JPH1014581A - Rabbit-type macrophage colony stimulant factor and dna fragment coding the same - Google Patents

Rabbit-type macrophage colony stimulant factor and dna fragment coding the same

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JPH1014581A
JPH1014581A JP8177916A JP17791696A JPH1014581A JP H1014581 A JPH1014581 A JP H1014581A JP 8177916 A JP8177916 A JP 8177916A JP 17791696 A JP17791696 A JP 17791696A JP H1014581 A JPH1014581 A JP H1014581A
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Japan
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rabbit
csf
amino acid
seq
acid sequence
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JP8177916A
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Japanese (ja)
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Koki Matsuyama
公喜 松山
Atsushi Ota
淳 太田
Kayoko Kato
佳代子 加藤
Seiichi Shimamura
誠一 島村
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Morinaga Milk Industry Co Ltd
Original Assignee
Morinaga Milk Industry Co Ltd
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain the subject new substance containing a specific amino acid sequence, which is allowed to have amino acid variation(s) unless functions to promote the survival, proliferation and differentiation of monocytes and macrophages are impaired, to be used for preventing and treating rabbit diseases and for developing medicines for such diseases. SOLUTION: This substance is a new rabbit-type macrophage colony stimulant factor which contains the amino acid sequence covering No.1 to 221 amino acids in an amino acid sequence of the formula, and is allowed to have amino acid variation(s) i.e., the substitution, insertion, deletion and/or transformation of at least one amino acid unless functions to promote the survival, proliferation and differentiation of monocytes and macrophages are impaired. This factor is applicable to preventing, treating rabbit diseases and developing medicines for such diseases. This factor is obtained by a process wherein a mRNA is isolated from established rabbit corneal cells SIRC, a cDNA is then synthesized using the mRNA, and subjected to PCR using a primer coding the partial amino acid sequence of the macrophage colony stimulant factor, and the resultant gene is expressed.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なウサギ型マ
クロファージ・コロニー刺激因子及びこれをコードする
ＤＮＡ断片に関する。ウサギ型マクロファージ・コロニ
ー刺激因子は、ウサギの病気の予防、治療、医薬品開発
等に応用することができる。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel rabbit macrophage colony stimulating factor and a DNA fragment encoding the same. Rabbit-type macrophage colony stimulating factor can be applied to prevention, treatment, drug development and the like of rabbit diseases.

【０００２】[0002]

【従来の技術】ヒト・マクロファージ・コロニー刺激因
子（以下、マクロファージ・コロニー刺激因子を「Ｍ−
ＣＳＦ」と記載することがある）は、単球、マクロファ
ージの生存、増殖及び分化を促進する機能を有するタン
パク質であり、単球、マクロファージの増殖及び活性化
を介した免疫賦活効果を有することが知られている。ヒ
ト型Ｍ−ＣＳＦは、既にアミノ酸配列が決定され［サイ
エンス(Science)、第２３５巻、第４７９５号、第１５
０４〜１５０８ページ、１９８７年］、ヒト尿から精製
されたヒト型Ｍ−ＣＳＦは、白血球増殖を目的とする医
薬品として平成３年から市販されており、その他の多様
な薬理効果、特に前述したように単球、マクロファージ
を介した免疫賦活活性を有することが解明されつつあ
る。BACKGROUND OF THE INVENTION Human macrophage colony stimulating factor (hereinafter referred to as "M-
CSF) is a protein having a function of promoting the survival, proliferation and differentiation of monocytes and macrophages, and may have an immunostimulatory effect through the proliferation and activation of monocytes and macrophages. Are known. The amino acid sequence of human M-CSF has already been determined [Science, Vol. 235, No. 4795, No. 15].
04-1508, 1987], human M-CSF purified from human urine has been marketed since 1991 as a drug for leukocyte proliferation, and has various other pharmacological effects, particularly as described above. It has been elucidated to have immunostimulatory activity via monocytes and macrophages.

【０００３】リコンビナント・ヒト型Ｍ−ＣＳＦは、大
腸菌、動物細胞等で生産されて研究用に使用され、その
立体構造も解明されつつある［ザ・ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー(The Journal of Biolog
ical Chemistry) 、第２６９巻、第４９号、第３１１７
１〜３１１７７ページ、１９９４年］。[0003] Recombinant human M-CSF is produced in Escherichia coli, animal cells and the like, used for research, and its three-dimensional structure is being elucidated [The Journal of Japan].
Biological chemistry (The Journal of Biolog
269, No. 49, No. 3117)
1-31177, 1994].

【０００４】また、マウスのＭ−ＣＳＦも、既にアミノ
酸配列が決定され［ヌクレイック・アシッド・リサーチ
(Nucleic Acid Research) 、第１５巻、第５号、第２３
８９〜２３９０ページ、１９８７年］、この組換えマウ
ス型Ｍ−ＣＳＦが、組換えヒト型Ｍ−ＣＳＦと共に試薬
として販売されている（フナコシ株式会社、総合カタロ
グ１９９５−１９９６、第１０〜１４ページ）。[0004] The amino acid sequence of mouse M-CSF has also been determined [Nucleic Acid Research].
(Nucleic Acid Research), Vol. 15, No. 5, No. 23
89-2390, 1987], and the recombinant mouse M-CSF is sold as a reagent together with the recombinant human M-CSF (Funakoshi Co., Ltd., general catalog 1995-1996, pp. 10-14). .

【０００５】ラット型Ｍ−ＣＳＦのアミノ酸配列も、既
に決定されている［ビオキミカ・エト・ビオフィジカ・
アクタ(Biochimica et Biophysica Acta) 、第１１７４
巻、第１４３〜１５２ページ、１９９３年）］が、その
配列は、マウスと全く同一とされている。ウサギ型Ｍ−
ＣＳＦはその存在は推定されているが、適当な細胞株等
を用いて大量に調製された実績はなく、従来そのアミノ
酸配列は、解明されていなかった。The amino acid sequence of rat M-CSF has also been determined [Biokimica eto biophysica.
Actor (Biochimica et Biophysica Acta), 1174
Vol., Pp. 143-152, 1993), but the sequence is exactly the same as that of the mouse. Rabbit type M-
Although the existence of CSF is presumed, there has been no record of preparing CSF in a large amount using an appropriate cell line or the like, and its amino acid sequence has not been elucidated conventionally.

【０００６】一方、ウサギは、毛皮、肉等を採取するた
めの家畜として、また、重要な実験動物として特に抗体
の調製に多用され、更にペットとしても広く飼育されて
いるが、高温多湿の我が国では、梅雨時、春秋の長雨時
等に体調不良となり、生後数日にして死亡することが多
く、飼育しやすい丈夫な品種が求められていると共に、
幼時、多湿の時期に免疫能を高め、病気に罹患し難くす
るための、薬剤及び技術が求められていた。[0006] On the other hand, rabbits are widely used as livestock for collecting fur, meat, etc., and as important experimental animals, particularly for the preparation of antibodies, and are also widely bred as pets. Then, during the rainy season, during the long rainy season of spring and autumn, it becomes unwell, often dies several days after birth, and a strong variety that is easy to breed is required,
There has been a need for drugs and techniques for enhancing immunity and reducing illness during childhood and humid periods.

【０００７】例えば、実験動物として飼育されているウ
サギは、我が国では１９８６年度で１７万羽（正田陽一
編、「ものをつくる動物たち」、第１１５ページ、東京
書籍、昭和６３年）、米国では５０万羽が飼育されてい
る（John E. Harkness and Joseph E. Wagner 著、今道
友則監訳、「ウサギとげっ歯類の生物学と臨床医学」、
第１２ページ、養賢堂、１９８５年）。ウサギは多産で
あり、１羽の雌が１年に約８０羽の仔ウサギを産出する
が、仔ウサギは消化器疾患等の感染症のためにその内約
３０〜５０羽が成育するに過ぎず、ウサギの疾病予防
は、実験動物、ペット用仔ウサギの供給上大きな課題で
あり、適当な予防、治療薬が待望されている（Lieve Ok
erman 著、斎藤久美子訳、「うさぎの臨床」、６ペー
ジ、インターズー社、１９９４年）。For example, in Japan, 170,000 rabbits are raised as experimental animals in Japan in 1986 (Yoichi Shoda, "Animals Making Things", page 115, Tokyo Book, 1988), and in the United States. 500,000 birds are bred (John E. Harkness and Joseph E. Wagner, translated by Tomonori Imado, "Rabbit and rodent biology and clinical medicine",
12th page, Yokendo, 1985). Rabbits are prolific, and one female produces about 80 pups a year, but about 30 to 50 pups grow due to infectious diseases such as digestive diseases. The prevention of disease in rabbits is a major issue in the supply of laboratory animals and rabbits for pets.
Erman, translated by Kumiko Saito, "Clinic of Rabbits", p. 6, Interzoo, 1994).

【０００８】実験動物としてのウサギは、前臨床試験、
特に奇形学的実験、組織培養、毒性試験、眼科学実験、
抗体の産生等で重要であり、病弱になりがちな純系ウサ
ギを経済的に確保するために、特に幼時において生存率
の向上できる薬剤が待望されてきた。また、家庭、動物
公園等でもペットとして広く飼育されているイエウサギ
及びパンダウサギ（白黒まだらのウサギ）は比較的病弱
で、梅雨時の高温多湿、晩秋の冷雨の季節に感染症、消
化不良等により死亡することが多く、適当な免疫増強
剤、特に副作用の少ない天然物由来の薬剤が待望されて
いた。[0008] Rabbits as experimental animals have been
Especially teratological experiments, tissue culture, toxicity tests, ophthalmological experiments,
In order to economically secure pure rabbits that are important in the production of antibodies and are likely to be sick, drugs that can improve the survival rate, particularly at an early age, have been desired. In addition, house rabbits and panda rabbits (black and white mottled rabbits), which are widely bred as pets in homes and animal parks, are relatively sick, and have infectious diseases, indigestion, etc. during the hot and humid season during the rainy season, the cold rainy season in the late autumn. Therefore, suitable immunopotentiators, especially drugs derived from natural products having few side effects, have been desired.

【０００９】このような状況において、ヒトに対するヒ
ト型Ｍ−ＣＳＦの臨床的使用経験における有用性から、
ウサギの場合にも感染症予防及び治療に効果が期待でき
るウサギ型Ｍ−ＣＳＦの実用化が望まれていた。In such a situation, the usefulness of human M-CSF in clinical use in humans indicates that
In the case of rabbits, the practical use of rabbit type M-CSF, which is expected to be effective in preventing and treating infectious diseases, has been desired.

【００１０】しかしながら、ウサギではＭ−ＣＳＦを産
生している細胞株が、従来特定されておらず、従ってウ
サギ型Ｍ−ＣＳＦの解明、利用も不可能であった。その
理由は、ウサギ型Ｍ−ＣＳＦの生体成分からの精製は、
ヒト型Ｍ−ＣＳＦが精製された材料である人尿のような
適当な材料が採取困難であることによるものであった。
例えば、ウサギの尿は、不純物を大量に含有し、タンパ
ク質の精製が困難であり、更に、ウサギの細胞株のうち
Ｍ−ＣＳＦを発現している細胞株は、従来明らかにされ
ておらず、組換えＤＮＡ技術により生産するために必要
なｃＤＮＡ配列は、解明されていなかった。[0010] However, a cell line producing M-CSF in rabbits has not been identified so far, and it has been impossible to elucidate and utilize rabbit M-CSF. The reason is that the purification of rabbit M-CSF from biological components
This was because it was difficult to collect a suitable material such as human urine from which human M-CSF was purified.
For example, rabbit urine contains a large amount of impurities, and it is difficult to purify proteins. Further, among cell lines of rabbits, cell lines expressing M-CSF have not been clarified, The cDNA sequence required for production by recombinant DNA technology has not been elucidated.

【００１１】このように、ウサギ型Ｍ−ＣＳＦの取得が
容易でないので、ウサギの病気の治療又は予防の目的
で、例えばヒト型Ｍ−ＣＳＦをウサギに投与しても、種
の相違から有効性が低く、その効果は期待できない。ま
た、長期又は反復投与により生じるヒト型Ｍ−ＣＳＦに
対する抗体に由来する副作用が不可避であった。As described above, since it is not easy to obtain rabbit type M-CSF, even if human type M-CSF is administered to rabbits for the purpose of treating or preventing diseases of rabbits, for example, its efficacy is high due to differences in species. But its effect is not expected. In addition, side effects derived from antibodies to human M-CSF caused by long-term or repeated administration were inevitable.

【００１２】また、医薬品開発の重要な１段階である薬
理試験において、ヒト型Ｍ−ＣＳＦの用途拡大の目的で
ヒト型Ｍ−ＣＳＦをウサギに投与し、このモデル実験系
で種々の解明を実施した場合、種の相違により抗体を生
じ、その効果の解明が困難であるのみならず、ウサギの
ショック死等も惹起することから、適切な薬理試験を行
うことが不可能であった（造血因子、第５巻、第１号、
第１９ページ、１９９４年）。In a pharmacological test, which is an important step in drug development, human M-CSF was administered to rabbits for the purpose of expanding the use of human M-CSF, and various elucidations were carried out in this model experimental system. In such a case, it is impossible to carry out an appropriate pharmacological test because antibodies are generated due to the difference in species, and it is difficult to elucidate the effects thereof, as well as to cause shock death of rabbits and the like (hematopoietic factors). , Volume 5, Issue 1,
19, 1994).

【００１３】[0013]

【発明が解決しようとする課題】ウサギ型Ｍ−ＣＳＦ
は、上述したように、その存在は推定されているが実用
的な量として調製された実績はない。本発明は、ウサギ
型Ｍ−ＣＳＦ及びこれをコードするＤＮＡ断片を提供す
ることを課題とする。Rabbit type M-CSF
Has been presumed to exist as described above, but has never been prepared as a practical amount. An object of the present invention is to provide a rabbit type M-CSF and a DNA fragment encoding the same.

【００１４】[0014]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決するために、ウサギ型Ｍ−ＣＳＦを取得すること
を企図し、その生産手段として、天然物からの精製は可
能性が低いことから、組換えＤＮＡ技術による生産につ
いて鋭意研究を行った。組換えＤＮＡ技術によるタンパ
ク質の生産においては、そのタンパク質をコードするｃ
ＤＮＡの取得が必須となるが、従来、このｃＤＮＡの取
得に適した細胞材料が知られていなかったので、本発明
者らは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（以下ＡＴＣＣと記載する）保存細胞株、理化学研究
所保存細胞株等について鋭意探索し、ウサギ型Ｍ−ＣＳ
ＦのｃＤＮＡ断片を取得するための材料として、ウサギ
細胞株約５０種の培養液をマウス骨髄細胞を用いたコロ
ニー形成アッセイ法によりＣＳＦ活性を指標にスクリー
ニングした結果、高いＭ−ＣＳＦ活性を有するタンパク
質を産生するウサギ株化細胞株のうち、特に角膜細胞株
ＳＩＲＣ（大日本製薬社製）が、比活性が高く、増殖特
性も良好であり、材料として望ましいことを見い出し
た。Means for Solving the Problems In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have attempted to obtain rabbit M-CSF, and as a means for producing the same, purification from natural products may be possible. Due to its low quality, intensive studies were conducted on production by recombinant DNA technology. In the production of proteins by recombinant DNA technology, c
Although it is necessary to obtain DNA, cell materials suitable for obtaining this cDNA have not been known so far. Therefore, the present inventors have studied American Type Culture Collection (hereinafter referred to as ATCC) -preserved cells. Strains, RIKEN preserved cell lines, etc.
As a material for obtaining the cDNA fragment of F, a protein having high M-CSF activity was obtained by screening a culture of about 50 kinds of rabbit cell lines by colony formation assay using mouse bone marrow cells using CSF activity as an index. Among rabbit cell lines that produce E. coli, corneal cell line SIRC (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) has been found to have high specific activity, good growth characteristics, and is desirable as a material.

【００１５】更に、本発明者らは、この細胞株からＭ−
ＣＳＦをコードするｃＤＮＡ断片を単離することに成功
し、その塩基配列を決定し、これを用いて細菌及び細胞
株での生産系を構築し、このタンパク質を大量生産する
ことに成功し、本発明を完成した。Further, the present inventors have determined that M-
Succeeded in isolating the cDNA fragment encoding CSF, determining its nucleotide sequence, using this to construct a production system in bacteria and cell lines, and succeeding in mass-producing this protein. Completed the invention.

【００１６】すなわち、本願の第一の発明は、配列番号
２においてアミノ酸番号１〜２２１で表されるアミノ酸
配列を含み、単球、マクロファージの生存、増殖及び分
化を促進する機能を損なわない１又は２以上のアミノ酸
残基の置換、挿入、欠失又は転位を含んでいてもよいウ
サギ型マクロファージ・コロニー刺激因子である。That is, the first invention of the present application includes the amino acid sequence represented by amino acid Nos. 1 to 221 in SEQ ID NO: 2, which does not impair the function of promoting the survival, proliferation and differentiation of monocytes and macrophages. Rabbit-type macrophage colony-stimulating factor which may contain substitution, insertion, deletion or transposition of two or more amino acid residues.

【００１７】また、本願の第二の発明は、配列番号２に
おいてアミノ酸番号１〜２２１で表されるアミノ酸配列
を含み、単球、マクロファージの生存、増殖及び分化を
促進する機能を損なわない１又は２以上のアミノ酸残基
の置換、挿入、欠失又は転位を含んでいてもよいウサギ
型マクロファージ・コロニー刺激因子をコードするＤＮ
Ａ断片である。Further, the second invention of the present application includes the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 221 in SEQ ID NO: 2, which does not impair the function of promoting survival, proliferation and differentiation of monocytes and macrophages. DN encoding rabbit macrophage colony stimulating factor optionally containing substitution, insertion, deletion or transposition of two or more amino acid residues
A fragment.

【００１８】[0018]

【発明の実施の形態】以下に、本発明について詳述する
が、説明を容易にするために、先ず本願の第二の発明か
ら詳述する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail, but for ease of explanation, the second invention of the present application will be described first.

【００１９】本発明のＤＮＡ断片は、後述するように、
Ｍ−ＣＳＦを産生するウサギ株化細胞株から調製したｃ
ＤＮＡから、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション
（ＰＣＲ）により増幅することによって得られる。ま
た、本発明により、Ｍ−ＣＳＦのｃＤＮＡの塩基配列が
明らかになったので、化学合成することによっても本発
明のＤＮＡ断片は得られる。さらに、ウサギ染色体ＤＮ
Ａを鋳型としてＰＣＲを行なうことにより、Ｍ−ＣＳＦ
をコードする染色体遺伝子が得られる。染色体由来のＭ
−ＣＳＦ遺伝子は、コード領域にイントロンを含むこと
が予想されるが、そのようなイントロンで分断されてい
るＤＮＡ断片であっても、Ｍ−ＣＳＦをコードする限
り、本発明のＤＮＡ断片に含まれる。The DNA fragment of the present invention is, as described below,
C prepared from a rabbit cell line producing M-CSF
It is obtained by amplifying from DNA by polymerase chain reaction (PCR). Furthermore, since the nucleotide sequence of the M-CSF cDNA has been elucidated by the present invention, the DNA fragment of the present invention can also be obtained by chemical synthesis. In addition, rabbit chromosome DN
By performing PCR using A as a template, M-CSF
Is obtained. M from chromosome
The -CSF gene is expected to contain an intron in the coding region, but even a DNA fragment interrupted by such an intron is included in the DNA fragment of the present invention as long as it encodes M-CSF. .

【００２０】ヒト型Ｍ−ＣＳＦの遺伝子を公知の方法
（特開平７−１４７９８９号公報）によりクローニング
した場合、約４ｋｂｐ以上の大きさのＤＮＡ断片が得ら
れる。生物活性を有する天然に存在する成熟型のヒト型
Ｍ−ＣＳＦは、２２３個のアミノ酸残基からなり、これ
をコードするＤＮＡの大きさは約７００ｂｐに相当す
る。When the human M-CSF gene is cloned by a known method (Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-147989), a DNA fragment having a size of about 4 kbp or more is obtained. The naturally occurring, mature human M-CSF having biological activity consists of 223 amino acid residues, and the size of the DNA encoding it is approximately 700 bp.

【００２１】Ｍ−ＣＳＦをコードするｃＤＮＡを取得す
るための材料としては、Ｍ−ＣＳＦを産生するウサギ由
来の臓器、又は株化した細胞であればすべて利用できる
が、その中でも特に角膜細胞が望ましい。角膜細胞から
常法［J. Sambrookら著、モレキュラー・クローニング
(Molecular Cloning) 、第３巻、第２版、コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spri
ng Harbor LaboratoryPress) 、１９８９年］によりメ
ッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を調製し、このｍＲＮ
Ａを鋳型として逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを調
製する。As a material for obtaining a cDNA encoding M-CSF, any organ derived from rabbits or cell lines that produce M-CSF can be used, and among them, corneal cells are particularly preferable. . Conventional method from corneal cells [Molecular cloning by J. Sambrook et al.
(Molecular Cloning), Volume 3, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press), 1989] to prepare messenger RNA (mRNA).
A single-strand cDNA is prepared using reverse transcriptase with A as a template.

【００２２】Ｍ−ＣＳＦの５´側プライマーと３´側プ
ライマーとして種々のオリゴヌクレオチドを化学合成し
て、これらと一本鎖ｃＤＮＡを用いて、ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼによりこのＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、アガ
ロースゲル電気泳動により目的の大きさのＤＮＡ断片を
調製する。調製したＤＮＡ断片は、直接塩基配列を決定
することができる。ＰＣＲに用いるプライマーとして
は、配列番号３及び４に示す塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチドが挙げられる。Various oligonucleotides are chemically synthesized as a 5'-side primer and a 3'-side primer of M-CSF, and using these and single-stranded cDNA, this DNA fragment is PCR-amplified by Taq DNA polymerase and subjected to agarose gel. A DNA fragment of a desired size is prepared by electrophoresis. The base sequence of the prepared DNA fragment can be determined directly. Examples of primers used for PCR include oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS: 3 and 4.

【００２３】また、この断片を適当な市販のプラスミド
ベクター、例えばｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、又はｐ
ＣＲII（インビトロゲン社製）に挿入し、大腸菌、例え
ばＨＢ１０１（宝酒造社製）、ＩＮＶＦ´α（インビト
ロゲン社製）を形質転換し、プラスミドを精製し、のち
塩基配列を決定することもできる。Further, this fragment is converted into an appropriate commercially available plasmid vector such as pUC118 (manufactured by Takara Shuzo) or pUC118
After insertion into CRII (manufactured by Invitrogen), Escherichia coli, for example, HB101 (manufactured by Takara Shuzo) or INVF'α (manufactured by Invitrogen) is transformed, the plasmid is purified, and then the nucleotide sequence can be determined.

【００２４】本発明のＤＮＡ断片の塩基配列を、常法に
より決定した結果を、配列番号１に示し、これがコード
しているアミノ酸配列を配列番号２に示した。本発明の
ＤＮＡ断片は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する
ウサギ型Ｍ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ断片である。配
列番号２において、成熟型ウサギ型Ｍ−ＣＳＦのアミノ
酸配列は、アミノ酸番号１〜２２１で表され、シグナル
配列を含むウサギ型Ｍ−ＣＳＦ前駆体のアミノ酸配列
は、アミノ酸番号−３２〜２２１で表される。成熟型ウ
サギ型Ｍ−ＣＳＦは、上記アミノ酸配列のＮ末端にメチ
オニン残基が付加されていてもよい。また、本発明にお
いて、ウサギ型Ｍ−ＣＳＦは、Ｍ−ＣＳＦとしての活
性、すなわち単球、マクロファージの生存、増殖及び分
化を促進する機能を実質的に損なわない限り、１又は２
以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を含ん
でいてもよい。これらのいずれのＭ−ＣＳＦをコードす
るＤＮＡ断片も本発明に含まれる。このようなＤＮＡ断
片として具体的には、配列番号１において塩基番号１０
１〜７６３で表される塩基配列を含むＤＮＡ断片、及び
配列番号１において塩基番号５〜７６３で表される塩基
配列を含むＤＮＡ断片が挙げられる。さらに、同一のア
ミノ酸配列をコードする塩基配列であれば、各アミノ酸
に対するコドンを同等のコドンに置換した配列も本発明
に含まれる。The result of the determination of the nucleotide sequence of the DNA fragment of the present invention by a conventional method is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence encoded by the result is shown in SEQ ID NO: 2. The DNA fragment of the present invention is a DNA fragment encoding rabbit M-CSF having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. In SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence of mature rabbit M-CSF is represented by amino acids Nos. 1-221, and the amino acid sequence of the rabbit M-CSF precursor including the signal sequence is represented by amino acids Nos. 32-22. Is done. The mature rabbit M-CSF may have a methionine residue added to the N-terminal of the amino acid sequence. In the present invention, rabbit M-CSF is 1 or 2 as long as the activity as M-CSF, that is, the function of promoting the survival, proliferation and differentiation of monocytes and macrophages is not substantially impaired.
The substitution, deletion, insertion or transposition of the above amino acid residues may be included. DNA fragments encoding any of these M-CSFs are also included in the present invention. Specifically, as such a DNA fragment, base number 10 in SEQ ID NO: 1
Examples include a DNA fragment containing the base sequence represented by base numbers 1 to 763 and a DNA fragment containing the base sequence represented by base numbers 5 to 763 in SEQ ID NO: 1. Furthermore, as long as the base sequence encodes the same amino acid sequence, a sequence in which a codon for each amino acid is replaced with an equivalent codon is also included in the present invention.

【００２５】次に、本願の第一の発明について詳述す
る。本発明のウサギ型Ｍ−ＣＳＦは、配列番号２におい
てアミノ酸番号１〜２２１で表されるアミノ酸配列を含
み、単球、マクロファージの生存、増殖及び分化を促進
する機能を損なわない１又は２以上のアミノ酸残基の置
換、挿入、欠失又は転位を含んでいてもよい。Next, the first invention of the present application will be described in detail. The rabbit type M-CSF of the present invention comprises an amino acid sequence represented by amino acids 1 to 221 in SEQ ID NO: 2, and does not impair the function of promoting survival, proliferation and differentiation of monocytes and macrophages. It may include substitution, insertion, deletion or transposition of amino acid residues.

【００２６】活性型Ｍ−ＣＳＦはホモ２量体からなる
が、単量体の成熟タンパク質を大腸菌で発現させた場
合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳
動）で分子量約２５，０００を示し、これを２量体化し
たものは分子量約５０，０００を示す。また、本願の第
二の発明のＤＮＡ断片を細胞株で発現させた場合には、
ウサギ型Ｍ−ＣＳＦは糖タンパク質として産生し、細胞
株としてＣＨＯ細胞由来のＤＵＫＸ−Ｂ１１細胞を用い
た場合には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量約９０，０００
の糖蛋白質として産生される。このような糖鎖を有する
ウサギ型Ｍ−ＣＳＦも本発明に含まれる。Active M-CSF is composed of a homodimer, but when a monomeric mature protein is expressed in Escherichia coli, it shows a molecular weight of about 25,000 by SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis). The dimerized product thereof has a molecular weight of about 50,000. When the DNA fragment of the second invention of the present application is expressed in a cell line,
Rabbit-type M-CSF is produced as a glycoprotein, and when DUKX-B11 cells derived from CHO cells are used as the cell line, the molecular weight is about 90,000 by SDS-PAGE.
It is produced as a glycoprotein. A rabbit type M-CSF having such a sugar chain is also included in the present invention.

【００２７】ウサギ型Ｍ−ＣＳＦは、例えば、本願の第
二の発明であるウサギ型Ｍ−ＣＳＦのＤＮＡ断片の全
部、又は一部を通常の方法により、プロモーター配列、
マーカー遺伝子、複製起点等を有する適当な発現ベクタ
ーに挿入して、微生物、培養細胞及び動植物に導入して
発現させることにより、大量に調製することが可能であ
る。例えば、Ｔ７ファージプロモーター、アンピシリン
耐性遺伝子、及び複製起点を有するプラスミドｐＥＴの
キット（宝酒造社製）を用い、このベクターのＴ７プロ
モーターの下流にあるクローニングサイトに本発明のウ
サギ型Ｍ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ断片を挿入し、キ
ットに含まれるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する
大腸菌を形質転換し、宿主大腸菌により産生されるＴ７
ＲＮＡポリメラーゼによりウサギ型Ｍ−ＣＳＦ遺伝子が
転写され、ｍＲＮＡが産生され、大腸菌によりウサギ型
Ｍ−ＣＳＦが発現される。成熟型ウサギ型Ｍ−ＣＳＦを
発現させる場合には、配列番号２においてアミノ酸番号
１〜２２１で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
断片の５’末端に開始コドン（ＡＴＧ）を、３’末端に
終始コドンを、これらの外側に制限酵素認識配列を付加
したものを用いればよい。これらのコドン及び制限酵素
認識配列を本発明のＤＮＡ断片に付加するには、このＤ
ＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅する際に用いるオリゴヌ
クレオチドプライマーに上記コドン及び制限酵素認識配
列を含ませればよい。発現されたウサギ型Ｍ−ＣＳＦ
は、顆粒体として菌体内に蓄積されているので、これを
８Ｍ尿素溶液、６Ｍグアニジン塩酸溶液等で可溶化し、
カラムクロマトグラフィーにより精製し、リフォールデ
ィングして天然と同一又は近似の構造を有するウサギ型
Ｍ−ＣＳＦを製造することができる。The rabbit M-CSF is prepared, for example, by subjecting all or a part of the DNA fragment of the rabbit M-CSF of the second invention of the present application to a promoter sequence,
It can be prepared in large quantities by inserting it into an appropriate expression vector having a marker gene, an origin of replication, etc., and introducing it into microorganisms, cultured cells, animals and plants, and expressing it. For example, using a T7 phage promoter, an ampicillin resistance gene, and a plasmid pET kit (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) having a replication origin, the rabbit M-CSF of the present invention is encoded at a cloning site downstream of the T7 promoter of this vector. The DNA fragment is inserted, E. coli having the T7 RNA polymerase gene contained in the kit is transformed, and T7 produced by the host E. coli is transformed.
The rabbit M-CSF gene is transcribed by RNA polymerase, mRNA is produced, and rabbit M-CSF is expressed by Escherichia coli. To express mature rabbit M-CSF, a DNA encoding the amino acid sequence represented by amino acids 1 to 221 in SEQ ID NO: 2
The fragment may have a start codon (ATG) at the 5 ′ end, a stop codon at the 3 ′ end, and a restriction enzyme recognition sequence added to the outside thereof. To add these codons and the restriction enzyme recognition sequence to the DNA fragment of the present invention, the D
The oligonucleotide primer used when amplifying the NA fragment by the PCR method may include the above-mentioned codon and restriction enzyme recognition sequence. Expressed rabbit type M-CSF
Is accumulated in the cells as granules, solubilized with 8M urea solution, 6M guanidine hydrochloride solution, etc.
Purification by column chromatography and refolding can produce rabbit M-CSF having the same or similar structure as that of nature.

【００２８】また、例えば、アデノウイルスプロモータ
ー、ＤＨＦＲ（デヒドロ葉酸還元酵素）遺伝子、ＳＶ４
０ポリＡ配列及び複製起点を有するプラスミドに、本願
の第一の発明のウサギ型Ｍ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ
断片を結合して挿入し、これをリン酸カルシウム法等に
よりＤＨＦＲを欠損しているＣＨＯ細胞（チャイニーズ
・ハムスター由来細胞）に遺伝子導入し、ＭＴＸ（メト
トレキセート）培地中で細胞培養することにより、糖鎖
を有するウサギ型Ｍ−ＣＳＦが発現される［メソッズ・
イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology) 、第
１８５巻、第５３７ページ、アカデミック・プレス社、
１９９０年］。その際、成熟型ウサギ型Ｍ−ＣＳＦを直
接発現させてもよいが、シグナル配列を有するウサギ型
Ｍ−ＣＳＦ前駆体をコードするＤＮＡ断片を細胞に導入
し、前駆体タンパク質を発現させてもよい。発現された
タンパク質は、細胞培養液中に可溶性タンパク質として
蓄積しているので、これを常法により限外濾過膜により
濃縮し、カラムクロマトグラフィーにより精製し、ウサ
ギ型Ｍ−ＣＳＦを取得することができる。Also, for example, adenovirus promoter, DHFR (dehydrofolate reductase) gene, SV4
DNA encoding the rabbit M-CSF of the first invention of the present application is added to a plasmid having a poly A sequence and an origin of replication.
The fragment was ligated and inserted, the gene was introduced into CHO cells (Chinese hamster-derived cells) deficient in DHFR by the calcium phosphate method or the like, and the cells were cultured in an MTX (methotrexate) medium, whereby sugar chains were obtained. Rabbit M-CSF is expressed [Methods
Methods in Enzymology, Vol. 185, p. 537, Academic Press,
1990]. At that time, the mature rabbit M-CSF may be directly expressed, or a DNA fragment encoding a rabbit M-CSF precursor having a signal sequence may be introduced into cells to express the precursor protein. . Since the expressed protein is accumulated as a soluble protein in the cell culture solution, it can be concentrated by an ultrafiltration membrane by a conventional method and purified by column chromatography to obtain rabbit M-CSF. it can.

【００２９】組換えＤＮＡ技術により調製し、カラムク
ロマトグラムグラフィー等により精製したウサギ型Ｍ−
ＣＳＦの活性は、後記する試験例３のメトカーフらによ
る方法から、骨髄細胞の増殖試験により測定することが
可能であり、ヒト型Ｍ−ＣＳＦのコロニー形成のタンパ
ク質重量当たりの比活性が、ヒト骨髄細胞を用いたアッ
セイで約１０8 Ｕ（単位）／ｍｇであり、本発明のウサ
ギ型Ｍ−ＣＳＦのコロニー形成のタンパク質重量当たり
の比活性が、ウサギ骨髄細胞を用いたアッセイで約１０
8 Ｕ（単位）／ｍｇ以上であることから、本願の第一の
発明で得られる物質は、ウサギ型Ｍ−ＣＳＦであること
が明らかである。Rabbit-type M-prepared by recombinant DNA technology and purified by column chromatography, etc.
The activity of CSF can be measured by a bone marrow cell proliferation test according to the method by Metcalfe et al. In Test Example 3 described later. The specific activity per colony-forming protein weight of the rabbit M-CSF of the present invention was about 10 8 U (unit) / mg in the cell-based assay.
From 8 U (unit) / mg or more, it is clear that the substance obtained in the first invention of the present application is rabbit-type M-CSF.

【００３０】以上のとおり、本発明のＤＮＡ断片は、ウ
サギ由来のウサギ型Ｍ−ＣＳＦをコードしており、配列
番号１に示したＤＮＡ配列は、ウサギ型Ｍ−ＣＳＦ前駆
体をコードするＤＮＡ配列であると同定され、この前駆
体は配列番号２に示すアミノ酸配列をコードすることが
確認された。As described above, the DNA fragment of the present invention encodes rabbit M-CSF derived from rabbit, and the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a DNA sequence encoding rabbit M-CSF precursor. The precursor was identified to encode the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.

【００３１】上記の方法により製造したウサギ型Ｍ−Ｃ
ＳＦは、そのまま、又は適当な賦型剤とともに混合し、
安定な薬剤としてウサギの治療等に用いることができ
る。例えば、ウサギ型Ｍ−ＣＳＦを塩化ナトリウム、ク
エン酸ナトリウム、グリシン、ショ糖及びポリソルベー
トと混合して溶解し、そのまま、又はこれを凍結乾燥
し、注射用蒸留水により生理食塩濃度に近い浸透圧に調
整して注射剤となし、１日１乃至数回、数日間から数か
月間随時皮下、静脈、筋肉等に注射することができる。Rabbit type MC produced by the above method
SF, as it is, or mixed with an appropriate excipient,
It can be used as a stable drug for treating rabbits and the like. For example, rabbit-type M-CSF is mixed and dissolved with sodium chloride, sodium citrate, glycine, sucrose and polysorbate, or as it is, or lyophilized, and osmotic pressure close to physiological saline concentration is obtained with distilled water for injection. It can be prepared as an injection, and injected subcutaneously, vein, muscle, etc. as needed once or several times a day for several days to several months.

【００３２】投与量は、体重１ｋｇ１日あたり０．１乃
至１００μｇが適当であるが、本発明のウサギ型Ｍ−Ｃ
ＳＦは、ウサギに対して用いるウサギ由来のタンパク質
であり、抗原性が弱いので投与量はこの範囲に限定され
るものではない。状況によっては、ブドウ糖溶液等の栄
養剤と混合して用いることもできる。また安定剤として
添加する薬剤は、前記のものに限定されるものではな
く、アルブミン（望ましくは、ウサギアルブミン）等の
タンパク質、マンニトール、リン酸塩等通常の注射薬に
用いられる安定剤を用いることができる。The dose is suitably from 0.1 to 100 μg per day per kg of body weight.
SF is a rabbit-derived protein used for rabbits, and its dose is not limited to this range because antigenicity is weak. In some situations, it can be used in combination with a nutrient such as a glucose solution. The drug to be added as a stabilizer is not limited to the above-mentioned one, but may be a protein such as albumin (preferably rabbit albumin), a stabilizer used in ordinary injections such as mannitol, phosphate and the like. Can be.

【００３３】次に試験例を示して本発明を詳述する。Next, the present invention will be described in detail with reference to test examples.

【００３４】＜試験例１＞この試験は、ウサギ型Ｍ−Ｃ
ＳＦの感染予防効果を調べるために行った。 １）試料の調製 後述の実施例５と同一の方法によりウサギ型Ｍ−ＣＳＦ
を調製した。 ２）試験方法 生後１か月、平均体重１５０ｇの仔パンダウサギ（日本
医科学動物研究所から入手）４５羽を、無作為に５羽ず
つ９群に分け、１〜３群の各５羽には３日に１回ずつ４
２日間ウサギ型Ｍ−ＣＳＦ５μｇ（１群）、１０μｇ
（２群）及び２０μｇ（３群）を含む生理食塩水０．２
ｍｌを背中の皮下に投与した。４〜６群の各５羽には３
日に１回ずつ４２日間にわたりヒト型Ｍ−ＣＳＦ（フナ
コシ社製）５μｇ（４群）、１０μｇ（５群）及び２０
μｇ（６群）を含む生理食塩水０．２ｍｌを背中の皮下
に投与した。更に７〜９群の各５羽には対照としてウサ
ギ血清アルブミン・フラクションＶ（シグマ社製）５μ
ｇ（７群）、１０μｇ（８群）及び２０μｇ（９群）を
含む生理食塩水０．２ｍｌを同様に４２日間にわたり背
中に皮下投与した。<Test Example 1> This test was performed using a rabbit type MC
It was performed to examine the infection preventive effect of SF. 1) Preparation of sample Rabbit type M-CSF by the same method as in Example 5 described later.
Was prepared. 2) Test method One month after birth, 45 panda rabbits (obtained from the Japan Institute of Medical Science and Animals) weighing 150 g were randomly divided into 9 groups of 5 birds each and divided into 5 groups of 1 to 3 groups. Is once every three days 4
2 days rabbit type M-CSF 5 μg (1 group), 10 μg
Physiological saline 0.2 containing (2 groups) and 20 μg (3 groups)
ml was administered subcutaneously on the back. 3 for each 5 birds in groups 4-6
5 μg (4 groups), 10 μg (5 groups) and 20 μg of human M-CSF (Funakoshi) once a day for 42 days
0.2 ml of physiological saline containing μg (6 groups) was administered subcutaneously on the back. Furthermore, rabbit serum albumin fraction V (manufactured by Sigma) 5 μm was used as a control for 5 birds in each of groups 7 to 9.
Similarly, 0.2 ml of physiological saline containing g (group 7), 10 μg (group 8) and 20 μg (group 9) was subcutaneously administered to the back for 42 days.

【００３５】各群の仔ウサギを屋外飼育舎で４か月間飼
育し、１か月毎に生存数を調査して試験した。 ３）試験結果 ウサギ型Ｍ−ＣＳＦを投与した第１群〜第３群では４か
月間の死亡数が、それぞれ１、０及び０羽、これら３群
の合計が１羽であった。ヒト型Ｍ−ＣＳＦを投与した第
４群〜第６群では４か月間の死亡数が、それぞれ２、２
及び２羽、これら３群の合計が６羽であり、第６群（２
０μｇ投与）の死亡１羽は、注射後短時間の死亡であ
り、抗体生成によるショック死の疑いがあった。第７群
〜第９群では４か月間の死亡数が、それぞれ２、２及び
３羽、これら３群の合計が７羽であり、ウサギ型Ｍ−Ｃ
ＳＦ投与により生存率の向上効果が得られることが認め
られた。尚、実施例７と同一の方法により調製したウサ
ギ型Ｍ−ＣＳＦを使用して試験したが、ほぼ同様の結果
が得られた。The rabbits of each group were bred for 4 months in an outdoor breeding house, and the number of surviving rabbits was examined every month for testing. 3) Test results In the first to third groups to which rabbit-type M-CSF was administered, the number of deaths for four months was 1, 0 and 0 birds, respectively, and the total of these three groups was 1 bird. In groups 4 to 6 to which human M-CSF was administered, the number of deaths during 4 months was 2, 2 respectively.
And two birds, and the total of these three groups is six, and the sixth group (2
(0 μg administered) was dead shortly after injection, and there was a suspicion of shock death due to antibody production. In the seventh to ninth groups, the number of deaths during the four months was 2, 2, and 3, respectively, and the total of these three groups was 7, and rabbit type MC
It was confirmed that SF administration had an effect of improving the survival rate. A test was performed using rabbit M-CSF prepared in the same manner as in Example 7, and almost the same results were obtained.

【００３６】＜試験例２＞この試験は、高脂血症モデル
ウサギに対するウサギ型Ｍ−ＣＳＦの効果を調べるため
に行った。 １）試料の調製及び試験動物 注射用蒸留水（大塚製薬社製）２ｍｌ当たり実施例７と
同一の方法により調製したウサギ型Ｍ−ＣＳＦ０．２７
ｍｇ、塩化ナトリウム（和光純薬社製）１．８５ｍｇ、
クエン酸ナトリウム（和光純薬社製）４．５ｍｇ、グリ
シン（和光純薬社製）８３ｍｇ、ショ糖（和光純薬社
製）２２ｍｇ及びポリソルベート（シグマ社製）０．１
１ｍｇの割合で溶解し、試料を調製した。また、ウサギ
血清アルブミン・フラクションＶ（シグマ社製）及びヒ
ト型Ｍ−ＣＳＦ（フナコシ社販売）を使用したことを除
き、前記試料と同一の組成の注射液を調製し、対照試料
１及び対照試料２とした。<Test Example 2> This test was conducted to examine the effect of rabbit M-CSF on hyperlipidemia model rabbits. 1) Preparation of Sample and Test Animal Rabbit M-CSF 0.27 prepared by the same method as in Example 7 per 2 ml of distilled water for injection (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.)
mg, sodium chloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) 1.85 mg,
Sodium citrate (manufactured by Wako Pure Chemical) 4.5 mg, glycine (manufactured by Wako Pure Chemical) 83 mg, sucrose (manufactured by Wako Pure Chemical) 22 mg, and polysorbate (manufactured by Sigma) 0.1
The sample was dissolved at a rate of 1 mg to prepare a sample. Also, an injection solution having the same composition as the above sample was prepared except that rabbit serum albumin fraction V (manufactured by Sigma) and human M-CSF (manufactured by Funakoshi) were used, and control sample 1 and control sample were prepared. And 2.

【００３７】高脂血症モデルウサギとして動物実験に多
用されているＷＨＨＬウサギ［アテロスクレロージス
（Atheroscrerosis)、第３６巻、第２６１〜２６８ペー
ジ、１９８０年。日本医科学動物研究所から入手］を使
用した。 ２）試験方法 ＷＨＨＬウサギは、ＬＤＬレセプター異常に起因するヒ
トの家族性高コレステロール血症のモデル動物として使
用され、２．５月齢から動脈硬化症が発症し、１２月齢
までに動脈硬化巣形成がほぼ完成することが知られてい
る。２．５月齢のＷＨＨＬウサギ２羽に、前記試料をウ
サギ型Ｍ−ＣＳＦとして５０μｇ／ｋｇの割合で毎日１
回（１週間では５回）１１月齢まで静脈注射し、対照群
の２羽には対照試料１をウサギ血清アルブミン・フラク
ションとして５０μｇ／ｋｇの割合で同様に投与した。
更に他の２羽には対照試料２をヒト型Ｍ−ＣＳＦとして
し５０μｇ／ｋｇの割合で同様に投与した。各群のウサ
ギを１２月齢まで飼育し、飼育期間終了後、各個体を解
剖し、頸動脈の動脈硬化病巣を検討した。 ３）試験結果 試料（ウサギ型Ｍ−ＣＳＦを含む）投与群の病巣面積
は、対照試料１投与群のそれの５０％、対照試料２投与
群では対照試料１投与群の７０％であったが、対照試料
２投与群では血中の抗ヒトＭ−ＣＳＦ抗体を生じている
ことが、免疫沈降法により確認された。以上の結果から
ウサギ型Ｍ−ＣＳＦにはＷＨＨＬウサギの動脈硬化阻止
効果があり、抗体を生じないため、ヒト型Ｍ−ＣＳＦよ
りもさらに有効であることが判明した。尚、実施例５と
同一の方法により調製したウサギ型Ｍ−ＣＳＦを使用し
て試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。A WHHL rabbit which is frequently used in animal experiments as a model model of hyperlipidemia [Atheroscrerosis, Vol. 36, pp. 261-268, 1980. Obtained from the Japan Institute of Medical Science and Animal] was used. 2) Test method WHHL rabbits are used as a model animal of familial hypercholesterolemia in humans due to LDL receptor abnormality. Arteriosclerosis develops from 2.5 months of age, and atherosclerotic lesions form by 12 months of age. It is known to be almost completed. Two 2.5-month-old WHHL rabbits were treated with the above sample as rabbit-type M-CSF at a rate of 50 μg / kg daily for 1 day.
(Five times a week) until the age of 11 months, and two birds in the control group were similarly administered control sample 1 at a rate of 50 μg / kg as a rabbit serum albumin fraction.
Further, the other two birds were treated with the control sample 2 as human M-CSF at a rate of 50 μg / kg. Rabbits in each group were bred until the age of 12 months, and after the breeding period, each individual was dissected to examine carotid arteriosclerotic lesions. 3) Test results The lesion area of the sample (including rabbit type M-CSF) administration group was 50% of that of the control sample 1 administration group, and 70% of the control sample 2 administration group of the control sample 1 administration group. It was confirmed by immunoprecipitation that the anti-human M-CSF antibody in the blood was generated in the control sample 2 administration group. From the above results, it has been found that rabbit M-CSF has an effect of inhibiting arteriosclerosis in WHHL rabbits and does not generate antibodies, and thus is more effective than human M-CSF. A test was performed using rabbit M-CSF prepared by the same method as in Example 5, and almost the same results were obtained.

【００３８】＜試験例３＞この試験は、ヒト型、マウス
型及びウサギ型Ｍ−ＣＳＦのインビトロ（in vitro）に
おける活性を比較するために行った。 １）試料の調製等 実施例５（試料１）又は実施例７（試料２）と同一の方
法により調製したウサギ型Ｍ−ＣＳＦ、ヒト型Ｍ−ＣＳ
Ｆ（フナコシ社製。試料３）及びマウス型Ｍ−ＣＳＦ
（フナコシ社製。試料４）の４試料を使用した。 ２）試験方法 メトカーフらの方法［エクスペリメンタル・ヘマトロジ
ー(Experimental Hematology) 、第１巻、第１８５〜２
０１ページ、１９７３年］により、各試料についてマウ
ス及びウサギの骨髄細胞に対するインビトロでのコロニ
ー形成活性を測定した。<Test Example 3> This test was performed to compare the in vitro activities of human, mouse and rabbit M-CSF. 1) Preparation of Sample, etc. Rabbit M-CSF, human M-CS prepared by the same method as in Example 5 (Sample 1) or Example 7 (Sample 2)
F (manufactured by Funakoshi Co .; sample 3) and mouse M-CSF
Four samples (Funakoshi, Sample 4) were used. 2) Test method The method of Metcalfe et al. [Experimental Hematology, Volume 1, 185-2]
01, 1973], the in vitro colony forming activity on mouse and rabbit bone marrow cells was determined for each sample.

【００３９】骨髄細胞は、以下のようにして調製した。
７週齢Ｃ５７ＢＬマウス（日本チャールスリバーから入
手）及び８か月齢ニュージーランドホワイトウサギ（日
本医科学動物研究所から入手）からそれぞれ大腿骨を取
り、５ｍｌシリンジにマッコイ５Ａ培地（フロー社製）
を満たし、この培地により骨髄細胞を押出し、次にピペ
ッティングにより骨髄細胞をマッコイ５Ａ培地に１０ｍ
ｌスピッツ中で分散した。スピッツを低速遠心機（日立
製作所製。ＣＲ５Ｂ型）により１０００ｒｐｍで５分間
遠心分離し、この沈殿物を再度同培地に分散し、３０秒
間粗大物を沈降させた上清を骨髄細胞として使用した。Bone marrow cells were prepared as follows.
Thigh bones were taken from a 7-week-old C57BL mouse (obtained from Charles River Japan) and an 8-month-old New Zealand white rabbit (obtained from Japan Institute of Medical Science and Animal Research), and McCoy's 5A medium (manufactured by Flow Inc.) was placed in a 5 ml syringe.
And the bone marrow cells are extruded with this medium, then the bone marrow cells are pipetted into McCoy's 5A medium for 10 m.
Dispersed in 1 spitz. The Spitz was centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes using a low-speed centrifuge (manufactured by Hitachi, Ltd., Model CR5B). This precipitate was dispersed again in the same medium, and the supernatant obtained by sedimenting a coarse substance for 30 seconds was used as bone marrow cells.

【００４０】この細胞１０5 個を１ｍｌの０．３％寒天
（ディフコ社製）、２０％牛胎児血清（フロー社製）を
含むマッコイ５Ａ培地に懸濁し、この懸濁液に０．１ｍ
ｌの各試料を混合し、３５ｍｍのディッシュに採取し
た。寒天が固化した後、３７℃、５％二酸化炭素ガスの
細胞培養装置（サンヨー社製）に入れ、７日間培養す
る。次にこのディッシュを倒立顕微鏡（オリンパス社
製。ＣＫ−１）により検鏡し、５０個以上の細胞からな
るコロニー数を測定し、サンプル１ｍｌ当たりに換算
し、コロニー形成単位（Ｕ）とし、この値にサンプルの
希釈倍率を乗じ、タンパク質１ｍｇ当たりのコロニー形
成単位を算出した。 ３）試験結果 マウスの骨髄を用いた試料１、試料２、試料３及び試料
４のコロニー形成単位数は、それぞれ０．５×１０8、
０．６×１０8、１．８×１０8及び２．０×１０8 Ｕ／
ｍｇであり、本発明のウサギ型Ｍ−ＣＳＦでは低値であ
った。一方、ウサギ骨髄を用いた試料１、試料２、試料
３及び試料４のコロニー形成単位数は、それぞれ２．０
×１０8、２．０×１０8、１．０×１０8及び１．０×
１０8 Ｕ／ｍｇであり、本発明のウサギ型Ｍ−ＣＳＦの
活性はヒト及びマウスのＭ−ＣＳＦのそれを上回った。10 5 cells were suspended in 1 ml of McCoy's 5A medium containing 0.3% agar (manufactured by Difco) and 20% fetal bovine serum (manufactured by Flow), and 0.1 m of the suspension was added to the suspension.
of each sample were mixed and collected in a 35 mm dish. After the agar solidifies, it is placed in a cell culture device (manufactured by Sanyo) at 37 ° C. and 5% carbon dioxide gas, and cultured for 7 days. Next, the dish was inspected with an inverted microscope (manufactured by Olympus Corporation; CK-1), and the number of colonies consisting of 50 or more cells was measured. The value was multiplied by the dilution factor of the sample to calculate the colony forming units per mg of the protein. 3) Test results The number of colony forming units of sample 1, sample 2, sample 3 and sample 4 using mouse bone marrow was 0.5 × 10 8 ,
0.6 × 10 8 , 1.8 × 10 8 and 2.0 × 10 8 U /
mg, which was low in the rabbit M-CSF of the present invention. On the other hand, the number of colony forming units of Sample 1, Sample 2, Sample 3, and Sample 4 using rabbit bone marrow was 2.0
× 10 8 , 2.0 × 10 8 , 1.0 × 10 8 and 1.0 ×
A 10 8 U / mg, the activity of the rabbit type M-CSF of the present invention exceeded that of M-CSF in humans and mice.

【００４１】以上のように、ウサギ由来のＭ−ＣＳＦ
は、マウス骨髄細胞に対するよりもウサギ骨髄細胞に対
して高い活性を示すことが明らかであり、Ｍ−ＣＳＦの
種特異性が確認され、ウサギの治療に用いる場合ウサギ
型Ｍ−ＣＳＦが有効であることが判明した。As described above, rabbit-derived M-CSF
Is apparently more active on rabbit bone marrow cells than on mouse bone marrow cells, confirming the species specificity of M-CSF, and using rabbit M-CSF for treatment of rabbits It has been found.

【００４２】[0042]

【実施例】以下に、実施例を示して本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるも
のではない。EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.

【００４３】実施例１（メッセンジャーＲＮＡ及び一本
鎖ｃＤＮＡの調製） 株化したウサギ角膜細胞ＳＩＲＣ（大日本製薬社製）を
１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地（大日本製薬社製）で培
養した。回収した細胞をフェノール及びクロロホルムに
より抽出してタンパク質等を除去し、イソプロパノール
を添加して全ＲＮＡを沈殿させて回収し、オリゴｄＴセ
ルロースカラム（クローンテック社製）に通してポリＡ
−ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を調製した。この操作により約１
０7細胞から約５μｇのｍＲＮＡが得られた。Example 1 (Preparation of Messenger RNA and Single-Stranded cDNA) The established rabbit corneal cell SIRC (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was cultured in a MEM medium (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) containing 10% FBS. The collected cells were extracted with phenol and chloroform to remove proteins and the like, and isopropanol was added to precipitate and collect the total RNA. The collected RNA was passed through an oligo dT cellulose column (Clontech) to poly A
-RNA (mRNA) was prepared. By this operation, about 1
0 7 mRNA of approximately 5μg from cells were obtained.

【００４４】次に、このｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵
素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを調製した。この操作は、ｃ
ＤＮＡ合成キット（First strand cDNA Synthesis Ki
t：宝酒造社製）を使用して添付のプロトコールに従っ
て実施した。操作手順は、マイクロ遠心管内で鋳型ｍＲ
ＮＡ５μｇ、ｄＮＴＰ混合物（最終濃度各２ｍＭ）、オ
リゴ（ｄＴ）18プライマー（最終濃度０．１μｇ／μ
ｌ）、逆転写酵素ＲＡＶ−２（最終濃度２μｇ／μ
ｌ）、ＲＮａｓｅインヒビター（最終濃度２μｇ／μ
ｌ）、及び定容量の１／５容量の緩衝液（５倍first st
rand synthesis buffer）を添加し、ＤＥＰＣ（ジエチ
ルピロカーボネイト）処理水で５０μｌの定容量とする
（以上の試薬は、いずれも前記キットに含まれてい
る）。この液を撹拌装置（サイエンンテフィック・イン
ターナショナル社製）により混合し、室温で１０分間放
置し、のち４２℃の恒温槽で１時間保温し、一本鎖ｃＤ
ＮＡ溶液を得た。Next, using this mRNA as a template, a single-stranded cDNA was prepared using reverse transcriptase. This operation is c
DNA synthesis kit (First strand cDNA Synthesis Ki
t: manufactured by Takara Shuzo) according to the attached protocol. The operation procedure is as follows.
NA 5 μg, dNTP mixture (final concentration 2 mM each), oligo (dT) 18 primer (final concentration 0.1 μg / μ
l), reverse transcriptase RAV-2 (final concentration 2 μg / μ
l), RNase inhibitor (final concentration 2 μg / μ
l) and 1/5 volume of buffer (5 times first st)
rand synthesis buffer) and make up to a fixed volume of 50 μl with DEPC (diethyl pyrocarbonate) -treated water (all of the above reagents are included in the kit). This solution was mixed with a stirrer (manufactured by Scientific International Co., Ltd.), allowed to stand at room temperature for 10 minutes, and then kept in a thermostat at 42 ° C. for 1 hour to obtain a single-stranded cD
An NA solution was obtained.

【００４５】実施例２（Ｍ−ＣＳＦのＤＮＡ断片の調製
及びこれを用いた形質転換大腸菌株の調製） ＰＣＲ法に用いる５´側プライマーとして配列番号３に
示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドＲＮＦ、及び
３´側プライマーとして配列番号４に示す塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドＲＮＲを、３９４型ＤＮＡシン
セサイザー（アプライドバイオシステムズ社製）を用い
て合成した。実施例１で調製した一本鎖ｃＤＮＡとプラ
イマーＲＮＦ及びＲＮＲを用いて、ＰＣＲ反応装置（DN
A Thermal Cycler：パーキン・エルマー社製）及びＤＮ
Ａポリメラーゼ（TaKaRa Ex Taq：宝酒造社製）により
ＰＣＲ増幅を行った。増幅産物を１％アガロースゲル電
気泳動により分離し、目的とする約７００ｂｐのＤＮＡ
断片を切り出し、ＤＮＡ抽出キット（ファルマシア社
製）によりＤＮＡ断片を精製した。Example 2 (Preparation of DNA fragment of M-CSF and preparation of transformed Escherichia coli strain using the same) Oligonucleotide RNF having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 as the 5 'primer used in the PCR method, and An oligonucleotide RNR having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 as a 3′-side primer was synthesized using a 394 type DNA synthesizer (manufactured by Applied Biosystems). Using the single-stranded cDNA prepared in Example 1 and primers RNF and RNR, a PCR reaction device (DN
A Thermal Cycler: Perkin-Elmer) and DN
PCR amplification was performed using A polymerase (TaKaRa Ex Taq: manufactured by Takara Shuzo). The amplification product was separated by 1% agarose gel electrophoresis, and the target DNA of about 700 bp
The fragment was cut out, and the DNA fragment was purified using a DNA extraction kit (Pharmacia).

【００４６】精製したＤＮＡ断片をクローニングベクタ
ーｐＣＲII（アンピシリン耐性マーカーを有する）に挿
入し、得られた組換えベクターで大腸菌ＩＮＶＦ´αを
形質転換した。この操作は、ＤＮＡクローニング用キッ
ト（Original TA Cloning Kit：インビトロゲン社製）
を使用し、添付のプロトコールに従って実施した。操作
手順は、マイクロチューブ内に精製したＤＮＡ断片、ク
ローニングベクターｐＣＲII、Ｔ４ＤＮＡライゲース及
び１０倍濃度のライゲーション・バッファーを添加し、
滅菌水で１０μｌの定容量とし、１２℃の恒温槽で終夜
反応させた。The purified DNA fragment was inserted into a cloning vector pCRII (having an ampicillin resistance marker), and Escherichia coli INVF'α was transformed with the obtained recombinant vector. This operation is performed using a DNA cloning kit (Original TA Cloning Kit: manufactured by Invitrogen).
And according to the attached protocol. The procedure was as follows: a purified DNA fragment, a cloning vector pCRII, a T4 DNA ligase and a 10-fold concentration of a ligation buffer were added to a microtube,
The volume was adjusted to 10 μl with sterile water, and the reaction was carried out overnight in a thermostat at 12 ° C.

【００４７】ライゲーション反応物とキット中の大腸菌
ＩＮＶＦ´αのコンピテントセルをマイクロチューブ中
で混和し、氷上で３０分間放置し、これを４２℃の恒温
槽で３０秒間加温し、のち速やかに氷中に移して２分間
放置した。これに４５０μｌのＳＯＣ培地［組成は、２
％バクトトリプトン（ディフコ社製）、０．５％バクト
イーストエクストラクト（ディフコ社製）、１０ｍＭ塩
化ナトリウム（和光純薬社製）、２．５ｍＭ塩化カリウ
ム（和光純薬社製）、１０ｍＭ硫酸マグネシウム（和光
純薬社製）、１０ｍＭ塩化マグネシウム（和光純薬社
製）及び２０ｍＭグルコース（和光純薬社製）］を添加
し、ロータリーシェーカー（ハイテック社製、ダブルシ
ェーカーＮＲ３００）で３７℃で１時間培養し、選択薬
剤であるアンピシリン（シグマ社製）１００μｇ／ｍｌ
を含む選択培地プレートにまき、目的のＭ−ＣＳＦ遺伝
子を保持した形質転換大腸菌株を選択し、保存した。The ligation reaction product and the competent cells of Escherichia coli INVF'α in the kit were mixed in a microtube, left on ice for 30 minutes, and heated in a constant temperature bath at 42 ° C. for 30 seconds. Transferred to ice and left for 2 minutes. To this, 450 μl of SOC medium [composition: 2
% Bactotrypton (Difco), 0.5% Bacto yeast extract (Difco), 10 mM sodium chloride (Wako Pure Chemical), 2.5 mM potassium chloride (Wako Pure Chemical), 10 mM sulfuric acid Magnesium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 10 mM magnesium chloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) and 20 mM glucose (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] were added at 37 ° C. on a rotary shaker (manufactured by Hitec, double shaker NR300). And incubated for 100 μg / ml of ampicillin (Sigma)
, And the transformed E. coli strain carrying the target M-CSF gene was selected and stored.

【００４８】実施例３（Ｍ−ＣＳＦのＤＮＡの塩基配列
決定） 実施例２により得られた形質転換大腸菌株を５ｍｌの２
×ＹＴ培地（１．６％バクトトリプトン、１．０％酵母
エキス及び０．５％塩化ナトリウムを含む）で振とう培
養機（タイヨー化学社製。恒温培養機）により終夜振と
う培養し、遠心分離して菌体を回収した。この菌体をＲ
Ｎａｓｅを含む懸濁用バッファー（ＲＮａｓｅ １００
μｇ／ｍｌ、５０ｍＭトリス−塩酸及び１０ｍＭＥＤＴ
Ａを含み、ｐＨ８．０）０．３ｍｌに懸濁し、０．３ｍ
ｌのアルカリ処理バッファー（２００ｍＭ水酸化ナトリ
ウム及び１％ＳＤＳを含む）を添加し、室温で５分放置
し、のち中和用バッファー（２．５５Ｍ 酢酸カリウ
ム、ｐＨ４．８）０．３ｍｌを添加して氷上で１０分保
持し、微量高速遠心機により１０，０００ｒｐｍで１５
分間遠心し、遠心上清をＤＮＡ精製用カラム（ＱＩＡＧ
ＥＮカラム：フナコシ社製）に通してプラスミドを精製
し、得られたプラスミドＤＮＡを塩基配列の決定に使用
した。Example 3 (Determination of DNA sequence of M-CSF DNA) 5 ml of the transformed E. coli strain obtained in Example 2 was used.
XYT medium (containing 1.6% bactotryptone, 1.0% yeast extract, and 0.5% sodium chloride) was shake-cultured overnight with a shaking incubator (manufactured by Taiyo Chemical Co., Ltd .; constant temperature incubator). The cells were collected by centrifugation. This cell is
Suspension buffer containing RNase (RNase 100
μg / ml, 50 mM Tris-HCl and 10 mM EDT
A, pH 8.0) suspended in 0.3 ml, 0.3 m
l of alkaline treatment buffer (containing 200 mM sodium hydroxide and 1% SDS) was added, and the mixture was left at room temperature for 5 minutes. Then, 0.3 ml of neutralization buffer (2.55 M potassium acetate, pH 4.8) was added. And hold on ice for 10 minutes, and then use a micro high-speed centrifuge at 10,000 rpm for 15 minutes.
After centrifugation, the supernatant is centrifuged for DNA purification (QIAG
The plasmid was purified by passing through an EN column (manufactured by Funakoshi), and the obtained plasmid DNA was used for determination of the nucleotide sequence.

【００４９】このプラスミドＤＮＡに挿入されているＤ
ＮＡ断片の塩基配列を３７３Ａ型ＤＮＡシーケンサー及
びシーケンシングキット（アプライドバイオシステムズ
社製）により分析した結果、配列番号１に示した塩基配
列を有することが確認された。The D inserted in the plasmid DNA
As a result of analyzing the nucleotide sequence of the NA fragment using a 373A DNA sequencer and a sequencing kit (manufactured by Applied Biosystems), it was confirmed that the NA fragment had the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.

【００５０】実施例４（形質転換大腸菌株によるウサギ
型Ｍ−ＣＳＦの調製） 配列番号１に示した塩基配列のコード領域のうち、最初
のメチオニンをコードする配列（ＡＴＧ）から９６個の
塩基配列は、３２個のアミノ酸をコードするが、ヒト型
Ｍ−ＣＳＦとのホモロジー（宝酒造社製ＤＮＡデータベ
ースであるＤＮＡＳＩＳによる）からこの３２個のアミ
ノ酸よりなるペプチドは、シグナル配列として成熟タン
パク質からは除去されると考えられるのでこの部分を除
去し、大腸菌によるＭ−ＣＳＦ成熟タンパク質の直接発
現に使用した。Example 4 (Preparation of rabbit type M-CSF using transformed E. coli strain) Of the coding region of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 96 base sequences from the first methionine coding sequence (ATG) Encodes 32 amino acids, but from its homology to human M-CSF (according to DNASIS, a DNA database manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), a peptide consisting of these 32 amino acids is removed from the mature protein as a signal sequence. Therefore, this portion was removed and used for direct expression of M-CSF mature protein by E. coli.

【００５１】実施例３より得られるプラスミドＤＮＡを
鋳型とし、５´側と３´側のプライマーにそれぞれ配列
番号５及び配列番号６に示す塩基配列を有する合成オリ
ゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ反応（１サイクル９４℃
で３０秒、５０℃で３０秒及び７２℃で６０秒を３０サ
イクル）を行い、得られるＤＮＡ断片を制限酵素Ｎｃｏ
Ｉ及びＨｉｎｄIII（宝酒造社製。以下制限酵素は全て
同じメーカーのものである）で切断し、ウサギ型Ｍ−Ｃ
ＳＦをコードするＤＮＡ断片（約６８０ｂｐ）を得た。Using the plasmid DNA obtained from Example 3 as a template, a PCR reaction (one cycle) was performed using synthetic oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 for the 5 'and 3' primers, respectively. 94 ° C
For 30 seconds, 50 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 60 seconds for 30 cycles).
I and HindIII (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd .; the following restriction enzymes are all from the same manufacturer) and cut into rabbit type MC
A DNA fragment (about 680 bp) encoding SF was obtained.

【００５２】尚、配列番号５に示すオリゴヌクレオチド
は、ＮｃｏＩ認識配列（塩基番号３〜８）を有し、塩基
番号５〜７は開始コドン（ＡＴＧ）であり、塩基番号８
〜１６は、配列番号１における塩基番号１０１〜１０９
と同一のアミノ酸配列をコードし、塩基番号１７〜３２
の配列は、配列番号１における塩基番号１１０〜１２５
と同一の塩基配列を有する。また、配列番号６に示すオ
リゴヌクレオチドは、ＨｉｎｄIII認識配列（塩基番号
３〜８）を有し、塩基番号１０〜３４は、配列番号１に
おける塩基番号７３９〜７６３に相補性を有し、塩基番
号７〜９は終始コドン（ＴＡＡ）に相補性を有する。The oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 5 has an NcoI recognition sequence (base numbers 3 to 8), base numbers 5 to 7 are initiation codons (ATG), and base number 8
To 16 are base numbers 101 to 109 in SEQ ID NO: 1.
And the same amino acid sequence as base numbers 17 to 32
Corresponds to base numbers 110 to 125 in SEQ ID NO: 1.
Has the same base sequence as The oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 6 has a HindIII recognition sequence (base numbers 3 to 8), and base numbers 10 to 34 have complementarity with base numbers 739 to 763 in SEQ ID NO: 1, 7 to 9 have complementarity to the stop codon (TAA).

【００５３】したがって、上記のプライマーを用いてＰ
ＣＲ反応を行なうと、成熟型ウサギ型Ｍ−ＣＳＦのアミ
ノ酸配列（配列番号２において塩基番号１〜２２１。但
し、Ｎ−末端にメチオニン残基が付加される）をコード
し、５’末端にＮｃｏＩ認識配列を、３’末端にＨｉｎ
ｄIII認識配列を有するＤＮＡ断片が増幅される。Therefore, using the primers described above,
When the CR reaction was carried out, the amino acid sequence of the mature rabbit M-CSF (base numbers 1-221 in SEQ ID NO: 2, with a methionine residue added at the N-terminus) was encoded, and NcoI was encoded at the 5′-terminus. Recognition sequence is Hin at the 3 'end.
A DNA fragment having a dIII recognition sequence is amplified.

【００５４】一方、市販のプラスミドから、プロモータ
ーとＳＤ配列を含むＤＮＡ断片、ターミネーターを含む
ＤＮＡ断片、及び複製起点を含むＤＮＡ断片を調製し
た。市販のプラスミドｐＥＴ−３ａ（ノバゲン社製）を
ＢｇｌII及びＮｃｏＩで切断し、アガロースゲル電気泳
動で断片を分離し、Ｔ７プロモーターとＳＤ配列を含む
９８ｂｐの断片をゲルから抽出した。市販のプラスミド
ｐＫＫ２３３−３（ファルマシア社製）をＨｉｎｄIII
及びＳｃａＩで切断し、前記と同様にターミネーター配
列を含む８２７ｂｐのＤＮＡ断片を得た。プラスミドｐ
ＧＥＭＥＸ−２（プロメガ社製）をＳｃａＩ及びＢｇｌ
IIで切断し、前記と同様に複製起点（ＣｏｌＥ１ｏｒ
ｉ）及びアンピシリン耐性マーカーを含む１５５６ｂｐ
のＤＮＡ断片を得た。On the other hand, a DNA fragment containing a promoter and an SD sequence, a DNA fragment containing a terminator, and a DNA fragment containing a replication origin were prepared from commercially available plasmids. A commercially available plasmid pET-3a (manufactured by Novagen) was digested with BglII and NcoI, the fragments were separated by agarose gel electrophoresis, and a 98 bp fragment containing the T7 promoter and SD sequence was extracted from the gel. A commercially available plasmid pKK233-3 (Pharmacia) was converted to HindIII.
And ScaI to obtain an 827 bp DNA fragment containing a terminator sequence in the same manner as described above. Plasmid p
GEMEX-2 (promega) was replaced with ScaI and Bgl
II, and the replication origin (ColE1or
i) and 1556 bp including the ampicillin resistance marker
Was obtained.

【００５５】得られた４つのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲ
ースで連結し、得られたＤＮＡで大腸菌ＮＭ５２２（ノ
バゲン社製）を形質転換してアンピシリン耐性株を選択
し、目的のプラスミドｐＵＳＡ４８（３１５０ｂｐ）を
保持する大腸菌株を得た。このプラスミドは、Ｔ７プロ
モーターの制御下で、配列番号２においてアミノ酸番号
１〜２２１で表されるアミノ酸配列（但し、Ｎ末端にメ
チオニン残基が付加される）をコードするタンパク質を
発現する。この大腸菌株を培養し、菌体からプラスミド
を抽出し、得られたプラスミドでタンパク質生産用大腸
菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバゲン社製）を形質転換
し、アンピシリン耐性株を選択し、プラスミドｐＵＳＡ
４８を保有するウサギ型Ｍ−ＣＳＦ生産菌株を得た。
尚、ＢＬ２１（ＤＥ３）は、ｌａｃプロモーター制御下
でＴ７ポリメラーゼを産生する。The obtained four DNA fragments were ligated by DNA ligase, and Escherichia coli NM522 (manufactured by Novagen) was transformed with the obtained DNA to select an ampicillin-resistant strain, and the desired plasmid pUSA48 (3150 bp) was retained. E. coli strain was obtained. This plasmid expresses, under the control of the T7 promoter, a protein encoding the amino acid sequence represented by amino acids 1 to 221 in SEQ ID NO: 2 (provided that a methionine residue is added to the N-terminus). This Escherichia coli strain is cultured, a plasmid is extracted from the cells, E. coli strain BL21 (DE3) for protein production (manufactured by Novagen) is transformed with the obtained plasmid, an ampicillin-resistant strain is selected, and plasmid pUSA is selected.
Rabbit-type M-CSF-producing strains carrying 48 were obtained.
BL21 (DE3) produces T7 polymerase under the control of the lac promoter.

【００５６】この大腸菌株を３Ｌジャーファーメンター
により３８．５℃で約１乃至２時間通気培養し、菌体濃
度がＯＤ６００ｎｍにより０．５〜１．０となった時点
で、０．４ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧ（イソプロピルβ
−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加し、３８．５℃
で更に４〜６時間培養し、次に、培養混合液を取り出
し、高速遠心機（日立製作所製。ＳＣＲ２０Ｂ）により
６０００ｒｐｍで１０分間室温で遠心し、湿重量約１０
ｇの菌体を得た。This Escherichia coli strain was subjected to aeration culture at 38.5 ° C. for about 1 to 2 hours using a 3 L jar fermenter. When the bacterial cell concentration reached 0.5 to 1.0 by OD600 nm, the final concentration of 0.4 mM was obtained. IPTG (isopropyl β
-D-thiogalactopyranoside) at 38.5 ° C.
For another 4 to 6 hours, then take out the culture mixture and centrifuge at 6000 rpm for 10 minutes at room temperature with a high-speed centrifuge (SCR20B manufactured by Hitachi, Ltd.) to obtain a wet weight of about 10
g of cells were obtained.

【００５７】得られた菌体を菌体容量の６〜１０倍の１
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、氷冷
し、卓上型超高圧細胞破砕装置（ミニラボ：レイニー社
製）により８×１０7Ｐａの圧力で破砕し、前記と同一
の遠心機により８０００ｒｐｍで３０分間、４℃で遠心
し、沈殿物（顆粒体）を収集し、前記と同一の緩衝液に
懸濁し、粗ウサギ型Ｍ−ＣＳＦを得た。The obtained cells were treated with 1 to 6 to 10 times the cell volume.
The suspension was suspended in 0 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), cooled with ice, and crushed at a pressure of 8 × 10 7 Pa using a table-top ultrahigh-pressure cell crusher (Minilab, manufactured by Rainey). The mixture was centrifuged at 8000 rpm for 30 minutes at 4 ° C., and the precipitate (granules) was collected and suspended in the same buffer as above to obtain crude rabbit M-CSF.

【００５８】実施例５（タンパク質のリフォールディン
グ及び精製） 実施例４で得た顆粒体湿重量１ｇに、尿素、ＥＤＴＡ
（エチレンジアミン四酢酸ナトリウム）及びＤＴＴ（ジ
チオスレイトール）をそれぞれ８Ｍ、１ｍＭ及び１０ｍ
Ｍの最終濃度で添加し、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）を添加して容量を１０ｍｌに調整し、こ
の懸濁液を４℃で一夜振とうして顆粒体を可溶化し、得
られたタンパク質溶液を超遠心機（ベックマン社製。Ｔ
Ｌ１００）により５０，０００ｒｐｍで３０分超遠心し
て上清を採取した。Example 5 (Refolding and Purification of Protein) To 1 g of the wet weight of the granules obtained in Example 4, urea and EDTA were added.
(Sodium ethylenediaminetetraacetate) and DTT (dithiothreitol) at 8 M, 1 mM and 10 m, respectively.
M, add 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) to adjust the volume to 10 ml, shake the suspension at 4 ° C. overnight to solubilize the granules, The obtained protein solution was subjected to an ultracentrifuge (Beckman, T.).
The supernatant was collected by ultracentrifugation at 50,000 rpm for 30 minutes according to L100).

【００５９】得られた上清３ｍｌをゲルろ過カラム（ト
ーソー社製。Ｇ３０００ＳＷ、２１．５ｍｍ×６００ｍ
ｍ）にかけ、２８０ｎｍのＵＶ吸収によりモニターし、
８Ｍ尿素、１ｍＭＥＤＴＡ及び１ｍＭＤＴＴを含む還元
変性条件下でゲル濾過ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラ
フィー）を実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより各画分を
チェックし、ウサギ型Ｍ−ＣＳＦに相当する画分（２５
ｋＤａ近辺）を回収し、ウサギ型Ｍ−ＣＳＦの単量体を
得た。3 ml of the obtained supernatant was applied to a gel filtration column (manufactured by Tosoh Corporation, G3000SW, 21.5 mm × 600 m).
m) and monitored by UV absorption at 280 nm,
Gel filtration HPLC (high performance liquid chromatography) was performed under reducing and denaturing conditions containing 8M urea, 1 mM EDTA and 1 mM DTT. Each fraction was checked by SDS-PAGE, and the fraction corresponding to rabbit type M-CSF (25
(near kDa) to obtain a rabbit M-CSF monomer.

【００６０】回収した溶液５０ｍｌを限外濾過装置（ア
ミコン社製。セントリプレップ１０、分画分子量１０，
０００）を用いて１０ｍｌに遠心濃縮し、これを４℃に
冷却した緩衝液（２ｍＭＧＳＨ、１ｍＭＧＳＳＧ、５ｍ
ＭＥＤＴＡ及び０．０２％アジ化ナトリウムを含む５０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液。ｐＨ８．５）２００ｍｌに徐
々に滴下し、そのまま４℃で７２時間連続撹拌し、ウサ
ギ型Ｍ−ＣＳＦのリフォールディング及び２量体化を行
った。リフォールディング及び２量体化終了後の溶液２
１０ｍｌを透析チューブ（三光純薬社製）に入れ、外液
を交換しながら５Ｌの０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に対して１夜透析し、のちチューブ内の液を取り出
し、硫酸アンモニウム粉末を１．５Ｍの最終濃度で添加
して沈殿させ、前記と同一の遠心機で１２，０００ｒｐ
ｍで３０分遠心して沈殿を回収した。An ultrafiltration device (manufactured by Amicon, Centriprep 10, fractionation molecular weight 10,
000) and centrifugally concentrated to 10 ml. This was cooled to 4 ° C. in a buffer (2 mM GSH, 1 mM GSSG, 5 mM).
50 with MEDTA and 0.02% sodium azide
mM Tris-HCl buffer. (pH 8.5) The solution was gradually dropped into 200 ml, and continuously stirred at 4 ° C. for 72 hours to refold and dimerize rabbit M-CSF. Solution 2 after completion of refolding and dimerization
10 ml was placed in a dialysis tube (manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.), and 5 L of 0.5 M phosphate buffer (pH 7.0) was exchanged while exchanging the external solution.
0) was dialyzed overnight, the liquid in the tube was taken out, ammonium sulfate powder was added at a final concentration of 1.5 M to precipitate, and the same centrifuge was used at 12,000 rpm.
The precipitate was collected by centrifugation at 30 m for 30 minutes.

【００６１】沈殿を少量の水に溶解し、硫酸アンモニウ
ム粉末を１．２Ｍの最終濃度で添加し、同様に遠心分離
し、１．２Ｍ硫酸アンモニウム濃度に可溶な上清を得
た。この上清４ｍｌ（タンパク質として１８ｍｇ相当）
を疎水相互作用クロマトカラムＰｈｅｎｙｌ−５ＰＷ
（トーソー社製。２１．５ｍｍ×１５０ｍｍ）にかけ、
１．２Ｍ硫酸アンモニウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）と０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
との直線濃度勾配により、ウサギ型Ｍ−ＣＳＦを溶出し
て分離した。The precipitate was dissolved in a small amount of water, and ammonium sulfate powder was added to a final concentration of 1.2 M, followed by centrifugation in the same manner to obtain a supernatant soluble in a concentration of 1.2 M ammonium sulfate. 4 ml of this supernatant (equivalent to 18 mg as protein)
Is converted to a hydrophobic interaction chromatography column, Phenyl-5PW.
(21.5 mm x 150 mm, manufactured by Tosoh Corporation)
0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) containing 1.2 M ammonium sulfate and 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0)
The rabbit type M-CSF was eluted and separated by the linear concentration gradient of

【００６２】得られた各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
分子量を測定し、分子量５０，０００のＭ−ＣＳＦのバ
ンドを主とする画分２５ｍｌを集め、限外濾過装置（ア
ミコン社製。８０５０型）により濃縮し、緩衝液を交換
して０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）を溶媒とする溶液として全量を１．
８ｍｌに濃縮し、精製した組換えウサギ型Ｍ−ＣＳＦを
得た。The molecular weight of each of the obtained fractions was measured by SDS-PAGE, and 25 ml of a fraction mainly composed of a M-CSF band having a molecular weight of 50,000 was collected and subjected to an ultrafiltration apparatus (Amicon, Model 8050). ), Exchange the buffer, and use a 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.15 M sodium chloride as a solvent.
It was concentrated to 8 ml to obtain a purified recombinant rabbit type M-CSF.

【００６３】得られたウサギ型Ｍ−ＣＳＦは、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥにより、純度が９５％以上であり、その溶液は
パイロジェントテスト・キット（第一製薬社製）を用い
たエンドトキシン・テストにより、タンパク質１ｍｇ当
たり０．０１エンドトキシン・ユニット以下であり、細
菌による汚染がなく、注射用に用い得る良好なタンパク
質であることを確認した。The obtained rabbit type M-CSF was prepared using SDS-
According to PAGE, the purity was 95% or more. The solution was determined to be less than 0.01 endotoxin unit per 1 mg of protein by an endotoxin test using a pyrogen test kit (manufactured by Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.). No protein was found to be a good protein that could be used for injection.

【００６４】尚、得られた精製組換えウサギ型Ｍ−ＣＳ
Ｆ １２μｇを用い、Ｎ端アミノ酸配列をペプチドシー
ケンサー（アプライドバイオシステムズ社製）により分
析した結果、Ｎ端から１８個まで、配列番号２において
アミノ酸番号１〜１７と一致した（Ｎ末端はメチオニン
残基であった）。また、この精製組換えウサギ型Ｍ−Ｃ
ＳＦをトリプシン処理し、ペプチドフラグメントを逆相
ＨＰＬＣにより分離精製し、そのペプチド配列をペプチ
ドシーケンサー（アプライドバイオシステムズ社製）に
より分析した結果、Ｎ末端のメチオニン残基以外は、配
列番号２におけるアミノ酸番号１〜２２１と一致した。The obtained purified recombinant rabbit M-CS
Using 12 μg of F, the N-terminal amino acid sequence was analyzed by a peptide sequencer (manufactured by Applied Biosystems). As a result, up to 18 amino acids from the N-terminal were identical to amino acid numbers 1 to 17 in SEQ ID NO: 2 (the N-terminal was a methionine residue). Met). The purified recombinant rabbit type MC
The SF was treated with trypsin, the peptide fragment was separated and purified by reverse-phase HPLC, and the peptide sequence was analyzed by a peptide sequencer (manufactured by Applied Biosystems). As a result, except for the N-terminal methionine residue, the amino acid number in SEQ ID NO: 2 was determined. 1-221.

【００６５】実施例６（形質転換細胞株によるウサギ型
Ｍ−ＣＳＦの調製） 実施例３と同一の方法により得られたプラスミドＤＮＡ
を鋳型とし、５´側と３´側のプライマーにそれぞれ配
列番号７及び配列番号８に示す塩基配列を有する合成オ
リゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ反応（１サイクル９４
℃で３０秒、５０℃で３０秒及び７２℃で６０秒を３０
サイクル）を行い、得られるＤＮＡ断片を制限酵素Ｘｈ
ｏＩ及びＥｃｏＲＩ（いずれも宝酒造社製）で切断し、
シグナルペプチドを含むウサギ型Ｍ−ＣＳＦをコードす
るＤＮＡ断片（約７７０ｂｐ）を調製した。Example 6 (Preparation of rabbit M-CSF using a transformed cell line) Plasmid DNA obtained by the same method as in Example 3
PCR using a synthetic oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 as the 5'-side and 3'-side primers, respectively, as a template.
30 seconds at 50 ° C., 30 seconds at 50 ° C. and 60 seconds at 72 ° C.
Cycle), and the resulting DNA fragment is
cut with oI and EcoRI (both from Takara Shuzo)
A DNA fragment (about 770 bp) encoding a rabbit M-CSF containing a signal peptide was prepared.

【００６６】尚、配列番号７に示すオリゴヌクレオチド
は、ＸｈｏＩ認識配列（塩基番号３〜８）を有し、塩基
番号９〜３７は、配列番号１における塩基番号５〜３３
と同一の塩基配列を有する。また、配列番号８に示すオ
リゴヌクレオチドは、ＥｃｏＲＩ認識配列（塩基番号３
〜８）を有し、塩基番号１２〜３５は、配列番号１にお
いて塩基番号７４０〜７６３に相補性を有し、塩基番号
９〜１１は、終始コドン（ＡＴＧ）に相補性を有する。The oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 7 has an XhoI recognition sequence (base numbers 3 to 8), and base numbers 9 to 37 correspond to base numbers 5 to 33 in SEQ ID NO: 1.
Has the same base sequence as In addition, the oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 8 is an EcoRI recognition sequence (base number 3
8), base numbers 12 to 35 have complementarity to base numbers 740 to 763 in SEQ ID NO: 1, and base numbers 9 to 11 have complementarity to the stop codon (ATG).

【００６７】したがって、上記のプライマーを用いてＰ
ＣＲ反応を行なうと、シグナルペプチドを含むウサギ型
Ｍ−ＣＳＦのアミノ酸配列（配列番号２において塩基番
号１〜２２１）をコードし、５’末端にＸｈｏＩ認識配
列を、３’末端にＥｃｏＲＩ認識配列を有するＤＮＡ断
片が増幅される。Therefore, using the primers described above,
When the CR reaction was carried out, the amino acid sequence of the rabbit M-CSF containing the signal peptide (base numbers 1 to 221 in SEQ ID NO: 2) was encoded, and the XhoI recognition sequence was located at the 5 ′ end, and the EcoRI recognition sequence was located at the 3 ′ end. The resulting DNA fragment is amplified.

【００６８】市販のプラスミドｐ３ＡＣＳＦ６９（ＡＴ
ＣＣから入手）を同様に制限酵素ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲ
Ｉで切断し、アガロースゲル電気泳動で断片を分離し、
５．１ｋｂｐ断片をゲルから抽出して精製した。The commercially available plasmid p3ACSF69 (AT
CC) and the restriction enzymes XhoI and EcoR
I, the fragments are separated by agarose gel electrophoresis,
The 5.1 kbp fragment was extracted from the gel and purified.

【００６９】得られた２つのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲ
ースで連結し、大腸菌ＮＭ５２２（宝酒造社製）を形質
転換してアンピシリン耐性株を選択し、目的プラスミド
ｐＵＳＡ６８（７０００ｂｐ）を保持する大腸菌株を得
た。この大腸菌株を培養し、プラスミドを抽出して、Ｄ
ＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株であるＤＵＫＸ−Ｂ１１細胞
（ＡＴＣＣから入手）を形質転換し、メトトレキセート
耐性株を選択し、プラスミドｐＵＳＡ４８を保持する細
胞株をウサギ型Ｍ−ＣＳＦ生産細胞株を得た。The obtained two DNA fragments were ligated by DNA ligase, and E. coli NM522 (manufactured by Takara Shuzo) was transformed to select an ampicillin-resistant strain, and an E. coli strain having the target plasmid pUSA68 (7000 bp) was obtained. . This E. coli strain is cultured, the plasmid is extracted, and D
DUKX-B11 cells (obtained from ATCC), which are HFR-deficient CHO cell lines, were transformed, methotrexate resistant strains were selected, and rabbit M-CSF-producing cell strains containing plasmid pUSA48 were obtained.

【００７０】この細胞株を２０Ｌの細胞培養装置（ケマ
ップ社製。ラボラトリー・パイロット・ファーメンター
ＣＦ３０００）によりメチオニンを除いたＤＭＥ培地と
Ｆ１０培地を１：１に含む培地（いずれも日水製薬社
製）計１５Ｌを用い、メトトレキセート（シグマ社製）
０．２ｍｇ／ｌを添加し、３７℃で空気及び二酸化炭素
ガスを通気しながら培養し、ｐＨ７．０〜７．５に調整
しながら細胞濃度を２×１０5〜１０6個／ｍｌに保持す
るために細胞培養液を１０Ｌずつ３〜４日に１回ハーベ
ストし、同量の新鮮培地を補って２０日間バッチリフィ
ード式による培養を継続した。This cell line was cultured in a 20 L cell culture apparatus (manufactured by Kemap Ltd., Laboratory Pilot Fermenter CF3000) in a 1: 1 medium containing DME medium and F10 medium without methionine (all manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.). ) Using a total of 15 L, methotrexate (manufactured by Sigma)
0.2 mg / l was added, the cells were cultured at 37 ° C. while passing air and carbon dioxide gas, and the cell concentration was maintained at 2 × 10 5 to 10 6 cells / ml while adjusting the pH to 7.0 to 7.5. To this end, 10 L of the cell culture solution was harvested once every 3 to 4 days, supplemented with the same amount of fresh medium, and continued to be cultured for 20 days by the batch refeed method.

【００７１】凍結保存した培養混合液計６０Ｌを取り出
し、融解して高速遠心機（日立製作所製。ＳＣＲ２０
Ｂ）により３０００ｒｐｍで２０分間、５℃で遠心し、
上清液を限外濾過装置（旭化成製、ＡＩＬ1010、分画分
子量10000 ）により濃縮し、脱イオン水を添加して再度
濃縮し、高速遠心機（日立製作所製。ＳＣ２０Ｂ）によ
り５℃で１２，０００ｒｐｍ、２０分間遠心して上清を
得た。A total of 60 L of the culture mixture, which has been cryopreserved, is removed, thawed, and centrifuged at high speed (manufactured by Hitachi, Ltd., SCR20)
B) centrifugation at 3000 rpm for 20 minutes at 5 ° C.,
The supernatant was concentrated using an ultrafiltration apparatus (AIL1010, manufactured by Asahi Kasei Corporation, molecular weight cut off 10,000), concentrated again by adding deionized water, and centrifuged at 5 ° C. for 12 hours using a high-speed centrifuge (SC20B, manufactured by Hitachi, Ltd.). The mixture was centrifuged at 000 rpm for 20 minutes to obtain a supernatant.

【００７２】実施例７（細胞由来組換えウサギ型Ｍ−Ｃ
ＳＦの精製） 実施例６で得た上清３ｍｌをゲルろ過ＨＰＬＣカラム
（トーソー社製。Ｇ３０００ＳＷ、２１．５ｍｍ×６０
０ｍｍ）にかけ、２８０ｎｍのＵＶ吸収によりモニター
し、１５０ｍＭ食塩を含む１０ｍＭリン酸緩衝液で溶出
し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより各画分をチェックし、ウサ
ギ型Ｍ−ＣＳＦに相当する画分（９０ｋＤａ近辺）を回
収した。Example 7 (Cell-derived recombinant rabbit MC)
Purification of SF) 3 ml of the supernatant obtained in Example 6 was subjected to a gel filtration HPLC column (manufactured by Tosoh Corporation, G3000SW, 21.5 mm × 60).
0 mm), monitored by UV absorption at 280 nm, eluted with 10 mM phosphate buffer containing 150 mM salt, checked for each fraction by SDS-PAGE, and found to have a fraction corresponding to rabbit type M-CSF (around 90 kDa) Was recovered.

【００７３】回収した溶液５０ｍｌを限外濾過装置（ア
ミコン社製。セントリプレップ１０、分画分子量１０，
０００）を用いて５ｍｌに濃縮し、この濃縮上清５ｍｌ
（タンパク質として５０ｍｇ相当）に１．２Ｍの濃度で
硫酸アンモニウム粉末を添加し、疎水相互作用クロマト
カラムＰｈｅｎｙｌ−５ＰＷ（トーソー社製。２１．５
ｍｍ×１５０ｍｍ）にかけ、１．２Ｍ硫酸アンモニウム
を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）及び０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）との直線濃度勾配によ
り、ウサギ型Ｍ−ＣＳＦを溶出分離した。An ultrafiltration device (Amicon, Centriprep 10, molecular weight cut off 10,
000) to 5 ml, and the concentrated supernatant 5 ml
Ammonium sulfate powder was added at a concentration of 1.2 M to (corresponding to 50 mg as a protein), and a hydrophobic interaction chromatography column Phenyl-5PW (manufactured by Tosoh Corporation, 21.5) was added.
mm × 150 mm), and 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) containing 1.2 M ammonium sulfate and 0.1 M
Rabbit type M-CSF was eluted and separated by a linear concentration gradient with M phosphate buffer (pH 7.0).

【００７４】得られた分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、
９０ｋＤａのウサギ型Ｍ−ＣＳＦのバンドを主とする画
分２５ｍｌを集め、限外濾過装置（アミコン社製。８０
５０型）により、濃縮をすると共に緩衝液の交換をし、
０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）を溶媒とする溶液として１．８ｍｌに濃
縮し、精製組換えウサギ型Ｍ−ＣＳＦを得た。The obtained fraction was subjected to SDS-PAGE,
25 ml of a fraction mainly composed of a 90 kDa rabbit M-CSF band was collected and subjected to an ultrafiltration apparatus (Amicon Co., Ltd., 80).
50 type) to concentrate and exchange the buffer.
The solution was concentrated to 1.8 ml as a solution using a 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.15 M sodium chloride as a solvent to obtain a purified recombinant rabbit type M-CSF.

【００７５】得られた精製組換えウサギ型Ｍ−ＣＳＦ
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるチェックにより純度が９５
％以上であり、この溶液はパイロジェントテストキット
（第一製薬社製）によるエンドトキシン・テストの結
果、１ｍｇタンパク質当たり０．０１エンドトキシン・
ユニット以下であり、細菌による汚染がなく、注射用に
用い得る良好な製品であることを確認した。The obtained purified recombinant rabbit type M-CSF
Has a purity of 95 as determined by SDS-PAGE.
%, And this solution was subjected to an endotoxin test using a pyrogen test kit (Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.).
It was confirmed that the product was a good product that could be used for injection without contamination by bacteria.

【００７６】尚、精製組換えウサギ型Ｍ−ＣＳＦ１０μ
ｇを用い、Ｎ端アミノ酸配列をペプチドシーケンサー
（アプライドバイオシステムズ社製）により分析した結
果、Ｎ端から１４個まで、配列番号２においてアミノ酸
番号１〜１４と一致していた。また、精製組換えウサギ
型Ｍ−ＣＳＦをトリプシン処理し、ペプチドフラグメン
トを逆相ＨＰＬＣにより分離精製し、そのペプチド配列
をペプチドシーケンサー（アプライドバイオシステムズ
社製）により分析した結果、配列番号２に記載のアミノ
酸配列（アミノ酸番号１〜２２１）と一致した。The purified recombinant rabbit M-CSF 10 μm
Using g, the N-terminal amino acid sequence was analyzed using a peptide sequencer (manufactured by Applied Biosystems). As a result, up to 14 N-terminal amino acid sequences were identical to amino acid numbers 1 to 14 in SEQ ID NO: 2. In addition, the purified recombinant rabbit M-CSF was treated with trypsin, the peptide fragment was separated and purified by reverse phase HPLC, and the peptide sequence was analyzed using a peptide sequencer (manufactured by Applied Biosystems). It was consistent with the amino acid sequence (amino acid numbers 1-221).

【００７７】[0077]

【発明の効果】本発明により、ウサギ型Ｍ−ＣＳＦ、及
びこれをコードするＤＮＡ断片が提供される。本発明に
より奏せられる効果は、次のとおりである。 １）本発明のウサギ型Ｍ−ＣＳＦを幼弱なウサギ、飼育
に適さない環境下で飼育されるウサギに投与することに
より、ウサギの免疫能が賦活され、飼育効率、特に幼弱
ウサギの生存率の向上、病気の予防及び治療効果が得ら
れる。 ２）本発明のウサギ型Ｍ−ＣＳＦは、ウサギを用いたＭ
−ＣＳＦモデル動物実験の材料として最適であり、デー
タ検討の障害となる抗体を生じ難いので、高度な医薬品
開発に応用可能である。 ３）本発明のウサギ型Ｍ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ断
片を、Ｍ−ＣＳＦの欠落又は欠損のあるウサギに遺伝子
導入し、遺伝子治療に用いることも可能である。 ４）本発明のウサギ型Ｍ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ断
片は、ウサギ型Ｍ−ＣＳＦの大量生産に使用できる。According to the present invention, a rabbit M-CSF and a DNA fragment encoding the same are provided. The effects provided by the present invention are as follows. 1) By administering the rabbit type M-CSF of the present invention to young rabbits and rabbits raised in an environment unsuitable for breeding, the immunity of the rabbits is activated, and the breeding efficiency, especially survival of the young rabbits The rate is improved, and the effects of preventing and treating diseases are obtained. 2) The rabbit type M-CSF of the present invention is a
-It is most suitable as a material for CSF model animal experiments, and hardly generates antibodies that hinder data examination, so that it can be applied to advanced drug development. 3) The DNA fragment encoding the rabbit M-CSF of the present invention can be used for gene therapy by introducing a gene into a rabbit lacking or deficient in M-CSF. 4) The DNA fragment encoding the rabbit M-CSF of the present invention can be used for mass production of rabbit M-CSF.

【００７８】[0078]

【配列表】[Sequence list]

配列番号：１ 配列の長さ：776 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：ウサギ 株名：ＳＩＲＣ 組織の種類：角膜細胞 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：5..763 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：sig_peptide 存在位置：5..100 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：mat_peptide 存在位置：101..763 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CCGT ATG ACC GCG CGG GGC GCC GCC GGG CGC TGC CCT CCC ACG ACA TGG 49 Met Thr Ala Arg Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp -32 -30 -25 -20 CTG GGC CCC TGG ATG CTG CTG GCC TGT CTC CTG GCG AGC AGG AGT GTC 97 Leu Gly Pro Trp Met Leu Leu Ala Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser Val -15 -10 -5 GCC GAG GTG GTG TCT GAG CAC TGC AGC CAC ATC ATC GGG AAC GGG CAC 145 Ala Glu Val Val Ser Glu His Cys Ser His Ile Ile Gly Asn Gly His 1 5 10 15 CTG CAG TCC CTA CAG CAG CTG ATT GAC AGT CAA ATG GAG ACC TCA TGC 193 Leu Gln Ser Leu Gln Gln Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys 20 25 30 CAC ATT GCC TTT GAG TTT GTG GAC CAG GAG CAG TTG AAG GAT CCC GTG 241 His Ile Ala Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val 35 40 45 TGC TAC TTG AAG AAG GGC TTC TTC CTG GTG GAA GAC ATC ATG GAG GAC 289 Cys Tyr Leu Lys Lys Gly Phe Phe Leu Val Glu Asp Ile Met Glu Asp 50 55 60 ACC CTG CGC TTC AAG CAC AGC ACG CCC AAC GCC AAG GCC ATC CTG CAG 337 Thr Leu Arg Phe Lys His Ser Thr Pro Asn Ala Lys Ala Ile Leu Gln 65 70 75 CTC CAG GAA CTC TCG CTC AGG CTC AGG GCC TGC TTC ACC AAG GAT CAT 385 Leu Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Arg Ala Cys Phe Thr Lys Asp His 80 85 90 95 GAA GAG GAC AAC AAG ACC TGT GTC CGA ACT TTC TAT GAG ACT CCA CTC 433 Glu Glu Asp Asn Lys Thr Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu 100 105 110 CAG TTG CTG GAG AAG ATC AAG AAT GTC TTT AAC GAA ACA AAG AAT CTC 481 Gln Leu Leu Glu Lys Ile Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu 115 120 125 CTT AAA GAG GAC TGG AAT ATT TTC AGC AAG AAC TGC AAC AAC AGC TTT 529 Leu Lys Glu Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe 130 135 140 GTT AAA TGC TCC AGC CAA GAT GTG GTG ACC AAG CCT GAT TGC AAC TGT 577 Val Lys Cys Ser Ser Gln Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys 145 150 155 CTG TAC CCC AAA GCC ACC CCT AAC AGT GAC CTG GCC TCC CCT CGC CAG 625 Leu Tyr Pro Lys Ala Thr Pro Asn Ser Asp Leu Ala Ser Pro Arg Gln 160 165 170 175 CCC CTT GAC CCC TCT ACA GCC CCC ATG GCT GGC TTG GCC TGG GCC GAC 673 Pro Leu Asp Pro Ser Thr Ala Pro Met Ala Gly Leu Ala Trp Ala Asp 180 185 190 GCT GAG GGG ACA CAG GGC AAC CCC CTC TTG CCC AGT GAG CAG GCC CCT 721 Ala Glu Gly Thr Gln Gly Asn Pro Leu Leu Pro Ser Glu Gln Ala Pro 195 200 205 GGC ACA GTG GAC CCA GGC AGC GCC AAG CAG CGA CCA CCC AGG 763 Gly Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gln Arg Pro Pro Arg 210 215 220 ACCTGCCAGA GCT 776 SEQ ID NO: 1 Sequence length: 776 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double strand Topology: Linear Sequence type: cDNA Origin Organism name: Rabbit Strain name: SIRC Tissue type: Corneal cell Sequence characteristics Symbol representing the feature: CDS Location: 5..763 Method for determining the feature: S Symbol representing the feature: sig_peptide Location: 5..100 Method for determining the feature: S Symbol representing the feature: mat_peptide Location: 101 ..763 Method for determining characteristics: S sequence CCGT ATG ACC GCG CGG GGC GCC GCC GGG CGC TGC CCT CCC ACG ACA TGG 49 Met Thr Ala Arg Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp -32 -30 -25- 20 CTG GGC CCC TGG ATG CTG CTG GCC TGT CTC CTG GCG AGC AGG AGT GTC 97 Leu Gly Pro Trp Met Leu Leu Ala Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser Val -15 -10 -5 GCC GAG GTG GTG TCT GAG CAC TGC AGC CAC ATC ATC GGG AAC GGG CAC 145 Ala Glu Val Val Ser Glu His Cys Ser His Ile Ile Gly Asn Gly His 1 5 10 15 CTG CAG TCC CTA CAG CAG CTG ATT GAC AGT CAA ATG GAG A CC TCA TGC 193 Leu Gln Ser Leu Gln Gln Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys 20 25 30 CAC ATT GCC TTT GAG TTT GTG GAC CAG GAG CAG TTG AAG GAT CCC GTG 241 His Ile Ala Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val 35 40 45 TGC TAC TTG AAG AAG GGC TTC TTC CTG GTG GAA GAC ATC ATG GAG GAC 289 Cys Tyr Leu Lys Lys Gly Phe Phe Leu Val Glu Asp Ile Met Glu Asp 50 55 60 ACC CTG CGC TTC AAG CAC AGC ACG CCC AAC GCC AAG GCC ATC CTG CAG 337 Thr Leu Arg Phe Lys His Ser Thr Pro Asn Ala Lys Ala Ile Leu Gln 65 70 75 CTC CAG GAA CTC TCG CTC AGG CTC AGG GCC TGC TTC ACC AAG GAT CAT 385 Leu Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Arg Ala Cys Phe Thr Lys Asp His 80 85 90 95 GAA GAG GAC AAC AAG ACC TGT GTC CGA ACT TTC TAT GAG ACT CCA CTC 433 Glu Glu Asp Asn Lys Thr Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu 100 105 110 CAG TTG CTG GAG AAG ATC AAG AAT GTC TTT AAC GAA ACA AAG AAT CTC 481 Gln Leu Leu Glu Lys Ile Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu 115 120 125 CTT AAA GAG GAC TGG AAT ATT TTC AGC AAG AAC TGC AAC AAC A GC TTT 529 Leu Lys Glu Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe 130 135 140 GTT AAA TGC TCC AGC CAA GAT GTG GTG ACC AAG CCT GAT TGC AAC TGT 577 Val Lys Cys Ser Ser Gln Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys 145 150 155 CTG TAC CCC AAA GCC ACC CCT AAC AGT GAC CTG GCC TCC CCT CGC CAG 625 Leu Tyr Pro Lys Ala Thr Pro Asn Ser Asp Leu Ala Ser Pro Arg Gln 160 165 170 170 175 CCC CTT GAC CCC TCT ACA GCC CCC ATG GCT GGC TTG GCC TGG GCC GAC 673 Pro Leu Asp Pro Ser Thr Ala Pro Met Ala Gly Leu Ala Trp Ala Asp 180 185 190 GCT GAG GGG ACA CAG GGC AAC CCC CTC TTG CCC AGT GAG CAG GCC CCT 721 Ala Glu Gly Thr Gln Gly Asn Pro Leu Leu Pro Ser Glu Gln Ala Pro 195 200 205 GGC ACA GTG GAC CCA GGC AGC GCC AAG CAG CGA CCA CCC AGG 763 Gly Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gln Arg Pro Pro Arg 210 215 220 ACCTGCCAGA GCT 776

【００７９】配列番号：２ 配列の長さ：221 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Thr Ala Arg Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp Leu -32 -30 -25 -20 Gly Pro Trp Met Leu Leu Ala Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser Val Ala -15 -10 -5 Glu Val Val Ser Glu His Cys Ser His Ile Ile Gly Asn Gly His Leu 1 5 10 15 Gln Ser Leu Gln Gln Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys His 20 25 30 Ile Ala Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys 35 40 45 Tyr Leu Lys Lys Gly Phe Phe Leu Val Glu Asp Ile Met Glu Asp Thr 50 55 60 Leu Arg Phe Lys His Ser Thr Pro Asn Ala Lys Ala Ile Leu Gln Leu 65 70 75 80 Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Arg Ala Cys Phe Thr Lys Asp His Glu 85 90 95 Glu Asp Asn Lys Thr Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln 100 105 110 Leu Leu Glu Lys Ile Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu 115 120 125 Lys Glu Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Val 130 135 140 Lys Cys Ser Ser Gln Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys Leu 145 150 155 160 Tyr Pro Lys Ala Thr Pro Asn Ser Asp Leu Ala Ser Pro Arg Gln Pro 165 170 175 Leu Asp Pro Ser Thr Ala Pro Met Ala Gly Leu Ala Trp Ala Asp Ala 180 185 190 Glu Gly Thr Gln Gly Asn Pro Leu Leu Pro Ser Glu Gln Ala Pro Gly 195 200 205 Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gln Arg Pro Pro Arg 210 215 220SEQ ID NO: 2 Sequence length: 221 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: protein sequence Met Thr Ala Arg Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp Leu -32 -30- 25 -20 Gly Pro Trp Met Leu Leu Ala Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser Val Ala -15 -10 -5 Glu Val Val Ser Glu His Cys Ser His Ile Ile Gly Asn Gly His Leu 1 5 10 15 Gln Ser Leu Gln Gln Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys His 20 25 30 Ile Ala Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys 35 40 45 Tyr Leu Lys Lys Gly Phe Phe Leu Val Glu Asp Ile Met Glu Asp Thr 50 55 60 Leu Arg Phe Lys His Ser Thr Pro Asn Ala Lys Ala Ile Leu Gln Leu 65 70 75 80 Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Arg Ala Cys Phe Thr Lys Asp His Glu 85 90 95 Glu Asp Asn Lys Thr Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln 100 105 110 Leu Leu Glu Lys Ile Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu 115 120 125 Lys Glu Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Val 130 135 140 Lys Cys Ser Ser Gl n Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys Leu 145 150 155 160 Tyr Pro Lys Ala Thr Pro Asn Ser Asp Leu Ala Ser Pro Arg Gln Pro 165 170 175 Leu Asp Pro Ser Thr Ala Pro Met Ala Gly Leu Ala Trp Ala Asp Ala 180 185 190 Glu Gly Thr Gln Gly Asn Pro Leu Leu Pro Ser Glu Gln Ala Pro Gly 195 200 205 Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gln Arg Pro Pro Arg 210 215 220

【００８０】配列番号：３ 配列の長さ：13 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸..合成ＤＮＡ CCCGTATGAC CGC 13SEQ ID NO: 3 Sequence length: 13 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single stranded Topology: linear Sequence type: other nucleic acid .. Synthetic DNA CCCGTATGAC CGC 13

【００８１】配列番号：４ 配列の長さ：13 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸..合成ＤＮＡ AGCTCTGGCA GGT 13SEQ ID NO: 4 Sequence length: 13 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: other nucleic acid .. Synthetic DNA AGCTCTGGCA GGT 13

【００８２】配列番号：５ 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸..合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：5..32 特徴を決定した方法： GGCC ATG GAA GTA GTA TCT GAG CAC TGC AGC C 32 Met Glu Val Val Ser Glu His Cys Ser 1 5 SEQ ID NO: 5 Sequence length: 32 Sequence type: number of nucleic acid strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: other nucleic acid .. Synthetic DNA Sequence characteristics Characteristic symbol: CDS Location: 5..32 Method for determining characteristics: GGCC ATG GAA GTA GTA TCT GAG CAC TGC AGC C 32 Met Glu Val Val Ser Glu His Cys Ser 15

【００８３】配列番号：６ 配列の長さ：34 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸..合成ＤＮＡ GGAAGCTTAC CTGGGTGGTC GCTGCTTGGC GCTG 34SEQ ID NO: 6 Sequence length: 34 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: other nucleic acid .. Synthetic DNA GGAAGCTTAC CTGGGTGGTC GCTGCTTGGC GCTG 34

【００８４】配列番号：７ 配列の長さ：37 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸..合成ＤＮＡ CCCTCGAGAT GACCGCGCGG GGCGCCGCCG GGCGCTG 37SEQ ID NO: 7 Sequence length: 37 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single stranded Topology: linear Sequence type: other nucleic acid .. Synthetic DNA CCCTCGAGAT GACCGCGCGGGGGGCGCCGCCG GGCGCTG 37

【００８５】配列番号：８ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸..合成ＤＮＡ CGGAATTCCT ACCTGGGTGG TCGCTGCTTG GCGCT 35SEQ ID NO: 8 Sequence length: 35 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single strand Topology: linear Sequence type: other nucleic acid .. Synthetic DNA CGGAATTCCT ACCTGGGTGG TCGCTGCTTG GCGCT 35

フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 島村 誠一 神奈川県座間市東原５丁目１番83号 森永 乳業株式会社生物科学研究所内Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification number Agency reference number FI Technical display location C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:19) (72) Inventor Seiichi Shimamura 5 Higashihara, Zama City, Kanagawa Prefecture 1-83, Morinaga Dairy Products Co., Ltd.

Claims (5)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 配列番号２においてアミノ酸番号１〜２
２１で表されるアミノ酸配列を含み、単球、マクロファ
ージの生存、増殖及び分化を促進する機能を損なわない
１又は２以上のアミノ酸残基の置換、挿入、欠失又は転
位を含んでいてもよいウサギ型マクロファージ・コロニ
ー刺激因子。1. The amino acid sequence of SEQ ID NO.
It may contain the amino acid sequence represented by 21 and may contain substitution, insertion, deletion or transposition of one or more amino acid residues which do not impair the function of promoting survival, proliferation and differentiation of monocytes and macrophages. Rabbit-type macrophage colony stimulating factor. 【請求項２】 配列番号２においてアミノ酸番号１〜２
２１で表されるアミノ酸配列を含み、単球、マクロファ
ージの生存、増殖及び分化を促進する機能を損なわない
１又は２以上のアミノ酸残基の置換、挿入、欠失又は転
位を含んでいてもよいウサギ型マクロファージ・コロニ
ー刺激因子をコードするＤＮＡ断片。2. The amino acid sequence of SEQ ID NO.
It may contain the amino acid sequence represented by 21 and may contain substitution, insertion, deletion or transposition of one or more amino acid residues which do not impair the function of promoting survival, proliferation and differentiation of monocytes and macrophages. DNA fragment encoding rabbit macrophage colony stimulating factor. 【請求項３】 配列番号１において塩基番号１０１〜７
６３で表される塩基配列を含む請求項２記載のＤＮＡ断
片。3. The nucleotide sequence of SEQ ID NO.
3. The DNA fragment according to claim 2, comprising the base sequence represented by 63. 【請求項４】 配列番号２においてアミノ酸番号−３２
〜２２１で表されるアミノ酸配列を有するウサギ型マク
ロファージ・コロニー刺激因子前駆体をコードするＤＮ
Ａ断片。4. The amino acid sequence of SEQ ID NO.
Encoding a rabbit macrophage colony-stimulating factor precursor having the amino acid sequence of
A fragment. 【請求項５】 配列番号１において塩基番号５〜７６３
で表される塩基配列を含む請求項４記載のＤＮＡ断片。5. The nucleotide sequence of SEQ ID NO.
The DNA fragment according to claim 4, which comprises a base sequence represented by the following formula:
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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US7473681B2 (en) 2000-10-31 2009-01-06 Pharma Mar, S.A. Kahalalide F

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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US7473681B2 (en) 2000-10-31 2009-01-06 Pharma Mar, S.A. Kahalalide F
JP2010047601A (en) * 2000-10-31 2010-03-04 Pharma Mar Sa Kahalalide f

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