JPH09505461A - DNA virus ribozyme - Google Patents

DNA virus ribozyme

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JPH09505461A JP7504865A JP50486595A JPH09505461A JP H09505461 A JPH09505461 A JP H09505461A JP 7504865 A JP7504865 A JP 7504865A JP 50486595 A JP50486595 A JP 50486595A JP H09505461 A JPH09505461 A JP H09505461A
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レニー，フィリップ
グルーブ，ベロニーク
ボーディノ，シルビー
メイソン，ジョン
コミュー，デビッド
アリ レザラン，モハマッド
バリー ドライ，イアン
エリス リグデン，ジャスティン
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ジーン シェアーズ プロプライアタリー リミティド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ハイブリダイズ領域及び触媒領域を含んで成るリボザイムであって、ここで前記ハイブリダイズ領域は植物細胞に感染できる DNAウィルスに結合した DNA分子から転写された標的mRNAの少なくとも一部にハイブリダイズでき、ここで前記触媒領域は前記標的mRNAを解裂でき、これにより前記 DNAウィルスの複製、感染及び／又は集成を実質的に抑制できるようなリボザイムに関する。 (57) [Summary] The present invention provides a ribozyme comprising a hybridizing region and a catalytic region, wherein the hybridizing region is a target mRNA transcribed from a DNA molecule bound to a DNA virus capable of infecting plant cells. Of the ribozyme, wherein the catalytic region is capable of cleaving the target mRNA, thereby substantially suppressing replication, infection and / or assembly of the DNA virus.

Description

【発明の詳細な説明】 DNAウィルスリボザイム 本発明はウィルス特異的mRNAの解裂を触媒することのできる合成リボザイム及 びその突然変異体並びに誘導体に関し、そしてより詳しくは、 DNAウィルス特異 的mRNAに関する。本発明は更に遺伝子導入細胞の作製におけるこのようなリボザ イムの利用、そして特に、これらのウィルスによる感染を阻害することのできる 遺伝子導入植物細胞及び植物に関する。 ウィルスはヒト、動物及び植物の数多くの重症及び潜在的に重症な病気の原因 因子である。植物ウィルスは特に穀類農産物を破壊又は減少させる能力を有し、 あるいは農業及び園芸産業に経済的に有意義なレベルで有害な影響を及ぼす。 これに関して特に重要視されているウィルスは DNAウィルス、例えばカウリモ ウィルス(Caulimoviruse)及びジェミニウィルス(Geminviruse)、並びに２種類の 非分類化ウィルス、即ち、サブテラニアン・クローバー・スタント・ウイルス(S ubterranean Clover Stunt Virus)（SCSV，Shu and helms，Virology，1986，16 7，38-49）及びココナッツ・フォリアー・デケイ・ウィルス(Coconut Foliar De cay Virus）(CFDV，Rohde ら、Virology，1990，176，648-51)である。ジェミニ ウィルスは小型ウィルスの群であり、これは植物細胞に感染する。これらは約29 00塩基対以下の「ビリオン・センス」又は「ポジティブ・センス」 DNAと呼ばれ る一本鎖環状 DNAを含む。ジェミニウィルスによる宿主細胞の感染により、ウィ ルスコートタンパク質は除去され、そしてビリオン・センスストランド及び「相 補性・センス」ストランドを含んで成る二本鎖の DNA複製形態が 合成される。転写は、ビリオン・センスストランド及び「相補性・センス」スト ランドの両者から起こり、（＋）及び（−）センス RNA転写体のそれぞれが出来 き上がる。 ジェミニウィルスの例には、メイズ・ストリーク・ウィルス(MSV)、ビーン・ ゴールデン・モザイクウィルス（BGMV）、アフリカン・カッサバ・モザイクウィ ルス（ACMV）、クロリス・ストリエート・モザイクウィルス(Chloris Striate M osaic Virus：CSMV)、トマト・イエロー・リーフ・カール・ウィルス(TYLCV)、 トマト・ゴールデン・モザイクウィルス（TGMV）、ビート・カーリー・トップ・ ウィルス（BCTV）及びトマト・リーフ・カール・ウィルス（TLCV）がとりわけ含 まれる（以降の表１に記載のウィルスも参照のこと）。これらのウィルスは、葉 のカーリング及びその他の葉の変形を含む、栽培植物における経済的に重要視さ れている病気の原因となる。特にTLCVはオーストラリアの北部においてひどい作 物ダメージを引き起こし、そして感染植物は中東及びヨーロッパにおける TYLCV により起こるものと似たような症状を示す。便宜上、そして何らかのことわりの ない限り、TLCV及び TYLCVは同義語として利用し、そしてTLCVのイスラエル及び サルジニア単離体についての本明細書での言及は TYLCV単離体と解されるべきで ある。一般に、「TLCV」はオーストラリア「単離体」を意味する。 ジェミニウィルスは感染細胞の核の中で複製し、そして一本鎖 DNA含有コリフ ァージ(例えばQX174)並びに一定のスタフィロコッカス・アウレウス（Staphyloc occus aureus ）及びバチルス・スブチリス（Bacillus subtilis ）プラスミド により利用されるものと類似のローリング・サークル機構を利用するものと考え られる。他の公知の植物ウィルス、例えばその他の植物 DNAウィルスは RNA中間 体を介して複製する。 ジェミニウィルス粒子は感染細胞の核の中にたまり、そこでおそらく DNA複製 及びウィルス集成が行われる(Davies ら、J．Cell．Sci（Suppl）（1987）７：9 5-107)。その推定複製形態はクロマチン様構造をとる約 2.7kbの二本鎖の共有閉 環環状 DNAであり、そして転写活性ウィルス形態のようである(Abouzid ら、Mol ．Gen．Genet．（1988）212：252-258)。宿主域及び昆虫ベクターに基づき、こ れらは通常３つのサブグループに分けられる。即ち、双子葉類ホストに感染し、 ２分節系ゲノムを有し、そしてシロアリ(white-fly)ベクター、ベミシア・タバ チ（Bemisia tabaci）（Genn.）により伝染するウィルス（ACMV，アリカン・カ ッサバ・モザイクウィルス（ Stanley and Gay，Nature（1983）301：260）；TG MV 、トマト・コールデン・モザイクウィルス（HamiHon ら、EMBO J．（1984） ３：2197）；BGMV 、ビーン・ゴールデン・モザイクウィルス(Horwarth ら、PNA S（1985）82：3512）；１分節系ゲノムを有し、イネ科のホストに感染し、そし てリーフホッパーベクターにより伝染するもの(MSV、メイズ・ストリーク・ウィ ルス（Nigeria 株、Mullinauxら EMBO J．（1984）３：3063；ケニヤ（Kenyan ）株、Havel NAR（1984）12 :7359）；DSV、ディジタリアン・ストリーク・ウィ ルス（Donson ら、Virology（1987）161：160）；WDV、ホイート・ドゥウォー フ・ウィルス（Mac Dowell ら EMBO J．（1985）４：2173)）；そして１分節系 ゲノムを有し、そしてリーフホッパにより伝染されるもの（BCTV、ビート・カー リー・トップ・ウィルス（Stanley ら、EMBO J．（1986）５：1761）；ToYDV、 タバコ・イエロー・ドゥウォーフ・ウィルス（Maris ら、Virology（1992）187 ：633)）又はシロアリにより伝染されるもの(TYLCV、トマト・イエロー・リーフ ・カール・ウィルス(イスラエル単離体、Navet ら、Virology（1991）185：151 ；サルジアン単離体、Kheyr-Pour ら NAT（1 991）19：6763)，TLCV 、トマト・リーフ・カール・ウィルス(オーストラリア単 離体、Dry ら J．Gen．Virol．（1993）74：147)）。 植物 DNAウィルス、特にジェミニウィルスの経済的重要性により、病気耐性手 法についての要望が生じた。 一つの手法は相補性 RNAを標的とするアンチセンス RNAにより人工的に遺伝子 発現を抑制することにある（Helene，C．& Tolume J．J．Biochim．Biophys．Ac ta 1049：99-125，1990； Vander Kroら Biotechniques 6：958-976，1988）。 アンチセンス RNAは細菌及び動物組織のウィルス感染を抑えるのに効果的に利用 されているが（Helene，C & Tolume，J．J．前掲）、植物におけるその利用は限 られた成功しか収められていない（Van Del Elzen， P．J．M．ら Plant Mol．B iol．13：337-346，1989； Powell，P．A.ら Proc．Nad．Aca．Sci．USA 86：69 49-6952，1989）。 事実、別の領域に対するキュウリ・モザイクウィルス(CMV)アンチセンス RNA を発現する遺伝子導入植物は、非常に低レベルのアンチセンス RNAのみを不合理 的に生成する一の系を除き、 CMV感染に対して一般に耐性でなかった(Rezaianら 、Plant Mol．Biol．（1988）11：463）。アンチセンスがこの耐性の原因である 証拠はない。ポテトにおいて、遺伝子導入植物における PVXコートタンパク質 R NA配列に対するアンチセンスは低レベルでの接種においてのみ PVXから守った(H emenwayら、EMBO J．（1988）7：1273)。 ２つの主たる問題は、大量のウィルス核酸を迅速に生成できる複製系に対抗さ せるのに必要なアンチセンスの量、及びウィルス RNAはほとんどサイトプラズマ にあり、一方アンチセンス転写体は核の中で生成されることにあるようである。 ジェミニウィルスに関して、アンチセンス技術は、薬剤耐性遺伝 子に転写融合されたTGMVのウィルスによりコードされる ALI遺伝子のアンチセン ス DNA配列を発現するタバコ植物に応用されている（Day A．G．らProc．Nad．A cad．Sci． USA 88：6721-6725，1991）。アンチセンス転写体を発現する遺伝子 導入植物系は低い症状発症を示したが、この遺伝子導入植物は不毛となる可能性 があり、このことはウィルス耐性植物の大量生産の妨げとなるであろう。 本発明に至るまで研究において、本発明者らはリボザイムの手法を採用するこ とにより植物 DNAウィルス耐性植物を作製するアンチセンス手法の欠点の解消を 試みた。 リボザイムは特異性の高いエンドリボヌクレアーゼ活性を有する合成 RNA分子 である。特に、これらは、標的 RNAの少なくとも一部に対してヌクレオチド配列 が相補性となっているハイブリダイズ領域及び標的 RNAを解裂する触媒領域を含 んで成る。リボザイムはHaseloff J．and Gerlach L. Nature 334：586-591 及 び国際特許出願第WO89／05852 によく説明されている。 しかしながら、リボザイム技術の存在にもかかわらず、現在まで、それは植物 DNAウィルス、そして特にジェミニウィルスの如くの植物一本鎖 DNAウィルスに は利用されていない。事実、 DNAウィルスに対するリボザイムの利用の成功は、 その非常に複雑な複製及び転写メカニズムの観点から、並びにこのような様々な 操作の達成及びウィルスのライフサイクルにおける種々の標的配列の介在レベル の正確なレベルを考慮するうえで現状入手できる情報の欠如から、予測できるも のではなかった。例えば、レプリカーゼＣ1は「ローリングサークル」複製段階 には介在するが、ウィルスの二本鎖複製形態の形成の前段階には介在しないと推 定されている（Elmer ら、Nucl．Acid．Res.，1988，16，p7043-7060）。 本発明に従うと、本発明者らは植物 DNAウィルスを標的とするこ とのできるリボザイムの開発に成功し、これによりかかるウィルスをコントロー ルする経済的に価値のある、且つ効率的な手段を提供する。 従って、本発明の一の観点は、ハイブリダイズ領域及び触媒領域を含んで成る リボザイムに関し、ここでこのハイブリダイズ領域は DNAウィルスに係る DNA分 子から転写された標的 RNAの少なくとも一部にハイブリダイズすることができ、 ここで前記触媒領域はこの標的mRNA配列を解裂することができ、これによりこの DNAウィルスの複製、感染及び／又は集成を実質的に抑えることができる。 より詳しくは、本発明はハイブリダイズ領域及び触媒領域を含んで成るリボザ イムに関し、ここでこのハイブリダイズ領域は植物一本鎖 DNAウィルスのビリオ ン・センス DNAストランド又は相補性・センス DNAストランドから転写された標 的mRNAの少なくとも一部とハイブリダイズすることができ、ここで前記触媒領域 はこの標的mRNA配列を解裂することができ、これによりこの DNAウィルスの複製 、感染及び／又は集成を実質的に抑えることができる。 便宜上、一本鎖 DNAウィルスについての言及には、その二本鎖複製形態につい ての言及も含む。 好適な態様において、植物一本鎖 DNAウィルスはジェミニウィルスであり、そ して標的mRNAは複製にとって必須のタンパク質をコードする。「必須」とは、ウ ィルスゲノム（又はその相補性形態）に特異的とされ、且つ特定の機能、例えば 複製、感染及び／又はウィルス集成のために必要又は実質的に必要とされるタン パク質を意味する。必須タンパク質のレベルの低下はその機能のレベルの低下、 即ち、特定の機能のレベルの減少を意味する。好ましくは、必須のタンパク質の レベル（又は特定機能のレベル）は、リボザイム抜きでの必須タンパク質のレベ ル（又は特定機能のレベル）に対して、 20％低い、より好ましくは少なくとも30％低い、更により好ましくは少なくとも 45％低い、更により好ましくは少なくとも55％低い、そして更により好ましくは 65〜75％低い、そしてより更に好ましくは85〜90％低いものとする 好都合には、必須タンパク質のレベル（又は特定機能のレベル）は、インビボ での生物学的バリエーションの範囲内で、インビトロで試験できうる。かかる試 験は、例えばインビトロでのmRNA分解生成物の分析によって行うことができうる 。 本発明の一の好適な観点に従うと、ハイブリダイズ領域及び触媒領域を含んで 成るリボザイムを提供し、ここでこのハイブリダイズ領域はジェミニウィルスの ビリオン・センス DNA分子から転写した評的mRNA又は前記ビリオン・センス DNA に相補性の DNA分子の少なくとも一部にハイブリダイズでき、前記mRNAは植物細 胞中での前記ジェミニウィルスの複製にとって必須のタンパク質をコードし、こ こで前記触媒領域は前記標的mRNA配列を解裂でき、これにより前記ジェミニウィ ルスの複製を実質的に抑えることができる。 更により好ましい態様において、この標的mRNA配列は細胞内で少ない量で存在 している。かかるmRNA分子の例は、ジェミニウィルスにおける、例えばTLCV又は TYLCVにおけるＣ１遺伝子又はその同等物、並びにその突然変異体、誘導体及び 変異体である。TLCVの一本鎖 DNAは６つのオープンリーディングフレーム(ORF) を含み、２つはリーフ・カール感染植物の中で生成された複製形態 DNAのビリオ ン・センスストランド上にあり、そして４つはその相補性・センスストランド上 にある。感染植物細胞におけるウィルスmRNAの分析は、複製にとって必須である Ｃ１遺伝子をコードするmRNAが、TLCVゲノムに特異的とされる他のmRNA転写体よ りも少ない量で認められることを示した。Ｃ１遺伝子の同等物形態には遺伝子Ｌ １，AL１及び AC１が含まれ、そして本明細書における「Ｃ１遺伝子」についての言及はその同 等物を含むものと解される。 その他の標的にはＣ２，Ｃ３及びＣ４転写体が含まれ、これはビリオン・セン ス遺伝子発現のトランス作用において、並びにウィルスの感染、病気表現型の発 現及び病気の発症のそれぞれにおいて役割を担っている。 別の好適な態様に従うと、本発明はハイブリダイズ領域及び触媒領域を含んで 成るリボザイムに関し、ここでこのハイブリダイズ領域はジェミニウィルス、そ して特にTLCVのＣ１遺伝子をコードする標的mRNA配列の少なくとも一部にハイブ リダイズでき、そしてここで前記触媒領域は前記標的mRNA配列を解裂でき、これ により前記ジェミニウィルス（例えばTLCVの複製を実質的に抑制することができ る。 好適な態様において、本発明のリボザイムはエンドリボヌクレアーゼ活性を有 し、且つDNAウィルスの複製、感染又は集成を阻害できる核酸化合物と定義する ことができ、この化合物は次式を有する少なくとも一単位「Ｒ」を含んで成る： ５′（Ｘ−Ｙ−Ｘ′）３′ （ここで： Ｘ及びＸ′はそれぞれ独立して少なくとも４個の塩基を有するヌクレオチド配 列を表わし、そしてウィルスゲノム又は DNAウィルスの（−）センス RNA転写体 のいづれかの少なくとも一部に相補性であり、 Ｙはリボザイムの触媒領域を表わす）。 この変異体に従うと、この標的 RNAは好ましくは（−）センス RNA転写体、即 ち、 DNAウィルスゲノム、特にジェミニウィルスの二本鎖複製形態の相補性・セ ンスストランドの転写に由来するmRNAで ある。この配列Ｘ及びＸ′は従って、（−）センス RNA転写体の少なくとも一部 に相補性である（これは一本鎖ゲノム DNAの少なくとも一部に相補性であること と同等である）。 以降「バイブリダイズアーム」と呼ぶ配列Ｘ及びＸ′は、基質 RNAに対するリ ボザイムの安定的なハイブリダイゼーション及びこの基質の効率的な解裂の両方 を可能とするに足りる長さである。通常Ｘ及びＸ′はそれぞれ少なくとも４個の ヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも６個のヌクレオチドの長さを有する 。このハイブリダイズアームの長さの上限は一般に標的とする基質の長さにより 決定され、そして 800又は1000塩基以上の長さでありうる。好適な長さは６〜 3 00塩基、例えば10〜 150塩基である。基質に対する、又は基質の一部に対するハ イブリダイズアームの相補性は、通常ハイブリダイズアームの全長にわたる。 リボザイムの触媒領域「Ｙ」は任意のタイプの適当なリボザイム、例えば「ハ ンマーヘッド」又は「ヘアーピン」に由来する。これらのリボザイムは特許出願 EP-A-321201及び EP-A-360257のそれぞれに記載されている。特に好ましいのは 「ハンマーヘッド」触媒領域であり（例えば図７参照のこと）、そして以降に詳 しく説明する。 リボザイムは式［Ｘ−Ｙ−Ｘ′］の一の「Ｒ」単位を有し、そして一の触媒領 域のみを有する「モノリボザイム」であってよい。 他方、リボザイムは複数の「Ｒ」単位を含んで成り、そして一般式：Ｒ1−Ｒ2 …Ｒn（ここでｎ＞１、そして50又は 100ほどの高い値を有してよい）を有する 「ポリリボザイム」であってよい。実際、約５〜10の「ｎ」値が頻繁である。従 って、ポリリボザイムは頭から尾に至る一連のリボザイムにより成り、モノリボ ザイム「Ｒ」又は「Ｘ−Ｙ−Ｘ′」単位は単位モチーフである。授言すれば、 これはハイブリダイズアームで互いと連結した一連の触媒領域である。以降、何 らかのことわりのない限り、全てのリボザイムの「Ｒ」単位により表わされるＸ 及びＸ′モチーフの凝集体をまとめて「相補性性」又は「ハイブリダイズ」配列 と呼ぶ。ポリリボザイムは通常単一転写体に対して「単一分子」として作用する 。即ち、各触媒領域の解裂部位は同一の転写体上にある。 ポリリボザイムの正確な構造は実際には、解裂させる基質の種類により主に決 定される。触媒領域の数、相補性配列におけるその位置、及び２つの連続する触 媒領域間の距離は基質中の「三塩基標的」部位の位置に大いに依存する。 「ハンマーヘッド」リボザイムは基質を「標的」部位 XXX、好ましくは XUX（ ここでＸは４塩基Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｕのうちのいづれかを表わし、そしてＵはウラシ ルを表わす）のすぐ下流で解裂する。一の特に好ましい標的配列はX0UYである（ ここで、Ｘ0は任意のリボヌクレオチド、Ｕはウラシル、そしてＹはアデニン、 シトシン又はウラシルを表わす）。X0UYは塩基対隣接領域の一部を構成し、そし てＹは塩基対ではない。Ｘ＋ OUYを規定する好適なトリプレットには、限定する ことなく、GUC，GUA，GUU，UUC及び CUCが含まれる。その他の標的部位、例えば CAC，UAC及び AACも可能だが、効率性が低い。Perrimanら(Gene，1992，113：15 7)はハンマーヘッドリボザイムについての長い標的部位を研究した。GUC，UUC， CUC，GUA及び GUU標的は同等の進行の研究を示した。 GUGに関しては、通常のリ ボザイムは解裂を誘導できなかったが、触媒ドメインのステム・ループの変化が 弱い活性リボゾームの形成をもたらした。有意に認識できる解裂を示す、中心位 置にＵ以外のヌクレオチドを有するいくつかの標的があった。 「ヘアーピン」タイプのリボザイムの場合、好適な標的配列はAG UCである。 これらの標的配列はポリリボザイムの構造及び機能において重要であり、その 理由はそれらが基質の解裂の位置を示唆するのみならず、それらが、触媒領域が 相補性配列の中に挿入されなけれぱならない位置をも規定するからである。事実 、ポリリボザイムの各触媒領域は、転写体の XUX部位に相当する相補性配列中の 部位になければならない。例えば、もし一つの XUX部位がＣ1遺伝子の 412位に あり、そして他方が 711にあるなら、触媒領域は相補性配列の 412に対応する位 置に、そして他方は 711に対応する位置に挿入する。授言すれば、各「Ｒ」単位 中の触媒ドメインに隣接するＸ及びＸ′ハイブリダイズ配列を、基質において標 的とされる XUX部位のまわれの塩基と相補性となるように選ぶ。 モチーフ XUXは RNA配列の中で非常に頻繁に見い出せるモチーフである。例え ば、平均して、ランダム且つ等分布の塩基を有する配列の中で64塩基毎に GUCモ チーフがある。このことは、基質が通常複数の XUX解裂部位を含むことを意味す る。前記の通り、ポリリボザイムの触媒領域は XUX部位に相当する相補性配列の 位置にある。しかながら、本発明に従う効率的な解裂を得るために、基質の各 X UX標的配列のための触媒領域を含む必要はない。ポリリボザイムの中に含まれて いる触媒領域の総数は転写標的の中に存在している XUX部位の総数と通常等しい 、又はそれより少ない。本発明のポリリボザイム変異体は従って非常に多様な数 の触媒領域を含みうる。例えば、TLCVのＣ1の場合、ポリリボザイムは、標的配 列が GUCであるとき、約２〜約６個の触媒領域を含みうる。基質の中の XUX部位 の数よりも少ない数の触媒領域を相補性配列の中に含ませることを決めたとき、 選択する部位の選定は以下の基準に従って行うことができる： ａ）標的とする２つの XUX部位間の距離、従ってリボザイム中の２つの触媒領 域の距離は、対応の触媒領域の間にあるポリリボザイムのハイブリダイズアーム が安定な状況で基質とハイブリダイズでき、且つ触媒領域同志のハイブリダイズ が阻止できるほどに十分に長くなくてはならない。少なくとも８塩基、そして好 ましくは少なくとも14塩基、例えば約20塩基の距離が極めて好都合である。むろ ん、この基準は基質が XUX部位を互いと非常に近い距離で含んでいるときにのみ 考慮しなければならないものである。そうでなければ、も基質の XUX部位が互い と８〜20塩基以上で離れているなら、この選定基準は重要でない。 ｂ）標的とする XUXは好ましくは有意な二次構造を有さない基質の一部にある 。このことは、基質に対するリボザイムのアクセス及びその効果を高める。三次 元フォールディング分析を実施してよい。 ｃ）標的とする XUX部位は、一つの及び同一のウィルスの種々の株間で、又は 変異体もしくは突然変異体間で、又は異なる辺線ウィルス間で保存されている相 同性領域の一部を成しうる。本発明の観点は以降に詳細に考慮する。 ｄ）標的とする XUX部位のその他の選定基準は、形質転換すべき植物の内因性 遺伝子との相同性の欠落である。事実、稀ではあるが、一部のウィルスは植物の ゲノムにおいて相同性のある配列を有する。従って、かかる配列内にある XUX部 位を避けることが重要である。 本発明のリボザイムにおいて、任意の一の「Ｒ」単位内のハイブリダイズＸ′ 及びＸモチーフは往々にして基質の隣接連続部に対して相補性である。この場合 、このリボザイムは「対称性」であると考えられ、そして触媒性ドメインは２つ の隣接アームの相補性によ り決定される固有部位において働く。この対称型リボザイムの好適な例は「純粋 相補性」リボザイムであり、それにおいては一定の「Ｒ」単位の３′ハイブリダ イズアーム及び隣接「Ｒ」単位の５′ハイブリダイズアームは、（−）センス R NA転写体又は DNAゲノムの中に連続している配列に対して相補性である。 授言すれば、本態様において、ハイブリダイズアームの凝集体は標的配列に対 する非介在型相補性の配列を備える。このタイプのポリリボザイムは、その配列 の中の個々の部位に複数のリボザイム触媒領域が挿入されている相補性配列と考 えられうる。この相補性配列は標的転写体の全長とハイブリダイズしうる。他方 、それは標的転写体のフラグメントのみとハイブリダイズしうる。注目のフラグ メントはポリリボザイムの対応の配列の中に少なくとも２つの触媒領域を含むこ とができるほどに長くなくてはならない。一般に、この変異体に関し、相補性配 列の長さは、触媒領域を数えずに（ハイブリダイズアームの合計）、約40〜2000 塩基でありうる。 400〜1000の長さが極めて好ましい。 本発明の変異体に従うと、前述のように「対称性」であるよりも、リボザイム は「非対称性」である少なくとも一の「Ｒ」単位でありうる又はそれを有しうる 。このことは、一定の「Ｒ」単位内のＸ及びＸ′ハイブリダイズアームが基質の 中で非連続的な２つの配列に対して相補性であることを意味する。このことは事 実上、「非対称性」「Ｒ」単位の触媒ドメインが基質の中で２つの異なる XUX部 位において作用しうることを意味する。その一方はその５′アームに対して相補 性である配列に隣接する XUX部位であり、そして他方は３′アームに対して相補 性である配列に隣接する XUX部位である。このタイプのリボザイムは特別に構築 するか、又は合成の際の自発的な再配列(rearrangement)の結果でありうる。他 方、３′隣接 アームがハイブリダイズする配列の位置、及び５′隣接アームがハイブリダイズ する配列の位置は、数百の塩基により、又は10もしくは20塩基ほどの少なさで隔 てられていてよい。このタイプの構造は有列であり、なぜならこれは触媒領域に おいて有意義な「経済性」を与えるからである；例えば、５つの「非対称性」「 Ｒ」単位は10の対称性単位と同一の結果を達しめうる。 本発明の別の非常に好適な態様に従うと、次式 Ｒ1−Ｒ2−Ｒ3…Ｒn を有するポリリボザイムにおいて、一定の「Ｒ」単位の３′ハイブリダイズアー ム（Ｘ′）及び隣りの「Ｒ」単位の５′ハイブリダイズアームは、ゲノムの又は （−）センス RNA転写体の非連続部分に対して相補性である。このタイプのポリ リボザイムは以降「ショートアームポリリボザイム」と呼ぶ。 このようなポリリボザイムの構造は基本的に、標的配列に対して相補性である 配列であり、それにおいてはリボザイム触媒領域は埋没しており、そしてそれは 相補性配列の欠点を有する。このポリリボザイム中の２つの触媒領域間の距離は 標的配列中の対応の XUX部位間の距離よりも短い。リボザイム間の距離は、基質 中の対応の標的部位間の距離に関係して有意に小さくしてよく、例えば、もし基 質の中の２つの隣接標的 XUX部位が1000ヌクレオチドの距離で隔てられているの なら、この「ショートアームリボザイム」の触媒領域間の距離は30又は40ヌクレ オチドほどの短さであってよい。従って、ハイブリダイズ配列の長さの90％以上 の削減を施してよい。２つの隣接触媒領域間の最短の長さは通常約８個のヌクレ オチド、そして好ましくは少なくとも20個のヌクレオチドとする。本発明者らは 、驚くべきことに、かかる短いハイブリダイズ配列が、ポリリボザイムが基質を 有効に解裂することの妨げとならず、そして事実、多 くの場合には失活の効率性を改善しうることを示す。 例えば、相補性配列の長さの削減はリボザイムの失活に至るような二次構造の 形成に係る問題を回避する。即ち、一定の長さのリボザイム分子に関して、基質 中のより多くの解裂部位を標的とするより多くの触媒領域を挿入してよい。 更に、ショートアームポリリボザイムの利用は、たとえ基質の配列の一部しか わかっていないときでも有効なポリリボザイムを構築できうることを意味する。 XUX標的部位のまわりの10又は15個の塩基を知るだけで十分である。 別の重要な利点は、短いハイブリダイズアームとして、もっぱら種々のウィル ス、例えば同タイプのウィルスにおいて保存されている配列を利用することがで きることにある。このようにして、種々のウィルスは、たとえ保存領域間の配列 が全体的には非類似であっても、同一のポリリボザイムにより失活されうる。 最後に、分子の小ささは、より簡単、且つより経済的な合成を可能とする。本 発明の「ショートアーム」リボザイムの機能的性質は、ポリリボザイムにおいて 、種々の触媒領域が互いと独立して作用しうることにある。 本発明のどのポリリボザイムも「ロングアーム」と「ショートアーム」リボザ イムの混合物、並びに「対称性」及び「非対称性」リボザイムの混合物を含みう る。他方、それはロングアームリボザイムのみ、もしくはショートアームのみを 、又は非対称のみ、等を含んでよい。リボザイムの構造は従って最適化して試験 できうる。 本発明の更なる態様に従うと、このポリリボザイムのハイブリダイズアームは 少なくとも２種類のウィルスに由来しうる。かかるポリリボザイムを以降「キメ ラ ポリリボザイム」と呼ぶ。このタイプの構築体の例として、TLCV及び TYLCV 由来配列の混合物、例えば サルジニア、イスラエル又はチュニジア株が挙げられる。このタイプのポリリボ ザイムは、もし一緒に存在しているなら、両タイプのウィルスの失活を確実なも のとし、又は異なる地理領域での単独の構築体の利用を可能にする。 本発明の更なる観点に従うと、このポリリボザイムは、２つの連続「Ｒ」単位 の間に、少なくとも４塩基の長さを有し、且つ（−）センス RNA転写体又は DNA ゲノムに対して相補性でない非相補性配列（Ａ）を含みうる。 このポリリボザイムの非相補性配列は正確な機能を有することができ、例えば それは形質転換体を選別するのに利用できうるコード配列により、又は更に DNA ウィルスの主標的以外で基質上に作用するもしくはポリリボザイムの一部に cis 作用を及ぼすリボザイムを含む配列より成りうる。それは一般にクローニング用 のポリリンカ、又はキメラポリリボザイムの構築を助けるアダプターを含む。こ の非相補性配列は通常４〜 500塩基、例えば20〜 100塩基の長さを有する。複数 の非相補性配列があるとき、これらは一緒になってポリリボザイムの長さの約90 ％まで、例えば50％を占めうる。このような非相補性配列は通常相補性配列Ｘ及 びＸ′の一部を代替するが、しかし触媒ドメインのすぐ隣りの少なくとも４個の 相補性塩基を残す。 最も好適な態様に従うと、本発明のリボザイムは、同一の株の変異体もしくは 突然変異体間、同一のウィルスタイプの株間、又は異なるタイプのウィルス間で 高度に保存されている一又は複数の領域に対してハイブリダイズアームが相補性 となるように構築する。 ジェミニウィルスの種々のオープンリーディングフレーム、即ち、Ｖ１，Ｖ２ ，Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３及びＣ４によりコードされる推定アミノ酸配列の対比を行っ た（例えば、表１に記載の文献を参照の こと）。Ｃ１レプリカーゼポリペプチドに関して、TLCVと TYLCV-Iとの間での最 大相同性は83％の相同性を伴った。TLCVと TYLCV-S間では、Ｃ１オープンリーデ ィングフレーム上で79％のアミノ酸同一性があった。 この対比を、TLCVに対する TYLCVのイスラエル、サルジニア及びチュニジア単 離体で行うと、類似の相同性が見い出された（表１参照のこと）。 表１についての解説 １〜14について、アミノ酸同一性はプログラムBest Fit of the UWGCG-Sequen ce analysis package による％で示す。ワードサイズ (K-tuple)は２、ギャップウェイトは 2.0、そしてギャップレングスウェイトは 0.1とした。プログラム FastAは同一の関係をもたらした。 15〜21について、アミノ酸同一性は構造−遺伝子対比マトリックスを用い、PC ／GENE Sequence analysis packageのPALIGNプログラムを利用して計算した（オ ープンギャップコストバリュー10；ユニットギャップコストバリュー10）。 ABMVA ：アブチロン（Abutilon）・モザイクウィルスDNA Ａ； ACMVA ：アメリカン・カッサバ・モザイクウィルスDNA Ａ； BGMVA ：ビーン・ゴールデン・モザイクウィルスDNA Ａ； ICMV：インディアン・カッサバ・モザイクウィルスDNA Ａ； SqlCV ：スカッシュ(Squash)・リーフ・カール・ウィルスDNA Ａ； PYMVA ：ポテト・イエロー・モザイクウィルスDNA Ａ； TGMVA ：トマト・ゴールデン・モザイクウィルスDNA Ａ； TYLCV-I ：トマト・イエロー・リーフ・カール・ウィルス・イスラエル単離体； TYLCV-S ：トマト・イエロー・リーフ・カール・ウィルス・タイ単離体； TLCV ：トマト・リーフ・カール・ウィルス； BCTV ：ビート・カーリー・トップ・ウィルス； TobYDV：タバコ・イエロードゥウォーフ・ウィルス； MSV ：メイズ・ストリーク・ウィルス； WDV：ホイート・ドゥウォーフ・ウィル ス。 表にまとめた結果はDry ら(J．Gen．Virol．（1993）74・147)及びKheyr-pour ら(Nucl．Acid．Res．（1991）19：6763)より得た。 TYLCV及びTLCVの３つの単 離体間の配列多様度は、種々のジェミニウィルス単離体又は株間での通常の非常 に高い配列類似性に対して 非常に対照的である。例えば、ACMVのケニヤ及びナイジェリア単離体の DNA配列 は96％の同一性を示し、そして MSVのケニヤ、ナイジェリア及び南アフリカ単離 体は最大約２％異なる。 TYLCV及びTLCVの３単離体間の強い配列多様度にかかわ らず、本発明者らはC1 RNA転写体の対比を行い、そして３つの非常に高度の保存 領域を同定した。その２つを図９に示す。これらの領域は以下の通りである（以 下の数え方は相補性・センス転写体のTLCVの数え方である）。 １．ほぼ 365〜435 ２．ほぼ 634〜737 ３．ほぼ 895〜972 これら３つのTLCV単離体（それぞれオーストラリア、イスラエル及びサルジニ ア由来）中のＣ１遺伝子のヌクレオチド配列を図１に示す。TLCV由来のＣ１遺伝 子の完全ヌクレオチド配列はMullinaux ら Virology，193：414-423，1993及びDry ら J．Gen．Virol.,74：147-151，1993に開示されている。このイスラエル 単離体はNavot らVirology，185：151-161，1991 により開示され、そしてサル ジニア単離体はKhyer-PourらNucl．Acid．Res．19：6763-6769，1991により開示 されている。 これらの保存領域中の標的部位により構築したポリリボザイムは従って全ての 辺縁株又は変異体が失活することを確実なものとするために利用されうる。上記 の通り、もしポリリボザイムが欠失ショートアームバージョンであってハイブリ ダイズアームがもっぱら保存領域に対応するものであるなら、保存領域間での配 列多様度は基質に対するポリリボザイムの効率的なハイブリダイゼーションに影 響を与えない。 本発明のこの観点に従うと、「保存領域」は約20塩基の長さにわたって 100％ の相同性を有するものと考える。一般に、この相同性 は30塩基にわたって約90％でありうる。リボザイムＲ１，Ｒ４，Ｒ５及びＲ２は 、以下の実施例に示している通り、これらの保存領域内にくるようにデザインす る。 従って、この態様に従うと、本発明はハイブリダイズ領域及び触媒領域を含ん で成るリボザイムであって、そのハイブリダイズ領域が特定のジェミニウィルス のうちの少なくとも２つの変異体、そして特にTLCVの少なくとも２つの変異体の Ｃ１遺伝子をコードする標的mRNA配列の少なくとも一部にハイブリダイズし、そ してここで前記触媒領域は前記標的mRNA配列を解裂でき、これにより前記ジェミ ニウィルス（例えば、TLCV，TYLC、並びにその突然変異体、誘導体及び変異体） の複製を実質的に抑制できるリボザイムに関する。 本発明のポリリボザイムは通常 RNAより成る。にもかかわらず、通常ポリリボ ザイムの一部、例えば、ハイブリダイズアームもしくはそのアームの一部、又は 更に触媒領域の一部、特に触媒活性が保たれていることを条件に「ループ」の一 部、を DNAに置き換えてよい（例えば、国際特許出願WO-9119789に記載の DNAに よる RNAの置換を参照のこと）。 触媒領域を考慮する限り、本発明のリボザイムは次式（Ｉ）の分子として表わ すことができる： （式中、（Ｘ）n及び（Ｘ）n′は DNAウィルスのmRNA配列に実質的に相補性であ るリボヌクレオチド配列を表わし；ｎとｎ′との合計は同一又は異なっていてよ く；（*）は相補性リボヌクレオチド間の塩基対合を表わし；Ｙは任意のリボヌ クレオチドを表わし、そして各Ｙは同一又は異なっていてよく；Ｙ′及びＹ″は オリゴヌクレオチド間での塩基対合が可能となるようにその全長の少なくとも一 部の間が相補性配列のリボヌクレオチドで表わすか、又はＹ′及びＹ″は一緒に なって一本の RNA配列を形成しており、ここでこの配列の少なくとも一部は相補 性ヌクレオチド間の塩基対合により形成されるステムを含んで成り；そして任意 的にＡ，Ｇ，Ｃ又はＵのいづれかより選ばれる追加のヌクレオチドが1Ａの後方 に挿入されている）。 別の態様において、このリボザイムは次式（II）に記載の通りである： （式中、（Ｘ）n及び（Ｘ）n′は DNAウィルス、そして特にジェミニウィルス、 例えばTLCVのmRNAに対して実質的に相補性であるリボヌクレオチド配列を示し； Ｙは任意のリボヌクレオチドを表わし、そして各Ｙ残基は同一又は異なっていて よく；（＊）は相補性ヌクレオチド間での塩基対合を表わし；ｎ及びｎ′は先に 定義の通りであり；Ｂは結合、塩基対合、リボヌクレオチド又は少なくとも２ 個のリボヌクレオチドを含むオリゴリボヌクレオチドを表わし；ｍ及びｍ′は１ 以上であり、そして同一又は異なっていてよく；そして任意的に、Ａ，Ｇ，Ｃ又 はＵのいづれかより選ばれる追加のヌクレオチドが1Ａの後方に挿入されている ）。 好適な態様において、リボザイムは次式（III）に記載の通りである： （式中、（Ｘ）n及び（Ｘ）n′は DNAウィルス、そして特にジェミニウィルス、 例えばTLCVのmRNAに実質的に相補性であるリボヌクレオチドを表わし；Ｙは任意 のリボヌクレオチドを表わし、そして各Ｙ残基は同一又は異なっていてよく；（ ＊）は相補性リボヌクレオチド間での塩基対合を表わし；ｎ及びｎ′は先に定義 の通りである）。 好ましくは、この DNAウィルスは一本鎖 DNAウィルスである。好ましくは、こ の一本鎖 DNAウィルスはジェミニウィルスである。最も好ましくは、このジェミ ニウィルスはTLCVであり、そして（Ｘ）n及び（Ｘ）n′はＣ１遺伝子mRNAの領域 にハイブリダイズできる配列を表わす。 最も好適な態様において、（Ｘ）n及び（Ｘ）n′は図１に記載のTLCV又は TYL CVのＣ１遺伝子mRNA転写体にハイブリダイズする。 体に特異的であり、そして以下に記載のヌクレオチド配列を含んで成る： 及び 上記及び図７の触媒領域は保存構造及び配列を有するが、一部のヌクレオチド のリボザイム活性を損うことなく欠失、挿入、置換又は改変されうることが認め られた。本発明は、その触媒活性が保存されていることを条件に、これらの改変 触媒領域の利用を含んで成る。この活性は以下の試験を利用して確認できる。 例えば、式Ｉ，II及びIIIに記載の触媒領域の１又は複数のヌクレオチドはヌ クレオチド含有塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、メチルシトシン、 ウラシル、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、イノシン又はその他のメチル 化塩基により変換されうる。触媒ループの最初の塩基対合を形成し合う「保存」 塩基Ｃ−ＧはＵ−Ａに置き代わりうる(Koizumi らFEBS Letts．228，2，228-230 ，1988)。 図７に示す触媒領域のヌクレオチドも化学修飾してよい。このヌクレオチドは 塩基、糖及びモノリン酸基より成る。これらの基それぞれを修飾してよい。かか る修飾は「Principles of Nucleic Acid Structure」(Wolfran Sanger編、Sprin ger Verlag，New York，1 984)に記載されている。例えば、この塩基はハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ア ルキル、アジド、ニトロ、フェニル基等の置換に耐えうる。このヌクレオチドの 糖成分はハロゲノ、アミノ又はアジド基による第二ヒドロキシル基の置換又は２ ′メチル化の如くの修飾に重ねてもよい。 ヌクレオチドのリン酸基は、ホスホラミデート、ホスホロチオエート及びホス ホネートのそれぞれをもたらしめるＮ，Ｓ又はＣによる酸素の変換により修飾さ れうる。この後者は有用な薬理動力学的特性を示しうる。 触媒領域の塩基及び／又はヌクレオチドは置換基、例えばチロシン又はヒスチ ジンの如くのアミノ酸も有しうる。 本発明の態様に従うと、リボザイムは触媒領域として図17に示しているかの如 くの１又は複数の構造体を含んで成りうる。この構造体、いわゆる「ミニザイム 」は国際特許出願WO-A-9119789に記載されている。これは「ハンマーヘッド」タ イプの触媒領域を示し、その「ループ」は「Ｐ」基により置き換えられている。 ＰはＧと1Ａとの共有結合、１もしくは複数のヌクレオチド(RNAもしくは DNA、 又は混合物、又は上記の誘導体）、又は触媒活性に影響を及ぼさない任意の原子 もしくはヌクレオチド以外の原子団であってよい。Ｐが複数のヌクレオチドを表 わすとき、それは内部塩基対合を含みうる。基「Ｐ」を構成するヌクレオチドの 配列及び数は重要でなく、そして１〜20個のヌクレオチドの間でよく、例えば好 ましくは１〜６個でよい。ワトソン・クリック型の内部塩基対合を欠く配列を選 ぶことが好ましい。 本発明のリボザイムの触媒活性はリボザイム又は事後転写によりリボザイムを もたらす配列を基質と接触させ、次いで解裂を実証することによってインビトロ で確認できうる。インビトロ解裂反応の ための実験条件は下記の通りである：温度は４〜60℃、そして好ましくは20〜55 ℃、pHは約 7.0〜 9.0、二価金属、例えばMg2+の１〜 100mM（好ましくは１〜20 mM）での存在下。ポリリボザイムは通常基質と等モニ比、又は過剰量で存在させ る。インビトロ解裂反応は好都合にはLamb and Hay（J．Gen．Virol.，1990，71 ，2257-2264）に記載の手順に従って実施する。この文献はプラスミドに挿入さ れたオリゴデオキシリボヌクレオチドからのリボザイムの生成のためのインヒド ロ転写にとって適切な条件も述べている。 インビトロ解裂条件は細胞に天然に存在している条件とする。 上記に記載の本発明の態様及び観点に従い、このリボザイムは標的mRNA配列に 「ハイブリダイズ」する又は「相補性」であるハイブリダイズアームを有すると 言われる。かかるハイブリダイゼーション及び相補は本明細書においては、標的 トリプレットでの解裂が生ずるよう、十分に安定な構造を形成するに足りる二本 鎖形成の度合いとして定義する。標的配列に依存して、このリボザイム及びmRNA の二次構造は、標的mRNA配列とリボザイムの片方又は両方のハイブリダイズアー ムとの間で好ましくは約５〜10以下、より好ましくは約３〜５、そして更により 好ましくは１〜３塩基以下で該対合するであろう。ハイブリダイズアーム全長で 、10％より多くの該対合が起こるべきでない。従って、本発明は本明細書に記載 のリボザイム、特にRz1，Rz2，Rz3，Rz4及び Rz5、それらを含むポリリボザイム 、並びにそれらの任意の又は全ての機能的突然変異体、誘導体、一部、同族体又 は類似体に及ぶ。かかる突然変異体の例にはリボザイムのハイブリダイズ領域及 び／又は触媒領域に対する一又は複数のヌクレオチド置換、欠失及び／又は付加 が含まれ、ただしかかる修飾リボザイムは標的mRNA配列を解裂する機能を維持し ていることを条件とする。 別の観点からすると、本発明はハイブリダイズドメイン及び触媒ドメインを有 するリボザイムであって、このハイブリダイズドメインがTLCVもしくは TYLCVの Ｃ１遺伝子をコードするmRNA分子中のヌクレオチド配列に実質的に相補性である ヌクレオチド配列を含んで成るか、又は前記TLCVもしくはTYLCV mRNA配列と高ス トリンジェンシー条件が高ストリンジェンシー条件下でインビトロでハイブリダ イズし、そして前記触媒領域が前記mRNA配列を解裂できるリボザイムに及ぶ。本 発明の観点はインビトロでの標的mRNAの解裂の程度により好適に決定される。 本発明の目的にとって、SambrookらMolecular Cloning：A Laboratory Manual ，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold SpringHarbor，NY，USA.頁 387-389 、パラグラフ11に記載のストリンジェンシー条件と考えられる。他方、中ストリ ンジェンシーは0.25〜 0.5％ W／VSDS、45℃、２〜３時間の利用でありうる。他 の条件も、核酸分子の濃度、純度及び起源に依存して適用できうる。 本発明は本明細書記載のリボザイムを含んで成る遺伝子構築体に及ぶ。これら の遺伝子構築体は一般にリボザイムを宿主細胞に移し入れる媒体としてのベクタ ー配列及びリボザイムの転写を指令するプロモーター配列並びにターミネーター を含んで成る。好適なプロモーターには、限定することなく、35Ｓカリフラワー ・モザイクウィルス（CaMV）又はダブル35ＳCaMVプロモーターが含まれる。CaMV プロモーターはOdell ら Nature 313：810-812，1985 に記載されている。これ らのリボザイムは一般に相補性形態であり、転写により、リボザイムが生成され る。本発明の遺伝子構築体は、本明細書記載のリボザイムを構成的、発育的又は 誘導的（例えば一定の刺激に応答して）に発現できる遺伝子導入植物を作るため に用いられる。最も好ましい遺伝子細胞はTLCV感染に実質的に耐性とされる。 本発明のリボザイム及び遺伝子構築体は、ウィルス感受性植物を用いてインビ ボで簡単に試験できうる。特に有用なインジケーター植物はタバコ植物である。 この分析は例えば症状の症度をスクリーニングすることにより定性的なものとす るか、又はサンプルを例えばリボザイム発現レベルもしくは標的mRNAのレベルを 測定することにより定量的なものとすることができる。定性又は定量分析の組合 せも利用できうる。 外来 DNAを植物に導入するための全ての公知の手段、例えばアグロバクテリア （Agrobacterium ）、コレクトロポレーション、プロトプラスト融合、粒子ガン によるボンバードメント、又は花粉、微小胞子、種子及び未熟胚の如くの細胞へ の DNA浸透、ウィルベクター、例えばジェミニウィルス又はサテライトウィルス を用いてよい。アグロバクテリア・トウメファシエンス（A．tumefaciens）及びリゾジーンス （Rhizogenes）が好適な手段を成す。この場合、ポリリボザイムを コードする配列を適当なベクターの中に、必要な全ての調節配列、例えばプロモ ーター、ターミネーター等、並びに形質転換体の選別に必要な任意の配列と一緒 に導入する。 一の手法において、タバコ細胞を、試験すべき遺伝子構築体と一緒にアグロバ クテリア を採用する標準手順を利用して形質転換する。一般に、タバコのアグロ バクテリア・トウメファシエンス 媒介形質転換はHorschらScience 227：1229-12 31，1985 に本質的に記載の通りにして実施するか、慣用の株LBA 4404を用い、 そして苗木を 250μｌ／mlの濃度のカナマイシンで選別する。形質転換細胞を小 植物に再生させ、そして発現のスクリーニングのためにサンプルを取り出す。こ の植物を自己繁殖及び発芽（seed）させ、そして遺伝子導入種子を新植物を作る のに用いる。この遺伝子導入植物を適当なコントロールを伴ってウィルスにさら し、そして症状発症度を分 析する。別に、又は更に、生化学分析により定量評価を行ってよい。この手法は ジェミニウィルス、そして特にTLCVに対するリボザイムのスクリーニングにとっ て極めて有用である。適当なリボザイム遺伝子構築体がこの手順を利用して同定 できたら、これらの特定の構築体を、例えばTLCV及び TYLCVの場合、遺伝子導入 トマト植物を作るために用いることができる。類似の形質転換及びスクリーニン グ手順を採用してよい。 遺伝子導入植物の耐性的性質は自己繁殖を実施することにより、又はＴ1を得 るための一世代子孫に基づいての非形質転換ゲノタイプとのかけ合わせにより試 験できうる。次いで、Ｔ1植物に、アグロ接種により DNAウィルスを接種する。 耐性度（即ち、「完全耐性」は症状の総合的な欠如を意味し、「寛容」は植物が 感染し、そして症状を示すが、回復することを意味し、「感受性」は、植物が症 状を示し、そしてウィルスを複製させることを意味する）を記録する。 本発明は特に、TLCV及び TYLCV感染に対して少なくとも多少耐性を示す遺伝子 導入トマト植物に関する。感染に対する耐性とは、約30％以上、好ましくは約50 ％以上、そして更には約70％以上の症状の定量的軽減を意味する（一般にウィル ス複製の阻害に基づく）。生物系の多様性に基づき、 100％のTLCV複製阻害を達 成するのは困難であるが、リボザイムの効果は様々な分子生物学的技術により高 まりうる。 本発明のこの観点に従うと、非遺伝子導入植物に比べてTLCVに対する曝露を経 て軽減した症状を示す遺伝子導入植物の方法を提供し、この方法はトマト植物細 胞を、TLCV由来のＣ１mRNAを解裂できる上記のリボザイムをコードする遺伝子構 築体で形質転換し、この形質転換細胞から植物を再生させ、この再生植物を自己 繁殖させ、そ してそれから種子を換得し、そしてその種子から遺伝子導入植物を成育させるこ とを含んで成る。 本発明は植物 DNAウィルス、より詳しくはジェミニウィルス、そして更には特 にTLCVに対する耐性を示す遺伝子導入植物に及ぶ。一の好適な態様において、こ の遺伝子導入植物はトマト植物とする。本発明はかかる遺伝子導入植物由来の再 生材料及び種子にも及ぶ（例えばトマト植物）。このリボザイムは構成的、発育 的又は誘導的に発現されうる。 本発明は更に以下の限定でない図面及び実施例を参照することにより説明する 。 図面において： 図１は３種のTLCV単離体由来の相補性・センスストランドのヌクレオチド配列 を示す：上列、TLCV（オーストラリア）；中列、TLCV（イスラエル）；下列、TL CV（サルジニア）。配列は５′→３′方向で示す。 図２はBamHＩ切断 Bin19にクローニングしたCaMV35S-1568bp TLCV フラグメン ト（Rz1，Rz2，及び Rz3含有）− CaMVpolyAを含んで成る pRIBO5BINの模式図で ある。３つのリボザイムRz1，Rz2，及び Rz3の挿入部位は位置1111，2056及び23 55に示す。この番号付けはビリオン−センス番号付けであり、そして図８及び10 に示す（−）センス番号付けを用いると、それぞれ位置1654，711 及び 412に相 当する。 図３はBamHＩ切断 Bin19にクローニングしたCaMV35S-1346bp TMCV フラグメン ト（Rz1，Rz2，及び Rz3含有）− CaMVpolyA発現カセットを含んで成る pRIBO5B IN DeLの模式図である。 図４はBamHＩ切断 Bin19にクローニングしたCaMV35S-3966bp TLCV フラグメン ト(Rz1及び Rz2含有)− CaMVpolyA発現カセットを含 んで成る pRIBO7BINの模式図である。 図５はBamHＩ切断 Bin19にクローニングしたCaMV35S-30bp TLCVフラグメント( Rz1含有)−CaMVpolyA 発現カセットを含んで成る pRIBO2BINの模式図である。 図６は遺伝子導入タバコにおけるリボザイム構築体発現のRT-PCR分析のために 用いたプライマーの位置の模式図である。 図７はリボザイムモデルの模式図である（Haselhoff and Gerlach，Nature，1 988 由来）。基質 RNAは、示している通り、リボザイムと塩基対合を形成する長 さの GUCに隣接する任意の配列（Ｘ）を解裂部位に有しうる。矢印は解裂部位を 示す。リボザイム中の保存塩基を枠で囲った。天然のハンマーヘッドにおいて、 基質及びリボザイム部はループにより接続され、分子内解裂がもたらされる。 図８は TYLCV-Sの相補性・センスストラントのヌクレオチド配列を示す。小文 字はリボザイム解裂部位を示す。 TYLCV-Sの配列はKher-Pour ら(Nucl．AcidRes ．（1991）19：6763)により公開されている。 図９はTLCVと TYLCV-S間の、レプリカーゼ遺伝子における保存領域を示す：図 ９（ａ）はリボザイムＲ１，Ｒ４及びＲ５まわりに高度に保存されている領域を 示す；図９（ｂ）はリボザイムＲ２のまわりに高度に保存されている領域を示す 。“：”は該対合を意味し、ギャップはヌクレオチドがないことを意味する。小 文字はリボザイム解裂部位を示す。 図10はTLCVの相補鎖のヌクレオチド配列を示す。Dry ら(J．Gen．Virol．（19 93）74：147)。小文字はリボザイム解裂部位を示す。 図11はポリリボザイムＤ，Ｆ及びＥの標的配列を示す。小文字はリボザイム解 裂部位を示す。大文字はリボザイムアームの相補性配列に相当する。 図12はリボザイム構築体の模式図である。斜線は TYLCV-S相補性・センススト ランドを表わし、そして実線はTLCV相補性・センスストランドを表わす。Ｒ＝リ ボザイム。 図13は二重ベクターpGAZE の模式物理地図である。 図14はリボザイムプラスミド、pGAZE-RzA，pGAZE-polyRzC，pGAZE-polyRzD，p GAZE-polyRzE，pGAZE-polyRzF,の模式物理地図である。 図15（ａ）は EcoRV切断 Bluescript SK＋に平滑末端化した pRIBO5BS：1690b d TLCV C1／C2／C3相補性フラグメント（３つのリボザイムを含む）の模式図で ある； 図15（ｂ）は BamHI切断 BIN19にクローニングした pRIBO5BIN：2660bp BgL II35S-C1／C2／C3相補性（３つのリボザイム含有）CaMVpolyA カセットの 模式図である；白抜き三角形は22bpのリボザイム挿入の位置を示す。E:EcoRＩ； H:HindIII；K:KpnＩ；P:Pst Ｉ；Sm:SamＩ；B:BamHＩ；SL:SaLＩ；St:SstＩ；X: Xho Ｉ；Xb:XbaＩ；C:Cla Ｉ。 図16はリボザイム構築体の模式図であり、それらの相互関係並びに「ショート アーム」リボザイム、polyE，polyF及びpolyD を得るのに実施した欠失を示す。 図17は「ミニザイム」構造を示し（WO-A-9119789）、ここで触媒領域のループ は要素「Ｐ」により置き換えられている。Ｐは、「Ｐ」基のリボヌクレオチドが 、配列（Ｘ′）n及び（Ｘ）n 2及びＰがもっぱらリボヌクレオチドより成るとき に「ワトソン・クリック」塩基対合により塩基対合しないことを条件として、少 なくとも１個のヌクレオチドである（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオ チド、誘導体又は混合物）。「Ｐ」は結合又は任意の原子もしくは原子団であっ てもよく、ただしリボザイムの触媒活性に影響を及ぼしてはならない。Ｘは式Ｉ ，II，IIIにおけるものと同じ意味を有 する。 実施例実施例Ｉ−TLCVの標的mRNAの選別： 適当な標的 RNAの選別ができるようにするため、主要mRNA転写体を同定し、そ してTLCVのオーストラリア単離体の環状ゲノムの上で地図化した［TLCV（オース トラリア）Mullineauxら、前掲；Dry ら前掲］。ウィルス DNAの相補性・センス ストランド由来のウィルスmRNAの一つは他のTLCV転写体より少ない量で見い出さ れた。この少量mRNA転写体はＣ１遺伝子をコードするものとして同定され、その 生成物はウィルスの複製にとって必要である。Daviesら、Trends in Genetics， ５：77-81，1989 ］。このmRNAはＣ２，Ｃ３及びＣ４と命名された。３つのその 他の遺伝子生成物もコードする。それらの機能はあまりよく分かっていない。従 って、Ｃ１遺伝子をコードするこの量の少ないmRNAを標的mRNAとして選んだ。こ の転写体の量の少なさは高率のリボザイム標的配列を意味し、これによりＣ１遺 伝子生成物のより実質的な低下が潜在的に可能である。実施例II−TLCV単離体間でのＣ１遺伝子の保存領域に基づくリボザイムの選別 ３つのTLCV単離体［TLCV（オーストラリア）、TLCV（イスラエル）及びTLVC（ サルジニア）］の相補性センスストランドのヌクレオチド配列を、リボザイムに より標的とされる保存領域を同定するために比較した。この配列対比を図１に示 す。３つの保存領域をリボザイムのデザインのために同定した。これらの保存領 域のうちの２つを図１に示す。配列対比に加えて、リボザイムのより高い効果が 可能となるように標的部位の二次構造を推定するためにコンピュータープログラ ムを用いた。実施例III−TLCVのＣ１遺伝子の保存配列を標的とするリボザイムの合成 実施例IV−Rz1，Rz2及び／又はRz3：pHIBO5BIN を担持する遺伝子構築体： Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３及びＣ４リーディングフレーム（ORPS）を含むヌクレオチド 1075-2643 由来のTLCVの1568フラグメントをpALTER-1(Promega)の中にクローニ ングした。リボザイム配列１，２及び３(それぞれRz1，Rz2及びRz3)を実施例III に記載の通りにして合成し、そしてインビトロ突然変異誘発系(Promega)におい て改変部位を利用してTLCV配列に導入した。導入リボザイム配列の組込みはジデ オキシ連鎖停止法を利用する配列決定により確認した。Rz1，Rz2及びRz3 は50℃ 及び37℃において、57 RNAポリメラーゼにより作った相補性・センスウィルス R NA転写体のインビトロ解裂を触媒することを示した。Rz1，Rz2及びRz3 を含む改 変1634bp相補性・センスTLCVフラグメントをアンチセンス方向で（C1 ORF転写に 対し）、ダブル35S CaMVプロモーターとCaMVpolyA 終止配列との間にクローニン グし、そして完全発現カセットを二重（binary）ベクター Bin19のの多重クロー ニング部位のBsmHＩ部位の中に導入した。得られる構 築体を pRIBO5BINとし、そして図２に示す。実施例Ｖ−Rz1，Rz2及び／又は Rz3：pRIBO5BIN DeLを担持する遺伝子構築体 この構築体は pRIBO5BIN（実施例IV）より、TLCVのBstBＩ部位（ヌクレオチド 2424）から３′末端に至る 216bpの領域の欠失により得た。得られる構築体をpR IBO5BINDeLとし、そして図３に示す。実施例VI−Rz1，Rz2及び／又は Rz3：pRIBO7BINを担持する遺伝子構築体 ： この構築体は pRIBO5BINDeL（実施例Ｖ）より、TLCVフラグメントの５′末端 （ヌクレオチド1075）から XhoＩ部位（ヌクレオチド2425）に至る 950bpの領域 の除去により得た。得られる構築体を pRIBO7BINとし、そして図４に示す。実施例VII−Rz1，Rz2及び／又は Rz3：pRIBO2BINを担持する遺伝子構築体 ： Rz1 を含む52bpのフラグメントを pRIBO5BIN（実施例IV）よりポリメラーゼ連 鎖反応(PCR)によって増幅させ、そしてアンチセンス方向（C1 ORF転写に対し） で、ダブル35S CaMVプロモーターとCaMVPolyAS終止配列との間にクローニングし 、そして完全発現カセットを二重ベクター Bin19の多重クローニング部位のBamH Ｉ部位の中に導入した。得られる構築性を pRIBO2BINとし、そして図５に示す。実施例VIII−遺伝子導入タバコ細胞系におけるリボザイム遺伝子構築体の発現： 実施例５〜８記載のリボザイム構築体を PCR分析を利用して遺伝子導入タバコ 植物における発現について試験した。 葉のサンプル(150mg)を、温室の中で鉢植えする前に遺伝子導入タバコ細胞系 から集め、そして液体Ｎ2の中で凍結した。サンプルを粉末となるまで粉砕し、 そして 0.5mlの抽出バッファー(0.1Ｍの トリス−ＨCL(pH9)，0.1ＭのNaCl，10mMのEDTA，１％ W／V の SDS及び１％ V／ V のベータメルカプトエタノール含有)及び 0.5mlのフェノールを伴って30Ｓ間 ボルテックスにかけた。この抽出物を12,000ｇで10分遠心し、そして上清画分を 集めた。この上清画分を更にフェノール、次いでフェノール／クロロホルム（１ ：１）で抽出した。全核酸画分を−20℃で酢酸ナトリウム／エタノールで沈殿さ せ、そして 12000ｇで10分遠心した。このペレットを80％ V／V のエタノールで 洗い、乾かし、そして50μｌの減菌水に再懸濁した。 第一ストランドcDNA反応は以上の通りに実施した。核酸サンプルを65℃で５分 、 100mgの CaMV Termプライヤー（５′-TTTACAAATACAAATACATACTAAGGGT ）と全 容量を５mlにおいてアニールした。このプライマーはこれらの転写体から生成し た全てのリボザイム構築体（図６参照）転写体の中に存在しているCaMV終止配列 内の領域に相補性である。 アニールした鋳型に、50mgのトリス−ＨCl (pH8.3)，50mMのＫCl，10mMのMgCl2 ，0.5mM のスペルミジン、10mMの DTT，１単位のリボヌクレアーゼインヒビタ ー及び2.25単位の AMV逆転写酵素を含む５μｌの逆転写酵素混合物を加えた。こ の混合物を42℃で60分、次いで94℃で２分インキュベートした。表示している場 合、コントロール反応を実施し、それにおいては AMV逆転写酵素は、反応体mMト リス−ＨCl (pH9)，1.5mM のMgCl2，1.5mMのMgCl2，0.1％ V／V のTriton X-100 ，200 μＭのdNTP，250 μＭのCaMV Term プライヤー（図６参照）、 0.5単位の Tag DNAポリメラーゼ及び２μｌの第一ストランドcDNA反応混合物から排除して ある。２つの交互の５′末端プライマーを使用し、その位置は添付図面に示して いる： PCR サイクル条件は、94℃で１分、50℃〜55℃で１分、72℃で３分を15〜30サ イクルとした。 PCR生成物は 1.2〜 1.8％ W／V アガロースゲルで分析した。 C3／CaMV Term プライヤー組合せを用いるRIBO5BIN及びRIBO5BINDeL の逆転写 酵素(RT)-PCR 分析はほぼ推定のサイズ、即ち、それぞれ1690bp及び1450bpの DN A生成物を生成した。 R1B ／CaMV Term プライヤー組合せを用いるRIBO5BIN，RIBO5BINDeL 及びRIBO 2BINのRT-PCR分析は、ほぼ推定のサイズ、即ち、それぞれ 504bp， 264bp及び 2 35bpの DNA生成物を生成した。 コントロール反応においては PCR生成物は認められなかった：（ａ）逆転写酵 素なし（ｂ）ベクター配列のみで形質転換された植物由来の核酸サンプル、即ち 、リボザイム配列を含まないもの。このことは、これらのプライマーにより観察 された PCR生成物が、導入したリボザイム構築体の RNA転写体に特異的に由来す ることを実証する。 C3／CaMV Term プライヤー組合せを用いる推定 PCR生成物のサイズは以下の通 りである： １．RIBO5BIN 1690 bp ２．RIBO5BINDel 1450 bp ３．RIBO7BIN − ４．RIBO2BIN − RIB ／CaMV Term プライマー組合せを用いる推定PCR 生成物のサイズは以下の 通りである： １．RIBO5BIN 504 bp ２．RIBO5BINDel 264 bp ３．RIBO7BIN 264 bp ４．RIBO2BIN 235 bp 実施例IX−リボザイム遺伝子の構築 ： ジェミニウィルスのC1 ORFによりコードされる推定アミノ酸配列の対合対比を 調べた（表１）。 サルジニア(Kheyr-Pourら、NAR （1991）19：6763)，タイ（Rochester ら、Vi rology（1990）178：520)），イスラエル（Navotら、Virology（1991）185: 15 1)），オーストラリア（Dry ら、J．Gen．Vir．（1993）74：147）由来の TYVCV ゲノム単離体のヌクレオチド配列の整合は、それらが、ウィルスの複製に必須の ポリペプチドをコードするＣ１転写体の内部フラグメントにおける３つの保存領 域であることを示す。TYLCV-S ゲノムのこのBstBＩ／ Eco0190Ｉ内部フラグメン ト(nt346〜nt982)を DraII／ SmaＩ消化 pBluescriptII SK ＋ファージミド（ST RATAGENE）にクローニングした。このクローンを、最も高度に保存された領域の 中に２つのリボザイムを導入する鋳型として用いた。二及び三次元フォルディン グ分析も、リボザイムによる解裂のためのより理論的なアクセス可能な標的部位 を維持するために行った。 ハンマーヘッドタイプ RNA（図１）の触媒ドメイン、この場合ではタバコ・リ ングスポット・ウィルス（STobRV）のサテライト RNAを、完全に無縁の基質 RNA と共にin transのハンマーヘッド構造をデザインするために用い、これにより標 的部位は推定部位において特異的に解裂する(Haseloff and Gerlach (1989)，Ge ne，82：43-52)。これらの著者により述べられている一般法則に従うと、ハンマ ーヘッドタイプのリボザイムにより解裂される基質 RNAにとっての唯一の要件は 、トリヌクレオチド配列の存在にある（その自己解裂は述べられている）（Perr imanら Gene（1992）113：157）。 TYLCV-SのＣ１転写体の最も高度に保存され た領域上に残っているハンマーヘッドタイプリボザイムのための２つの位置を図 ２及び３に 示す。 ＊位置Ｒ４、ヌクレオチド 407（標的部位 GUC）； ＊位置Ｒ５、ヌクレオチド 430（標的部位 UUC）； これらの位置に TobRVのサテライト RNAの22塩基のハンマーヘッド配列を導入 するため、Kammann ら(Nucl．Acid．Res．（1989）17：5404)に記載のポリメラ ーゼ連鎖反応(PCR)による DNAの迅速挿入突然変異誘発手法を利用した。 この方法は以下の合成オリゴヌクレオチドを必要とする： ２つのハンマーヘッドタイプリボザイムを担持するオリゴＲ４−Ｒ５： 下線配列は ToRSTのサテライトのハンマーヘッド構造に相当する大文字は標的 部位に相当する。 オリゴＲ４−Ｒ５はApplied Biosystems Model 380B DNA 合成装置で合成した ： オリゴＴ７ 配列決定用プライマー（Pharmacia）： オリゴＴ３ 配列決定用プライマー（Pharmacia）： 第一 PCR(PCR)工程において、オリゴＲ４−Ｒ５及びオリゴＴ３配列決定用プ ライマー間の配列を増幅させた。この増幅フラグメントをモレキュラー・シーブ ・カラム(Prime Erase Quick（商標）キット、STRATAGENE)で精製した。第二 PC R(PCRII)工程において、この増幅フラグメントをそれ自身プライマーとして、オ リゴＴ７の配列決定用プライマーと組合せて用いた。 PCR条件は FILのと通りと した： PCR は50mMのＫCl，10mMのトリス−ＨCl pH8.3，1.5mM のMgCl2，300mMづつの dNTP，２Ｕの Tagポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetus），40pgの鋳型 DNA，100p M づつのプライマーを含む全反応容量10０μｌで実施した。 PCRIIは PCRＩと同 じだが、５μｌ（アガロースゲルから推定して 300ngの増幅フラグメント）アッ セイ容量の PCRＩをプライミングに直接用いた。変性：２min 94℃；アニーリン グ２min 40℃；合成３min 72℃；各工程を30サイクル。 アガロース電気泳動を用いる精製後、 PCR生成物をBstBＩで消化し、クレノウ フラグメントでフィル・インし、そして最後にEco0109Ｉで消化した。得られる 679ntフラグメントを SmaＩ／ DraII消化Bluescript SK ＋ベクターにクローニ ングした。クローニング配列を含むクローニングベクターを当業界公知の技術を 利用して細菌宿主XL 1 Blue(STRATAGENE)の中に形質転換し、そして繁殖させた （Maniatis，Molecular cloning，A Laboratory quide，第２版、1939，Cold Sp ring Harbor Laboratory publishers）。 TobRV のサテライト RNAの２つのハンマーヘッド配列の存在はＴ７配列決定用 キット(Pharmacia)を用いる配列分析により確認した。この結果は触媒性Ｒ４及 びＲ５部位の完全挿入を示した。実施例Ｘ−リボザイムプラスミドの構築 ： 図15に示すプラスミドpRIBO5BSはその外のプラスミドの構築のための基礎であ る。このプラスミドは1690bpの５′末端− AseＩフラグメントをもつpBluescrip t SK＋ベクターであり、それは次の位置に３つのハンマーヘッドタイプリボザイ ムをもつTLCV（図４）のＣ１／Ｃ４／Ｃ２／Ｃ３相補性フラグメントに相当する ： −Ｒ１（ヌクレオチド 412、標的部位 CUU）、 −Ｒ２（ヌクレオチド 711、標的部位 CUU）及び −Ｒ３（ヌクレオチド1654、標的部位 GUA）。 プラスミドｐポリリボザイムＥはプラスミドpRIBO5BSより、位置Ｒ２及びＲ３ にある２つのハンマーヘッドタイプ配列間の領域に相当する 877bpの「クレノウ ポリメラーゼを用いてフィル・インした XhoＩ-BclＩ」フラグメントと、 264bp の「５′末端− TthIIIＩ」フラグメントを欠失させることにより得た。このTth IIIＩ部位をクレノウポリメラーゼを用いてフィル・インした。この「Tth III Ｉ−HindIII(pBluescript SK ＋ベクターの部位)フラグメントをアガロースゲル の電気泳動による分離後に単離した。このフラグメントを、マング・ビーン・ヌ クレアーゼフラグメントを用いて消化した SacＩ-XbaＩから予め欠失させた、pB luescript SK＋ベクターのクレノウポリメラーゼを用いてフィル・インしたEcoR Ｉ及びHindIII部位の中にクローニングした。 ポリリボザイムＥは 434個の塩基を含み、そして図５及び６に示す通り３つの リボザイムＲ１（位置28），Ｒ２（位置 327）及びＲ３（位置 399）を含む(pol y R2E-R2)。リボザイムの触媒性ドメインに隣接するアームのサイズは： ＊５′末端からリボザイムＲ１に至る27ヌクレオチド； ＊Ｒ１とＲ２との間の 298ヌクレオチド； ＊Ｒ２とＲ３との間の71ヌクレオチド； ＊リボザイムＲ３から３′末端に至る35ヌクレオチド。 ポリリボザイムＦプラスミドはｐポリリボザイムＥプラスミドに由来する。リ ボザイムＲ１を含むTLCVのレプリカーゼ遺伝子の56bpの「 SmaＩ（pBluescript SK＋ベクターの中の５′末端付近の位置）−SacＩ」フラグメントを、先に記載 の通りにして２つのリボザイムＲ４及びＲ５をもつ TYLCV−サルジニア単離体の レプリカーゼ遺伝子の98bpの「クレノウ−ポリメラーゼを用いてフィル・インし たBstBＩ-SacＩ」フラグメントに置き換えた。変換したフラグメン トは TYLCVとTLCV株間で非常に高度に保存されている領域を有する。TLCVの 365 nt〜 435ntと TYLCV−サルジニア単離体の 370nt〜 440nt領域との間でのヌクレ オチド配列同一性は97％に相当した（図３）。 キメラポリリボザイムＦは２つの異なる起源： TYLCV−サルジニア単離体及び TLCV−オーストラリア単離体を有するレプリカーゼ遺伝子フラグメントを含む。 これらのフラグメントの集成を SacＩ部位において行った。人工ポリリンカーを 用いて２つのフラグメントを集成することも可能である。この非相補性配列の一 体化はポリリボザイムの触媒活性に有害な影響を与えなかった。 ポリリボザイムＦは 479塩基を含み、そして図５及び６に示している通り、４ つのリボザイム、Ｒ４（位置59），Ｒ５（位置83），Ｒ２（位置 372）及びＲ３ （位置 444）を含む。 リボザイムの触媒ドメインに隣接するアームのサイズは以下の通りである： ＊５′末端からリボザイムＲ４に至るまで59ヌクレオチド； ＊リボザイムＲ４とＲ５との間で22ヌクレオチド； ＊リボザイムＲ５とＲ２との間で 288ヌクレオチド； ＊リボザイムＲ２とＲ３との間で71ヌクレオチド； ＊Ｒ３から３′末端に至るまで35ヌクレオチド。 キメラｐポリリボザイムＤはｐポリリボザイムＦに由来する。TLCVに由来する 206bpの「Sac Ｉ-SwaＩ」フラグメントを欠失させた。 SacＩ部位はT4-DNAポリ メラーゼの作用により破壊した。ポリリボザイムＤは 270塩基を含み、そして図 ５及び６に示している通り４つのリボザイム、Ｒ４（位置59），Ｒ５（位置83） 、Ｒ２（位置 163）及びＲ３（位置 235）を含む。 リボザイムの触媒ドメインに隣接するアームのサイズは以下の通 りである： ＊５′末端からリボザイムＲ４に至るまで59ヌクレオチド； ＊リボザイムＲ４とＲ５間で22ヌクレオチド； ＊リボザイムＲ５とＲ２間で79ヌクレオチド； ＊リボザイムＲ２とＲ３間で71ヌクレオチド； ＊リボザイムＲ３から３′末端に至るまで35ヌクレオチド。 ポリリボザイムＥ，Ｆ及びＤの配列を Pharmaciaより供給のＴ７配列決定用キ ットを用いて確認した。 ポリリボザイムＥ，Ｆ及びＤの機能は Pormege由来の「Protocol and Applica tion Book 」に記載のプロトコールに従ってインビトロで試験した。 発現シグナルはポリリボザイムの中に含ませなかった。このため、これらはダ ブル35Ｓプロモーター及びCaMVの35Ｓ RNAのポリ（Ａ）のコントロール下に置い た。 このような構築を実現するため、ダブル35Ｓプロモーター、モノリボザイムＲ １及びCaMVの35Ｓのポリ（Ａ）より成る発現カセットを下記の pRIBO2BINプラス ミドから単離した。 pRIBO2BINプラスミドを SacＩで消化した。 SacＩ部位をT4-DNAポリメラーゼ を用いて平滑末端にした。 線状化 pRIBO2BINプラスミドをSalＩで消化し、発現カセットを含む「 SacＩ フィルド・イン SalＩ」フラグメントをアガロースゲルで構築し、そしてpBlues cript SK＋ベクターの中に「クレノウポリメラーゼを用いてフィル・インした X baＩ及び SalＩ」部位においてクローニングした。 次にモノリボザイムＲ１に相当するHindIII- BamHＩフラグメントを、ｐポリ リボザイムＥ，Ｆ及びＤのそれぞれから単離したポリリボザイムＥ，Ｆ及びＤを 含むHindIII- BamHＩフラグメントに置き換 えた。HindIII- BamHＩフラグメントは発現ベクターにおいて逆方向となってい る。 ポリリボザイムＥ，Ｆ又はＤを有する発現カセットpGA492(An，Plant Physiol ．（1986）81：86)由来の二重ベクター pGAZE（図７）にクローニングした。こ のpGA492ベクターを SacＩ及びSca Ｉで二重消化し、Ｔ４ポリメラーゼを用いて 平滑末端にし、そしてアガロースゲル精製の後にライゲーションした。 排除されたフラグメントはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ 遺伝子のほぼ全体に相当する。このHindIII部位をStratageneにより供給されたH indIII- EcoRＩアダプターによりEcoRＩ部位に変換させもした。pGA492に関し、 pGAZEは植物形質転換のために必要な cis作用要素、例えば T-DNAボーダー、植 物において発現可能な選択マーカー（カナマイシン耐性）、クローニング部位、 及び広宿主域レプリコンを含む。カナマイシン耐性マーカーはtn５のノパリンシ ンターゼコントロール領域及びネオマイシンホスホトランスフェラーゼコード領 域から構築した。 pGAZEベクターをEcoRＩで消化し、そしてクレノウポリメラーゼを用いしフィ ル・インした。ポリリボザイムＥ，Ｆ又はＤを有する発現カセットを含む「 Sac Ｉフィル・イン SalＩ」フラグメントをpGAZE のEcoRＩフィル・イン部位にクロ ーニングした。 得られる組換二重ベクター、 pGAZE−ポリリボザイムＥ，pGAZE −ポリリボザ イムＦ及び pGAZE−ポリリボザイムＤ（図９）を直接形質転換（Holstersら、Mo l．Gen．Genet．（1978）163：181 由来のプロトコール）により、アグロバクテ リア・トウメファシエンス のデスアーム株 LBA4404（Hoekema ら、Nature（1983 ）303：179）の中に導入した。 触媒ドメイン及び隣接アーム（長さ15塩基）を含むモノリボザイ ムＲ１に相当するリボザイムＡ、並びに上記のポリリボザイムＣ（実施例Ｖ）に ついて、上記の通りにして pGAZE及び／又は pGA492 の中に発現カセットを導入 した。 これにより、 pGAZE−リボザイムＡ， pGA492 −リボザイムＡ及び pGAZE−ポ リリボザイムＣ（図８）が得られた。上記の構築体全ての課題の遺伝子をアグロ バクテリアを基礎とする共培養系を利用してトマトに導入した。トマトの形質転 換及び再生はEillattiら（Biotechnology（1987）５：726）に記載の通りにして 実施した。実施例ＸＩ−遺伝子導入植物の分子分析 ＊ RNA分析： 全 RNAをChandlerら(Plant Physiol．（1983）74：47)に従い、グリーンハウ スの中で成育させた遺伝子導入及び非遺伝子導入植物の幼葉から単離した。 RNA をアガロース・ホルムアルデヒドゲルで分離し、そしてニトロセルロース膜に転 写した。そのブロットを課題の遺伝子のラベル化フラグメント又は全体とハイブ リダイズさせた。等量の RNAが各ラインに適用されたかをチェックするため、ニ トロセルロース膜をメチレンブルーで染色した。 ＊ DNA分析： サザンブロット分析のため、全 DNAをDellaportaら(Plant Mol．Biol．Rep． （1983）１：19)に従ってグリーンハウスの中で成育させた遺伝子導入及び非遺 伝子導入植物の幼葉から単離し、制限酵素によってその製造者の仕様書に従って 消化し、アガロースゲルで電気泳動させることにより分離し、そして毛細管作用 によりニトロセルロースに移した。このブロットを課題の遺伝子のラベル化フラ グメント又は全体でプロービングした。実施例ＸII−アグロ接種による種々の構築体により形質転換したトマト植物の T YLCV耐性の評価 TYLCV又はそのクローニング DNAは機械的に導入できないため、アグロ接種技 術（Grimsley ら Plant DNA Infections Agents，Hoho and Schell(編)Springe r，Wien，New york（1987）pp87-107）をクローニング DNAの感染能をアッセイ するために用いた。 TYLCV−サルジニア株ゲノムを二重植物形質転換用ベクターpBin19（Stanley ら EMBO J．（1986）５：1761）の SstＩ部位に挿入し、そしてpBin19のポリリ ンカーから TYLCVの遺伝子内領域を通じて TYLCVの地図位地 152にあるBamHＩ部 位に及ぶ約 600bpのBamHＩフラグメントを欠失させた。次に TYLCVの完全ゲノム ユニットも残りの SstＩ部位に挿入してpBin19中の 1.8量体の TYLCV−ゲノムを 得た。このプラスミドを直接アグロバクテリア・トウメファシエンス株 LBA4404 に導入した。アグロバクテリア・トウメファシエンス培養物を28℃で約48時間増 殖させた。この細胞をペレット化し、そして水で２回洗い、そして最初の減菌水 の１／10の量に再懸濁した。 ３〜４葉段階にある若い形質転換トマト植物を18ゲージ針を用いて、濃縮アグ ロバクテリアにより３枚の最も若い葉の葉柄に接種した。 この植物を密閉成育槽の中に16ｈ、日光のもとで24℃、70％の相対湿度で入れ ておいた。 当業者は本発明は本発明の範囲で遠脱することなく改良できることを予測でき るであろう。Detailed Description of the Invention   DNA virus ribozyme   The present invention provides a synthetic ribozyme capable of catalyzing the cleavage of virus-specific mRNA. And its mutants and derivatives, and more particularly, DNA virus specific For specific mRNA. The invention further provides such ribozymes in the production of transgenic cells. It is able to inhibit the use of immunity, and especially the infection by these viruses The present invention relates to transgenic plant cells and plants.   The virus is responsible for numerous severe and potentially serious diseases of humans, animals and plants Is a factor. Plant viruses especially have the ability to destroy or reduce cereal produce, Or it has a detrimental effect on the agricultural and horticultural industry at economically meaningful levels.   Viruses of particular importance in this regard are DNA viruses such as Kaurimo. Virus (Caulimoviruse) and Geminivirus (Geminviruse), and two kinds of Unclassified virus, or subterranean clover stunt virus (S ubterranean Clover Stunt Virus) (SCSV,Shu and helms, Virology, 1986, 16 7, 38-49) and Coconut Foliar Devirus cay Virus) (CFDV,Rohde et al., Virology, 1990, 176, 648-51). Gemini Viruses are a group of small viruses that infect plant cells. These are about 29 Called "virion sense" or "positive sense" DNA of less than 00 base pairs Single-stranded circular DNA. Infection of host cells with geminivirus causes The luscoat protein is removed, and the virion sense strand and "phase A double-stranded DNA replicative form comprising a "complementary / sense" strand Is synthesized. Transcription consists of virion sense strands and "complementarity sense" strands. Originated from both lands, producing (+) and (-) sense RNA transcripts, respectively. Rise up.   Examples of Gemini viruses are Mayes Streak Virus (MSV), Bean Golden Mosaic Virus (BGMV), African Cassava Mosaic Ruth (ACMV), Chloris Striate M osaic Virus: CSMV), tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), Tomato Golden Mosaic Virus (TGMV), Beat Curly Top Virus (BCTV) and Tomato Leaf Curl Virus (TLCV) (See also the viruses listed in Table 1 below). These viruses are leaves Economic importance in cultivated plants, including curling and other leaf deformation Cause a disease that has been. Especially TLCV is a terrible product in northern Australia. Causes material damage and infected plants are TYLCV in the Middle East and Europe Symptoms similar to those caused by. For convenience, and for some reason Unless otherwise stated, TLCV and TYLCV are used as synonyms, and TLCV Israel and References herein to Sardinia isolates should be construed as TYLCV isolates. is there. Generally, "TLCV" means Australian "isolate."   Geminiviruses replicate in the nuclei of infected cells and are associated with single-stranded DNA-containing colloids. (E.g. QX174) as well as certain Staphylococcus aureus (Staphyloc occus aureus )as well asBacillus subtilis(Bacillus subtilis) Plasmid Thought to use a rolling circle mechanism similar to that used by Can be Other known plant viruses, such as other plant DNA viruses, are RNA intermediate Replicate through the body.   Geminivirus particles accumulate in the nucleus of infected cells, where they probably replicate DNA. And virus assembly (Davies et al., J. Cell. Sci (Suppl) (1987) 7: 9). 5-107). Its putative replicative form has a chromatin-like structure and is a covalently closed double-stranded chain of approximately 2.7 kb. Circular circular DNA, and appears to be a transcriptionally active viral form (Abouzid et al. Mol. . Gen. Genet. (1988) 212: 252-258). Based on host range and insect vector They are usually divided into 3 subgroups. That is, it infects a dicotyledon host, It has a bipartite genome and is a white-fly vector, Bemisia taba A virus (ACMV, Alican mosquito) transmitted by Bemisia tabaci (Genn.) Saba mosaic virus (Stanley and Gay, Nature (1983) 301: 260); TG MV, tomato colden mosaic virus (HamiHonEt al., EMBO J. (1984) 3: 2197); BGMV, Bean Golden Mosaic Virus (Horwarth et al., PNA) S (1985) 82: 3512); having a segmental genome and infecting gramineous hosts. That are transmitted by the leaf hopper vector (MSV, Maize Streak Ruth (Nigeria strain,MullinauxEMBO J. et al. (1984) 3: 3063; Kenyan ) Stock, Havel NAR (1984) 12: 7359); DSV, Digital Streak Wee Ruth (Donson  Et al., Virology (1987) 161: 160); WDV, Wheat Dwar. F virus (Mac Dowell  EMBO J. et al. (1985) 4: 2173)); and the one-segment system Those that have a genome and are transmitted by leaf hoppers (BCTV, beat car) Lee Top Virus (StanleyEt al., EMBO J. (1986) 5: 1761); ToYDV, Tobacco Yellow Dwarf Virus (Maris et al., Virology (1992) 187 : 633)) or those transmitted by termites (TYLCV, tomato yellow leaf) Karl virus (Israel isolate,NavetEt al., Virology (1991) 185: 151. A Sardinian isolate,Kheyr-Pour  NAT (1 991) 19: 6763), TLCV, tomato leaf curl virus (Australia only) Detachment,DryEt al. Gen. Virol. (1993) 74: 147)).   Due to the economic importance of plant DNA viruses, especially geminiviruses, disease resistance There was a demand for law.   One method is to artificially generate genes using antisense RNA that targets complementary RNA. To suppress the expression (Helene, C. & TolumeJ. J. Biochim. Biophys. Ac ta 1049: 99-125, 1990;Vander KroBiotechniques 6: 958-976, 1988). Antisense RNA is effectively used to control viral infections of bacterial and animal tissues Has been (Helene, C & Tolume, J. et al. J. (Above), its use in plants is limited Only the successes that have been met (Van Del Elzen,P. J. M. Plant Mol. B iol. 13: 337-346, 1989;Powell, P. A.Et al Proc. Nad. Aca. Sci. USA 86:69 49-6952, 1989).   In fact, cucumber mosaic virus (CMV) antisense RNA to another area Transgenic plants expressing irrational are irrational with only very low levels of antisense RNA. It was not generally resistant to CMV infection, except for one system that generated it (Rezaian et al. , Plant Mol. Biol. (1988) 11: 463). Antisense is responsible for this resistance There is no evidence. PVX coat protein R in transgenic plants in potato Antisense to NA sequences protected against PVX only at low levels of inoculation (H emenway et al., EMBO J. (1988) 7: 1273).   The two main problems are countering replication systems that can rapidly produce large amounts of viral nucleic acid. The amount of antisense and viral RNA required to induce , While antisense transcripts appear to be produced in the nucleus.   For geminiviruses, antisense technology is Antisense of ALI gene encoded by TGMV virus transcribed and fused to the offspring Has been applied to tobacco plants expressingDay A. G.LaProc. Nad. A cad. Sci. USA 88: 6721-6725, 1991). Gene expressing antisense transcript Transgenic system showed low symptom onset, but this transgenic plant may be barren , Which would impede mass production of virus resistant plants.   In the research leading up to the present invention, the present inventors have adopted the method of ribozyme. To eliminate the shortcomings of the antisense method of producing plant DNA virus resistant plants by Tried.   Ribozymes are synthetic RNA molecules with highly specific endoribonuclease activity. It is. In particular, these are nucleotide sequences for at least part of the target RNA. Contains a hybridizing region that is complementary and a catalytic region that cleaves the target RNA. It consists of. RibozymesHaseloff J. and Gerlach L. Nature 334: 586-591 And international patent application WO 89/05852.   However, despite the existence of ribozyme technology, to date it is a plant  DNA viruses, and especially plant single-stranded DNA viruses like Geminivirus Is not used. In fact, successful use of ribozymes against DNA viruses In terms of its highly complex replication and transcription mechanisms, as well as such various Achievement of manipulation and intervening levels of different target sequences in the viral life cycle Can be predicted from the lack of information currently available in considering the exact level of It wasn't. For example, Replicase C1Is the "rolling circle" replication stage , But not at the pre-stage of formation of the double-stranded replicative form of the virus. Defined (ElmerEt al., Nucl. Acid. Res., 1988, 16, p7043-7060).   In accordance with the present invention, we can target plant DNA viruses. We succeeded in developing a ribozyme that can To provide economically valuable and efficient means of   Accordingly, one aspect of the invention comprises a hybridizing region and a catalytic region. For ribozymes, this hybridizing region is the DNA portion of the DNA virus. Can hybridize to at least a portion of the target RNA transcribed from the offspring, The catalytic region is now capable of cleaving this target mRNA sequence, which  DNA virus replication, infection and / or assembly can be substantially suppressed.   More particularly, the invention relates to ribozymes comprising a hybridizing region and a catalytic region. Im, where this hybridizing region is the plant single-stranded DNA virus A marker transcribed from the DNA sequence of the sense or complementary DNA strand. Of the catalytic mRNA, wherein the catalytic region Can cleave this target mRNA sequence, which allows the DNA virus to replicate. , Infection and / or assembly can be substantially suppressed.   For convenience, reference to single-stranded DNA virus refers to its double-stranded replicative form. Including all references.   In a preferred embodiment, the plant single-stranded DNA virus is Geminivirus, The target mRNA then encodes a protein essential for replication. "Required" means Specific to the virus genome (or its complementary form) and has a specific function, eg Tandems required or substantially required for replication, infection and / or virus assembly It means quality. A decrease in the level of an essential protein is a decrease in the level of its function, That is, it means a decrease in the level of a specific function. Preferably of the essential protein The level (or level of specific function) is the level of essential protein without ribozyme. (Or level of specific function) 20% lower, more preferably at least 30% lower, even more preferably at least 45% lower, even more preferably at least 55% lower, and even more preferably 65-75% lower, and even more preferably 85-90% lower   Conveniently, the level of essential protein (or the level of a particular function) is determined in vivo. Within the range of biological variations in. Such a trial Testing can be performed, for example, by in vitro analysis of mRNA degradation products .   According to one preferred aspect of the present invention, a hybridizing region and a catalytic region are included. A ribozyme consisting of Evaluation mRNA transcribed from virion sense DNA molecule or the virion sense DNA Can hybridize to at least a portion of a DNA molecule complementary to Which encodes a protein essential for the replication of the Geminivirus in the cell. The catalytic region can then cleave the target mRNA sequence, which allows the Gemini virus to cleave. It is possible to substantially suppress the duplication of ruth.   In an even more preferred embodiment, the target mRNA sequence is present in low amounts in the cell. doing. Examples of such mRNA molecules are, for example, in Geminiviruses, such as TLCV or  C1 gene in TYLCV or its equivalent, and its mutants, derivatives and It is a mutant. TLCV single-stranded DNA has 6 open reading frames (ORFs) , Two of which are replicative form DNA produced in leaf curl infected plants. On its sense strand, and four on its complement sense strand. It is in. Analysis of viral mRNAs in infected plant cells is essential for replication The mRNA encoding the C1 gene is different from other mRNA transcripts that are specific to the TLCV genome. It was shown that it was recognized in a much smaller amount. The equivalent form of the C1 gene is gene L 1, AL1 and AC1 is included, and references to "C1 gene" herein are the same. It is understood to include equivalents.   Other targets include C2, C3 and C4 transcripts, which are virion centers. Trans-action of gene expression, as well as viral infection and development of disease phenotype. It plays a role in both the present and the onset of disease.   According to another preferred embodiment, the present invention comprises a hybridizing region and a catalytic region. A ribozyme consisting of And in particular at least part of the target mRNA sequence encoding the C1 gene of TLCV Can be lysed, and wherein the catalytic region can cleave the target mRNA sequence, Can substantially suppress the replication of said Geminivirus (eg TLCV You.   In a preferred embodiment, the ribozyme of the invention has endoribonuclease activity. And a nucleic acid compound capable of inhibiting the replication, infection or assembly of a DNA virus The compound may comprise at least one unit "R" having the formula:                       5 '(X-Y-X') 3 ' (here:   X and X'are each independently a nucleotide sequence having at least 4 bases. (−) Sense RNA transcripts of a viral genome or DNA virus Is complementary to at least a portion of any of the   Y represents the catalytic region of the ribozyme).   According to this variant, this target RNA is preferably a (−) sense RNA transcript, The DNA virus genome, especially the complementation / separation of the double-stranded replicative form of Geminivirus. MRNA derived from the transcription of the first strand is there. This sequence X and X'is therefore at least part of the (-) sense RNA transcript. Complementary to (at least partially complementary to single-stranded genomic DNA Is equivalent to).   The sequences X and X ′, which will be referred to as “hybridized arms” below, are the sequences for the substrate RNA. Both stable hybridization of the bozyme and efficient cleavage of this substrate It is long enough to enable. Usually X and X'are each at least 4 Has a length of nucleotides, and preferably at least 6 nucleotides . The upper limit of the length of this hybridizing arm generally depends on the length of the target substrate. Determined and can be 800 or 1000 bases or more in length. Suitable length is 6 to 3 00 bases, for example 10 to 150 bases. Substrate or partial substrate The complementarity of the bridging arm usually spans the entire length of the hybridizing arm.   The catalytic region "Y" of a ribozyme may be any type of suitable ribozyme, such as "ha". Derived from "Nimmerhead" or "hairpin". Patent applications for these ribozymes  It is described in each of EP-A-321201 and EP-A-360257. Especially preferred The "hammerhead" catalytic area (see, for example, FIG. 7) and is described in detail below. I will explain it.   Ribozymes have one "R" unit of formula [X-Y-X '] and one catalytic region. It may be a "monoribozyme" having only a region.   Ribozymes, on the other hand, comprise multiple "R" units and have the general formula: R1-R2 … Rn(Where n> 1, and may have values as high as 50 or 100) It may be a "polyribozyme". In fact, "n" values of about 5-10 are frequent. Obedience Thus, polyribozymes consist of a series of ribozymes from the head to the tail, The Zym "R" or "X-Y-X '" units are unit motifs. In short, This is a series of catalytic regions linked to each other by hybridizing arms. What after Unless otherwise indicated, X represented by the "R" unit of all ribozymes And X'motif aggregates are collectively a "complementarity" or "hybridizing" sequence Call. Polyribozymes usually act as a "single molecule" on a single transcript . That is, the cleavage site of each catalyst region is on the same transcript.   The exact structure of the polyribozyme actually depends mainly on the type of substrate to be cleaved. Is determined. The number of catalytic regions, their position in the complementary sequence, and two consecutive touches. The distance between media regions depends largely on the position of the "tribasic target" site in the substrate.   The “hammerhead” ribozyme targets the substrate to the “target” site XXX, preferably XUX ( Where X represents any of the four bases A, C, G, U, and U is the (Representing le) is cleaved immediately downstream. One particularly preferred target sequence is X0UY ( Where X0Is any ribonucleotide, U is uracil, and Y is adenine, Represents cytosine or uracil). X0UY forms part of the base pair flanking region and Y is not a base pair. Limited to suitable triplets that define X + OUY No, GUC, GUA, GUU, UUC and CUC are included. Other target sites, for example CAC, UAC and AAC are also possible but less efficient.PerrimanEt al. (Gene, 1992, 113: 15) 7) studied a long target site for the hammerhead ribozyme. GUC, UUC, The CUC, GUA and GUU targets showed comparable progression studies. For GUG, the usual Bozyme was unable to induce cleavage, but the stem-loop changes in the catalytic domain It resulted in the formation of weakly active ribosomes. Central position, showing significant recognizable cleavage There were some targets with nucleotides other than U in position.   In the case of "hairpin" type ribozymes, the preferred target sequence is AG It is UC.   These target sequences are important in the structure and function of polyribozymes, The reason is that they not only suggest the position of cleavage of the substrate, This is because it also defines the position that must be inserted into the complementary sequence. fact , Each catalytic region of the polyribozyme is in the complementary sequence corresponding to the XUX site of the transcript. Must be on site. For example, if one XUX site is C1At position 412 of the gene If there is, and the other is at 711, the catalytic region is at the position corresponding to 412 of the complementary sequence. Position and the other at the position corresponding to 711. In other words, each "R" unit X and X'hybridizing sequences flanking the catalytic domain in It is chosen to be complementary to the base around the targeted XUX site.   Motif XUX is a very frequently found motif in RNA sequences. example For example, on average, every 64 bases in a sequence with random and evenly distributed bases is a GUC model. I have a chief. This means that the substrate usually contains multiple XUX cleavage sites. You. As mentioned above, the catalytic region of the polyribozyme has a complementary sequence corresponding to the XUX site. In position. However, in order to obtain efficient cleavage according to the present invention, each X It is not necessary to include the catalytic region for the UX target sequence. Included in polyribozyme Total number of catalytic regions is usually equal to the total number of XUX sites present in the transcription target , Or less. The polyribozyme variants of the present invention are therefore highly variable in number. Of the catalytic region. For example, C of TLCV1In the case of polyribozyme, When the row is GUC, it may contain from about 2 to about 6 catalytic regions. XUX site in the substrate When it is decided to include in the complementary sequence a smaller number of catalytic regions than Selection of the site of choice can be made according to the following criteria:   a) the distance between the two targeted XUX sites, and thus the two catalytic regions in the ribozyme The region distance is the hybridizing arm of the polyribozyme between the corresponding catalytic regions. Can hybridize with the substrate in a stable condition, and hybridize with the catalytic regions Must be long enough to prevent them. At least 8 bases, and good A distance of at least 14 bases, for example about 20 bases is very convenient. Muro Well, this criterion is only when the substrates contain XUX sites very close to each other. This is something that must be taken into consideration. Otherwise, the XUX sites of the substrate are also This selection criterion is not important if they are separated by more than 8-20 bases.   b) the targeted XUX is preferably on a part of the substrate that does not have significant secondary structure . This enhances the access of the ribozyme to the substrate and its effect. Tertiary An original folding analysis may be performed.   c) targeting XUX sites between different strains of one and the same virus, or Phases that are conserved among mutants or mutants, or between different pedigree viruses It can form part of the homosexual domain. Aspects of the invention are considered in detail below.   d) Other criteria for selecting the target XUX site are the endogenous plants to be transformed. The lack of homology with the gene. In fact, although rare, some viruses It has homologous sequences in the genome. Therefore, the XUX part in such an array It is important to avoid rank.   In the ribozyme of the present invention, the hybridizing X'in any one "R" unit The and X motifs are often complementary to the adjacent continuum of the substrate. in this case , The ribozyme is considered to be "symmetrical" and has two catalytic domains. Due to the complementarity of adjacent arms of It works at the specific site determined by A preferred example of this symmetrical ribozyme is "pure". "Complementary" ribozymes, in which certain "R" units of the 3'hybridizer The 5'hybridizing arm of the is arm and the adjacent "R" unit has a (-) sense R It is complementary to a contiguous sequence in the NA transcript or DNA genome.   In other words, in this aspect, the aggregates of hybridizing arms pair with the target sequence. A non-intervening complementary sequence. This type of polyribozyme has its sequence Considered to be a complementary sequence in which multiple ribozyme catalytic regions are inserted at individual sites in It can be obtained. This complementary sequence is capable of hybridizing with the entire length of the target transcript. The other , It can hybridize only with fragments of the target transcript. Featured flag The fragment contains at least two catalytic regions within the corresponding sequence of the polyribozyme. It has to be long enough to be able to. In general, for this variant, the complementary sequence The row length is approximately 40-2000 without counting the catalytic regions (total of hybridizing arms). It can be a base. A length of 400 to 1000 is highly preferred.   According to the variants of the present invention, ribozymes are preferred to being "symmetrical" as described above. May be or have at least one "R" unit that is "asymmetric" . This means that the X and X'hybridizing arms within a given "R" unit are It is meant to be complementary to two sequences that are non-contiguous within. This is a thing In effect, the catalytic domain of the "asymmetric" "R" unit is the two different XUX moieties in the substrate. It means that it can act at the position. One of which is complementary to its 5'arm XUX site flanking a sequence that is sexual, and the other is complementary to the 3'arm The XUX site flanks the sequence that is sex. This type of ribozyme is specially constructed Or may be the result of spontaneous rearrangement during synthesis. other Direction 3'adjacent The position of the sequences to which the arms hybridize, and the 5'adjacent arms hybridize The positions of the sequences to be separated are separated by hundreds of bases or by as little as 10 or 20 bases. It can be done. This type of structure is aligned because it is in the catalytic region. Because it gives a meaningful "economy"; for example, the five "asymmetries" " The "R" unit can achieve the same result as the 10 symmetric units.   According to another very preferred aspect of the present invention,                       R1-R2-RThree… Rn In a polyribozyme having a certain number of "R" units of 3'hybridizer 5'hybridizing arm of the X (X ') and the adjacent "R" unit (-) Complementary to non-contiguous portion of sense RNA transcript. This type of poly The ribozyme is hereinafter referred to as "short arm polyribozyme".   The structure of such a polyribozyme is basically complementary to the target sequence. Sequence, in which the ribozyme catalytic region is buried, and it is It has the drawback of complementary sequences. The distance between the two catalytic regions in this polyribozyme is Shorter than the distance between the corresponding XUX sites in the target sequence. The distance between ribozymes is the substrate May be significantly smaller in relation to the distance between the corresponding target sites in Two adjacent target XUX sites in the quality are separated by a distance of 1000 nucleotides Then, the distance between the catalytic regions of this "short arm ribozyme" is 30 or 40 nucleotides. It may be as short as Ochid. Therefore, 90% or more of the length of the hybridizing sequence May be reduced. The shortest length between two adjacent catalytic regions is usually about 8 Otide, and preferably at least 20 nucleotides. The present inventors Surprisingly, such a short hybridizing sequence allows the polyribozyme to act as a substrate. It does not prevent effective tearing, and in fact It shows that the efficiency of deactivation can be improved in many cases.   For example, reducing the length of complementary sequences can lead to inactivation of ribozymes in secondary structures. Avoid formation problems. That is, for a given length of ribozyme molecule, the substrate More catalytic regions may be inserted that target more cleavage sites in it.   Furthermore, the use of short-arm polyribozymes only allows for a partial sequence of the substrate. It means that an effective polyribozyme can be constructed even when it is unknown.  It is sufficient to know 10 or 15 bases around the XUX target site.   Another important advantage is that as a short hybridizing arm, it will be used exclusively for different viruses. , Sequences that are conserved in the same type of virus can be used. There is to be able to. In this way, various viruses can Can be inactivated by the same polyribozyme even though they are totally dissimilar.   Finally, the small size of the molecule allows for easier and more economical synthesis. Book The functional properties of the "short arm" ribozymes of the invention are That is, the various catalytic regions can act independently of each other.   All of the polyribozymes of the present invention are "long arm" and "short arm" ribozymes. And mixtures of "symmetric" and "asymmetric" ribozymes. You. On the other hand, it has only long arm ribozymes or short arms only. , Or only asymmetry, etc. may be included. Ribozyme structure is therefore optimized and tested I can do it.   According to a further aspect of the invention, the hybridizing arm of this polyribozyme is It can be derived from at least two viruses. Such polyribozyme will be referred to as "texture" It is called "La polyribozyme". Examples of this type of construct include TLCV and TYLCV A mixture of derived sequences, eg Examples include Sardinia, Israel or Tunisia strains. This type of polyribo Zym also ensures the inactivation of both types of viruses if they exist together. Or allow the use of a single construct in different geographic areas.   According to a further aspect of the invention, the polyribozyme comprises two consecutive "R" units. Has a length of at least 4 bases between, and (-) sense RNA transcript or DNA It may include non-complementary sequences (A) that are not complementary to the genome.   The non-complementary sequence of this polyribozyme can have the correct function, eg It may be a coding sequence which may be used to select transformants, or additionally DNA Acts on a substrate other than the main target of the virus or cis in a part of polyribozyme It may consist of a sequence containing the ribozyme which acts. It is generally for cloning Or an adapter that aids in the construction of the chimeric polyribozyme. This The non-complementary sequence of is usually 4 to 500 bases, for example 20 to 100 bases in length. Multiple When there are non-complementary sequences of, they together form about 90 of the length of the polyribozyme. %, For example 50%. Such non-complementary sequences are usually complementary sequences X and And a part of X ′, but at least four immediately adjacent to the catalytic domain Leave complementary bases.   According to the most preferred embodiment, the ribozyme of the invention is a variant of the same strain or Between mutants, strains of the same virus type, or between different types of viruses Hybridizing arms are complementary to one or more highly conserved regions Build to be   Various open reading frames of Gemini virus, namely V1 and V2 , Deduced amino acid sequences encoded by C1, C2, C3 and C4 (For example, see the documents listed in Table 1. thing). For C1 replicase polypeptides, the maximum between TLCV and TYLCV-I Greater homology was associated with 83% homology. C1 open lead between TLCV and TYLCV-S There was 79% amino acid identity on the in-frame.   This comparison compares TYLCV to TLCV in Israel, Sardinia and Tunisia. Similar homology was found when carried out in detachment (see Table 1). Commentary on Table 1   For 1-14, the amino acid identity is the program Best Fit of the UWGCG-Sequen. Shown in% by ce analysis package. Word size (K-tuple) is 2, gap weight is 2.0, and gap length weight is It was set to 0.1. Program FastA has brought about the same relationship.   For 15-21, amino acid identity was determined using the structure-gene contrast matrix, PC Calculated using the PALIGN program of the / GENE Sequence analysis package (O Open gap cost value 10; unit gap cost value 10). ABMVA: Abutilon mosaic virus DNA A; ACMVA: American Cassava Mosaic Virus DNA A; BGMVA: Bean Golden Mosaic Virus DNA A; ICMV: Indian Cassava Mosaic Virus DNA A; SqlCV: Squash leaf curl virus DNA A; PYMVA: Potato Yellow Mosaic Virus DNA A; TGMVA: Tomato Golden Mosaic Virus DNA A; TYLCV-I: tomato yellow leaf curl virus Israel isolate; TYLCV-S: tomato yellow leaf curl virus Thai isolate; TLCV: tomato leaf curl virus; BCTV: Beat Curly Top Virus; TobYDV: Tobacco Yellow Dwarf Virus; MSV: Maize Streak Virus; WDV: Wheat Dwarf Will Su.   The results summarized in the table areDry(J. Gen. Virol. (1993) 74.147) andKheyr-pour (Nucl. Acid. Res. (1991) 19: 6763). TYLCV and TLCV 3 single Sequence diversity between isolates is usually very high among different geminivirus isolates or strains. For high sequence similarity In sharp contrast. For example, the DNA sequences of ACMV Kenya and Nigeria isolates. Show 96% identity, and MSV Kenya, Nigeria and South Africa isolates The bodies differ by up to about 2%. Concerned for the strong sequence diversity between the three isolates of TYLCV and TLCV However, we compared the C1 RNA transcripts and demonstrated three very high levels of conservation. The area was identified. The two are shown in FIG. These areas are as follows (below The number below is how to count TLCV of complementation / sense transcripts).   1. Almost 365-435   2. Almost 634-737   3. Almost 895-972   These three TLCV isolates (Australia, Israel and Sardinia respectively) The nucleotide sequence of the C1 gene in (from a) is shown in FIG. C1 inheritance from TLCV The complete nucleotide sequence of the offspring isMullinaux Virology, 193: 414-423, 1993 andDry Et al. Gen. Virol., 74: 147-151, 1993. This israel The isolate isNavotEt al., Virology, 185: 151-161, 1991, and monkeys. Zinnia isolate isKhyer-PourNucl. Acid. Res. 19: 6763-6769, disclosed by 1991 Have been.   Polyribozymes constructed with target sites in these conserved regions are therefore It can be used to ensure that the marginal strain or mutant is inactivated. the above If the polyribozyme is a deletion short arm version, If the soybean arms correspond exclusively to the storage areas, the allocation between the storage areas is Row diversity affects efficient hybridization of polyribozymes to substrates. Does not affect.   According to this aspect of the invention, a "conserved region" is 100% over a length of about 20 bases. Are considered to have homology with. In general, this homology Can be about 90% over 30 bases. Ribozymes R1, R4, R5 and R2 are , Designed to fit within these storage areas, as shown in the examples below. You.   Therefore, according to this aspect, the invention includes a hybridizing region and a catalytic region. A ribozyme consisting of Of at least two variants of TLCV, and in particular of at least two variants of TLCV Hybridizes to at least part of the target mRNA sequence encoding the C1 gene, and The catalytic region is then able to cleave the target mRNA sequence, which allows the gem Niviruses (eg TLCV, TYLC, and mutants, derivatives and variants thereof) The present invention relates to a ribozyme capable of substantially suppressing the replication of A.   The polyribozyme of the present invention usually consists of RNA. Nevertheless, normal polyribo A part of the zym, for example a hybridizing arm or part of that arm, or In addition, a part of the catalyst area, especially the "loop" is provided on condition that the catalytic activity is maintained. Part may be replaced by DNA (for example, the DNA described in International Patent Application WO-9119789 See RNA Replacement).   As long as the catalytic region is taken into consideration, the ribozyme of the present invention is represented by the molecule of the following formula (I). You can: (In the formula, (X)nAnd (X)n'Is substantially complementary to the mRNA sequence of the DNA virus Ribonucleotide sequence; the sum of n and n'may be the same or different. Ku; (*) Represents base pairing between complementary ribonucleotides; Y is any ribonucleotide. Represents a cleotide and each Y may be the same or different; Y'and Y "are At least one of its entire length must allow for base pairing between the oligonucleotides. Between parts are represented by complementary sequence ribonucleotides, or Y'and Y "are taken together. Form a single RNA sequence, where at least part of this sequence is complementary. Comprising a stem formed by base pairing between sex nucleotides; and Is an additional nucleotide selected from the group consisting of A, G, C or U.1Behind A Has been inserted into).   In another embodiment, the ribozyme is as described in formula (II): (In the formula, (X)nAnd (X)n'Is a DNA virus, and especially a Gemini virus, For example, showing a ribonucleotide sequence that is substantially complementary to TLCV mRNA; Y represents any ribonucleotide, and each Y residue is the same or different. Well; (*) represents base pairing between complementary nucleotides; n and n'are As defined; B is a bond, base pairing, ribonucleotide or at least 2 Represents an oligoribonucleotide containing 1 ribonucleotide; m and m ′ are 1 And may be the same or different; and, optionally, A, G, C or Is an additional nucleotide selected from either U1Inserted behind A ).   In a preferred embodiment, the ribozyme is as described in formula (III): (In the formula, (X)nAnd (X)n'Is a DNA virus, and especially a Gemini virus, For example, represents a ribonucleotide that is substantially complementary to the mRNA of TLCV; Y is any , And each Y residue may be the same or different; *) Represents base pairing between complementary ribonucleotides; n and n ′ are defined above Is the street).   Preferably the DNA virus is a single stranded DNA virus. Preferably, The single-stranded DNA virus of is a geminivirus. Most preferably this gem Nivirus is TLCV, and (X)nAnd (X)n′ Is the region of C1 gene mRNA Represents a sequence capable of hybridizing to   In the most preferred embodiment, (X)nAnd (X)n′ Is TLCV or TYL shown in FIG. It hybridizes to the C1 C1 gene mRNA transcript. It is body-specific and comprises the nucleotide sequence described below: as well as   The catalytic region of the above and FIG. 7 has a conserved structure and sequence, but some nucleotides Recognized that it can be deleted, inserted, substituted or modified without impairing the ribozyme activity of Was done. The present invention provides these modifications provided that their catalytic activity is preserved. Comprising the use of a catalytic region. This activity can be confirmed using the following test.   For example, one or more nucleotides in the catalytic region of Formulas I, II and III are Cleotide-containing bases such as adenine, guanine, cytosine, methylcytosine, Uracil, thymine, xanthine, hypoxanthine, inosine or other methyl It can be converted by a modified base. "Conservation" by forming the first base pairing of the catalytic loop Bases CG can replace UA (KoizumiFEBS Letts. 228, 2, 228-230 , 1988).   The nucleotides in the catalytic region shown in FIG. 7 may also be chemically modified. This nucleotide It consists of a base, a sugar and a monophosphate group. Each of these groups may be modified. Scarecrow `` Principles of Nucleic Acid Structure '' (Wolfran Sanger, Sprin ger Verlag, New York, 1 984). For example, this base can be halogen, hydroxy, amino, It withstands substitution of alkyl, azido, nitro, phenyl groups, etc. Of this nucleotide The sugar component is a substitution of a secondary hydroxyl group with a halogeno, amino or azido group or 2 It may also be overlaid with modifications such as'methylation.   The phosphate group of a nucleotide is linked to phosphoramidate, phosphorothioate and phosphate. Modified by the conversion of oxygen by N, S or C to give each of the honates. Can be This latter may exhibit useful pharmacokinetic properties.   The bases and / or nucleotides of the catalytic domain are substituted by substituents such as tyrosine or hist It may also have amino acids such as gin.   According to an embodiment of the present invention, the ribozyme is shown as the catalytic region in FIG. It may comprise one or more structures. This structure, the so-called "minizyme Is described in International Patent Application WO-A-9119789. This is a "hammerhead" tag Ip shows the catalytic region, the "loop" of which is replaced by a "P" group. P is G1A covalent bond with A, one or more nucleotides (RNA or DNA, Or mixtures, or the above derivatives), or any atom that does not affect the catalytic activity Alternatively, it may be an atomic group other than nucleotides. P represents multiple nucleotides When omitted, it may include internal base pairing. Of the nucleotides that make up the group "P" The sequence and number are not critical and may be between 1 and 20 nucleotides, for example It is preferably 1 to 6. Select sequences lacking Watson-Crick type internal base pairing Preferably.   The catalytic activity of the ribozyme of the present invention is determined by ribozyme or post-transcriptional ribozyme In vitro by contacting the resulting sequence with a substrate and then demonstrating cleavage. You can check with. In vitro cleavage reaction The experimental conditions for are as follows: the temperature is 4 to 60 ° C., and preferably 20 to 55. C, pH about 7.0-9.0, divalent metal, e.g. Mg2+1-100 mM (preferably 1-20 mM) in the presence. Polyribozyme is usually present in an equimolar ratio to the substrate, or in excess. You. The in vitro cleavage reaction is conveniently performed by Lamb and Hay (J. Gen. Virol., 1990, 71). , 2257-2264). This document was inserted into a plasmid For the production of ribozymes from isolated oligodeoxyribonucleotides B. Appropriate conditions for transcription are also mentioned.   In vitro cleavage conditions are those that naturally occur in cells.   In accordance with the aspects and aspects of the invention described above, the ribozyme can be used to target mRNA sequences. Having a hybridizing arm that is “hybridizing” or “complementary” Be told. Such hybridization and complementation, as used herein, refers to target Two lines sufficient to form a sufficiently stable structure so that triplet cleavage occurs It is defined as the degree of chain formation. Depending on the target sequence, this ribozyme and mRNA The secondary structure of ribozyme is the hybrid mRNA of the target mRNA sequence and one or both of the ribozymes. Preferably about 5-10 or less, more preferably about 3-5, and even more Preferably, it will pair with 1 to 3 bases or less. Total length of hybridizing arm , No more than 10% of the pairings should occur. Accordingly, the present invention is described herein. Ribozymes, especially Rz1, Rz2, Rz3, Rz4 and Rz5, polyribozymes containing them , And any or all functional mutants, derivatives, parts, homologues or Extends to analogues. Examples of such mutants include the ribozyme hybridizing region and And / or catalytic region with one or more nucleotide substitutions, deletions and / or additions However, such modified ribozymes retain the ability to cleave the target mRNA sequence. The condition is that   In another aspect, the invention comprises a hybridizing domain and a catalytic domain. Ribozyme that binds to the TLCV or TYLCV Is substantially complementary to the nucleotide sequence in the mRNA molecule encoding the C1 gene It comprises a nucleotide sequence, or is of high sequence with the TLCV or TYLCV mRNA sequence. Hybridization in vitro under conditions of high stringency. And the catalytic region spans a ribozyme capable of cleaving the mRNA sequence. Book The aspect of the invention is suitably determined by the degree of cleavage of the target mRNA in vitro.   For the purposes of the present invention,SambrookEt al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, USA. Pp. 387-389. , The stringency conditions described in paragraph 11 are considered. On the other hand, Midori Manger can be 0.25-0.5% W / VSDS, 45 ° C., 2-3 hours utilization. other The above conditions may also be applicable depending on the concentration, purity and origin of the nucleic acid molecule.   The present invention extends to a genetic construct comprising a ribozyme described herein. these Gene constructs are commonly used as vectors to transfer ribozymes into host cells. -Sequence and promoter sequence that directs transcription of ribozyme and terminator Comprising. Suitable promoters include, without limitation, 35S cauliflower Includes a mosaic virus (CaMV) or double 35SCaMV promoter. CaMV The promoter isOdellEt al. Nature 313: 810-812, 1985. this These ribozymes are generally complementary forms, and transcription produces a ribozyme. You. The gene construct of the present invention comprises the ribozyme described herein as constitutive, developmental or To produce transgenic plants that can be inducibly expressed (eg, in response to a constant stimulus) Used for Most preferred genetic cells are rendered substantially resistant to TLCV infection.   The ribozymes and gene constructs of the present invention can be used in infectious plants using virus susceptible plants. You can easily test it with Bo. A particularly useful indicator plant is the tobacco plant. This analysis should be qualitative, for example by screening the severity of symptoms. Or the sample can be assayed for ribozyme expression levels or target mRNA levels, for example. It can be made quantitative by measuring. Qualitative or quantitative analysis combination You can also use it.   All known means for introducing foreign DNA into plants, such asAgrobacteria (Agrobacterium), Collectoporation, protoplast fusion, particle gun By bombardment or cells such as pollen, microspores, seeds and immature embryos DNA Penetration, Will Vectors, eg Geminivirus or Satellite Virus May be used.Agrobacterium tumefaciens(A. tumefaciens) andResogenes (Rhizogenes) Is the preferred means. In this case, polyribozyme The coding sequence is provided in an appropriate vector containing all the necessary regulatory sequences, such as promoters. Data, terminator, etc., as well as any sequences required for selection of transformants. To introduce.   In one approach, tobacco cells are used together with the genetic construct to be tested.Agroba Cteria Transform using standard procedures employing. In general, for tobaccoAggro Bacteria tumefaciens Vector transformationHorschLaScience227: 1229-12 31, 1985, or using the conventional strain LBA 4404, The seedlings are then screened with kanamycin at a concentration of 250 μl / ml. Small transformed cells The plants are regenerated and samples taken for expression screening. This Plants self-propagate and seed, and produce transgenic seeds into new plants Used for Expose the transgenic plants to the virus with appropriate controls. And the degree of symptom onset Analyze. Alternatively or additionally, quantitative evaluation may be performed by biochemical analysis. This method For screening geminiviruses, and especially ribozymes for TLCV Are extremely useful. Appropriate ribozyme gene constructs were identified using this procedure If possible, transfer these specific constructs to gene transfer, for example in the case of TLCV and TYLCV. It can be used to make tomato plants. Similar transformation and screening The following procedure may be adopted.   The resistant nature of transgenic plants can be determined by self-propagation1Got Test by crossing with non-transformed genotypes based on one generation offspring for You can test. Then T1Plants are inoculated with the DNA virus by agroinoculation. Tolerance (that is, "total tolerance" means an overall lack of symptoms, "tolerance" means that the plant Infected and symptomatic, which means to recover, "susceptibility" means that the plant Status, and means that the virus is allowed to replicate).   The present invention is particularly directed to genes that are at least somewhat resistant to TLCV and TYLCV infections. Regarding introduced tomato plants. Resistance to infection is about 30% or more, preferably about 50% % Or more, and even about 70% or more means quantitative relief of symptoms (typically Based on the inhibition of replication). Reaches 100% inhibition of TLCV replication based on biodiversity Although difficult to produce, the effects of ribozymes can be enhanced by various molecular biology techniques. I can marry.   In accordance with this aspect of the invention, exposure to TLCV is experienced compared to non-transgenic plants. And a method of transgenic plants showing reduced symptoms. Cell, and the gene structure encoding the above-mentioned ribozyme capable of cleaving TLCV-derived C1 mRNA. Transformed by construction, regenerate plants from the transformed cells, and Breed it The seeds from the seeds and then grow transgenic plants from the seeds. And   The present invention relates to plant DNA viruses, more particularly geminiviruses, and more particularly. To transgenic plants that show resistance to TLCV. In one preferred embodiment, The transgenic plant of is a tomato plant. The present invention is a plant derived from such a transgenic plant. It also extends to raw materials and seeds (eg tomato plants). This ribozyme is constitutive and developmental Can be expressed indirectly or inducibly.   The present invention is further described by reference to the following non-limiting drawings and examples .   In the drawing:   Figure 1. Nucleotide sequences of complementary sense strands from three TLCV isolates. Shown: Top row, TLCV (Australia); Middle row, TLCV (Israel); Bottom row, TL CV (Sardinia). The sequences are shown in the 5'to 3'direction.   Figure 2BamHICaMV35S-1568bp TLCV Fragment cloned in truncated Bin19 (Containing Rz1, Rz2, and Rz3) -a schematic diagram of pRIBO5BIN containing CaMV polyA is there. The insertion sites for the three ribozymes Rz1, Rz2, and Rz3 are at positions 1111, 2056, and 23. Shown in 55. This numbering is the virion-sense numbering, and Figures 8 and 10 Using the (-) sense numbering shown in Figure 1, positions 1654, 711, and 412 respectively Hit   Figure 3BamHICaMV35S-1346bp TMCV Fragment cloned in truncated Bin19 PRIBO5B (containing Rz1, Rz2, and Rz3) -CaMV polyA expression cassette It is a schematic diagram of IN DeL.   Figure 4BamHICaMV35S-3966bp TLCV Fragment cloned in truncated Bin19 (Containing Rz1 and Rz2) -contains CaMV polyA expression cassette It is a schematic diagram of pRIBO7BIN consisting of.   Figure 5BamHICaMV35S-30bp TLCV fragment (cloned into truncated Bin19 FIG. 7 is a schematic diagram of pRIBO2BIN containing a Rz1-containing) -CaMV polyA expression cassette.   Figure 6 for RT-PCR analysis of ribozyme construct expression in transgenic tobacco. It is a schematic diagram of the position of the used primer.   Figure 7 is a schematic diagram of the ribozyme model (Haselhoff and Gerlach, Nature, 1 988). The substrate RNA has a length that forms base pairs with the ribozyme, as shown. Can have any sequence (X) adjacent to the GUC at the cleavage site. The arrow indicates the cleavage site Show. The conserved bases in the ribozyme are boxed. In the natural hammerhead, The substrate and ribozyme moiety are connected by a loop, resulting in intramolecular cleavage.   FIG. 8 shows the nucleotide sequence of TYLCV-S complementary / sense strand. Small sentence The letter indicates the ribozyme cleavage site. The sequence of TYLCV-S is described by Kher-Pour et al. (Nucl. AcidRes . (1991) 19: 6763).   Figure 9 shows the conserved region in the replicase gene between TLCV and TYLCV-S: Figure 9 (a) is a highly conserved region around ribozymes R1, R4 and R5. Figure 9 (b) shows a highly conserved region around ribozyme R2. . A ":" means the pairing and a gap means no nucleotides. small Letters indicate ribozyme cleavage sites.   Figure 10 shows the nucleotide sequence of the complementary strand of TLCV.Dry(J. Gen. Virol. (19 93) 74: 147). Lowercase letters indicate ribozyme cleavage sites.   FIG. 11 shows the target sequences of polyribozymes D, F and E. Lower case letters are ribozyme solutions Indicates a cleavage site. The capital letters correspond to the complementary sequences of the ribozyme arm.   FIG. 12 is a schematic diagram of a ribozyme construct. The shaded area is TYLCV-S complementarity / sense string Lands, and solid lines represent TLCV complementarity-sense strands. R = li Bozyme.   Figure 13 is a schematic physical map of the double vector pGAZE.   Figure 14 shows ribozyme plasmids, pGAZE-RzA, pGAZE-polyRzC, pGAZE-polyRzD, p. It is a schematic physical map of GAZE-polyRzE and pGAZE-polyRzF.   Figure 15 (a) shows pRIBO5BS: 1690b blunt-ended with EcoRV-cleaved Bluescript SK +. d A schematic representation of the TLCV C1 / C2 / C3 complementary fragment (containing three ribozymes) Fig. 15 (b) shows pRIBO5BIN: 2660bp cloned into BamHI-digested BIN19.  BgL II35S-C1 / C2 / C3 complementation (containing 3 ribozymes) of CaMV polyA cassette Schematic diagram; open triangles indicate the position of the 22 bp ribozyme insertion. E: EcoRI; H: HindIII; K: KpnI; P: PstI; Sm: SamI; B: BamHI; SL: SaLI; St: SstI; X: Xho I; Xb: Xba I; C: Cla I.   Figure 16 is a schematic diagram of ribozyme constructs, showing their interrelationship and "short The deletions performed to obtain the "arm" ribozymes, polyE, polyF and polyD are shown.   Figure 17 shows the "minizyme" structure (WO-A-9119789), where the loop of the catalytic domain Has been replaced by the element "P". P is a ribonucleotide of the “P” group , Array (X ')nAnd (X)n 2And P consists exclusively of ribonucleotides With a "Watson-Crick" base pair At least one nucleotide (ribonucleotide, deoxyribonucleoside) Tide, derivative or mixture). "P" is a bond or any atom or group of atoms However, it should not affect the catalytic activity of the ribozyme. X is the formula I , II, III have the same meaning as I do. ExampleExample I-Selection of TLCV target mRNAs:   In order to be able to select the appropriate target RNA, the major mRNA transcript was identified and And mapped on the circular genome of an Australian isolate of TLCV [TLCV (aus (Toralia)MullineauxEt al., Supra;Dry[Above]]. Complementarity / sense of viral DNA One of the strand-derived viral mRNAs was found in lesser amounts than other TLCV transcripts. Was. This small amount of mRNA transcript was identified as encoding the C1 gene, The product is necessary for viral replication.DaviesEt al., Trends in Genetics, 5: 77-81, 1989]. This mRNA was named C2, C3 and C4. Three that It also encodes other gene products. Their functions are not well understood. Obedience Therefore, this small amount of mRNA encoding the C1 gene was selected as the target mRNA. This The low abundance of transcripts in Escherichia coli indicates a high rate of ribozyme target sequences, which results in C1 residues. A more substantial reduction in gene product is potentially possible.Example II-Selection of ribozymes based on the conserved region of the C1 gene among TLCV isolates   Three TLCV isolates [TLCV (Australia), TLCV (Israel) and TLVC ( Sardinia)] complementary nucleotide sequence of ribozyme Comparisons were made to identify more targeted conserved regions. This sequence contrast is shown in Figure 1. You. Three conserved regions were identified for ribozyme design. These conservation areas Two of the areas are shown in FIG. In addition to sequence contrast, the higher efficacy of ribozymes A computer program was used to estimate the secondary structure of the target site as possible. Used.Example III-Synthesis of ribozymes targeting the conserved sequence of the C1 gene of TLCV Example IV-Rz1, Rz2 and / or Rz3: a gene construct carrying pHHIBO5BIN:   Nucleotides containing C1, C2, C3 and C4 reading frames (ORPS) The 1568 fragment of TLCV from 1075-2643 was cloned into pALTER-1 (Promega). I did. Ribozyme sequences 1, 2, and 3 (Rz1, Rz2, and Rz3, respectively) were used in Example III. And synthesized in vitro in a mutagenesis system (Promega). Was introduced into the TLCV sequence by utilizing the modified site. Incorporation of the introduced ribozyme sequence Confirmed by sequencing using the oxy chain termination method. Rz1, Rz2 and Rz3 are 50 ℃ Complementarity and sense virus R generated by 57 RNA polymerase at 37 ° C It has been shown to catalyze the in vitro cleavage of NA transcripts. Modified including Rz1, Rz2 and Rz3 Altered 1634 bp complementation / sense TLCV fragment in antisense direction (for C1 ORF transcription) Between the double 35S CaMV promoter and the CaMV polyA termination sequence. And the complete expression cassette is cloned into the binary vector Bin19. Of the training siteBsmHIIntroduced into the site. Obtained structure The construction was named pRIBO5BIN and is shown in Figure 2.Example V-Rz1, Rz2 and / or Rz3: a gene construct carrying pRIBO5BIN DeL   This construct was derived from pRIBO5BIN (Example IV)BstBISite (nucleotide It was obtained by deleting a region of 216 bp from 2424) to the 3'end. PR the resulting construct IBO5BINDeL and shown in FIG.Example VI-Rz1, Rz2 and / or Rz3: a gene construct carrying pRIBO7BIN :   This construct is derived from pRIBO5BINDeL (Example V) at the 5'end of the TLCV fragment. From (nucleotide 1075)XhoI950 bp region extending to site (nucleotide 2425) Was obtained by removal of. The resulting construct was designated pRIBO7BIN and is shown in FIG.Example VII-Rz1, Rz2 and / or Rz3: a gene construct carrying pRIBO2BIN :   A 52 bp fragment containing Rz1 was polymerase chained from pRIBO5BIN (Example IV). Amplified by strand reaction (PCR) and antisense orientation (for C1 ORF transcription) And clone it between the double 35S CaMV promoter and the CaMV PolyAS termination sequence. , And the complete expression cassette BamH at the multiple cloning site of the dual vector Bin19. It was introduced into the I site. The resulting construct was designated pRIBO2BIN and is shown in FIG.Example VIII-Expression of ribozyme gene constructs in transgenic tobacco cell lines:   The ribozyme constructs described in Examples 5 to 8 were transformed into tobacco using PCR analysis. Tested for expression in plants.   A leaf tobacco sample (150 mg) was transferred to a transgenic tobacco cell line prior to potting in a greenhouse. Collected from and liquid N2Frozen in. Crush the sample to a powder, And 0.5 ml of extraction buffer (0.1 M Tris-HCL (pH9), 0.1 M NaCl, 10 mM EDTA, 1% W / V SDS and 1% V / V containing beta-mercaptoethanol) and for 30S with 0.5 ml phenol Vortexed. The extract was centrifuged at 12,000g for 10 minutes, and the supernatant fraction was collected. This supernatant fraction was further mixed with phenol and then with phenol / chloroform (1 Extracted in 1). Total nucleic acid fraction was precipitated with sodium acetate / ethanol at -20 ° C. And centrifuged at 12000 g for 10 minutes. Use 80% V / V ethanol for this pellet. Washed, dried and resuspended in 50 μl sterile water.   The first strand cDNA reaction was performed as described above. Nucleic acid sample at 65 ℃ for 5 minutes , 100mg CaMV Term Pliers (5'-TTTACAAATACAAATACATACTAAGGGT) and all The volume was annealed in 5 ml. This primer was generated from these transcripts CaMV termination sequence present in all ribozyme constructs (see Figure 6) Is complementary to the region within.   Add 50 mg Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 10 mM MgCl to the annealed template.2 , 0.5 mM spermidine, 10 mM DTT, 1 unit of ribonuclease inhibitor And 5 μl of reverse transcriptase mixture containing 2.25 units of AMV reverse transcriptase. This The mixture was incubated at 42 ° C. for 60 minutes and then at 94 ° C. for 2 minutes. When displaying If not, a control reaction is performed in which AMV reverse transcriptase Squirrel-HCl (pH9), 1.5 mM MgCl2， 1.5mM MgCl2, 0.1% V / V Triton X-100 , 200 μM dNTP, 250 μM CaMV Term pliers (see Figure 6), 0.5 units  Exclude from Tag DNA polymerase and 2 μl of first strand cDNA reaction mixture is there. Two alternating 5'end primers were used, the positions of which are shown in the accompanying drawings. Is:   PCR cycle conditions are 94 ° C for 1 minute, 50 ° C to 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 3 minutes for 15 to 30 minutes. I took it as an icle. PCR products were analyzed on a 1.2-1.8% W / V agarose gel.   Reverse transcription of RIBO5BIN and RIBO5BINDeL using C3 / CaMV Term pliers combination Enzyme (RT) -PCR analysis showed that the DN was approximately the estimated size, namely 1690 bp and 1450 bp, respectively. A product was produced.   RIBO5BIN, RIBO5BINDeL and RIBO using R1B / CaMV Term pliers combination RT-PCR analysis of 2BIN showed that the estimated size was 504bp, 264bp and 2 respectively. A 35 bp DNA product was produced.   No PCR product was observed in the control reaction: (a) Reverse transcription fermentation A nucleic acid sample from a plant transformed only with the elementless (b) vector sequence, ie , Which does not contain a ribozyme sequence. This is observed with these primers PCR product generated is specifically derived from the RNA transcript of the introduced ribozyme construct. Demonstrate that.   The size of the putative PCR product using the C3 / CaMV Term pliers combination is Is:                     1. RIBO5BIN 1690 bp                     2. RIBO5BINDel 1450 bp                     3. RIBO7BIN −                     4. RIBO2BIN −   The size of the putative PCR product using the RIB / CaMV Term primer combination is Is as follows:                     1. RIBO5BIN 504 bp                     2. RIBO5BINDel 264 bp                     3. RIBO7BIN 264 bp                     4. RIBO2BIN 235 bp Example IX-Construction of ribozyme gene :   The pairwise contrast of the deduced amino acid sequence encoded by the Geminivirus C1 ORF was determined. It investigated (Table 1).   Sardinia (Kheyr-PourEt al., NAR (1991) 19: 6763), Thailand (Rochester et al., Vi rology (1990) 178: 520)), Israel (Navot et al., Virology (1991) 185: 15 1)), Australia (Dry et al.J. Gen. Vir. (1993) 74: 147) derived TYVCV The alignment of the nucleotide sequences of the genomic isolates indicates that they are essential for viral replication. Three conserved regions in the internal fragment of the C1 transcript encoding the polypeptide It is a region. This BstBI / Eco0190I internal fragment of TYLCV-S genome (Nt346-nt982) digested with DraII / SmaI pBluescriptII SK + phagemid (ST RATAGENE). This clone of the most highly conserved region It was used as a template into which two ribozymes were introduced. Two and three dimensional foldin Analysis also shows more theoretical accessible target sites for ribozyme cleavage. Went to maintain.   The catalytic domain of hammerhead-type RNA (Figure 1), in this case tobacco Satellite RNA of long-spot virus (STobRV), a completely unrelated substrate RNA Used to design an in trans hammerhead structure, which The target site is specifically cleaved at the putative site (Haseloff and Gerlach (1989), Ge ne, 82: 43-52). Following the general rules stated by these authors, hammers -The only requirement for a substrate RNA that is cleaved by a head-type ribozyme is , In the presence of a trinucleotide sequence (its self-cleavage is stated) (Perr iman et al  Gene (1992) 113: 157). The most highly conserved C1 transcript of TYLCV-S Figure 2 positions for remaining hammerhead type ribozymes on the open area 2 and 3 Show.   * Position R4, nucleotide 407 (target site GUC);   * Position R5, nucleotide 430 (target site UUC);   Introduced a 22-base hammerhead sequence of TobRV satellite RNA at these positions For this purpose, the polymer described in Kammann et al. (Nucl. Acid. Res. (1989) 17: 5404). A rapid insertion mutagenesis method of DNA by polymerase chain reaction (PCR) was used.   This method requires the following synthetic oligonucleotides:   Oligo R4-R5 carrying two hammerhead ribozymes:   The underlined array corresponds to ToRST's satellite hammerhead structure. It corresponds to the part.   Oligos R4-R5 were synthesized on an Applied Biosystems Model 380B DNA synthesizer :         Oligo T7 Sequencing Primer (Pharmacia):         Oligo T3 Sequencing Primer (Pharmacia):   In the first PCR (PCR) step, oligo R4-R5 and oligo T3 sequencing The sequences between the limers were amplified. This amplified fragment is labeled with molecular sieves. Purified with a column (Prime Erase Quick ™ kit, STRATAGENE). Second PC In the R (PCRII) step, this amplified fragment was used as a primer by itself. Used in combination with the Rigo T7 sequencing primer. PCR conditions are as per FIL did:   PCR is 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 1.5 mM MgCl 2.2， 300mM each dNTP, 2U Tag polymerase (Perkin Elmer Cetus), 40pg template DNA, 100p A total reaction volume of 100 μl containing M primers was performed. PCRII is the same as PCRI However, 5 μl (300 ng amplified fragment estimated from agarose gel) A small amount of PCRI was used directly for priming. Denaturation: 2min 94 ℃; Annie Lin 2 min 40 ° C; synthesis 3 min 72 ° C; 30 cycles for each step.   After purification using agarose electrophoresis, the PCR product was digested with BstBI and treated with Klenow. Filled in with the fragment and finally digested with Eco0109I. can get The 679nt fragment was cloned into SmaI / DraII digested Bluescript SK + vector. I did. A cloning vector containing a cloning sequence can be prepared by a technique known in the art Used to transform and propagate into bacterial host XL 1 Blue (STRATAGENE) (Maniatis, Molecular cloning, A Laboratory quide, 2nd edition, 1939, Cold Sp ring Harbor Laboratory publishers).   The presence of two hammerhead sequences in TobRV satellite RNA is for T7 sequencing Confirmed by sequence analysis using the kit (Pharmacia). This result is catalytic R4 and And the complete insertion of the R5 site.Example X-Construction of ribozyme plasmids :   The plasmid pRIBO5BS shown in Figure 15 is the basis for the construction of the other plasmids. You. This plasmid is pBluescrip with a 1690 bp 5'end-AseI fragment. t SK + vector, which has three hammerhead type rebosai in the following positions: Corresponding to the C1 / C4 / C2 / C3 complementary fragment of the TLCV carrying the :   -R1 (nucleotide 412, target site CUU),   -R2 (nucleotide 711, target site CUU) and   -R3 (nucleotide 1654, target site GUA).   The plasmid p polyribozyme E was derived from the plasmid pRIBO5BS at positions R2 and R3. The 877 bp “Klenow” corresponding to the region between the two hammerhead type sequences at XhoI-BclI "fragment filled in with polymerase and 264 bp Was obtained by deleting the "5'-TthIIII" fragment of This Tth  The IIII site was filled in using Klenow polymerase. This "Tth III I-HindIII (pBluescript SK + vector site) fragment was agarose gel Was isolated after separation by electrophoresis. This fragment is Mang Bean Nu PB, previously deleted from SacI-XbaI digested with the clearase fragment EcoR filled in using Klenow polymerase of luescript SK + vector It was cloned into the I and HindIII sites.   Polyribozyme E contains 434 bases and contains 3 bases as shown in FIGS. Contains ribozymes R1 (position 28), R2 (position 327) and R3 (position 399) (pol y R2E-R2). The size of the arm adjacent to the catalytic domain of the ribozyme is:   * 27 nucleotides from the 5'end to ribozyme R1;   * 298 nucleotides between R1 and R2;   * 71 nucleotides between R2 and R3;   * 35 nucleotides from ribozyme R3 to the 3'end.   The polyribozyme F plasmid is derived from the p polyribozyme E plasmid. Re The 56 bp SmaI (pBluescript of the replicase gene of TLCV containing bozyme R1 The position near the 5'end in the SK + vector) -SacI "fragment is described above. Of TYLCV-Sardinia isolate with two ribozymes R4 and R5 The 98 bp replicase gene was filled in using Klenow-Polymerase. BstBI-SacI ”fragment. Converted Fragmen The genotype has a region highly conserved between the TYLCV and TLCV strains. TLCV 365 between the nt-435nt and the 370nt-440nt region of the TYLCV-Sardinia isolate. Otide sequence identity corresponded to 97% (Figure 3).   Chimeric polyribozyme F has two different origins: TYLCV-Sardinia isolate and TLCV-contains a replicase gene fragment with an Australian isolate. The assembly of these fragments was done at the SacI site. Artificial polylinker It is also possible to use to assemble two fragments. One of this non-complementary sequence Somatization did not deleteriously affect the catalytic activity of polyribozymes.   Polyribozyme F contains 479 bases and, as shown in FIGS. Two ribozymes, R4 (position 59), R5 (position 83), R2 (position 372) and R3 Including (position 444).   The size of the arm adjacent to the catalytic domain of the ribozyme is as follows:   * 59 nucleotides from the 5'end to ribozyme R4;   * 22 nucleotides between ribozyme R4 and R5;   * 288 nucleotides between ribozyme R5 and R2;   * 71 nucleotides between ribozyme R2 and R3;   * 35 nucleotides from R3 to the 3'end.   Chimeric p-polyribozyme D is derived from p-polyribozyme F. Derived from TLCV  The 206 bp "Sac I-Swa I" fragment was deleted. SacI site is T4-DNA poly It was destroyed by the action of merase. Polyribozyme D contains 270 bases and Four ribozymes, R4 (position 59) and R5 (position 83), as shown in 5 and 6. , R2 (position 163) and R3 (position 235).   The size of the arm adjacent to the ribozyme catalytic domain is Is:   * 59 nucleotides from the 5'end to ribozyme R4;   * 22 nucleotides between ribozymes R4 and R5;   * 79 nucleotides between ribozyme R5 and R2;   * 71 nucleotides between ribozymes R2 and R3;   * 35 nucleotides from ribozyme R3 to the 3'end.   The sequences of polyribozymes E, F and D were supplied by Pharmacia for T7 sequencing. It was confirmed using a tablet.   The functions of polyribozymes E, F and D are “Protocol and Applica” derived from Pormege. Tested in vitro according to the protocol described in "tion book".   Expression signals were not included in the polyribozyme. Therefore, these are Bull 35S promoter and CaMV 35S RNA under control of poly (A) Was.   In order to realize such a construction, double 35S promoter, monoribozyme R An expression cassette consisting of 1 and CaMV 35S poly (A) was added to pRIBO2BIN plus Isolated from Mido.   The pRIBO2BIN plasmid was digested with SacI. The SacI site is replaced with T4-DNA polymerase Was used to make blunt ends.   The linearized pRIBO2BIN plasmid was digested with SalI, containing the expression cassette "SacI. The "Filled in SalI" fragment was constructed on an agarose gel and pBlues In the cript SK + vector, "X filled in using Klenow polymerase "baI and SalI" sites.   Next, a HindIII-BamHI fragment corresponding to monoribozyme R1 was added to ppoly Polyribozymes E, F and D isolated from ribozymes E, F and D respectively Replace with HindIII-BamHI fragment containing I got it. The HindIII-BamHI fragment is inverted in the expression vector You.   Expression cassette pGA492 (An, Plant Physiol having polyribozyme E, F or D) . (1986) 81:86) and cloned into the dual vector pGAZE (Fig. 7). This PGA492 vector was double digested with Sac I and Sca I and then with T4 polymerase Made blunt-ended and ligated after agarose gel purification.   The excluded fragment is chloramphenicol acetyltransferase It corresponds to almost all of the genes. This HindIII site is the H supplied by Stratagene. It was also converted to an EcoRI site with the indIII-EcoRI adaptor. Regarding pGA492,  pGAZE is a cis-acting element required for plant transformation, such as T-DNA border, plant Selectable marker (kanamycin resistance), cloning site, And a broad host range replicon. The kanamycin resistance marker is tn5 nopaline Ntase control region and neomycin phosphotransferase coding region Built from the area.   The pGAZE vector was digested with EcoRI and ligated using Klenow polymerase. I went in. "Sac containing an expression cassette having polyribozyme E, F or D" The "I fill in Sal I" fragment was cloned into the EcoRI fill in site of pGAZE. I learned.   The resulting recombinant double vector, pGAZE-polyribozyme E, pGAZE-polyribozyme ImF and pGAZE-polyribozyme D (Fig. 9) were directly transformed (Holsters et al., Mo. l. Gen. Genet. (Protocol derived from (1978) 163: 181)Agrobacte Lear Toumefaciens Death Arm Strain LBA4404 (HoekemaEt al, Nature (1983 ) 303: 179).   Monoribozyg containing a catalytic domain and adjacent arms (15 bases in length) Ribozyme A corresponding to the murine R1 and the above polyribozyme C (Example V) Then, introduce the expression cassette into pGAZE and / or pGA492 as described above. did.   As a result, pGAZE-ribozyme A, pGA492-ribozyme A and pGAZE-po Liribozyme C (FIG. 8) was obtained. The target genes of all the above constructs are agglomerated. It was introduced into tomato using a bacterial-based co-culture system. Tomato transformation Exchange and reproductionEillatti(Biotechnology (1987) 5: 726). Carried out.Example XI-Molecular analysis of transgenic plants * RNA analysis:   Total RNAChandler(Plant Physiol. (1983) 74:47). It was isolated from young leaves of transgenic and non-transgenic plants grown in moss. RNA Separated on an agarose / formaldehyde gel and transferred to a nitrocellulose membrane. I copied it. The blot is hybridized with labeled fragments or whole of the gene of interest. It was lysed. Check to see if equal amounts of RNA were applied to each line. The trocellulose membrane was stained with methylene blue. * DNA analysis:   Total DNA for Southern blot analysisDellaporta(Plant Mol. Biol. Rep. (1983) 1:19), and gene transfer and non-death grown in a greenhouse. Isolated from young leaves of transgenic plants and by restriction enzymes according to their manufacturer's specifications Digested, separated by electrophoresis on agarose gel, and capillary action Transferred to nitrocellulose. Use this blot to label the gene of interest. And then probed as a whole.Example XII-T of tomato plants transformed with various constructs by agroinoculation Evaluation of YLCV resistance   Since TYLCV or its cloning DNA cannot be introduced mechanically, Art (Grimsley  Plant DNA Infections Agents, Hoho and Schell (ed.) Springe r, Wien, New york (1987) pp87-107) Cloning DNA infectivity assay It was used to   TYLCV-Sardinia strain genome is double plant transformation vector pBin19 (Stanley EMBO J. et al. (1986) 5: 1761), and inserted into the SstI site, BamHI part at the TYLCV map position 152 through the TYLCV intragenic region A BamHI fragment of approximately 600 bp spanning positions was deleted. Next, the complete TYLCV genome The unit was also inserted into the rest of the SstI site to generate the 1.8-mer TYLCV-genome in pBin19. Obtained. This plasmid directlyAgrobacterium tumefaciensStock LBA4404 Was introduced.Agrobacterium tumefaciensIncubate culture at 28 ° C for approximately 48 hours I made it. Pellet the cells and wash twice with water, and first sterilized water Resuspended in 1/10 volume.   A young transgenic tomato plant at the 3-4 leaf stage was concentrated using an 18 gauge needle. The petiole of three youngest leaves was inoculated with bacterium.   Place this plant in a closed growth tank for 16 hours at 24 ° C and 70% relative humidity in the sunlight. I left it.   Those skilled in the art can predict that the present invention can be improved without departing from the scope of the present invention. Will

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ボーディノ，シルビー フランス国，エフ―63870 オーチン，ロ ティスメン―レ―ボルカン，２ (72)発明者 メイソン，ジョン オーストラリア国，ビクトリア 3066，コ リングウッド，ジップス ストリート 16，カルジーン パシフィック プロプラ イアタリー リミティド (72)発明者 コミュー，デビッド フランス国，エフ―63000 クレルモン― フェーラン，リュ―ア．―カルル，９ (72)発明者 レザラン，モハマッド アリ オーストラリア国，サウス オーストラリ ア 5066，バーンサイド，シッターズ メ モリアル ドライブ 14 (72)発明者 ドライ，イアン バリー オーストラリア国，メルローズ パート 5039，キンストン アベニュ 111 (72)発明者 リグデン，ジャスティン エリス オーストラリア国，サウス オーストラリ ア 5024，ウエスト ビーチ，チェットウ インド ストリート 10────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (72) Inventor Bodino, Silvie             France-F-63870 Ochin, Ro             Tismen-Les-Volcans, 2 (72) Inventor Mason, John             Australia, Victoria 3066, Co             Ringwood, Zip Street             16, Calgene Pacific Pro Plastic             Eatary Limited (72) Inventor Commu, David             France, F-63000 Clermont-             Fehran, Ruer. -Carle, 9 (72) Inventor Rezaran, Mohammad Ali             South Australia, Australia             A 5066, Burnside, Sitters Me             Morial Drive 14 (72) Inventor Dry, Ian Barry             Australia, Melrose part             5039, Kinston Avenue 111 (72) Inventor Rigden, Justin Ellis             South Australia, Australia             A 5024, West Beach, Chettow             India street 10

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．ハイブリダイズ領域及び触媒領域を含んで成るリボザイムであって、ここ で前記ハイブリダイズ領域が、植物細胞に感染できる DNAウィルスに結合してい る DNA分子から転写された標的mRNA配列の少なくとも一部にハイブリダイズする ことができ、ここで前記触媒領域が前記標的mRNA配列を解裂でき、これにより前 記 DNAウィルスの複製、感染及び／又は集成を実質的に抑制することができる、 リボザイム。 ２．前記植物 DNAウィルスが一本鎖 DNAウィルスである、請求項１記載のリボ ザイム。 ３．前記一本鎖 DNAウィルスがジェミニウィルスである、請求項２記載のリボ ザイム。 ４．前記ジェミニウィルスが、メイズ・ストリーク・ウィルス(MSV)、ビーン ・ゴールデン・モザイクウィルス（BGMV）、アフリカン・カッサバ・モザイクウ ィルス（ACMV）、クロリス・ストリエート・モザイクウィルス（CSMV）、トマト ・イエロー・リーフ・カール・ウィルス(TYLCV)、トマト・ゴールデン・モザイ クウィルス（TGMV）、トマト・リーフ・カール・ウィルス（TLCV）及びビート・ カーリー・トップ・ウィルス（BCTV）より成る群から選ばれる、請求項３記載の リボザイム。 ５．前記ジェミニウィルスがトマト・リーフ・カール・ウィルス（TLCV）、ト マト・イエロー・リーフ・カール・ウィルス(TYLCV)又はそれらの突然変異体、 誘導体もしくは変異体である、請求項４記載のリボザイム。 ６．ハイブリダイズ領域及び触媒領域を含んで成るリボザイムであって、ここ で前記ハイブリダイズ領域がジェミニウィルスのビリ オン・センス DNA分子又はこのビリオン・センス DNA分子に相補性である DNA分 子から転写された標的mRNA配列の少なくとも一部にハイブリダイズでき、ここで 前記触媒領域が前記標的mRNA配列を解裂でき、これにより前記ジェミニウィルス の複製を実質的に抑制する、リボザイム。 ７．前記mRNA転写物が、ウィルスにより指令されたその他のmRNA転写物よりも 少ない量となっている、請求項６記載のリボザイム。 ８．前記mRNA転写物が、Ｃ１，Ｌ１，AL１，AC１又はジェミニウィルス遺伝子 の複製に関するその他の遺伝子に由来する、請求項７記載のリボザイム。 ９．前記Ｃ１遺伝子が前記ジェミニウィルスの相補性・センス DNAストランド により特異的とされてる、請求項８記載のリボザイム。 10．前記ジェミニウィルスが、メイズ・ストリーク・ウィルス(MSV)、ビーン ・ゴールデン・モザイクウィルス（BGMV）、アフリカン・カッサバ・モザイクウ ィルス（ACMV）、クロリス・ストリエート・モザイクウィルス（CSMV）、トマト ・イエロー・リーフ・カール・ウィルス(TYLCV)、トマト・ゴールデン・モザイ クウィルス（TGMV）、トマト・リーフ・カール・ウィルス（TLCV）及びビート・ カーリー・トップ・ウィルス（BCTV）、好ましくはTLCV，TYLCV又はその突然変 異体、誘導体もしくは変異体より成る群から選ばれる、請求項９記載のリボザイ ム。 11．前記リボザイムのハイブリダイズ領域が配列X0UYに隣接するリボヌクレオ チドの配列にハイブリダイズすることができ、ここでＸは任意のリボヌクレオチ ド、Ｕはウラシル、そしてＹはアデニン、シトシン又はウラシルであり、前記ハ イブリダイズ領域は図１に示す配列の領域の一部と実質的に同一であるヌクレオ チド配列を含 んで成る、請求項10記載のリボザイム。 12．次の群 及び から選ばれる、請求項11記載のリボザイム。 13．エンドヌクレアーゼ活性を有し、且つ DNAウィルスの複製、感染又は集成 を阻害できる核酸化合物であって、次の一般式を有する少なくとも一の単位「Ｒ 」 ５′（Ｘ−Ｙ−Ｘ′）３′ （ここで： Ｘ及びＸ′はそれぞれ独立して少なくとも４個のヌクレオチド配列を示し、そ してウィルスのゲノム又は DNAウィルスの（−）センス RNA転写物のいづれかの 少なくとも一部に相補性であり； Ｙはリボザイムの触媒領域を表す）を含んで成る、核酸化合物。 14．一の「Ｒ」単位のみを含んで成り、且つ次の一般式 ［Ｘ−Ｙ−Ｘ′］ （ここでＸ，Ｘ′及びＹは先に定義の通りである）を有する、請求項13記載の核 酸化合物。 15．複数の「Ｒ」単位を含んで成り、且つ次の一般式 Ｒ1−Ｒ2…Ｒn （ここでＲは先に定義の通りであり、そしてｎ＞１である）を有する、請求項13 記載の核酸化合物。 16．任意の「Ｒ」単位内のＸ及びＸ′配列が DNAゲノムウィルス又は（−）セ ンス RNA転写物の隣接連続部に相補性である、請求項14記載の核酸化合物。 17．一定の「Ｒ」単位の３′Ｘ′配列及びその隣接の「Ｒ」単位の５′Ｘ配列 が、 DNAゲノム又は（−）センス RNA転写物の中で連続となっている配列に相補 性である、請求項15記載の核酸化合物。 18．任意の「Ｒ」単位内のＸ及びＸ′配列がゲノム又は（−）センス RNA転写 物の不連続部に相補性である、請求項14記載の核酸化合物。 19．一定の「Ｒ」単位の３′Ｘ′配列及び隣接の「Ｒ」単位の５′Ｘ配列が、 ゲノム又は（−）センス RNA転写物の不連続部に相補性である、請求項15記載の 核酸化合物。 20．少なくとも４個の塩基を有し、且つウィルスのゲノム又は（−）センス R NA転写物に対して相補性でない配列「Ａ」を２つの連続「Ｒ」単位の間に含む、 請求項13〜19のいづれか１項記載の核酸化合物。 21．前記相補性でない配列「Ａ」がポリリンカー又はスペーサーである、請求 項20記載の核酸化合物。 22．少なくとも２種のタイプの DNAウィルスの単離体のゲノム又は（−）セン ス転写物に対して相補性であるＸ及びＸ′配列を含んで成る請求項15〜21のいづ れか１項記載の核酸化合物。 23．少なくとも一の「Ｒ」単位が、 DNAウィルス間、例えば同一のタイプの D NAウィルス間で高度に保存されている領域に対して相補性である、請求項15〜21 のいづれか１項記載の核酸化合物。 24．前記リボザイム触媒領域「Ｙ」がハンマーヘッド触媒領域で ある、先の請求項のいづれか１項に記載の核酸化合物。 25．次式（Ｉ）のリボザイム （式中、（Ｘ）n及び（Ｘ）n′は DNAウィルスのmRNA配列に実質的に相補性であ るリボヌクレオチド配列を表わし；ｎとｎ′の合計は同一又は異なっていてよく ；（* ）は相補性リボヌクレオチド間の塩基対合を表わし；Ｙは任意のリボヌク レオチドを表わし、そして各Ｙは同一又は異なっていてよく；Ｙ′及びＹ″はオ リゴヌクレオチド間での塩基対合が可能となるようにその全長の少なくとも一部 の間が相補性配列のリボヌクレオチドで表わすか、又はＹ′及びＹ″は一緒にな って一本の RNA配列を形成しており、ここでのこの配列の少なくとも一部は相補 性ヌクレオチド間の塩基対合により形成されるステムを含んで成り；そして任意 的にＡ，Ｇ，Ｃ又はＵのいづれかより選ばれる追加のヌクレオチドが1Ａの後方 に挿入されている）。 26．次式（II）の請求項25のリボザイム （式中、（Ｘ）n及び（Ｘ）n′は DNAウィルス、そして特にジェミニウィルス、 例えばTLCV又は TYLCVのmRNAに対して実質的に相補性であるリボヌクレオチド配 列を示し；Ｙは任意のリボヌクレオチドを表わし、そして各Ｙ残基は同一又は異 なっていてよく；（＊）は相補性ヌクレオチド間での塩基対合を表わし；ｎ及び ｎ′は先に定義の通りであり；Ｂは結合、塩基対合、リボヌクレオチド又は少な くとも２個のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを表わし；ｍ及びｍ′ は１以上であり、そして同一又は異なっていてく；そして任意的に、Ａ，Ｇ，Ｃ 又はＵのいづれかより選ばれる追加のヌクレオチドが1Ａの後方に挿入されてい る）。 27．次式（III）の請求項26記載のリボザイム （式中、（Ｘ）n及び（Ｘ）n′は DNAウィルス、そして特にジェミニウィルス、 例えばTLCVのmRNAに実質的に相補性であるリボヌクレオチドを表わし；Ｙは任意 のリボヌクレオチドを表わし、そして各Ｙ残基は同一又は異なっていてよく；（ ＊）は相補性リボヌクレオチド間での塩基対合を表わし；ｎ及びｎ′は先に定義 の通りであ）。 28．次の群から選ばれる、請求項27記載のリボザイム 及び 29．請求項１，６，13，25又28に記載のリボザイムの相補性配列及びベクター 配列を含んで成る遺伝子構築体。 30．前記相補性リボザイム配列に作動連結しているプロモーターを更に含んで 成る請求項29記載の遺伝子構築体。 31．次の群、pRIBO5BIN，pRIBO5BINDel，pRIBO7BIN，pRIBO2BIN，pGAZE-RzA， pGAZE-polyRzC，pGAZE-polyRzD，pGAZE-polyRzE，pGAZE-polyRzF，pGA492-RzA及 びpGA492polyRzC より選ばれる遺伝子構築体。 32．植物 DNAウィルスの複製、感染及び／又は集成を抑制でき、前記植物細胞 が請求項１，６，13，25又は28のいづれか１項記載のリボザイムを発現する、遺 伝子導入植物。 33．前記植物 DNAウィルスが一本鎖 DNAウィルスである、請求項32記載の遺伝 子導入植物。 34．前記一本鎖 DNAウィルスがジェミニウィルスである、請求項33記載の遺伝 子導入植物。 35．前記ジェミニウィルスがTLCV又はTYLCVである、請求項34記載の遺伝子導 入植物。 36．前記発現させるリボザイムが、RIBO5，RIBO5DeL，RIBO7，RIBO2，RzA，po lyRzC，polyRzD，polyRzE，polyRzFより成る群から選ばれる、請求項35記載の遺 伝子導入植物。 37．前記植物がトマト植物である、請求項３〜36のいづれか１項記載の遺伝子 導入植物。 38．植物に DNAウィルス耐性を授ける方法であって、植物に請求項１，６，13 ，25又は28のいづれか１項記載のリボザイムを、例えばリボザイムをコード DNA 配列による植物の器官の安定的な遺伝子形質転換、その後の遺伝子導入植物の再 生により行う方法。[Claims]   1. A ribozyme comprising a hybridizing region and a catalytic region, wherein And the hybridizing region is bound to a DNA virus that can infect plant cells. Hybridize to at least part of the target mRNA sequence transcribed from the DNA molecule Where the catalytic region is capable of cleaving the target mRNA sequence, which It is possible to substantially suppress the replication, infection and / or assembly of the DNA virus, Ribozyme.   2. The ribo according to claim 1, wherein the plant DNA virus is a single-stranded DNA virus. Zyme.   3. The ribosome according to claim 2, wherein the single-stranded DNA virus is a geminivirus. Zyme.   4. The Gemini virus is Maize Streak virus (MSV), Bean ・ Golden Mosaic Virus (BGMV), African Cassava Mosaic Virus (ACMV), chloris striate mosaic virus (CSMV), tomato ・ Yellow leaf curl virus (TYLCV), tomato golden mosai Kuvirs (TGMV), Tomato Leaf Curl Virus (TLCV) and beets The curly top virus (BCTV) selected from the group consisting of 3. Ribozyme.   5. The Gemini virus is Tomato Leaf Curl Virus (TLCV), Mat yellow leaf curl virus (TYLCV) or mutants thereof, The ribozyme according to claim 4, which is a derivative or variant.   6. A ribozyme comprising a hybridizing region and a catalytic region, wherein And the hybridizing region is a geminivirus An on-sense DNA molecule or a DNA component complementary to this virion-sense DNA molecule Can hybridize to at least a portion of the target mRNA sequence transcribed from the offspring, where The catalytic region is capable of cleaving the target mRNA sequence, which results in the Geminivirus. Ribozymes that substantially suppress the replication of Escherichia coli.   7. The mRNA transcript is more than other mRNA-directed mRNA transcripts. The ribozyme according to claim 6, which has a small amount.   8. The mRNA transcript is C1, L1, AL1, AC1 or geminivirus gene The ribozyme according to claim 7, which is derived from another gene involved in the replication of Escherichia coli.   9. The C1 gene is a complementary / sense DNA strand of the Geminivirus The ribozyme according to claim 8, which is made more specific by.   Ten. The Gemini virus is Maize Streak virus (MSV), Bean ・ Golden Mosaic Virus (BGMV), African Cassava Mosaic Virus (ACMV), chloris striate mosaic virus (CSMV), tomato ・ Yellow leaf curl virus (TYLCV), tomato golden mosai Kuvirs (TGMV), Tomato Leaf Curl Virus (TLCV) and beets Curly Top Virus (BCTV), preferably TLCV, TYLCV or sudden changes The ribozyme according to claim 9, which is selected from the group consisting of a variant, a derivative and a variant. M   11. The hybridizing region of the ribozyme has the sequence X0Ribonucleo adjacent to UY Of the tide sequence, where X is any ribonucleotidy. De, U is uracil, and Y is adenine, cytosine or uracil. Nucleotide region is substantially identical to part of the region of the sequence shown in FIG. Including tide sequence The ribozyme according to claim 10, which comprises:   12． Next group as well as The ribozyme according to claim 11, which is selected from:   13. Has endonuclease activity and replicates, infects or assembles DNA viruses A nucleic acid compound capable of inhibiting the reaction of at least one unit "R "                       5 '(X-Y-X') 3 ' (here:   X and X'each independently represent a sequence of at least 4 nucleotides, The viral genome or DNA (-) sense RNA transcript of the virus. At least partially complementary;   Y represents the catalytic region of the ribozyme).   14. Comprising only one "R" unit and having the general formula:                             [X-Y-X '] 14. The core of claim 13 having (where X, X'and Y are as defined above). Acid compounds.   15． Comprising a plurality of "R" units and having the general formula:                           R1-R2… Rn 13. where R is as defined above and n> 1. The described nucleic acid compound.   16. The X and X'sequences within any "R" unit are DNA genomic virus or (-) sec. 15. The nucleic acid compound according to claim 14, which is complementary to the adjacent continuous region of the RNA transcript.   17． A constant 3'X 'sequence of "R" units and its adjacent 5'X sequence of "R" units Are complementary to sequences that are continuous in the DNA genome or (-) sense RNA transcript. 16. The nucleic acid compound according to claim 15, which is sex.   18． X and X'sequences within any "R" unit are genomic or (-) sense RNA transcripts 15. The nucleic acid compound according to claim 14, which is complementary to a discontinuity in a product.   19. A constant "R" unit of 3'X 'sequence and adjacent "R" unit of 5'X sequence are: 16. The method according to claim 15, which is complementary to the discontinuity of the genome or the (−) sense RNA transcript. Nucleic acid compound.   20. It has at least 4 bases and has a viral genome or (-) sense R Including a sequence "A" that is not complementary to the NA transcript between two consecutive "R" units, The nucleic acid compound according to any one of claims 13 to 19.   twenty one. The non-complementary sequence "A" is a polylinker or spacer. Item 21. The nucleic acid compound according to Item 20.   twenty two. Genomes or (-) sensates of at least two types of DNA virus isolates 22. Any of claims 15-21 comprising X and X'sequences which are complementary to the transcript. The nucleic acid compound according to item 1.   twenty three. At least one "R" unit may be present between DNA viruses, eg D of the same type. 22. Complementary to a region highly conserved among NA viruses, 22. The nucleic acid compound according to any one of 1.   twenty four. The ribozyme catalytic region "Y" is a hammerhead catalytic region. A nucleic acid compound according to any one of the preceding claims.   twenty five. Ribozyme of the following formula (I) (In the formula, (X)nAnd (X)n'Is substantially complementary to the mRNA sequence of the DNA virus The sum of n and n'can be the same or different. ; (* ) Represents base pairing between complementary ribonucleotides; Y is any ribonucleotide Represents a leotide, and each Y may be the same or different; Y'and Y "are At least part of its length to allow base pairing between the lygonucleotides Are represented by complementary sequence ribonucleotides, or Y'and Y "are taken together. Form a single RNA sequence, where at least part of this sequence is complementary. Comprising a stem formed by base pairing between sex nucleotides; and Is an additional nucleotide selected from the group consisting of A, G, C or U.1Behind A Has been inserted into).   26. The ribozyme according to claim 25 of the following formula (II) (In the formula, (X)nAnd (X)n'Is a DNA virus, and especially a Gemini virus, For example, a ribonucleotide sequence that is substantially complementary to TLCV or TYLCV mRNA. Lanes; Y represents any ribonucleotide, and each Y residue is the same or different. (*) Represents base pairing between complementary nucleotides; n and n'is as defined above; B is a bond, a base pair, a ribonucleotide or a minor Represents an oligonucleotide containing at least two ribonucleotides; m and m ' Are one or more and must be the same or different; and, optionally, A, G, C Or an additional nucleotide selected from either U1Inserted behind A ).   27. The ribozyme according to claim 26 of the following formula (III): (In the formula, (X)nAnd (X)n'Is a DNA virus, and especially a Gemini virus, For example, represents a ribonucleotide that is substantially complementary to the mRNA of TLCV; Y is any , And each Y residue may be the same or different; *) Represents base pairing between complementary ribonucleotides; n and n ′ are defined above Street).   28. The ribozyme according to claim 27, which is selected from the following group: as well as   29. Complementary sequence of ribozyme according to claim 1, 6, 13, 25 or 28 and vector A genetic construct comprising a sequence.   30. Further comprising a promoter operably linked to said complementary ribozyme sequence 30. The gene construct according to claim 29.   31. The next group, pRIBO5BIN, pRIBO5BINDel, pRIBO7BIN, pRIBO2BIN, pGAZE-RzA, pGAZE-polyRzC, pGAZE-polyRzD, pGAZE-polyRzE, pGAZE-polyRzF, pGA492-RzA and And a gene construct selected from pGA492polyRzC.   32. A plant cell capable of suppressing the replication, infection and / or assembly of a plant DNA virus, Expresses the ribozyme according to any one of claims 1, 6, 13, 25 or 28. Gene transfer plant.   33. 33. The heredity according to claim 32, wherein the plant DNA virus is a single-stranded DNA virus. Introduced plant.   34. The genetic according to claim 33, wherein the single-stranded DNA virus is a geminivirus. Introduced plant.   35. The gene transfer according to claim 34, wherein the geminivirus is TLCV or TYLCV. Plant.   36. The ribozyme to be expressed is RIBO5, RIBO5DeL, RIBO7, RIBO2, RzA, po 36. The remains of claim 35, selected from the group consisting of lyRzC, polyRzD, polyRzE, polyRzF. Gene transfer plant.   37. The gene according to any one of claims 3 to 36, wherein the plant is a tomato plant. Introduced plant.   38. A method for conferring DNA virus resistance to a plant, which comprises: , 25 or 28, for example, a DNA encoding a ribozyme, for example, a ribozyme. Stable genetic transformation of plant organs with sequences, followed by re-generation of transgenic plants. How to do it live.
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