JPH09511392A

JPH09511392A - 高性能細胞培養バイオリアクターおよび方法

Info

Publication number: JPH09511392A
Application number: JP7521185A
Authority: JP
Inventors: ゴッフェ、ランダール・エー
Original assignee: ユニシン・テクノロジーズ・インコーポレーテッド
Priority date: 1994-02-09
Filing date: 1994-02-09
Publication date: 1997-11-18
Also published as: AU6765594A; WO1995021911A1; EP0743981A1; EP0743981A4; AU687059B2

Abstract

(57)【要約】同心円的中空氏束（２２，２３）を有する、高性能の中空繊維バイオリアクターが開示される。中央の中空繊維束（２３）は培養培地を供給する一方、外側の中空繊維束（２２）は細胞培養に必要な酸素を供給する。この高性能バイオリアクターの使用方法には、例えば、明細書中で説明した幹細胞のex vivo増殖が含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】高性能細胞培養バイオリアクターおよび方法〔発明の分野〕本発明は、中空繊維バイオリアクターに関する。さらに詳しくは、本発明は新規な高性能バイオリアクターおよびその利用方法に関する。〔発明の背景〕先行技術のバイオリアクターは、通常、一本のタイプの中空繊維を介して培地を灌流する。このようなバイオリアクターの様々な欠点には、細胞塊が不均一なこと、代表的細胞増殖サンプルの調達が困難なこと、酸素添加が不十分なため低性能であること、および酸素レベルをコントロールできないことなどが含まれる。さらに、ミクロ環境因子たとえばpHを効率的にコントロールできない。また、細胞の混合または同時培養が不可能である。定義明細書および請求の範囲において、次の用語は以下の意味を有する。 HPBr- 高性能バイオリアクター毛管外スペース（ESC）--中空繊維により占拠されないバイオリアクターカートリッジ内のスペース。毛管内スペース（ICS）--バイオリアクターにおける中空繊維の内腔により画成されるスペースの合計。 OXY-1--カリフォルニア州92680、タスチン、シュート 106、フランクリンアベニュー 14272のユニシンテクノロジー社（UniSyn Technologies Inc.，14272 Fr anklin Avenue，Suite 106，Tustin，California 92680）から入手可能である中空繊維酸素添加器。OXY-1バイオリアクターは、マット状に編まれた0.2 μm孔径のポリエチレン中空繊維を有する。ガス交換のための活性表面積は、1ft2である。 BR110--ユニシンテクノロジー社から市販されている小さな中空繊維バイオリアクター。BR110中空繊維の材質はセルロースであり、分子量カットオフ(MWc)は 10kDである。細胞増殖のための活性表面積は1.5ft2である。ミクロマウス(Micro Mouse)BR110--ユニシンテクノロジー社から市販されている、ガス交換のためのICSループに一定の長さのシリコーンチューブを有するBR1 10バイオリアクターを備えた滅菌使い捨てバイオリアクター装置。セル-ファーム(Cell Pharm)1000--ユニシンテクノロジー社から市販されている中空繊維バイオリアクター装置。セル-ファーム1000システムは、コントローラー、pHセンサ、ガス混合コントロール能力、培地貯蔵部、ヒーターおよび蠕動性ポンプおよびピンチバルブを含む。 MAb--モノクロナール抗体三菱酸素添加繊維--日本の三菱から入手可能な中空繊維の0.2 μm孔径ポリプロピレン一本ストランド。グルコース利用速度(GUR)−当該サンプルを取得する一日前のバッチ式供給システム中の栄養培地からグルコースが消費される速度(単位は、単位時間当たりの量、たとえばgm/日)。これは、以下のように導かれる： GUR＝Ｆ（Ｇｆ−Ｇ）＋Ｖ（G1−Ｇ），Ｇ＝（G1+G2）/２ここで、ＧｆはIC培地供給におけるグルコース濃度(すなわち、-4.1g/L); G1 は、当該サンプルを取得する前日のIC再循環培地におけるグルコース濃度（g/L ）；G2は、当該サンプル取得日IC再循環培地におけるグルコース濃度(g/L)；Ｆは、IC培地供給速度(L/日)；Vは、貯蔵部におけるIC培地の容量(L)である。乳酸塩生成速度(LPR)−グルコースを消費しながら、乳酸塩(またはむしろ乳酸 )が嫌気的に生成する速度。したがって、酸素は反応に関係することなく、グルコース一分子が乳酸塩二分子を作る。乳酸塩生成速度(LPR),g/日は、次のように定義される： LPR＝［Ｆ（Ｌ−Ｌｆ）＋Ｖ（Ｌ−L1）］x0.09，Ｌ＝（L1＋L2）/２ここで、Lfは毛管内(IC)培地における乳酸塩濃度(すなわち、0.1mM)であり；L1 は当該サンプルを取得した前日のIC再循環培地における乳酸塩濃度(mM)であり； L2はIC再循環培地における乳酸塩濃度(mM)である。〔発明の概要〕非効率的な酸素添加によって、中空繊維細胞培養装置の効率は集中的に制約されることがわかった。本発明は、先行技術の装置と比べて著しく向上した栄養培地への酸素添加を達成する、新規なバイオリアクターを提供するものである。本発明よれば、栄養培地は、酸素添加中空繊維の外側束で囲まれた、これと同軸の内部通路を介して供給される。内側培地通路は、一本の培地多孔性チューブまたは培地供給中空繊維の内部束により提供される。外側繊維束、すなわち酸素添加繊維束の外面は、細胞物質の混合、生成細胞のサンプリングまたは採取を容易にするために、バイオリアクターハウジングの内壁から離間されている。本発明の高性能バイオリアクターは特に、商業目的での生体分子の製造に使用される昆虫細胞のような、高度の酸素感受性細胞の増殖に適している。〔高性能バイオリアクターの構成〕本明細書のこの部分は、図1-10を参考にして、本発明を実施するバイオリアクターの構成について本発明者が現在知っている最も良い形態を記載する。〔図面の簡単な説明〕図１は、本発明のバイオリアクターの模式図である。図２は、図１で示すバイオリアクターの、実質的に同一である二つの端部の一方の断面図である。図３は、効率的および寸法合わせ可能な組立(scaleable fabrication)を可能にする、高性能バイオリアクターの中空繊維ハウジングおよび重要な部品を表している。図3Aは、図３の中空繊維ハウジングの側面図である。図４は、注封材料(potting compound)を用いた金型内での図３の組立を示す。図５は、金型から取り出した後のカートリッジの注封端部を示し、過剰の接着剤および繊維の除去のために、指示された二つのカットマークを有する。マスク成分は犠牲にされ、過剰の接着剤とともに除去されることは注意すべきである。中空繊維ガイドは、中空繊維ハウジングの端部シールの永久部品として接着剤中に埋め込まれたままである。図６は、バイオリアクターカートリッジの切断端部を示す。図７は、二重口ヘッダーを含む最終組立品であり、これは繊維の内部束へ培地を供給し、繊維の外側同軸環へ酸素含有ガスを供給するための手段を提供するものである。図８は、繊維ガイドの詳細な尺度図である。この部品は二つのタイプの繊維をまとめる手段を提供するもので、中心繊維束を、繊維の外部束のものとは別の口部へ封入することができる。図９は、犠牲となるマスクの詳細な尺度図であり、これは繊維ガイドの口部にわたって嵌合して、中心繊維束口部を封止するためのきれいな表面を提供する。図10は、繊維の中心束へ培地を供給し、これとは別に外側繊維へ酸素含有ガスを供給するための二重口ヘッダーの詳細な尺度図である。〔発明の詳細な説明〕図１を参照して説明すると、バイオリアクター10は、その導入端部および取出端部に、ほぼ同一のヘッダー12および13を備えたハウジング11を含んでいる。ヘッダー12および13は、酸素含有ガスおよび培地を導入し、取出すための口部14、 15、16および17を有する。図２は、内側培地供給繊維束23と同軸の、外側酸素添加繊維束22を示している。酸素添加束22の外周は、ハウジング11の内壁から間隔24をあけて離間されている。ヘッダー口部14および16は、酸素添加束22へ酸素含有ガスを導入し、また酸素含有ガスを取出すように適合されている。ヘッダー口部15および17は、栄養培地供給束22へ栄養培地を通過させ、またここから栄養培地を除去するように適合されている。生成細胞またはたんぱく質を、口部18,19,20または21を通してスペースからサンプリングおよび回収する。播種細胞を、口部18,19,20または21を通して導入することもできる。本発明を実施するバイオリアクターを組み立てる好ましい方法は、主要な６工程を含んでいる。これを図3-10を参照しながら説明する。１．必要な本数のストランドを有する繊維トウ(fiber tows)から、長さ43/4 インチの繊維束を作る。各束の端をテープで包み、これにより繊維をしっかり固定する。２．図３で示すように、繊維ガイド(10a)およびマスク(10b)を有するジャケット(10)を組み立てる。３．セルロース繊維束を、1800 RPMおよび52℃で20分間予備加熱および予備紡糸して、過剰のグリセリン加工助剤を除去する。セルロース繊維を、図3Aで示すジャケット組立品の各端部において、繊維ガイドの中心の孔へ注意深く挿入する。同様に、繊維ガイドの三つの側面の孔を通して、酸素添加繊維の三つの束を入れ、確実にこれらが緩く収容されるようにする。さらに、束を65℃で14-18時間乾燥する。４．温かいジャケット/束組立品を、図４で示すように注封金型に入れて束の固定していない端部を包む。この組立品を、アプリケーターにおいて予め混合したポリウレタン樹脂とともに、遠心分離機へ入れる。組立品全体を、1500RPM にて50-60分間、38-45℃にて回転する。樹脂を、口部18および20、または19および21のいずれかを介してジャケット組立品(10)へ入れる。５．図５に示す二本の切断線に沿って、ジャケット/束組立品の注封した端部で温かい硬化樹脂を切断する。マスク(図３における10b)に沿って切断片を除去し、繊維ガイド(図３に示す10a)の清潔な表面を暴露する。この表面はヘッダーを止めるのに関係する。６．ヘッダーは、マスクを除去することにより暴露する清潔な表面およびジャケット(10)の外側リムへ、ポリウレタン樹脂を施した後に取り付けられる。室温で24時間硬化を行う。培地供給繊維タイプ中空繊維は、本発明の範囲内であるチューブ状製品の特定の群に対応する。したがって、外側で増殖する細胞への栄養培地の灌流を可能にしつつ、再循環(ICS )ループへ組み込まれることのできる何れかの多孔性チューブまたは繊維も、本発明に含まれる。以下は、本発明に使用するのに好ましいチューブまたは繊維の例である：（i）透析、限外濾過およびミクロ濾過特性を有する中空繊維およびチューブ、すなわち(a)分子量カットオフ(MWc)が1kDから1,000kD；および(b)孔径範囲が0 .01μm-5.0μmのもの。最も好ましい範囲は、10 kD MWcおよび約１μmまでの孔径である。（ii）構造物の材料には、ポリマー、グラファイト、セラミック（多孔性ガラスファイバーを含む）および金属(たとえば、ステンレススチール)が含まれる。一般的には、ポリマーには良好な物理的特性(たとえば、引っ張り強度、溶融温度およびガラス転移温度)を有することが要求される。これらにはセルロース、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスルホン(および他の機械工業用熱可塑性樹脂)、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、様々なポリマーブレンド等が含まれる。特に好ましい培地供給繊維は、10-1,000kDのMWcおよび孔径0.01-1.0μmのセルロースポリマーから得たものである。酸素添加繊維タイプ中空繊維は、本発明における酸素添加のために選択されるただひとつの環形状物である。これらの中空繊維は、多孔性または非多孔性の何れであってもよい。酸素添加のための多孔性中空繊維は、代表的には疎水性(ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン(テフロン)等)である。非多孔性中空繊維の例(これらに限定するものではないが)には、シリコーンおよびシリコーンコポリマーチューブが含まれる。これらは、典型的には中実(solid)の壁構造体を通過する高いガス透過性を有する。多孔性の疎水性中空繊維は、孔径が0.01-0.5μmの範囲である場合に、ガス交換に関して最も効果的である。最適には、孔径は0.1-0.2 μmの範囲である。特に好ましい酸素添加繊維はポリプロピレンから作られ、孔径は0.15μmである。操作の検討 HPBrは、バイオリアクタージャケットの中心に位置する中空繊維束または他の環状構造体の内腔(またはICS)を介して、栄養培地を再循環する手段を備えている。これらの中空繊維またはチューブは、その透過性について選択され、また場合によってはその表面特性(たとえば、親水性または疎水性)について選択される。これら構造体の多孔性壁を通って灌流された培地は、ECS内に播種した細胞を浸す。 O₂/CO₂ガス混合物を、中心に配置した中空繊維またはチューブと同軸に位置する内腔チューブまたは中空繊維の束を介して、HPBrへ供給する。ガス混合物は、培地の流れと反対に流れる。一つの重要な操作パラメーターは、酸素添加繊維におけるガス圧である。最適圧力は使用する繊維のストランドの数、およびECS中を灌流する培地の圧力の関数である。たとえば、180本の三菱製ポリプロピレン繊維を有する実施例で記載されているバイオリアクターの実施態様は、泡立ち点 >2.5-3 psiを示した。540本の酸素添加繊維を有するHPBrについては、泡立ち点は約２psiに近かった。細胞の塊が増加し、細胞が繊維に直接付着するにつれて、泡立ち点は増加する傾向になるであろう。表１は、例IIで記載したHPBrの二つのタイプ(すなわち、タイプＩおよびII)について、酸素添加繊維の数と培地繊維の数との間の関係を示す。比較のために、さらに別の二つのHPBr構造(タイプIIIおよびIV)、およびOXY-1/BR110の組み合わせが含まれている。その数字は、酸素添加繊維表面積の培地繊維表面積に対する比が増加すると、酸素添加効率もまた細胞培養に利用可能な毛管外スペースを犠牲にして増加することを示す。 HBRタイプIVは、本発明に含まれるさらに極端な例であり、ここでは環状細胞培養スペースは従来のBR110バイオリアクターの範囲内である。ECS11.8mlは、BR 110またはOXY-1について、約70%（最大）繊維充填密度から予測される範囲内である(全く繊維が存在しない注封ジャケットにおける最大スペースは約22mLである)。実施例IIに記載されている態様について、酸素添加繊維/培地繊維の表面積比の範囲は、0.03から5.5の間である。好ましい範囲は0.7から2.6の間である。このデータが示すように、本発明は、その中で細胞が培養され、そして比較的少数の多孔性中空繊維または大きな多孔性チューブ（たとえばグラファイトチューブ）により培地が供給される、酸素添加装置に関する。ガス組成は、ECSで作られる細胞増殖のためのミクロ環境において、酸素添加の効率性ならびにpHを定めるのに重要である。pHの効果を示す実証的データを実施例IIに示す。本発明は、pHを、これまで可能であったよりも正確に、必要な最適範囲にモニターしコントロールすることができる。バイオリアクターにおいて、外側の大部分の酸素添加繊維とジャケットの内壁との間に、環状スペースを準備する。このスペースは、細胞塊を含むために特別に設計された、ECSの一部分である。この培養スペースは、バイオリアクターを( 最適に)定期的に前後に（120°まで）回転させる場合に、混合を促進する。さらに、これにより生成物(特に、たとえば細胞治療用のための完全な生存細胞のサンプリングおよび回収が容易になる。このスペースはまた、固定化依存性(ancho rage dependent)細胞のための微粒子担体を、HPBrに含ませることを可能にする。このことが重要である特定の場合としては、細胞治療用の造血幹細胞の培養が挙げられる。幹細胞は、固定化依存性間質細胞(内皮細胞を含む)が存在するとより良好に増殖する。しかしながら、幹細胞は固定化非依存性である。それゆえ、微粒子担体に固定された間質細胞は幹細胞と同時培養することができる。したがって、このようにして作られたミクロ環境は、幹細胞の長期にわたる生体外増殖(ex-vi vo expansion)という従来実現されなかった目的を促進するであろう。この細胞培養スペースによって、細胞の高収率および生存性が達成される。最後に、様々な細胞タイプの増殖および分化に重要な、高価な増殖因子およびサイトキンを比較的少量添加することにより、さらにミクロ環境に適合させるようにすることができる。本発明の重要で新しい特徴には、夫々独立または組み合わせた状態で、次のものが含まれる。即ち、一つのジャケットにおけるガス供給繊維vs培地供給繊維の比較的高い比率；ガスの組成、圧力および流速による、酸素添加およびpHのコントロール；大きな細胞塊を増殖するため、並びに微粒子担体を含むための毛管外スペースを提供するための、比較的低い繊維充填密度；多孔性チューブまたは中空繊維を使用して培地を供給し、また多孔性または非多孔性中空繊維を同軸上に配置して酸素添加ガスを供給する。異なった材料から作られた二つの異なったタイプの中空繊維を使用する。これは本発明の実施例により提示される。一つのタイプの繊維(たとえば微孔性ポリプロピレン)は、それぞれの束における培地灌流およびガス交換が圧力を調節することにより達成され、コントロールされる場合に利用される。固定化非依存性細胞が非常に高密度で培養される場合の適用では、細胞が繊維上ではなく、主に懸濁液中で増殖するので、疎水性繊維が好ましい。培地供給が、一本の多孔性チューブまたは一つの中空繊維束により与えられるようにしてもよい。中空繊維またはチューブ表面へコーティングを施すと、細胞の付着に影響を及ぼす(陽性または陰性のいずれか)。たとえば、バイオリアクター繊維上にインビボ被覆された、細胞間の結合組織に見られる細胞マトリックス分子は、内皮細胞およびチャイニーズハムスター(CHO)細胞のような固定化依存性細胞の付着を促進する。活性アミノ酸配列［アルギニン-グリシン-アスパラギン酸］を含む他の分子、いわゆるマトリックス分子に見られる″RGD″もまた、この利点を提供する。HPBr表面に塗布された細胞マトリックス分子は、造血幹細胞への効率的遺伝子導入を導くミクロ環境を促進する。固定化依存性細胞のための表面積の追加は、ECSにおける培養スペースへ微粒子担体を導入することにより達成される。異なった細胞種(たとえば幹細胞と間質細胞)を同時培養して、相乗的利益を得ることができる。 ECS(またはICS)への酸素担体(特にヘモグロビンおよびペルフルオロ化学品エマルジョン)の添加によって、細胞への酸素供給を正確にコントロールし、かつ細胞塊を迅速に増殖させる能力は著しく向上する。実施例Ｉ 15日間の細胞培養実験二回を、ユニシンセルファーム1000中型バイオリアクターシステムにおいて、IgG1モノクロナール抗体を分泌する3C11ハイブリドーマ細胞系を用いて実施した。実験１において、三つのユニシンBR110バイオリアクターカートリッジ(1.5ft²セルロース中空繊維)には、酸素マストランスファーのためにユニシンOXY-1酸素添加器(1ft²,0.2 μm孔径ポリエチレン酸素添加繊維)を装備した。実験２において、三個の高性能バイオリアクター(HPBr)の同じ大きさのカートリッジ（#1、#2および#3）を、3C11細胞培養におけるHPBrの能力を評価するために設けた。これらのHPBrは全て、450本のセルロース中空繊維(10kD M.W .カット-オフ)を有するが、#1および#2は異なった量の酸素添加繊維(マット形状、OXY-1において使用のように)を有し：また、#3は504本のポリエチレン酸素添加繊維を有していた。図11は、実験１で使用した、一つのOXY-1カートリッジを有する三個のBR110カートリッジについての流路模式図である。培地再循環速度は、培地再循環蠕動性ポンプのRPMを設定することにより確定された。CO₂および空気を含む混合ガスを、ガス蠕動性ポンプを用いることにより、向流酸素添加器を通して、バイオリアクターのICSループ中で再循環している培地へ導入した。pHの検量線作成および温度プローブを、操作マニュアルにしたがって行った。ICS培地のpHを7.0〜7.4 の範囲にコントロールするために、セルファーム1000のコントロールユニットによって、混合ガス中のCO₂比率を自動的に調節した。また、このコントロールユニットは、一定温度37℃に維持した。図12は、実験２における三個のHP Brカートリッジについての流路模式図である。実験２に関連するICS培地流路については何の変更もない。しかしながら、ガス流路の変更が計画された。これには、混合ガスの供給ラインを三個のHPBrおよび培地貯蔵部の両方に連結することが含まれる。現行のセルファーム1000のこの大まかな変更は、ガスの流れおよび逆圧の最適コントロールをもたらさないことは注意すべきである。ガスの供給ラインをICS再循環培地貯蔵部と繋ぐと、セルファーム1000システムコントローラーによるpHコントロールが容易になる。すべてのチューブ、フィルター、プローブおよび貯蔵部、新規瓶および廃棄瓶を含む全流路を、液状サイクルにおいて30分間120℃でオートクレーブした。最終的な組立品には、バイオリアクターカートリッジをセルファーム1000システムへ組み込むことが含まれる。汚染度チェックおよびシステムフラッシュを24時間行うようにセットして、滅菌、グリセリンの除去(セルロース繊維のための加工助剤)を確実に行い、システムの安定性に配慮する。培地条件： (i)ICS--５%牛胎児血清（FBS）＋１%ペニシリン/ストレプトマイシン＋２% グルタミン、DMEM 1000 mL中 (ii)ECS--20% FBS＋１%ペニシリン/ストレプトマイシン＋２%グルタミン、D MEM 1000 mL中 BR110およびHPBrを含む各バイオリアクターカートリッジに、18ゲージ針を付けた二本の滅菌した10mLシリンジを用いて、ECSへ同じ3x10⁸個の細胞(90%以上生存)を播種した。一つのシリンジは、5mL ECS培地および細胞を含んでいる。第二のシリンジは空で、播種の間に置換された培地を集めるのに使用する。生成物を播種方法と同様の方法で採取した。採取は、一般的には一週間に三回、各々10mLずつ行い、このセルファーム1000システムについての標準的操作手段を細胞培養を維持するために毎日続けた。細胞培養システムにおける方法パラメーターは、グルコース吸収、乳酸塩製造、NH3製造、MAb製造およびICS培地の灌流速度をモニターするように設定された。与えられたいずれかの時点で、中空繊維バイオリアクターに存在する細胞塊を直接判定することはできないので、MAb製造を、実験１および２における二つのタイプのバイオリアクター中での酸素マストランスファーの効果を測定するための手段とみなしてもよい。採取物におけるMAb濃度は放射状免疫拡散分析(radial i mmunodiffusion assay)により分析され、バイオリアクターのICSからサンプルとして取り出したグルコース、乳酸塩およびNH3は、コダック社のエクタケムアナライザー(Kodak Ektachem Analyzer)を用いて分析された。灌流速度は、新規瓶の培地レベルを測定することにより決定された。初期灌流速度は240mL/日であり、実験が終了するまでに、グルコース濃度(これが1.5 g/L程度に低くなるまで) または乳酸塩濃度(これが20mM程度に達するまで)の何れかにしたがって、最大10 00ml/日まで段階的に増やした。 3C11細胞について、各HPBrカートリッジ(実験2)における累積的MAb生産を、図 13における各BR110(実験1)のものと比較する。乳酸塩製造速度のグルコース消費速度に対する比は、酸素マストランスファーの効果を評価する指標として開発された。この比は、実験１に比べると実験２において著しく低かった(図4で示される)。これらの結果は、HPBrカートリッジにおける酸素添加繊維が、増殖細胞に対する酸素マストランスファーの抵抗減少を補助することを示している。特に、ポリエチレン酸素添加繊維を有する他の二つのHPBrにおけるものよりより高いMA b製造レベルを与える、三菱製の酸素添加繊維を有するHPBrカートリッジについて該当する。ECSにおける比較的高濃度に溶解した酸素濃度により、細胞はより効率的に増殖するものと思われる。実施例II 25日間の細胞培養実験(実験1)を、IgG1モノクロナール抗体を分泌する3C11ハイブリドーマ細胞系で行なった。試験システムは、コントロールされた条件下で、三個のHPBrカートリッジの性能を評価するように設計された。対照として、実験２では、ユニシンOXY-1酸素添加器を有するユニシンミクロマウスBR110小型バイオリアクターを使用した。実験３は、拡散による酸素マストランスファーのためのシリコーンチューブを有する、ユニシンミクロマウスBR110小型バイオリアクターからなるものである。実験１で使用した試験システムは、手動で調節される培地流路およびガス流速および圧力で、HPBrを動作させるように設定されたものである（図14参照）。三個のポンプヘッドを有する蠕動ポンプ組立品を使用して、100mL/分の流速で、各 HPBrを介して同じ培地再循環を与える。各HPBrのECSにおける温度は、サーモスタットで温度をコントロールした再循環水浴中に三個の培地貯蔵部を浸漬することにより、37℃にコントロールされた。ICS培地のpHは、空気75%〜85%中のCO₂で貯蔵部における培地の上部スペースを曝気することにより、7.00-7.30の範囲にコントロールされた。この混合ガスはまた、38mL(標準)/分の一定流速および逆圧1.5psiで、三個のHPBrカートリッジへガスを供給するためにも使用された。三個のHPBrカートリッジの各々は、灌流により細胞へ培地を供給するために、 450本のセルロース中空繊維を有していた。HPBr#1および#2は両方とも、180本の三菱製の酸素添加繊維を有した。HPBr #3における三菱製酸素添加繊維の数は、# 1および#2のものより三倍ほど多かった。実験１については、汚染度チェックおよびシステムフラッシュを、ミクロマウス操作マニュアルに見られる手引き書に従って実施した。実験２は、一定温度(37℃)を維持するために、オーブン中で組み立てられた。予め混合した空気およびCO₂を、BR110バイオリアクターのICSにおけるループ再循環培地の方向とは反対方向で、約70mL(標準)/分の速度でOXY-1酸素添加器に通した。pHを7.0−7.4の範囲にコントロールするために、CO₂の空気に対する比を、二つのガスフローメーターにおけるバルブを用いて調節した。実験３は、一定の温度(37℃)を維持するためのCO₂インキュベータ中で行われ、またインキュベーター中ガス比をCO₂7%および空気93%に設定することにより、 IC培地中の一定のpH(7.0-7.2)が確立された。培地条件：（i）ICS--５% FBS＋１%ペニシリン/ストレプトマイシン＋２%グルタミン、 DMEM 1000 mL中（ii）ECS--20% FBS＋１%ペニシリン/ストレプトマイシン＋２%グルタミン、 DMEM 1000 mL中 18ゲージ針を付けた二本の滅菌した10mLシリンジを用いて、ECSへ3x10⁸個の細胞(91%生存)を播種した。一つのシリンジは、5mL ES培地および細胞を含んでいる。第二のシリンジは空で、播種の間に置換された培地を集めるのに使用した。実験２および３の両方において、上記で説明した方法を用いて、ECSに4x10⁸ 個の細胞(95%生存)を播種した。実験２および３についての標準的操作方法が、細胞培養を毎日維持するために続けられた。実験１については、逆圧およびガス流速を毎日調節し、各ICS培地からサンプリングし、そして各カートリッジのECS からの回収を行った。細胞培養システムにおける方法パラメーターは、グルコース摂取、乳酸塩およびNH₃の生成、並びにMAb生成をモニターするように設定された。累積MAb生成をモニターして、実験1-3において例示した異なった酸素マストランスファー方法の効果を測定した。バイオリアクター用のICS培地は、グルコース濃度が2.0g/L未満に落ちたか、或いは乳酸塩濃度が20mM以上になったときに、新しい培地と置換された。実験２および３については、バイオリアクターのECSからのMAbの採取は、(ミクロマウスプロトコールにより定められているように)一週間に三回および各々につき10m Lの量で行った。MAb生成は放射状免疫拡散分析により分析され、HPBrのECSの採取物におけるグルコース、乳酸塩およびNH₃濃度もまた分析された。HPBrのICSおよびECSに見られるこれら細胞代謝物のレベル間の差を記録した。図15は、各HPBrカートリッジおよび実験２および３で生成された累積IgG1を示している。HPBr #3は、HPBr#1および#2と比較して、MAb生成に優れていることがわかった。HPBrを実験２および３におけるBR110バイオリアクターと比較したときにも、同様な結論が導き出された。これは、HPBrにおける酸素添加繊維の増加によって酸素供給が増加したために、細胞増殖およびMAb生成を著しく向上できることを示唆する。また、LPRのGURに対する比がHPBr#3について計算され、他のバイオリアクターよりもかなり低いことがわかった。これは、ECS中の増加した酸素の存在下では、グルコースがより一層効果的に利用されることを示す。図16は、様々なバイオリアクターについて、乳酸塩/グルコース比を比較している。最も低い比はHPBr装置により示され、これらの低い値は、長期にわたる細胞培養実験についての通常のバイオリアクターおよび酸素添加方法のものよりも低いままである。理想的には、この比は、細胞培養実験を通して出来るかぎり０に近くなければならず、これはグルコースの最適代謝利用を示す。表２は、バイオリアクターおよび酸素添加器の特性の比較である。これにはまた、これらの物理的特性の機能としての、バイオリアクター/酸素添加器の組み合わせの相対的抗体産生能を含む。この実施態様において、酸素添加繊維の数( または表面積)が増加し、また酸素添加器の培地繊維表面積に対する比が増加するにつれて、バイオリアクターの生産性もまた向上する。図17は、HPBrで達成可能なpHコントロールのレベルを示している。表示された特定のデータは、HPBr #3のものである。pHコントロールは、MAb生成に対するバイオマス生成を調節する。低pH、たとえば7.0は、細胞を指数関数的に増殖する層に維持して、高いバイオマスを作ることを助長する傾向にある。高pH、たとえば7.4は、細胞を安定な状態層に保ち、それゆえ高い生産性を示すことを助長する傾向にある。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年２月２６日【補正内容】請求の範囲１．バイオリアクターであって：（ａ）実質的に管状の細胞培養チャンバ（該チャンバは、第一および第二の端部、長手軸および前記チャンバへのアクセスを与えるポートを有する）を限定する内壁を備えたハウジングと；（ｂ）前記チャンバの長手軸を取り囲む中央の多孔性中空繊維束（該中央束の各繊維はそれぞれ入口端および出口端を有し、これらの入口端は軸方向に演出した共通の液体入口ポートと流体流通している）と；（ｃ）前記中央束と同心円的に且つこれを取り囲んで配置された、ガス透過性中空繊維の環状束であって、前記環状束の各ガス透過性繊維はそれぞれ出口端および入口端を有し、これらの出口端は軸方向に延出した液体入口ポートを取り囲む共通の環状スペースと流体流通しており、ガス出口ポートは共通の環状スペースと流体流通しているガス透過性中空繊維の環状束；とを具備したバイオリアクター。２．請求項１に記載のバイオリアクターであって、細胞が異様のための環状スペースを与えるために、前記環状束が前記細胞培養チャンバの内壁から離間しており、前記環状スペース内の液体の混合を容易にするために、前記バイオリアクターはその軸の周りで回転することができるバイオリアクター。３．請求項２に記載のバイオリアクターであって、更に、前記細胞培養のための環状スペース内に複数の微小担体を具備しているバイオリアクター。４．請求項１に記載のバイオリアクターであって、前記多孔性中空繊維の表面積に対する前記ガス透過性中空繊維の表面積の比が、約0.03〜約5.5であるバイオリアクター。５．請求項１に記載のバイオリアクターであって、多孔性中空繊維の中央束が、約７０％の充填密度で設けられているバイオリアクター。６．請求項１に記載のバイオリアクターであって、前記ガス透過性中空繊維の環状束が、約0.01〜約0.5ミクロンの孔径を有する疎水性繊維からなるバイオリアクター。７．請求項１に記載のバイオリアクターであって、前記中央束の多孔性中空繊維が、１０ｋＤ〜1000ｋＤの範囲の分子量を有するセルロースポリマーからなるバイオリアクター。８．請求項７に記載のバイオリアクターであって、前記中空繊維が、約0.01 〜1.0ミクロンの孔径を有するバイオリアクター。９．請求項１に記載のバイオリアクターであって、毛管外スペースが、該バイオリアクターの内部容積の５５〜９０容量％であるバイオリアクター。１０．バイオリアクターであって：（ａ）実質的に管状の細胞培養チャンバ（該チャンバは、第一および第二の端部、長手軸および前記チャンバへのアクセスを与えるポートを有する）を限定する内壁を備えたハウジングと；（ｂ）前記チャンバの長手軸を取り囲む多孔性中空繊維からなる中央束と；（ｃ）前記中央束と同心円的に且つこれを取り囲んで配置された、ガス透過性中空繊維の環状束であって、バイオリアクターが前記長手軸の周りに回転するときに細胞培養および混合のための環状スペースを限定するように、前記環状束の最も外側の繊維は前記内壁から離間している環状束と；（ｄ）前記第一および第二の端部に設けられた、前記多孔性中空繊維を通して栄養培地を通過させるための手段と；（ｅ）前記第一および第二の端部に設けられた、前記ガス透過性中空繊維を通して酸素含有ガスを通過させるための手段；とを具備したバイオリアクター。１１．請求項１０に記載のバイオリアクターであって、更に、前記細胞培養のための環状スペース内に複数の微小担体を具備しているバイオリアクター。１２．請求項１０に記載のバイオリアクターであって、前記多孔性中空繊維の表面積に対する前記ガス透過性中空繊維の表面積の比が、約0.03〜約5.5であるバイオリアクター。１３．請求項１０に記載のバイオリアクターであって、多孔性中空繊維の中央束が、約７０％の充填密度で設けられているバイオリアクター。１４．請求項１０に記載のバイオリアクターであって、前記ガス透過性中空繊維の環状束が、約0.01〜約0.5ミクロンの孔径を有する疎水性繊維からなるバイオリアクター。１５．請求項１０に記載のバイオリアクターであって、前記中央束の多孔性中空繊維が、１０ｋＤ〜1000ｋＤの範囲の分子量を有するセルロースポリマーからなるバイオリアクター。１６．請求項１５に記載のバイオリアクターであって、前記中空繊維が、約 0.01〜1.0ミクロンの孔径を有するバイオリアクター。１７．請求項１０に記載のバイオリアクターであって、毛管外スペースが、該バイオリアクターの内部容積の５５〜９０容量％であるバイオリアクター。

Claims

【特許請求の範囲】１．中空繊維バイオリアクターであって：導入端部、取出端部、前記導入端部に隣接する第一の口部および前記取出端部に隣接する第二の口部を有するハウジングと；前記ハウジング内に栄養培地を供給するための、第一の多孔性中空繊維の内部束と；前記第一の中空繊維束と同軸上にあり、かつ前記ハウジングの内壁から離間して設けられた、前記ハウジング内に酸素含有ガスを供給するための第二の中空繊維の外部束と；前記ハウジングの導入端部のための導入ヘッダーと；前記ハウジングの取出端部のための取出ヘッダーとを具備し；前記導入ヘッダーは、前記第一の中空繊維の内部束へ栄養培地を導入するための第一の口部および前記第二の中空繊維の外部束へ酸素を導入するための別の第二の口部を有し、前記取出ヘッダーは、前記第一の中空繊維の内部束から培地を除去するための第一の口部および前記第二の中空繊維の外部束から酸素含有ガスを除去するための第二の口部を有するバイオリアクター。２．前記第一の多孔性中空繊維の内部束が、分子量カットオフ1kD−1,000kDおよび孔径0.01μm-5.0μmを有する請求項１の中空繊維バイオリアクター。３．前記第一の多孔性中空繊維の内部束がセルロース、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスルホン、ポリメチルメタクリレートまたはポリアクリロニトリル繊維からなる請求項１または２の中空繊維バイオリアクター。４．前記第二の中空繊維外部束が、孔径0.01μm-0.5μmのポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリテトラフルオロエチレンからなる多孔性疎水性繊維である請求項１の中空繊維バイオリアクター。５．前記第二の中空繊維外部束が、非多孔性でガス透過性のシリコーンまたはシリコーンコポリマー繊維からなる請求項１の中空繊維バイオリアクター。６．前記第二の中空繊維外部束表面積の前記第一の中空繊維内部束表面積に対する比が0.03−5.5である請求項１の中空繊維バイオリアクター。７．細胞マトリックスまたはアミノ酸配列（アルギニン-グリシン-アスパラギン酸）を含む合成分子が、ハウジング内における利用可能な表面を被覆する請求項６の中空繊維バイオリアクター。８．二酸化炭素および酸素添加ガスの組み合わせを使用して、毛管外スペースにおけるpHおよび酸素レベルをコントロールする請求項６の中空繊維バイオリアクター。９．毛管外スペースまたは毛管内スペースに酸素担体を含む請求項６の中空繊維バイオリアクター。 10．ヘモグロビンまたはペルフルオロ化学品エマルジョンが毛管外スペースまたは毛管内スペースに存在する請求項６の中空繊維バイオリアクター。 11．昆虫細胞の培養のための請求項６の中空繊維バイオリアクター。 12．中空繊維の前記第二の束の外表面および前記ハウジングの内壁の間の前記スペースにおける固定化依存性細胞のための微粒子担体をさらに具備する請求項１の中空繊維バイオリアクター。 13．造血幹細胞と同時培養するために、間質細胞が前記微粒子担体に固定されている請求項12の中空繊維バイオリアクター。 14．ハウジングと、前記ハウジング内のガス透過性中空繊維の環状束と、前記中空繊維の環状束を通る内腔と、酸素含有ガスを前記環状束の前記中空繊維に通す手段と、前記中空繊維の環状束を通る前記内腔に栄養培地を通す手段、とを具備するバイオリアクター。 15．請求項14のバイオリアクターであって、さらに、前記中空繊維の環状束を通る前記内腔内に位置する多孔性チューブを具備するのバイオリアクター。 16．請求項14のバイオリアクターであって、前記ハウジング内に栄養培地を供給するための、前記内腔内に位置する多孔性中空繊維の束をさらに具備するバイオリアクター。 17．幹細胞の生体外増殖方法であって：間質細胞が固定されている微粒子担体を含んだ毛管外スペースを有する中空繊維バイオリアクターを提供することと、前記バイオリアクターにおいて幹細胞および前記間質細胞を同時に培養することからなる幹細胞の生体外増殖方法。