JPH10508303A

JPH10508303A - Ｍｏｒａｘｅｌｌａの主要外層膜蛋白ＣＤ

Info

Publication number: JPH10508303A
Application number: JP8513562A
Authority: JP
Inventors: ヤン、ヤン−ピン; イー．ハークネス、ロビン; イー．マイアーズ、リサ; マクギネス、アーシュラ; エイチ．クライン、マイケル
Original assignee: コノートラボラトリーズリミテッド
Priority date: 1994-10-24
Filing date: 1995-10-23
Publication date: 1998-08-18
Anticipated expiration: 2015-10-23
Also published as: CN1161376C; AU3695395A; PT787144E; US6121427A; DE69524626T2; CN1174559A; DK0787144T3; CA2203540A1; DE69524626D1; ES2169166T3; CA2203540C; RU2186582C2; JP3534771B2; MX9702952A; HK1009453A1; ATE210678T1; WO1996012733A1; EP0787144A1; AU706832B2; EP0787144B1

Abstract

(57)【要約】 Moraxella株、特にはM.catarrhalisのものまたはM.catarrhalisから単離可能なものに相当する単離・精製非変性外層膜蛋白ＣＤを、その菌株の細胞塊を遠心によって破壊することで得られる細胞溶解物を分別して、ペレットと大部分の可溶性細菌蛋白を含む廃棄上清を得ることで単離する。そのペレットを選択的に抽出して、残留する可溶性蛋白、ＣＤ以外の膜蛋白ならびにリポ多糖類およびリン胞質などの他の汚染物を除去する。残留したＣＤ含有ペレットを分散・可溶化し、次に遠心によって分別して、残留する細胞残屑を除去する。ＣＤ蛋白は診断関係の利用分野および免疫原性組成物において有用であり、特にin vivoで宿主に投与して、ＣＤ蛋白を産生するかまたは宿主においてＣＤ蛋白と特異的に反応する抗体を誘発することができる蛋白を産生する病原菌によって引き起こされる疾患に対する予防を行う上で有用である。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称 Moraxellaの主要外層膜蛋白ＣＤ発明の属する技術分野本発明は、免疫学の分野に関するものであり、詳細には、Moraxellaからの主要外層膜蛋白ＣＤ、それの製造方法およびそれの利用に関する。発明の背景中耳炎は、幼年期で最も一般的な病気であって、７歳以前の小児全体の約７０％が少なくとも１回は中耳炎を患ったことがある。慢性中耳炎があると、小児において聴覚、言語および認識に障害が生じる場合がある。それは、Streptococcu s pneumoniae（約５０％）、分類できないHaemophilus influenzae（約３０％）およびMoraxella（Branhamella）catarrhalis（約２０％）による細菌感染によって引き起こされる。米国のみで、中耳炎治療のコストは、抗生物質ならびに扁桃摘出術、咽頭扁桃切除術および鼓膜切開術管挿管などの外科的処置に対して年間１０億ないし２０億ドルとなる。中耳炎は、言語能力が急速に発達している時期に起こることから、具体的に学習および聴覚知覚に関係する発達障害が、頻回に中耳炎を起こす小児において報告されている。 M.catarrhalisは主として、呼吸管にコロニー形成し、主に粘膜の病原体となる。鼓膜穿刺によって得られた中耳液の培養液を用いる研究から、M.catarrhali sが中耳炎例の約２０％の原因となっていることが明らかになっている（参考文献１−本願を通じて、本発明が関係する最新技術をより詳細に説明することを目的として、括弧内に各種参考文献を引用している。各引用についての詳細な関係書目情報については、明細書の最後の部分で請求の範囲の直前の箇所に記載してある。これら参考文献の開示内容については、本明細書では、本開示内容中に参考文献によって盛り込まれている）。 M.catarrhalisによって引き起こされる中耳炎の発生率は上昇しつつある。pne umococcusおよび分類できないH.influenzaeによって引き起こされる中耳炎を予防する方途が開発されていることから、中耳炎の原因としてのM.catarrhalisの相対的重要度はさらに高くなるものと予想することができる。 M.catarrhalisはさらに、成人における下部呼吸管感染、特に慢性気管支炎および肺気腫の状態における重要な原因でもある（参考文献２、３、４、５、６、７および８）。M.catarrhalisはさらに、小児および成人における副鼻腔炎（参考文献９、１０、１１、１２および１３）の原因でもあり、場合によっては侵襲性疾患を引き起こす（参考文献１４、１５、１６、１７、１８および１９）。他のグラム陰性菌同様、M.catarrhalisの外層膜は、リン脂質、リポ多糖類（ＬＰＳ）および外層膜蛋白（ＯＭＰ）からなる。M.catarrhalisＯＭＰのうち８個が主要成分として確認されている。これらは文字Ａ〜Ｈによって表記され、最初が分離９８ｋＤａのＯＭＰＡであり、最後は分子量２１ｋＤａのＯＭＰＨである（参考文献２０）。 M.catarrhalisで確認されている主要ＯＭＰのうち、ＣＤという名称の見かけ上のダブレット（doublet）は熱変性蛋白である。それの分子量は室温で５５ｋＤａであり、還元条件下に加熱すると６６ｋＤａとなる。ＣＤ特異的モノクローナル抗体を用いた研究で明らかになっているように、この蛋白は表面に露出しており、各種M.catarrhalis株間で保存されている（参考文献２１）。ＣＤをコードする遺伝子は最近、マーフィーら（Murphy et al.）によってクローニングされ、大腸菌で発現されている（参考文献２２）。M.catarrhalisの３０個の単離物についてのＣＤ遺伝子中の配列に相当するオリゴヌクレオチドプローブを用いた制限マッピングにより、サザーンブロッティングアッセイで同一のパターンが得られ、ＣＤ遺伝子の配列が保存されていることが示唆されている。そこで、M.catarrhalisの熱変性蛋白ＣＤは、表面に露出し保存される蛋白であって、調べたM.catarrhalis株の全てにおいて存在する少なくとも２個のエピトープを含むものである（参考文献２１）。ＣＤ蛋白の性質は、その蛋白がM.ca tarrhalisその他のＣＤ蛋白を産生するかあるいはＣＤ蛋白と特異的に反応する抗体を形成することができる蛋白を産生する病原菌によって引き起こされる疾患の診断およびその疾患に対する予防接種において利用できることを示している。抗原として使用するための精製ＣＤ蛋白（およびそれの精製方法）、ワクチン、他の抗原および免疫原ならびに診断薬取得のための担体を含む免疫原性製剤を提供することは有利であると考えられる。発明の概要本発明は、Moraxella catarrhalisの精製主要外層膜蛋白ＣＤおよびＣＤ蛋白の精製方法を提供することを目的とするものである。本発明の１実施態様によれば、Moraxella株から単離可能な単離・精製した非変性外層膜蛋白ＣＤが提供される。ＣＤ蛋白は、実質的にその生構造を持ち（実質的に、Moraxella株におけるＣＤ蛋白の特徴的免疫原性を有するために）、M.c atarrhalis 4223またはＲＨ４０８などのM.catarrhalis株から単離することができる。そのような単離・精製ＣＤ蛋白は、Moraxellaの非ＣＤ外層膜蛋白、リン脂質およびリポ多糖類を実質的に含まない。本発明はさらに、本願で提供される外層膜蛋白を免疫的に有効な量で有してなる免疫原性組成物をも提供するものである。その免疫原性組成物は、宿主に対するin vivo投与用のワクチンとして製剤して、ＣＤ蛋白を産生するかあるいは宿主においてＣＤ蛋白と特異的に反応する抗体を誘発することができる蛋白を産生する病原菌によって引き起こされる疾患に対する予防を行うことができる。詳細には、その病原菌は、M.carrhalisである。本発明の免疫原性組成物は、微粒子、カプセル、ＩＳＣＯＭまたはリポソーム製剤として製剤することができる。その免疫原性組成物は、標的分子（targetin g molecule）と組み合わせて、免疫系の特異的細胞または粘膜表面に運搬することができる。標的分子には、ＷＯ９２／１７１６７（Biotech Australia Pty.Lt d.）に記載のような菌株Ｂ１２および細菌毒断片、ならびに米国特許５１９４２５４号（Barberら）に記載のようなモノクローナル抗体などがある。本発明の免疫原性組成物（ワクチンを含む）はさらに、１以上の他の免疫原性または免疫刺激性の材料を含むことができ、その免疫刺激性材料は１以上のアジュバントであることができる。本発明での使用に好適なアジュバントには、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＱＳ２１、ＱｕｉｌＡ、それらの誘導体および構成成分、ＩＳＣＯＭ基質、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、糖脂質類縁体、ならびにアミノ酸のオクタデシルエステル、ムラミルジペプチド、ポリホスファゼン、ＩＳＣＯＰＲＰ、ＤＣ−ｃｈｏｌ、ＤＤＢＡおよびリポ蛋白、あるいはその他のＴｈ１反応を誘発するアジュバントなどがあるが、これらに限定されるものではない。アジュバントの特定の有利な組み合わせは、１９９４年６月１６日に出願され、本願とともに係属中の米国特許出願第２６１，１９４号（本願の譲受人に譲渡されており、その開示内容は参考文献として本明細書に組み込まれる）に記載されている。本発明のさらに別の態様においては、宿主で免疫応答を発生させる方法において、宿主に本明細書に記載の免疫原性組成物を免疫的に有効な量で投与する段階を有してなる方法が提供される。その免疫応答は、体液性あるいは細胞介在性の免疫応答であることができる。その免疫応答は、宿主に対して、ＣＤ蛋白を産生するかあるいは宿主においてＣＤ蛋白と特異的に反応する抗体を誘発することができる蛋白を産生する病原菌によって引き起こされる疾患の予防を行うことができる。疾患に対する予防を提供され得る宿主には、ヒトなどがある。本発明のさらに別の態様においては、ＣＤ外層膜蛋白に対して特異的で、本願で提供される免疫原性組成物によって宿主を免疫感作することで産生することができる抗体が提供される。本発明のさらに別の態様においては、検体中でMoraxella catarrhalis蛋白の外層膜蛋白ＣＤと特異的に反応する抗体の有無を測定する方法であって、（ａ）ＣＤ蛋白および該蛋白と特異的に反応する検体中に存在する前記抗体を有してなる複合体を形成するような条件下で、本願で提供されるＣＤ蛋白と検体とを接触させる段階；ならびに（ｂ）前記複合体の形成を測定する段階を有してなる方法が提供される。本発明のさらに別の態様においては、検体中のＣＤ蛋白の有無を測定する方法であって、（ａ）被験者を、本願で提供される免疫原性組成物で免疫感作して、ＣＤ蛋白に特異的な抗体を産生する段階、（ｂ）検体と前記抗体とを接触させて、検体中に存在するＣＤ蛋白と前記ＣＤ蛋白特異抗体を有してなる複合体を形成する段階；ならびに（ｃ）前記複合体の形成を測定する段階を有してなる方法も提供される。ＣＤ蛋白は、Moraxella catarrhalis株あるいはＣＤ蛋白を産生するかまたは宿主においてＣＤ蛋白と特異的に反応する抗体を形成することができる蛋白を産生する細菌の一部であることができる。本発明のさらに別の態様においては、検体中でＣＤ蛋白と特異的に反応する抗体の有無を測定するための診断キットであって、（ａ）本願で提供されるＣＤ蛋白、（ｂ）前記ＣＤ蛋白と検体とを接触させて、前記ＣＤ蛋白および検体中に存在する前記抗体とを有してなる複合体を形成する手段、ならびに（ｃ）前記複合体の形成を測定する手段を有してなるキットが提供される。本発明はさらに、検体中のＣＤ蛋白の有無を検出するための診断キットであって、（ａ）本願で提供されるＣＤ蛋白に特異的な抗体、（ｂ）該抗体と検体とを接触させて、ＣＤ蛋白およびＣＤ特異抗体を有してなる複合体を形成する手段、ならびに（ｃ）前記複合体の形成を測定する手段を有してなるキットをも提供するものである。本発明は、その別の態様において、ＣＤ蛋白を産生するかあるいは宿主においてＣＤ蛋白と特異的に反応する抗体を誘発することができる蛋白を産生する病原菌によって引き起こされる疾患に対する予防のためのワクチンを製造する方法であって、本願で提供される免疫原性組成物を被験宿主に投与して、ＣＤ蛋白を産生するかまたは宿主においてＣＤ蛋白と特異的に反応する抗体を形成することができる蛋白を産生する病原菌によって引き起こされる疾患に対する予防を行うために該組成物の各種成分の相対量および該組成物の投与頻度を求める段階；ならびに前記の所定の投与量および投与頻度に従って被投与宿主に投与するのに好適な剤型で免疫原性組成物を製剤する段階を有してなる方法を提供するものである。被投与宿主はヒトであることができる。本発明のさらに別の態様においては、Moraxella株からの外層膜蛋白ＣＤに特異的なモノクローナル抗体を形成する方法であって、（ａ）本願で提供される免疫原性組成物を１匹以上のマウスに投与して、１匹以上の免疫感作マウスを得る段階、（ｂ）前記１匹以上の免疫感作マウスからＢリンパ球を採取する段階、（ｃ）前記１匹以上の免疫感作マウスから採取したＢリンパ球を骨髄肺細胞と融合することで、ハイブリドーマを形成する段階、（ｄ）特定の抗ＣＤ蛋白抗体を産生するハイブリドーマをクローニングする段階、（ｅ）前記抗ＣＤ蛋白抗体産生クローンを培養する段階、ならびに（ｆ）前記培地から抗ＣＤ蛋白抗体を単離する段階を有してなる方法が提供される。本発明のさらに別の態様においては、ＣＤ蛋白を産生する菌株の単離・精製外層膜蛋白ＣＤを製造する方法であって、（ａ）前記菌株の細胞塊を取得する段階、（ｂ）前記細胞塊を破壊して、細胞溶解物を得る段階、（ｃ）前記細胞溶解物を分別して、第１の上清と第１のペレットを得て、該第１の上清が実質的に大部分の可溶性細菌蛋白を含有するものである段階、（ｄ）前記第１の上清を前記第１のペレットから分離する段階、（ｅ）前記第１のペレットの抽出を行って、該ペレットから実質的に全ての可溶性蛋白およびＣＤ蛋白以外の膜蛋白を除去して、第２の上清およびＣＤ蛋白を含む抽出済みペレットを得る段階、（ｆ）前記第２の上清を前記抽出済みペレットから分離する段階、（ｇ）前記抽出済みペレットを溶解させて、可溶化抽出物を得る段階、（ｈ）前記可溶化抽出物を分別して、ＣＤ蛋白含有上清と廃棄ペレットを得る段階；ならびに（ｉ）前記ＣＤ蛋白含有上清を廃棄ペレットから分離する段階を有してなる方法が提供される。ＣＤタンパクを生産する細菌株は、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓであってもよい。細胞溶解産物は遠心分離によって分画し、溶解抽出物は遠心分離によって分画する。最初のペレットを選択的に抽出する段階は、界面活性剤を用いた少なくとも１回の抽出（数回の抽出を含む）からなる。抽出後のペレットを分散させ、界面活性剤と可溶化溶媒とからなる緩衝液を用い、所定の温度で、所定時間抽出し、抽出物を得る。緩衝液は約７から約８．５のｐＨを有し、約０．１〜２重量％の界面活性剤、例えばＴｒｉｔｏｎX−１００および可溶化剤として約３〜８モル、例えば４モルの尿素を含む。可溶化は、約４０〜７０℃ で、約１０〜１２０分間行う。通常、ＣＤを含む上清はその後透析を行って界面活性剤および可溶化剤を除去し、さらにＣＤタンパク溶液を非変性型として精製する。本発明は、別の側面でＭｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの非クランピング株、すなわちＭｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓＲＨ４０８（ＡＴＣＣ識別番号５５，６３７）を提供する。このような非クランピング株は、凝集が問題となる大規模ファーメンターで培養を行う場合特に有用である。この非クランピング株は本発明の別の側面で、当該抗血清により、非クランピング株のあらかじめ設定した数の細胞を殺すことによる補体阻害を行い、ついで前記の抗Ｍｏｒａｘｅｌｌａ抗細菌活性の尺度として、あらかじめ設定した細胞数に対する前記抗血清によって死滅した細胞の割合を測定することからなる、抗血清の抗Ｍｏｒａｘｅｌｌａ抗細菌活性の測定に使用することができる。本発明の利点は、 −ＣＤタンパクを生産するＭｏｒａｘｉｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓを含む細菌株の精製ＣＤ外膜タンパクの簡単な分離法を提供し、 −Ｍｏｒａｘｅｌｌａ株から単離、精製された非変性外膜タンパクＣＤを提供し、 −Ｍｏｃａｘｅｌｌａおよびそれによって感染された宿主の同定に使用する診断キットおよび免疫学的試薬を提供することである。図面の簡単な説明以下の図を参照し、本発明をさらに詳細に説明する。図１は、本発明に係わるＭｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓからのＣＤタンパクの精製法を示すフローダイヤグラムである。図２は、分離、精製したＣＤタンパクのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示す。図３は、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ全体を免疫投与することによるマウスにおけるＣＤ−特異的抗体の生成を示す。図４は、分離、精製したＣＤタンパクを免疫投与することによるマウスにおけるＣＤ−特異的抗体の生成を示す。図５は、多くのＭ．ｃａｔａｒｒｈｌｉｓ株に抗原が保全されていることを示す免疫ブロットである。図６は、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈｌｉｓ全体または分離、精製したＣＤタンパクのいずれかを免疫投与したマウスにおけるＩｇＧサブクラスプロファイルの比較である。図７は、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ全体または分離、精製したＣＤタンパクの免疫投与によって生成したマウス抗−血清の、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの表面に表現されたＣＤタンパクに対する結合能のフローサイトメトリーによって測定した結果を示す。図８は、分離、精製したＣＤタンパクの免疫投与により生成したマウス抗−ＣＤ抗血清のＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとその他の中耳炎病原細菌を特異的に識別能を実証する免疫ブロットである。発明の概要本出願において、”Ｍｏｒａｘｅｌｌａ菌株の外膜タンパクＣＤ”という用語は、各種Ｍｏｒａｘｅｌｌａ菌株に存在する天然のタンパクを含み、アミノ酸配列に変異を有するタンパクを有し、または含むＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの外膜タンパクＣＤの１群を基底するために使用する。本出願において、第一のタンパクが免疫学的に第二のタンパクと関連があるか、同じ機能を有している場合は、第二のタンパクの”機能的類縁体”とする。機能的類縁体は、例えばタンパクのフラグメントまたはその置換、付加または欠失変異体である。本発明は、基本的に純粋なＣＤ外膜タンパクの調製に使用する新規な方法を提供する。ここに示す分離、精製した外膜タンパクＣＤの提供には、ＣＤタンパクを生産するか、ＣＤタンパク、フラグメントまたはその類縁体を特異的に識別する抗体を生成しうるタンパクを生産するあらゆる細菌を用いると便利である。本発明は、遺伝子組換え技術によって生産されたＣＤタンパクおよびＣＤタンパクの免疫学的性質を保持するその類縁体を含む。当該細菌は一般に病原性細菌であり、典型的にＭｏｒａｘｅｌｌａ属、例えばＭｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓである。これらの菌株は、一般に医療現場または細菌のカルチャーコレクションから入手することができる。適当なＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ株としては、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ４２２３およびＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓＲＨ４０８を挙げることができる。図１は、本発明の１実施例によるＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓからのＣＤタンパクの精製法を示すフローダイヤグラムである。細胞全体を従来の緩衝液条件下で溶融させ、細胞溶融液を得る。この細胞溶融液を遠心分離し、約９５％の溶存タンパクを含む上清とペレット（ＰＰＴ₁）に分ける。界面活性剤を用い、このペレットを選択的に抽出し、残った可溶性タンパクおよびＣＤタンパク以外の膜タンパクをペレット（ＰＰＴ₁）ならびにリン脂質およびリポ多糖類等のその他の混在物から分離する。このような選択的抽出は、従来の方法で行うことができる。このような方法の１例として、界面活性剤によるペレットの反復抽出を挙げることができる。特に、最初の界面活性剤抽出はＴｒｉｔｏｎＸ−２００を用いて行い、ついで遠心分離を行い、上清をデカントして残っている可溶性タンパクのほとんどを除去し、別のペレット（ＰＰＴ₂）を得る。このようなＴｒｉｔｏｎ X−２００抽出は、pH約７〜８．５の緩衝液、典型的にｐＨ８．０のＴｒｉｓ緩衝液を用いて調製した約０．２〜１重量％のＴｒｉｔｏｎＸ−２００溶液を用いて行う。さらに、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはその他の適当な界面活性剤、例えばデオキシコール酸ナトリウムを用いてＰＰＴ₂の界面活性剤抽出を１回または数回行い、ついで遠心分離を行い、上清をデカントしてＣＤタンパク以外の外膜タンパクのほとんどを除去するとともにその他の混在物を除去し、別のペレット（ＰＰＴ₃）を得る。このような追加抽出は、約０．１〜１重量％の界面活性剤溶液を用いて行う。界面活性剤の濃度が高くなるとＣＤタンパクのある程度の溶解が起こり、収率が低下するので、通常回避する。このような界面活性剤溶液は、一般にpH約７〜８．５の緩衝液、典型的にｐＨ８．０のＴｒｉｓ緩衝液を用いて調製する。ＰＰＴ₃を製造するために行うＰＰＴ₁の界面活性剤抽出は、適当な温度範囲、例えば約４〜３０℃で行う。上記の選択抽出手順では数種類の界面活性剤を用いて行ったが、選択抽出は適切な選択抽出能を有する単一の界面活性剤を用いて行うこともできる。細胞溶融ペレットの界面活性剤による選択抽出で得られた固形物（ＰＰＴ₃）はＣＤタンパクおよび細胞破片を含むが、その他の細菌タンパクおよび混在物のほとんどが除去されている。ついで、ＣＤタンパクを固形物から可溶化し、得られた溶液を例えば遠心分離することにより細胞破片を除去する。このような可溶化は、まず界面活性剤溶液を用いて固形物を分散させ、ついでタンパク可溶化剤、例えば尿素等を用いて分散しているＣＤタンパクを溶解させ、遠心分離によって分散している細胞破片を除去することによって行う。固形物（ＰＰＴ₃）を分散させるために用いる界面活性剤溶液は、従来使用されている界面活性剤、例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００をｐＨ約７〜８．５の緩衝液に約０．１〜２重量％になるように溶解させて調製する。使用する可溶化剤の量は、少なくとも懸濁しているＣＤタンパクのほとんど全てを溶解させる量とする。例えば、尿素を用いる場合、約３〜８Ｍの濃度を用いることができる。可溶化は、約４０〜７０℃に少なくともＣＤタンパクがほとんど完全に溶解するまで、例えば約１０〜１２０分間加温することによって促進することもできる。ＣＤタンパク溶液を破片のペレットから分離した後、従来の方法、例えば従来の条件下で透析を行うなどして可溶化剤を除去し、ＣＤタンパク溶液を得る。この手順によって、分離、精製された非変性外膜ＣＤタンパクの水溶液が得られる。ＣＤタンパク水溶液は、使用目的に応じて適当な濃度、一般に約１００〜２００μｇ／ｍＬの濃度で提供することができる。それ以上濃厚な溶液も、従来の方法を用いて調製することができる。図２は、ここに記載した方法、典型的には図１に模式的に示す方法により精製したＣＤタンパクのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による純度分析の結果である。図２のレーン２は、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ細胞溶融物を示す。レーン３は、細胞溶融液を５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で処理した後遠心分離によって得られた可溶性タンパクの約９５％を含む上清を示す。レーン４および５は、それぞれ細胞溶融液を５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で処理した後遠心分離によって得られたペレットを１回および２回界面活性剤抽出して得られた上清を示す。レーン６は、既知のタンパク分子量（５５６６０ｋＤａ）を有する精製ＣＤタンパクを示す。ここに提供する外膜ＣＤタンパクの精製法によって、少なくとも純度７０％のＣＤタンパク調製物が得られる。図２のレーン６に示す調製物の純度は、デンシトメータによる分析で、少なくとも９５％であった。図３および４は、本発明に係わる分離、精製外膜タンパクＣＤのマウスにおける免疫活性を示す。図３は、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ細胞全体を免疫投与したマウスにおけるＣＤ−特異性抗体の生産を示す。図４は、本発明に係わる精製ＣＤタンパクを免疫投与した場合の特異性抗体の生産を示す。これらのデータから明らかなように、精製ＣＤタンパクは強い免疫活性を有し、細菌の一部として免疫系に投与した場合のＣＤタンパクの免疫活性に匹敵する。免疫組成物（ワクチンを含む）の成分として、また診断用の抗原として使用するためには、ここに記載したように精製されたＣＤタンパクは、多様なＭｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ菌株を識別または中和する抗体を有利に生成するものでなければならない。図５（パネルＡ）は、ここに提供された生成ＣＤタンパクを免疫投与したマウスで生産されたマウス抗−ＣＤ抗血清の各種Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓから分離したＣＤタンパクの識別能を示す免疫ブロットである。試験したＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ菌株は以下の通りである。図５（パネルＢ）も、精製ＣＤタンパクと強い反応を示したＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの不活性化全細胞（レーン２）またはＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの各株（レーン３〜１０）を免疫投与したマウスで得られた免疫血清を示す。この図は、ＣＤタンパクはＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓにおける免疫活性の高いタンパクであることを示している。図６は、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの不活性化全細胞またはここに提供した分離、精製ＣＤタンパクを免疫投与したマウスにおける抗−ＣＤＩｇＧサブクラスのプロファイルの比較である。最も顕著な反応は、ＩｇＧ₁およびＩｇＧ₂アイソタイプで認められた。さらに、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの不活性化全細胞と精製ＣＤタンパクを免疫投与により得られたＩｇＧサブクラスのプロファイルはよく似ていることから、ここに記載した分離、精製ＣＤタンパクは構造的にその天然タンパクとほとんど同じであると考えられる。図７は、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓに結合している抗−ＣＤ抗血清のフローサイトメトリー分析を示す。ここに記載した分離、精製ＣＤタンパクを免疫投与することによって生産されたマウス抗ＣＤ抗血清のプールしたものの無傷のＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓに対する結合能（パネルＡ）は、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの全細胞を免疫投与した場合の抗−Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（パネルＢ）とほぼ同等であった。同じ抗−ＣＤ抗血清がＣＤタンパクを生産しない細菌Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ（パネルＤ）に顕著な結合を示さなかったことから、結合はＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓに特異的であると考えられる。一方、プールしたマウス抗−Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ抗血清は、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓと強く反応した（パネルＥ）。パネルＣおよびＦは、非免疫血清がＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓおよびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａにほとんど結合しないことを示している。このフローサイトメトリー分析は、ここに提供した分離、精製ＣＤタンパクを免疫投与することによって得られた抗−ＣＤ抗体が無傷のＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ細胞表面上のＣＤタンパクを識別し、ここに提供するＣＤタンパクは構造的にその天然型とかなりよく似ていることを示している。本発明の実施例によると、ここに提供する分離、精製ＣＤタンパクは中耳炎の病原細菌からＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓを特異的に識別するために使用することができる抗体の生成に有用である。図８は、ここに提供されたＣＤタンパクを免疫投与したマウスで生産されたマウス抗−ＣＤ抗血清の特異的反応を示す免疫ブロットである。分析に用いた細菌は、以下の通りである。図８に示した結果から明らかなように、ここに提供するＣＤ−特異性抗血清は同じような臨床症状を示す病原細菌を同定し、識別する上で有用である。下表１に示した結果は、ここに提供するＣＤタンパクを免疫投与することによって生成されたマウスまたはモルモット抗−ＣＤ抗血清の２種類のＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ株に対する細胞溶融能である。結果から明らかなように、４２２３株から分離したＣＤタンパクを免疫投与することによって生産された両抗血清は、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ４２２３株に由来する相同性の非凝集性Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓＲＨ４０８株および非相同性の非凝集性株ＱＳ（ＣｅｎｔｒｅＨｏｓｐｉｔａｌｉｅｒｄｅｌ’ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅＬａｖａｌ，Ｓｔ．Ｆｏｙ，ＱｕｅｂｅｃのＤｒ．Ｍ．Ｇ．Ｂａｒｇｅｒｏｎから提供されたもの）に対して抗菌作用を有する。モルモット免疫血清中の抗菌力価は、きわめて高かった（１：1,024）。マウス抗ＣＤ−抗血清中の抗菌作用は両株に対して約１：１２８であり、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ不活性化全細胞を免疫投与することによって生産された抗−Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ抗血清の力価と同等であった。ここに提供する分離、精製ＣＤタンパクの抗菌性抗体生産能は、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓまたはＣＤタンパクを生産するか、またはＣＤタンパクを特異的に識別する抗体を生成するタンパクを生産するその他の細菌に起因する疾病を予防するためにＣＤタンパクをワクチンとしてｉｎｖｉｖｏで使用できることを示唆している。すなわち、本発明の別の側面によれば、ここに提供するＣＤタンパクの免疫学的に有効な量とその生理学的に許容される単体とからなるＭｏｒａｘｅｌｌａまたはＣＤタンパクを生産するか、ＣＤを特異的に識別する抗体を誘導するタンパクを生産するその他の病原性細菌に対するワクチンを提供するものである。また、ここに提供するＣＤタンパクは、ヘプタン、多糖類またはペプチドの単体タンパクとを使用し、ＣＤに関連しない抗原決定基とワクチンの抱合体を形成させることもできる。ここに提供するＣＤタンパクは、診断試薬、抗原または抗−ＣＤ抗体の誘導、ＭｏｒａｘｅｌｌａおよびＣＤを特異的に識別する抗体を誘導するタンパクを生産するその他の病原性細菌による疾病に対する免疫賦与ならびにＭｏｒａｘｅｌｌａおよび上記のその他の細菌による感染を検出するための抗原として有用である。本発明の別の実施例によると、ここに提供するＣＤタンパクはキメラ分子の調製および包被細菌を含む病原性細菌に対する複合ワクチン（配糖体を含む）の調製に単体分子として使用することができる。例えば、本発明の配糖体は、脂質オリゴ糖（ＬＯＳ）およびＰＲＰを含む多糖類抗原を有するあらゆる細菌に起因する疾病および感染に対する防御能の賦与に使用することができる。例えばこのような病原性細菌は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（インフルエンザ菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎球菌）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（大腸菌）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（髄膜炎菌）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ（腸チフス菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｔｓ（ミュータンス連鎖球菌）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ（クリプトコックス−ネオフォルマンス）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ（クレブシエラ属）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（緑膿菌）である。ＣＤタンパクと抱合体を形成する特定の抗原および当該抱合体を得る方法は、当該出願人に譲渡された公開ＰＣＴ出願ＷＯ９４／１２６４１に記載されており、比較として本出願にも含める。もう一つの具体例においてＣＤ蛋白質の担体機能は、例えば腫瘍細胞の異常多糖類に対して免疫応答を誘起するために、或いは血液治療剤や生物活性剤と接合できる抗腫瘍抗体を作るために使用することができる。本発明は、活性の薬剤物質、特に Moraxella に感染することによりもたらさされる疾病に対するワクチンの中の活性成分として使用するための、Moraxella 株から分離することのできる、分離精製した非変性の外膜蛋白質ＣＤに及ぶ。本発明の種々の具体例がワクチン接種、診断、例えば Moraxella 感染症及びＣＤ蛋白質を特異的に識別する抗体を作り出すことのできる蛋白質を生成する他のバクテリア性病原体による感染症の処置、及び免疫学的試薬類の創出の分野において多くの用途を有する。このような用途の非制限的な記述が更に以下にあげられている。１．ワクチンの調製と使用ワクチンとして使用するのに適した免疫原性組成物を、ここに記述するようにＣＤ蛋白質から作ることができる。好ましくはその抗原性物質を強く透析して望ましくない小さな分子量の分子を除去し、及び／又は所望のビヒクルの中により容易に調剤されるように凍結乾燥する。この免疫原性の組成物は対象体の中で免疫応答を引き出すが、これは種々の抗ＣＤ抗体、及びオプソン化（opsonize）性又は殺菌性の種々の抗体を含めて種々の抗体を作り出す。このワクチン接種された対象体が Moraxella 又は他の、特異的にＣＤ蛋白質を識別する種々の抗体を作り出し得る蛋白質を形成するバクテリアに試験感染されるべきときは、それら抗体はそのバクテリアに結合して不活性化する。更に、オプソン化性又は殺菌性の抗ＣＤ抗体は別な機構によっても保護をもたらすことができる。種々のワクチンを含む免疫原性組成物は注射可能剤として、液体溶液又はエマルジョンとして調製することができる。ＣＤ蛋白質はこのＣＤ蛋白質と相容性のある薬剤的に受容性のある種々の左薬と混合することができる。このような左薬は水、食塩水、デキストローズ、グリセロール、エタノール及びそれらの組み合わせを含む。それら免疫原性組成物及びワクチン類は更に、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤或いはそれらの有効性を高める免疫助成剤のような予備的な種々の物質を含むことができる。免疫原性組成物及びワクチン類は非経口的に、皮下又は筋肉内注射により投与することができる。これと異なって、本発明に従い形成されるそれら免疫原性組成物は種々の粘膜表面において免疫応答を発現させる態様で調剤して投与することができる。すなわち、この免疫原性組成物は、例えば経鼻的又は経口的（胃内）経路により種々の粘膜表面へ投与することができる。これと異なり、坐薬及び経口用調剤を含む他の他の投与形態も望ましいであろう。坐薬のためには結合剤及び担体は、例えばポリアルカレングリコール類又はトリグリセリド類を含むことができる。このような坐薬はその活性成分を約 0.5 ないし約 10 ％、好ましくは約１ないし２％の範囲で含む混合物から形成することができる。経口用調剤は、通常的に用いられる補薬類、例えば薬剤級のサッカリン、セルローズ及び炭酸マグネシウムを含むことができる。これらの組成物は溶液、懸濁液、タブレット、丸薬、カプセル、徐放性調剤又は粉末の形であることができ、そして約１ないし 95 ％のＣＤ蛋白質、好ましくは約 20 ないし約 75 ％を含む。それら免疫原性の調剤及びワクチン類は投薬用調剤と相容性のある態様で、そして治療的に有効な、保護的な、及び免疫原性であるような量で投与される。投与量は、例えば各個体の抗体を合成し、そして必要の場合細胞に媒介される免疫応答を作り出す免疫系の能力を含めてその処置されるべき対象体に依存する。投与するのに要求される活性成分の正確な量は実務者の判断に依存する。しかしながら好適な投与量範囲は当業者により容易に決定することができ、そしてワクチン接種当りそのＣＤ蛋白質のμｇのオーダーであることができる。初期投与量及び追加投与量の好適な規範も可変であるが、初期投与に引き続くいくつかの後続投与を含むことができる。各投与量はまた投与の経路にも依存し、そしてその宿主の大きさに従って変化する。本発明に従う免疫原性組成物の中のＣＤ抗原の濃度は一般に約１ないし 95 ％である。ただ１つの病原体の抗原性物質を含むワクチンは１価ワクタンである。いくつかの病原体の抗原性物質を含むワクチンは組み合わせワクチンであり、そしてこれらも本発明に含まれる。このような組み合わせワクチンは、例えば種々の病原体からの、又はその同じ病原体の種々の株からの、或いは種々の病原体の組み合わせからの物質を含む。それら抗原が、燐酸緩衝された食塩水の中の約 0.05 ないし 0.1 ％の溶液として一般に用いられる免疫助成剤とともに一緒に投与されるときは免疫原性を大きく改善することができる。種々の免疫助成剤は抗原の免疫原性を高めるけれども、それ自身免疫原性である必要はない。各免疫助成剤はその投与部位の近傍に局部的にその抗原を保持することよって、抗原のその免疫系の各細胞へのゆっくりとした徐放を助けて貯蔵所効果を作り出すように作用することができる。種々の免疫助成剤はまた、その免疫系の細胞を或る抗原貯蔵所へ引きつけてそのような細胞を免疫応答が引き出されるように刺激することもできる。種々の免疫刺激剤又は免疫助成剤が、例えば種々のワクチンに対する宿主免疫応答を改善するために多年にわたり用いられてきた。リポポリサッカリドのような、内来的な免疫助成剤は通常、ワクチンとして使用される殺菌され、又は弱毒化されたバクテリアの成分である。外来的な免疫助成剤は典型的には各抗原に非共有結合的に結合された免疫モジュレータであり、そして宿主の免疫応答を高めるように調剤される。すなわち、非傾向的に投与された各抗原に対する免疫応答を高める種々の免疫助成剤が確認されている。しかしながらこれら免疫助成剤の若干は毒性であって望ましくない副作用を引き起こす場合があって、人又は多くの動物においてそれらを使用するのを不適当にする。実際に、水酸化アルミニウム及び燐酸アルミニウム（総合的に通常アラムと称される）のみが人及び獣医用のワクチンにおいて免疫助成剤として慣用的に用いられている。アラムの、ジフテリアやテタヌストキソイドに対する抗体応答を上昇させる効果性はよく確認されており、そして HBsAg ワクチンがアラムにより免疫助成されている。アラムの有用性は若干の適用対象についてよく知られているけれども、これは制限を有する。例えば、アラムはインフルエンザワクチン接種には無効であり、そして細胞媒介免疫応答を非一定的に誘起させる。それらアラムで免疫助成された種々の抗原により引き出される抗体はマウスにおいては主として IgG₁ アイソタイプであり、これは若干のワクチン性剤による保護に対しては最適ではない。広範囲の外来的免疫助成剤が種々の抗原に対する強い免疫応答を引き起こすことができる。これらは、種々の膜蛋白質抗原に錯化したサポニン類（免疫刺激性錯化物）、鉱物油を含むプルロニックポリマー、鉱物油中の殺菌されたマイコバクテリア、フロイントの完全アジュバント、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）やリポポリサッカリド（ＬＰＳ）のようなバクテリア性生成物、並びにリピドＡ及び種々のリポソームを含む。液性免疫応答（ＨＩＲ）及び細胞媒介免疫（ＣＭＩ）を効率的に誘起させるために種々の免疫原が種々の免疫助成剤の中で乳化される。多くの免疫助成剤は毒性であり、そして肉芽腫、急性や慢性の炎症（フロイントの完全アジュバント：ＦＣＡ）、細胞溶解（サポニン類及びプルロニックポリマー）及び発熱原性、関節炎及び前部ぶどう膜炎（ＬＰＳ及びＭＤＰ）を誘起する。ＦＣＡは優れた免疫助成剤であって実験において広く用いられているけれども、これを人及び獣医用のワクチンにおいて使用することはその毒性のために許可されていない。理想的な免疫助成剤の望ましい特性は下記のようであり、すなわち (1) 毒性がないこと、 (2) 長く永続する免疫応答を励起する能力があること、 (3) 製造が簡単で長期間の貯蔵において安定であること、 (4) 所望の場合、種々の経路により投与された種々の抗原に対してＣＭＩ及びＨＩＲの両方を引き出す能力があること、 (5) 他の免疫助成剤との相乗効果があること、 (6) 抗原を与える細胞（ＡＰＣ）の数と選択的に相互作用できること、 (7) 適当なT_H1 又はT_H2 細胞特異的免疫応答を特異的に引き出すことができること、及び (8) 種々の抗原に対して適当な抗体アイソタイプ水準（例えばIgA）を選択的に上昇させ得ることである。 1989 年８月８日に Lockhoff 等に与えられ、ここに参照文献として採用される米国特許第 4,855,283 号は N-グリコシルアミド、N-グリコシル尿素及び N-グリコシルカルバメートを含むグリコリピド類似体を免疫モジュレータ又は免疫助成剤として記述しているが、これらの各々はその糖残基においてアミノ酸で置換されている。すなわち、Lockhoff 等（米国特許第 4,855,283 号、及び参考文献２７）はグリコスフィンゴリピド類及びグリコグリセロリピド類のような天然産のグリコリピド類に構造的な類似性を示す N-グリコリピド類似体がヘルペスシンプレックスウィルスワクチン及びシュードラビースウィルスワクチンの両方において強い免疫応答を引き出し得ることを報告している。天然産のリピト残基の機能を模倣するために、長鎖状アルキルアミン類と、アノマー性炭素原子を介してその糖に直接結合している脂肪酸とから若干のグリコリピドが合成されている。 Moloney に与えられて本特許権者自身に譲渡されてここで参考文献として採用される米国特許第4,258,029 号はオクタデシルチロシン塩酸塩（ＯＴＨ）がテタヌストキソイド及びホルマリンで不活性化した I、II 及び III 型ポリオミエリチスウィルスワクチンと錯化したときに免疫助成剤として作用したことを記述している。また、Nixon-George 等（参考文献２４）は組換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原と錯化した種々の芳香族アミノ酸のオクチデシルエステルがＢ型肝炎ウィルスに対する宿主の免疫応答を高めたことを報告している。種々の合成ペプチドのリピド化もそれらの免疫原性を高めるのに用いられている。すなわち、Wiesmuller（参考文献２５）はトリパルミチル−Ｓ−グリセリル −システイニルセリルセリン免疫助成剤に結合させた、口蹄病ウィルス蛋白質と相同の配列を含むペプチドがグラム陰性菌からのリポ蛋白質のＮ末端部の合成的類似体であることを記述している。更に、Deres 等（参考文献２６）は、リポペプチドに N-パルミチル-S-[2,3-ビス(パルミチルオキシ)-(2RS)-プロピル-[R] −システイン（ＴＰＣ）を結合させることによって、ウィルス特異性の細胞毒性Ｔリンパ球にインフルエンザウィルスの核蛋白質から導かれた修飾された合成ペプチドを含む合成リポペプチドワクチンを生体内で組み入れることを報告している。２．イムノアッセ本発明のＣＤ蛋白質は、抗バクテリア性、抗 Moraxella 性及び抗ＣＤ性の抗体の検出のための、従来技術において公知の、酵素と結合させたイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＲＩＡ及び他の、非酵素結合抗体を結合するアッセイ又は操作を含む種々の種々のイムノアッセイにおける抗原として、種々の抗ＣＤ抗体の発現のための免疫原として有用である。ＥＬＩＳＡ法においてはこのＣＤ蛋白質は、例えばポリスチレンのマイクロタイタープレートの窪のような、蛋白質を結合できる表面のような選ばれた表面の上に固定化される。不十分に吸着されたＣＤ蛋白質を除くために洗浄した後、その試験試料について抗原的に中性であることが知られている牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液のような非特異的な蛋白質をその選ばれた表面に結合させることができる。これはその固定化する表面の上の非特異的な吸着部位をブロックし、そしてそのようにしてその表面への抗血清の非特異的な結合によってもたらされる背景値の低下を許容する。次に、その固定化用表面を、免疫性錯体（抗原／抗体）の形成に導くような態様で、臨床的又は生物学的な物質等のような処理されるべき試料と接触させる。これは試料を、例えばＢＳＡ、牛ガンマグロブリン（ＢＧＧ）及び／又は燐酸緩衝された食塩水（ＰＢＳ）／トウイーンの溶液のような稀釈剤で稀釈することを含む。次にその試料を約 25 ないし 37 ℃のオーダーのような温度において２時間から４時間までにわたりインキュベートする。インキュベーションに続いてその試料と接触した表面を免疫錯化されない物質を除くために洗浄する。この洗浄操作はＰＢＳ／トウイーン或いは硼酸緩衝液のような溶液で洗浄することを含むことができる。その試験試料とその結合されたＣＤ蛋白質との特異的な免疫錯体の形成及び引き続く洗浄に続いて、その免疫錯体形成の発生、及び更にその量をも、その免疫錯体をその第１抗体についての特異性を有する第２抗体にさらすことによって決定することができる。試験試料が人起源のものであるときは、この第２抗体は人免疫グロブリン及び一般に IgG に対する特異性を有する抗体である。検出手段を提供するために、この第２抗体は、例えば適当な発色性の基材とともにインキュベートしたときに発色を生ずる酵素活性のような関連する活性を有することができる。次に定量化を、例えば分光光度計を用いて発色の程度を測定することにより達成することができる。生物学的寄託物ここで記述され、かつ参照される Branhamella catarrhalis 株 RH408 は、ブダペスト協定に従い、そして本願の出願に先立って米国メリーランド州ロックビルの 12301 Parklawn Drive 所在の American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）に寄託された。Branhamella catarrhalis 株 RH408 は既に表示番号N o．55,637 及び提出日 1994 年 12 月 13 日が与えられている。この寄託された株の試料はこの米国特許出願に基づく特許の付与に際して公衆に入手可能となる。ここに記述し、かつ特許請求される発明は寄託された株によってその範囲が制限されるものではなく、と言うのはその寄託された具体例は本発明の説明のみを目的としているからである。非凝集性であってこの出願に記述されたと同じ識別のための特徴を有するいかなる等価の、又は類似の株も本発明の範囲に含まれるものである。実施例以上の開示は本発明を一般的に説明するものである。より完全な理解は、下記の特別な諸例を参照することにより得ることができる。これらの例はもっぱら説明のためにのみ記述されており、そして本発明の範囲を限定しようとするものではない。事情が示唆でき、又は便利となり得るときに種々の変形及び種々の等価の置換が意図される。種々の特別な用語がここで用いられているが、これらの用語は説述を目的とするものであってなんらの制限を目的としたものではない。この開示及びこれらの例において用いられているけれども明瞭には説明されていない分子起源論、蛋白質生化学及び用いた免疫学の種々の方法は科学的文献に充分に報告されており、そして当業者の能力に充分含まれるものである。例１この例は M．catarrhalis の成育を説明するものである。 M．catarrhalis 株 4223 を 20 ｍｌのブレインハート浸出（ＢＨＩ）ブイヨンの中に接種した。この培養液を 37 ℃において曝気しながら１夜インキュベートした。鉄を制限した条件のもとでの成育のためにその１夜培養液１ｍｌを、25 μｍのＥＤＤＡを含む 20 ｍｌのＢＨＩブイヨンの中に接種し、そしてこの培養液を 37 ℃において約３ないし４時間にわたり成育した。中間ログ相（A₅₇₈＞0. 5）まで成育した細胞を 10,000 Ｇにおいて 20 分間遠心分離することにより捕集した。そのペレットを例３に記述するようにＣＤ蛋白質の抽出のために用いた。例２この例は M．catarrhalis の非凝縮性の株 RH408 の発生を示す。 M．catarrhalis 株 4223 を 20 ｍｌのＢＨＩブイヨンの含まれたいくつかのフラスコの中に接種し、そしてこれらの培養液を 37 ℃において振盪（170 rpm ）しながら１夜インキュベートした。各１夜培養液の５ｍｌを個別の１ｍｌの管の中に移し、そして室温において３ないし８時間にわたり乱されないようにそのままにしておいてバクテリアを沈降させた。各培養培地の透明になった上相の 1 00μｌを、25 ｍｌのＰＨＩブイヨンに接種いるために用い、そしてそれら培養液を上記のように 37 ℃において１夜インキュベートした。この操作を、透明になった培地の 25 μｌを用いて６回繰り返してそれぞれ１夜の培養のために 25 ｍｌのＢＨＩに接種した。各非凝集性のバクテリアの培養液を３時間毎の間隔で A₅₇₈ の測定により同定してそのように操作された株の沈降速度をもとのM.cata rrhalls 株 4223 の培養液のそれと比較した。M．catarrhalis RH408 を含む非凝集性の突然変異体はその３時間の間に凝集しなかった。ＢＨＩ寒天プレートの上で株 RH408 は全ての非凝集性株に典型的なコロニー形態を有した。例３この例はＣＤ蛋白質の抽出及び精製を示す。ＣＤ蛋白質を第１図に一般的に示す操作によって M．catarrhalis から分離した。例１に記述したように作られた 250 ｍｌの培養液からの M．catarrhalis の細胞ペレットをｐＨ 8.0 の 50 mM のトリス−HCl 40 ｍｌの中に再分散させ、そして音波照射（３× 10 分、70 ％装荷率）により粉砕した。その抽出液を 20,000 Ｇにおいて遠心分離し、そしてその得られた、M．catarrhalis からの可溶性蛋白質を 95 ％よりも多く含む上澄液は捨てた。残留したペレット（ＰＰＴ₁）を、最初 0.5 ％のトリトン X-100 及び 10 m M のＥＤＴＡを含んでいる 50 mM のｐＨ 8.0 のトリス 40 ｍｌの中で、そして次に 0.5 ％のＳＤＳを含んでいる 50mM のｐＨ8.0 のトリス 40 ｍｌの中で２度抽出した。これら２つの抽出は残りの可溶性蛋白質並びにＣＤ蛋白質を除く膜蛋白質の大部分を除去する。上記の抽出から得られたペレット（ＰＰＴ₃）をＣＤの精製のための出発物質として使用した。このペレットを 0.5 ％のトリトン X-100、10 mM のＥＤＴＡを含んでいる 50 mM のｐＨ 8.0 のトリスの中に再懸濁させた。その得られた懸濁液に６Ｍの濃度まで尿素を加え、そして次にその懸濁液を 60 ℃において 30 分間加熱してそのＣＤ蛋白質を可溶化させた。20,000 Ｇにおいて 30 分間遠心分離した後、その得られた上澄液は均一な精製ＣＤ蛋白質を含んでおり、そしてそのペレットから分離された。その精製ＣＤ蛋白質溶液をｐＨ 8.0 の 50 mM のトリスに対して１夜透析して尿素を除去し、そして次に更に 20,000 Ｇにおいて 30 分間遠心分離して溶液から出てきたいかなる沈殿物も除去した。このような条件のもとでそのＣＤ蛋白質は可溶性のままに留まった。その最終調剤の中のＣＤの量はＢＣＡ蛋白質アッセイにより約 100 μｇ／ｍｌであると求められ、そしてそのＣＤ蛋白質の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（第２図参照）及びデンシトメトリーにより評価された。第２図に示したＣＤ蛋白質の純度は約 95 ％であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、その作られたＣＤ蛋白質がそのような蛋白質について知られている 55 ないし 60 KDa の分子量を有していることを確認した（参考文献２１）。この精製されたＣＤ蛋白質のこの同一性は、臭化シアン分解破片のアミノ酸配列分析により、発表されている配列（参考文献２２）と比較して確認された。この精製したＣＤ蛋白質は -20 ℃において貯蔵した。例４この例は精製ＣＤ蛋白質を用いてのマウス及びモルモットの免疫感作を示す。５匹の Balb/c マウスのいくつかの群に第１、第 29 及び第 43 日目に、不活性化M．catarrhalis（約 10⁵ 個の細胞）か、又は例３に記述したように作られた精製ＣＤ蛋白質（0.3μｇないし10μｇ）かを AlPO₄（１投与当り 1.5 ｍｇ）の存在のもとに皮下的に（ｓ．ｃ．）３回注射した。第 14、28、42、及び 56 日目にその抗ＣＤ抗体力価をＥＩＡによって分析するために各血液試料を採取した。２匹のモルモット（ケベック州 Charles River）のいくつかの群を第１日目に完全なフロイントのアジュバント（ＣＦＡ）の中で乳化させた精製ＣＤ蛋白質の 10 μｇの投与により筋肉内的に（ｉ．ｍ．）免疫化した。第 14 及び第 29 日目に各動物に不完全なフロイントのアジュバント（ＩＦＡ）の中で乳化させた蛋白質の同量を追加投与した。第 42 日目にその抗血清の殺菌的活性を分析するために血液試料を採取した。例５この例はマウスの抗血清中の抗Ｃ／Ｄ抗体の決定のためのＥＩＡを示す。ＥＩＡを、Panrzutti 等（参考文献２３）により記述されたと本質的に同様に実施した。マイクロタイタの各窪をＣＤ蛋白質の１μｇで室温において 16 時間にわたり被覆した。次に各プレートをＰＢＳの中の 0.1 ％（ｗ／ｖ）の牛血清アルブミンでブロックした。各マウス血清を順次稀釈し、各窪に加え、次いで室温において１時間にわたりインキュベートした。西洋わさびペルオキシダーゼに抱合させた山羊の抗マウス IgG （Fc 特異性）抗体の親和性精製した F(ab’)₂ 断片を第２抗体として用いた。反応はテトラメチルベンチジン（ＴＭＢ／H₂O₂ ）を用いて展開させ、そして吸光度を 450 ｎｍにおいて（参照波長として 540 ｎｍを用いて）Flow Multiskan ＭＣＣマイクロプレートリーダーの中で測定した。抗血清の反応性力価は稀釈の逆数として定義したが、予備免疫血清試料で得られたそれよりも吸光度の２倍の上昇を一定的に示す。例６この例はマウスの血清の中の抗ＣＤ IgG の従属群を決定するためのＥＩＡを示す。マイクロタイタの各窪を精製ＣＤの１μｇで被覆した。免疫性研究（例４に記述した通りの）からのマウス血清試料の各最終ブリードをプールしてＥＩＡにおいて試験した。西洋わさびペルオキシダーゼに抱合させたラットの抗マウス Ig G₁、IgG_2a、IgG_2b抗体及び西洋わさびペルオキシダーゼに抱合させたラビットの抗マウス IgG₃をＥＩＡにおける試薬として用いた。各抱合体の使用稀釈度は交叉反応性を除くために精製抗体従属群を用いて決定した。各反応性力価は例５におけるそれとして記述したように決定した。例７この例は流動サイトメトリー分析を示す。 M．catarrhalis 株 RH408 を例１に記述したと同様に約２×10⁴ Cfu／ｍｌまで育成し、そして次に100 μｌの部分量を、１％ＢＳＡの含まれたＢＰＳ（４mM のMa₂HPO₄・7H₂O、1.5mM の KH₂PO₄、140mM のNaCl、７ mM のKCl、ｐＨ 7.3）の中に１／500 に稀釈した 200 μｌの各抗血清と混合した。各試料を次に４℃において30分間インキュベートした。H．influenxzae 株12 も２×10⁴ Cfu／ｍｌまで成育させ、同じ抗血清とともにインキュベートし、そして負のコントロールとして用いた。追加的ないくつかのコントロールはいかなる１次抗血清も存在しない抱合体のみを用いたインキュベーション含んだ。１次インキュベーションの後でバクテリアを１％のＢＳＡの含まれたＰＢＳで２回洗浄し、そして次に 200 μｌの、親和性精製した山羊抗マウスイムノグロブリン−ＤＴＡＦ（オンタリオ州 Mississaga の Jackson ImmunoResearch Labs，Inc.）と混合した。バクテリアを４℃において30分間その抱合体とともにインキュベートし、ＰＢＳ／ＢＳＡの中で２回洗浄し、そして１％のパラホルムアルデヒドの中に再懸濁させた。着色させたバクテリアの蛍光を Coulter Elite 流動サイトメータを用いて評価した。各分析において１万個のバクテリアを評価した。アルゴンレーザーを用い、そして 525 ｎｍのところの発光信号を捕集した。抗体結合の水準は対数スケール基準の蛍光の平均チャンネルとして表わした。例８この例はM．catarrhalis に対する殺菌的評価を示す。抗血清のいくつかの試料（25 μｌ）を 56 ℃に 30 分間加熱して補体活性を除き、そして 0.1 ％のＢＳＡ（ＶＢＳ）を含むベロナール緩衝液（NaCl 8.0 g /l、NaHCO₃ 0.25g/l、Na バルビツレート 0.30g/l、バルビツール酸0.45 g/l、 MgCl₂・6H₂O 0.1g/l，CaCl₂・2H₂O 0.05g/l）の中に１：８に稀釈し、次いで 96 個の窪の Nune マイクロタイタープレートの第１窪に加えた。ＶＢＳの中の各抗血清の１連の２倍稀釈物を残余の窪の中に入れた。Ａ₅₇₈＞0.5まで成育させたバクテリア細胞をＶＢＳの中で１： 200,000 に稀釈し、そしてこのバクテリア懸濁液の各 25 μｌの部分量を各窪に加えた。モルモット補体（ＭＤの Walkersvi lle の Biowhittaker）をＶＢSの中に１： 10 に稀釈し、そしてこの溶液の 25 μｌを各窪に加えて反応を開始させた。各プレートを 37 ℃において 60 分間インキュベートし、そして次に各反応混合物の 50 μｌを 2.2 ％の Mueller-Hint on ブイヨン及び 1.5 ％の寒天を含む Mueller-Hinton の寒天プレートの上に塗布した。37℃において 48 時間インキュベートした後、各コロニーを計数して殺菌性力価（予備免疫血清を含むコントロールと比較して50 ％よりも多いバクテリアを殺菌できる抗血清の最高稀釈度の逆数）を求めた。開示の要約この開示の要約として、本発明は Moraxella 株から単離されたものであるか、又はこれに相当するものである、分離精製された非変性外膜蛋白質及びこのものをバクテリアの株から分離する方法を提供するものである。種々の変法が本発明の範囲内で可能である。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年１１月１８日【補正内容】２３．検体中でMoraxella catarrhalis蛋白の外層膜蛋白ＣＤと特異的に反応する抗体の有無を測定する方法であって、（ａ）ＣＤ蛋白および該蛋白と特異的に反応する検体中に存在する前記抗体を有してなる複合体を形成するような条件下で、請求項１記載のＣＤ蛋白と検体とを接触させる段階；ならびに（ｂ）前記複合体の形成を測定する段階を有してなる方法。２４．検体中のＣＤ蛋白の有無を測定する方法であって、（ａ）被験者を、請求項８記載の免疫原性組成物で免疫感作して、ＣＤ蛋白に特異的な抗体を産生する段階、（ｂ）検体と前記抗体とを接触させて、検体中に存在するＣＤ蛋白と前記ＣＤ蛋白特異抗体を有してなる複合体を形成する段階；ならびに（ｃ）前記複合体の形成を測定する段階を有してなる方法。２５．検体中のＣＤ蛋白が、（ａ）Moraxella catarrhalis株あるいは（ｂ）ＣＤ蛋白を産生するかまたは宿主においてＣＤ蛋白と特異的に反応する抗体を形成することができる蛋白を産生する細菌の一部である請求項２３記載の方法。２６．検体中でＣＤ蛋白と特異的に反応する抗体の有無を測定するための診断キットであって、（ａ）請求項１記載のＣＤ蛋白、（ｂ）前記ＣＤ蛋白と検体とを接触させて、前記ＣＤ蛋白および検体中に存在する前記抗体とを有してなる複合体を形成する手段、ならびに（ｃ）前記複合体の形成を測定する手段を有してなる診断キット。２７．検体中のＣＤ蛋白の有無を検出するための診断キットであって、（ａ）請求項１９記載の抗体、（ｂ）該抗体と検体とを接触させて、ＣＤ蛋白およびＣＤ特異抗体を有してなる複合体を形成する手段、ならびに（ｃ）前記複合体の形成を測定する手段を有してなる診断キット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 16/12 Ｃ０７Ｋ 16/12 Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｎ 1/20 ＡＣ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/00 ＢＣ１２Ｐ 21/00 Ｇ０１Ｎ 33/50 ＴＧ０１Ｎ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 33/569 Ｆ 33/569 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ハークネス、ロビンイー. カナダ国エム２ケー１ビー８オンタリオ州ウイロウダールシェパードアヴェニューイースト 640 アパートメント 1706番 (72)発明者マイアーズ、リサイー. カナダ国エヌ１イー２エックス５オンタリオ州ゲルフエリザベスストリート 187 (72)発明者マクギネス、アーシュラカナダ国エル４エス１ジー３オンタリオ州リッチモンドヒルアルマコート６ (72)発明者クライン、マイケルエイチ. カナダ国エム２ピー１ビー９オンタリオ州ウイロウダールムンロブールヴァード 16

Claims

【特許請求の範囲】１．Moraxella株または該菌株の機能的類縁物から単離することができる単離・精製非変性外層膜蛋白ＣＤ。２．前記Moraxella株におけるＣＤ蛋白の特徴的免疫原性を有する請求項１記載のＣＤ蛋白。３．Moraxella株がMoraxella catarrhalisである請求項２記載のＣＤ蛋白。４．前記菌株が、Moraxella catarrhalis RH408である請求項３記載のＣＤ蛋白。５．約７０重量％以上の純度を有する請求項１記載のＣＤ蛋白。６．約９５重量％以上の純度を有する請求項５記載のＣＤ蛋白。７．水溶液の形の請求項２記載のＣＤ蛋白。８．請求項１記載の外層膜蛋白を免疫的に有効な量で含有する免疫原性組成物。９．宿主に対するin vivo投与用のワクチンとして製剤して、ＣＤ蛋白を産生するかあるいは宿主においてＣＤ蛋白と特異的に反応する抗体を誘発することができる蛋白を産生する病原菌によって引き起こされる疾患に対する予防を行う請求項８記載の免疫原性組成物。１０．病原菌がMoraxella株である請求項９記載の免疫原性組成物。１１．菌株がMoraxella catarrhalisである請求項１０記載の免疫原性組成物。１２．さらに１以上の他の免疫原性または免疫刺激性材料を有してなる請求項１１記載の免疫原性組成物。１３．１以上の他の免疫刺激性材料が１以上のアジュバントである請求項１２記載の免疫原性組成物。１４．１以上のアジュバントが、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＱＳ２１、ＱｕｉｌＡまたはそれらの誘導体もしくは成分、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、糖脂質類縁体、アミノ酸のオクタデシルエステル、ムラミルジペプチド、リポ蛋白、ポリホスファゼン、ＩＳＣＯＭ基質、ＩＳＣＯＰＲＰ、ＤＣ−ｃｈｏｌならびにＤＤＢＡからなる群から選択される請求項１３記載の免疫原性組成物。１５．宿主が霊長類である請求項１４記載の免疫原性組成物。１６．霊長類がヒトである請求項１５記載の免疫原性組成物。１７．微粒子、カプセル、ＩＳＣＯＭまたはリポソーム製剤として製剤される請求項９記載の免疫原性組成物。１８．免疫系の特異的細胞または粘膜表面への運搬のために標的分子と組み合わせた請求項９記載の免疫原性組成物。１９．請求項８記載の免疫原性組成物によって宿主を免疫感作することで産生することができるMoraxellaの外層膜ＣＤ蛋白に特異的な抗体。２０．宿主で免疫応答を発生させる方法において、宿主に請求項８記載の免疫原性組成物を免疫的に有効な量で投与する段階を有してなる方法。２１．前記免疫応答が、体液性または細胞介在性の免疫応答である請求項２０記載の方法。２２．前記免疫応答が、宿主に対して、ＣＤ蛋白を産生するかまたは宿主においてＣＤ蛋白と特異的に反応する抗体を誘発することができる蛋白を産生する病原菌によって引き起こされる疾患の予防を行うものである請求項２１記載の方法。２３．検体中でMoraxella catarrhalis蛋白の外層膜蛋白ＣＤと特異的に反応する抗体の有無を測定する方法であって、（ａ）ＣＤ蛋白および該蛋白と特異的に反応する検体中に存在する前記抗体を有してなる複合体を形成するような条件下で、請求項１記載のＣＤ蛋白と検体とを接触させる段階；ならびに（ｂ）前記複合体の形成を測定する段階を有してなる方法。２４．検体中のＣＤ蛋白の有無を測定する方法であって、（ａ）被験者を、請求項８記載の免疫原性組成物で免疫感作して、ＣＤ蛋白に特異的な抗体を産生する段階、（ｂ）検体と前記抗体とを接触させて、検体中に存在するＣＤ蛋白と前記ＣＤ蛋白特異抗体を有してなる複合体を形成する段階；ならびに（ｃ）前記複合体の形成を測定する段階を有してなる方法。２５．検体中のＣＤ蛋白が、（ａ）Moraxella catarrhalis株あるいは（ｂ）ＣＤ蛋白を産生するかまたは宿主においてＣＤ蛋白と特異的に反応する抗体を形成することができる蛋白を産生する細菌の一部である請求項２３記載の方法。２６．検体中でＣＤ蛋白と特異的に反応する抗体の有無を測定するための診断キットであって、（ａ）請求項１記載のＣＤ蛋白、（ｂ）前記ＣＤ蛋白と検体とを接触させて、前記ＣＤ蛋白および検体中に存在する前記抗体とを有してなる複合体を形成する手段、ならびに（ｃ）前記複合体の形成を測定する手段を有してなる診断キット。２７．検体中のＣＤ蛋白の有無を検出するための診断キットであって、（ａ）請求項１７記載の抗体、（ｂ）該抗体と検体とを接触させて、ＣＤ蛋白およびＣＤ特異抗体を有してなる複合体を形成する手段、ならびに（ｃ）前記複合体の形成を測定する手段を有してなる診断キット。２８．ＣＤ蛋白を産生するかあるいは宿主においてＣＤ蛋白と特異的に反応する抗体を誘発することができる蛋白を産生する病原菌によって引き起こされる疾患に対する予防のためのワクチンを製造する方法であって、請求項８記載の免疫原性組成物を被験宿主に投与して、ＣＤ蛋白を産生するかまたは宿主においてＣＤ蛋白と特異的に反応する抗体を形成することができる蛋白を産生する病原菌によって引き起こされる疾患に対する予防を行うために該組成物の各種成分の相対量および該組成物の投与頻度を求める段階；ならびに前記の所定の投与量および投与頻度に従って被投与宿主に投与するのに好適な剤型で免疫原性組成物を製剤する段階を有してなる製造方法。２９．投与宿主がヒトである請求項２８記載の方法。３０．Moraxella株からの外層膜蛋白ＣＤに特異的なモノクローナル抗体を形成する方法であって、（ａ）請求項８記載の免疫原性組成物を１匹以上のマウスに投与して、１匹以上の免疫感作マウスを得る段階、（ｂ）前記１匹以上の免疫感作マウスからＢリンパ球を採取する段階、（ｃ）前記１匹以上の免疫感作マウスから採取したＢリンパ球を骨髄腫細胞と融合することで、ハイブリドーマを形成する段階、（ｄ）特定の抗ＣＤ蛋白抗体を産生するハイブリドーマをクローニングする段階、（ｅ）前記抗ＣＤ蛋白抗体産生クローンを培養する段階、ならびに（ｆ）前記培地から抗ＣＤ蛋白抗体を単離する段階を有してなる方法。３１．ＣＤ蛋白を産生する菌株の単離・精製外層膜蛋白ＣＤを製造する方法であって、（ａ）前記菌株の細胞塊を取得する段階、（ｂ）前記細胞塊を破壊して、細胞溶解物を得る段階、（ｃ）前記細胞溶解物を分別して、第１の上清と第１のペレットを得て、該第１の上清が実質的に大部分の可溶性細菌蛋白を含有するものである段階、（ｄ）前記第１の上清を前記第１のペレットから分離する段階、（ｅ）前記第１のペレットの選択的抽出を行って、該ペレットから実質的に全ての可溶性蛋白およびＣＤ蛋白以外の膜蛋白を除去して、第２の上清およびＣＤ蛋白を含む抽出済みペレットを得る段階、（ｆ）前記第２の上清を前記抽出済みペレットから分離する段階、（ｇ）前記抽出済みペレットを溶解させて、可溶化抽出物を得る段階、（ｈ）前記可溶化抽出物を分別して、ＣＤ蛋白含有上清と廃棄ペレットを得る段階；ならびに（ｉ）前記ＣＤ蛋白含有上清を廃棄ペレットから分離する段階を有してなる方法。３２．前記菌株がMoraxella株である請求項３１記載の方法。３３．前記菌株が、Moraxella catarrhalisである請求項３１記載の方法。３４．前記細胞溶解物をそれの遠心によって分別し、可溶化抽出物をそれの遠心によって分別する請求項３１記載の方法。３５．第１のペレットを選択的に抽出する段階が、１以上の界面活性剤抽出を有してなる請求項３４記載の方法。３６．前記第１のペレットの抽出段階が、複数の界面活性剤抽出を有してなる請求項３５記載の方法。３７．前記抽出済みペレットを、該抽出済みペレットの可溶化を行って可溶化抽出物を提供するだけの温度および時間で、界面活性剤および可溶化剤を含む緩衝液に分散させ、その液によって可溶化する請求項３５記載の方法。３８．前記緩衝液が約７〜約８．５のｐＨを有し、界面活性剤を約０．１〜約２重量％含有し、前記可溶化剤としての尿素を約３〜約８Ｍで含有する請求項３７記載の方法。３９．界面活性剤が、トリトンＸ−１００である請求項３８記載の方法。４０．前記可溶化を、約４０〜約７０℃で約１０〜約１２０分間行う請求項３８記載の方法。４１．引き続きＣＤ含有上清を透析して前記界面活性剤および可溶化剤を除去して、さらに純粋な非変性形のＣＤ蛋白溶液を得る請求項４０記載の方法。４２．Moraxella catarrhalis RH408（ＡＴＣＣ指定番号５５６３７）の確認特性を有するMoraxella catarrhalis菌株。４３．抗血清の抗Moraxella抗殺菌活性を測定する方法において、前記抗血清によって請求項４０記載の非凝集株の所定数の細胞の補体介在殺菌を実施する段階、ならびに前記抗Moraxella抗殺菌活性の尺度として前記抗血清によって殺菌された前記所定数の細胞の割合を測定する段階を有してなる方法。