JPH10130247A - レドックス活性化合物およびその使用 - Google Patents

レドックス活性化合物およびその使用

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JPH10130247A
JPH10130247A JP9259106A JP25910697A JPH10130247A JP H10130247 A JPH10130247 A JP H10130247A JP 9259106 A JP9259106 A JP 9259106A JP 25910697 A JP25910697 A JP 25910697A JP H10130247 A JPH10130247 A JP H10130247A
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ハインデル ディーター
Rupert Dr Herrmann
ヘルマン ルパート
Joachim Dr Hoenes
ヘーネス ヨアヒム
Hans-Peter Dr Josel
ヨーゼル ハンス−ペーター
Martina Dr Junius-Comer
ユニウス−コマー マルティナ
Hartmut Dr Merdes
メルデス ハートムート
Axel Dr Schmidt
シュミット アクセル
Ernst Dr Selbertinger
ゼルバーティンガー エルンスト
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 分析対象物質測定用の検出試薬として、光安
定性に優れ、かつレドックス反応における検出可能な分
子特性が可変的であるレドックス活性化合物の提供。 【解決手段】構造式（Ｉ）および／または（II）の化合
物またはそれらの塩の使用： 【化１】 [式中、R1およびR2は、各々、水素、ハロゲンまたは有
機基であり、Xは、O、S、C(Acc)2、CH(Acc)またはN(Ac
c)（但しAccは電子求引性基）を表し、Phは、場合によ
り置換されているフェニル環を表し、ｎは０〜４の整数
であり、Arは特定の環状構造を表す］。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、分析対象物質(ana
lyte)の測定方法用の検出試薬の製造におけるレドック
ス活性化合物の使用、およびこれらのレドックス活性化
合物を含有する試薬キットに関する。さらに、新規なレ
ドックス活性化合物も開示されている。
【０００２】
【従来の技術】レドックス反応により、種々のサンプル
物質中の分析対象物質を検出および分析することが可能
になる。これらの反応において、酸化系または還元系
は、直接または仲介物(mediator)を介して、レドックス
指示薬に作用する。分析対象物質の存在によって、レド
ックス指示薬の還元または酸化が起こる。還元または酸
化が分子特性の検出可能な変化を生じさせる好適なレド
ックス指示薬が用いられる場合には、分析すべき分析対
象物質の定量的および／または定性的検出を行うことが
可能である。
【０００３】分析対象物質は、例えば、検出試薬の色が
酸化または還元によって変化する比色検出方法、あるい
は電気化学的検出方法によって分析可能である。比色検
出試薬の例としては、レザズリン、ヘテロポリ酸（EP-B
-0431456）、テトラゾリウム化合物（EP-B-0574769）、
ニトロソ芳香族化合物（EP-A-0620283）、RIND化合物
（すなわち、還元された場合に分子内反応が起こる化合
物；例えば、EP-A-0190750およびWO86/04681参照）が挙
げられる。電気化学的検出方法におけるレドックス活性
化合物の例としては、ニトロソ芳香族化合物、フェナジ
ニウム(phenazinium)塩、ヘキサシアノ鉄酸カリウムお
よびベンゾキノン（例えば、EP-A-0441222およびEP-A-0
505494参照）が挙げられる。
【０００４】しかし、当業界の現状において公知である
比色検出試薬には、幾つかの問題がある。例えば、テト
ラゾリウム塩は、光に対して著しく不安定である。さら
に、その塩構造は、還元によって破壊され、その結果生
じるホルマザンは、通常は水に不溶性である（H.-J.Gud
er、Indigo/Tetrazolium Dyes、１２．１章、Non radio
active labeling anddetection of biomolecules，C.Ke
ssler,発行，Springer-Verlag BerlinHeidelberg 199
2）。レザズリンの場合、いくつかの用途では、還元体
と酸化体との色の差はあまりにも小さい。ヘテロポリ酸
は、還元体の不十分な吸収および好ましくない吸収波長
により、多くの用途においては感度が不十分であり、さ
らに、その還元体の吸収波長に関しては、あまり可変的
でない(less variable)。RIND化合物は、診断試験にと
っては、あまりにも不活性すぎる場合が多い。一方、ニ
トロソ芳香族化合物は干渉の影響を非常に受けやすく、
形成される染料が、過還元の結果として退色する可能性
がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
課題は、分析対象物質の測定用の検出試薬として、当業
界における現状での問題が少なくとも部分的に解消され
る新規なレドックス活性化合物を提供することである。
この新規なレドックス活性化合物は、一方では、その検
出可能な分子特性に関して非常に可変的でなければらな
ず、また他方では、その還元体および酸化体が十分に安
定でなければならない。
【０００６】
【課題を解決するための手段】この課題は、本発明によ
り、従来では生化学的分析または医学的診断において使
用されてはいなかった、ベンゾキノキサリンジオン下部
構造(substructure)またはこの下部構造の改変体(varia
nts)（例えば、デヒドロインダンスロンまたはベンゾナ
フトフェナジンジオン構造等）を含有する新規なレドッ
クス対(redox pair)を用いることによって達成される。
デヒドロインダンスレンは、長い間、ハロゲン化インダ
ンスロン等のアントラキノン染料の合成において知られ
てきた中間体である。このクラスの物質の幾つかの代表
的なものは、例えば、研究論文シリーズ「複素環化合物
の化学(The Chemistry of HeterocyclicCompounds)」
「フェナジン(Phenazines)」の巻、G.A. SwanおよびD.
G.I.Felton、1975、Interscience Publishers Inc., Ne
w York、特に431〜433頁、469頁および477頁に記載され
ている。スルホン化誘導体の合成も公知である［例え
ば、独国特許第129847号（1901年5月10日）および同第
第216891号（1908年12月13日）参照］。
【０００７】例えばナフト [2,3-a]フェナジン-8,13-ジ
オン、ベンゾ[a]-ナフト[2,3-h]フェナジン-8,13-ジオ
ン等のベンゾキノキサリン下部構造を有する化合物、お
よびさらに縮合されたアリール基を有する改変体、およ
びそれらの染料への化学的還元も、長い間にわたって公
知であった（前出の「Phenazines」参照）。
【０００８】ベンゾキノキサリンジオン下部構造を有す
るレドックス対は、ほぼ１００年間にわたって公知であ
るが、それらは、従来では医学的診断または生化学的分
析には用いられてはいなかった。驚くべきことに、今
や、これらの物質が検出試薬、特に比色検出方法におけ
る検出試薬として格別に好適であることがわかった。す
なわち、それらは、還元状態、さらには酸化状態におい
て高い光安定性を有し、さらに、親水性基、電子供与体
基または受容体基等の置換基の特定の導入によって、溶
解性、その酸化体および還元体の吸収極大の位置等の特
性に関して広範囲に改変可能である。このことにより、
試験片または液体試験におけるような、広い適用領域が
可能になる。さらに、それらは、比色および電気化学的
用途における仲介物としても使用可能である。
【０００９】したがって、本発明の主題は、分析対象物
質の測定方法用の検出試薬としての、またはそのような
検出試薬の製造のための、構造式（Ｉ）および／または
（II）：
【化７】 [式中、R1およびR2は、それぞれ独立して、水素、ハロ
ゲンまたは有機基であり、Xは、O、S、C(Acc)2、CH(Ac
c)またはN(Acc)を表し、かつAccは電子求引性基であ
り、Phは、場合により置換されているフェニル環を表
し、ｎは０〜４の整数であり、Arは構造式(IIIa)、(III
b)、(IVa)、(IVb)、(Va)、(Vb)、（VIa）または（VI
b）：
【化８】
【化９】 （式中、R3、R3'、R4、R4'、R5およびR5'は、それぞれ
独立して、水素、ハロゲンおよび有機基であり、Yおよ
びY'は、それぞれ独立して、NまたはCR6 であり、ここ
で、R6は水素、ハロゲンまたは有機基であり、Zは、N
R、OまたはSであり、ここで、Rは有機基または水素であ
り、R'は、それぞれの場合において、独立して、場合に
より置換されているアルキルまたはアリール基であり、
ｍは、それぞれの場合において、独立して、０または１
であり；ｍ＝１である場合には、上記構造式(IIIa)、(I
Va)、（Va）および（VIa）中のR'に結合している窒素が
陽電荷を有し、かつ適当な対イオンが存在し、そして上
記構造式（IIIb）、（IVb)、(Vb)および(VIb)において
ｐ＝０であり；ｍ＝０の場合には、ｐ＝１である）の基
を表す］の化合物またはそれらの塩の使用である。
【００１０】構造式（Ｉ）および（II）の化合物に加え
て、それらの化合物の塩、例えば酸付加塩等を使用する
ことも可能である。かかる塩の、あるいは１個または数
個のR'を有する荷電化合物の好適な対イオンの例として
は、ハロゲン化物、BF4 - 、PF6 - 、ClO4 - またはアセテ
ート等の有機アニオンが挙げられる。荷電化合物は、好
ましくは唯一1個のみの基R'を含有する。
【００１１】構造式（Ｉ）および（II）の化合物におい
て、R1およびR2の少なくとも１つは、好ましくは、場合
によって置換基を有していてもよい芳香族または複素芳
香族環系を含有する。この置換基としては、例えば、場
合によってヘテロ原子を含有してもよい直鎖、分岐鎖、
飽和または不飽和の炭化水素基（例えば、C1〜C4アルキ
ルまたはハロアルキル基等のアルキル基、C1〜C4ヒドロ
キシアルキル基等のヒドロキシアルキル基など）、ハロ
ゲン原子（例えば、F、Cl、Br、I）、および／または以
下に定義するような親水性基がある。上記芳香族環の幾
つかの置換基は、一緒になって、例えばアルキレン架橋
によって架橋していてもよい。R1およびR2も一緒になっ
て架橋してもよい。R1およびR2は、特に好ましくは、一
緒になって、置換されていてもよいベンゼン環などの芳
香族または複素芳香族環系を形成する。さらに、R1およ
びR2は、一緒になって、追加のPhn-Ar基を形成してもよ
い。
【００１２】構造式（Ｉ）および（II）中のXは、好ま
しくはO、C(Acc)2、CH(Acc)またはN(Acc)である。Acc
は、例えば正のハメット(Hammett)シグマ値を有する置
換基などの電子求引性置換基である［例えば、「有機化
学における立体配置効果(StericEffects in Organic Ch
emistry)」、John Wiley and Sons, Inc. 、1956、570
〜574頁；および「物理有機化学の進歩(Progress in Phy
sical Organic Chemistry)、第２巻、Interscience Pub
lishers 、1964、333〜339頁を参照」。かかる置換基の
具体例としては、シアノ、カルボキシ、ニトロ、ハロゲ
ン、トリハロゲンメチル、カルボニル、カルバモイル、
スルホニル、スルファモイル、エステル基などが挙げら
れる。シアノ、ニトロおよびエステル基が好ましく、シ
アノおよびニトロ基が特に好ましい。
【００１３】Phは、場合によって置換されていてもよい
フェニル環を表し、ここにおいて、置換基は、例えば、
ハロゲン、アルキルおよび／またはヒドロキシアルキル
（上記を参照）であってもよい。ｎは、好ましくは０〜
１の整数である。ｎ＝０の場合、構造式（Ｉ）の化合物
は、好ましくは、図１中の化合物１および２で示す骨格
構造を有する。これに関して、化合物１は、2個の窒素
原子が置換基として環系の5位および６位に位置するナ
フトキノン改変体として説明することができる。図１中
の化合物３および４は、これらの構造の改変体を表す。
この場合、ナフトキノン環系の窒素原子は、5位および8
位（化合物３）または6位および７位（化合物４）に位
置する。図１中の化合物５は、化合物１のフェニル類似
の改変体である（ｎ＝１）。構造式（II）の化合物の骨
格構造は、図１に示す化合物６である。
【００１４】図１中の化合物７および８は、化合物１を
1回または２回にわたってアルキル化した改変体であ
る。R'は、場合によって置換されているアルキル基、好
ましくはC1〜C4アルキル基、特に好ましくはC1〜C2アル
キル基であるか、あるいは、場合によって置換されてい
るアリール基、好ましくはフェニル基である。
【００１５】構造式(IIIa)と(IIIb)、(IVa)と(IVb)、(V
a)と(Vb)、(VIa)と(VIb)の基は、それぞれ、化合物の酸
化改変体と還元改変体を表す。これらの基において、
R3、R4および、もしも存在する場合にはR3'、R4'、R5お
よびR5'の少なくとも１つが、R 1およびR2のように場合
によって置換されていてもよい芳香族または複素芳香族
環系を含有する。構造式(IIIa)、(IIIb)、(IVa)、(IV
b)、(VIa)および(VIb)の基において、R3およびR4は、一
緒になって架橋してもよい。それらは、好ましくは、一
緒になって、少なくとも部分的に芳香族または複素芳香
族構造を有する環系を形成する。さらに、これらの基の
１つまたは数個（例えば、R3およびR4）が、個々に、芳
香族環系、特に複素芳香族環系（例えば、ピリジン環）
を含有することも好ましい。
【００１６】構造式(Va)および(Vb)の基において、
（ａ）R3とR4、および／またはR3'とR4'、または（ｂ）
R4とR5、および／またはR4'とR5'は、それぞれ、一緒に
なって架橋してもよい。それらは、好ましくは、少なく
とも部分的に芳香族または複素芳香族構造を有する環系
を形成する。これらの基は、特に好ましくは、それぞ
れ、一緒になって、場合によって置換されているナフタ
レンまたはアントラキノン環系を形成する。一方、これ
らの基の１個または数個は、個々に、芳香族または複素
芳香族環系を含有してもよい。
【００１７】本発明による化合物の大きな利点は、個々
の化合物の特性（例えば、吸収極大の位置のような分光
分析上の特性、電気化学的特性、または溶解度特性）
が、置換基をほとんど任意に変化させることによって、
広範囲にわたって改変可能であることである。これらの
化合物は、好ましくは、1個または数個の、電荷担体の
ような親水性基を含有して、水溶解性を高める。そのよ
うな親水性基は、好ましくは、（ａ）カルボン酸基、ス
ルホン酸基およびリン酸基、およびそれらから誘導され
る塩（例えば、アンモニウムまたはアルカリ金属塩
等）、（ｂ）硫酸モノエステル基、リン酸モノエステル
基およびリン酸ジエステル基、およびそれらから誘導さ
れる塩、および（ｃ）１級、２級または３級アミン基、
および４級アンモニウム基、特に３級アミン基および４
級アンモニウム塩から選ばれる。一方、上記親水性基
は、非イオン性基であってもよく、例えば、（ｄ）多価
アルコールや多価アミノアルコール等（例えば、トリ
ス、もしくはモノサッカライド、オリゴサッカライドま
たはポリサッカライド）の残基などのポリヒドロキシ
基、（ｅ）C2〜C3ポリアルキレンオキシ基またはC2〜C3
ポリアルキレンチオ基が挙げられる。スルホン酸基およ
びアミン基は特に好ましい。さらに、上記親水性基は、
上記基（ａ）〜（ｅ）の2種以上の組み合わせを含んで
いてもよい。
【００１８】構造式（Ｉ）および／または（II）の化合
物を金属錯体の形態で用いることも可能である。好適な
金属の例は、遷移金属または希土類金属である。
【００１９】本発明による化合物の合成は、公知の方法
に従って行うことが可能である。すなわち、スルホン化
ジヒドロインダンスロンは、インダンスレンをスルホン
化し、続いて酸化することによって得ることが可能であ
る。オルトキノンとオルトジアミノアリール化合物とを
縮合してフェナジンを形成することは、標準的な反応で
ある（G.A. Swan,「複素環化合物の化学(The Chemistry
of Heterocyclic Compounds)」中の「フェンナジン(Ph
enazines)」、A. Weissberger発行、Interscience Publ
isher Inc., New York 1975 参照）。Arが構造式(Va)ま
たは(Vb)の基を表す化合物のウィッティッヒ(Wittig)反
応による合成は、例えば、ニコライズ(Nicolaides)およ
びチリナス(Litinas)による刊行物に記載されている(J.
Chem. Res.(M) 1983, 658-663)。
【００２０】本発明による化合物は、分析対象物質の定
性的および／または定性的な測定方法用の検出試薬の調
製に用いられる。この測定は、血液、血清、血漿または
尿等の体液のサンプルのような水系液体中で行うことが
可能である。この方法は、キュベット内で行われるよう
な湿式試験、または対応する試薬担体上での乾式試験と
して行うことが可能である。
【００２１】分析対象物質は、単一の反応によって、あ
るいは一連の反応によって測定してもよい。分析対象物
質の測定は、好ましくはレドックス反応を包含し、この
レドックス反応では、本発明による検出試薬の検出可能
な分子特性の変化、例えば、分光分析上の特性の変化
（例えば、吸光度または蛍光）または電気化学的特性の
変化などの検出可能な変化がある。
【００２２】吸収特性の変化を測定することが特に好ま
しく、これは、IR、UV、特に可視領域における分光分析
検出方法によって達成可能である。驚くべきことに、ス
ルホン酸基等の親水性基の導入によって、本発明による
化合物の還元体の吸収極大が約600〜800nmの長波長領域
において起こり、それによって、血清中で分析対象化合
物を測定する場合には、血清成分による干渉が全く生じ
なくなることがわかった。このことは、特に構造式（II
I）（式中、R3およびR4は、一緒になってナフタレン環
系を形成し、かつスルホン酸基等の親水性基は、ピラジ
ン窒素に直接隣接しているC原子に結合する）の基にも
適用される。
【００２３】分光分析上の特性に加えて、検出試薬の電
気化学的特性（例えば、レドックス電位または電流の変
化など）を測定することも可能である。好適な電気化学
的検出方法の例としては、シクロボルタメトリー(cyclo
voltammetry)および電流滴定がある。
【００２４】本発明による検出試薬によって測定される
分析対象物質は、例えば、細菌、酵母、真菌、植物細胞
または動物細胞等の細胞（例えば白血球）であり、その
場合、これらの細胞の特定の還元または酸化活性が検出
可能である。さらに、酵素を検出対象物質として検出す
ることが可能であり、そのような酵素としては、例え
ば、オキシダーゼ（例えば、ペルオキシダーゼ）、また
はデヒドロゲナーゼ（例えば、グルコースオキシダー
ゼ、乳酸エステルデヒドロゲナーゼ）、またはヒドロラ
ーゼ（例えば，リパーゼ、グラクトシダーゼ、アルカリ
ホスファターゼ）などのオキシドレダクターゼが挙げら
れる。それ以外の検出対象物質としては、アスコルビン
酸、システイン、グルタチオン、チオレドキシン等の検
出試薬とのレドックス反応に関与しうる生物学的または
化学的物質；グルコース、乳酸、トリグリセライド、コ
レステロール等の代謝性物質；抗原、ハプテンおよび抗
体等の免疫学的に反応性である物質；およびペプチド性
核酸などの核酸または核酸誘導体が挙げられる。
【００２５】したがって、本発明による化合物は、臨床
的診断用の液体または乾式試験等の多くの適用分野にお
ける検出試薬として使用可能である。さらに、それら
は、還元または酸化酵素を検出したり存在位置を見つけ
たりするための組織学において、細胞増殖および細胞毒
性試験のための、さらには種子の発芽試験、生体染色、
組織（例えば正常組織または腫瘍組織）中のデヒドロゲ
ナーゼの組織化学的および細胞化学的検出のための細胞
生物学において、および例えばコルチコレステロイドを
検出するための、薄層クロマトグラフィーにおける検出
剤として使用可能である。
【００２６】構造式（Ｉ）および（II）の化合物は、直
接的な検出試薬として使用してもよい。すなわち、分析
対象物質は、この化合物の分子特性の検出可能な変化に
より直接測定される。一方、この化合物は、仲介物とし
て作用してもよく、もう１つの検出系と組み合わせて用
いてもよい。すなわち、分析対象物質は、この化合物の
分子特性の変化によって直接測定されるのではなく、例
えば電気化学的検出系（例えば、EP-A-0441222参照）ま
たは他の化学物質（例えば、テトラゾリン化合物）等の
もう１つの検出系により測定される。
【００２７】本発明の好ましい態様では、構造式（Ｉ）
および（II）による化合物を用いてオキシドレダクター
ゼ活性を検出するが、ここで、検出すべき分析対象物質
は、一方では、それ自体がデオキシドレダクターゼであ
るか、もう一方ではオキシドレダクターゼ基質であって
もよい。この検出は、好ましくは、オキシドレダクター
ゼ補助基質(co-substrate)の存在下で、特にNAD(P)+ ま
たはNAD(P)H/H+ の系で、あるいはフラビンやPQQ等の他
の補助基質の存在下で行われる。
【００２８】オキシドレダクターゼ活性は、酵素の補助
基質からの電子の、酸化された化合物への移動、または
その逆の反応（すなわち、還元された化合物からの電子
の、酵素補助基質への移動）を触媒する仲介物の存在下
で測定してもよい。NAD(P)依存性デヒドロゲナーゼに対
する好適な仲介物の例としては、酵素ジアフォラーゼま
たは、N-メチルフェナジニウムメトスルフェートがあ
る。しかし、酵素補助基質からの電子を酸化された化合
物に直接移動させること、あるいは還元された化合物か
らの電子を酵素補助基質へ直接移動させることも可能で
ある。
【００２９】本発明のさらに好ましい態様は、グルコー
ス染料オキシドレダクターゼ活性などの染料オキシドレ
ダクターゼ活性を検出するための、構造式（Ｉ）および
／または（II）の化合物の使用である。この場合、酵素
は、酵素基質から、酸化された化合物へ直接移動可能で
ある。しかし、PQQ等の補助酵素(co-enzyme) 仲介物を
用いることが好ましい。他の分析対象物質の測定では、
酸化活性は、本発明による化合物の還元体を用いて検出
してもよい。
【００３０】本発明のさらに好ましい態様は、ヒドロラ
ーゼ活性を検出するための、構造式（Ｉ）および／また
は（II）の化合物の使用であり、ここにおいて、ヒドロ
ラーゼまたはヒドロラーゼ基質は、検出すべき分析対象
物質であってもよい。かかる検出は、好ましくは、酸化
的カップリング系により、例えばβ−ガラクトシダーゼ
・カップリングにより行われ、ここでは、加水分解が、
酸化された場合に本発明の酸化された化合物を還元する
ヒドロラーゼ基質の開裂による、酸化性化合物の形成を
引き起こす。
【００３１】さらに、本発明は、サンプル中の分析対象
物質の測定方法であって、サンプルを、少なくとも1種
の構造式（Ｉ）および／または（II）の化合物を含有す
る試薬と接触させ、かつ分析対象物質が該試薬の検出可
能な特性の変化によって測定されることを特徴とする該
測定方法に関する。分析対象物質測定用の本発明による
試薬は、構造式（Ｉ）および／または（II）の化合物の
少なくとも１種を含有し、かつ、仲介物、付随する物質
(accpmpanying substances)（例えば、緩衝液、塩類、
界面活性剤、および場合によっては他の補助試薬等）等
の他の試験成分をさらに含有する試薬キットの１成分と
して、試薬または幾つかの別個の部分的試薬の形態で存
在してもよい。上記の付随する物質は、例えば、ｐＨの
変化および／または界面活性剤の添加によって、本発明
による化合物の分子特性の改変（例えば、スペクトル特
性）が可能になるように、任意に選ばれてもよい。
【００３２】本発明による試薬は、液体試験用の試薬で
あってもよく、そのような試薬は、例えば、水系または
非水系液体中の溶液または懸濁液の形態で、あるいは粉
体または凍結乾燥物として存在する。一方、この試薬
は、例えば、吸収性または膨潤性担体に吸収された、あ
るいは感光性フィルム層に組み込まれた乾燥試験試薬と
して存在してもよい。液体試験試薬は、好ましくは、本
発明による方法に必要とされる全ての成分を含有する。
水および水溶解性有機溶剤（例えば、アルコール、アセ
トンまたはジメチルホルムアミド）を含有する混合物
が、溶剤または懸濁剤として考えられる。安定性の理由
から、試験に必要とされる成分を２種または数種の部分
試薬に分配し、それらを実際の分析まで混合しないこと
が有利である。
【００３３】本発明による試薬は、試験片の形態で存在
してもよい。そのような試験片は、種々の態様において
公知である（例えば、DE-A-3247608、EP-A-0262445また
はEP-A-0256806を参照）。試験片において、測定方法を
行う上で必要とされる試薬の成分は、固形担体層上に存
在する。吸収性および／または膨潤性の材料が担体層と
して考えられ、それらは試験すべきサンプル液によって
湿潤される。例としては、ゼラチン、セルロース、有機
ポリマーおよびコポリマー、または合成繊維フリースが
ある。上記試薬の成分は、これらの担体材料の中または
上に固形の形態で存在する。サンプルが試験片上に塗布
されるか、あるいは試験片がサンプル中に浸漬される場
合、その片には液体環境が形成され、その内部で検出反
応が進行する。反応によって生じる色の変化は、目視ま
たは光度測定により（例えば反射計によって）、あるい
は電気化学的に評価することが可能である。
【００３４】本発明による化合物は、さらに、感光性フ
ィルムまたはフォト層(photo layers) に組み込まれて
いてもよい。この場合、担体材料は、少なくとも本質的
に透明なフィルム材料であり、好ましくは、波長200〜9
00nmの電磁線に対して透過性なものである。好適な担体
材料は、有機ポリマーおよびコポリマーであり、例え
ば、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、
セルロースエステル等、およびそれらのコポリマーであ
る（例えば、WO86/04681の実施例11〜13参照）。
【００３５】用いられる化合物の濃度は、測定すべき分
析対象物質の濃度に依存する。本発明による方法におい
て測定すべき分析対象物質の典型的な濃度は、基質の場
合には１０-6〜１０-1mol/lであり、酵素活性を検出す
る場合には１０-15mol/lへと低下する。これと対応し
て、用いられる化合物の典型的な濃度は、１０-6〜１mo
l/lである。テトラゾリウム化合物または特定の酸化的
カップリング試薬等の別の検出可能な化合物を本発明に
よる化合物と組み合わせて用いる場合には、これらは、
好ましくは、本発明による化合物に対して少なくとも理
論上の比率であり、好ましくは1.5〜２倍過剰である。
【００３６】本発明のさらにもう１つの主題は、構造式
（Ｉ）および（II）の新規な化合物であり、特に、イン
ダンスレンモノスルホン酸、インダンスレンジスルホン
酸およびそれらのナトリウムおよびカリウム塩を除い
た、少なくとも１個の上記したような親水性基を含有す
る化合物である。
【００３７】構造式（VIIa）、（VIIb）、（VIIIa）ま
たは（VIIIb）：
【化１０】
【化１１】 〔式中、R1、R2、X、R'、ｍ、ｐ、R3、R4、R5、R3'、
R4'、R5'、YおよびY'は、上記化合物（Ｉ）と同じ意味
を表す。〕を有する新規化合物は、特に好ましい。X
は、特に好ましくはOを表す。さらにR1およびR2、およ
び／またはR3、R4、R5、R3'、R4'、R5'の少なくとも１
つが芳香族または複素芳香族環系を含有することが好ま
しい。R1およびR2は、例えば、場合によって置換されて
いるベンゼン環であってもよく、化合物（VIIa）および
（VIIb）において、R3およびR4は互いに架橋していても
よく、かつ、例えば、場合によって置換されているナフ
タレンまたはアントラキノン環系を形成してもよい。そ
れに対応して、化合物（VIIIa）および（VIIIb）におい
て、（ａ）R3とR4、および／またはR3'とR4'は一緒にな
って架橋しているか、あるいは（ｂ）R4とR5、および／
またはR4'とR5'は互いに架橋していてもよく、かつ、例
えば、芳香族または複素芳香族構造を含有する環系を形
成してもよい。
【００３８】ＹおよびY'は、好ましくは、それぞれの場
合において、CR6を表し、ここでR6は上記化合物（Ｉ）
と同じ意味を表す。
【００３９】
【実施例】実施例１〜４ ［ベンゾナフトフェナジン-8,13-ジオンの合成］実施例
１〜４による化合物は、ジアミノアントランキノンをオ
ルト−ジカルボニル化合物と縮合することにより合成す
る。
【００４０】実施例１：8,13-ジヒドロ-ベンゾ[a]ナフ
ト[2,3-h]フェナジン-8,13-ジオン-3,6-ジスルホン酸二
ナトリウム塩および10,15-ジヒドロ-ベンゾ[a]ナフト
[2,3-j]フェナジン-10,15-ジオン-3,6-ジスルホン酸二
ナトリウム塩 4.8g（0.02モル）の1,2-ジアミノアントラキノンと7.2g
（0.02モル）の1,2-ナフトキノン-3,6-ジスルホン酸二
ナトリウム塩〔W. Langenbeck,H. Le Blanc, B.Lukowcy
k. Chem. Ber. 1954, 87, 496；C. Grundmannの"Mothod
en der Organischen Chemie" (Houben Weyl) publ. C.
Grundmann Georg Thieme Verlag Stuttgart 1979, vol.
VII 3b (Chinone II), P.64-75 にしたがって調製〕と
を100mlの酢酸に懸濁した懸濁液を、環流下で、撹拌し
ながら２時間にわたって沸騰させる。室温まで冷却した
後、それを1000mlの水と混合する。この混合物を濾過
し、続いてその濾液を酢酸エチルで３回振とうすること
によって抽出する。分別した水相を50mlまで濃縮する。
水を溶離剤として用いてLH２０でのカラムクロマトグラ
フィーにかけた後、１gの２種の異性体を得る。
【００４１】（一方の異性体についてのデータ） neg. LSIMS（水／gly／m-NBA）：m/z 542 [m-Na+H], 51
9 [m-2Na+H],520 [m-2Na+2H] UV/Vis吸収（0.1Mリン酸緩衝液 pH=7.0）：420nm；アス
コルビン酸で還元後：780, 703, 570nm 1H-NMR (d6-DMSO) ppm: 7.92 (t,[1H]), 7.99 (t,[1
H]),8.18 (d,[1H]),8.20(d,[1H]),8.32 (d,[1H]),8.35
(s,[1H]),8.58 (d,[1H]),8.76 (s,[1H]),8.78 (d,[1
H]),9.35 (d,[1H]), 13C-NMR (d6-DMSO) ppm: 125.53, 125.75, 126.06, 12
6.65, 126.69, 128.64,130.98, 131.31, 131.58, 133.6
5, 133.75, 134.75, 135.51, 136.08, 137.98,140.68,
141.55, 143.11, 143.44, 150.63, 182.35, 183.02 。
【００４２】（もう一方の異性体についてのデータ） neg. LSIMS（水／gly／m-NBA）：520, [m-2Na+2H], 1H-NMR (d6-DMSO) ppm: 7.95 (t,[1H]), 7.08 (t,[1
H]),8.17 (d,[1H]),8.19(d,[1H]),8.32 (s,[1H]),8.36
(d,[1H]),8.68 (d,[1H]),8.73 (s,[1H]),8.73 (d,[1
H]),9.40 (d,[1H]), UV/Vis吸収（0.1Mリン酸緩衝液 pH=7.0）：414nm；アス
コルビン酸で還元後：805, 660, 555nm。 上記２種の異性体の構造式は図２ａおよび２ｂに示す。
【００４３】実施例２：15-ブロモ-8,13-ジヒドロ-ベン
ゾ[a]ナフト[2,3-h]フェナジン-8,13-ジオン-3,6,11-ト
リスルホン酸三ナトリウム塩および8-ブロモ-10,15-ジ
ヒドロ-ベンゾ[a]ナフト[2,3-j]フェナジン-10,15-ジオ
ン-3,6,12-トリスルホン酸三ナトリウム塩 0.6ml（15ミリモル）の臭素を、１g（３ミリモル）の2-
アミノ-アントラキノン-6-スルホン酸[O. Bayer の"Mot
hoden der Organischen Chemie" (Houben Weyl) publ.
O. Bayer Georg Thieme Verlag Stuttgart 1979, vol.
VII 3c (Chinone III), P.182] を５mlの75%硫酸中に溶
解した溶液に添加する。それを３時間にわたって105℃
に加熱し、室温まで冷却した後で50mlの水を添加する。
1.5gの粗生成物（1,3-ジブロモ-2-アミノ-アントラキノ
ン-6-スルホン酸）を精製せずに15mlの25%アンモニア溶
液とオートクレーブ中で100℃で反応させる。この生成
物（1,2-ジアミノ-3-ブロモ-アントラキノン-6-スルホ
ン酸）を飽和塩化ナトリウム溶液の添加により沈殿さ
せ、LH20のカラムクロマトグラフィーによってメタノー
ル／水（１：１）を溶離剤として用いて精製する（紫色
のバンドを回収する）。400mg（１ミリモル）の1,2-ジ
アミノ-3-ブロモ-アントラキノン-6-スルホン酸と550mg
（１ミリモル）の1,2-ナフトキノン-3,6-ジスルホン酸
二ナトリウム塩（上記を参照）との懸濁液を環流下で２
時間にわたって６mlの酢酸中で撹拌しながら沸騰させ
る。この反応混合物を実施例１と同様にして処理する。
それぞれ100mgの２種の異性体を得る。
【００４４】（一方の異性体についてのデータ） neg. LSIMS（水／gly／m-NBA）：m/z 667 [m-3Na+H], 6
78 [m-3Na+2H] UV/Vis吸収（0.1Mリン酸緩衝液 pH=7.0）：422nm；アス
コルビン酸で還元後：802, 716, 660 nm （もう一方の異性体についてのデータ） UV/Vis吸収（0.1Mリン酸緩衝液 pH=7.0）：416nm；アス
コルビン酸で還元後：810（弱い）、715（弱い）, 545n
m。 上記２種の異性体の構造式は図２ｃおよび２ｄに示す。
【００４５】実施例３：8,13-ジヒドロ-3-ニトロ-ベン
ゾ[a]ナフト[2,3-h]フェナジン-8,13-ジオン-6-スルホ
ン酸または10,15-ジヒドロ-3-ニトロ-ベンゾ[a]ナフト
[2,3-j]フェナジン-10,15-ジオン-3,6-スルホン酸 ６ミリモルの5-アミノ-6-ヒドロキシ-ナフタレン-2スル
ホン酸(H.E. Fierz-David, L. Blangey, H. Kaul, Hel
v. Chim. Acta 1946, 29, 1765)を30分間にわたって80
℃まで10mlの68%硝酸中で加熱する。０℃まで急速に冷
却した後、50mlの飽和塩化ナトリウム溶液を添加する。
褐緑色の沈殿を吸引濾過し、風乾する。この粗3-ニトロ
ナフト-1,2-キノン-6スルホン酸を２時間にわたって環
流下で３ミリモルのジアミノ-アントラキノンと共に20m
lの氷酢酸中で沸騰する。それを実施例１に記載のよう
にして処理する。収量：40mg（１種のみの異性体が単離
される）。
【００４６】neg. LSIMS（水／gly／m-NBA）：m/z 484
[m-Na], UV/Vis吸収（0.1Mリン酸緩衝液 pH=7.0）：410nm；アス
コルビン酸で還元後：800（弱い）, 638nm。 この化合物の構造式は図２ｅに示す。
【００４７】実施例４：8,13-ジヒドロ-4-ビス（2-ヒド
ロキシエチル）アミノ-ベンゾ[a]ナフト [2,3-h]フェナ
ジン-8,13-ジオンおよび10,15-ジヒドロ--4-ビス（2-ヒ
ドロキシエチル）アミノ-ベンゾ[a]ナフト[2,3-j]フェ
ナジン-10,15-ジオン 238mg（１ミリモル）のジアミノアントラキノンおよび2
61mg（１ミリモル）の4-ビス（2-ヒドロキシエチル）ア
ミノ-1,2-ナフトキノン〔1,2-ナフトキノン-4-スルホン
酸ナトリウム塩とジエタノールアミンとから、C. Grund
mannの"Methoden der Organischen Chemie" (Houben We
yl) Publ. C. Grundmann Georg ThiemeVerlag Stuttgar
t 1979, Vol. VII 3b(Chinone II) P. 64-75に明記され
たようにして合成する〕を、２時間にわたって環流下で
20mlの氷酢酸中で撹拌しながら沸騰させる。室温まで冷
却した後、上記の酢酸を減圧蒸留によって除去する。そ
の残留物を、酢酸エチル／メタノール／氷酢酸混合物
（２：２：１）を溶離剤として用いてシリカゲル上で分
離する。レモンイエローのバンドを回収する。収量：20
mg（異性体混合物）。
【００４８】UV/Vis吸収（Ｈ2Ｏ）：445nm;還元後：548
nm。 上記２種の異性体の構造式は図２ｆおよび図２ｇに示
す。上記のプロセスにより、文献において公知である、
あるいは実施例１〜４に記載されているジアミノ-アン
トラキノンを、文献において公知である、あるいは市販
されている1,2-ジカルボニル化合物またはその水和物と
縮合することによって得られた別の化合物を図３にまと
める。
【００４９】実施例５および６： デヒドロインダンスレンスルホン酸の合成 デヒドロインダンスロンスルホン酸は、インダンスレン
をスルホン化し、続いそれを酸化することによって得
る。この製造方法は、フリードレンダー・テキストブッ
ク(Friedlander textbook)に記載されている。
【００５０】実施例５：デヒドロインダンスロン・モノ
スルホン酸（Lit.: Fr. IX, 783による） 5g（８ミリモル）のホウ酸を10mlの濃硫酸中に溶解す
る。0.3g（0.7ミリモル）のインダンスロンを上記の熱
い溶液に添加し、その混合物を４時間にわたって環流下
で沸騰させる。この混合物を冷却し、50mlの蒸留氷水で
希釈する。続いて、それを濾過し、上記硫酸の大部分を
除去する。その残留物を少量の蒸留水中で沸騰させ、熱
濾過し(hot filtered) 、洗浄して乾燥する（収量：0.2
5gのインダンスロン・モノスルホン酸）。次に、それ
を、氷上で冷却しながら、15分間にわたって、10mlの濃
硫酸と10mlの発煙硝酸との混合物と共に撹拌する。続い
て、それを、氷上で冷却しながら水で50mlに希釈し、吸
引濾過する。その褐色固形物をセファデックス(Sephade
x)LH-20上でメタノールを溶離剤として用いて精製す
る。アスコルビン酸を添加した際に青色になるフラクシ
ョンをプールする。溶媒を蒸留によって除去し、残留物
を水で取り出す。この溶液を凍結乾燥する。収量：90m
g。 UV/Vis吸収：（0.1Mリン酸緩衝液 pH=7.0）：392nm；還
元後：717,667nm。 この化合物の構造式を図４の上部に示す（ｎ＝１）。
【００５１】実施例６：デヒドロインダンスロンスルホ
ン酸二ナトリウム塩の調製（Lit.: Fr. VI, 413によ
る） ２gのインダンスロンを加熱して、１gのホウ酸および60
mlの発煙硫酸［発煙硫酸 (oleum)、30%SO3］と共に沸騰
させる。この沸騰は、この反応溶液のサンプルが、大量
の水で希釈した際に透明な青色溶液を生ずるまで行う。
続いて、この油性の溶液を200mlの氷水中に注意深く滴
下する。この混合物を４Ｄガラスフリットの上で吸引濾
過する。フィルターのケークが得られるが、これは、依
然として水および硫酸を含有する。上記反応からのイン
ダンスロンジスルホン酸は、依然として湿っており、こ
れを、氷上で冷却しながら、15分間にわたって20mlの発
煙硝酸と共に撹拌する。続いて、それを、冷却しなが
ら、50%水酸化ナトリウム溶液でゆっくりと中和する。
この溶液をダイアイオン(Diaion)上で、水を溶離剤とし
て用いて脱塩する。この褐色の溶出液を濃縮し、実施例
５と同様にして、セファデックスLH-20上で、水を溶離
剤として用いて分離する。収量：200mg。UV/Vis吸収：
（0.1Mリン酸緩衝液 pH=7.0）：394nm；還元後：790, 7
14, 655nm。 この化合物の構造式を図４の上部に示す（ｎ＝２）。ス
ルホン酸残基の置換位置はおそらく７位および１６位で
ある。
【００５２】実施例７：2-（ピリド-2-イル）-3-（1-メ
チルピリド-2-イリウム）ナフト-[2,3-a]キノキサリン-
7,12-ジオン-メチルスルフェート 2.38g（10ミリモル）の1,2-ジアミノアントラキノンお
よび2.12g（10ミリモル）のビピリジイルを、10mlの氷
酢酸中で、５分間にわたって、撹拌しながら、環流まで
沸騰させる。室温まで冷却した後、それを吸引濾過す
る。その残留物を、氷酢酸から再結晶する。［収量：2.
45gの2,3-（ジピリド-2-イル）ナフト[2,3-a]キノキサ
リン-7,12-ジオン］。この残留物（5.84ミリモル）を、
30分間にわたって、100℃まで、0.6ml（6.42ミリモル）
のジメチルスルフェートと共に10mlのニトロベンゼン中
で加熱する。室温まで冷却した後、それを、50mlのエー
テルの添加によって沈殿させる。この残留物を吸引濾過
し、アセトニトリルからエーテルを用いて４回にわたっ
て再沈殿させる。それを取り出して200mlの沸騰イソプ
ロパノール中に入れ、濾過する。この濾液をエーテル／
石油エーテル（１：１）と混合する。微細な淡橙色の針
状物が沈殿する。収量：250mg。この化合物の構造式を
図４の下に示す。
【００５３】LSIMS： M/Z 429 UV（0.1Mリン酸緩衝液 pH=7.0）：380nm；アスコルビン
酸で還元後：533nm；1H-NMR (CD3CN) ppm: 3.51 (s,[3
H]), 4.25 (s,[3H]),7.46 (m,[1H]),7.90 (m,[3H]),8.1
5 (dd,[2H]),8.24 (d,[1H]),8.29 (dd,[2H]),8.55 (dd,
[2H]),8.74 (d,[1H]),8.83 (d,[1H]),8.94 (d,[1H]) 。 13C-NMR (CD3CN) ppm: 47.46, 53.65, 124.97, 126.52,
127.27, 127.62, 128.13, 128.65, 128.96, 129.99, 1
32.88, 134.90, 135.84, 136.11, 138.42, 139.08, 14
0.70, 143.39, 146.19, 146.67, 147.05, 149.80, 152.
02, 153.77, 154.81, 157.83, 183.45, 183.85 。
【００５４】実施例８：指示薬とグルコース／glucDOR
との反応 以下をキュベット内で混合する。 ・指示薬（デヒドロインダンスロンジスルホン酸二ナト
リウム塩）の５mM溶液（蒸留水中）：20μl ・0.1Mのリン酸緩衝液（pH=7）：1870μl ・１Mのグルコース溶液：10μl 100μlのGlucDOR溶液［PQQ（0.016 mg/ml)および塩化カ
ルシウム（0.7 mol/l)を含有する0.05MのHepes緩衝液(p
H7.0)、PQQ（c=0.016 mg/ml)および塩化カルシウム（c=
0.7 mol/l)を含有］を300U/mlの濃度で添加する。添加
後、60秒毎にUV/Visを記録する（図５）。８分後には、
さらなる色の変化は全く測定できない。
【００５５】実施例９：指示薬とNADH／ジアフォラーゼ
との反応 以下をキュベット内で混合する。 ・8,13-ジヒドロベンゾ[a]-ナフト[2,3-h]フェナジン-
8,13-ジオン-3,6-ジスルホン酸二ナトリウム塩またはそ
の[2,3-j]異性体の５ｍＭ溶液（蒸留水中）：20μl ・0.1Mのリン酸緩衝液（pH=7）：1870μl ・0.1MのNADH溶液（蒸留水中）：10μl 100μlのジアフォラーゼ溶液［0.1Mのリン酸緩衝液(pH
7.0)に、100U/mlの濃度で溶解させたもの］をこれに添
加し、UV/Visスペクトルを60秒後に記録する（図６）。
【００５６】実施例10：NADHの測定 測定混合物：（最終濃度） リン酸緩衝液（pH=7）： 100 mM 指示薬： 0.5 mM （8,13-ジヒドローベンゾ[a]ナフト[2,3-h]フェナジン-
8,13-ジオン-3,6-ジスルホン酸二ナトリウム塩またはそ
の[2,3-j]異性体） NADH： 50-100μmol キュベット内での最終濃度５U/mlは、ジアフォラーゼ溶
液［100U/ml, 0.1Mリン酸緩衝液(pH=7)］で調節し、704
nmにおける吸光度の変化を１分後に測定する。高い濃度
のNADHを用いる程、大量のグルーグリーン(glue-green)
の染料が形成される（図７）。
【００５７】実施例11：指示薬とフェナジンメトスルフ
ェート／NADHとの反応の反応速度論 以下をキュベット内で順次混合する。 ・8,13-ジヒドロベンゾ[a]-ナフト[2,3-h]フェナジン-
8,13-ジオン-3,6-ジスルホン酸二ナトリウム塩の５mM溶
液（蒸留水中）：20μl ・0.1Mのリン酸緩衝液（pH=7）：1870μl ・0.1MのNADH溶液（蒸留水中）：10μl ・ 10μg/mlのフェナジンメトスルフェート溶液（蒸留
水中に溶解）：100μl 703nmにおける吸光度を経時的に測定する（図８）。仲
介物を添加後、青色の染料が形成される。
【００５８】実施例12：ヒドロラーゼ基質との組み合わ
せ 以下をキュベット内に入れる。 ・3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシドの５mM溶液
（蒸留水中）：20μl ・0.1Mのリン酸緩衝液（pH=7）：1860μl UV/Visスペクトルを記録する。次いで、100μlのβ-ガ
ラクトシダーゼ溶液［0.1Mのリン酸緩衝液（pH=7）（38
4U/ml)〕を添加する。添加の150秒後、UV/Visスペクト
ルを記録する。大気中の酸素によって形成されるインジ
ゴの吸収バンドが弱く見られる。次いで、20μlの8,13-
ジヒドロベンゾ[a]-ナフト[2,3-h]フェナジン-8,13-ジ
オン-3,6-ジスルホン酸二ナトリウム塩またはその[2,3-
j]異性体の５mM溶液（蒸留水中）を添加する。添加の15
0秒後、UV/Visスペクトルを記録する。深青色の溶液が
形成される。両方の染料の吸収バンドが見られる（図９
参照）。
【００５９】実施例13：NBTによるフルクトースの測定
(J.D. Kruse-Jarres, J. Jaraushら, Laboratoriumsmed
izin 1989, 13, 245）のためのBoehringer Mannheim テ
ストキット (オーダーNo. 1101 668)の標準緩衝液中に
おける、市販のNBT（4-ニトロブルーテトラゾリンクロ
ライド、Boehringer Mannheim Gmbh 1087479 Ch1452812
1）および8,13-ジヒドロベンゾ[a]-ナフト[2,3-h]フェ
ナジン-8,13-ジオン-3,6-ジスルホン酸二ナトリウム塩
またはその[2,3-j]異性体の光安定性2.2%の界面活性剤
を含有するNBTまたはベンゾナフトフェナジン- ジオン
の0.5mM溶液［0.2Mの炭酸ナトリウム緩衝液（pH=10.3)
中］を新たに調製する。UV/Visスペクトルを記録する。
この溶液を10分間にわたって暗室に室温で静置した後
で、さらにスペクトルを記録する。スペクトルは変化し
ない。続いて、この溶液を60Wのキセノンランプで照射
する（照射源からの距離：30cm、室温）。総照射時間
5、10、30および60分後にスペクトルを記録する。NBT溶
液の場合、UV/Visスペクトルは、照射時間が長くなるに
つれて変化する。紫色の着色が目視によって観察でき
る。これとは対照的に、ベンゾナフトフェナジン−ジオ
ン溶液は変化しない（図１０参照）。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による好ましい指示薬物質の構造式を示
す図である。
【図２】実施例１〜４で合成されたベンゾナフトフェナ
ジン-8,13-ジオンの構造式を示す図である。
【図３】本発明によるさらにもう１つのベンゾナフトフ
ェナジン-8,13-ジオンの構造式を示す図である。
【図４】実施例５および６で合成されたデヒドロインダ
ンスレンスルホン酸、および実施例７で合成されたピリ
ジルナフトキノキサリン-7,12-ジオン-メチルスルフェ
ートの構造式を示す図である。
【図５】本発明によるグルコース検出用の指示薬のUV/V
isスペクトルを示す図である。
【図６】仲介物であるジアフォラーゼ存在下での本発明
によるNADH検出用の指示薬のUV/Visスペクトルを示す図
である。
【図７】仲介物であるジアフォラーゼ存在下での本発明
によるNADH検出用の指示薬のUV/Visスペクトルを示す図
である。
【図８】仲介物であるフェナジンメトスルフェート存在
下での本発明による指示薬とNADHとの反応速度論(kinet
ics)のUV/Visスペクトルを示す図である。
【図９】β−ガラクトシダーゼ活性の測定における本発
明による指示薬のUV/Visスペクトルを示す図である。
【図１０】本発明による指示薬とテトラゾリウム塩との
光安定性の比較を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｄ 487/04 １４７ Ｃ０７Ｄ 487/04 １４７ 491/048 491/048 495/04 １０５ 495/04 １０５ (72)発明者 ルパート ヘルマン ドイツ連邦共和国 Ｄ−82362 ヴァイル ハイム イン デル アウ 23 (72)発明者 ヨアヒム ヘーネス ドイツ連邦共和国 Ｄ−64673 ツビンゲ ンベルグ ロダウアー シュトラーセ 50 アー (72)発明者 ハンス−ペーター ヨーゼル ドイツ連邦共和国 Ｄ−82362 ヴァイル ハイム プレーラテンヴェーク ７ (72)発明者 マルティナ ユニウス−コマー ドイツ連邦共和国 Ｄ−82327 テューチ ング ハルバーガー アレー 11 (72)発明者 ハートムート メルデス ドイツ連邦共和国 Ｄ−69123 ハイデル ベルグ シュシュテルシュトラーセ ５ア ー (72)発明者 アクセル シュミット ドイツ連邦共和国 Ｄ−80634 ミュンヘ ン グートルンシュトラーセ 18 (72)発明者 エルンスト ゼルバーティンガー ドイツ連邦共和国 Ｄ−81675 ミュンヘ ン トロゲルストラーセ 29

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 分析対象物質測定用の検出試薬の調製に
    おける、構造式（Ｉおよび／または（II）の化合物また
    はそれらの塩の使用： 【化１】 [式中、R1およびR2は、それぞれ独立して、水素、ハロ
    ゲンまたは有機基であり、Xは、O、S、C(Acc)2、CH(Ac
    c)またはN(Acc)を表し、かつAccは電子求引性基であ
    り、Phは、場合により置換されているフェニル環を表
    し、ｎは０〜４の整数であり、Arは構造式(IIIa)、(III
    b)、(IVa)、(IVb)、(Va)、(Vb)、（VIa）または（VI
    b）： 【化２】 【化３】 （式中、R3、R3'、R4、R4'、R5およびR5'は、それぞれ
    独立して、水素、ハロゲンおよび有機基であり、Yおよ
    びY'は、それぞれ独立して、NまたはCR6 であり、ここ
    で、R6は水素、ハロゲンまたは有機基であり、Zは、N
    R、OまたはSであり、ここで、Rは有機基または水素であ
    り、R'は、それぞれの場合において、独立して、場合に
    より置換されているアルキルまたはアリール基であり、
    ｍは、それぞれの場合において、独立して、０または１
    であり；ｍ＝１である場合には、上記構造式(IIIa)、(I
    Va)、（Va）および（VIa）中のR'に結合している窒素が
    陽電荷を有し、かつ適当な対イオンが存在し、そして上
    記構造式（IIIb）、（IVb)、(Vb)および(VIb)において
    ｐ＝０であり；ｍ＝０の場合には、ｐ＝１である）の基
    を表す］。
  2. 【請求項２】 分析対象物質の測定が、検出試薬の分子
    特性の検出可能な変化が存在するレドックス反応を含
    む、請求項１に記載の使用。
  3. 【請求項３】 オキシドレダクターゼ活性を測定するた
    めの、請求項１または２に記載の使用。
  4. 【請求項４】 前記測定が、オキシドレダクターゼ補助
    基質、特にPQQ、NAD(P)+またはNAD(P)H/H + 存在下で行
    われる、請求項３に記載の使用。
  5. 【請求項５】 オキシドレダクターゼが測定すべき分析
    対象物質である、請求項３または４に記載の使用。
  6. 【請求項６】 オキシドレダクターゼ基質が測定すべき
    分析対象物質である、請求項３または４に記載の使用。
  7. 【請求項７】 ヒドロラーゼ活性を測定するための、請
    求項１または２に記載の使用。
  8. 【請求項８】 前記検出が酸化的カップリング系により
    行われる、請求項７に記載の使用。
  9. 【請求項９】 ヒドロラーゼが測定すべき分析対象物質
    である、請求項７または８に記載の使用。
  10. 【請求項１０】 ヒドロラーゼ基質が測定すべき分析対
    象物質である、請求項７または８に記載の使用。
  11. 【請求項１１】 前記構造式（Ｉ）および（II）の化合
    物におけるR1およびR2の少なくとも1つが、場合により
    置換されていてもよい芳香族または複素芳香族環系を含
    有する、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の使用。
  12. 【請求項１２】 R1 およびR2が一緒になって芳香族ま
    たは複素芳香族環系を形成する、請求項１１に記載の使
    用。
  13. 【請求項１３】 構造式(IIIa)、(IIIb)、(IVa)、(IV
    ｂ)、(Va)、(Vb)、(VIa)および(VIb)の基において、
    R3、R4および、もしも存在する場合にはR3'、R4'、R5お
    よびR5'の少なくとも１つが、場合により置換されてい
    てもよい芳香族または複素芳香族環系を含有する、請求
    項１〜１２のいずれか１つに記載の使用。
  14. 【請求項１４】 構造式(IIIa)、(IIIb)、(IVa)、(IV
    b)、(VIa)および(VIb)の基において、R3およびR4が一緒
    になって架橋して、好ましくは、少なくとも部分的に芳
    香族または複素芳香族構造を有する環系を形成する、請
    求項１３に記載の使用。
  15. 【請求項１５】 構造式(Va)および(Vb)の基において、
    （ａ）R3とR4、および／またはR3'とR4'が、あるいは
    （ｂ）R4とR5、および／またはR4'とR5'が、それぞれの
    場合において、一緒になって架橋し、好ましくは一緒に
    なって、少なくとも部分的に芳香族または複素芳香族構
    造を有する芳香族または複素芳香族環系を形成する、請
    求項１３に記載の使用。
  16. 【請求項１６】 それぞれの場合において、基が一緒に
    なって、場合により置換されているナフタレンまたはア
    ントラキノン環系を形成する、請求項１４または１５に
    記載の使用。
  17. 【請求項１７】 構造式（Ｉ）および／または（II）の
    化合物が金属錯体の形態で用いられる、請求項１〜１６
    のいずれか１つに記載の用途。
  18. 【請求項１８】 サンプル中の分析対象物質の測定方法
    であって、前記サンプルを、構造式（Ｉ）および／また
    は（II）の化合物を含有する試薬と接触させ、前記試薬
    の検出可能な特性の変化によって分析対象物質を測定す
    ることを特徴とする方法。
  19. 【請求項１９】 サンプル中の分析対象物質を測定する
    ための、少なくとも１種の構造式（Ｉ）および／または
    （II）の化合物を含有する試薬。
  20. 【請求項２０】 他の試験成分に加えて、請求項１９に
    記載の試薬を含有す試薬キット。
  21. 【請求項２１】 構造式（Ｉ）および／または（II）の
    化合物の分子特性を改変する付随する物質（accompanyi
    ng substance）を含有する、請求項２０に記載の試薬キ
    ット。
  22. 【請求項２２】 インダンスレンモノスルホン酸、イン
    ダンスレンジスルホン酸を除いた、少なくとも1種の親
    水性基を含有する構造式（Ｉ）または（II）の化合物、
    およびそれらのナトリウム塩またはカリウム塩： 【化４】 （式中、R1、R2、X、Ph、ｎおよびArは請求項１と同じ
    意味を表す）。
  23. 【請求項２３】 構造式（VIIa）または（VIIb）を有す
    る、請求項２２に記載の化合物： 【化５】 （式中、R1、R2、X、R'、ｍ、ｐ、R3、R4、YおよびY'
    は、請求項１と同じ意味を表す）。
  24. 【請求項２４】 構造式（VIIIa）または（VIIIb）を有
    する、請求項２３に記載の化合物： 【化６】 （式中、R1、R2、X、R'、ｍ、ｐ、R3、R4、R5、R3'、
    R4'およびR5'は、請求項１と同じ意味を表す）。
  25. 【請求項２５】 XがOを表す、請求項２２〜２４のい
    ずれか１つに記載の化合物。
  26. 【請求項２６】 R1およびR2の少なくとも１つが芳香族
    または複素芳香族環系を含有する、請求項２２〜２５の
    いずれか１つに記載の化合物。
  27. 【請求項２７】 R3およびR4の少なくとも1つが芳香族ま
    たは複素芳香族環系を含有する、請求項２３、２５およ
    び２６のいずれか１つに記載の化合物。
  28. 【請求項２８】 YおよびY'がそれぞれCR6（式中、R6は
    請求項１と同じ意味を表す）を表す、請求項２３、２５
    および２６のいずれか１つに記載の化合物。
  29. 【請求項２９】 R3、R4、R5、R3'、R4'およびR5'の少な
    くとも1つが芳香族または複素芳香族環系を含有する、
    請求項２４〜２６のいずれか１つに記載の化合物。
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