｅ Ｈ分析 ラセミ体の、および実質的にキラル的に純粋な糖間結合を有するホスホロチオ エートのＲＮａｓｅ Ｈに対する感受性を分析した。オリゴヌクレオチド（ＲＮ Ａに対し２倍モル過剰）および５μｇ（３．１ｋｂ）のインビトロで合成された ｍＲＮＡ（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを用いて）を５μｌのＲＮａｓ ｅ Ｈハイブリダイゼーション緩衝液中６０℃にて３０分間インキュベートした 。試料を徐々に室温まで冷却し、次に３．７ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ，２０ユニット のＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ Ｈ（Ｐｒｏｍｅｇａ），１４２ｍＭ ＤＴＴ，１ ５０ｍＭ ＫＣｌおよび３ｍＭ ＭｇＣｌ2に調節した。試料は３７℃で３０分 間 インキュベートした。次に試料をフェノール抽出、エタノール沈殿させ、１．２ ％アガロースゲルでの電気泳動、続いてのエチジウムブロミド染色により分析し た。ＲＮＡ試料のおおよその長さを決定するため、試料と同時にマーカーをゲル に流した。実施例１０ ＨＣＶにより引き起こされる肝炎に罹患した患者を、それぞれ実施例３または 実施例１９の方法にしたがって合成した、オリゴ＃２５９（配列番号１）、オリ ゴ＃２６０（配列番号２）、オリゴ２７０（配列番号３）、オリゴ＃３３０（配 列番号４）またはオリゴ３４０（配列番号５）で処置する。１−１０００μｇ／ ｋｇ体重のオリゴヌクレオチドを薬学的に許容しうる担体中に取り込ませ、静脈 内または筋肉内投与する。処置は、疾患が除去されるまで必要に応じて反復する ことができる。実施例１１ ＩＣＡＭ−１により媒介される炎症性疾患に罹患した患者をＩＳＩＳ−２３０ ２、すなわち実施例３または実施例１９にしたがって合成され、配列GCCCAAGCTG GCATCCGTCA（配列番号６）を有するオリゴヌクレオチドで処置する。１−１００ ０μｇ／ｋg体重のオリゴヌクレオチドを薬学的に許容しうる担体中に取り込ま せ、静脈内または筋肉内投与する。処置は、疾患が除去されるまで必要に応じて 反復することができる。実施例１２ サイトメガロウイルスにより引き起こされる網膜炎に罹患した患者を、ＩＳＩ Ｓ−２９２２、すなわち実施例３または実施例１９にしたがって合成され、配列 GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG（配列番号７）を有するオリゴヌクレオチドで処置する 、１−１０００μｇ／ｋｇ体重のオリゴヌクレオチドを薬学的に許容しうる担体 中に取り込ませ、硝子内（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌｌｙ）投与する。処置は、 感染が除去されるまで必要に応じて反復することができる。実施例１３ ＰＫＣ−α−媒介性癌に罹患した患者を、ＩＳＩＳ−３５２１、すなわち実施 例３または実施例１９にしたがって合成され、配列GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA（配 列番号８）を有するオリゴヌクレオチドで処置する。１−１０００μｇ／ｋｇ体 重のオリゴヌクレオチドを薬学的に許容しうる担体中に取り込ませ、静脈内また は筋肉内投与する。処置は、疾患が除去されるまで必要に応じて反復することが できる。実施例１４ Ｃ−ｒａｆキナーゼ−媒介性癌に罹患した患者を、ＩＳＩＳ−５１３２、すな わち実施例３または実施例１９にしたがって合成され、配列TCCCGCCTGTGACATGCA TT（配列番号９）を有するオリゴヌクレオチドで処置する。１−１０００μｇ／ ｋｇ体重のオリゴヌクレオチドを薬学的に許容しうる担体中に取り込ませ、静脈 内または筋肉内投与する。処置は、疾患が除去されるまで必要に応じて反復する ことができる。実施例１５ Ｃ−ｒａｆキナーゼ−媒介性癌に罹患した患者を、それぞれ実施例３または実 施例１９にしたがって合成したＩＳＩＳ−２５０３（配列番号１０）、ＩＳＩＳ −２５７０（配列番号１１）またはＩＳＩＳ−６９５７（配列番号１２）を有す るオリゴヌクレオチドで処置する。１−１０００μｇ／ｋｇ体重のオリゴヌクレ オチドを薬学的に許容しうる担体中に取り込ませ、静脈内または筋肉内投与する 。処置は、疾患が除去されるまで必要に応じて反復することができる。 それぞれ実施例１６、１７および１８の化合物１、２および３は、Ｓｔｅｃ ｅｔ ａｌ．［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：５８８３（１９ ９１）］およびＳｔｅｃ ａｎｄ Ｌｅｓｎｉｋｏｗｓｋｉ［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ，Ｅｄ．，Ｖ ｏｌｕｍｅ２０、ｐ．２８５，１９９３）の方法にしたがって合成した。実施例１６ ２−クロロ−１，３，２−オキサチアホスホラン（１）の合成 ピリジン（１ｍｏｌ）、ベンゼン（４００ｍＬ）、２−メルカプトエタノール （０．５ｍｏｌ）および三塩化リン（０．５ｍｏｌ）の混合物を室温で３０分間 撹拌する。塩化ピリジニウムを濾別し、溶媒を減圧下に蒸発させ、粗生成物を減 圧下の蒸留により精製する。７０−７２℃／２０ｍｍＨｇで沸騰する画分を回収 し、31Ｐ ＮＭＲにより特性決定する。実施例１７ Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−１，３，２−オキサチアホスホラン（２）の合 成 化合物１（０．２ｍｏｌ）をｎ−ペンタン（３００ｍＬ）に溶解し、ジイソプ ロピルアミン（０．４ｍｏｌ）を滴加する。反応混合物を室温で３０分間撹拌し 、その後ジイソプロピルアミン塩酸塩を濾別し、溶媒を減圧下に蒸発させて、粗 生成物を真空蒸留により精製する。生成物２は、７０℃／０．１ｍｍＨｇで沸騰 する画分として得られ、これを31Ｐ ＮＭＲおよび質量分析により特性決定する 。実施例１８ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン−３’−Ｏ−［２−チオノ−１，３，２ −オキサチアホスホラン］（３）の合成 ５’−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン（１０ｍｍｏｌ）および１Ｈ−テトラ ゾール（１１ｍｍｏｌ）を真空乾燥し、ジクロロメタン（２５ｍＬ）に溶解する 。化合物２（１１ｍｍｏｌ）を溶液に加え、反応混合物を室温で２時間撹拌する 。乾燥元素イオウ（１５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で１６時間撹拌し 、放置する。次に未反応イオウを濾別し、濾液を減圧下に濃縮する。残渣をクロ ロホルム（３ｍＬ）に溶解し、シリカゲル（２３０−４００メッシュ）カラムク ロマトグラフィーにより精製し、最初にクロロホルム、次にクロロホルム：メタ ノール（９７：３）で溶出する。シリカゲル上のカラムクロマトグラフィーによ り化合物３の別々のジアステレオマー種を得る。化合物３を酢酸エチルに溶解し 、シリカゲル６０Ｈカラムに負荷する。酢酸エチルを溶出溶媒として用い、溶出 はＨＰＴＬＣ（シリカゲル６０、展開溶媒として酢酸エチル）によりモニターす る。化合物３の分離されたジアステレオマーを含む画分を減圧下に濃縮し、残渣 を31Ｐ ＮＭＲおよびＨＰＬＣ（Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｓｉ１００、５μＭ 、溶出剤として酢酸エチル、流速３ｍＬ／分）により特性決定する。早い溶出画 分はＳｐジアステレオマーに対応し、遅い溶出画分はＲｐジアステレオマーであ る。実施例１９ 固相自動化合成における５’−ＯＨヌクレオシドとジアステレオマー的に純粋な 化合物３との反応の立体特異的制御 Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）モ デル３８０Ｂ自動化ＤＮＡ合成機を用いて、Ｓｔｅｃらの方法にしたがった。５ ’−ＯＨヌクレオシドとジアステレオマー的に純粋なヌクレオシドオキサチアホ スホラン、例えば化合物３との間の反応は、触媒として１，８−ジアザビシクロ （５．４．０）ウンデセ−７−エン（ＤＢＵ）の使用を必要とする。自動化ＤＮ Ａ合成においてオリゴヌクレオチドを支持体マトリックスに結合するために用い られる市販のリンカーはＤＢＵに対して不安定であるため、リンカーにおける修 飾が必要である。オキサチアホスホラン法によるオリゴヌクレオチド合成のため の適当なリンカーは、ＤＢＵに耐性であり、濃水酸化アンモニウムにより室温で １時間以内に加水分解することができる”コハク酸−サルコシニル”リンカーで ある。 （Ａ）”コハク酸−サルコシニル”リンカーを用いる、固体マトリックスに結合 した５’−Ｏ−ジメトキシトリチルヌクレオシドの合成 （１）Ｎ−Ｆｍｏｃ−サルコシン（Ｂａｃｈｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉ ｎｃ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）（１．６ｍｍｏｌ）を長鎖アルキル アミン−ＣＰＧ（ＬＣＡ−ＣＰＧ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（２ ｇ）に加え、真空下に乾燥した。無水ＤＭＦ（５ｍＬ）、ピリジン（０．５ｍＬ ）およびＤＣＣ（２．４ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で１２時間振盪し た。次に溶媒を濾別し、支持体をメタノール：アセトニトリル：ピリジン（１： １：１、３ｘ２０ｍＬ）で洗浄した。支持体をピリジン中のピペリジンの１０％ 溶液１０ｍＬで処理することにより、Ｎ−Ｆｍｏｃ保護基を除去した。Ｎ−サル コシニル化ＬＣＡ−ＣＰＧをメタノール：アセトニトリル：ピリジン（１：１： １、３ｘ２０ｍＬ）で洗浄し、真空下に乾燥した。 （２）５’−Ｏ−ジメトキシトリチルヌクレオシドを、ＤＭＦ（２ｍＬ）、ピ リジン（０．２ｍＬ）およびＤＣＣ（５０ｍｇ）の存在下に、（１）に記載のよ うにして得たサルコシニル化ＬＣＡ−ＣＰＧに加えた。反応混合物を室温で１２ 時間振盪し、次にメタノール：アセトニトリル：ピリジン（１：１：１、３ｘ２ ０ｍＬ）で洗浄した。乾燥後、支持体をＮ−メチルイミダゾール：ＴＨＦ（１ｍ Ｌ）および無水酢酸／ルチジン（１ｍＬ）で１５分間処理した。次に、支持体を メタノール：アセトニトリル：ピリジン（１：１：１、３ｘ１０ｍＬ）、続いて アセトニトリル（３ｘ１０ｍＬ）で洗浄し、次に真空下に乾燥した。 （Ｂ）次に、ジアステレオマー的に純粋な活性化ヌクレオシドを、３００倍モル 過剰のＤＢＵの存在下に、サルコシニルＬＣＡ−ＣＰＧ支持体に結合したオリゴ ヌクレオチドの上に加えた。活性化ヌクレオシドのジアステレオマーは、カップ リング反応において用いる前に、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル６０Ｈ 、溶出溶媒として酢酸エチルを用いる、溶出はＨＰＴＬＣ（シリカゲル６０、展 開溶媒として酢酸エチル）によりモニターした］で精製した。合成プロトコルは 表３に示される。 ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのジアステレオマー純度は、31Ｐ Ｎ ＭＲにより、ＨＰＬＣ（Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｓｉ１００、５ＡＭ、溶出剤 として酢酸エチル、流速３ｍＬ／分）により、酵素的に、または電気泳動法によ り判定することができる。実施例２０ ヒト患者における疾患状態の治療 本発明のオリゴヌクレオチドは、種々の疾患状態の治療に用いることができる 。特定の疾患状態であると診断された患者の治療は、薬学的に許容される処方中 の有効用量のオリゴヌクレオチドを適当な経路で患者に投与することを含む。有 効なオリゴヌクレオチド用量は、治療すべき疾患状態、疾患状態の重篤度および 治療される患者の年齢に依存する。オリゴヌクレオチドの有効用量はそのＩＣ50 に基づいて決定することができ、これは当業者には日常的な方法である。あるい は、オリゴマーの有効用量は、薬物動態学ソフトウエアプログラムＴｏｐＦｉｔ を用いることにより決定することができる。例えば、オリゴヌクレオチドの用量 は、疾患状態の進行に依存して、体重１ｋｇあたり０．０１μｇ（子供用）から １００ｇ（成人用）まで様々である。同様に、投与の頻度は、疾患状態の進行に 依存し、１日１回またはそれ以上から、２０年に１度まで様々であろう。 オリゴヌクレオチド投与の経路は、治療すべき疾患状態による。例えば、炎症 性疾患について処置される患者へのオリゴヌクレオチドの投与は、経口または直 腸経路で行うことができる。ＡＩＤＳに苦しむ患者の処置の場合には、オリゴヌ クレオチド投与の最も有効な方法は、経口経路または皮下注射によるものであろ う。癌、例えば乳癌は、皮下注射により処置することができ、一方、結腸癌はオ リゴヌクレオチドの経口または直腸投与により処置することができる。中枢神経 系の疾患または疾病は、オリゴヌクレオチドを患者の脊柱または脳に送達するた めに、髄腔内または脳室内投与により最もよく処置されるであろう。 オリゴヌクレオチド投与に続き、患者を疾患状態に伴う症状の緩和についてモ ニターすることができる。次に、疾患状態の重篤度および処置に対する反応性に より、用量を調節（増加または減少）することができる。 本発明のオリゴヌクレオチドを他の伝統的治療と組み合わせて投与することが 好ましいであろう。オリゴヌクレオチドは、ＡＩＤＳに苦しむ患者の治療のため のＡＺＴ、炎症性疾患、例えば潰瘍性大腸炎の治療のためのスルファサラジン（ ｓｕｌｆａｓａｌａｚｉｎｅ）、および結腸癌の治療のための５−フルオロウラ シル等の薬剤と組み合わせて投与することができるが、これらに限定されない。 また、疾患状態について治療が成功した患者に維持療法を投与することが望ま しいであろう。維持投与計画の一部としてのオリゴヌクレオチド投与の用量およ び頻度は、体重１ｋｇあたり０．０１μｇから１００ｇで、１日１回またはそれ 以上から数年に１回まで様々である。実施例２１ オリゴヌクレオチドの脳室内投与 薬剤を患者の脳に直接送達するための脳室内薬剤投与は、脳を苦しめる疾患を 有する患者の治療に望ましいであろう。このオリゴヌクレオチド投与のモードを 行うために、シリコンカテーテルを外科手術でヒト患者の脳の脳室内に導入し、 これを腹部に外科手術で移植した皮下注入ポンプ（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ Ｉｎｃ ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に接続する［Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒ ｃｈ，４４：１６９８（１９８４）］。ポンプを用いてオリゴヌクレオチドを注 入し、外部プログラミング装置の補助によって正確な用量調節および用量スケジ ュールの変更を行う。ポンプの貯蔵器容量は１８−２０ｍＬであり、注入速度は ０．１ｍＬ／ｈから１ｍＬ／ｈの範囲であろう。毎日から毎月の投与の頻度およ び投与すべき薬剤の体重１ｋｇあたり０．０１μｇから１００ｇの範囲の用量に 依存して、ポンプ貯蔵器は、３−１０週間間隔で補充することができる。ポンプ の補充は、ポンプの自己密封性隔膜を経皮的に穿剌することにより行われる。実施例２２ オリゴヌクレオチドの髄腔内投与 患者の脊柱に薬剤を導入するための髄腔内薬剤投与は、中枢神経系の疾患を有 する患者の治療に望ましいであろう。このオリゴヌクレオチド投与の経路を行う ためには、シリコンカテーテルを外科手術でヒト患者のＬ３−４腰椎脊柱空間中 に移植し、これを上部腹部に外科手術で移植した皮下注入ポンプに接続する［Ｔ ｈｅ Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ，２７：９１２ （１９９３）およびＣａｎｃｅｒ，４１：１２７０（１９９３）］。ポンプを用 いてオリゴヌクレオチドを注入し、外部プログラミング装置の補助によって正確 な用量調節および用量スケジュールの変更を行う。ポンプの貯蔵器容量は１８− ２０ｍＬであり、注入速度は０．１ｍＬ／ｈから１ｍＬ／ｈの範囲であろう。毎 日から毎月の投与の頻度および投与すべき薬剤の体重１ｋｇあたり０．０１μｇ から１００ｇの範囲の用量に依存して、ポンプ貯蔵器は、３−１０週間間隔で補 充することができる。ポンプの補充は、ポンプの自己密封性隔膜を経皮的に１回 穿剌することにより行われる。実施例２３ ＡＩＤＳに罹患した患者を、ＩＳＩＳ−５３２０、すなわち実施例３または実 施例１９にしたがって合成し、配列TTGGGGTT（配列番号１７）を有するオリゴヌ クレオチドで処置する。体重１ｋｇあたり１−１０００μｇのオリゴヌクレオチ ドを薬学的に許容しうる担体中に取り込ませ、硝子内投与する。処置は、感染が 除去されるまで必要に応じて反復することができる。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION     Oligonucleotides with high chiral purity phosphorothioate linkagesCross Reference of Related Applications   This application is based on U.S. patent application Ser. No. 08/297, filed Aug. 29, 1994. 703 is a continuation-in-part application, filed October 16, 1991, This is a continuation-in-part of U.S. Patent Application No. 07 / 777,007. This application US Patent Application No. 08 / 058,023 filed May 5, 1993 A continuation-in-part application, which is a US patent application Ser. 7 / 777,670 (May 18, 1993 as US Pat. No. 5,212,295) ), Which is part of US patent application Ser. No. 07 / 777,007. It is a continuation application. Each of the above patent applications is assigned to the assignee of the present invention. The entire disclosure of each application is incorporated herein by reference.Field of the invention   The present invention provides a sequence-specific phosphorothioate containing nucleosides linked by intersugar linkages. Oate oligonucleotides and their synthesis and use. More details In particular, the intersugar linkage connecting the nucleosides of the oligonucleotide of the present invention is substantially A purely all-Sp or all-Rp chiral phosphorothioate linkage. You. Such oligonucleotides are produced by chemical or enzymatic synthesis. You. They are particularly well suited as diagnostic, therapeutic and research reagents.Background of the Invention   Oligonucleotide hybridizes to single-stranded RNA or single-stranded DNA It is known. Hybridization is based on the bases of the oligonucleotide. A sequence-specific base pair hydrogen bond to a base of the target RNA or DNA. Like that Base pairs are said to be complementary to each other.   For determining the degree of hybridization of oligonucleotides to complementary nucleic acids In some cases, the relative ability of an oligonucleotide to bind a complementary nucleic acid The comparison can be made by measuring the melting temperature of the hybridization complex. it can. Melting temperature (Tm) is a physical property characteristic of a double helix. 5 (Hybridized) vs. Coiled (unhybridized) It represents the temperature (° C.) present at a ratio of 0%. Tm is high using the UV spectrum. Determined by determining the formation and collapse (melting) of hybridization complexes Is done. The base stacking that occurs during hybridization is due to UV absorption (Lightening). Thus, a decrease in UV absorption indicates a higher Tm. The higher the Tm, the greater the bond strength between the chains.   Target RNA using intracellular enzyme RNase H using oligonucleotide Can be performed enzymatically. Mechanism of such RNase H cleavage Indicates that the 2'-deoxyribofuranosyl oligonucleotide hybridizes to the target RNA. You need to soy. The resulting DNA-RNA duplex is RN Activates the ase H enzyme, and the activated enzyme cleaves the RNA strand. RNA strand Cleavage disrupts the normal function of the target RNA. Phosphorothioate oligonuc Leotide works by this type of mechanism. However, DNA oligonucleotides In order for leotide to be useful for cellular activation of RNase H, oligonucleotide Otides survive in cells for a time sufficient for RNase H activation, and It must be reasonably stable against lyse. Non-cellular uses, such as Oligonu In the use of nucleotides as research reagents, such nuclease stability Would not be necessary.   Some publications by Walder et al. Describe RNase H and oligonucleotides. The interaction with is described. Of particular interest are: (1) Dag le et al. , Nucleic Acids Research 199 0, 18, 4751; (2) Dagle et al. , Antisense Research And Development 1991, 1, 11; 3) Eder et al. , J. et al. Biol. Chem. 1991, 266, 6 472; and (4) Dagle et al. , Nucleic Acids   Research 1991, 19, 1805. According to these publications, Modified phosphodiester internucleoside linkages and modified phosphorothioate nucleosides DNA oligonucleotides that have both internucleotide linkages are cellular RNase H Substrate. Since these are substrates, the target RNA is Activate cleavage. However, the author further states that Xenopus s) In the embryo, both phosphodiester and phosphorothioate linkages Note that it also undergoes exonuclease degradation. Such a nucleus Degradation rapidly depletes oligonucleotides available for RNase H activation It is harmful.   As described in references (1), (2) and (4), the RNase H activity Stabilizes oligonucleotides against nuclease degradation with conjugation For phosphoramidates, alkyl phosphonates or phosphotriesters With a short section of phosphodiester-linked nucleotides located between the sections of A 2'-deoxyoligonucleotide was constructed. Contains phosphoramidate Since the oligonucleotide was stabilized against exonuclease, the In tribute (4), the authors argue that each phosphoramidate linkage is Causes a 1.6 ° C drop in the measured Tm value of the midate-containing oligonucleotide It is noted that it did. Such a decrease in Tm value is caused by the oligonucleotide and its Shows a decrease in hybridization between the target nucleic acid strand and the target nucleic acid strand.   Oligonucleotide applications as diagnostics, research reagents, and therapeutics include Gonucleotides are transported across cell membranes or taken up by cells Properly hybridizing to the target RNA or DNA, and subsequently It is necessary to stop or destroy nucleic acid function. These essential features are part Depends on the initial stability of the oligonucleotide to nuclease degradation You. In addition, these functions can be used to target oligonucleotides to target RNA or DNA molecules. Depends on the specificity of the leotide.   Serious deficiencies for these purposes of oligonucleotides are intracellular and cellular. Susceptible to enzymatic degradation by various ubiquitous nucleases That is. Unmodified, "wild-type" oligonucleotides are converted to nucleases It is not useful as a therapeutic because it is more rapidly degraded. Therefore, Modification of oligonucleotides to confer ase resistance It was a major focus of research aimed at developing treatment and diagnostics.   Modification of oligonucleotides to enhance nuclease resistance generally involves It has been performed in the sugar-phosphate backbone, especially on the phosphorus atom. Phosphorothioate Are reported to be resistant to nucleases. Furthermore, phosphorothioe The oligonucleotides generally are naturally occurring phosphodiester oligonucleotides More chemically more stable. Phosphorothioate oligonucleotides can also be Shows solubility in aqueous medium. In addition, phosphorothioate oligonucleotides -RNA heteroduplex acts as a substrate for foreign RNase H Can be In addition, phosphorothioate oligonucleotides have high thermal power Shows chemical stability. However, if the oligonucleotide is not The ability to bind with certainty depends on hybridization to target RNA or DNA. Although important to the oligonucleotide, modifications at the phosphorus atom of the oligonucleotide Demonstrates varying degrees of nuclease resistance, but generally poor hybridization Have the drawback of a non-linear characteristic [Cohen, J. et al. S. , Ed. , Oligonuc leoteides: Antisense Inhibitors of Gen e Expression (CRC Press, Inc., Boca Rat) on, FL, 1989].   The reason for this poor hybridization is due to the prochiral nature of the phosphorus atom. There will be. Modification at the internal phosphorus atom of the modified phosphorus oligonucleotide is Generates Rp and Sp stereoisomers.   Modified phosphorus oligos obtained to date where the resulting molecule has an asymmetric substituent The nucleotide is 2nPieces (n is between phosphorothioate sugars in the oligonucleotide) (Equal to the number of bonds). Therefore, 14 A 15-mer phosphorothioate oligonucleotide containing two asymmetric centers is 214That is, it contains 16,384 diastereomers. From this perspective, racemic In the mixture, only a small percentage of oligonucleotides have sufficient affinity Seems to specifically hybridize to target mRNA or DNA .   Chemically synthesized phosphorothioates with chirally pure intersugar linkages. Ligonucleotides have so far been characterized by one or two diastereomers Limited to molecules with only intersugar linkages. Has chirally pure intersugar linkages Oligonucleotide synthesis has not yet been achieved by automated synthesis. For example, a chemically synthesized library of sequence-specific phosphorothioate oligonucleotides The effect of chirality introduced in the semi-mixture was not evaluated until recently. this is, This is because sulfur is incorporated non-stereospecifically during automated synthesis. For example, S tec et al. , J. et al. Chromatography, 326: 263 ( 1985) discloses certain oligonucleotide phosphorothiomers having racemic intersugar linkages. Oate was synthesized, but with one or at most two diastereomeric phosphorus Clarify diastereomers of certain small oligomers with bonds Only came.   However, Stec et al. [Nucleic Acids Res. , 19: 5883 (1991)], followed by automated stereocontrolled synthesis of oligonucleotides. Reported. The method described in the above-mentioned literature is based on a pentavalent phosphorothioyl center. Nucleophilic substitution catalyzed by bases in   Synthesis of phosphorothioates containing all Rp intersugar linkages using enzymatic methods Has been studied by several authors [Burgers and Ecks tein, J .; Biological Chemistry, 254: 6889 (1979); Gupta et al. , J. et al. Biol. Chem. , 256 : 7689 (1982); Brody and Frey, Biochemist. ry, 20: 1245 (1981); and Eckstein and Jobi. n, Biochemistry, 2: 4546 (1983)]. Brody et al. ( Biochemistry, 21: 2570 (1982)], and Roman iuk and Eckstein [J. Biol. Chem. , 257: 7684 (1982)] enzymatically convert poly TpA and poly ApT phosphorothioate Synthesized. Burgers and Eckstein [Proc. Natl. Ac ad. Sci. U. S. A. , 75: 4798 (1978)]. Suphorothioate was synthesized enzymatically. Cruse et al. [J. Mol. Biol. , 192: 891 (1986)] disclose three diastereomeric Rp GpC proteins. Hexathiothioate dimer linked by a natural phosphodiester bond Summer.   The relative ability of an oligonucleotide to bind to a complementary nucleic acid depends on the specific hybrid The comparison can be made by measuring the melting temperature of the isomerization complex. Melting temperature (Tm) is a physical property characteristic of a double helix, Represents the temperature (° C.) at which the il form (unhybridized) is present at 50%. T m is the hybridization formation and collapse (melting) using the UV spectrum. ) Is determined. Bases generated during hybridization Is accompanied by a reduction in UV absorption (lightening). Therefore, UV absorption A decrease indicates a higher Tm. The higher the Tm, the stronger the bond strength between the chains Will be larger. Non-Watson-Crick base pairs are strongly destabilizing to Tm Has an effect.   Preliminary report [Stec, J. et al. W. , Oligonucleotides as   Antisense Inhibitors of Gene Express session: Therapeutic Implications, Meetin g abstracts, June 18-21, 1989] Of two thymidine methyl phosphonates linked by a phosphodiester bond of All but one of the intersugar linkages have modified phosphate linkages Steric configuration of thymidine homopolymer octamer ("other than one") An "except one" Sp solid configuration has been formed. One Except for all Rp “other than one” methylphosphonate sequences which have an intersugar bond of Rp Specific thymidine homooctamer, ie (dT)8Is a 15-mer deoxyadenosine Homopolymer, ie (dA)FifteenAnd "except one" Sp configuration A similar thymidine homopolymer with a thiomethylphosphonate linkage, i.e. D (T) having all but one sp-sugar linkageFifteenAnd d (A)FifteenFormed by Thermodynamically more stable hybrid (Tm <O ° C.) (Tm 38 ° C.). The natural phosphodiester bond Have (dT)8Ie, octatimidylic acid and d (A)FifteenHybrid between Is reported to have a Tm of 14 ° C.   More recently, Ueda et al. [Nucleic Acids Research , 19: 547 (1991)] describes Rp diasters for use in translation systems. Les Enzymatic synthesis of mRNA intermittently incorporating omeric phosphorothioate linkages did. Ueda et al. Reported 17 promoters for T7 RNA polymerase and T7 coliphan DNA with one stop site was used. T7 RNA polymer In vitro synthesis by ribonuclease has been used for mRNAs with hundreds to tens of thousands of nucleotides. Generated.   Backbone chirality can also be attributed to phosphorothioate oligonucleotide-RNA heterogeneity. Will affect duplex susceptibility to RNase H activity . RNase H is an RNA-DNA oligonucleotide heteroduplex RNase H has been suggested to cause cleavage of RNA components in The ability to serve as a template for has significant therapeutic implications. Rp and For oligonucleotides containing a racemic mixture of Sp intersugar linkages, all oligonucleotides Suphorothioate oligonucleotides function equally as substrates for RNase H It is not known whether it can be done. Phosphodies of nucleic acids for various catalytic reactions The hydrolysis of the ter backbone is based on a stereospecific mechanism (in-line mechanism) and It proceeds by reversing the configuration. Therefore, for racemic mixtures , Correct chirality for maximum hybridization efficiency and translation termination Will only be present in a small percentage. You That is, it can serve as a substrate for RNase H in a heteroduplex. Increase the percentage of phosphorothioate oligonucleotides That would lead to more effective compounds for antisense therapy.   Substantially chirally pure to increase the certainty of hybridization High demand for phosphorothioate oligonucleotides with smart intersugar linkages I have. In addition, phosphoryls having such substantially chirally pure intersugar linkages Thioate oligonucleotides will lead to more effective therapeutic compounds. However, so far, there has been little success in synthesizing such molecules. . Accordingly, phosphorothioates having substantially chirally pure intersugar linkages A simple method for synthesizing oligonucleotides is highly desirable.   Nuclease resistance of oligonucleotides in the development of oligonucleotide therapy It is recognized that sex and hybridization certainty are very important Came. Oligonucleotides with nuclease resistance are also used as research reagents and diagnostics. It is also desired as a drug withdrawal.Summary of the Invention   In accordance with the present invention, all nucleoside units are substantially all Sp Phosphorothioate intersugar linkage or substantially all Rp phosphorothioate sugars Phosphorothioate oligonucleotides linked together by any of the interlinks Otide is provided. Preferably, the phosphorothioate oligonucleotide of the invention The tide is complementary to at least a portion of the sequence of the target RNA or DNA.   Further, in accordance with the present invention, a system having substantially chirally pure intersugar linkages. Chemical and enzymatic synthesis of column-specific phosphorothioate oligonucleotides A method is provided. Here, the phosphorothioate oligonucleotide is actually Together either qualitatively all of the Rp or substantially all of the Sp Consisting of at least 10 nucleoside units linked to Preferably, Suphorothioate oligonucleotides are capable of providing substantially chirally pure intersugar linkages. Consisting of about 10 to about 50 more linked nucleoside units. More preferred The phosphorothioate oligonucleotide is substantially chirally pure Consisting of about 15 to about 30 nucleoside units linked by an intersugar linkage. Most Also preferably, said phosphorothioate oligonucleotide is substantially chiral. From about 17 to 21 nucleoside units linked by an essentially pure sugar linkage Become. The method uses all four of the sequence primer, template, and excess Of a chirally pure nucleoside 5'-O- (1-thiotriphosphate) Including combining. The method further comprises the addition and subsequent addition of a polymerase. Cleavage of the primer from the complementary oligonucleotide will result in a complementary oligonucleotide. And synthesizing leotide. Further, the method comprises the complementary oligonucleotide. Dissociating the oxide from the template.   Sequence-specific phosphorothioates with substantially chirally pure intersugar linkages. In another embodiment of the method of the present invention for synthesizing a oligonucleotide, the sequence primer , Template and nucleoside 5'-O- (1-thiotriphosphate) Combine the racemic mixture of It has a substantially chirally pure intersugar linkage and A phosphorothioate oligonucleotide that is complementary to the template is It is synthesized by adding the enzyme and selected metal ions. Like this The synthesized oligonucleotide is dissociated from the template and primer. Let   Phosphorothioate oligonucleotides with substantially chirally pure intersugar linkages Otide is a heteroduplex formed with target RNA and DNA It is useful for increasing the thermodynamic stability of E.g. Furthermore, the oligonucleotides of the present invention are useful for modulating the activity of RNA. You.Detailed description of the invention   The phosphorus atom in the phosphodiester bond of the oligonucleotide is a "prochiral" It can be said that. When the non-bonded oxygen atom of the phosphodiester bond is substituted or Is modified to produce a chiral sugar-phosphate linkage. The resulting sugar linkage is S It is either a p-to-sugar linkage or an Rp-to-sugar linkage. Natural phosphodiester linkage Displacing the unbound oxygen atom of with sulfur to give a phosphorothioate linkage gives the chiral A center is formed, giving Sp and Rp diastereomers. Phosphorus atom in sugar backbone Are substantially all Sp or Rp. Called pure.   Ribonucleoside-5'-O- (1-thiotriphosphate) (NTPαS) And 2'-deoxyribonucleoside-5'-O- (1-thiotriphosphate G) (dNTPαS) is described in Ludwig and Eckstein [J. Org. Chem. , 631 (1989)], and racemic Sp and Rp. Synthesized as a mixture. In this exemplary synthetic scheme, the unprotected nucleo Is converted to 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one Which phosphitylates the 5'-hydroxyl group. Following Pyrophos Reaction with phosphate induces cyclic triphosphates that are reactive towards sulfur. A conductor is formed and the Rp and Sp nucleosides 5'-O- (1-thiotriphospho ), Ie a mixture of α-thiotriphosphates. The product For example, purification by DEAE-Sephadex chromatography, NMR Identification using optical analysis (by characteristic Rp or Sp chemical shift) it can.   As shown in the examples below, pure Rp and Sp nucleoside-5'- The O- (1-thiotriphosphate) diastereomer can be produced, for example, by reversed-phase HPLC. It can be easily isolated on a production scale using chromatography. like this Nucleotide diastereomers isolated by simple HPLC can And Sp nucleoside 5'-O- (1-thiotriphosphate) diastereomer Can be further characterized by analytical HPLC comparison with commercial samples of   Sequence-specific natural oligonucleotides, i.e. natural phosphodiester Enzymatic synthesis of oligonucleotides is suitable in the presence of templates and primers. It can be performed by using an appropriate nuclease. Similarly, chirally mixed Racemic mixing of phosphorothioate oligonucleotides with combined intersugar linkages Can be synthesized. According to the invention, such an enzymatic synthesis is Enantiomerically pure in the presence of column-specific templates and primers All Sp or all Rp nucleosides 5'-O- (1-thiotriphosphine Is used as a substrate for a suitable nuclease, thereby providing substantially chiral Sequence-Specific Phosphorothioate Oligonucleotides with Pure Intersugar Bonds Can be further developed to include the synthesis of For example, commercially available DNA poly Sequenase, a meraseTM(U.S. Biochemical, Inc. , Cleveland, OH). Nucleotide Templates and Racemic Phosphorothioate Oligonucleotides Can be used to synthesize phosphorothioate oligonucleotides it can. By using this polymerase, phosphodiester and phosphodiester Both rothioate primers can be extended.   The yield of enzymatically synthesized phosphorothioate oligonucleotides is Repeat polymerase by repeatedly adding rates and primers By repeatedly adding the nucleoside triphosphate, Or to optimize by combining some or all of these Can be. For example, repeated addition of template and primer The maximum cascade yield is maximized. Further optimization is done with templates and Pre-hybridization with the immersion buffer in the system buffer, followed by cooling And by adding a nucleoside triphosphate and a polymerase. Wear.   Select the appropriate polymerase to allow DNA or RNA phosphorothioate Gonucleotides can be produced. Such polymerases include T 7 DNA polymerase, a modified T7 DNA polymerase, such as those discussed above. QuenaseTM, E .; coli DNA polymerase, DNA polyklenowra Fragment polymerase, M.P. Luteus polymerase, T4 tap Teriophage polymerase, modified T4 DNA polymerase, T7 RNA polymer Lase and E. coli RNA polymerase, but not necessarily Are not restricted.   Enzymatic synthesis involves the configuration of a phosphorus atom around a chiral center. Proceed with reversal. That is, use of all α-thiotriphosphates of Sp. Use yields phosphorothioate oligonucleotides of substantially all Rp , The use of all Rp α-thiotriphosphates results in substantially all of the Sp A phosphorothioate oligonucleotide results. In another aspect of the invention, Phosphorothioate oligonucleotides use metal ions in the reaction solution Promotes preferential uptake of one or the other chiral α-thiotriphosphate To form a nucleoside-5'-O- (1-thiotriphosphate) It can be synthesized from a racemic mixture. As mentioned above, phosphorothioate Oligonucleotide polymerase synthesis involves the precursor nucleoside-α-thiotri With a reversal of configuration around the chiral center of the phosphate Achieved. While not wishing to be bound by theory, all of Rp's The optimization of the configuration is described, for example, in E. Reaction using E. coli polymerase This can be achieved by adding high concentrations of magnesium ions in the buffer. It is thought that. Similarly, while not wishing to be bound by theory again, All Sp configurations have high manganese ion in reaction buffer. It is thought that it can be obtained by using the ion concentration.   According to the invention, "substantially all" means at least 75% of the sugar linkages Is meant to include all oligonucleotides that are chirally pure. More preferably, it has about 85% to about 100% chirally pure intersugar linkages. Oligonucleotides are substantially chirally pure. Most preferably, about 9 Oligonucleotides with 5% to about 100% chirally pure intersugar linkages are Is substantially chirally pure.   In the context of the present invention, the term "phosphorothioate oligonucleotide" refers to Phosphorothio formed from naturally occurring bases, sugars and phosphorothioate linkages Oate oligonucleotides. Naturally occurring bases include adenine and guani , Cytosine, thymine and uracil. Natural sugars include β-D-ribo Includes furanosyl and β-D-2'-deoxy-erythro-pentofuranosyl. It is. "Phosphorothioate oligonucleotides" also include nucleoside-5 ' -O- (1-thiotriphosphate) analogs are suitable substrates for polymerases To some extent, the phosphorothioate nucleotide unit of the oligonucleotide. Modified sugars or modified bases incorporated into the sugars. Oligo of the invention Modified bases of nucleotides include adenine, guanine, cytosine, uracil Thymine, xanthine, hypoxanthine, 2-aminoadenine, 6-methyl, 2 -Propyl and other alkyl-adenines, 5-halouracil, 5-halocytosine 6-azauracil, 6-azacytosine and 6-azathymine, pseudoura Syl, 4-thiouracil, 8-haloadenine, 8-aminoadenine, 8-thio- Luadenine, 8-thiolalkyladenine, 8-hydroxyl adenine and Other 8-substituted adenine, 8-haloguanine, 8-aminoguanine, 8-thiol Guanine, 8-thiolalkylguanine, 8-hydroxylguanine and others 8-Substituted guanines, other aza and deazauracils, other aza and deazachi Midines, other aza and deazacytosine, other aza and deazaadenine, other Aza and deazaguanine, 5-trifluoromethyluracil and 5-trif Luorocytosine is included. The sugar component can be either deoxyribose or ribose. There may be. The oligonucleotides of the present invention can also be modified nucleobases or Other modifications consistent with the spirit of the invention, especially as therapeutic, diagnostic or research reagents Easily To include a nucleobase having a modification that increases its nuclease resistance Is also good. Oligonucleotides of the invention are used as diagnostic, therapeutic and research reagents can do. These can be used to treat an effective amount of the oligonucleotide of the invention with a suitable drug. For use in pharmaceutical compositions by adding to a biologically acceptable diluent or carrier. Can be These are further characterized by the undesired production of proteins. Can be used to treat an organism having a disease of interest. Organisms, desirably Has a sequence that can specifically hybridize with the target nucleic acid The oligonucleotide of the present invention.   Formulation of the therapeutic composition and its subsequent administration is well within the skill of the artisan. Conceivable. Generally, for treatment, it is primarily intended for patients in need of such treatment. The oligonucleotide according to the invention is treated, usually in a pharmaceutically acceptable carrier. Depending on the age of the patient being treated and the severity of the disease state, 0.0 Administer doses ranging from 1 μg to 100 g. In addition, treatment plans may Duration, which will vary depending on the characteristics of the patient, its severity, and the patient's overall condition. It can be extended from once a day to once every few years. After the procedure, the patient is For changes in the status of the disease and for relief of symptoms of the disease condition. Patient is present Increase the oligonucleotide dose if it does not respond significantly to the current dose level Or if relief of symptoms of the disease state is observed, or If the condition is eliminated, the dose can be reduced.   The oligos of the present invention, optionally in combination with other traditional therapeutic modalities, It may be more effective to treat the patient with the nucleotide.   Dosage may be adjusted for several days until healing occurs or reduction in disease state is achieved. The course of treatment for up to several months depends on the severity and responsiveness of the condition to be treated. Most Dosage schedules can be calculated from measurements of drug accumulation in the patient's body. Wear. Persons of ordinary skill can easily determine optimum dosages, dosing methodologies and repetition rates. . Optimal doses will vary depending on the relative potency of the individual oligonucleotides, Has been found to be effective in vitro and in vivo in animal models. C50Can be estimated based on Generally, the dose is 0.0 1 μg to 100 g, once a day or more, once a week, once a month To Given once or once a year, or once every few years.   Following a successful treatment, the oligonucleotide should be given a weight of 1 to prevent recurrence of the disease state. 0.01 μg to 100 g per kg, once a day or more, once every several years It may be desirable to provide maintenance therapy to the patient at a maintenance dose in a range of times.   Pharmaceutical compositions of the invention may be used to determine whether local or systemic treatment is desired and It can be administered in a number of ways depending on the area to be treated. Administration is Topical (including ophthalmic, vaginal, rectal, nasal), oral or parenteral be able to. For parenteral administration, intravenous infusion, subcutaneous, intraperitoneal or intramuscular injection, Or intrathecal or intraventricular icular) administration.   Formulations for topical administration include transdermal patches, ointments, lotions, creams, Gels, drops, suppositories, sprays, solutions and powders may be included. Normal Pharmaceutical carriers, aqueous, powder or oily bases, thickeners, etc. are necessary or desirable There will be. Coated condoms, gloves, etc. may also be useful.   Compositions for oral administration include powders, granules, suspending agents in water or non-aqueous media Or a solution, capsule, sachet, or tablet. Thickening agent, aroma Agents, diluents, emulsifiers, dispersing aids or binders may be desired.   Compositions for intrathecal or intraventricular administration include buffers, diluents and other Sterile aqueous solutions that may contain suitable additives are included.   Formulations for parenteral administration include buffers, diluents and other suitable additives. Sterile aqueous solutions that may be included are included.   The phosphorothioate oligonucleotide of the present invention can be used for hybridization. , For their effects on nuclease resistance and RNase H activity, Natural phosphodiester oligonucleotides and racemic phosphorothioates Can be compared to both nucleotides. Similarly, substantially chirally pure Pure phosphorothioate oligonucleotides with a unique intersugar linkage The ability to increase the effectiveness of the treatment in a test system can be assessed. Increasing the efficacy of such treatments may include pharmacokinetics or metabolism, toxicology, (I.e. absorption and distribution) and species comparisons.   Homopolymers with all Rp or all Sp intersugar linkages have stability and And was useful for the first study of other characteristics. However, these oligonucleotides Tides have little therapeutic use because they are not specific to target molecules. target In order to specifically hybridize to a nucleic acid, a phosphorothio having a specific sequence is required. Eate oligonucleotides are required.   Sequence-specific phosphorothioates with substantially chirally pure intersugar linkages. Ligonucleotides heat the heteroduplex with target RNA and DNA. Useful for increasing mechanical stability and conferring RNase H activity.   Using radiolabels, phosphorothiones with substantially chirally pure intersugar linkages It can aid in the identification of oate oligonucleotides. Synthesize with an automated synthesizer Racemic phosphorothioate oligonucleotides For the oxidation reaction of the obtained hydrogen phosphonate oligomer,35S] (radioactive label Elemental sulfur). Enzymatically synthesized phosphorothioe Labeling of the oligonucleotide is [α-32P] ATP and ligase Or [α-35S] can be performed using ATP . In addition, radiolabeled nucleoside triphosphates can be probed and sequenced. Can be used in analysis. Autoradiograms are created in a standard way. It is.   The template of the present invention comprises a region of a nucleic acid sequence that directs the synthesis of a disease enhancing protein. Is most preferred. For the region of the template oligonucleotide Short oligonucleotides that form base pairs with each other Acts as a primer forming the starting point for leotide synthesis.   Phosphorothioate oligonucleotides with substantially chirally pure intersugar linkages Otides are susceptible to nuclease cleavage, e.g., restriction endonuclease cleavage. Can be synthesized using primers selected to have a site on it it can. The cleavage site may be located at the 3 'end of the primer. Suitable Cleavage at the site by the appropriate restriction endonuclease results in the first 5 ' An oligonucleotide is obtained from which the terminal nucleoside is obtained from the primer. Departure Another nucleoside of said phosphorothioate oligonucleotide is enzymatically Nucleoside chiral thiotriphosphate added by means.   By selecting an appropriate restriction nuclease with the selected primers The various 5'-terminal nucleosides of the desired phosphorothioate oligonucleotide Can be appropriately placed at the 5 'end of the phosphorothioate nucleotide. You. That is, one nucleoside from the primer is newly A newly synthesized sequence-specific phosphorothioate oligonucleotide of the present invention Design any endonuclease recognition site as long as it is the first 5 'nucleoside Can be This results in the enzymatically synthesized phosphorothioe of the present invention. Various nucleosides are generated at the 5 'end of the salt oligonucleotide.   Complete the enzymatic extension of the primer on the appropriate template of the desired sequence Then, by using an appropriate nuclease, the phosphorothioate of the present invention can be used. Ligonucleotides can be eliminated from the primer. For example, desired A guanosine nucleoside at the 5 'end of the phosphorothioate oligonucleotide Using a primer having the sequence CTGCAG at the 3 'end Can be Next, by using Pst1 restriction nuclease, A-G The bond can be broken. Therefore, the guanosine nucleotide of this AG bond The osidic component is the 5 'terminal nucleic acid of the desired phosphorothioate oligonucleotide. It can be incorporated as an osid. Other restriction endonucleases include But not limited, BamH1, Smal and HinD III restriction endonucleases There is creatase.   The oligonucleotide still associated with the template, And then, for example, by gel electrophoresis and / or chromatography. Therefore, it can be purified. For example, a suitable purification is SepPac (Mill standard in combination with ipore, Milford, MA) chromatography Polyacrylamide / urea gel electrophoresis. Use Another useful chromatography technique is HPLC chromatography.   The chiral phosphorothioate oligonucleotides of the present invention also include t al. [Nucleic Acids Res. , 19: 5883 (199 1)] and Stec and Lesnikowski (Methods i n Molecular Biology, S.M. Agrawal, Ed. , Vo lume 20, p. 285, 1993]. It can be chemically synthesized via a xathiaphosphorane intermediate.   Having substantially chirally pure intersugar linkages synthesized according to the methods of the present invention. Phosphorothioate oligonucleotides can be analyzed by a number of methods. Can be. For example, the resulting substantially chirally pure all Sp or sulfur Sequence-specific phosphorothioate oligonucleotides having all Rp intersugar linkages The configuration analysis for31P] Judgment using NMR chemical shift be able to. Such a chemical shift is associated with the phosphorothioate dinucleotide. Used to identify Rp epimers (Ludwig and Ecks tein, J .; Org. Chem. , 631-635 (1989)].   The sequence accuracy of the phosphorothioate oligonucleotides of the present invention is Can be determined using the sensitivity of the heteroduplex to lease Wear.   The phosphorothioate oligonucleotide sequence is When the 3'-hydroxyl group of the nucleotide is [α-32P] Cordycepin triphosphate Labeled (i.e., 3'-deoxyadenosine-5'-triphosphate) By doing so, confirmation can be further enhanced. Oligonucleotide obtained The tide can also be subjected to enzymatic degradation.   Phosphorothioate oligonucleotides with substantially chirally pure intersugar linkages The relative ability of otide to bind to the complementary strand is substantially chirally pure intersugar linkage Of a phosphorothioate oligonucleotide having a nucleoside with its complementary strand The comparison can be made by measuring the melting temperature of the isomerization complex. Melting temperature (Tm) is a physical property characteristic of a double helix, Mean celsius temperature at which il form (unhybridized) is present at 50% doing. Tm is determined by hybridization formation using the UV spectrum. And decay (melting). Hybridization Intermediate base stacking is accompanied by a reduction in UV absorption (lightening). as a result , A decrease in UV absorption indicates a higher Tm. The higher the Tm, the more chain binding strength The degree is greater. Non-Watson-Crick base pair is strongly unstable to Tm Has a chemical effect. Therefore, the optimal choice of oligonucleotide for its target RNA In order to obtain binding, it is desirable that base pairs be as close to optimal accuracy as possible. No.   The phosphorothioate oligonucleotides of the present invention further include various exonucleic acids. Evaluate resistance to degradability of reases and endonucleases be able to. Treating the phosphorothioate oligonucleotide with nuclease Next, for example, electrophoresis (PAGE) using a polyacrylamide gel is performed, and the To a suitable dye [eg, Stains AllTM(Sigma Chem. C o. , St. [Lois, MO)]. Can be. Degradation products can be quantified using laser densitometry. Can be.   Substantially chirally pure intersugar linkages using fetal calf serum and human serum Nucleolysis to phosphorothioate oligonucleotides having (olitic) activity can be assessed. For example, substantially all Rp sugars Evaluation of phosphorothioate oligonucleotides with intermolecular bonds in this way can do. 3'- or 5'-end-capped molecule (1 cap Having one or several phosphorothioate linkages) Test to find the combination that produces the greatest nuclease stability be able to. Capping uses sequenced Rp monomers to cap the sequence. The cap portion is chemically synthesized, and the cap is then placed on an oligonucleotide on a DNA synthesizer. It can be carried out by incorporating it into leotide. Regarding capping Analysis shows the importance of chirality on nucleolytic stability and the maximum stability Can be determined to determine the number of bonds required to obtain   Phosphorothioate oligonucleotides for the catalytic activity of RNase H- The sensitivity of the RNA heteroduplex can also be assessed. Phosphorothio Eat oligonucleotides can be used at various hybridization temperatures with radioactive labels. Together with the identified target mRNA (eg, synthesized via T7 RNA polymerase). Can be cubated. Next, Minshul and Hunt [N uc. Acid Res. , 6433 (1986)). E., heteroduplex. 37 ° C with RNase H from E. coli Can be incubated. Next, the product was analyzed by Northern blot analysis. RNase H activity. In this method, the raw The product was electrophoresed on a 1.2% agarose / formaldehyde gel and nitrocellulose Transfer to the source. Next, a random primer complementary to the target mRNA [32P] -label Search for filters using cDNA and quantify by autoradiography I do. By comparing various phosphorothioate analogs, RNA and complex Effect on the ability to act as a substrate for RNase H when formed You can examine the effect of sexuality.   E. FIG. E. coli RNase H and mammalian RNAse H A comparison of the sensitivity of heteroduplexes can be made. Heterodue The plex was incubated in rabbit reticulocyte lysate under translational conditions. Northern blot for catalytic cleavage of mRNA by endogenous RNase H It can be assayed by analysis. This allows mammalian RNAse The effect of chirality on H activity can be examined.   Phosphorothioate oligonucleotides with substantially chirally pure intersugar linkages Otide has also been reviewed for inhibition of gene expression in cell culture model systems. Can be valued. Substantially Pure Chirally Pure Phospho with Intersugar Bonds Rothioate oligonucleotides are more potent or more specific for gene expression Designed to target a reporter gene to determine if it is an inhibitor Phosphorothioate oligonucleotides having substantially chirally pure intersugar linkages Can synthesize and test nucleotides in cell culture models of gene expression You. Effect of antisense on gene expression using vector pSV2CAT Examining has been described previously [Henthorn et al. , Proc . Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 85: 6342 (1988)]. . This vector contains the bacterial chloramphenicol under the control of the SV40 promoter. Acetyltransferase gene. Translation of CAT mRNA 15-mer phosphorothio having all Rp intersugar linkages of the initially complementary sequence D PSV2CAT was transferred to HeLa cells using a target oligonucleotide. And then all phosphorothioate oligonucleotides having an Rp intersugar linkage. Cells can be treated with otide for 48 hours to assay intracellular CAT activity. Wear. Next, a phosphorothioate having a substantially chirally pure intersugar linkage is prepared. The activity in inhibiting gene expression is determined by the use of chemicals with diastereomeric intersugar linkages. Random phosphorothioate and natural phosphodiester of the same sequence Can be directly compared to oligonucleotides.   The vector pSV2APAP [Marcus-Sekura et al. , N ucleic Acids Research, 15: 5749 (1987)] Contains the mammalian placental alkaline phosphatase gene (PAP). This is also Used as a reporter to measure the effect of antisense on gene expression Can also be used. PAP is an intron and other RNA processing signal Reporter in that it is a mammalian gene, not a bacterial gene containing As a gene, it has advantages over CAT. At present, the expression of PAP is Is thought to more closely mimic events in mammalian gene expression in . A substantially chirally pure sugar linkage, as described above for CAT mRNA 15-mer phosphorothioate oligonucleotides with similarity Racemic phosphorothioate and natural phosphodiester containing Can be examined in parallel with the oligonucleotide. PAP and CAT repo Experiments to determine non-specific effects of protein constructs on gene expression Used as a control in   In addition, phosphorothioate oligomers having substantially chirally pure intersugar linkages Gornucleotides demonstrate their ability to act as inhibitors of RNA translation in vivo. Can be evaluated. Various therapeutic fields are based on the oligonucleotide of the present invention. Can be the target of such operations. One therapeutic area is hepatitis C virus Hepatitis caused by HCV. The following phosphorothioate olives Gonucleotides have applications in the treatment of HCV hepatitis: oligo # 259, CCTTTC GCGACCCAACACTA (SEQ ID NO: 1), oligo # 260, GCCTTTCGCGACCCAACACT (sequence No. 2), oligo 270, GTACCACAAGGCCTTTCGCG (SEQ ID NO: 3), oligo # 330, GTGCTCATGGTGCACGGTCT (SEQ ID NO: 4) and oligo # 340, TTTGG ATTCGTGCTCATGG (SEQ ID NO: 5). Another therapeutic area is cell-cell adhesion molecules (ICAM- It is an inflammatory disease mediated by 1). Ori with application in the treatment of inflammatory diseases The oligonucleotides include ISIS-2302, GCCCAAGCTGGCATCCGTCA (SEQ ID NO: 6). ) Is included. Another therapeutic area is the induction by cytomegalovirus (CMV). Includes infections caused. ISIS-2922 applied for the treatment of CMV retinitis A phosphorothioate oligonucleotide having the sequence GCGTTTGCTCTTCTTC It has TTGCG (SEQ ID NO: 7). Another therapeutic area includes protein kinase C-α (P KC-α) -mediated cancers. ISIS-3521 provides such A phosphorothioate oligonucleotide having application in the treatment of cancer, having the sequence GT It has TCTCGCTGGTGAGTTTCA (SEQ ID NO: 8). Yet another therapeutic area includes Cr af kinase-mediated cancers are included. ISIS-5132 is a treatment for such cancers. A phosphorothioate oligonucleotide having application to the sequence TCCCGCCTGT GACATGCATT (SEQ ID NO: 9). Yet another therapeutic area is Ha-ras or Include cancers mediated by Ki-ras. The following phosphorothioate oligonucleotides Nucleotides have applications in the treatment of such cancers: ISIS-2503, TCCG TCATCGCTCCTCAGGG (SEQ ID NO: 10), ISIS-2570, CCACACCGACGGCGCCC (SEQ ID NO: 11), and ISIS-6957, CAGTGCCTGCGCCGCGCTCG (SEQ ID NO: No. 12). Another therapeutic area is HIV-mediated AIDS and other related Infections. ISIS-5320 is a host that has application in the treatment of AIDS. Holothioate oligonucleotide having the sequence TTGGGGTT (SEQ ID NO: 17) I do. In the above sequence, the individual nucleotide units of the oligonucleotide Are written from left to right in the 5 'to 3' direction.   In the context of the present invention, "hybridization" refers to complementary nucleotides. Means hydrogen bonds between the two units, which are Watson-Crick, Hoogstee Or an inverse Hoogsteen hydrogen bond. For example, adenine and thimi Are complementary nucleobases that pair by hydrogen bond formation. In this specification As used herein, "complementary" refers to the sequence complementarity between two nucleotide units. Also represent. For example, a nucleotide unit at a certain position on an oligonucleotide Hydrogen bond to a nucleotide unit at the same position on a DNA or RNA molecule If possible, the oligonucleotide and DNA or RNA are Are considered to be complementary to each other. Oligonucleotides and their DNA or R NA means that a sufficient number of corresponding positions in each molecule can hydrogen bond with each other When occupied by nucleotide units, they are complementary to each other. That is, "Specifically hybridizable" and "complementary" refer to oligonucleotides Sufficient for stable and specific binding to occur with the target RNA or DNA A term used to indicate a degree of complementarity. Oligonucleotide specific Must be 100% complementary to its target DNA sequence to be able to hybridize to It will be appreciated that there is no need. The target RNA of the oligonucleotide or Binding to a DNA molecule interferes with the normal function of the target RNA or DNA and is specific Conditions for which specific binding is desired, for example, in the case of in vivo assays or therapeutic treatments. Under physical conditions or, in the case of in vitro assays, the conditions under which the assay is performed Sufficient to avoid non-specific binding of oligonucleotides to non-target sequences If there is a degree of complementarity, the oligonucleotide will hybridize specifically. Can be.   In particular, the oligonucleotides of the present invention are disclosed in the following U.S. patent applications (assignee of the present invention): As a diagnostic, in the treatment, as specified in And can be used for research. These applications have the following title: Co compositions and Methods for Modultin gRNA Activity, 463,358, filed Jan. 11, 1990. No .: Antisense Oligonucleotides Inhibit ors of Papilloma Virus, filed December 4, 1989 No. 445,196; Oligonucleotide Therapies for Modulating the Effects of Herpes virus, No. 485,297, filed Feb. 26, 1990; Reagent s and Methods for Modulating Gene Ex presentation Through RNA Mimicry, March 1990. No. 497,090 filed on the 21st; Oligonucleotide Modu ration of Lipid Metabolism, April 3, 1990. No. 516,969 filed on Nov. 0; Oligonucleotides for Modulating the Effects of Cytomegalo virus Infections, filed on August 16, 1990, filed on 568,3. No. 66; Antisense Inhibitors of the Huma n Immunodeficiency Virus, published May 11, 1990 No. 521,907; Nuclease Resistant Pyrim Idine Modified Oligonucleotides for Modulation of Gene Expression, July 1990 No. 558,806 filed on Nov. 27; Novel Polyamine Con Justified Oligonucleotides, July 27, 1990 No. 558,663; Modulation of Gene Express session Through Interference with RNA Secondary Structure, No. 518, filed May 4, 1990. , No. 929; Oligonucleotide Modulation of Cell Adhesion, filed August 14, 1990, No. 567,286. Inhibition of Influenza Viruses, 199; No. 567,287 filed on Aug. 14, 0; Inhibition of Ca ndida, No. 568,672, filed August 16, 1990; and Anti. sense Oligonucleotides Inhibitors o PCT / US90, filed December 3, 1990, by Papillomavirus / 07067. These patent applications disclose the use of R Discloses many means by which improved regulation of NA and DNA activity can be achieved doing. Certain sequences disclosed in the above patent applications may be used with the present invention. In this regard, the disclosure of the above-mentioned U.S. patent application is incorporated herein by reference. You.   The following examples are illustrative and do not limit the invention.Example 1 5'-O- (1-thiotriphosphate) nucleotide of all Sp or all Rp Isolation of leoside   5'-O- (1-thiotriphosphate) deoxynucleoside and ribonucleic acid Cleosides are available from ODS Hypersil (Shandon Southern). , Runcon, UK) using solvent A (5 mM tetrabutyrate). 30 mM potassium phosphate containing luammonium ion, pH 7.0) and solvent Isocratation of B (methanol solution of 5 mM tetrabutylammonium hydroxide) C-18 reversed phase high performance liquid chromatography (HPLC) eluting with More isolated. Alternatively, a straight line from 0% to 15% acetonitrile in 20 minutes 100 mM triethylammonium bicarbonate with change in concentration gradient, pH 7.5, Effective separation is achieved with.   To confirm the purity of the separated enantiomers by such HPLC, HPL The Sp and Rp deoxynucleotide enantiomers separated by C. I . Deo available commercially from Dupont, Wilmington, DE Compare with xynucleoside 5'-O- (1-thiotriphosphate) s.Example 2 Substantially all Rp sugar linkages of racemic phosphorothioate oligonucleotides Of Phosphorothioate Extensions Having Moiety   Racemic phosphorothioate oligonucleotide primers have all Rp Enzymatic synthesis of a suorothioate extension was performed using modified T7 DNA polymerase I, C Quenase (SequenaseTM) (US Biochemicals C) orp. Cleveland, OH). This T7 DNA Polymerer Hybridase to 21-mer natural phosphodiester oligonucleotide using Extend the 18mer phosphorothioate oligonucleotide primer Lengthen. 1 containing 30 pmol of primer and template X SequenaseTMReaction buffer (US Biochemicals Corp.) . , Cleveland, OH) (final volume 10 μl) was heated at 95 ° C. for 5 minutes. Cool slowly to room temperature. 180 pmol of deoxy 5 '-[α-35S] Thidine triphosphate and sequenaseTMEnzyme (U.S. Biochem) icals Corp. , Cleveland, OH) at 37 ° C for 20 minutes Incubate for The product is treated with 20% polyacrylamide / 7 M urine Analysis by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) using a denaturing gel You. The product autoradiograph was compared to a control reaction without primer / template. Compare. The final product is further characterized, for example, by enzymatic degradation. That One such degradation is snake venom phosphatase degradation. E. FIG. coli DNA Dinucleoside monophosphorothioate snake synthesized using polymerase I Toxin phosphatase degradation shows that dinucleosides are in the Rp configuration Indicates thatExample 3 Phosphorothioate oligonucleotides having substantially pure Rp intersugar linkages Synthesis of CGACTATGCAAGTAC (SEQ ID NO: 13)   Large-scale of sequence-specific all-Rp phosphorothioate oligonucleotides Enzymatic synthesis involves the 55-mer natural phosphodiester template and 41me r using a natural phosphodiester primer of r. The template array is: GTACTTGCATAGTCGATCGGAAAATAGGGTTCTCATCTCCCGGGATTTGGTTTGAG (SEQ ID NO: 14). The primer sequence is CTCAACCAAATCCCGGGAGATGAGAACCCTATTTTCCGATC (SEQ ID NO: 15). Template is the desired specific sequence It was selected to have a sequence complementary to CGACTATGCAAGTAC (SEQ ID NO: 13). Sequenase diluted from 5 × to 1 ×TMBuffer solution (US Biochemi) cals Corp. , Cleveland, OH) was used. template And both primers were added to 40 μL of this buffer at a concentration of 20 nM. Hybridize template and primers at 95 ° C for 5 minutes and bring to room temperature Cool. After cooling the buffer, the buffer was adjusted to 7 mM DTT. Next, 20 μL 1: 8 diluted sequenaseTMGTPαS with enzyme and 320 μM Sp each, CTPαS, ATPαS and TTPαS were added. The reaction solution is HTwo1 by O Adjusted to 40 μL. The reaction was incubated at 37 ° C. for 18 hours. Reaction solution Is extracted twice with an equal amount of phenol as usual, and 2.5 volumes of 1 Precipitate by treatment with 00% ethanol, pellet, 500 μL Washed with 70% ethanol, pelleted again and dried. Settle for 20 minutes for 30 minutes μL of HTwoO, then 40 μL of HTwo1 mM CaCl in OTwo, 25 mM Squirt HCl, adjusted to pH 8.0. The solution is maintained at 95 ° C for 5 minutes, quenched (Ie, cooled very quickly with ice). 4.6 μM DNase I After incubation at 37 ° C for 10 minutes, the synthesized oligonucleotides were The template and primer were removed from the otide. Phenol the reaction mixture , And precipitated with ethanol as described above. HTwoResuspend in O , SepPakTMChromatography (Millipore, Milford, MA) with 20% polyacrylamide / 7M urea gel electrophoresis And purified.   In another synthesis, PstI restriction nuclease (Life Techno) logs, Inc. , Gaithersburg, MD). The mer-linked phosphorothioate oligonucleotide was cleaved at the restriction site. Desired The phosphorothioate oligonucleotide CGACTATGCAAGTAC (SEQ ID NO: 13) is SepPakTMChromatography (Millipore, Milford, M Purified using polyacrylamide / 7M urea gel electrophoresis in combination with A) Was. Enzymatic as affected by repeated template-primer addition throughout the reaction Cascade was used to optimize the yield. 20 ml by cascade incremental synthesis 75 A from the reaction solution260All units Rp configuration phosphoroty An oate oligonucleotide CCGACTATGCAAGTAC (SEQ ID NO: 13) was obtained.Example 4 Phosphorothio with racemic mixture of intersugar linkages using automated DNA synthesis Synthesis of Eate Oligonucleotides   Oligonucleotides can be prepared by automated DN using hydrogen phosphonate chemistry in a conventional manner. A synthesizer (Applied Biosystems model 380B) [Agrawetal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 85: 7079 (1988)]. After the final coupling process, By oxidizing the sesame with sulfur in carbon disulfide / triethylamine / pyridine A phosphorothioate linkage was generated. After sulfur oxidation, ammonium hydroxide The oligonucleotide is dissociated from the support using standard deprotection The protecting group was removed. Phosphorothioate oligonucleotides are oligonucleotide Column (OPC; ABI, Foster City, CA) chromatograph And HPLC (using Beckman System Gold HPLC) ). The HPLC-purified oligonucleotide was subsequently And gel electrophoresis on 20% acrylamide / 7 M urea or H for analysis. The final purity was evaluated by PLC. Oligonucleotide sequence certainty And iodine oxidation in water / water and standard sequencing. These oligos Nucleotides are of all possible Rp and Sp isomers at each phosphorus bond. Including mixtures of combinations.Example 5 T7 RNA Polymers for Thermodynamic and Kinetic Hybridization Analysis Synthesis of complementary DNA or RNA sequences using an enzyme   The synthesis of short complementary DNA oligonucleotides with natural phosphodiester linkages Performed using standard automated synthesis on an ABI model 380B DNA synthesizer. The correct length oligonucleotide is purified by HPLC and sequenced using standard techniques. Were determined.   Use T7 RNA polymerase to prepare short hybridization assays. New complementary RNA oligonucleotides were synthesized. Required to synthesize short RNA High concentration and large amount of T7 RNA polymerase to initiate many cycles Ze was needed. Because of this need, T7 RNA polymerase has An E. coli strain containing the NA polymerase expression vector, BL21 / pAR1219 (B Brookhaven National Laboratory, Upton, (Obtained from New York). Approximately 300,000 by isolation from 2L cells Yielded 500,000 units of T7 RNA polymerase. Absorbance value = 1. 2A600. This is sufficient for the synthesis of short (10-30 nucleotide) RNA species. Concentrated. For the synthesis, an ABI synthesizer (ABI, Foster City, CA) ) Using the T7 promoter, and the complementary target sequence and T7 promoter. A template containing the hybridization sequence was synthesized. Templates and The promoter is purified by HPLC and the correct species is present for enzymatic synthesis. To be there. Synthesized product is 20% polyacrylamide / 8M Purified on urea gel and sequenced by conventional methods.Example 6 Heat denaturation   Oligonucleotides (phosphorothioate oligonucleotides of the invention or Others) along with complementary DNA or RNA oligonucleotides 100 mM ionic strength buffer at 4 μM standard concentration for each oligonucleotide Solution (89.8 mM NaCl, 10 mM sodium phosphate, pH 7.0, 0.2 mM EDTA). Heat the sample to 90 ° C. First using an or Response II spectrophotometer (Corning) The absorbance was measured. The sample is then gradually cooled to 15 ° C. The change in absorbance was monitored in nm. Raise the temperature by 1 degree, read the absorbance and melt. The denaturation profile was analyzed by taking the first derivative of the curve. Data is also available at Tm and And Delta G were determined using two-phase linear regression analysis. Of these exams The results are shown in Table 1. Example 7 Synthesis of radiolabeled oligonucleotide   Determine binding stringency of various phosphorothioate oligonucleotides For quantification, a filter binding assay was utilized. That is, these are DNA or Or the tendency to hybridize with RNA to form heteroduplexes. Weighed. These assays require a radiolabeled oligonucleotide.   Phosphorothioate oligonucleotides having all Rp intersugar linkages are represented by S purified from p monomer [35S] -Synthesized from monomer by enzymatic method. Automatic synthesis of phosphorothioate oligonucleotides containing chiral intersugar linkages For this purpose, an oligonucleotide containing a hydrogen phosphonate was synthesized and then pyridine / Elemental in carbon disulfide mixture [35[S] in the presence. Obtained radioactive label e Suphorothioate oligonucleotides are prepared by OPC chromatography and HP It can be purified by LC. Nitrocellulose filter for target mRNA And bake at 80 ° C. for 2 hours, blocking, followed by radiolabeled phosphorothio Hybridized with oate oligonucleotide. Combined stringency Can be performed after increasing the temperature or in the elution buffer (eg, Tris NaCl buffer). Radiolabeled oligonucleotide eluted from the filter after increasing the Was evaluated by quantifying the The eluted oligonucleotide is also In an anion exchange HPLC protocol using a socratic phosphate buffer Also evaluated by their mobility. The results show that a racemic mixture of The mobility was compared with that of a standard oligonucleotide prepared as follows.Example 8 Nuclease digestion   Phosphorothioate oligonucleotides in medium containing 10% fetal calf serum (FCS) Determination of the nuclease degradation rate of nucleotides was determined by using a 10% heat inactivated Performed in Rubecco's Modified Essential Medium (DMEM). At 55 ° C before adding to the medium Thermal inactivation of FCS was performed for 1 hour. Racemic and chirally pure sugar linkages Oligonucleotides with different resistance to nuclease digestion separately Was tested. 66 μg / ml of each oligonucleotide was separately added to the medium, Incubation was performed at 37 ° C. at the time intervals shown in Table 2. Aliquots of 15 μl Take 15 μl of 0.1 M Tris-HCl (pH 8.3) containing 9 M urea, 0.1 μl. Added to 1 M boric acid and 2 mM EDTA. Mix aliquots by vortexing And stored at -20 ° C. On 20% polyacrylamide / 7M urea slab gel Was used for polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) analysis. After electrophoresis "S tins All "(Sigma. Chem. Co., St. Louis, M. The gel was stained with O). After destaining, the gel was subjected to an UltraScan XL apparatus. (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala , Swedeu) were analyzed by laser densitometry. Perform integration And data are the percentages from full length (n) to n-1 before incubation. Expressed as a decrease. Oligonucleotides with chirally pure intersugar linkages of Rp The results for the tide sequence CCGACTATGCAAGTAC (SEQ ID NO: 6) are shown in Table 2.   As is evident from Table 2, phospholipids having substantially chirally pure intersugar linkages Rothioate oligonucleotides are phosphorothioate having racemic intersugar linkages. It showed higher nuclease digestion resistance than the target oligonucleotide.Example 9 RNase H analysis   Racemic and substantially chirally pure phosphorothios with intersugar linkages Eats were analyzed for sensitivity to RNase H. Oligonucleotide (RN A 2 fold molar excess over A) and 5 μg (3.1 kb) synthesized in vitro mRNA (using T7 RNA polymerase promoter) was added to 5 μl of RNas Incubated for 30 minutes at 60 ° C. in eH hybridization buffer . The sample was gradually cooled to room temperature, then 3.7 mg / ml BSA, 20 units E. coli RNase H (Promega), 142 mM DTT, 1 50 mM KCl and 3 mM MgClTwoWas adjusted to Sample is 30 minutes at 37 ° C while Incubated. Next, the sample was extracted with phenol and precipitated with ethanol. % Agarose gel electrophoresis followed by ethidium bromide staining. Was. Gel the markers simultaneously with the sample to determine the approximate length of the RNA sample Shed.Example 10   Patients suffering from HCV-induced hepatitis were treated in Example 3 or Oligo # 259 (SEQ ID NO: 1) synthesized according to the method of Example 19, GO # 260 (SEQ ID NO: 2), oligo 270 (SEQ ID NO: 3), oligo # 330 ( Column 4) or oligo 340 (SEQ ID NO: 5). 1-1000 μg / kg of oligonucleotide is incorporated into a pharmaceutically acceptable carrier. Intramuscular or intramuscular administration. Treatment is repeated as needed until disease is eliminated be able to.Example 11   Patients suffering from inflammatory diseases mediated by ICAM-1 were treated with ISIS-230 2, ie synthesized according to Example 3 or Example 19, the sequence GCCCAAGCTG Treat with an oligonucleotide having GCATCCGTCA (SEQ ID NO: 6). 1-100 Incorporation of 0 μg / kg body weight oligonucleotide in pharmaceutically acceptable carrier And administer intravenously or intramuscularly. Treatment as needed until disease is eliminated Can be repeated.Example 12   Patients with retinitis caused by cytomegalovirus were treated with ISI S-2922, ie synthesized according to Example 3 or Example 19, the sequence Treat with oligonucleotide having GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG (SEQ ID NO: 7) Pharmaceutically acceptable carrier for oligonucleotide of 1-1000 μg / kg body weight And administered intravitreally. The treatment is It can be repeated as needed until the infection is eliminated.Example 13   Patients with PKC-α-mediated cancer were treated with ISIS-3521, Synthesized according to Example 3 or Example 19, the sequence GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA ( Treat with oligonucleotide having column number 8). 1-1000 μg / kg body The heavy oligonucleotide is incorporated into a pharmaceutically acceptable carrier and injected intravenously or Is given intramuscularly. Treatment may be repeated as necessary until disease is eliminated it can.Example 14   Patients with C-raf kinase-mediated cancer were treated with ISIS-5132, That is, the sequence TCCCGCCTGTGACATGCA was synthesized according to Example 3 or Example 19. Treat with an oligonucleotide having TT (SEQ ID NO: 9). 1-1000 μg / kg of oligonucleotide is incorporated into a pharmaceutically acceptable carrier. Intramuscular or intramuscular administration. Treatment is repeated as needed until disease is eliminated be able to.Example 15   Patients with C-raf kinase-mediated cancer were treated as in Example 3 or ISIS-2503 synthesized according to Example 19 (SEQ ID NO: 10), ISIS Has -2570 (SEQ ID NO: 11) or ISIS-6957 (SEQ ID NO: 12) Treated with an oligonucleotide. 1-1000 μg / kg body weight oligonucleotide Otide is incorporated into a pharmaceutically acceptable carrier and administered intravenously or intramuscularly . The treatment can be repeated as necessary until the disease is eliminated.   Compounds 1, 2 and 3 of Examples 16, 17 and 18, respectively, were et al. [Nucleic Acids Res. , 19: 5883 (19 91)] and Sec and Lesnikowski [Methods in Molecular Biology, S.M. Agrawal, Ed. , V olume20, p. 285, 1993).Example 16 Synthesis of 2-chloro-1,3,2-oxathiaphospholane (1)   Pyridine (1 mol), benzene (400 mL), 2-mercaptoethanol (0.5 mol) and phosphorus trichloride (0.5 mol) at room temperature for 30 minutes Stir. The pyridinium chloride is filtered off and the solvent is evaporated under reduced pressure to reduce the crude product. Purify by distillation under pressure. Collect fractions boiling at 70-72 ° C / 20mmHg And31Characterized by P NMR.Example 17 Synthesis of N, N-diisopropylamino-1,3,2-oxathiaphospholane (2) Success   Compound 1 (0.2 mol) was dissolved in n-pentane (300 mL), and Ropyramine (0.4 mol) is added dropwise. The reaction mixture is stirred at room temperature for 30 minutes Then, diisopropylamine hydrochloride was filtered off and the solvent was evaporated under reduced pressure to give a crude product. The product is purified by vacuum distillation. Product 2 boils at 70 ° C./0.1 mmHg To obtain the fraction31Characterized by P NMR and mass spectrometry .Example 18 5'-O-dimethoxytritylthymidine-3'-O- [2-thiono-1,3,2 -Oxathiaphospholane] (3)   5'-O-dimethoxytritylthymidine (10 mmol) and 1H-tetra The sol (11 mmol) is dried in vacuo and dissolved in dichloromethane (25 mL) . Compound 2 (11 mmol) is added to the solution and the reaction mixture is stirred at room temperature for 2 hours . Dry elemental sulfur (15 mmol) was added and the reaction mixture was stirred at room temperature for 16 hours. ,put. Then unreacted sulfur is filtered off and the filtrate is concentrated under reduced pressure. Residue Dissolve in chloroform (3 mL), silica gel (230-400 mesh) column Purify by chromatography, first chloroform, then chloroform: meta Elute with phenol (97: 3). By column chromatography on silica gel To give separate diastereomeric species of compound 3. Compound 3 is dissolved in ethyl acetate , Loaded on a silica gel 60H column. Elution using ethyl acetate as elution solvent Is monitored by HPTLC (silica gel 60, ethyl acetate as a developing solvent) You. The fraction containing the separated diastereomer of compound 3 was concentrated under reduced pressure to give a residue. To31P NMR and HPLC (Licrosspher Si100, 5 μM , Ethyl acetate as eluent, flow rate 3 mL / min). Fast elution The fraction corresponds to the Sp diastereomer and the late eluting fraction is the Rp diastereomer. You.Example 19 5'-OH nucleosides in solid-phase automated synthesis and diastereomerically pure Stereospecific control of the reaction with compound 3   Applied Biosystems (Foster City, CA) Using a Dell 380B automated DNA synthesizer, following the method of Stec et al. 5 '-OH nucleoside and diastereomerically pure nucleoside oxathiapho The reaction between suphoranes, for example compound 3, is carried out using 1,8-diazabicyclo as a catalyst. (5.4.0) Requires the use of undec-7-ene (DBU). Automated DN A used to bind oligonucleotides to a support matrix in synthesis Since some commercially available linkers are unstable to DBU, Decoration is required. For oligonucleotide synthesis by the oxathiaphospholane method Suitable linkers are resistant to DBU and are concentrated at room temperature with concentrated ammonium hydroxide. With a "succinic-sarcosinyl" linker that can hydrolyze within one hour is there. (A) Attached to a solid matrix using a “succinic-sarcosinyl” linker Of 5'-O-dimethoxytrityl nucleoside   (1) N-Fmoc-sarcosine (Bachem Bioscience, I nc. , Philadelphia, PA) (1.6 mmol) with long-chain alkyl Amine-CPG (LCA-CPG, Sigma, St. Louis, MO) (2 g) and dried under vacuum. Anhydrous DMF (5 mL), pyridine (0.5 mL ) And DCC (2.4 mmol) were added and the reaction mixture was shaken at room temperature for 12 hours. Was. Then the solvent was filtered off and the support was treated with methanol: acetonitrile: pyridine (1: 1). 1: 1, 3 x 20 mL). Support is 10% of piperidine in pyridine The N-Fmoc protecting group was removed by treatment with 10 mL of the solution. N-monkey The cosinylated LCA-CPG was converted to methanol: acetonitrile: pyridine (1: 1: (1, 3 x 20 mL) and dried under vacuum.   (2) 5'-O-dimethoxytrityl nucleoside was added to DMF (2 mL), As described in (1), in the presence of lysine (0.2 mL) and DCC (50 mg). Added to the sarcosinylated LCA-CPG thus obtained. The reaction mixture was cooled to room temperature for 12 hours. Shaking for an hour, then methanol: acetonitrile: pyridine (1: 1: 1, 3 × 2 0 mL). After drying, the support was washed with N-methylimidazole: THF (1 m L) and acetic anhydride / lutidine (1 mL) for 15 minutes. Next, the support Methanol: acetonitrile: pyridine (1: 1: 1, 3 × 10 mL), followed by Washed with acetonitrile (3 × 10 mL) and then dried under vacuum. (B) Next, the diastereomerically pure activated nucleoside was added at a 300-fold molar Oligos bound to a sarcosine LCA-CPG support in the presence of excess DBU Added above nucleotides. The diastereomer of the activated nucleoside is Before use in the ring reaction, column chromatography (silica gel 60H) Using ethyl acetate as the elution solvent, elution was performed using HPTLC (silica gel 60, (Ethyl acetate as open solvent). The synthesis protocol is It is shown in Table 3.   The diastereomeric purity of the phosphorothioate oligonucleotide is31P N By MR, HPLC (Licrosspher Si100, 5AM, eluent) Ethyl acetate at a flow rate of 3 mL / min), enzymatically or by electrophoresis. Can be determined.Example 20 Treatment of disease states in human patients   The oligonucleotides of the present invention can be used to treat various disease states . Treatment of a patient diagnosed with a particular disease state may take place in a pharmaceutically acceptable regimen. Administering an effective dose of the oligonucleotide to the patient by a suitable route. Yes Effective oligonucleotide doses will determine the disease state to be treated, the severity of the disease state and Depends on the age of the patient being treated. The effective dose of oligonucleotide is its IC50 Which is a routine method for those skilled in the art. There Indicates the effective dose of the oligomer is determined by the pharmacokinetic software program TopFit. Can be determined. For example, oligonucleotide dose Is from 0.01 μg / kg of body weight (for children), depending on the progress of the disease state It varies up to 100 g (for adults). Similarly, the frequency of administration will depend on the progression of the disease state. It will vary from once or more a day to once every 20 years.   The route of oligonucleotide administration will depend on the disease state to be treated. For example, inflammation Administration of oligonucleotides to patients treated for sexually transmitted diseases may be oral or direct. It can be performed by the intestinal route. In the case of treatment of patients suffering from AIDS, The most effective method of nucleotide administration may be by the oral route or by subcutaneous injection U. Cancer, for example, breast cancer, can be treated by subcutaneous injection, while colon cancer can be treated. It can be treated by oral or rectal administration of lignonucleotides. Central nervous system A system disease or disorder is one in which the oligonucleotide is delivered to the patient's spine or brain. For example, it will be best treated by intrathecal or intraventricular administration.   Following oligonucleotide administration, patients should be monitored for relief of symptoms associated with the disease state. Can be naughty. Second, the severity of the disease state and its responsiveness to treatment Thus, the dose can be adjusted (increased or decreased).   The oligonucleotides of the invention can be administered in combination with other traditional therapies. Would be preferable. Oligonucleotides for the treatment of patients suffering from AIDS AZT, sulfasalazine for the treatment of inflammatory diseases such as ulcerative colitis ( Sulfasalazine), and 5-fluoroura for the treatment of colon cancer It can be administered in combination with an agent such as sill, but is not limited thereto.   It is also desirable to administer maintenance therapy to patients who have been successfully treated for the disease state. Would be good. Dose and dose of oligonucleotide administration as part of a maintenance regimen The frequency is 0.01 μg to 100 g per kg of body weight, once a day or From the above, it varies up to once every several years.Example 21 Intraventricular administration of oligonucleotides   Intraventricular drug delivery, which delivers drugs directly to the patient's brain, can reduce brain afflictions. It would be desirable to treat patients with. This mode of oligonucleotide administration To do this, a silicone catheter was surgically introduced into the ventricle of the human patient's brain, A subcutaneous infusion pump (Medtronic Inc.) was surgically implanted in the abdomen. . , Minneapolis, MN) [Cancer Research ch, 44: 1698 (1984)]. Inject oligonucleotide using pump Accurate dose adjustment and dose scheduling with the aid of external programming equipment Make changes to the rules. The reservoir capacity of the pump is 18-20 mL and the infusion rate is It will range from 0.1 mL / h to 1 mL / h. Daily and monthly dosing frequency and Dose of the drug to be administered in the range of 0.01 μg to 100 g per kg of body weight Depending on, the pump reservoir can be refilled at 3-10 week intervals. pump Is performed by percutaneously piercing the self-sealing septum of the pump.Example 22 Intrathecal administration of oligonucleotides   Intrathecal drug delivery to introduce drugs into the patient's spine may have central nervous system disorders. It would be desirable for the treatment of patients who do. Perform this oligonucleotide administration route To achieve this, a silicone catheter is surgically placed in the L3-4 lumbar spine space of a human patient. And connected to a subcutaneous infusion pump surgically implanted in the upper abdomen [T he Annals of Pharmacotherapy, 27: 912. (1993) and Cancer, 41: 1270 (1993)]. Use pump Injection and accurate with the aid of external programming equipment Adjust dose and change dose schedule. Pump storage capacity is 18- 20 mL and infusion rates will range from 0.1 mL / h to 1 mL / h. every Frequency of administration from day to month and 0.01 μg per kg of body weight of drug to be administered Pump reservoirs may be replenished at 3-10 week intervals, depending on the dose range Can be charged. The pump is refilled once percutaneously through the self-sealing septum of the pump. It is performed by piercing.Example 23   Patients with AIDS were treated with ISIS-5320, ie, Example 3 or An oligonucleotide synthesized according to Example 19 and having the sequence TTGGGGTT (SEQ ID NO: 17) Treat with nucleotides. Oligonucleotide of 1-1000 μg / kg body weight The drug is incorporated into a pharmaceutically acceptable carrier and administered intravitreally. The treatment is It can be repeated as needed until removed.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ (31)優先権主張番号 ０８／４６８，４４７ (32)優先日 1995年６月６日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／４６８，５６９ (32)優先日 1995年６月６日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／４６９，８５１ (32)優先日 1995年６月６日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／４７０，１２９ (32)優先日 1995年６月６日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／４７１，９６６ (32)優先日 1995年６月６日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／４７１，９６７ (32)優先日 1995年６月６日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification symbol FI C07H 21/04 C07H 21/04 B (31) Priority claim number 08 / 468,447 (32) Priority date June 6, 1995 (33) Priority country United States (US) (31) Priority number 08 / 468,569 (32) Priority date June 6, 1995 (33) Priority country United States (US) (31) Priority Claim number 08 / 469,851 (32) Priority date June 6, 1995 (33) Priority claim country United States (US) (31) Priority claim number 08 / 470,129 (32) Priority date June 1995 6th (33) Priority Country United States (US) (31) Priority Number 08 / 471,966 (32) Priority Date June 6, 1995 (33) Priority Country United States (US) (31) Priority number 08 / 471,967 (32) Priority date 199 June 6, 5 (33) Priority Claimed States United States (US) (81) Designated States EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU , MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD) , SZ, UG), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD , MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, J, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号 ６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２または 配列番号１７により表され、ヌクレオシドユニットの少なくとも７５％は、Ｓｐ ホスホロチオエート３’−５’結合により一緒に結合されているオリゴヌクレオ チド。 ２．ヌクレオシドユニットのすべてがＳｐホスホロチオエート３’−５’結合に より一緒に結合されている、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。 ３．請求項１記載のオリゴヌクレオチドおよび許容しうる担体を含む組成物。 ４．配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号 ６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２または 配列番号１７により表され、ヌクレオシドユニットの少なくとも７５％は、Ｒｐ ホスホロチオエート３’−５’結合により一緒に結合されているオリゴヌクレオ チド。 ５．ヌクレオシドユニットのすべてがＲｐホスホロチオエート３’−５’結合に より一緒に結合されている、請求項４記載のオリゴヌクレオチド。 ６．請求項４記載のオリゴヌクレオチドおよび許容しうる担体を含む組成物。[Claims] 1. SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 or Represented by SEQ ID NO: 17, at least 75% of the nucleoside units have Sp Oligonucleotides linked together by phosphorothioate 3'-5 'linkages Chid. 2. All of the nucleoside units are in Sp phosphorothioate 3'-5 'linkages. 2. The oligonucleotide of claim 1, which is more joined together. 3. A composition comprising the oligonucleotide of claim 1 and an acceptable carrier. 4. SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 or Represented by SEQ ID NO: 17, at least 75% of the nucleoside units have Rp Oligonucleotides linked together by phosphorothioate 3'-5 'linkages Chid. 5. All of the nucleoside units are in Rp phosphorothioate 3'-5 'linkages. 5. The oligonucleotide of claim 4, which is more joined together. 6. A composition comprising the oligonucleotide of claim 4 and an acceptable carrier.
JP9501254A 1995-06-06 1996-06-05 Oligonucleotides with high chiral purity phosphorothioate linkages Pending JPH10510433A (en)

Applications Claiming Priority (17)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/469,851 US5587361A (en) 1991-10-15 1995-06-06 Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US08/468,569 1995-06-06
US08/467,597 1995-06-06
US08/467,597 US5607923A (en) 1991-10-15 1995-06-06 Oligonucleotides for modulating cytomegalovirus having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US08/469,851 1995-06-06
US08/466,692 US5654284A (en) 1991-10-15 1995-06-06 Oligonucleotides for modulating RAF kinase having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US08/471,967 US5599797A (en) 1991-10-15 1995-06-06 Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US08/471,966 1995-06-06
US08/470,129 1995-06-06
US08/471,967 1995-06-06
US08/471,966 US5661134A (en) 1991-10-15 1995-06-06 Oligonucleotides for modulating Ha-ras or Ki-ras having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US08/468,447 1995-06-06
US08/468,569 US5620963A (en) 1991-10-15 1995-06-06 Oligonucleotides for modulating protein kinase C having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US08/468,447 US5576302A (en) 1991-10-15 1995-06-06 Oligonucleotides for modulating hepatitis C virus having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US08/470,129 US5635488A (en) 1991-10-15 1995-06-06 Compounds having phosphorodithioate linkages of high chiral purity
US08/466,692 1995-06-06
PCT/US1996/008757 WO1996039154A1 (en) 1995-06-06 1996-06-05 Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000262871A Division JP2001103987A (en) 1995-06-06 2000-08-31 Oligonucleotide of high chiral purity bearing phosphorothioate linkage
JP2000262865A Division JP2001114798A (en) 1995-06-06 2000-08-31 Oligonucleotide having phosphorothioate bond having high chiral purity

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH10510433A true JPH10510433A (en) 1998-10-13

Family

ID=27575447

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP9501254A Pending JPH10510433A (en) 1995-06-06 1996-06-05 Oligonucleotides with high chiral purity phosphorothioate linkages
JP2000262865A Pending JP2001114798A (en) 1995-06-06 2000-08-31 Oligonucleotide having phosphorothioate bond having high chiral purity
JP2000262871A Pending JP2001103987A (en) 1995-06-06 2000-08-31 Oligonucleotide of high chiral purity bearing phosphorothioate linkage

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000262865A Pending JP2001114798A (en) 1995-06-06 2000-08-31 Oligonucleotide having phosphorothioate bond having high chiral purity
JP2000262871A Pending JP2001103987A (en) 1995-06-06 2000-08-31 Oligonucleotide of high chiral purity bearing phosphorothioate linkage

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP0831854A4 (en)
JP (3) JPH10510433A (en)
AU (1) AU698739B2 (en)
CA (1) CA2223103A1 (en)
NO (1) NO975558L (en)
WO (1) WO1996039154A1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017537644A (en) * 2014-12-16 2017-12-21 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス Screening method for chiral toxicity

Families Citing this family (165)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5744460A (en) * 1996-03-07 1998-04-28 Novartis Corporation Combination for treatment of proliferative diseases
AU8512598A (en) * 1997-07-25 1999-02-16 Hybridon, Inc. Oligonuclotides having 3' terminal stereospecific phosphorothioates
EP1067956B1 (en) 1998-04-03 2007-03-14 University Of Iowa Research Foundation Methods and products for stimulating the immune system using immunotherapeutic oligonucleotides and cytokines
US6867294B1 (en) * 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
US6242589B1 (en) * 1998-07-14 2001-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphorothioate oligonucleotides having modified internucleoside linkages
JP2002521489A (en) * 1998-07-27 2002-07-16 ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション Stereoisomers of CpG oligonucleotides and related methods
TW201006846A (en) 2000-03-07 2010-02-16 Senomyx Inc T1R taste receptor and genes encidung same
TW201022287A (en) 2001-01-03 2010-06-16 Senomyx Inc T1R taste receptors and genes encoding same
CN100400045C (en) * 2001-05-16 2008-07-09 米珍尼克斯公司 Nucleic acid-based compounds and methods of use thereof
CN100489102C (en) 2001-06-26 2009-05-20 塞诺米克斯公司 T1R hetero-oligomeric taste receptors and cell lines that express said receptors and use thereof for identification of taste compounds
US6916621B2 (en) 2002-03-27 2005-07-12 Spectral Genomics, Inc. Methods for array-based comparitive binding assays
BR0309391A (en) 2002-04-19 2005-10-25 Diversa Corp Phospholipases, nucleic acids encoding them and methods for preparing and using them
US7226771B2 (en) 2002-04-19 2007-06-05 Diversa Corporation Phospholipases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CA2515481A1 (en) 2003-02-14 2004-09-02 Biogen Idec Ma Inc. An expression cassette and vector for transient or stable expression of exogenous molecules
PL3023498T3 (en) 2003-03-06 2019-05-31 Basf Enzymes Llc Amylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CA3007908A1 (en) 2003-03-07 2005-04-14 Dsm Ip Assets B.V. Hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
WO2004090099A2 (en) 2003-04-04 2004-10-21 Diversa Corporation Pectate lyases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CN103484486B (en) 2003-07-02 2018-04-24 维莱尼姆公司 Dextranase, encode they nucleic acid and preparation and use their method
AU2004285410B2 (en) 2003-08-06 2011-04-14 Senomyx, Inc. Novel flavors, flavor modifiers, tastants, taste enhancers, umami or sweet tastants, and/or enhancers and use thereof
US7741089B2 (en) 2003-08-11 2010-06-22 Verenium Corporation Laccases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
BRPI0510939A (en) 2004-06-16 2007-07-17 Diversa Corp compositions and methods for enzymatic chlorophyll discoloration
US8821884B2 (en) 2004-07-27 2014-09-02 The Regents Of The University Of California Compositions and methods using MD-2 mutants and chimeric proteins
US20090038023A1 (en) 2005-03-10 2009-02-05 Verenium Corporation Lyase Enzymes, Nucleic Acids Encoding Them and Methods For Making and Using Them
KR101393679B1 (en) 2005-03-15 2014-05-21 비피 코포레이션 노쓰 아메리카 인코포레이티드 Cellulases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
JP2009512421A (en) 2005-08-15 2009-03-26 ヴァクシン インコーポレイテッド Immunization method for birds by non-replicating vector vaccine administration
BRPI0617057A2 (en) 2005-08-30 2011-07-12 Univ Miami isolated antibody, tumor necrosis factor 25 receptor-specific toxin (tnfr25), method for activating tumor necrosis factor 25 receptor (tnfr25), method for inhibiting tumor necrosis factor 25 receptor (tnfr25) signaling in a cell , antitumor vaccine, method for immunizing a patient against tumor, method for treating cancer in a patient, method for treating and / or preventing intestinal inflammation, therapeutic composition for facilitating an organ transplant, method for transplanting tissue from a donor to a host, method for inhibiting clonal expression of a cognate cd8 t cell population, method for treating and / or preventing pulmonary inflammation, isolated tnfr25 antagonist, composition and expression vector
ES2618858T3 (en) 2005-09-02 2017-06-22 The Regents Of The University Of California Methods and combinations of tests to detect melanoma
EP2216403A3 (en) 2006-02-02 2010-11-24 Verenium Corporation Esterases and related nucleic acids and methods
MY160772A (en) 2006-02-10 2017-03-15 Verenium Corp Cellulolytic enzymes, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
USRE45660E1 (en) 2006-02-14 2015-09-01 Bp Corporation North America Inc. Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
WO2007103389A2 (en) 2006-03-07 2007-09-13 Cargill, Incorporated Aldolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
EP2385108B1 (en) 2006-03-07 2016-11-23 BASF Enzymes LLC Aldolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
KR101387563B1 (en) 2006-04-21 2014-04-25 세노믹스, 인코포레이티드 Comestible compositions comprising high potency savory flavorants, and processes for producing them
CA2669453C (en) 2006-08-04 2018-11-13 Verenium Corporation Glucanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
HUE025544T2 (en) 2006-09-21 2016-02-29 Basf Enzymes Llc Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
PL2057274T3 (en) 2006-09-21 2014-05-30 Dsm Ip Assets Bv Phospholipases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
ES2734114T3 (en) 2006-12-21 2019-12-04 Basf Enzymes Llc Amylases and glucoamylases, nucleic acids that encode them and methods to form and use them
CN101652381B (en) 2007-01-30 2014-04-09 维莱尼姆公司 Enzymes for treatment of lignocellulosics, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CN101688201B (en) 2007-04-27 2013-08-21 加利福尼亚大学董事会 Plant CO2 sensors, nucleic acids encoding them, and methods for making and using them
JP5744518B2 (en) 2007-10-03 2015-07-08 ビーピー・コーポレーション・ノース・アメリカ・インコーポレーテッド Xylanase, nucleic acids encoding xylanase and methods for producing and using them
EP2200649A4 (en) 2007-10-19 2012-09-26 Univ California Compositions and methods for ameliorating cns inflammation, psychosis, delirium, ptsd or ptss
EP2238261B1 (en) 2008-01-03 2013-12-04 Verenium Corporation Isomerases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US8709772B2 (en) 2008-01-03 2014-04-29 Verenium Corporation Transferases and oxidoreductases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
DK2853269T3 (en) 2008-05-19 2019-08-05 Advaxis Inc Double delivery system for heterologous antigens comprising a recombinant Listeria strain attenuated by dal / dat mutation and deletion of ActA comprising a nucleic acid molecule encoding a listeriolysine O prostate-specific antigen fusion protein
US9650639B2 (en) 2008-05-19 2017-05-16 Advaxis, Inc. Dual delivery system for heterologous antigens
US9017660B2 (en) 2009-11-11 2015-04-28 Advaxis, Inc. Compositions and methods for prevention of escape mutation in the treatment of Her2/neu over-expressing tumors
WO2010019696A2 (en) 2008-08-12 2010-02-18 Allylix, Inc. Method for production of isoprenoids
US8198062B2 (en) 2008-08-29 2012-06-12 Dsm Ip Assets B.V. Hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
EP2326720B1 (en) 2008-09-15 2018-03-21 F. Hoffmann-La Roche AG Compositions and methods for regulating cell osmolarity
EP2370451B1 (en) 2008-12-02 2016-11-16 Wave Life Sciences Japan, Inc. Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
HUE028642T2 (en) 2009-04-20 2016-12-28 Galen Bio Inc Compositions for transfection of biomolecules into cells
AU2010249500B2 (en) 2009-05-21 2016-03-24 Basf Enzymes Llc Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
AU2010270714B2 (en) 2009-07-06 2015-08-13 Wave Life Sciences Ltd. Novel nucleic acid prodrugs and methods use thereof
WO2011008768A1 (en) 2009-07-13 2011-01-20 Wayne State University Modified egfr ectodomain
AU2010279637B2 (en) 2009-08-03 2012-08-23 University Of Miami Method for in vivo expansion of T regulatory cells
UA109884C2 (en) 2009-10-16 2015-10-26 A POLYPEPTIDE THAT HAS THE ACTIVITY OF THE PHOSPHATIDYLINOSYTOL-SPECIFIC PHOSPHOLIPASE C, NUCLEIC ACID, AND METHOD OF METHOD
UA111708C2 (en) 2009-10-16 2016-06-10 Бандж Ойлз, Інк. METHOD OF OIL REFINING
US20120277112A1 (en) 2009-10-19 2012-11-01 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut Predicting response to anti-cancer therapy via array comparative genomic hybridization
US20120322677A1 (en) 2009-10-19 2012-12-20 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut Predicting benefit of anti-cancer therapy via array comparative genomic hybridization
WO2011048498A2 (en) 2009-10-19 2011-04-28 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut Differentiation between brca2-associated tumours and sporadic tumours via array comparative genomic hybridization
JP2013507989A (en) 2009-10-26 2013-03-07 アボット・ラボラトリーズ Detection of chromosomal abnormalities associated with prognosis of non-small cell lung cancer
US10016617B2 (en) 2009-11-11 2018-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Combination immuno therapy and radiotherapy for the treatment of Her-2-positive cancers
JP5985397B2 (en) 2009-11-11 2016-09-06 アドバクシス インコーポレイテッド Recombinant Listeria strain and immunogenic composition containing the same
CA2798190A1 (en) 2010-05-10 2011-11-17 Abbott Laboratories Detection of chromosomal abnormalities associated with endometrial cancer
WO2012038837A2 (en) 2010-09-20 2012-03-29 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut Methods for predicting response to anti-cancer therapy in cancer patients
EP2620428B1 (en) 2010-09-24 2019-05-22 Wave Life Sciences Ltd. Asymmetric auxiliary group
WO2012138377A2 (en) 2010-10-01 2012-10-11 Trustees Of The University Of Pennsylvania The use of listeria vaccine vectors to reverse vaccine unresponsiveness in parasitically infected individuals
AR083354A1 (en) 2010-10-06 2013-02-21 Bp Corp North America Inc VARIABLE POLYPEPTIDES CBH I (CELOBIOHIDROLASAS I) WITH REDUCED PRODUCT INHIBITION
WO2012083240A2 (en) 2010-12-16 2012-06-21 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Oligonucleotide array for tissue typing
CN103687611A (en) 2011-03-11 2014-03-26 阿德瓦希斯公司 Listeria-based adjuvants
JP6128529B2 (en) 2011-07-19 2017-05-17 ウェイブ ライフ サイエンシズ リミテッドＷａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ． Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids
US8450107B1 (en) 2011-11-30 2013-05-28 The Broad Institute Inc. Nucleotide-specific recognition sequences for designer TAL effectors
US9745631B2 (en) 2011-12-20 2017-08-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for diagnosing and treating oncogenic kras-associated cancer
WO2013124740A2 (en) 2012-02-23 2013-08-29 Stichting Vu-Vumc BRCA DEFICIENCY PROTEIN AND mRNA SIGNATURES USEFUL IN IDENTIFICATION OF PATIENTS WITH BRCA-DEFICIENT TUMORS AND PREDICTING BENEFIT OF ANTI-CANCER THERAPY IN CANCER PATIENTS
WO2013138337A1 (en) 2012-03-12 2013-09-19 Advaxis Suppressor cell function inhibition following listeria vaccine treatment
EP2855698A4 (en) 2012-05-24 2016-03-30 Dana Farber Cancer Inst Inc Targeting the glutamine to pyruvate pathway for treatment of oncogenic kras-associated cancer
AU2013278070B2 (en) 2012-06-22 2019-07-11 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for mediating plant stomatal development in response to carbon dioxide and applications for engineering drought tolerance in plants
WO2014012090A1 (en) 2012-07-13 2014-01-16 The Broad Institute, Inc. Molecular sleds comprising a positively-charged amino acid sequence and a molecular cargo and uses thereof
US9617547B2 (en) 2012-07-13 2017-04-11 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant
CN104661664B (en) 2012-07-13 2020-07-03 波涛生命科学有限公司 Chiral control
EP2872485B1 (en) 2012-07-13 2020-12-16 Wave Life Sciences Ltd. Asymmetric auxiliary group
WO2014014518A1 (en) 2012-07-18 2014-01-23 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for treating, preventing and predicting risk of developing breast cancer
WO2014018423A2 (en) 2012-07-25 2014-01-30 The Broad Institute, Inc. Inducible dna binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof
ES2786193T3 (en) 2012-12-12 2020-10-09 Broad Inst Inc Genetic engineering and optimization of improved enzyme systems, methods, and compositions for sequence manipulation
US20140179770A1 (en) 2012-12-12 2014-06-26 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
EP2931899A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
PL2784162T3 (en) 2012-12-12 2016-01-29 Broad Inst Inc Engineering of systems, methods and optimized guide compositions for sequence manipulation
EP2931892B1 (en) 2012-12-12 2018-09-12 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
WO2014093655A2 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
KR20210041631A (en) 2013-01-09 2021-04-15 유니버시티 오브 마이애미 Compositions and methods for the regulation of t regulatory cells using tl1a-ig fusion protein
US11332719B2 (en) 2013-03-15 2022-05-17 The Broad Institute, Inc. Recombinant virus and preparations thereof
AU2014281030B2 (en) 2013-06-17 2020-07-09 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for targeting and modeling diseases and disorders of post mitotic cells
WO2014204724A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Delivery, engineering and optimization of tandem guide systems, methods and compositions for sequence manipulation
CA2915842C (en) 2013-06-17 2022-11-29 The Broad Institute, Inc. Delivery and use of the crispr-cas systems, vectors and compositions for hepatic targeting and therapy
KR20160034901A (en) 2013-06-17 2016-03-30 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 Optimized crispr-cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
KR20160056869A (en) 2013-06-17 2016-05-20 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using viral components
WO2015050844A1 (en) 2013-10-01 2015-04-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods of treating cancer with atovaquone-related compounds
WO2015057671A1 (en) 2013-10-14 2015-04-23 The Broad Institute, Inc. Artificial transcription factors comprising a sliding domain and uses thereof
WO2015058052A1 (en) 2013-10-18 2015-04-23 The Broad Institute Inc. Spatial and cellular mapping of biomolecules in situ by high-throughput sequencing
EP3540051B1 (en) 2013-12-12 2022-08-17 The Broad Institute, Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for hsv and viral diseases and disorders.
EP3080258A1 (en) 2013-12-12 2016-10-19 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods of use of crispr-cas systems in nucleotide repeat disorders
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
EP3080259B1 (en) 2013-12-12 2023-02-01 The Broad Institute, Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation
CN106061510B (en) 2013-12-12 2020-02-14 布罗德研究所有限公司 Delivery, use and therapeutic applications of CRISPR-CAS systems and compositions for genome editing
EP3079726B1 (en) 2013-12-12 2018-12-05 The Broad Institute, Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using particle delivery components
JPWO2015108047A1 (en) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 Chiral nucleic acid adjuvant having immunity induction activity and immunity induction activator
US10322173B2 (en) 2014-01-15 2019-06-18 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having anti-allergic activity, and anti-allergic agent
WO2015108048A1 (en) 2014-01-15 2015-07-23 株式会社新日本科学 Chiral nucleic acid adjuvant having antitumor effect and antitumor agent
CA2936712A1 (en) * 2014-01-16 2015-07-23 Meena Chiral design
RU2019119862A (en) 2014-02-20 2019-07-15 Аллерган, Инк. ANTIBODY TO C5 COMPLETE COMPONENT
CN106232624B (en) 2014-02-27 2020-01-21 阿勒根公司 Complement factor Bb antibodies
ES2824108T3 (en) 2014-03-12 2021-05-11 Icahn School Med Mount Sinai Method to identify kidney allograft recipients at risk for chronic injury
US10350264B2 (en) 2014-03-27 2019-07-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for modulating NCOA4-mediated autophagic targeting of ferritin
EP3161165B1 (en) 2014-06-26 2020-11-18 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Method for diagnosing subclinical and clinical acute rejection by analysis of predictive gene sets, therapeutic agent for use in the treatment and kits for determining the expression
CN106999561A (en) 2014-07-18 2017-08-01 阿德瓦希斯股份有限公司 Combination for treating the antagonists of PD 1 of prostate cancer and vaccine based on Listeria
EP3180426B1 (en) 2014-08-17 2019-12-25 The Broad Institute, Inc. Genome editing using cas9 nickases
WO2016049251A1 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for modeling mutations in leukocytes
WO2016049163A2 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Use and production of chd8+/- transgenic animals with behavioral phenotypes characteristic of autism spectrum disorder
WO2016049024A2 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for modeling competition of multiple cancer mutations in vivo
WO2016049258A2 (en) 2014-09-25 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Functional screening with optimized functional crispr-cas systems
WO2016094872A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Dead guides for crispr transcription factors
WO2016094880A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of crispr systems and compositions for genome editing as to hematopoietic stem cells (hscs)
WO2016094874A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Escorted and functionalized guides for crispr-cas systems
EP3889260A1 (en) 2014-12-12 2021-10-06 The Broad Institute, Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
WO2016100974A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 The Broad Institute Inc. Unbiased identification of double-strand breaks and genomic rearrangement by genome-wide insert capture sequencing
WO2016106236A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 The Broad Institute Inc. Rna-targeting system
EP3702456A1 (en) 2014-12-24 2020-09-02 The Broad Institute, Inc. Crispr having or associated with destabilization domains
WO2016108926A1 (en) 2014-12-30 2016-07-07 The Broad Institute Inc. Crispr mediated in vivo modeling and genetic screening of tumor growth and metastasis
EP3298172B1 (en) 2015-05-22 2023-07-26 The Regents of The University of California Determining risk of prostate cancer recurrence
WO2016205728A1 (en) 2015-06-17 2016-12-22 Massachusetts Institute Of Technology Crispr mediated recording of cellular events
WO2016205749A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
WO2016205764A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
WO2016205745A2 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Cell sorting
KR20180133374A (en) 2015-10-22 2018-12-14 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 Type VI-B CRISPR Enzymes and Systems
WO2017075294A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Board Institute Inc. Assays for massively combinatorial perturbation profiling and cellular circuit reconstruction
WO2017106657A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
US20200263190A1 (en) 2016-04-19 2020-08-20 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
SG11201810179RA (en) 2016-04-19 2018-12-28 Broad Inst Inc Novel crispr enzymes and systems
AU2017253107B2 (en) 2016-04-19 2023-07-20 Massachusetts Institute Of Technology CPF1 complexes with reduced indel activity
CA3028158A1 (en) 2016-06-17 2017-12-21 The Broad Institute, Inc. Type vi crispr orthologs and systems
WO2018005873A1 (en) 2016-06-29 2018-01-04 The Broad Institute Inc. Crispr-cas systems having destabilization domain
CN110312799A (en) 2016-08-17 2019-10-08 博德研究所 Novel C RISPR enzyme and system
SG10201913505WA (en) 2016-10-17 2020-02-27 Univ Nanyang Tech Truncated crispr-cas proteins for dna targeting
KR102454284B1 (en) 2017-03-15 2022-10-12 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 Novel cas13b orthologues crispr enzymes and systems
EP3610009A1 (en) 2017-04-12 2020-02-19 The Broad Institute, Inc. Novel type vi crispr orthologs and systems
US20210278416A1 (en) 2017-05-09 2021-09-09 The Broad Institute, Inc. Gut microbiome function predicts response to anti-integrin biologic therapy in inflammatory bowel diseases
AU2018289077B2 (en) 2017-06-23 2022-03-10 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
WO2019089803A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for studying cell evolution
WO2019113506A1 (en) 2017-12-07 2019-06-13 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for multiplexing single cell and single nuclei sequencing
JP7464279B2 (en) 2018-04-16 2024-04-09 アイカーン スクール オブ メディスン アット マウント シナイ Methods and kits for prediction of acute rejection and kidney allograft loss using pre-transplant transcriptome signatures in recipient blood
WO2020041380A1 (en) 2018-08-20 2020-02-27 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for optochemical control of crispr-cas9
WO2020236967A1 (en) 2019-05-20 2020-11-26 The Broad Institute, Inc. Random crispr-cas deletion mutant
KR20220044811A (en) 2019-08-16 2022-04-11 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 Targeted trans-sequencing using CRISPR/CAS13
MX2022015950A (en) 2020-06-25 2023-01-24 Mycotechnology Inc Sweet protein from truffle.
US11248265B1 (en) 2020-11-19 2022-02-15 Clear Labs, Inc Systems and processes for distinguishing pathogenic and non-pathogenic sequences from specimens
EP4247151A1 (en) 2020-11-20 2023-09-27 Revivicor Inc. Multi-transgenic pigs with growth hormone receptor knockout for xenotransplantation
WO2022271548A2 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Massachusetts Institute Of Technology Compositions, methods and systems for the delivery of gene editing material to cells
CA3232376A1 (en) 2021-09-20 2023-03-23 Maria KOKKINAKI Multitransgenic pigs comprising ten genetic modifications for xenotransplantation
WO2023141602A2 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2023185697A2 (en) 2022-03-29 2023-10-05 Accuredit Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. Compositions and methods for treatment of transthyretin amyloidosis
GB202208575D0 (en) 2022-06-13 2022-07-27 Univ Edinburgh Activation of noncoding host gene loci
WO2024020346A2 (en) 2022-07-18 2024-01-25 Renagade Therapeutics Management Inc. Gene editing components, systems, and methods of use
WO2024044723A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2024061296A2 (en) 2022-09-22 2024-03-28 Accuredit Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. Compositions and methods for treatment of hypercholesterolemia and/or cardiovascular disease

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995006659A1 (en) * 1992-07-01 1995-03-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5212295A (en) * 1990-01-11 1993-05-18 Isis Pharmaceuticals Monomers for preparation of oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
US5506212A (en) * 1990-01-11 1996-04-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides with substantially chirally pure phosphorothioate linkages
WO1992003139A1 (en) * 1990-08-14 1992-03-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide modulation of cell adhesion
WO1994008003A1 (en) * 1991-06-14 1994-04-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE INHIBITION OF THE ras GENE
AU2874892A (en) * 1991-10-15 1993-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
US5681747A (en) * 1992-03-16 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid sequences encoding protein kinase C and antisense inhibition of expression thereof
JPH08506479A (en) * 1992-09-10 1996-07-16 財団法人化学及血清療法研究所 Compositions and methods for the treatment of hepatitis C virus-related disorders

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017537644A (en) * 2014-12-16 2017-12-21 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス Screening method for chiral toxicity

Also Published As

Publication number Publication date
EP0831854A1 (en) 1998-04-01
CA2223103A1 (en) 1996-12-12
JP2001114798A (en) 2001-04-24
JP2001103987A (en) 2001-04-17
AU6252896A (en) 1996-12-24
WO1996039154A1 (en) 1996-12-12
NO975558D0 (en) 1997-12-02
NO975558L (en) 1998-01-26
EP0831854A4 (en) 2001-01-24
AU698739B2 (en) 1998-11-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH10510433A (en) Oligonucleotides with high chiral purity phosphorothioate linkages
US5607923A (en) Oligonucleotides for modulating cytomegalovirus having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5599797A (en) Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5661134A (en) Oligonucleotides for modulating Ha-ras or Ki-ras having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5576302A (en) Oligonucleotides for modulating hepatitis C virus having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5587361A (en) Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5620963A (en) Oligonucleotides for modulating protein kinase C having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5635488A (en) Compounds having phosphorodithioate linkages of high chiral purity
CA2121144C (en) Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
US5506212A (en) Oligonucleotides with substantially chirally pure phosphorothioate linkages
US5521302A (en) Process for preparing oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
US5852188A (en) Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
JP4383720B2 (en) Oligonucleotide N3 &#39;→ P5&#39; phosphoramidate: synthesis and compounds; hybridization and nuclease resistance properties
JP3529135B2 (en) How to cut a specific RNA strand
JP3585583B2 (en) Sugar-modified oligonucleotides for detecting and modulating gene expression
US5654284A (en) Oligonucleotides for modulating RAF kinase having phosphorothioate linkages of high chiral purity
EP0431523A2 (en) Modified nucleotide compounds
JP2001002696A (en) 2&#39;modified oligonucleotide having gap
JP2005522997A (en) Oligonucleotides containing alternating segments and uses thereof
AU2003202376A1 (en) Oligonucleotides comprising alternating segments and uses thereof
JPH09505307A (en) Multi-chiral synthetic phosphonate oligomers
KR100257972B1 (en) Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
EP0931090A1 (en) Improved chimeric oligonucleotide vectors
WO1997014708A1 (en) Oligonucleotides containing thiol-substituted nucleoside derivatives and methods of use thereof