JPH09501936A - Methods, Compositions and Devices for Administering Naked Polynucleotides Encoding Bioactive Peptides - Google Patents

Methods, Compositions and Devices for Administering Naked Polynucleotides Encoding Bioactive Peptides

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JPH09501936A
JPH09501936A JP7507766A JP50776695A JPH09501936A JP H09501936 A JPH09501936 A JP H09501936A JP 7507766 A JP7507766 A JP 7507766A JP 50776695 A JP50776695 A JP 50776695A JP H09501936 A JPH09501936 A JP H09501936A
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イーヤル ラズ
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THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
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Abstract

(57)【要約】 本発明には、生物活性ペプチドを作動的にコードするポリヌクレオチドを投与することによって、（特に治療用ペプチドを予防接種するかまたは一過的に発現させるため）宿主中に生物活性ペプチドを導入する方法が含まれている。大部分の実施態様において、上記ポリヌクレオチドは、リポソームのようなコロイド製剤と複合しておらずまたゲノム組込みベクターと結合もしていないという意味で、裸である。一実施態様では、裸のポリヌクレオチドが、宿主の他の組織と比べて高濃度の抗原提示細胞を有する宿主の組織に投与される。そのポリヌクレオチドは、取り込まれて、局所的に、全身的に、および／または宿主の侵入点から離れた位置で発現される。他の実施態様では、ポリヌクレオチドは、哺乳類の高齢関連の疾病および疾患耐性の損失を遅らせ、治療しおよび予防するのに効果的なペプチドを発現する。この実施態様では、治療量以下のレベルのペプチドが宿主の発育の適当な段階で発現される。本発明の方法に使用する装置と組成物も述べられている。   (57) [Summary] The present invention introduces a bioactive peptide into a host (especially for vaccination or transient expression of a therapeutic peptide) by administering a polynucleotide operatively encoding the bioactive peptide. A method is included. In most embodiments, the polynucleotide is naked in the sense that it is not complexed with a colloidal formulation such as liposomes and is not associated with a genomic integration vector. In one embodiment, the naked polynucleotide is administered to a tissue of the host that has a high concentration of antigen presenting cells as compared to other tissues of the host. The polynucleotide is taken up and expressed locally, systemically, and / or at a location remote from the point of entry of the host. In other embodiments, the polynucleotides express peptides that are effective in delaying, treating and preventing loss of age resistance and disease resistance in mammals. In this embodiment, subtherapeutic levels of the peptide are expressed at appropriate stages of host development. Devices and compositions for use in the method of the invention are also described.

Description

【発明の詳細な説明】 生物活性ペプチドをコードする裸のポリヌクレオチドを投与するための方法、組 成物および装置関連米国特許願 本願は、１９９３年８月２６日付けで米国特許商標庁に出願された米国特許願 第０８／１１２，４４０号の一部継続出願である。米国政府の権利についての陳述 本発明は、米国国立衛生研究所が付与した認可番号ＡＲ０７５６７およびＡＲ ２５４４３に基づいて政府援助によってなされたともいえる。米国政府は本発明 に何らかの権利を持っている可能性がある。発明の背景 １．発明の分野 本発明は、生物活性ペプチドを作動的に（operatively）コードする１種以上 のポリヌクレオチドを、好ましくは無侵襲的手段で哺乳類の宿主に導入すること によって、生物活性ペプチドを哺乳類宿主に投与する方法に関する。また本発明 は、前記ポリヌクレオチドを投与して、哺乳類の老化に付随する疾病と免疫機能 の喪失を予防し治療する方法に関する。 ２．関連技術の説明 生物活性を有するペプチドまたはタンパク質を患者の細胞に直接導入すること は治療の面で大きな価値がある。しかし、この手法にはいくつかの欠点がある。 重要な問題には、特に、ペプチドに対し て生体応答を生じるのに充分な投与量において潜在的な毒性がある恐れのあるこ とである。実際面でも、これらペプチドを単離・精製するかまたは合成するのに 伴う費用の問題がある。さらに、これらペプチドの臨床効果も、その生体内での 半減期が比較的短いこと（これは標的組織中に存在するプロテアーゼ類によって これらペプチドが分解されることが通常原因である）によって限定される。 これらの理由から、タンパク質を発現する遺伝子を患者／宿主に送達すること によって患者にタンパク質を導入する方法は、タンパク質を投与する方法に代わ る興味深い方法である。しかし、今までのところ、異種遺伝物質を宿主に導入す る主な手段は、例えば宿主の細胞をウイルスベクターで形質転換することによっ て、遺伝子を宿主のゲノムに組み込む方法である。ウイスルエンベロープ受容体 タンパク質を含有するプロテオリポソーム内に封入されたＤＮＡを含有する、リ ポソーム中に封入されたＤＮＡを用いて、生後の動物に遺伝子を直接生体内に輸 送する方法も報告されている。 １９８４年に、リス肝炎の裸のクローン化プラスミドＤＮＡをリスの肝臓内に 注射したところ、リスにウイルス感染と抗ウイルス抗体の生成が起こったことを 示した米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）での研究が報告された（Ｓｅｅｇｅｒ他、 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８１巻、５８４９〜５８ ５２頁、１９８４年）。数年後、Ｆｅｌｇｎｅｒ他は、骨格筋の組織に注射され た裸のポリヌクレオチド（すなわち、リポソームまたはウイルスの発現ベクター と結合していないＤＮＡまたはＲＮＡ）からタンパク質が発現されたと報告した （Ｆｅｌｇｎｅｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４７巻、１４６５頁、１９９０年、さ らにＰＣＴ出願国際公開第ＷＯ９０／１１０９２号を参照）。Ｆｅｌｇｎｅｒ他 は、筋肉組織が、多核細胞、筋小胞体、および筋肉細胞中に深く延びるＴ管（横 断細管）システムを含んでなり、独特の構造を有しているので、筋肉細胞はポリ ヌクレオチドを効率的に取り込んで発現すると予想し た。 他の組織の細胞も裸のポリヌクレオチドを取り込むことができると考えられて いるが、他の組織内での発現は、今まで、発現される遺伝子の送達が、送達系、 例えば細胞のリポソーム形質転換による場合しか確認されていない。実際に、他 の研究者達は、骨格筋以外の組織内では裸のポリヌクレオチドの取込みと発現が 検出可能なレベルまたは生物活性レベルでは起こらないと示唆している（例えば 、Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ、 ８９巻１１２７７〜１１２８１頁、１９９２年［遺伝子をエアゾルで送達した場 合、発現はリポソーム送達系を使用すれば起こったが、ＤＮＡだけを導入したと きは発現が起こらなかった］、およびＴａｎｇ他、Ｎａｔｕｒｅ、３５６巻、１ ５２〜１５４頁、１９９２年［コロイド金のビーズに結合させたｈＧＨプラスミ ドをワクチン「ガン」でマウスの皮膚に注射したとき免疫応答を誘発しなかった ］を参照）。 長期療法で筋肉組織中にＤＮＡまたはＲＮＡを注射することは、筋肉細胞内で 遺伝子を発現させるのに一般に有効であるが、遺伝子の劣化が原因で失われる発 現を補うため繰り返し注射する必要がある。この手法は、時間がかかり高価であ るだけでなく、注射部位とその近傍に炎症が起こるので実用的でないといえる。 このような炎症によって、ヌクレオチドが導入される筋肉などの体細胞がそれ自 体が免疫応答の標的になり（例えば、実施例Ｉを参照）、重篤な筋壊死をもたら すことがある。さらに、ＤＮＡの筋肉内注射は、筋肉組織を損傷する危険がある だけでなく、治療の効力も明らかに低下させる。例えば、オタワ大学に勤務する 研究者達は、最近、「横紋筋は、プラスミドＤＮＡの形態で伝達されるリポータ ー遺伝子を吸収し発現できることを見出された唯一の組織である…しかし、我々 の知見によれば、上記注射法で損傷した繊維はプラスミドＤＮＡを取り込んで発 現することをしない。」ということを観察した（Ｄａ ｖｉｓ他、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、４巻、１５１〜１５９頁、 １９９３年）。 さらに、筋肉注射を使うことは、筋肉組織自体の疾患に対する治療の場合、少 なくとも短期間は有効であるとはいえ、患者の身体の他の場所で発現されたペプ チドに対する、組織に特異的な免疫応答または他の生体応答を刺激するのには余 り有効でないようである。 その結果、筋肉内注射は、多くの感染症の主な侵入点すなわち皮膚および粘膜 においてペプチドを発現させるのに特に実用的な方法ではない。 さらに、ポリヌクレオチドを筋肉内に注射すると、標的筋肉細胞にるコード化 タンパク質の放出のため、組織中に抗体と細胞傷害性Ｔ細胞の両者の生成をもた らすようである。これとは対照的に、タンパク質の注射は（例えば予防接種方式 の場合）、外因性タンパク質はクラスＩプロセシング経路には効率よく入らない ので、細胞障害性Ｔ細胞の生成は通常誘発しない。 ＰＣＴ特許出願国際公開第ＷＯ９０／１１０９２号（先に考察した）で、発明 者らは、骨格筋や他の体組織中に裸ＤＮＡを注射すると注射された細胞の細胞質 中に遺伝子が発現されるようになると提唱した。さらに発明者達は、コードされ たタンパク質が次にクラスＩプロセシング経路に入り、細胞障害性Ｔ細胞の生成 を誘発する（樹立されたウイルス感染症と癌を制御するのに必要）と考えている 。しかしながら、先に考察したように、代わりに、抗原を発現する体細胞はいず れも、クラスＩ拘束細胞障害性Ｔ細胞応答が抗原に対し誘導される前に、まず抗 原提示細胞による取込みに用いられる細胞外空間に抗原を放出しなければならな いようである。この結論は、抗原提示に関する最近の研究によって裏付けられて おり、「非造血細胞中に独占的に発現される…クラスＩ拘束抗原に対する免疫応 答をプライムすると、その抗原を提示する前に、その抗原を宿主の骨髄由来細胞 に伝達する」という観察がなされている（Ｈｕａｎ ｇ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６４巻、９６１〜９６５頁、１９９４年）。したがっ て、ＰＣＴ出願国際公開第ＷＯ９０／１１０９２号のタンパク質を発現させるた め筋肉細胞に遺伝物質を導入する方法が基づいている少なくとも一つの前提は、 正確ではない。 しかしながら、筋肉内注射を使うと、注射された遺伝子が劣化する前に全身的 に比較的高いレベルのタンパク質が発現される。このような応答は、タンパク質 置換を目的とする療法の場合、望ましいとはいえ、比較的速いクリアランスまた は比較的低いレベルの発現が最適である免疫化プロトコルでは、意図していない 毒性がもたらされることがある。その結果、規則的に脱落もしくは再生する組織 （例えば、皮膚）におよび／または生体内で摩耗速度が比較的高い細胞（例えば 、抗原提示細胞）に遺伝子を導入することは、遺伝子免疫化のための一層有用な 経路であろう。 遺伝子の送達系について、遺伝子を宿主のゲノムに導入するウイルスベクター のような手段には、宿主細胞内の遺伝物質の損傷を伴う潜在的な健康面の危険性 がある。遺伝子を生体内で送達するのにカチオンリポソームまたはバイオリステ ィックデバイス（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｄｅｖｉｃｅ）（すなわち、ビーズに結 合されたポリヌクレオチドを組織に「発射する」ワクチン「ガン」）を使用する ことは準備集中的であり、かつ標的細胞に伝達するのに適切な粒子の大きさを選 択するいくつかの実験を行う必要がある。さらに、ヌクレオチドを導入する侵襲 的な手段（例えば、注射）には、（特に長期治療の場合）組織外傷の問題があり 、例えば臓器のような特定の標的組織に対するアクセスが制限される。 イオン導入法その他の経皮伝達方法のようなペプチドの医薬製剤を無侵襲的に 送達する手段には、少なくとも組織の外傷を最小にする利点がある。しかし、経 皮もしくは粘膜による伝達がなされるペプチドの生物学的利用率は、これらの組 織中のプロテアーゼの濃度が比較的高いので限定される、と信じられている。さ らにあいにく なことに、ペプチドをコードする遺伝子を経皮または粘膜で伝達することによっ てペプチドを送達する高信頼性の手段は、まだ入手できない。 裸遺伝子を生体内で発現することによるペプチドの成功裡の投与における利点 は、サイトカインタンパク質類（例えば、インターロイキン−２、以後「ＩＬ− ２」と呼称する）を患者に投与して老化に伴う疾患を治療または予防する免疫療 法の現状と比較することによって、説明することができる。 哺乳類の種は、生活様式と寿命が異なるにもかかわらず、ほとんどすべての哺 乳類の種に、老化過程の一部としてある種の疾患が起こる。これらの疾患として は、癌、高血圧症、血管障害および糖尿病になることがあるインスリン抵抗性が ある。これら疾患の発症のタイミングは環境因子だけが原因であると考えられる ことはできないので、その発症は遺伝的にプログラムされていると考えられてい る。しかし、実際に老化過程および年齢に関連する疾病の発生を制御するプロセ スは知られていない。 一般に、老化には、外因性抗原に対し免疫応答を行う能力の低下、機能の余力 およびストレスに対する応答の低下、ならびに線維症への傾向の増大が付随して いる。これらの状態はすべて、循環サイトカイン類が関与しているかまたはこれ らサイトカイン類によって生体内で一部制御されている。 例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）タンパク質は、グルコース恒常性 に影響し、インスリン耐性のＣ５７ＢＬ／Ｋｓ ｄｂマウスとＣ５７ＢＬ／６Ｇ ｏｂ／ｏｂマウスに対して血糖降下薬として作用することができる（Ｄｅｌ Ｒｅｙ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８６巻、５９４ ３頁、１９８９年）。成人発症型糖尿病のこれら動物モデルの場合、ヒト組換え ＩＬ−１を１回注射すると、グルコース血中濃度が数時間正常になる。またＩＬ −１は、食欲に影響する視床下部下垂体軸およびスト レスに対する応答に対して作用することも知られている。したがって、ＩＬ−１ の産生または応答性が異常であると、老化に伴うインスリン非依存性糖尿病と肥 満の両方が起こる基になる。それ故、ＩＬ−１遺伝子療法（ＩＬ−２について記 載されているのと正確に同じに投与して）によって、マウスとヒトにおける糖尿 病の発症が防止される。 高血圧症は、糖尿病とともに起こることが多い老化の別の随伴症である。最近 の研究によって、血圧を主に調節するのは内皮性弛緩因子の酸化窒素であること が分かった。酸化窒素の産生は、ＩＬ−１によって調節される。したがって、老 化とともに起こる血圧の上昇も、ＩＬ−１遺伝子療法によって予防することがで きる。ＩＬ−１タンパク質は、動物に急激に投与すると、発熱させショックを起 こすこともある。しかし、身体遺伝子療法によって低濃度のＩＬ−１を続けて産 生すると、これらの副作用は回避される。 医薬投与量のサイトカインタンパク質類の投与による生物学的効果に関する研 究が最近研究者達によってなされており、免疫系を刺激してある種の病原体に対 するその応答を増大しそして例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した 患者などのような免疫不全の患者の免疫機能を維持しようとの探索が進んでいる 。 具体的に述べると、免疫系疾患の治療薬としてＩＬ−２を投与する試みが最近 次のようにいくつも報告されている。すなわち、Ｔｅｐｐｌｅｒ他、Ｊ．Ｅｘｐ ．Ｍｅｄ．、１７７巻、４８３〜４９２頁、１９９３年（組換えＩＬ−２タンパ ク質とポリエチレングリコールの接合体のＨＩＶ感染患者に対する投与）、Ｃａ ｌｉｇｕｉｒｉ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９１巻、１２３〜１３２頁 、１９９３年（進行癌の患者に対する組換えＩＬ−２タンパク質の長期注入）、 およびＫａｐｌａｎ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻、１５７〜１６ ２頁、１９９２年（マラバーらい（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）またはＨＩＶに感染した 患者に対するＩＬ−２の投与） がある。これら研究の中心は、ＩＬ−２タンパク質を、その毒性を最小にする方 法で投与する手段を開発することである。 ＩＬ−２タンパク質の毒性は、その有効な治療薬としての使用に対する主な障 害になっている。ＩＬ−２療法は、効果的であるためには、一般に、投与された タンパク質が、高アフィニティーのＩＬ−２受容体を飽和しかつ循環ナチュラル キラー（ＮＫ）細胞を著しく膨張されるのに充分な量で血清中に存在している必 要がある。しかし、高投与量のＩＬ−２は、重篤な低血圧症、肺水腫、腎不全、 心臓不整脈および神経機能障害などの致命的な毒性をもたらす。この問題を克服 するために上記研究者達が採用した方法は、感染および／または疾患が発症した 後、比較的少ない投与量でＩＬ−２タンパク質を長期間投与して実験する方法で あった。しかし、この方法は、矛盾のない予測可能なＩＬ−２療法に対して効果 的なパラメータを定義しなければならない。特に、サイトカイン類の導入によっ てもたらされる循環タンパク質の濃度は、プロテアーゼで分解されるためもあっ て、時間が経過するにつれて相当に変化する。したがって、繰り返し注射する必 要があり、その結果、患者が利用できるタンパク質の量に「山と谷」が生じる。 さらに、ＩＬ−２による研究は、類似の方法が、相当の臨床実験を行った後でも 、年齢に関連する疾病を含む各種の病状で役割を果たす他のサイトカイン類を使 用する場合確実に有効なのかどうかを示していない。 したがって、タンパク質（サイトカイン類と抗原類が含まれるがこれらに限定 されない）の毒性を最小にする方法でタンパク質を宿主に導入する効果的な手段 が要求されている。さらに具体的に述べると、確実にしかし治療量以下の濃度の タンパク質を長期間発現させるような方法で宿主にタンパク質を導入する手段も 要求されている。後者の場合、特に年齢関連疾病と予防・治療するためサイトカ イン類を投与する手段が要求されている。 さらに広げて述べると、上記考察は、皮膚と粘膜に局所免疫を誘 発して例えば性的感染症と呼吸器疾患に対して宿主に予防接種できるペプチドを 生体内で発現する裸ヌクレオチドを導入する有効な手段に対する要求も示してい る。また、組織に著しく外傷を与えることなく組織特異的な方法で、生物活性ペ プチドをコードする遺伝子を、宿主に導入する手段に対する要求も示唆されてい る。 本発明はこれらの全ての要求に取り組むものである。発明の概要 本発明の好ましい実施態様の詳細を、添付図面と以下の説明で述べる。本発明 の詳細を一旦知ると、当該技術分野の当業者にとって多くの追加的な革新および 変更が自明であろう。 １．定義 以下の定義は、本発明の考察を簡単に行えるように提供するものである。しか し、当該技術分野の当業者は、これらの定義は、本発明の適法の範囲および精神 から逸脱することなく、均等物を含むよう拡大できることが分かるであろう。こ の理由により、これらの定義は、本発明を限定すると解釈すべきでない。 ａ．「裸のポリヌクレオチド」は、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味し、かつ本発明に よって実施される治療法の目的に対し適当なセンスストランドとアンチセンスス トランドを含む。この場合のポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドが含ま れる場合もある。この文脈における「裸の」は、コロイド物質（リポソーム製剤 を含む）と複合したり、ポリヌクレオチドを宿主ゲノム中に取り込ませるベクタ ー中に含有さたりしていないポリヌクレオチドを意味する。 ｂ．「作動的にコードしている」（Ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ）は、所望の翻訳産物例えばペプチドまたはタンパク質の発現、および所望の場 合、分泌を行うのに必要なプロモーター などの配列を含有するよう修飾されたポリヌクレオチドを意味する。本発明の実 施態様はすべて公知のプラスミド発現ベクターを使用して実施することができる 。好ましくは、これらのベクターは、所望の翻訳産物をコードするｃＤＮＡを含 有している。したがって、特にことわらない限り、「ポリヌクレオチド」または 「裸のポリヌクレオチド」は、適切なプラスミド発現ベクターに含有されている 作動的なコーディング配列を意味する。 ｃ．「ポリヌクレオチドの混合物」は、同じプロモーターの制御下にある２種以 上２００種までのポリヌクレオチドの種を意味するものとする。 ｄ．「合成」は、ポリヌクレオチドの配列を合成する公知の手法を意味し、未変 性ポリヌクレオチドの単離と精製を含む。 ｅ．「ペプチド」は、生体内で所望の生体作用を有する、小ペプチド類、ポリヌ クレオチド類、オリゴペプチド類およびタンパク質を意味する。 ｆ．「イオン導入法」は、ペプチド類を宿主に連続的に送達するのに現在使用さ れている公知の経皮透過手法を意味する。さらに具体的に述べると、その手法は 、生理的に許容される電流を加えることによってイオン種の輸送を容易に行える ようにするプロセスである。このプロセスおよび他の経皮透過手法は、Ｃｈｉｅ ｎ他、Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、「Ｎｏｖｅｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、７章、Ｃ項（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，１９９２年）に記載されており、その関連する開示事項は、医薬 送達の技術に関する当該技術分野の知識の状態を示す目的で本明細書に援用する ものである。 ｇ．「界面活性剤／吸収促進剤」は、特定の小分子およびペプチド類の吸収と移 入を容易にする、当該技術分野で現在公知の化学薬剤を意味する。 ｈ．「抗原提示細胞」すなわち「ＡＰＣ」には、ランゲルハンス細 胞、輸入リンパ管のベール細胞、樹状細胞、およびリンパ系臓器の指状突起細胞 などの公知のＡＰＣが含まれる。また、この定義には、（１）この発明のポリヌ クレオチドを皮膚に吸収し発現するリンパ球とマクロファージ、および（２）本 明細書に含まれている組織写真に示す単核細胞などのような単核細胞も含まれて いる。これらの細胞は、組織細胞ではないが、抗原提示細胞と考えられる。本発 明にとってこれらの細胞の中で最も重要なものは、表皮、ならびに頬粘膜、腟、 子宮頚および食道の偏平粘膜上皮（ＡＰＣの濃度が「比較的高い」領域）を含む 、上皮およびリンパ組織の胸腺依存性領域中に多数存在していることが知られて いるＡＰＣである。したがって、本明細書で使用する「皮膚」と「粘膜」という 用語は、下記のそれらの定義に加えてＡＰＣが集合している部位を特に意味して いる。 ｉ．「宿主」は、本発明によって実施される療法の受容者を意味する。宿主は、 任意の脊椎動物でもよいが、好ましくは哺乳類である。宿主は、哺乳類の場合、 ヒトが好ましいが、家畜もしくはペットの動物でもよい。 ｊ．「標的組織」は、裸のポリヌクレオチドの発現が求められている宿主の組織 を意味する。 ｋ．「皮膚」は、本明細書では、宿主の表皮、真皮および皮下の組織を意味する 。 ｌ．「粘膜」は、身体内に位置している宿主の粘膜組織を意味し、限定されない が、呼吸流路（気管支流路、肺上皮および鼻腔上皮を含む）、生殖器流路（腟、 陰茎および肛門の粘膜を含む）、尿流路（例えば尿道、膀胱など）、口、眼、な らびに声帯を含む。 ｍ．「侵入点」は、すぐ隣接している組織をんで、裸ポリヌクレオチドを宿主に 導入する部位、を意味する。 ｎ．「代理終点（Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ Ｅｎｄ Ｐｏｉｎｔ）」は、疾患が発症 する直前に起こる宿主の生物学的状態を意味する。その 例としては、糖耐性の損失（糖尿病）、コレステロール濃度の増大（心臓病）お よび血液中および尿中に遊離ラジカルのアミノ酸が存在すること（これは中枢神 経系において遊離ラジカルを解毒する酵素が損失していることを意味する）が挙 げられる。 ｏ．「生物学的欠陥」は、哺乳類の老化に伴う、免疫機能または良好な健康状態 の損失（疾患および宿主の疾患に対する抵抗性の欠陥を含む）を意味する。 ｐ．「治療量以下の濃度」および「治療量以下の投与量」は、裸のポリヌクレオ チドを宿主に一回非累積的に投与することによって発現されたペプチドに対して 宿主が急性の検出可能な応答を起こすのに不充分な量で、裸ポリヌクレオチドが 宿主内で行うペプチドの発現を意味する。 ｑ．「真皮」および「表皮への投与」は、裸ポリヌクレオチドを皮膚にまたは皮 膚を通じて与える投与経路を示す。真皮経路としては、真皮内と皮下の注射およ び経皮透過がある。表皮経路としては、刺激体に対して免疫応答を誘発するのに 充分に皮膚の最外層を刺激する手段がある。その刺激体としては、機械的または 化学的（好ましくは局所用の）物剤がある。 ｒ．「上皮投与」は、化学的刺激剤が粘膜の上皮に塗布されることを除いて、化 学薬剤の表皮投与とほとんど同じ方法である。 ｓ．「ＩＬ」は、インターロイキンを意味する。 ｔ．「ＴＨＩ応答」は、ある種のＡＰＣすなわちマクロファージ類ゃや樹状細胞 類に結合してそれらを活性化する抗原によって優先的に誘発される体液免疫応答 を意味する。 ｕ．「生物活性ペプチド」は、宿主に投与した場合、宿主内で治療利点を発揮す るかまたは免疫応答を誘発するペプチドを意味する。 ２．考察 一面において、本発明は、抗原またはペプチドを作動的にコード する（を作らせるための遺伝子コードを持っている）裸のポリヌクレオチドを宿 主の細胞に送達することによって、抗原に対する局所免疫または治療用のペプチ ドもしくはポリヌクレオチドに対する全身応答を誘発する方法で構成されている 。さらに詳しく述べると、裸ポリヌクレオチドは、身体の他の組織と比べて比較 的高濃度の抗原提示細胞を含有している組織に送達することが好ましい。本発明 は、関与する発現メカニズムについて特定の原理によって完全には限定されない が、ポリヌクレオチドが単核細胞、恐らく宿主の抗原提示細胞によって発現され るので、裸のポリヌクレオチドの投与によるこれら組織内での生物学的応答が達 成されると考えられる。また、該単核細胞は、裸ポリヌクレオチドの導入に対す る炎症性免疫応答に関与していると考えられる。 組織学的研究によると、裸のポリヌクレオチドは、有意な量で、線維芽細胞な どの組織細胞によって直接には吸収されないようである（実施例９と図１５を参 照）。この結論は、（１）微量の裸ポリヌクレオチドをマウスに真皮内投与して さえも顕著なＴＨ１応答を誘発したこと（マクロファージと樹状細胞による抗原 提示を示唆、実施例１７と図２４〜２５を参照）、（２）裸ポリヌクレオチドを マウスに真皮内投与を行うと、検出可能な濃度の抗体の産生を刺激することなく 、細胞障害性Ｔ細胞の生成を誘発したこと（実施例１５と図２１を参照）、およ び（３）抗原としてのポリヌクレオチドに対して長期の免疫記憶が誘発されるこ と（実施例１６と図２２〜２３）を示す研究結果によって裏付けられている。 本発明のこの方法において炎症が明確な役割を演じているとすれば、炎症に伴 い標的組織の細胞膜の透過性が増大して裸ポリヌクレオチドの取り込み（特に皮 膚と粘膜などのようなバリヤーを越えての取り込み）が促進されることは、当該 技術分野の当業者にとって十分に評価されることであろう。 標的組織として理想的なのは、皮膚または粘膜である。これらの 組織は、局在した治療または免疫の応答を誘発することが望ましい感染症または 疾患に対して治療が行われる場合、特に好ましい。例えば、粘膜経路の投与は、 感染組織における抗原に対する免疫応答を追加刺激するために治療を行う性的感 染症の治療に好ましい。鼻腔内経路の投与（吸入または吹入による）も、呼吸器 疾患とその関連疾患を治療する療法に対し特に有用である。さらに、粘膜または 真皮の経路は、アレルゲンに対する免疫化を行うのに有用である。また、これら の組織は、再生する性能があるため、導入された物質が侵入点に留まっている期 間が制限されるので好ましい。 標的組織中に存在している抗原提示細胞が裸ポリヌクレオチドの発現を仲介す る働きをもっているので、本発明の方法は、局在応答を誘発するのに有用である ほどに発現されたペプチドに対する全身応答を誘発するのには有用ではない。し かし、投与量が充分な場合は、一過性全身効果を誘発することができる。したが って、発現されたペプチドに対する全身応答を誘導する本発明のこの面での有用 な用途は、他の全身治療のアジュパントとしての用途であろう。 本発明の別の面としては、ＡＰＣは伝達体として働き、裸のポリヌクレオチド をリンパ系臓器および侵入点以外の粘膜組織に送達する。この実施態様を、以下 の仮定にを参照しながら説明するが、記載されているメカニズムは、本発明を限 定するように解釈すべきではない。 この実施態様においては、ＡＰＣは、裸ポリヌクレオチドを侵入点またはその 近傍で吸収し、次いでリンパ循環系に送る。ＡＰＣは、リンパ節に到達すると、 発現されたタンパク質を抗原として提示して、免疫応答を刺激する。そこから、 例えば粘膜から、「ホーミング」受容体を保有するこれらＡＰＣは、リンパ循環 系に再び入り、侵入点の組織以外の標的細胞に定着するまで循環していく。所望 により、ホーミング受容体（標的細胞リガンドに結合する特異的膜タンパク質） の配列が決定され、裸ポリヌクレオチドに組み込まれる。 リンパ系での発現について、この実施態様は、サイトカイン類を送達すること によって、宿主の応答性を高めて、宿主中に存在する特異的サイトカイン類の濃 度を増大させる手法も提供する。特に、リンパ系臓器において、循環サイトカイ ン類（抗原投与とともにまたはそれから短時間後に投与された）の宿主濃度が増 大すると、病原体抗原に対する宿主の免疫応答を追加増大させることができ、そ して（１）ワクチンのアジュバントとして働き、（２）自己免疫疾患における自 己抗原に対する免疫応答を減少させ、または（３）アロ抗原（例えば、組織また は臓器の移植の後で産生される）に対する免疫応答を減少させる。 対象の遺伝子を保有するＡＰＣがリンパ節から移動して、ＡＰＣがホーミング 受容体を持っている組織まで循環する場合、その遺伝子は、接近可能な侵入点に 投与し、不便で接近しにくい部位で発現させることができる。例えば、鼻腔内に 送達された裸ポリヌクレオチドは、適当な条件下で、生殖器の粘膜で発現される 。 本発明の他の用途は、抗原に対するアレルギー反応を和らげる用途である。こ の点では、鼻の投与経路が特に有用である。 例えば、ＩＬ−２、γインターフェロンおよび／または形質転換成長因子（Ｔ ＧＦβ）の遺伝子を投与して、ＩｇＥ分子の産生を抑制することができる。最近 の臨床試験で、ＩＬ−２とγインターフェロンは、ＩｇＥの産生を妨害するのに 充分な投与量で毒性であることが確認されたので、上記方法は特に興味深い。そ のうえ、ＩｇＥ分子は、皮膚と粘膜中に支配的に存在しているので、本発明の侵 入点としてこれらの経路を使用すると、これらの組織でのアレルギー反応を和ら げるのに特に効果的であると期待できる。 皮膚または粘膜で局在応答を誘発することが有用な場合の実施例が現存する。 特に、粘膜経路の投与は、性的感染症を治療する場合に好ましい。この療法は、 ＨＩＶ、ヒト乳頭腫ウイルス（生殖器のいぼの生成に関与しているウイルスなど ）などの感染因子または皮 膚ウイルス感染症に対する局所免疫応答を調節するのに用いることができる。ま た、免疫抑制が治療面で価値がある場合、免疫抑制因子（例えばＴＧＦβ）を有 効にコードする遺伝子も本発明の方法によって供給することができる。この方法 が有用な場合の実施例は、炎症性腸疾患を治療する場合である。 本発明の特に有用な局面は、老化に伴う疾病の発症に関連するサイトカイン類 及び生化学物質を、治療量以下の濃度で長期間、宿主に供給するための本発明の 利用である。この局面では、裸のポリヌクレオチドは、サイトカインまたは関連 成長因子のようなタンパク質を作動的にコードし、これらのタンパク質が哺乳類 の循環系中に存在するかしないかで老化に伴う疾病の発生を容易にしたり遅延さ せたりするという具合に、免疫系を刺激する。このような疾病は、その血清中濃 度が通常年齢とともに減少するペプチド類、例えばサイトカイン類、成長ホルモ ン類および酵素類（例えば、ヒトのα−Ｌフコシダーゼ、これは抗原に対する炎 症性応答を仲介する）の濃度を増大させることによって抑制することができる。 本発明のその外の特別な利点は、比較的少ない投与量の抗原を投与することで ある。さらに具体的に述べると、抗原を作動的にコードするであろうポリヌクレ オチドが抗原自体の代わりに投与されるので、宿主に導入される異物質の量が比 較的少ない。さらに、裸ポリヌクレオチドの皮膚または粘膜を通じての投与経路 は、同じ強さの免疫応答を起こすのに必要なＤＮＡの濃度が筋肉内投与経路の場 合より低い（例えば、約１／１０〜１／５０である。例えば、実施例１６と図２ ２〜２３を参照）。その結果、本発明は、例えば多価ワクチンとして用いるため 、数百種もの異なる抗原をコードする裸ポリヌクレオチドを投与するのに役立つ 。 本発明の他の特別な利点は、アンチセンス療法での使用である。簡潔にいうと 、特定の障害が特定の変異した核酸配列の発現と関連している場合、その変異遺 伝子が転写もしくは翻訳の段階で特異的 な発現を行うのを妨害するヌクレオチド配列を使用することができる。この手法 は、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／またはリボザイムを利用し 、特異的な変異ｍＲＮＡをアンチセンス核酸でマスクするかまたは該ｍＲＮＡを リボザイムで切断することによって、該ｍＲＮＡの転写または翻訳を遮断する。 アンチセンス核酸は、特異的ｍＲＮＡ分子の少なくとも一部分に対して相補的 なＤＮＡまたはＲＮＡの分子である（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉ ｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ、２６２巻、４０頁、１９９０年）。現在までに、いくつ かの遺伝子や癌遺伝子がサプレッションまたはダウンレギュレーションのために 標的になっており、以下のものがある。すなわち、限定されないが、ｐ５３（Ｖ ．Ｓ．Ｐｒａｓｏｌｏｖ他、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（モスクワ）、２２巻、１１０ ５〜１１１２頁、１９８８年）、ｒａｓ（Ｓ．Ｋ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ他、Ｍｏｌ ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２６巻、９８５〜９９１頁、１９８９年、Ｄ．Ｂｒｏｗｎ 他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓ．、４巻、２４３〜２４９頁、１９８９年）、ｆ ｏｓ（Ｂ．Ｌｅｖｉ他、Ｃｅｌｌ．Ｄｉｆｆｅｒ．Ｄｅｖｌ、２５巻（Ｓｕｐｐ ｌ）、９５〜１０２頁、１９８８年、Ｄ．Ｍｅｒｃｏｌａ他、Ｇｅｎｅ、７２巻 、２５３〜２６５頁、１９８８年）、およびｍｙｃ（Ｓ．Ｏ．Ｆｒｅｙｔａｇ、 Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、８巻、１６１４〜１６２４頁、１９８８年、Ｅ ．Ｖ．Ｐｒｏｃｈｏｗｎｉｋ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、８巻、３６８ ３〜３６９５頁、１９８８年、Ｓ．Ｌ．Ｌｏｋｅ他、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４１巻、２８２〜２８８頁、１９８８年） である。 それは、全ての症例において、標的の変異遺伝子の産生を遮断するのに充分で はない。Ｌｅｖｉｎｅ他が報告しているように（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｉｓｉｃａ Ａｃｔａ、１０３２巻、１１９〜１３６頁、１９９０年 ）、腫瘍表現型に寄与する 突然変異には少なくとも５種類ある。したがって、多重突然変異遺伝子の障害の 各突然変異を標的にすることにより、アンチセンス療法の利点を最適化しなけれ ばならない。本発明の方法は、ポリヌクレオチドの混合物を送達するのに特に適 しているので、多重突然変異のアンチセンス療法に特に有用である。 また、アンチセンス療法は、例えばIII型、IV型およびＬｅｖｉｎｅらの前掲 文献に記載されているIII型に似ているＶ型の変異で新生物細胞を産生する確率 を増大するよう直接作用する変異タンパク質の産生を遮断するのにも使用できる 。また、アンチセンスポリヌクレオチドは、突然変異が顕著でない場合、例えば 適正なタンパク質をコードする非突然変異対立遺伝子が残っている場合、治療上 効果的である。しかし、突然変異がＩ型突然変異の場合のように顕著なとき、お よびある種のIII型突然変異の場合のような両方の対立遺伝子が欠失しているか または一方が欠失して他方が突然変異体であるとき、アンチセンス療法に続いて 置換療法を行うことが好ましい。 置換療法では、変異遺伝子またはガン原遺伝子を持っていると確認された標的 細胞に、その確認された変異遺伝子に関連する障害または異常増殖が起こるのを 未然に防止するのに必要な野生型タンパク質を産生する野生型遺伝子が導入され る。 腫瘍サプレッサー遺伝子の場合、サプレッサー遺伝子を培養細胞中に導入する と、細胞死が起こるかまたは識別できる変化が全く起こらないが、これらの細胞 は動物内でもはや腫瘍形成性でなはいことが知られている。したがって、リボザ イムおよび／またはアンチセンスの療法を遺伝子置換療法とともに行う場合、リ ボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドが特異的である変異遺伝子を含 有する細胞集団が、治療中の患者内での異常増殖の発生にもはや寄与しなくなる 機会が増大する。 また、本発明は、癌状態すなわち特定の遺伝子の欠失または特定の遺伝子内の 多形性によって仲介される細胞増殖障害を治療する遺 伝子療法を提供するものである。この療法は、変異遺伝子によって起こる増殖障 害をもっていると本発明の方法で確認された細胞に、特異的なアンチセンスポリ ヌクレオチドおよび／または置換野生型遺伝子を導入することによって、その効 果を達成する。その細胞が、多形性を有する遺伝子の複製を防止するために、ア ンチセンス療法のみならず野生型遺伝子の置換も必要なのかどうかは、事例ごと に決定されねばならず、そしてその変異が顕著な効果をもっているのかどうか、 すなわち、その野生型遺伝子の両方の対立遺伝子が破壊されてその遺伝子が全く 存在しないことが細胞増殖効果をもっているのかどうか、によって決まる。 皮膚にまたは皮膚の近傍に局所免疫を誘発する好ましい投与経路は、経皮透過 、真皮内注射、または表皮細胞の最外層の表面のひっかきもしくは刺激（すなわ ち表皮投与）による経路であるが、皮下注射もある種の用途に用いられ得る。呼 吸道に局所免疫を誘発するのに好ましい投与経路は、吸入または吹入による経路 であるが、他の粘膜組織への投与経路はその所在によって変わる。 裸のポリヌクレオチドを皮膚または粘膜に導入すべき場合、界面活性剤、吸収 促進剤、化学的刺激剤（例えば、角質溶解剤）または機械的刺激体を用いること により、注射の必要なしに、ポリヌクレオチドを容易に送達できることが好まし い。遺伝子以外の小分子の取り込みを容易にする界面活性剤および吸収促進剤は 、当該技術分野で公知であり、過度の試験を行うことなく遺伝子の取り込みを容 易にするため使用するのに適応させることができる。裸のポリヌクレオチドを導 入するその他の実質上非侵襲の手法は、ペプチドの経皮透過に用いて成功してい る経皮透過による方法（好ましくはイオン導入法）である。 循環するサイトカイン類および関連ペプチドの産生を刺激する本発明の実施態 様の場合、非経口の投与経路を用いることができるが、宿主の組織にほとんど侵 襲しないか全く侵襲しない経路を用いるこ とが非常に好ましい。しかし、裸のポリヌクレオチドは繰り返し投与する必要が あるので、筋肉内注射は好ましくない。代わりに、裸のポリヌクレオチドを、皮 膚および粘膜のような再生する身体の領域に導入することは、これらの領域が、 各投与に伴う外傷によって直接冒される細胞を置換する性能をもっているので、 好ましい。本発明のこれらの実施態様で発現させるタンパク質を確実に分泌させ るため、当該技術分野の当業者にとって公知の分泌を制御する配列を、このよう な配列が全長の遺伝子中にまだ存在していない場合、投与される裸のポリヌクレ オチド中に含有させる。 さらに、ポリヌクレオチドは、治療量以下の濃度でペプチドを送達する本発明 の実施態様で用いる場合、リポソームに接合されるか、または生体外でそのポリ ヌクレオチドによってトランスフェクトされた細胞で送達されてもよいことに留 意すべきである。しかしながら、先に考察した理由から、これらの実施態様では 、裸のポリヌクレオチドと粘膜または真皮の投与経路を用いることがやはり好ま しい。特に、リポソームを使用すると発現レベルが低下するようである。この現 象は、リポソームを抗原物質として認識するＡＰＣの性能が低いことが原因のよ うである。図面の簡単な説明 図１は、ｐＲＥＶｋ３およびｐＲＳＶＩＬ−２を筋肉内注射した後の慢性炎症 （パネルＡ）と筋壊死（パネルＢ）を示す筋肉組織の断面を示す。パネルＣはｐ ＲＥＶＫ３またはｐＲＳＶＩＬ−２を皮下注射した後の類似の筋肉組織の断面を 示す。 図２Ａは、裸のｐＣＭＶＲＮＰを真皮内注射した後の血清中抗ＮＰＩｇＧのＥ ＬＩＳＡ分析結果を示し、図２Ｂは、裸のｐＣＭＶＲＮＰを筋肉内注射した後の 血清中抗ＮＰＩｇＧのＥＬＩＳＡ分析結果を示す。 図３は、裸のｐＣＭＶＲＮＰをＢａｌｂ／ｃマウスの鼻腔内に導入する前の抗 ＮＰＩｇＧのＥＬＩＳＡ分析結果を示す。 図４は、麻痺されていない群のＢａｌｂ／ｃマウスの抗ＮＰＩｇＧのＥＬＩＳ Ａ分析結果を示す。 図５は、麻酔された群のＢａｌｂ／ｃマウスの抗ＮＰＩｇＧのＥＬＩＳＡ分析 結果を示す。 図６は、ｐＲＳＶＩＬ−２とｐＲＳＶＩＬ−４（パネルＡ）およびｐＲＳＶＴ ＧＦβ１（パネルＢ）を筋肉内注射されたマウスの血清中の抗ＫＬＨの濃度のＥ ＬＩＳＡ分析結果を示す。 図７は、ｐＲＳＶＩＬ−２（パネルＡ）、ｐＲＳＶＴＧＦβ１（パネルＢ）お よびｐＲＳＶＴＧＦβ（パネルＣ）を筋肉内注射した後のマウスの血清中の抗ト ランスフェリンの濃度のＥＬＩＳＡ分析結果を示す。 図８は、（ｐＲＳＶＩＬ２とｐＲＳＶＴＧＦβを注射されたマウスにおける） 抗原投与（ａｎｔｉｇｅｎ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）後の足蹠腫検定の結果を示す 。 図９は、ｐＲＳＶＩＬ−２およびｐＲＳＶＴＧＦβを注射されたＭＲＬ／ｌｐ ｒ／ｌｐｒマウスの抗クロマチン血清中濃度のＥＬＩＳＡ分析結果を示す。 図１０は、個々のＡＫＲ／Ｊマウスが時間の経過につれて示すＩＬ−２発現量 のＥＬＩＳＡ分析結果を示す。 図１１は、図１０に記載されているマウスの長命データを示す。 図１２は、治療量以下の濃度でＩＬ−２遺伝子の発現を起こすのに充分な投与 量で裸のポリヌクレオチドを導入した後の、ＡＫＲ／Ｊマウス（マウスリンパ腫 のモデル）のＮＫ細胞の細胞溶解活性の51Ｃｒ放出検定試験の結果を示す。 図１３（ａ）−（ｂ）は、若いＢａｌｂ／ｃマウスと老年のＢａｌｂ／ｃマウ スに裸ｐＲＳＶＩＬ−２を異なる投与量で投与した後のＩＬ−２発現のレベルを 示す。 図１４は、異なる侵入点でｐＲＳＶＩＬ−２を投与した後、血清中に検出され たＩＬ−２発現のレベルを示す。 図１５は、Ｂａｌｂ／ｃにおけるｐＣＭＶＲＮＰの侵入点での皮膚の組織学的 試験の結果を示す写真であり、単核細胞（ＡＰＣ）によるプラスミドの取り込み を示している。ＡＰＣは矢印で示し、組織細胞（プラスミドを含有していない） は傾斜線（ｓｌａｓｈｅｄ ｌｉｎｅ）で示してある。 図１６は、裸のｐＣＭＶＲＮＰをＢａｌｂ／ｃマウスに機械的に表皮に投与し た後の抗ＮＰＩｇＧのＥＬＩＳＡ分析結果を示す。 図１７は、裸のｐＣＭＶＲＮＰをＢａｌｂ／ｃマウスに化学的に表皮に投与し た後の抗ＮＰＩｇＧのＥＬＩＳＡ分析結果を示す。 図１８は、ＩＬ−２をコードする裸のポリヌクレオチドを投与した後、時間の 経過につれて血清中に検出されたＩＬ−２発現の安定性を示す。 図１９は、裸のｐＣＭＶＲＮＰを真皮内に注射されたＢａｌｂ／ｃマウスにウ イルス投与がなされた後に生存した期間を示すカプラン−マイヤー生存曲線を示 す。 図２０は、ＣＭＶまたはＲＳＶのプロモーター配列を含有する裸のプラスミド を別個に真皮内に注射した後のＮＰ遺伝子の発現をグラフで比較して示す。 図２１は、各種の裸プラスミドを真皮内に注射した後、マウス内に検出された 細胞障害性Ｔ細胞のレベルを示す。 図２２は、（１）β−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチドを筋肉 内もしくは真皮内に注射して投与した後、および（２）β−ガラクトシダーゼを 真皮内に注射して投与した後の、抗β−ガラクトシダーゼ抗体のＥＬＩＳＡ分析 結果を示す。 図２３は、抗原のブースター注射を行った後の図２２に示すマウス由来の血清 中抗β−ガラクトシダーゼ抗体のＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。 図２４は、（１）β−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチドを真皮 内または筋肉内に注射したマウスまたは（２）該酵素を真皮内に注射したマウス の血清中ＩｇＧ２Ａ型抗体のＥＬＩＳＡ分析結果を示す。 図２５は、（１）β−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチドを真皮 内または筋肉内に注射したマウスまたは（２）該酵素を真皮内に注射したマウス の血清中ＩｇＧ１型抗体のＥＬＩＳＡ分析結果を示す。 図２６は、抗原のブースター注射を行った後の図２５に記載のマウスの血清中 ＩｇＧ２Ａ型抗体のＥＬＩＳＡ分析結果を示す。 図２７は、抗原のブースター注射を行った後の図２４に記載のマウスの血清中 ＩｇＧ１型抗体のＥＬＩＳＡ分析結果を示す。 図２８は、（１）β−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチドでコー トされたとがった先端で皮膚をひっかくことによって導入されたマウスまたは（ ２）該酵素を真皮内に注射されたマウスの血清中ＩｇＧ２Ａ型抗体のＥＬＩＳＡ 分析結果を示す。 図２９は、（１）β−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチドでコー トされたとがった先端で皮膚をひっかくことによって導入されたマウスまたは（ ２）該酵素を真皮内に注射されたマウスの血清中ＩｇＧ１型抗体のＥＬＩＳＡ分 析結果を示す。発明の詳細な説明 この説明を通じて示される実施態様および実施例は、代表例とみなすべきであ り、本発明を限定するものではない。 Ｉ．相当な濃度の抗原提示細胞を有する標的組織への裸のポリヌクレオチドの導 入 Ａ．裸のポリヌクレオチドの製造 本発明に使用されるポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡでもよいが、相 補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列が好ましい。本発明で用いられるポリヌクレオチド 配列は、（ａ）発現可能であり、かつ（ｂ）非複製性（ｎｏｎｒｅｐｌｉｃａｔ ｉｎｇ）であるかまたは宿主ゲノム中に複製されないように当該技術分野で公知 の手段で処理しなければならない。本発明に使用するのに適切なポリヌクレオチ ドの製造について以下に説明し、次いで特定のポリヌクレオチドの組成物の製造 法を示す具体的な実施例を以下に提供する。しかし、非複製性ポリヌクレオチド の他の公知の製造法も適切なものであることは当該技術分野の当業者にとって明 らかなことである。 本発明に使用するポリヌクレオチドは、当該技術分野で公知のハイブリッド形 成法を用いて得ることができる。また、ＤＮＡとＲＮＡは、当該技術分野で公知 の自動核酸合成装置を用いて合成することもできる。ポリヌクレオチドの混合物 を生成させるのに、公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することが特 に好ましい。ゲノム核酸類は、Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏ ｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２章と４章（Ｗｉｌｅ ｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９年）に記載されているプロトコルなど の当該技術分野で公知の方法で製造することができる。ＣＤＮＡは、当該技術分 野で公知の方法で製造することができる（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ他、Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓ ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ）米国ニューヨーク、１９８２年）を参照） 。また、対象のポリヌクレオチドを含有するｃＤＮＡ発現ライブラリーも当該技 術分野で公知の方法によって選別することができる。参考のため、上記の方法の 実施例を以下の考察によって説明する。 特定の用途に用いる好ましいポリヌクレオチドは、先に述べた発明の概要の項 で提案されている。例えば、本発明の裸のポリヌクレオチドは治療用ペプチドを 作動的にコードできるが、抗原として作用して体液応答および／または細胞応答 を刺激することができる免疫原性ペプチドをコードする方が好ましい。また、裸 のポリヌクレオチドは抗体を作動的にコードすることができる。この点について 、「抗体」という用語には、あらゆるクラスの全免疫グロブリン、キメラ抗体類 、二重もしくは多重の抗原特異性を有するハイブリッド抗体類、およびハイブリ ッドフラグメントを含有するフラグメントが含まれる。また、「抗体」の意味の 中には、そのようなフラグメントの接合体、および例えば米国特許第４，７０４ ，６９２号に記載されているようないわゆる抗原結合タンパク質類（一本鎖の抗 体類）も含まれる。代わりに、そのコードされる抗体は、例えば米国特許第４， ６９９，８８０号に記載されているような抗イディオタイプ抗体（他の抗体を捕 捉する抗体）であってもよい。 しかし、当該技術分野の当業者は、本発明の方法は、対象の治療用および／ま たは免疫原性のペプチドを作動的にコードするポリヌクレオチドまたはその混合 物を投与するのに用いるよう構成されていることが分かるであろう。したがって 、本発明は、特定のポリヌクレオチドを使用することに限定されない。 本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、別個のフラグメ ントの形態またはより大きな構造体の成分としてのデオキシリボヌクレオチド類 またはリボヌクレオチド類を意味する。 本発明の治療用および／または免疫原性のペプチドをコードするＤＮＡは、ｃＤ ＮＡフラグメントから、または組換え転写単位に発現されうる合成遺伝子を提供 するオリゴヌクレオチド類から組み立てることができる。本発明のポリヌクレオ チドの配列としては、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡの配列がある。ポリヌクレ オチドの配列は、遺伝コードから推定できるが、その遺伝コードの縮重を考慮し なければならない。本発明のポリヌクレオチド類には、その遺伝コードの結果と して縮重している配列が含まれているが、その配列は当該技術分野の当業者であ れば容易に決定できる。 所望の治療用および／または免疫原性のペプチドをコードするポリヌクレオチ ド配列は、真核生物または原核生物中に発現させることができる。宿主としては 、微生物、酵母、昆虫および哺乳類生物を挙げることができる。真核生物または ウイルスの配列を有するＤＮＡ配列を原核生物中で発現する方法は、当該技術分 野で公知である。宿主中で発現し複製することができる生物学的に機能を有する ウイルスおよびプラスミドのＤＮＡベクターも当該技術分野で公知である。この ようなベクターは、本発明のＤＮＡを組み込むのに用いられる。 本発明のポリヌクレオチドとしては、対象の治療用および／または免疫原性の ペプチドを作動的にコードする公知のポリヌクレオチドの機能誘導体がある。「 機能誘導体」という用語は、ある分子の「フラグメント類」、「変異体類」、「 類似体類」または「化学的誘導体類」を意味する。本発明のＤＮＡ配列のいずれ かのような一つの分子の「フラグメント」には、その分子の任意のヌクレオチド サブセットが含まれる。このような分子の「変異体」とは、その全分子またはそ のフラグメントに実質的に類似している天然に存在する分子を意味する。ある分 子の「類似体」とは、その全分子またはそのフラグメントに実質的に類似してい る非天然の分子を意味する。 本明細書で用いる場合、分子は、通常その分子の一部分ではない 追加の化学部分を他の分子が含有している場合、その他の分子の「化学誘導体」 であるといわれる。このような部分によって、分子の溶解性、吸収性、生物学的 半減期などを改善することができる。あるいは、これらの部分は、その分子の毒 性を低下させ、分子の望ましくない副作用などを除くかまたは減少させることが できる。このような効果を仲介できる当該技術分野で公知の部分は、例えばＲｅ ｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６ 版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、米国ペンシルベニア州、イース トン（１９８０年）に開示されている。 したがって、「ポリヌクレオチド」という用語には、本明細書で用いる場合、 本明細書に記載されているポリヌクレオチドに実質的に類似しかつ類似の活性を 有する、機能誘導体、フラグメント類、変異体類、類似体類および化学誘導体類 が含まれる。 また、本発明の治療用および／または免疫原性のペプチドを製造するのに使用 するＤＮＡ配列は、いくつもの方法で得ることができる。例えば、そのＤＮＡは 、当該技術分野で公知のハイブリッド形成法を用いて単離することができる。こ れらの方法には、限定されないが、１）ゲノムまたはｃＤＮＡのライブラリーと プローブのハイブリッドを形成させて共有されているヌクレオチド配列を検出す る方法、２）発現ライブラリーを抗体で選別して共有されている構造の特徴を検 出する方法、および３）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による合成がある。ま た、そのフラグメントをコードする特異的ＤＮＡ配列は、１）二本鎖ＤＮＡ配列 をゲノムＤＮＡから単離する、２）ＤＮＡ配列を化学的に製造して対象のポリペ プチドに必要なコドンを提供する、および３）ドナーの真核細胞から単離された ｍＲＮＡを逆転写することによって二本鎖ＤＮＡ配列を生体外で合成する、こと によって得ることができる。後者の場合、一般にｃＤＮＡと呼ばれる、ｍＲＮＡ の二本鎖ＤＮＡの補体が最終的に形成される。 ハイブリッド形成法は、各プローブが潜在的に、変性二本鎖ＤＮＡの不均一混 合物を含有するハイブリッド形成試料中の特異的ＤＮＡ配列の完全補体である場 合、標識を付けた混合合成オリゴヌクレオチドのプローブを用いて組換えクロー ンを選別するのに有用である。このような選別を行う場合、ハイブリッド形成は 、一本鎖ＤＮＡまたは変性二本鎖ＤＮＡについて実施することが好ましい。ハイ ブリッド形成法は、対象のポリペプチドに関連するｍＲＮＡの存在量が極端に少 ない場合、起源由来のｃＤＮＡクローンを検出するのに特に有用である。換言す れば、非特異的結合を避けるのを目的とする緊縮ハイブリッド形成条件を用いる ことによって、例えば、標的ＤＮＡを混合物中の単一プローブとハイブリッドを 形成させることによって特異的ｃＤＮＡクローンをオートラジオグラフィーで可 視化することができる。 対象のポリヌクレオチドを含有していると考えられるｃＤＮＡライブラリーは 、ｃＤＮＡ由来の各種ｍＲＮＡを卵母細胞中に注入し、ｃＤＮＡ遺伝子産物が発 現するのに充分な時間を与え、次いで例えば対象のポリヌクレオチドがコードす るペプチドに対して特異的な抗体を用いるかまたは繰り返しモチーフに対するプ ローブおよび対象のポリヌクレオチドがコードするペプチドの特徴的な組織発現 パターンを利用することによって、所望のｃＤＮＡの発現産物の存在について試 験して選別することができる。あるいは、ｃＤＮＡライブラリーは、少なくとも 一つのエピトープをもっている治療用および／または免疫原性のペプチドの発現 について、そのペプチドに対し特異的な抗体を用いて間接的に選別することがで きる。このような抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として 誘導され、対象のｃＤＮＡの存在を示す発現産物を検出するのに使用することが できる。 適当なプローブが入手できるならば、核酸ハイブリッド形成法に依存する選別 法によって、任意の生物から任意の遺伝子配列を単離 することができる。問題のタンパク質をコードする配列の一部分に相当するオリ ゴヌクレオチドプローブは、化学的に合成することができる。そのためには、ア ミノ酸配列の短いオリゴペプチドストレッチが分かっていなければならない。タ ンパク質をコードするＤＮＡ配列は、その遺伝コードから推定できるが、そのコ ードの縮重を考慮しなければならない。配列が縮重している場合、混合付加反応 を実施することができる。これには変性二本鎖ＤＮＡの不均一混合物が含まれる 。このような選別を行う場合、ハイブリッド形成は、一本鎖ＤＮＡまたは変性二 本鎖ＤＮＡについて実施することが好ましい。 本発明の裸のポリヌクレオチドは、これらポリペプチドの発現を制御する調節 タンパク質を作動的にコードする他のポリヌクレオチドに接合するかもしくはそ のような他のポリヌクレオチドと組み合わせて使用してもよく、または認識、プ ロモータおよび分泌の配列を含有していてもよい。当該技術分野の当業者は、過 度の試験を行わずに、調節ポリヌクレオチドを選択し、それを本発明の裸のポリ ヌクレオチド中に組み込む（該調節ポリヌクレオチドがまだ存在していない場合 ）ことができる。例えば、マウスまたはヒトの系に用いる適切なプロモーターと その使用については、前掲の Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ の第１章に記載されている。 本発明に用いる特に好ましい形態の裸のポリヌクレオチドは、プラスミドベク ターに組み込まれた形態のものである。プラスミドベクター、特にレプリケータ ーを含有するプラスミドベクター、を使用すると、標的組織中での遺伝子の発現 が延長される。また、ある種のプラスミドベクターは、ペプチドをコードする遺 伝子がこのベクターに組み込まれると、高レベルの発現が達成されるので、免疫 原性ペプチドに対する免疫応答の優れたメディエイタである。 適切なプラスミドベクターは、当該技術分野では公知であり、前 掲の Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ ｏｌｏｇｙ の第１章に記載のベクター類が挙げられる。特に好ましい２種のプ ラスミドベクターは、ｐＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）とｐＣＭＶ（サイトメガ ロウイルス）のプロモーターベクターである。これらプロモーターのうち、ＣＭ Ｖは、筋肉以外の組織に導入されるポリヌクレオチドに対して好ましい。この好 ましさは、ＣＭＶプロモーターを利用すると、ここでいう文脈において、高レベ ルの発現が達成される、という観察結果に基づいている。 ＲＳＶプロモーターを単離する適切なプロトコルおよびプラスミドベクターを 構築する際の該プロモーターの使用法については、Ｇｏｒｍａｎ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、７９巻、６７７７頁（１９８２年）に 記載されている。他の好ましいプラスミドベクターは、ｐＲＥＰ７とｐＲＥＶで あり、これらは米国カリフォルニア州サンディエゴ所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 社から市販されている。ポリヌクレオチドをクローン化する場合、ｍＲＮＡを製 造するのに特に適切なプラスミドは、Ｋｒｅｉｇ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｓ Ｒｅｓ．、１２巻、７０５７〜７０７０頁（１９８４年）に記載されている ｐＳＰ６４Ｔクローニングベクターである。開始コドンを含有する任意のｃＤＮ Ａは、このプラスミドに導入することが可能であり、ｍＲＮＡは発現されたＤＮ Ａ鋳型から通常の技術を用いて製造される。 本発明に利用できる各種のウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘル ペスウイルス、ワクシニア、または好ましくはレトロウイルスのようなＲＮＡウ イルスがある。このレトロウイルスのベクターとしては、マウスまたは鳥類のレ トロウイルスのベクターの誘導体が好ましい。単一の異種遺伝子を挿入できるレ トロウイルスベクターの例としては、限定されないが、モロニーマウス白血病ウ イルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベーマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕ ＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ ）がある。多くのさらに別のレトロウイルスベクターが多重遺伝子を組み込むこ とができる。これらのベクターは、全て、選択マーカーの遺伝子を運ぶかまたは 組み込むことができるので、形質導入された細胞を同定して生成させることがで きる。 ウイルスベクターに、例えば、特異的標的細胞上の受容体に対するリガンドを コードする他の遺伝子とともに、対象の配列を１種以上挿入することによって、 そのベクターは標的特異的になる。レトロウイルスベクターは、例えば糖、糖脂 質またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することによって標的 特異的にすることができる。好ましいターゲティングは、抗体を用いてレトロウ イルスベクターを標的とすることによって達成される。当該技術分野の当業者は 、レトロウイルスのゲノムに挿入して対象のポリヌクレオチドを含有するレトロ ウイルスベクターの標的特異的送達を行うことができる特異的ポリヌクレオチド 配列を知っているか、または過度の実験を行うことなく容易に確認できるであろ う。必要な場合、別のベクターを用いて置換遺伝子を細胞に標的送達することが できる。アンチセンス療法の場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは多形性を 有する標的遺伝子に対してのみ特異的であるから、アンチセンスオリゴヌクレオ チドと置換遺伝子も同じベクターで送達することができる。 組換えレトロウイルス類は欠陥があるので、感染性ベクター粒子を製造するに は補助が必要である。この補助は、例えばＬＴＲ内の調節配列の制御下でレトロ ウイルスの全構造遺伝子をコードするプラスミドを含有するヘルパー細胞系を用 いることによって提供される。これらのプラスミドは、パッケージング機構が、 包膜（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）を行うためのＲＮＡ転写物を認識できるよ うにするヌクレオチド配列を欠いている。パッケージングシグナルが欠失してい るヘルパー細胞系としては、限定されないが、例えば Ψ２、ＰＡ３１７およびＰＡ１２がある。これらの細胞系は、ゲノムがパッケー ジされていないので、中空ビリオンを産生する。レトロウイルスベクターが、パ ッケージングシグナルが無傷であるようなヘルパー細胞内に導入され、しかし構 造遺伝子は対象の他の遺伝子で置換されていると、そのベクターはパッケージさ れてベクタービリオンを産生することができる。 発現を監視するため、これらのベクターは修飾して公知のレポーター遺伝子を 含有させてもよい。例えば、Ｎｏｒｔｏｎ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、 ５巻、２８１頁（１９８５年）に記載されているｐＲＳＶ ｌａｃ−Ｚ ＤＮＡ ベクターは、タンパク質発現によってβ−ガラクトシダーゼを産生することがで きる。ルシフェラーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ （「ＣＡＴ」、ｐＲＳＶ−ＣＡＴプラスミドの構築に関するＧｏｒｍａｎ他の前 掲の文献を参照）も使用できる。簡便なプラスミドの増殖は、大腸菌内で行うこ とができる（例えば、前掲のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌを参照）。 トレライジングワクチン（ｔｏｌｅｒｉｚｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｅ）として使 用する場合、ポリヌクレオチド類の混合物またはポリヌクレオチド類の別個に同 時に投与される群が、免疫抑制サイトカイン（例えばＴＧＦβ）のために作動的 にコードしている遺伝子および関連する組織互換性タンパク質について作動的に コードしている別の遺伝子を含有していてもよい。このやり方は、異種抗原（ア ロ抗原を含む）および自己抗原に対する耐性を誘発させる際に用いるよう適応し ている。 アンチセンス療法に用いる場合、合成のアンチセンスオリゴヌクレオチド類は 、一般に１５〜２５個の塩基の長さである。ヒトゲノムがランダムな組織である とすれば、統計学的に、１７量体がヒトＤＮＡの細胞ｍＲＮＡ中の非反復配列を 形成し、１５量体が細胞ｍ ＲＮＡの成分中の非反復配列を形成していることが示唆される。したがって、選 択された遺伝標的に対する実質上の特異性が本発明の合成オリゴマーを用いて容 易に得ることができる。 細胞内で、アンチセンス核酸は、対応するｍＲＮＡとハイブリッドを形成して 二本鎖分子を生成する。その細胞は二本鎖のｍＲＮＡを翻訳しないので、アンチ センス核酸はｍＲＮＡの翻訳を妨害する。約１５個のヌクレオチドからなるアン チセンスオリゴマーは、容易に合成され、かつ標的のヌクレオチド変異体産生細 胞中に導入されたとき、大きな分子より問題を起こすことが少ないようであるの で、好ましい。遺伝子の生体外翻訳を阻害するのにアンチセンス法を使用するこ とは、当該技術分野で公知である（Ｍａｒｃｕｓ−Ｓａｋｕｒａ、Ａｎａｌ．Ｂ ｉｏｃｈｅｍ．、１７２巻、２８９頁、１９８８年）。あまり一般的ではないが 、ＤＮＡに直接結合するアンチセンス分子も用いることができる。 リボザイム類は、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼに類似の方式で他の一本鎖Ｒ ＮＡを特異的に切断する性能を有するＲＮＡ分子である。これらのＲＮＡをコー ドしているヌクレオチド配列を修飾することによって、ＲＮＡ分子内に変異癌原 遺伝子または腫瘍抑制遺伝子が生成することに関連する特異的ヌクレオチド配列 を認識しそれを切断する分子を作製することができる（Ｃｅｃｈ、Ｊ．Ａｍｅｒ ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｎ．、２６０巻、３０３０頁、１９８８年）。この手方の主な 利点は、リボザイムが配列特異的であるので、特定の変異配列を有する標的ｍＲ ＮＡのみが不活性化されることである。 リボザイムには２種の基本的な型がある。すなわち、テトラヒメナ型（ｔｅｔ ｒａｈｙｍｅｎａ−ｔｙｐｅ）（Ｈａｓｓｅｌｈｏｆｆ、Ｎａｔｕｒｅ、３３４ 巻、５８５頁、１９８８年）と「ハンマーヘッド」型（”ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ”−ｔｙｐｅ）である。テトラヒメナ型リボザイムは、４塩基の長さの配列を認 識し、一方「ハンマーヘッド」型リボザイムは１１〜１８塩基の長さの配列を 認識する。認識配列が長ければ長いほど、その配列が標的ｍＲＮＡの種の中に排 他的に出現する可能性が大きくなる。したがって、特異的なｍＲＮＡの種を不活 性化するには、ハンマーヘッド型リボザイムの方がテトラヒメナ型リボザイムよ り好ましく、そして１８塩基の認識配列の方が短い認識配列より好ましい。 未修飾のオリゴデオキシリボヌクレオチドは、血清および細胞ヌクレアーゼ類 によって容易に分解される。したがって、当該技術分野でよく知られているよう に、リン酸骨格に特定の修飾を行って、アンチセンスＤＮＡに対してヌクレアー ゼ耐性を付与した。例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびα −アノマー糖ホスフェートなど、骨格修飾オリゴマー類は、血清および細胞ヌク レアーゼ類に対する耐性が増大した。そのうえ、メチルホスホネートは、非イオ ン性であり、親油性が増大して、細胞膜を通じての取込みが改善される。アンチ センス剤として修飾オリゴヌクレオチドを使用する場合、わずかに長いかまたは 短い配列が必要であろう。というのは、分子構造の化学変化がハイブリッド形成 に影響するからである（Ｌ．Ａ．Ｃｈｒｉｓｅｙ他、ＢｉｏＰｈａｒｍ、４巻、 ３６〜４２頁、１９９１年）。これらの骨格を修飾したオリゴは、標的配列に結 合し、その細胞の翻訳機構が特異的ＲＮＡに結合するのを遮断するかまたはＲＮ Ａ／ＤＮＡ二重らせん（ｄｕｐｌｅｘ）構造を形成してリボヌクレアーゼＨ活性 を誘発することによって、その阻害作用を発揮する。 Ｂ．裸ポリヌクレオチド類の医薬製剤 裸のポリヌクレオチドの組成物およびポリヌクレオチドの混合物は、医薬とし て許容される懸濁液、溶液または乳濁液中に入れてもよい。適切な媒体としては 食塩水があるが、ポリヌクレオチドを標的組織へ送達するのに抗原提示細胞に依 存しないそれら実施態様の場合は、リポソーム製剤でもよい。 さらに具体的に述べると、医薬として許容される担体としては、 滅菌された水性または非水性の溶液、懸濁液および乳濁液がある。非水性溶媒の 例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物 油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体と しては、水、アルコール／水の溶液、乳濁液または懸濁液があり、食塩水と緩衝 媒体が含まれる。非経口媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキスト ロース、デキストロースと塩化ナトリウム、ラクテイテッドリンゲル液（ｌａｃ ｔａｔｅｄ Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ）または不揮発性油がある。静脈内媒体としては 、流体と栄養補給物、電解質補給物（例えば、リンゲルデキストロースに基づい たもの）などがある。保存剤および他の添加剤、例えば、抗菌薬、酸化防止薬、 キレート薬および不活性ガスなども存在していてもよい。さらに、裸ポリヌクレ オチドの組成物は、本発明による後程の再構成および使用に備えて、当該技術分 野で公知の手段を用いて凍結乾燥してもよい。 裸ポリヌクレオチドの抗原としてのＡＰＣ認識に依存しない本発明の態様の場 合、先に考察した標的ベクター送達系に加えて、標的送達のためにコロイド分散 系を使用することもできると思われる。しかし、裸のヌクレオチドを投与するた めに本発明の方法を用いること、およびこれらヌクレオチドを比較的高い濃度の 抗原提示細胞を有する組織に投与することの利点があるが、ポリヌクレオチドを 送達するのにコロイド分散系を使用するのはあまり好ましい方法ではないであろ うということが当該技術分野の当業者にとって理解されるであろう。したがって 、このような系についての以下の考察は、本発明の好ましい方法でも特定の適応 症に対する用途には利用できないと判断するのに主として参考にしてもらうため に、提供するものである。 コロイド分散系としては、巨大分子複合体類、ナノカプセル類、マイクロスフ ェア類、ビーズ類、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル類、混合ミセル類お よびリポソーム類を含む脂質ベースの系 がある。本発明の好ましいコロイド系は、リポソームである。 リポソーム類は、生体外および生体内で送達媒体として有用な人工の膜小胞で ある。大きさが０．２〜４．０μｍの範囲内の大型一重膜小胞（ＬＵＶ）が、大 型の巨大分子を含有する水性緩衝液をかなりのパーセントで被包できることが分 かっている。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび無傷のビリオンは、水性の内容物中に入れて 被包し、生物学的に活性な形態で細胞に送達することができる（Ｆｒａｌｅｙ他 、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、６巻、７７頁、１９８１年）。リ ポソームは、哺乳類の細胞に加えて、植物、酵母および細菌の細胞にポリヌクレ オチドを送達するのに用いられてきている。リポソームが効率的な遺伝子輸送媒 体であるためには、下記の特性をもっていなければならない。すなわち、（１） アンチセンスポリヌクレオチドをその生物活性を低下させることなく高効率にコ ードする遺伝子を被包すること、（２）非標的細胞に比べて標的細胞の方に優先 的にかつ実質的に結合すること、（３）小胞の水性内容物を標的細胞の細胞質に 高効率に送達すること、および（４）遺伝情報を正確かつ効果的に発現すること 、である（Ｍａｎｎｉｎｏ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻、６８２頁、 １９８８年）。 リポソームの組成は、通常、リン脂質類特に相転移温度が高いリン脂質類の組 合せ体であり、通常ステロイド類特にコレステロールと組み合わせたものである 。他のリン脂質類または他の脂質類も使用することができる。リポソーム類の物 理特性は、ｐＨ、イオン強度および二価カチオンの存在に依存している。 リポソームを製造するのに有用な脂質類の例としては、ホスファチジル化合物 類、例えばホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジ ルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質類、セレブロシド 類およびガングリオシド類がある。特に有用なのは、ジアシルホスファチジルグ リセロール類であり、これらは、その脂質部分が１４〜１８個の炭素原子を含有 し特に１６〜１８個の炭素原子を含有し、かつ飽和している。リン脂質の実例と しては、卵のホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよ びジステアロイルホスファチジルコリンである。 リポソーム類のターゲティングは、解剖学的因子と機械論的因子に基づいて分 類することができる。解剖学的分類は、例えば、臓器特異的、細胞特異的および 細胞小器官特異的の選択性のレベルに基づいている。機械論的ターゲティングは 、受動的であるかまたは能動的であるかに基づいて区別することができる。受動 ターゲティングは、洞様毛細血管を有する臓器中の細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞 中にリポソームが分布するという自然の傾向を利用している。一方、能動ターゲ ティングでは、リポソームをモノクローナル抗体、糖、糖脂質またはタンパク質 のような特異的リガンドにカップリングさせるか、または天然に存在する局在部 位以外の臓器と細胞型へのターゲティングを達成するためリポソームの組成もし くは大きさを変えることによって、リポソームが改変される。 標的送達系の表面は、種々の方法で修飾することができる。リポソームの標的 送達系の場合、脂質群は、リポソームの脂質二重層中に組み込まれて、ターゲテ ィングリガンドはリポソーム二重層との安定した結合が維持される。脂質の連鎖 をターゲティングリガンドに結合するのに各種の連結基を用いることができる。 ＡＰＣの発現に依存している本発明のこれら実施態様の場合、リポソーム製剤 は、裸ポリヌクレオチドの生体内での取込みをかなり制限するので、使用すべき ではない。このような実施態様では、代わりに、等張緩衝溶液が、裸ポリヌクレ オチドの取込みを最大にするのに好ましい媒体である。さらに、吸収促進剤、界 面活性剤、化学的刺激剤または機械的刺激手段も、裸ポリヌクレオチド組成物が 侵入点を通じて透過するのを促進するのに好ましい。有機医薬またはペプチドが ベースの医薬の粘膜送達に使用して成功している促進 剤と界面活性剤に関する一般原理については、Ｃｈｉｅｎ、Ｎｏｖｅｌ Ｄｒｕ ｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第４章（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ 、１９９２年）を参照されたい。医薬の鼻腔内送達の公知の手段と原理に関する 具体的な情報は、Ｃｈｉｅｎの前掲文献の第５章に記載されている。適切な鼻腔 内吸収促進剤の例が第５章の表２と３に記載されているが、一層おだやかな薬剤 が好ましい。さらに、医薬の経皮送達の公知の手段と原理も、Ｃｈｉｅｎの前掲 文献の第７章で考察されている。また、粘膜／鼻腔内送達を行う本発明の方法に 用いる適切な薬剤が、Ｃｈａｎｇ他、Ｎａｓａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ 、「Ｔｒｅａｔｉｓｅ ｏｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅ ｒｔｙ」の第９章と表３−４Ｂ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，１９９２年）に 記載されている。皮膚を通じて医薬を吸収するのを促進することが知られている 適切な薬剤が、Ｓｌｏａｎ著のＵｓｅ ｏｆ Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ Ｐａｒａ ｍｅｔｅｒｓ ｆｒｏｍ Ｒｅｇｕｌａｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｔｈｅｏｒｙ ｔｏ Ｄｅｓｃｒｉｂｅ Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ−Ｄｒｉｖｅｎ Ｐｒｏｃ ｅｓｓｅｓ 、第５章、「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ｔｏｐｉｃａｌ ａｎｄ Ｏｃｕｌ ａｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、１９９２ 年）およびそのテキストの他の部分に開示されている。 これらの方法（および医薬送達を容易にするため便利に使用される他の方法） は、当該技術分野の当業者が過度に試験を行うことなく、本発明の方法に用いる 裸のポリヌクレオチドを製造するのに適応させることができると考えられる。特 に、前記パラグラフで考察した方法は、本発明の発明者の知見によれば、ポリヌ クレオチドの送達に従来用いられたことはないが、この目的に使用するのに適し ていると考えられる。その理由のため、上記引用文献類は、本発明の方法に必須 なものではないが、本明細書に援用するものである。この適合性を説明する具体 的な実施例を以下に述べる。 Ｃ．裸のポリヌクレオチドを投与する手段と経路 皮膚投与経路の場合、導入手段は、表皮投与、皮下注射または真皮内注射によ る方法である。これらの手段のうち、表皮投与は、真皮内組織中に高濃度でＡＰ Ｃが存在していると考えられる場合好ましい。 しかし皮膚投与経路に用いる導入手段で最も好ましいのは、侵襲性が最も少な い手段である。これらの手段の中で好ましいのは、経皮透過法と表皮投与法であ る。 経皮透過法の場合、イオン導入法が適切な方法である。イオン導入法の透過は 市販されている「パッチ」を用いて実施できるが、このパッチは、その生成物を 、無傷の皮膚を通じて数日間以上にわたって連続して送達する。この方法を使用 すると、比較的濃度が高い医薬組成物の透過を制御することができ、組合せ医薬 の注入を行うことができ、そして吸収促進剤を同時に使用できる。 この方法に用いる代表的なパッチ製品は、米国カリフォルニア州ロスアンゼル ス所在のＧｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ社の登録商標製品 ＬＥＣＴＲＯ ＰＡＴＣＨ である。この製品は、電子制御により貯留電極（ｒ ｅｓｅｒｖｏｉｒ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）を中性ｐＨに維持して、いろいろな濃 度の投与を行い、かつ連続的におよび／または周期的に投与するよう適応させる ことができる。そのパッチの調製と使用は、ＬＥＣＴＲＯ ＰＡＴＣＨ製品に添 付されているメーカー印刷の指示書に従って実施しなければならない。なお、そ の指示書は、本明細書に援用するものである。 表皮投与法は、基本的に、刺激体に対する免疫応答を引き起こすのに充分に表 皮の最外層を機械的にまたは化学的に刺激する。具体的に述べると、その刺激は 、ＡＰＣを刺激部位に引き付けるのに充分な刺激でなければならない。さきに考 察したように、次にＡＰＣは、投与された裸ポリヌクレオチドを取り込みそして 発現すると考 えられる。 代表的な機械的刺激方法では、直径が非常に小さくかつ短い多数の尖叉が使用 され、その尖叉を使用して、皮膚を刺激しＡＰＣを刺激部位に引きつけ、その尖 叉の末端から転移した裸ポリヌクレオチドを取り込ませる。例えば、フランス国 リヨン所在のＰａｓｔｕｅｒ Ｍｅｒｉｅｕｘ社が製造したＭＯＮＯ−ＶＡＣＣ 旧ツベルクリン試験には、裸のポリヌクレオチドを導入するのに適した装置が含 まれている。 その装置（米国では、ペンシルベニア州スイフトウォーター所在のＣｏｎｎａ ｕｇｈｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社が販売している）は、一方の 末端にシリンジプランジャーを備え他方の末端に尖叉ディスク（ｔｙｎｅ ｄｉ ｓｋ）と備えたプラスチック製コンテナーで構成されている。その尖叉デスクは 、表皮細胞の最外層をひっかく長さの小直径の尖叉を多数保有している。ＭＯＮ Ｏ−ＶＡＣＣのキットの尖叉には、各々旧ツベルクリンがコートされているが、 本発明の場合、各ニードルは、裸ポリヌクレオチドまたはその混合物の医薬組成 物でコートされている。この装置は、この装置の製品に含まれている、メーカー が記載した説明書にしたがって使用される。使用と投与に関するこれらの説明書 は、この装置の通常の使用方法を説明するため本明細書に援用するものである。 この実施態様でも使用できる類似の装置は、アレルギー試験を実施するのに現在 使用されている装置である。 裸のポリヌクレオチドを表皮投与するのに適切な他の方法は、表皮の最も外側 の細胞を刺激する化学薬剤を使用し、充分な免疫応答を誘発してＡＰＣをその領 域に引き付ける方法である。一つの例は角質溶解剤であり、例えば、Ｎｏｘｅｍ ａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社が登録商標ＮＡＩＲで販売している市販の局所脱 毛クリーム中に使用されているサリチル酸がある。このやり方は、粘膜の上皮へ の投与を行うのにも利用できる。この化学刺激剤は、機械的刺激体 とともに適用してもよい（例えば、ＭＯＮＯ−ＶＡＣＣ型尖叉が化学刺激剤でコ ートもされていると、こうなるが）。裸のポリヌクレオチドは、化学刺激剤も含 有している担体中に懸濁されているか、または該刺激剤と同時に投与されてもよ い。 粘膜投与の場合、導入手法は、侵入点の場所によって変わる。特に、呼吸器感 染症に対する免疫化と治療を行う場合は、鼻腔内投与法が最も好ましい。これら の方法としては、裸ポリヌクレオチドまたはその混合物のエアロゾル懸濁液の吸 入または裸ポリヌクレオチドまたはその混合物の吹入がある。坐剤および局所製 剤も、生殖器および眼の細胞の部位のような特定の粘膜に導入するのに適してい る。裸ポリヌクレオチドの腟送達について特に興味深いのは、腟サンドイッチ型 リングとペッサリーである。これら装置の例とその使用方法については、Ｃｈｉ ｅｎの前掲の文献第９章に記載されている。 本発明の方法を用いて供給される各裸ポリヌクレオチドまたはその混合物の投 与量は、宿主が所望する応答および使用されるポリヌクレオチドによってかわる 。一般的に、一回の投与で１００〜２００μｇまでのＤＮＡを投与できるが、皮 膚または粘膜を通じて約０．３μｇという少量のＤＮＡを投与して長期間続く免 疫応答を誘発することができると考えられる。 しかし、本発明の目的を達成するには、裸のポリヌクレオチドが、そのポリヌ クレオチドがコードしている生物学的に活性のペプチドを発現させるのに充分な 投与量で供給されれば充分である。特別の状態（例えば治療量以下の投与量のサ イトカインを供給する場合）に適した投与量は、以下の考察と実施例で説明する 。 これらの投与量は、治療レベル、治療量以下のレベルまたは免疫原性レベルの 発現を達成するために改変してもよい。発現されたペプチドの存在と量を確認す る方法は、当該技術分野の当業者にとって公知のことなので、詳細には述べない 。これらの方法のある種の 物を下記の実施例で述べるが、これらの方法としては、一般に、免疫検定法（例 えば、酵素結合イムノソルベント検定法）、ＰＣＲ法、および当該技術分野で公 知の方法に従って実施される免疫組織学的分析方法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｌ ｏｇｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｅｓ）がある。投与されるポリヌクレオチドの投与 量は、これらの検定法と定量法ならびに当該臨床技術分野の当業者にとって公知 の生体内臨床微候によって提供される情報に基づいて、所望の発現レベルを達成 するために、調節することができる。 ＩＩ． 年齢に関連する疫病の発症の場合に重要なサイトカイン類 および他のタンパク質を治療量以下のレベルで発現させる ための、裸ポリヌクレオチドの導入 裸のポリヌクレオチドを製造し導入する上記の方法は、本発明のこの実施態様 に用いるのに適している。この実施態様においては、ここに述べる方法が治療量 以下のレベルの循環サイトカイン類と類縁タンパク質を産生するのに採用される 。上記で分かるように、治療量以下のレベルの発現タンパク質を産生するのに必 要な裸ポリヌクレオチドの量は、熟練した臨床家であれば、容易に決定し必要に 応じて調節することができる。 本発明のこの局面は、所望のタンパク質のために作動的にコードしているポリ ヌクレオチドまたはその組換え混合物を、好ましくは老化に伴う生物学的欠陥が 発生する前に、哺乳類に投与することによって実施される。例えば、免疫系が弱 くなったことに伴う疫病が発生する危険性が高い患者に、例えば、疾患に対する 代理終点の観察によって決定される疾患の発症の前に、連続レベルでタンパク質 発現を行うよう、治療量以下のレベルの免疫刺激性インターロイキン（例えばＩ Ｌ−２）を投与する。疾患の危険度が高い患者の場合、この治療は患者の寿命全 体を通じて続けられる。患者にこの長期コースの治療を受け入れさせるためには 、ポリヌクレオチドの個々の 投与量（および得られるタンパク質発現のレベル）は低く（すなわち治療量以下 で）なければならない。しかし、ポリヌクレオチドは、タンパク質よりもはるか にゆっくりと分解する（すなわち、数箇月の差）と考えられるので、あまり頻繁 に投与しなくてもよく、したがって、患者に対する毒性と外傷の危険が最小にな る。 さらに具体的に述べると、老化に伴う疾患状態、またはＨＩＶ−１感染症の過 程でのＣＤ４Ｔ細胞の損失のような免疫系の弱体化が原因の他の生物学的事象が 発生する前または発生と同時に、所望のポリヌクレオチドの投与を開始する。疾 患状態または免疫機能の損失が発生する。疾患状態または免疫機能の損失が発生 する前に長期の連続した治療を開始することが好ましい。治療は、対象の遺伝子 、特にサイトカイン類（例えば、インターロイキン類とリンフォトキシン類）の ためのコードを有する遺伝子の治療量以下のレベルでの発現により達成されてい る。 最も好ましくは、対象の遺伝子の少なくとも一つが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、成 長ホルモン（ＧＨ）、ソマトメジン類（例えば、インスリン様成長因子［ＩＧＦ −１］）および／またはＴＧＦβのためのコードを有する遺伝子であるのがよい 。これらのタンパク質は、免疫応答の大きさ（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１、Ｇ ＨおよびＩＧＦ−１）、ストレスもしくは損失に対する全身応答（例えば、ＩＬ −１）、組織の細胞充実性（ＧＨとＩＧＦ−１）および細胞外マトリックスタン パク質と結合組織の沈着（ＴＧＦβ）を制御するか、またはこれらに影響し得る 。そして後者は、ＩＬ−１とＩＬ−２の活性が減少するにつれて、一層大きな生 物学的作用を発揮する。 本発明のこの特定の方法は、一部において、前記セクションＩに記載されてい る方法のサブセットである。しかし、当該技術分野の当業者は、本発明のこの実 施態様が、「裸」でないポリヌクレオチドすなわちコロイド分散系に結合されて いるポリヌクレオチドを用いて実施できることが分かるであろう。しかし、上記 セクションＩ で開示した方法は優れたものであるが、その実践法（すなわち、比較的高比率の ＡＰＣを含有する組織中に導入された「裸」のポリヌクレオチドを用いての）が はるかに好ましいのである。 ＩＩＩ．裸ポリヌクレオチド反応混液（ｃｏｃｋｔａｉｌ）の投与 本発明の他の局面は、単一プロモーターの制御下で、例えば、２００個までの ポリヌクレオチド配列を含有する遺伝子構造体を発現させることを通して、ペプ チド反応混液（すなわち、ポリヌクレオチドの混合物）を投与することである。 この実施態様は、類似の症状を起こす異なる種の物質による感染症を治療するの に特に有用である。例えば、類似の臨床症状を有する呼吸器疾病を起こすライノ ウィル類の公知の種は、１００種を超えて存在している。特定の感染中の種を同 定を行う（労力を要しかつしばしば正確でないプロセス）よりも、本発明の方法 に従ってカクテルワクチンを投与することができ、それにより多数の異なるライ ノウィルスに対する免疫応答を刺激することができる。また、このやり方によっ て、異なる患者由来のエンベロープ遺伝子（この遺伝子は、必要な場合、増幅し てもよい）のプールされた単離物を用いて、ＨＩＶの各種の株に対するワクチン を構築することができる。 ポリヌクレオチドの混合物を投与は、２種以上の生物活性を有するペプチドを 送達するのにも役立つ。例えば、免疫原性ペプチドのために作動的にコードする 裸ポリヌクレオチドを、抗体を作動的にコードする裸ポリヌクレオチドと連結す るかまたは一緒に投与して、ペプチドと抗体の両者が発現されるようにすること ができる。 実例を示すと、ＩＬ−２と抗ｇｐ７１を連帯して発現する遺伝子類を投与によ り（ＩＬ−２タンパク質で得られた結果に基づいて）、マウス内のマウス白血病 ウイルス（ＭｕＬＶ）に応答して発生した腫瘍組織内に抗体が局在する結果が得 られた（ＩＬ−２／抗ｇｐ７１ｍＡｂの同時投与によって得られた結果について 、Ｓｃｈｕｌｚ 他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５０巻、５４２１〜５４２５頁、１９９０年を参 照）。 本発明の各実施態様の局面を示す例を以下に示す。これら例は、例示している とみなすべきであり、本発明を限定しているとみなすべきではない。 例 裸ポリヌクレオチドの筋肉内注射を行った後、マウスに局在した 遅延型過敏症が起こる 裸のプラスミドｃＤＮＡを筋肉内に注射すると、そのポリヌクレオチドがコー ドしているペプチドが発現する（先に報告した結果と矛盾しない）が、筋肉組織 内に該遺伝子に対する免疫応答が誘発される（先に報告した結果とは逆である） 。２種のプラスミドを同時に注射すると、この炎症反応が慢性になり、筋壊死が 現われる。両者の応答は、遺伝子の侵入点すなわち筋肉組織における、該遺伝子 に対する局在した遅延型過敏症の応答の診断と一致している。先の予想とは逆に 、筋肉細胞による取込みというよりむしろこの炎症性応答が、その筋肉注射に次 いで裸ポリヌクレオチドが発現したことの（唯一の原因ではないにしても）原因 でもあるようである。 裸のｃＤＮＡの筋肉内注射によって起こる免疫応答を説明するため、ｐＲＥＶ ｋ３とｐＲＳＶＩＬ２を次のように調整した。プラスミド類の製造 慢性リンパ性白血病のヒト患者由来の転位カッパライト遺 伝子（rearranged kappa light gene）を単離した。この遺伝子は、Ｈｕｍｋｖ ３２５を含有し、このＨｕｍｋｖ３２５は、ＩｇＭ自己抗体と慢性リンパ性白血 病細胞によって共通して発現される１７．１０９交差反応性イディオタイプをコ ードしている。この遺伝子は、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｍａｒｔｉ ｎ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７５巻、９８３頁（１９９２年）に記載されて いる。なお、この文献は、本明細書に援用するものである。 この遺伝子のＶ−Ｊ領域を含有する１０４０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ フラグメントを切取り、哺乳類発現ベクターｐＲＥＰ７（米国カリフォルニア州 サンディエゴ所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のポリクローニング部位中に、ラ ウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）長末端反復（ＬＴＲ）の下流に挿入して、ベクター を製造しｐＲＥＶｋ３と命名した。再構成（rearranged）ＪＫ１セグメントの下 流には、翻訳を終結する自然終止コドンがある。 ｐＲＳＶＩＬ−２という名称のＩＬ−２発現ベクターを製造するため、ベクタ ーｐＲＳＶＬ（Ｗｏｌｆｆ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７巻、１４６５頁、１９９ ０年）中のルシフェラーゼｃＤＮＡを、Ｃｕｌｌｅｎ、Ｃｅｌｌ、４６巻、９３ ７頁（１９８６年）に教示されている方法に従って、ｐＢＣ１２／ＨＩＶ／ＩＬ −２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、 Ｎｏ．６７６１８）の６８０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントで 置き換えた。このＷｏｌｆｆ他およびＣｕｌｌｅｎの文献は、これら発現ベクタ ーの構築に関する当該技術分野の知識を示すために本明細書に援用するものであ る。マウスへのプラスミドｃＤＮＡの筋肉内注射 ８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスをメ トキシフルランで麻酔した。プラスミドｃＤＮＡ（１００μｇ／注射）を１００ μｌの食塩水に懸渇させ、次いで２８ゲージの注射針を用いて四頭筋に一週間間 隔で４回注射した。６頭のマウスの一群は、１００μｇのｐＲＥＶｋ３を注射さ れた。別の一群の６頭のマウスは、各１００μｇのｐＲＥＶｋ３とｐＲＳＶＩＬ −２を注射され、第三群のマウスは、１００μｇの食塩水だけを注射された。こ れらの注射を行う直前に、血液試料を内側前頭脳底動脈から集めた。プラスミド類による生体内遺伝子発現を確認するためのＥＬＩＳＡ法 Ｈｕｍｋ ｖ３２５産物に対する抗体をＥＬＩＳＡ法（酵素結合イムノソルベント検定法） で測定した。ＩｇＭリウマチ因子Ｇｌｏ がＨｕｍｋｖ３２５遺伝子によってコードされ、１７．１０９イディオタイプの 正の（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）カッパ軽鎖を持っている。その精製タンパク質を、０ ．１Ｍホウ酸塩、０．２ＭＮａｃｌを含有しているｐＨ８．２の緩衝ホウ酸食塩 水すなわちＢＢＳ中に１０μｇ／ｍｌの濃度で溶解し、次いでその１００μｌず つをプラスチック製の微量滴定プレートのウェルに添加した。４℃で一夜インキ ュベートした後、これらプレートを、０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＢ ＢＳ（ＢＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）で２回洗浄し、次に１％ウシ血清アルブミンを補充 したＢＢＳ（ＢＢＳ／ＢＳＡ）を用いて室温で４時間クエンチした。ＢＢＳ／Ｔ ｗｅｅｎで２回洗浄した後、ＢＢＳ／ＢＳＡで連続希釈を行った試料を二つずつ ウェルに分配した。室温で３時間インキュベートした後、プレートをＢＢＳ／Ｔ ｗｅｅｎで４回洗浄し、次に、ＢＢＳ／ＢＳＡで１：２０００に希釈したビオチ ニル化痛風抗マウスＩｇＧ（米国メリーランド州ゲイサーズバーグ所在のＫｉｒ ｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ社）とともにインキュベートした。１時間後、 これらプレートをＢＢＳ／Ｔｗｅｅｎで４回洗浄し、次いで２５μｌのＴＭＢペ ルオキシダーゼの基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ社）とともにイ ンキュベートした。３０分後に、４５０ｎｍ波長光の吸光度をマイクロプレート リーダー（米国カリフォルニア州メロンパーク所在のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅ ｖｉｃｅｓ社）で測定した。その免疫血清中の抗体含量を推定するため、試験結 果を、モノクロナール抗体１７．１０９で作成した標準曲線と比較した（例えば 、Ｃａｒｓｏｎ他、（１９８３年）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０巻、１０８ １〜１０８７頁におけるこのｍＡｂの説明を参照）。 これらの検定結果は、対象の抗体の産生が増大したことを示し、それによりプ ラスミドによる遺伝子の発現を裏付けている。組織学的評価 筋肉内注射を行ったマウスを４９日目に殺した。遺伝子が注射さ れた筋肉を１０％ホルマリンで固定し、組織学的評価 のために処理した。 ｐＲＥＶｋ３とｐＲＳＶＩＬ２を同時に注射されてあった筋肉の部分は、慢性 炎症と筋壊死を実証し、これは局在遅延型過敏症の応答と一致した（図１Ａおよ び１Ｂ）。これと対照的に、ｐＲＥＶｋ３またはｐＲＳＶＩＬ２を単独で注射さ れた筋肉は、皮下注射の部位にリンパ様浸潤物が局在していた（図１Ｃ）。 例ＩＩ 裸ポリヌクレオチドを真皮内注射した後の遺伝子発現 裸ポリヌクレオチドの筋肉内注射に代わるものを探究するため、マウスに裸ｃ ＤＮＡプラスミドの真皮内注射を行った。遺伝子の発現が観察されたので、測定 を行った。 インフルエンザのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）のための遺伝子を、上記のｐＣ ＭＶプラスミド中にサブクローン化した。インフルエンザの多数の株から由来の ＲＮＰ遺伝子は、当該技術分野で公知であり、各種の株内の配列中に高度に保存 されている（例えば、Ｇｏｒｍａｎ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、６５巻、３７０４頁、 １９９１年を参照）。 ４頭の８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスに、１００μｌのＨＢＳＳ中に懸渇させた ｐＣＭＶ−ＰＮＰの１５μｇを３回注射した。尾の基部に２週間間隔で真皮内注 射を行った。細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、クラスＩのＭＨＣ分子が提示 する抗原を認識して、ウィルスに感染した細胞を除くのに重要な役割を果たす。 ｃＤＮＡ発現ベクターによる筋肉内（ｉ．ｍ．）免疫化は、抗原をクラスＩのＭ ＨＣ分子に導入してＣＴＬ応答を刺激するのに効果的な方法とみなされた。この 研究では、インフルエンザの核タンパク質（ＮＰ）抗原遺伝子を含有するプラス ミドの真皮内（ｉ．ｄ．）注射を行ったところ、ＮＰ特異的ＣＴＬおよび高力価 の抗ＮＰ抗体の両者が該発された。これらの抗体は、局所炎症なしで、注射して から６週間後に最高量に到達し、少なくとも２８週間変化しなかった。 プラスミドＤＮＡは、臭化エチジウムの存在下におけるＣｓＣｌ染色法（ｂａ ｎｄｉｎｇ）で精製し、凍結して１０ｍＭのトリスーＨＣｌ、０．１ｍＭのＥＤ ＴＡ、ｐＨ８．０の中に貯蔵した。注射 を行う前に、そのプラスミドをエタノールで沈殿させ、０．１ｍＭのＥＤＴＡを 含有する正常食塩水に溶解した。 Ｖｉｅｒａ他、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｌ．、２巻、４８７頁、（１９９０年）に 記載されているのと実質的に同様に、ＥＬＩＳＡ法で血清中の抗ＮＰＩｇＧの存 在量を測定した。この検定の試験結果を図２Ａに示す。それら動物の全てが高力 価の抗ＮＰ抗体を発生し、２０週間以上保持された。図２Ｂに示すように、真皮 内注射は、等価量のプラスミドの筋肉内注射（例Ｉに記載したように行った）と 比べ、抗体価が約４倍高くなるようであった。 図２の座標軸は、それぞれ、時間に対するＥＬＳＡ法力価（平均、１オンス） を示す。すべてのグラフ点に対する血清希釈度は、２５６０である。 例ＩＩＩ 裸のポリヌクレオチドを鼻腔内に誘導した後の遺伝子発現 例ＩＩで記載したのと同じＨＢＢＳ懸渇液中の同じプラスミド（ｐＣＭＶ−ＲＮ Ｐ）を用いて、インフルエンザリボ核タンパク質をコードする裸ポリヌクレオチ ドを、６頭ずつの３群のＢａｌｂ／ｃマウスの鼻腔内に導入した。血清による種 々の希釈度のプラスミドを導入する前後の抹消血液中の抗ＮＰＩｇＧの濃度を、 例ＩＩに記載したようにしてＥＬＩＳＡ法で測定した。血液は、鼻腔内に導入し て６週間後に各々マウスから採取した。 図３は、プラスミドを鼻腔内に導入する前後に行ったＥＬＩＳＡ法検定の結果 をグラフで示す。グラフには血清希釈度に対してＥＬＩＳＡ力価をプロットして ある。図３において、数値は、各群の個々のマウスについての値（＃１−３）お よび各群の全マウスについ ての平均値（＃Ｇ１−Ｇ３）を示す。 麻酔なしで、３×７．５μｇのプラスミドを注射された第二群のマウスは、バ ックグランド（図３）と比べて抗体の高い力価を示した。これらのデータを図４ に示す。 第三群のマウスは、麻酔をかけて同重量のプラスミドを注射された。これらの マウス中の抗ＮＰＩｇＧの力価が示すＲＮＰの発現は、麻酔をかけなかったマウ スで達成された発現と実質的に類似していた。麻酔をかけたマウスについてのデ ータを図５に示す。 発現は、吸収促進剤を追加使用することによって高めることができ、かつ時効 性促進剤で期間を延長することができる。なお、時効性促進剤の特性と使用法は 、Ｃｈｉｅｎの前揚文献の第５章に示唆されているように、当該技術分野で公知 である。 例ＩＶ ＩＬ−２、ＴＧＦ−β１およびＩＬ−４の裸遺伝子を投与した後 の、治療量以下のレベルのサイトカイン類の発現およびそのサイ トカイン類に対する全身応答 ＩＬ−２、ＴＧＦ−β１およびＩＬ−４のための発現ベクターの構築 ヒト（ｈ ）ＩＬ−２（ＡＴＣＣ ６７６１８）、ＴＧＦ−β１（ＡＴＣＣ ５９９５４） およびマウスＩＬ−４（ＡＴＣＣ ３７５６１）のためのｃＤＮＡを、ベクター ｐＢＳＩＩ ＳＫ（米国カリフォルニア州サンディエゴ所在のＩｎｖｉｔｒｏｇ ｅｎ社から入手）の中にサブクローン化して、５’−ＨｉｎｄＩＩＩと３’−Ｓ ｍａ１の部位を生成させた。これらの部位を使用して、例Ｉに記載した発現ベク ターｐＲＳＶＬ中のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨ１ルシフェラーゼｃＤＮＡフラグ メントを置換した。得られた発現ベクタ ー類（ｐＲＳＶＩＬ２、ｐＲＳＶＴＧＦβｌおよびｐＲＳＶＩＬ４）は、ラウス 肉腫ウィルス（ＲＳＶ）の長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターおよびＳＶ４０ポ リアデニル化部位を含有している。プラスミドＤＮＡは、米国カリフォルニア州 チャッツワース所在のＱｉａｇｅｎ社から入手したＱＩＡＧＥＮキットを用いて 形質転換ＤＨ５α大腸菌から精製した。 これら３種のベクターの振る舞いは、Ｌｏｔｚ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１ ６７巻、１２５３頁、（１９８８年）に記載されているようにして、マウスＣ2 Ｃ12筋芽細胞（ＡＴＣＣ［American Type Culture Collection、米国メリーラン ド州ロックフォード所在）ＣＲＬ １７７２〕の一過性リポフェクション（tran sient lipofection）によって確認した。なお、上記Ｌｏｔｚ他の文献は、本明 細書に援用するものである。各々の場合、リポフェクションを行ってから４８時 間後に得た上澄み液は、適当な特異的中和抗体（米国ミネソタ州ミネアポリス所 在のＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）の存在下または非存在下でマウスのＣ３Ｈ／Ｈ ｅＦ胸腺細胞を用いてリンパ球活性化因子（ＬＡＦ）検定法によって測定したと ころ、生物活性サイトカインを含有していた。実験要綱 ５週齢のＢａｌｂ／ｃマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ社（米国メイン州バーハーバー所在）から購入した。６週齢の時点（ゼロ日目 ）で動物を４頭ずつのマウスからなる４群に分割した。ゼロ日目、７日目および １４日目に、第二群〜第四群に、右大腿部の異なる５箇所に、１００μｌの正常 食塩水に溶解した合計１００μｇのプラスミドＤＮＡ（ｐＲＳＶＩＬ２、ＰＲＳ ＶＴＧＦβ１またはｐＲＳＶＩＬ４）を２８ゲージの針で筋肉内（ｉ．ｍ．）に 注射した。３日目、１０日目および１７日目（サイトカイ ン遺伝子を注射してから３日後）に、１００μｌのＩＭＪＥＣＴ ＡＬＵＭ（水 酸化アルミニウム、米国イリノイ州ロックフォード所在のＰｉｅｒｃｅ社）に分 散させた１００μｇのキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）（米国 ミズーリ州セントルイス所在のＳｉｇｍａ社）を同じ大腿部に筋肉内注射して全 動物を免疫化した。 第二組の実験は、類似のプロトコルで行った。８頭ずつのマウスからなる５群 の各マウスの右大腿部に、１００μｇのプラスミドＤＮＡ（第二〜第四の群にそ れぞれｐＲＳＶＩＬ２、ｐＲＳＶＴＧＦβ１またはｐＲＳＶＩＬ４）を注射した 。第一群には正常食塩水を注射したが、第五群には、１００μｇのｐＲＳＶＩＬ ２と１００μｇのｐＲＳＶＴＧＦβを注射した。 第一の実験と異なり、抗原（ヒトトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ社））を、同 じ条件下で左肩の筋肉内に注射した。５６日目または６３日目に、５０μｌの正 常食塩水中に懸渇させた５０μｇの抗原（それぞれ、ＫＬＨまたはトランスフェ リン）を皮下にブースト注射した。全動物は、眼窩後神経叢から血液を１週間ご とに採集して抗体のレベルを測定した。 ６週齢のＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ、１０マウス／群）に、同じ方法で１００μｇのｐＲＳＶＩＬ２、ｐＲＳＶ ＴＧＦβ１またはｐＲＳＶｎｕｌｌ（すなわち、導入遺伝子なし）を４週間間隔 で３回注射した。マウスは、１６週時点すなわち最後の注射をしてから２週間後 に採血して、抗クロマチン抗体のレベルを測定した。トランスフェリンの実験で は、ｐＲＳＶＴＧＦβ１群の３頭のマウス、対照群の１頭のマウスおよびｐＲＳ ＶＩＬ２群の１頭のマウスが、採血中または麻酔中に死ん だ。ｃＤＮＡプラスミドによるサイトカイン類の発現によって起こった、抗原応答に 対する効果を確認する抗体検定 微量滴定プレートのウエル（Ｃｏｓｔａｒ＃３ ５９０、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）をヒトトランスフェリンでコー トし（１００μｌ／ウエル、ホウ酸緩衝食塩水（ＢＢＳ）ｐＨ８．０中に１０μ ｇ／ｍｌ、一夜）、そして同じ緩衝液で洗浄し、次いで１％ウシ血清アルブミン （ＢＳＡ）のＢＢＳ溶液でクエンチした。ＢＢＳの０．５％Ｔｗｅｅｎ２０で２ 回洗浄した後、リン酸緩衝食塩水ｐＨ７．４（ＰＢＳ）で１：１０００に希釈し た血清試料を添加して、ウエルを倍にした。４℃で一夜インキュベートした後、 プレートをＢＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次にＢＢＳで１：８０００に希釈した ビオチニル化抗マウスＩｇＧと抗マウスＩｇＭ（米国ペンシルベニア州ウエスト ・グローブ所在のＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）とともにイン キュベートした。１％ＢＳＡを含有するＢＢＳで１：２０００に希釈したペルオ キシダーゼ標識ストレプタビジン（米国メリーランド州ゲイサーズバーグ所在の Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ社）とともに１時間インキュベートした 後、プレートをＢＢＳ／Ｔｗｅｅｎで４回洗浄し、次いでＴＭＢペルオキシダー ゼ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ社）とともにインキュベートし た。３０分後に、４５０ｎｍ波長光の吸光度を、ＴＩＴＥＲＴＥＫ ＭＵＬＴＩ ＳＣＡＮ ＭＥＴＥＲ（米国メリーランド州、ロックビル所在のＦｌｏｗ Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）で測定した。各検定には、１：５０００で出発して連 続して希釈した標準のマウス抗ＫＬＨまたは抗トランスフェリン抗血清を含めた 。トランスフェリンの実験では、吸光度の値は相対抗体濃度に変換した。 以下の試験結果の記載事項の中で、１は標準の抗血清の１：５０００希釈液中に おける抗体のレベルと定義する。 全ＩｇＧと全ＩｇＧ１の濃度は、トランスフェリンの実験では、メーカーの説 明にしたがって、放射状免疫拡散法のキット（米国カリフォルニア州サンディエ ゴ所在のＴｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ社）を用いて測定した。 クロマチンに対する抗体を、上記の各例に記載されているようにして、ＥＬＩ ＳＡ法で測定した。そのＥＬＩＳＡ表のＯＤ値は、強い陽性の基準血清（ｓｔｒ ｏｎｇｌｙ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｒｕｍ）について作 成した標準曲線を参照して、得た。得られた試験結果は、試験血清と同じＯＤ× １０6を与え、存在する抗体の量の尺度単位を表すように示した、標準曲線の希 釈度である。絶対単位は任意であり、図６と７に等価の希釈率（ｅｑｕｉｖａｌ ｅｎｔ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）で表してある。ＴＧＦ−β１タンパク質の循環濃度の測定 遺伝子を投与することによって循環 サイトカインの濃度の増大が持続されるようになるかどうかを測定するため、マ ウスから６週目すなわち第１回の遺伝子注射をしてから４週間後に採血し、その 血漿試料のＴＧＦ−β１活性を、ＣＣＬ６４ミンク肺細胞増殖検定法を用いて検 定した。なお、この検定法は、Ｌａｔｚ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４４巻、 ４１８９頁に記載されているものを若干改変した方法である。また、この文献は 本明細書に援用するものである。ＴＧＦ−β１を特異的に中和するがＴＧＦ−β ２またはＴＧＦ−β３を中和しないウサギ抗体は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ 米国ミネソタ州ミネアポリス所在）から購入した。遅延型過敏症応答の測定 サイトカイン遺伝子の注射によって細胞 性免疫が調整されるかどうかを測定するため、遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答を、 抗原投与を行ってから４８時間後の足蹠腫脹によって試験した。７０日目に、１ ００μｌの正常食塩水中の１００μｇのトランスフェリンを右後足の足蹠に注射 した。足蹠の厚みを、注射前と注射してから４８時間後にキャリパーで測定し、 これら測定値の差を計算した。試験結果 異種抗原に対する抗体応答に及ぼすサイトカイン遺伝子注射の効果 第一組の実験で、異種抗原すなわちキーホールドリンペットヘモシアニン（Ｋ ＬＨ）、これはプラスミドと同じ部位に注射したが、に対する抗体応答に及ぼす サイトカイン遺伝子の筋肉内注射の効果を測定した。ＫＬＨに対する抗体は、ｐ ＲＳＶＩＬ２とｐＲＳＶＩＬ４の群の方が対照群よりも高いレベルに到達した（ 図６、パネルＡ）。これと対照的に、抗ＫＬＨ抗体は、ｐＲＳＶＴＧＦβ１群の 方が対照群よりも低かった（図６、パネルＢ）。サイトカイン遺伝子が、その効 果を所属リンパ節だけでなく全身にわたって発揮したかどうかを測定するため、 抗原（トランスフェリン）とサイトカインベクターを二つの異なる部位に注射す る第二組の実験を行った。トランスフェリンに対する抗体は、ｐＲＳＶＩＬ２群 で最高であり（図７、パネルＡ）、ｐＲＳＶＴＧＦβ１群では最低であった（図 ７、パネルＢ）。これらの試験結果は、上記２種のプラスミドの注射が抗体応答 と刺激するかまたは阻害することができることを示した。 いくつかの生体外の系で、ＴＧＦβは、ＩＬ−２の作用を打ち消す。ＴＧＦβ が生体内で同じ活性をもっているかどうかは分かっていない。したがって、ＩＬ −２またはＴＧＦ−β１をコードするプ ラスミドを同時に注射する実験を実施した。ｐＲＳＶＩＬ２とｐＲＳＶＴＧＦβ １の両者を注射した群の抗トランスフェリン抗体のレベルは、ｐＲＳＶＴＧＦβ 群と区別できなかった（図１０）パネルＣ）。すなわち、ＴＧＦ−β１の発現が ＩＬ−２の作用を完全に中和したことを実証している。ｐＲＳＶＩＬ４群の抗ト ランスフェリン抗体の平均レベルは、対照群より高かったが、有意差はなかった （１１週目で２．３±０．４対１．７±０．３６ｍｇ／Ｌ）。全ＩｇＧおよびＩｇＧ１のレベル トランスフェリンを注射したマウス由来の血 清中の全ＩｇＧのレベルを測定した。最高のＩｇＧレベルは、ｐＲＳＶＩＬ２群 とｐＲＳＶＩＬ４群において１０週間後と１１週間後に観察された。一方最低の レベルは、ｐＲＳＶＴＧＦβ１群に見られた（表Ｉ）。ＴＧＦ−β１プラスミド を注射すると、ＩＬ−２による増加を完全に阻害した。ｐＲＳＶＩＬ２／ｐＲＳ ＶＴＧＦβ１群の全ＩｇＧのレベルは、ｐＲＳＶＴＧＦβ１群と類似していた。 ｐＲＳＶＩＬ４を注射されたマウスは、ＩｇＧ１の濃度が他の群より有意に高か った。 遅延型過敏症（ＤＴＨ） サイトカイン遺伝子の注射によって細胞性免疫を調整 できるかどうかを決定するため、抗原投与後に足蹠腫脹検定法を行って試験した 。図８に示すように、対照群と比べて、ｐＲＳＶＩＬ２注射マウスに、高度に有 意な足蹠腫脹の増大があった。ｐＲＳＶＴＧＦβ１を同時に注射すると、ＩＬ− ２の効果を完全に阻害した。循環ＴＧＦ−β１のレベル ６週目すなわち最後のｐＲＳＶＴＧＦβ１の注射を してから４週間後のＴＧＦβ１の平均血漿中濃度は、ｐＲＳＶＩＬ２を注射した かまたは未処置の動物の場合僅かに０．３２ｎｇ／ｍｌであったのに比べて、２ ．６ｎｇ／ｍｌであり、これは８倍の差を示している。そのＴＧＦ−βの活性は 、ＴＧＦ−β１に対する特異的抗体によって中和された（表ＩＩ）。 最後のプラスミドを注射してから４週間後に、ｐＲＳＶＴＧＦ−β１かｐＲＳ ＶＩＬ−２のいずれかを注射されたマウスから血漿の試料を集めた。これらの試 料は、１：１０に希釈し、ｐＨ４まで酸性にし、中和し、次いでＣＣＬ６４検定 法でＴＧＦ−β活性について３回ずつ試験した。また、これら試料の一部を、Ｃ ＣＬ６４検定 法に付する前に、ＴＧＦ−β１に対して特異的なウサギ中和抗体（１０ｎｇ／ｍ ｌ）とともにインキュベートした。免疫前ウサギのＩｇＧは、ＴＧＦβの活性の レベルを変えなかった。ＴＧＦβのレベルは、組換えＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄ Ｓ ｙｓｔｅｍｓ社）を含む標準曲線と比べて求め、ｎｇ／ｍｌの単位で表し、１群 当たり３個の試料の平均値±ＳＥで示した。抗クロマチン抗体 トランスフェリンの試験から得た試験結果は、プラスミドＤ ＮＡの注射によって、異種抗原に対する細胞性または体液性の免疫応答中に３種 のサイトカインに特徴的な生物学的効果が誘発されたことを示した。この方法が 、進行中の病的免疫応答を調整するのにも効果的であるかどうかを決定するため 、ＩＬ−２とＴＧＦ−β１のプラスミドを筋肉注射でＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマ ウスに導入した。なお、このマウスは、高力価の自己抗体を産生し、全身性エリ テマトーデスのモデルとして使用されている。ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウス中 のクロマチンに対する自己抗体の力価は、ｐＲＳＶＩＬ２群で有意に増大した。 ｐＲＳＶＴＧＦβ１群に最低の力価がみとめられた。これら２群間の平均値の差 はほぼ７倍であった（図９）。 プラスミドｃＤＮＡの注射後の筋肉組織内での遺伝子発現は、リポーター遺伝 子構造体を用いる実験で、前掲のＷｏｌｆｆ他、Ｎａｔｕｒｅの文献により以前 に実証されている。しかし、本明細書のここで提供した試験結果は、ｃＤＮＡ発 現ベクターを筋肉内に直接注射すれば、全身性の効果を有する生物活性タンパク 質の産生を誘発できるということを初めて実証している。サイトカインの遺伝子 と抗原は、異なる時間に異なる部位で、実験動物に注射した。さらに、これらサ イトカイン遺伝子の免疫作用は、投与後、幾週間も持 続した。これらの試験結果は、これらサイトカイン遺伝子の効果が全身的に発揮 されたことを示している。 例Ｖ マウスリンパ腫モデルにおける裸のポリヌクレオチドの治療量以下の発現によ る予防ＩＬ−２遺伝子免疫療法（発現されたタンパク質が疾病の発症を予防もし くは遅延させることができるかどうかの試験） 実験計画とマウスへの注射 ６月齢のＡＫＲ／Ｊ退役繁殖（retired breeder） 雌マウス、１６月齢の退役繁殖雌ＩＣＲ異種交配マウス、１６月齢のＢＡＬＢ／ ｃの老退役繁殖雌マウスおよび６週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社（米国メイン州バーハーバー所在）から購入した。Ａ ＫＲ雌マウスは、９月齢までに９０％がリンパ腫を発症する。実験を行う前に、 ＡＫＲ／Ｊマウスは、血液塗抹スライドの分析によって循環リンパ芽細胞の存在 について予め選別した。リンパ腫のない動物を、ＤＮＡを注射するための２３頭 のマウスの２群に分割した。ＡＫＲとＩＣＲのマウスは、１週間ごとに３回ＤＮ Ａを注射され、引き続き実験中２週に１回注射された。 ＩＬ−２の遺伝子は、上記の例に記載されているようにして、適当な発現ベク ター中にサブクローン化した。前記の諸実験例に記載されているように、ｐＲＳ ＶＩＬ−２と呼ばれているベクターは、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復プロモ ーターの配列とＳＶ４０ポリアデニル化配列との間にはさまれた、ＩＬ−２をコ ードする配列（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＃６７６１８、米国メリーランド州ロックビ ル）を含有している。 対照のベクターのｐＲＳＶは、ＩＬ−２をコードする配列を持っていない。プ ラスミドＤＮＡは、Ｐｒｏｍｅｇａ ＭＥＧＡＰＲＥＰ キット（米国ウィスコ ンシン州マディソン）を用いて大量に精製した。精製されたプラスミドＤＮＡ（ ２５μｇ／注射）を０．９％ＮａＣｌ溶液（１００μｌ／注射）中に懸濁させ、 次に２８ゲージの注射針を用いて各マウスの右の四頭筋に直接注射した。タンパク質の発現と検出 血清試料を、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ ， Ｉｎｃ．社（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ所在）から入手したＩＬ −２ ＥＬＩＳＡキットを使用してヒトＩＬ−２について検定した。各試料は２ 回ずつ検定し、組換えヒトＩＬ−２の血清中濃度を用いる標準曲線と比較した。 この検定法の検出の最低限界は、７５ｐｇ／ｍｌである。マウスＩＬ−２との交 差反応性は、極微小観察された。 これらの試験結果を図１０に報告する（個々のマウスの発現の時間経過）。動物の長命に関する効果 動物の生存状況を出生時から殺した時点まで測定した 。動物を殺したのは、ａ）著しく体重が減少したとき（すなわち、２週間で３０ ％以上）、ｂ）胸腺肥大のためハンチング（hunching）または呼吸障害が出現し たとき、またはｃ）末梢血液中に多数のリンパ芽細胞がみられた時である。一般 に、末梢リンパ芽細胞は、突然（ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ）出現し、老化の身体的兆 候が死亡する前７〜１０日間に検出可能になった。 生存曲線データの統計的解析は、当該技術分野で公知のカプラン−マイヤー生 存曲線推定量を用いて実施した。群の間の有意性は、当該技術分野で公知のマン テル−ヘンツェル検定法（Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｔｚｅｌ ｔｅｓｔ）を用い て求めた。 この実験に用いた動物の長命に関するデータは、図１１に要約してある。対照 群の動物の１／２がリンパ腫で７箇月２０日で死亡し、全体が９箇月で死亡した 。これに対して、裸のｐＲＳＶＩＬ−２を投与された６頭の動物のうち、４頭が ９カ月後に生存していた。若いＡＫＲ／Ｊマウスにおける、リンパ芽細胞に対する細胞溶解活性に及ぼすＩ Ｌ−２遺伝子発現の影響を測定するためのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞集団の 分析 注射されたマウスのナチュラルキラー細胞溶解活性を、当該技術分野で公 知の標準51Ｃｒ放出検定法を使って測定した。ＹＡＣ−１（ＮＫ感受性マロニー マウス白血病ウイルス誘導マウスリンパ腫細胞系）およびＰ８１５（ＮＫ耐性マ ウス肥満細胞腫細胞系）をＡＴＣＣ（米国メリーランド州ロックビル所在）から 入手し、標的細胞として使用した。51Ｃｒ標識標的細胞を、丸底９６ウエル微量 滴定プレートのウエルに添加し、次いで各種のエフェクター対標的比（Ｅ／Ｔ比 ）が得られるように、エフェクター細胞を３回ずつプレートした。非付着性マウ スＰＢＬ（エフェクター細胞）を、リンパ球Ｍ（カナダ、オンタリオ州、ホーン ビー所在のＣｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．社）の勾 配遠心分離によって単離し、次いで培養皿内で一夜インキュベートすることによ って、単核細胞を消耗させた。エフェクター細胞と標的細胞を４時間、同時にイ ンキュベートした。上澄み液を収穫し、ガンマカウンターで計数して同位元素の 放出量を測定した。 試験結果を、次の式：１００×［（平均ｃｐｍ実験量−平均ｃｐｍ自発的放出 量）／（平均ｃｐｍ全放出量−平均ｃｐｍ自然放出量）］から計算した百分率比51 Ｃｒ放出量として図１２に示す。示した数値は、指定のＥ／Ｔ比および表示の 時点における全ての試料の場合 の平均値＋ＳＥＭである。自然放出量は、２％ＳＤＳを添加した後に測定した。 この検定の試験結果によって、プラスミドを注射されたＡＫＲ／Ｊマウスのリン パ芽細胞に対するナチュラルキラー活性が確認されている。この活性は、通常な ら、これらのマウスには実質的に存在しないであろう。 例ＶＩ 若いマウスと老年のマウスに裸ＩＬ−２遺伝子を導入する際の投与レベルの変 化に対する応答 Ｂａｌｂ／ｃマウスと例Ｖに記載のプラスミド類を用いて、０．９％食塩水中 のｐＲＳＶＩＬ２を、別々のマウスに１週間に１度それぞれ０（すなわちｐＲＳ Ｖのみ）、５、１２．５、２５、５０および１００μｇ／注射の投与量で注射し た。各投与量について、３頭の若いマウス（約１６週齢）と３頭の老年マウス（ １６月齢以上）の右後足の筋肉内に注射した。 ＩＬ−２の発現を、例Ｖに記載したようにしてマウスの各群について検定した 。これらのデータを図１３の（ａ）−（ｂ）に示す。動物の体重と身体の外観も 毒性の徴候として監視した。５０μｇと１００μｇの試験投与レベルで、幾分か の毒性が現れた。 これらのマウスで最高の結果が得られたのは、０．９％食塩水１００ｍｌ中１ ２．５〜２５μｇの場合である。発現は、１箇月時点では老年マウスの方が僅か に大きかったが、２週時点では若いマウスの方が僅かに大きかった。 例ＶＩＩ 各種の侵入点を通して裸のポリヌクレオチドを導入した後の全身 発現 若いＢａｌｂ／ｃマウスの群に、１週間間隔で、裸のｐＲＳＶＩＬ２を、（１ ）皮下（背部）、（２）筋肉内（右後足）、（３）真皮内（尾の基部）、または （４）鼻腔内に注射した。使用したプラスミドは、例Ｖに記載したものと同じで あった。 これらの各ルートを介して裸のｐＲＳＶＩＬ２を投与して得られた全身発現の レベルに関するデータを、図１４に示す。 例ＶＩＩＩ ＩＣＲマウス中のヒトＩＬ−２または発現と、マウスナチュラルキラー細胞集 団の特異的刺激および膨張との相関関係 ＡＫＲ癌モデルにおいて、ＩＬ−２を注射されたマウス中のナチュラルキラー 細胞集団の特異的膨張と刺激は、腫瘍細胞の免疫サーベイランスについてこの群 に有利な効果を与える因子である。したがって、例Ｖでは、ＩＬ−２のレベル（ ＥＬＩＳＡ法で測定）は、ナチュラルキラー活性と相関関係があった。両者の値 は、対照を注射された群の値に比べて有意に増大した。そして、その増大は、同 じ時間間隔（注射の０〜３箇月）中に経験された。同じ時点で、末梢のリンパ球 または顆粒球のレベルの変化は、処置を受けた動物の血液塗抹スライドの分析に よって検出されなかった。この知見は、注射後に炎症が全く起こらなかったこと 、およびＮＫ細胞集団以外の免疫系のサブセットが注射後のＩＬ−２発現のレベ ルに影響されなかったこと、を示しているので、重要である。 同じ情報を老年の動物について以下のようにして求めた。 動物の各群は、１０頭の老年のＩＣＲマウス（固有の病状がない異系交配マウ ス系）で構成されていた。前記例のＡＫＲ動物と同じ プロトコルを用いて、動物に、ｐＲＳＶまたはｐＲＳＶ−ＩＬ−２を注射した。 これらの動物（注射してから０〜４箇月後）の相対白血球数を測定した。その結 果を以下の表ＩＩに示す。 ＮＫ細胞活性を、例Ｖに記載されているようにして、51Ｃｒ放出検定法で測定 した。標的細胞は、ｐ８１５（ＮＫ耐性マウス肥満細胞腫）またはＹＡＣ−１（ ＮＫ感受性マウスリンパ腫）であった。エフェクター細胞は、リンパ球Ｍ遠心分 離法で単離した。ＮＫ細胞活性を測定するのに用いた式は、以下のとおりである 。 これらのデータを下記表ＩＶに示す。 例ＩＸ 皮膚の侵入点における、単核細胞による裸ポリヌクレオチドの細胞取り込みを 示す組織学的試験 裸ｐＣＭＶｌａｃｚをＢａｌｂ／ｃマウスの尾の真皮内に注射してから３日後 に、マウスを殺した。プラスミドの侵入点の組織培養物を得て、大腸菌β−ガラ クトシダーゼ活性を求めるため染色した。これら培養物の組織学的試験で得たス ライドの写真（４０倍）を図１５に示す。 図１５に示すように、プラスミドは単核細胞によって取り込まれていることが わかる（青色）。組織試料中の線維芽細胞は染色されていないので、プラスミド はこれらの細胞には取り込まれなかったことを示している。プラスミドをまさに 取り込んだ丸みのある単核細胞は、マクロファージおよび／または他の抗原提示 細胞のようである。このことは、プラスミドの取込みが捕食作用によるものであ ることを示しているといえる。 例Ｘ 機械的刺激体を用いて免疫応答を誘発する裸ポリヌクレオチドの表皮投与 図１６は、機械的手段によってｐＣＭＶＲＮＰの表皮投与を行った後の抗ＮＰ ＩｇＧの血清中濃度について、例Ｉに記載したのと同様にして、ＥＬＩＳＡ法で 分析した結果を示す。 プラスミドを、先に記載したようにして、前記の未コートのＭＯＮＯ−ＶＡＣ Ｃ装置の尖叉にコートした（あるいは、長期間にわたって安定に貯蔵するため、 該装置の尖叉上に裸のポリヌクレオチドを凍結乾燥させることもできることに留 意すべきである）。該装置 の尖叉全体上の全プラスミド濃度は、等張正常食塩水担体中約５０μｇであった （約１５０μｇプラスミド／ｍｌ）。Ｂａｌｂ／ｃマウスの背部の毛をそり落と し、次いでそのそった皮膚を上記尖叉装置でゆるやかにひっかいた。図１６に示 すように、抗ＮＰＩｇＧが続いて血清中に検出された（例えば、４２日目にこの マウスの血清は１：１０２４０の力価の抗体を含有していた）。 例ＸＩ 化学薬剤を用いて免疫応答を誘発する裸ポリヌクレオチドの表皮投与 化学薬剤を塗布するとともにｐＣＭＶＲＮＰを表皮投与した後の抗ＮＰＩｇＧ の血清中濃度について、例Ｉに記載したのと同様にして、ＥＬＩＳＡ法で分析し た結果を図１７に示す。 プラスミドを４０μｇの等張正常食塩水に懸濁させて、１ｍｌ当たり約１５０ μｇのプラスミドを含有させた。この溶液をＢＡＮＤ−ＡＩＤブランドの包帯の 非接着性パッド（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ社）に吸収させた。 Ｂａｌｂ／ｃマウスの毛を例Ｘに記載されているのと同様にしてそり落とし、 市販の角質溶解剤（すなわち、先に述べた、商品名ＮＡＩＲで販売されている脱 毛クリーム）をそのそり落とした皮膚に塗布した。数分後に、その角質溶解剤を 皮膚から洗い落とし次いでプラスミドを含有する包帯をその皮膚に貼付した。図 １７に示すように、処置した動物は、１：６４０の力価で血清抗ＮＰＩｇＧを発 生した。 例ＸＩＩ 裸ｐＲＳＶ−ＩＬ−２を投与した後のＩＬ−２発現の安定性 ＩＬ−２発現の安定性を、例ＶＩＩついて述べたマウスで、測定した。ｐＲＳ Ｖ−ＩＬ−２を１週間間隔で２回注射した後、ＩＬ−２の血清中濃度を、例Ｖに 記載したようにして、測定した。老年マウスの場合、ＩＬ−２の血清中濃度は、 若いマウスよりゆっくり減少した。これらのデータを図１８に示すが、ＡＰＣの 濃度が特に筋肉組織に比べて相対的に高い組織に裸のポリヌクレオチドを導入す ることによって、比較的安定な遺伝子発現が達成できる、ことを示している。 例ＸＩＩＩ 裸ｐＣＭＶＲＮＰを真皮内に注射されたマウスによる、ウイルスの攻撃に対す る免疫応答 適当な裸ポリヌクレオチドによる予防接種で発生した免疫が、致命的なウイル スの攻撃から動物を保護できるかどうかを試験するため、インフルエンザウイル スのＨ１Ｎ１株（Ａ／ＰＲ／８／３４、米国のＢａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＩｎｏｃｅｎｔ Ｎ．Ｍｂａｗｖｉｋｅ博士から提供 された）由来のＮＰ遺伝子を含有するｐＣＭＶＲＮＰプラスミド１５μｇを３回 １０頭のＢａｌｂ／ｃマウスからなる群に真皮内注射を行った。対照群には、注 射されない動物と関連のないプラスミド（ｐｎＢＬ３）を注射された動物が含ま れている。 最初にプラスミドを注射してから６週間後、ＬＤ90投与量のＨ３Ｎ２インフル エンザ株（Ａ／ＨＫ／６８、この株もＭｂａｗｕｉｋｅ博士から提供された）を 動物に投与した。真皮内に予防接種されたマウスは、予防接種されていない対照 マウスと比べて、上記攻撃 に対して有意に保護された（ｐ＜０．０１）。図１９（カプラン−マイヤー生存 曲線）を参照。 例ＸＩＶ 裸のサイトメガロウイルスもしくはラウス肉腫ウイルスのプロモーターを含有 する裸プラスミドを真皮内注射した後の遺伝子発現の相対レベル 発現ベクター中に用いたプロモーター領域の可能な効果を、例ＩＩに述べたＲ ＮＰ遺伝子を含有する２種のプラスミドを試験することによって、評価した。一 方のプラスミドｐＣＭＶＲＮＰは、サイトメガロウイルスの即時初期プロモータ ー（immediate early promoter）、エンハンサーおよびイントロン領域をもって いた。他方のプラスミドは、ラウス肉腫ウイルスのＬＴＲ領域由来のプロモータ ーを有していた（ｐＲＳＶＲＮＰ）。図２０に示すように、これらプラスミドに よって発現されたＮＰタンパク質に対する抗体応答は、真皮注射した後、ＣＭＶ プロモーターの方が一貫して高かった。なお、このことは、ＮＰ遺伝子を筋肉内 注射した後にみられる応答とは異なっているが、２種のプラスミドによって産生 される抗体のレベルの方はほとんど等価である（データは示していない）。 例ＸＶ 裸ポリヌクレオチドを真皮内投与した後の細胞障害性Ｔリンパ球応答の選択誘 発 Ｃ５７／Ｂ６系のマウスの尾に、ＣＤＭ８ ｏｖａプラスミド（詳細は、Ｓｈ ａｓｔｒｉ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５０巻、２７２４〜２７３６頁、１９ ９３年に報告されている）から精製し た裸ＤＮＡ１００μｇを、２週間の間隔で真皮内注射を行った。このＣＤＭ８ ｏｖａプラスミドは、オボアルブミンに対する全長（１．８ｋｂ）のｃＤＮＡを 含有している。 第２回の遺伝子投与を行ってから２週間後、マウスの脾臓を取り出し、次に、 合成のオバルブミンペプチドで予めパルスされてあってそれに致命的に放射線（ ３０００ラド）を照射された共通遺伝子の脾細胞とともに生体外で培養した。こ のペプチドは、マウス中の細胞障害性Ｔ細胞に対するクラスＩ拘束標的であり、 Ｓｈａｓｔｒｉ他に記載されている組織適合性ハプロタイプＫbを有している。 ５日間培養した後、これら細胞を二つのタイプの標的とともにインキュベート して、オバルブミンをコードする遺伝子を導入されたマウスによる細胞障害性Ｔ 細胞の生成について試験した。これらの標的は、合成オバルブミンペプチドでパ ルスされたマウスＥＬ−４リンパ球またはオボアルブミンのｃＤＮＡで安定にト ランスフェクトされたＥＬ−４細胞であった（図２１を参照。オバルブミンのｃ ＤＮＡは、図中で「ＥＧ７」と示してある）。これら２種の標的の溶解百分率を 異なるエフェクター対標的比（図２１ではＥ：Ｔ比として示してある）の場合に ついて測定した。図２１に示すように、裸ＣＤＭ８ ｏｖａプラスミドを導入さ れた動物は、オバルブミン標的（すなわち、オバルブミンペプチドを有するＥＬ −４およびＥＧ７）に対して特異的であるが、対照のＥＬ−４細胞（すなわち、 オバルブミンペプチドを含有していないＥＬ−４細胞）に対しては特異的でない 細胞障害性Ｔ細胞を産生した。 ＣＤＭ８ ｏｖａプラスミドを真皮内に予防接種されたＣ５７／Ｂ６マウスも 、オバルブミンに対する抗体について選別された。ＣＤＭ８ ｏｖａプラスミド を投与してから６週間後に集めた血清は、 検出可能なレベルの抗体を含有していなかった（オバルブミンをコートした微量 滴定プレートについて、酵素結合イムノソルベント検定法を用いて測定した）。 総合的に、これらのデータは、本発明の裸ポリヌクレオチドの投与法が、抗体産 生を誘発することなしに、ＭＨＣクラスＩ拘束細胞障害性Ｔ細胞（この場合オバ ルブミンに対するＴ細胞である）を誘発することを示している。 例ＸＶＩ Ｔ細胞に対する抗原による刺激によって誘発される、裸ポリヌクレオチドの真 皮内投与後の延長された免疫記憶 ＣＭＶプロモーターの制御下で大腸菌酵素β−ガラクトシダーゼをコードする プラスミド型の裸ポリヌクレオチド（「ｐＣＭＶ Ｌａｃ−Ｚ」）（０．５〜５ ｎｇ／１ｍｇのＤＮＡ内毒素含量）の０．１、１、１０および１００μｇを、４ 頭ずつのマウスからなる群に、筋肉内（「ＩＭ」）または真皮内（「ＩＤ」）の 投与経路で投与した。比較のために、４頭のマウスからなる別の群に１００μｇ のβ−ガラクトシダーゼタンパク質（「ＰＲ」）を真皮内に投与した。注射は、 すべて担体として５０μｌの正常食塩水を用いて行った。ＩＭおよびＩＤの注射 は、０．５ｍｌのシリンジと２８．５ゲージの針で実施した。その後、２週間の 間隔をおいて、酵素結合イムノソルベント検定法で抗体を測定した。 要約すると、全抗体は、固相抗原としてβ−ガラクトシダーゼ（米国カリフォ ルニア州所在のＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を用いて測定した。微量滴定プレート （Ｃｏｓｔａｒ）米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）を、９０ｍＭホウ酸塩 （ｐＨ８．３）＋８９ｍＭのＮａＣｌ（すなわちホウ酸緩衝食塩水：ＢＢＳ）に 溶解した抗 原５μｇで、一夜室温にてコートし、次いで１０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミ ンを含有するＢＢＳで一夜ブロックした。 血清試料は、最初の８週間は１：４０の希釈度で出発して、その後は１：３２ ０の希釈度でＢＢＳで連続的に希釈した。これらの試料をプレートに添加し一夜 室温で貯蔵した。これらプレートをＢＢＳ＋０．０５％ポリソルベート２０で洗 浄し、次にアルカリ性ホスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（米国ペンシ ルベニア州ウェストグローブ所在のＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎａｒｅｓｅａｒ ｃｈ Ｌａｂｓ．社）の１：２０００希釈液と室温で１時間反応させるか、また は同じ条件下で、アルカリ性ホスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（米国 アラバマ州のＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏ−ｔｅｃｈ社）の１：２０００希釈液と 反応させるか、またはアルカリ性ホスファターゼ標識ラット抗マウスＩｇＧ２Ａ 抗体（米国カリフォルニア州のＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）の１：５００希釈液と 反応させた。プレートを再度洗浄し、次いで、１ｍＭのＭｇＣｌ2を含有する０ ．０５Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ９．８）中に１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェノール ホスフェート（米国インディアナ州インディアナポリス所在のＢｏｅｈｒｉｎｇ ｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を含有する溶液を添加した。基質をプレートに添加 してから１時間後に、４０５ｎｍの波長光の吸光度を読み取った。 図２２に示すように、ｐＣＭＶ Ｌａｃ−ＺプラスミドをＩＤ注射で投与され た動物とＰＲを投与された動物には、等価の大きさの抗体応答が誘発されたが、 一方ｐＣＭＶ Ｌａｃ−ＺプラスミドをＩＭ注射で投与された動物には、それよ り小さい抗体応答が測定された。 Ｔ細胞の記憶を評価するため、動物に、別の部位にＩＤ注射で０． ５μｇのＰＲをブースト（追加投与）した。もし、これらの動物が記憶Ｔ細胞を 発生してβ−ガラクトシダーゼに対する抗体の産生を制御していたのであったな らば、これら動物は、可溶性タンパク質の抗原を追加投与した後に、初回抗原投 与に対する応答で示されたよりもはるかに激しい免疫応答になると考えられる。 図２３に示すように、ｐＣＭＶ Ｌａｃ−ＺプラスミドをＩＤ注射によって投 与された動物は、プラスミドまたはＰＲをＩＭ注射で投与された動物よりも相当 に優れた免疫記憶を発生していたことは明らかである。さらに、ＩＤ注射を受け た動物が発生した記憶は、最低約１２週間持続した。 例ＸＶＩＩ 裸ポリヌクレオチドを真皮内投与した後のＴＨ１応答の選択的誘発 マウスに おいて、ＩｇＧ２Ａ抗体は、ＴＨ１型免疫応答に対する血清マーカーであり、一 方ＩｇＧ１抗体は、ＴＨ２型免疫応答を示唆している。ＴＨ２応答は、アレルギ ー随伴ＩｇＥ抗体クラスを含み、可溶性タンパク質抗原が比較的強いＴＨ２応答 を刺激する傾向がある。これに対して、ＴＨ１応答は、マクロファージおよび樹 状細胞に結合する抗原によって誘発される。ＴＨ１応答は、アレルギー症とＡＩ ＤＳを治療するのに特に重要である。 応答があるとすれば、どの応答が本発明の裸ポリヌクレオチドを投与されたマ ウスによって起こされるのであろうかを決定するために、マウスに、ｐＣＭＶ Ｌａｃ−Ｚまたは前記の例に記載のタンパク質を予防接種した。２週間隔で、β −ガラクトシダーゼに対するＩｇＧ２ａとＩｇＧ１が少しでも存在すれば、該酵 素をコートした微量滴定プレート上で、酵素結合イムノソルベント検定法（Ｉｇ Ｇ１およびＩｇＧ２Ａのサブクラスに対し特異的な抗体を使用して）によって、 その存在を測定した。 図２４に示すように、プラスミドをＩＤ注射で投与されたマウスのみが高力価 のＩｇＧ２Ａ抗体を産生した。図２５に示すように、該酵素自体でマウスを免疫 化すると（「ＰＲ」）、比較的高い力価のＩｇＧ１抗体の産生が誘発された。Ｉ Ｍで注射されたマウスの場合は、ＩｇＧ２ＡおよびＩｇＧ１の抗体の両者が低力 価で、明らかな選択性なしで産生された。これらの図に示すデータは、４頭ずつ のマウスからなる各群から得た数値の平均値で構成されている。 時間の経過に対する抗体応答の安定性を測定するため、同じ群の動物に、０． ５μｇの酵素を真皮内に注射して追加投与を行った。図２６と２７に示すように 、予めＩＤ注射された動物に酵素を追加投与すると、ＩｇＧ２Ａ抗体応答に１０ 倍近くの上昇を誘発した（すなわち、抗体力価が１：６４０から１：５１２０ま で上昇した）が、ＩｇＧ１応答は刺激しなかった。これらのデータは、裸ポリヌ クレオチドのＩＤ投与によって誘発される選択的ＴＨ１応答が、続いての抗原へ に暴露にも拘わらず、宿主内に維持されていることを示している。 例ＸＶＩＩＩ 機械的刺激体による裸ポリヌクレオチドの投与後のマウス内のＴＨ１応答 例ＸＶＩＩで述べた実験を、次に挙げる相違点を除いて、別の群のマウスにお いて繰り返した。すなわち、その相違点は、（１）初回抗原投与だけを試験した 、および（２）ｐＣＭＶ Ｌａｃ−Ｚプラスミドを、４頭のマウスからなる１群 に例Ｘで述べた尖叉装置を 用いて投与し、一方β−ガラクトシダーゼタンパク質（１０μｇ）を、４頭のマ ウスからなる他の群に真皮内（ＩＤ）注射で投与した、ことである。 図２８に示すように、プラスミドを投与されたマウスは、タンパク質を投与さ れたマウスと比べて、比較的低い力価のＩｇＧ１抗体を産生した。これに対して 、図２９に示すように、プラスミドを投与されたマウスは、タンパク質を投与さ れたマウスに比べて、十分に高い力価のＩｇＧ２Ａ抗体を産生した。 これらの試験結果は、例ＸＶＩＩで得た結果に類似しているが、興味深いこと に、次のような違いがある。すなわち、尖叉装置で皮膚をひっかくことによって プラスミドを投与されたマウスは、同じプラスミドをＩＤ注射で投与されたマウ スよりも一層高い力価のＩｇＧ２Ａ抗体を産生した（これら両群とも、ＩＭ注射 でプラスミドを投与されたマウスよりも高い力価のＩｇＧ２Ａ抗体を産生した） 。これらの試験結果は、皮膚を尖叉装置でひっかくと、裸のポリヌクレオチドの ための「損傷を受けた」侵入点に多数のＡＰＣが引きつけられることを示し、か つ、ＡＰＣが、筋肉や他の体細胞よりも、遺伝子の投与と発現を行うのに一層効 果的な標的である、という学説と一致している。 これらの図に示したデータは、４頭のマウスからなる各群から得た数値の平均 値で構成されている。Detailed Description of the Invention Methods, sets for administering naked polynucleotides encoding bioactive peptides Products and equipmentRelated US Patent Application   This application is a US patent application filed with the US Patent and Trademark Office on August 26, 1993. It is a partial continuation application of No. 08 / 112,440.Statement of US Government Rights   This invention is directed to grant numbers AR07567 and AR awarded by the National Institutes of Health. It can be said that it was made with government support based on 25443. US Government Invents May have some rights to.Background of the Invention 1. Field of the invention   The present invention is one or more operatively encoding bioactive peptides. Of the polynucleotide of claim 1 into a mammalian host, preferably by non-invasive means By the method of administering a bioactive peptide to a mammalian host. The present invention Administers the polynucleotide to treat diseases and immune functions associated with aging in mammals. To prevent and treat the loss of 2. Description of related technology   Introducing a bioactive peptide or protein directly into a patient's cells Is of great therapeutic value. However, this approach has some drawbacks. The key issues, especially for peptides Potential toxicity at doses sufficient to produce a biological response And. In practical terms, the isolation, purification or synthesis of these peptides There is a cost problem involved. Furthermore, the clinical effect of these peptides is Relatively short half-life, which depends on the proteases present in the target tissue It is usually due to the degradation of these peptides).   For these reasons, delivering a protein-expressing gene to a patient / host The method of introducing protein into a patient by It is an interesting method. However, so far, the introduction of heterologous genetic material into the host The main means is to transform host cells with viral vectors, for example. Then, the gene is integrated into the genome of the host. Virus envelope receptor A protein containing DNA encapsulated within a proteoliposome containing protein, Using the DNA encapsulated in the posome, the gene can be directly transferred into a living animal. The method of sending is also reported.   In 1984, squirrel hepatitis naked cloned plasmid DNA was introduced into squirrel liver. When injected, it was confirmed that the squirrel had a viral infection and the production of antiviral antibodies. A study at the National Institutes of Health (NIH) was presented as shown (Seeger et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, Volume 81, 5849-58 52, 1984). Years later, Felgner et al. Were injected into skeletal muscle tissue. Naked polynucleotide (ie, liposome or viral expression vector) Protein was expressed from DNA or RNA that is not bound to (Felgner et al., Science) Vol. 247, p. 1465, 1990. See also PCT application WO 90/11092). Felgner and others Is a T-tube (transverse) in which muscle tissue extends deeply into multinucleated cells, sarcoplasmic reticulum, and muscle cells. The muscle cells are composed of a polytubular system and have a unique structure, Expected to efficiently incorporate and express nucleotides Was.   It is believed that cells of other tissues can also take up the naked polynucleotide However, expression in other tissues has so far been limited to delivery of expressed genes by delivery systems, It has only been confirmed, for example, by liposome transformation of cells. In fact, others Researchers have shown that naked polynucleotide uptake and expression occurs in tissues other than skeletal muscle. Suggests that it does not occur at detectable or bioactive levels (eg , Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 11277-11281, 1992 [When a gene is delivered by aerosol] Expression occurred using the liposome delivery system, but only with DNA introduced. Expression did not occur], and Tang et al., Nature, 356, 1 52-154, 1992 [hGH plasma bound to colloidal gold beads. Vaccine did not elicit an immune response when injected into the skin of mice with the vaccine "cancer" ])).   Injecting DNA or RNA into muscle tissue with long-term therapy is Although generally effective in expressing genes, genes lost due to gene degradation Repeated injections are needed to make up for the current situation. This approach is time consuming and expensive Not only that, it is not practical because inflammation occurs at the injection site and its vicinity. Due to such inflammation, somatic cells such as muscles into which nucleotides are introduced are themselves The body becomes the target of an immune response (see, eg, Example I), resulting in severe myonecrosis Sometimes. In addition, intramuscular injection of DNA risks damaging muscle tissue Not only that, the efficacy of the treatment is obviously reduced. For example, working at the University of Ottawa Researchers recently said that "striated muscle is a reporter that is transmitted in the form of plasmid DNA. -It is the only tissue found to be able to absorb and express genes ... but we According to the findings of the above, fibers damaged by the above-mentioned injection method take up plasmid DNA and are released. Do not reveal. Was observed (Da vis et al., Human Gene Therapy, vol. 4, pp. 151-159, 1993).   Furthermore, the use of intramuscular injection is less effective in treating diseases of the muscle tissue itself. Although effective for a short period of time, if it is expressed elsewhere in the patient's body, Not sufficient to stimulate a tissue-specific immune response or other biological response to tid Does not seem to be effective.   As a result, intramuscular injection is a major entry point for many infections: the skin and mucous membranes. It is not a particularly practical method to express the peptide in.   In addition, intramuscular injection of the polynucleotide results in the coding of target muscle cells. Due to the release of the protein, it produced both antibodies and cytotoxic T cells in the tissue. It seems to be. In contrast, protein injections (eg vaccination regimens ), Exogenous proteins do not efficiently enter the class I processing pathway Therefore, it does not normally induce the generation of cytotoxic T cells.   Invented in PCT patent application WO 90/11092 (discussed above) When injected with naked DNA into skeletal muscle and other body tissues, the cytoplasm of injected cells He proposed that the gene would be expressed in it. In addition, the inventors Proteins then enter the class I processing pathway to generate cytotoxic T cells To induce (required to control established viral infections and cancer) . However, as discussed above, instead of somatic cells expressing the antigen, They also have to be tested for anti-class I restricted cytotoxic T cell responses before they are elicited against the antigen. Antigen must be released into the extracellular space used for uptake by the primary presenting cells It seems to be. This conclusion is supported by recent studies on antigen presentation , "Implicitly expressed in non-hematopoietic cells ... Immune response to class I restricted antigen When the answer is primed, the antigen is presented to the host bone marrow-derived cells before it is presented. Have been observed (Huan g, et al., Science, 264, 961-965, 1994). Accordingly To express the protein of PCT application WO 90/11092. At least one premise on which the method of introducing genetic material into muscle cells is based it's not correct.   However, intramuscular injection can be used systemically before the injected gene is degraded. Expresses relatively high levels of protein. Such a response is a protein For therapies aimed at replacement, although desirable, relatively fast clearance or Is not intended in immunization protocols where relatively low levels of expression are optimal This may result in toxicity. As a result, tissues that regularly drop or regenerate Cells (eg, skin) and / or cells that have a relatively high wear rate in vivo (eg, , Antigen presenting cells) are more useful for gene immunization. It will be a route.   Regarding the gene delivery system, a viral vector that introduces the gene into the host genome Means such as are associated with potential health risks associated with damage to genetic material in the host cell. There is. Cationic liposomes or biolisters for delivering genes in vivo. Biodevice (ie, attached to beads) Use a vaccine "cancer" that "fires" the combined polynucleotide into the tissue Is preparatory and selects the appropriate particle size for delivery to target cells. It is necessary to carry out some experiments to choose. In addition, the invasiveness of introducing nucleotides Traditional means (eg injection) have problems of tissue trauma (especially for long term treatment) , Limited access to specific target tissues, such as organs.   Non-invasive peptide pharmaceutical preparations such as iontophoresis and other transdermal delivery methods The means for delivery has at least the advantage of minimizing tissue trauma. However, The bioavailability of peptides transmitted by the skin or mucous membranes is determined by these groups. It is believed to be limited by the relatively high concentration of proteases in the weave. Sa Unfortunately In particular, by transducing the gene encoding the peptide transdermally or mucosally Reliable means of delivering peptides by means of gas are not yet available.   Advantages in successful administration of peptides by expressing naked genes in vivo Refers to cytokine proteins (eg, interleukin-2, hereafter “IL- 2) is administered to patients to treat or prevent diseases associated with aging. It can be explained by comparison with the current state of the law.   Despite the different lifestyles and longevity of mammal species, almost all mammal species Certain diseases occur in mammalian species as part of the aging process. As these diseases Has insulin resistance which can lead to cancer, hypertension, vascular disorders and diabetes is there. The timing of the onset of these diseases may be due solely to environmental factors The onset is thought to be genetically programmed because You. However, there are processes that actually control the aging process and the development of age-related diseases. Su is not known.   In general, aging is a decrease in the ability to mount an immune response to exogenous antigens, and a surplus of functions. And a decreased response to stress, and an increased tendency to fibrosis I have. All of these conditions involve or involve circulating cytokines. Are partially regulated in vivo by cytokines.   For example, interleukin-1 (IL-1) protein is associated with glucose homeostasis. And C57BL / 6G and insulin resistant C57BL / Ks db mice and C57BL / 6G   It can act as a hypoglycemic agent in ob / ob mice (Del Rey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Volume 86, 594 P. 3, 1989). In these animal models of adult-onset diabetes, human recombination A single injection of IL-1 normalizes blood glucose levels for several hours. Also IL -1 is hypothalamic pituitary axis and stroke that affect appetite It is also known to act on the response to loess. Therefore, IL-1 Abnormal production or responsiveness of insulin causes aging-related non-insulin-dependent diabetes mellitus and fertilization. It is the basis on which both maturity occurs. Therefore, IL-1 gene therapy (for IL-2 Dosing in exactly the same manner as listed) The onset of the disease is prevented.   Hypertension is another complication of aging that often occurs with diabetes. Recently Study shows that it is nitric oxide, an endothelial relaxation factor, that regulates blood pressure I understood. Nitric oxide production is regulated by IL-1. Therefore, old The rise in blood pressure that accompanies aging can also be prevented by IL-1 gene therapy. Wear. IL-1 protein causes fever and shock when administered rapidly to animals. It may be rubbed. However, somatic gene therapy continued to produce low levels of IL-1. When produced, these side effects are avoided.   Research on biological effects of administration of pharmaceutical doses of cytokine proteins Research has recently been conducted by researchers to stimulate the immune system against certain pathogens. To increase its response and to be infected with eg human immunodeficiency virus (HIV) The search for maintaining the immune function of immunocompromised patients such as patients is progressing. .   Specifically, there have been recent attempts to administer IL-2 as a therapeutic agent for immune system diseases. Several reports have been made as follows. That is, Teppler et al., J. Exp . Med. 177, 483-492, 1993 (recombinant IL-2 tamper Administration of the conjugate of polyethylene and polyethylene glycol to HIV infected patients), Ca Liguiri et al., J. Clin. Invest. , 91, pp. 123-132 , 1993 (Long-term infusion of recombinant IL-2 protein into patients with advanced cancer), And Kaplan et al., Bio / Technology, 10 volumes, 157-16. P. 2, 1992 (M. leprae or HIV infected Administration of IL-2 to patients) There is. The center of these studies is to find the IL-2 protein to minimize its toxicity. It is to develop a means of administering by law.   The toxicity of the IL-2 protein is a major obstacle to its use as an effective therapeutic agent. It ’s doing harm. IL-2 therapy was generally given to be effective Protein saturates high-affinity IL-2 receptors and circulates naturally Killer (NK) cells must be present in the serum in an amount sufficient to be significantly expanded. It is necessary. However, high doses of IL-2 are associated with severe hypotension, pulmonary edema, renal failure, It causes fatal toxicity such as cardiac arrhythmias and neurological dysfunction. Overcoming this problem The methods adopted by the above researchers to achieve the onset of infection and / or disease Then, a method of conducting an experiment by administering the IL-2 protein for a long time with a relatively small dose there were. However, this method is effective for consistent and predictable IL-2 therapy. Parameters must be defined. In particular, the introduction of cytokines The resulting circulating protein concentration is also degraded by proteases. And changes considerably over time. Therefore, repeated injections are necessary. The result is that there are “peaks and valleys” in the amount of protein available to the patient. Moreover, studies with IL-2 show that a similar method, even after considerable clinical experimentation, Use other cytokines that play a role in various medical conditions, including age-related diseases. It does not indicate whether it is definitely valid when used.   Therefore, proteins (including but not limited to cytokines and antigens) Effective means of introducing the protein into the host in a manner that minimizes the toxicity of Is required. More specifically, certain but sub-therapeutic concentrations There is also a means for introducing the protein into the host in such a manner that the protein is expressed for a long period of time. Has been requested. In the latter case, cytoca Means for administering insulins are required.   More broadly stated, the above considerations induce local immunity to the skin and mucous membranes. Peptides that can be vaccinated against the host against sexually transmitted diseases and respiratory diseases, for example. It also shows the need for effective means of introducing naked nucleotides expressed in vivo. You. It is also a tissue-specific method that does not cause significant trauma to tissues and is tissue-specific. It has been suggested that there is a demand for a means for introducing a gene encoding a peptide into a host. You.   The present invention addresses all these needs.Summary of the invention   The details of the preferred embodiment of the invention are set forth in the accompanying drawings and the description below. The present invention Once you know the details of, many additional innovations and The change will be obvious. 1.Definition   The following definitions are provided to facilitate the discussion of the present invention. Only However, those skilled in the art will appreciate that these definitions are within the legal scope and spirit of the invention. It will be appreciated that the equivalents may be expanded without departing from the. This For these reasons, these definitions should not be construed as limiting the invention. a. "Naked polynucleotide"Means DNA or RNA, and in the present invention Therefore, the appropriate sense strand and antisense strand for the purpose of the therapy to be implemented. Including Toland. The polynucleotide in this case includes the oligonucleotide In some cases. "Naked" in this context refers to colloidal substances (liposomal formulations (Including) and a vector that integrates the polynucleotide into the host genome -Means a polynucleotide that is not contained in the b. "Operatively coded"(Operatively encoding ) Is the expression of the desired translation product, eg peptide or protein, and Promoter required for secretion A polynucleotide modified to contain a sequence such as. Fruit of the invention All embodiments can be carried out using known plasmid expression vectors . Preferably, these vectors contain a cDNA encoding the desired translation product. Have. Thus, unless otherwise stated, "polynucleotide" or The "naked polynucleotide" is contained in an appropriate plasmid expression vector By operative coding sequence. c. "A mixture of polynucleotidesIs more than two species under the control of the same promoter By up to 200 species of polynucleotide shall be meant. d. "SynthesisMeans a known technique for synthesizing a polynucleotide sequence, Isolation and purification of sex polynucleotides. e. "peptideIs a small peptide or polynuclear compound that has a desired biological effect in vivo. It refers to cleotides, oligopeptides and proteins. f. "Ion introduction methodIs currently used to deliver peptides to a host continuously. It means a known percutaneous permeation method. More specifically, the method is , Easy transport of ionic species by applying physiologically acceptable current Is the process of doing so. This process and other percutaneous permeation techniques are described by Chie. n et al., Transdermal Drug Delivery, “Novell Drug Delivery Systems ”, Chapter 7, Section C (Marcel Dekker, 1992), the related disclosures of which are related to pharmaceuticals. Incorporated herein to indicate the state of the art in the art of delivery Things. g. "Surfactant / absorption promoterIs the absorption and transfer of certain small molecules and peptides. By chemical agents currently known in the art to facilitate entry. h. "Antigen presenting cells"APC" means Langerhans Cells, veil cells of imported lymphatic vessels, dendritic cells, and dendritic cells of lymphoid organs Known APCs such as In addition, this definition includes (1) Lymphocytes and macrophages that absorb and express cleotide in the skin, and (2) Also included are mononuclear cells such as the mononuclear cells shown in the tissue photographs included in the description. I have. These cells are not tissue cells, but are considered antigen presenting cells. Departure The most important of these cells for Ming are the epidermis, as well as the buccal mucosa, vagina, Includes squamous mucosal epithelium of the cervix and esophagus (areas with "relatively high concentrations of APC") , Known to be present in large numbers in thymus-dependent regions of epithelial and lymphoid tissues It is an APC. Therefore, the terms "skin" and "mucous membrane" are used herein. The term specifically refers to the site where APCs are assembled in addition to their definitions below. I have. i. "Host"Means the recipient of the therapy performed by the present invention. The host is It may be any vertebrate, but is preferably a mammal. If the host is a mammal, Humans are preferred but domestic or pet animals may be used. j. "Target tissueIs the host tissue in which expression of the naked polynucleotide is sought. Means k. "Skin"Herein refers to the epidermis, dermis and subcutaneous tissue of the host . l. "Mucous membrane"Means, but is not limited to, mucosal tissue of the host located within the body , Respiratory channels (including bronchial channels, lung epithelium and nasal epithelium), genital channels (vaginal, (Including the penis and anus mucous membranes), urinary channels (eg urethra, bladder, etc.), mouth, eyes, Ravi and vocal cords are included. m. "Entry pointIs a host for naked polynucleotide Means a site to be introduced. n. "Surrogate end point(Surrogate End Point) " Means the biological state of the host that occurs immediately before. That Examples include loss of glucose tolerance (diabetes), increased cholesterol levels (heart disease) and And the presence of free-radical amino acids in blood and urine (this is the central deity (Meaning that the enzyme detoxifying free radicals in the system is lost). You can o. "Biological defect"Is the immune function or good health associated with aging of mammals Loss of disease, including defects in disease and resistance to host disease. p. "Subtherapeutic concentration"and"Sub-therapeutic dose"The Naked Poly Nucleo For peptides expressed by non-cumulative administration of tide to the host Naked polynucleotides may be present in insufficient amounts in the host to produce an acute, detectable response. It means the expression of the peptide in the host. q. "Dermis"and"Administration to the epidermisIs the naked polynucleotide on or in the skin The route of administration given through the skin is shown. The dermal route includes intradermal and subcutaneous injection and And percutaneous penetration. As an epidermal pathway, it is used to induce an immune response to stimulants. There are means to fully stimulate the outermost layers of the skin. As the stimulator, mechanical or There are chemical (preferably topical) agents. r. "Epithelial administration", Except that a chemical stimulant is applied to the mucosal epithelium. It is almost the same method as the epidermal administration of academic drugs. s. "IL"Means interleukin. t. "THI responseIs a kind of APC, that is, macrophages and dendritic cells Humoral immune response elicited preferentially by antigens that bind to and activate them Means u. "Bioactive peptideExerts therapeutic benefit within the host when administered to the host Or a peptide that induces an immune response. 2.Consideration   In one aspect, the present invention operatively encodes an antigen or peptide. Host a naked polynucleotide (that has the genetic code to make it) Local immunity to antigens or therapeutic peptides by delivery to the main cells Configured to elicit a systemic response to a polynucleotide or polynucleotide . More specifically, naked polynucleotides compare to other tissues in the body. It is preferable to deliver to a tissue containing an extremely high concentration of antigen-presenting cells. The present invention Is not completely limited by a particular principle regarding the expression mechanism involved However, the polynucleotide is expressed by mononuclear cells, presumably the host's antigen-presenting cells. Therefore, the biological response in these tissues is reached by the administration of naked polynucleotides. It is thought to be made. In addition, the mononuclear cell is resistant to the introduction of the naked polynucleotide. It is thought to be involved in the inflammatory immune response.   Histological studies show that naked polynucleotides, in significant amounts, are not fibroblasts. It does not appear to be directly absorbed by any tissue cell (see Example 9 and Figure 15). See). This conclusion is that (1) intradermal administration of a trace amount of naked polynucleotide to mice Even induced a marked TH1 response (antigens by macrophages and dendritic cells Suggestion of presentation, see Example 17 and Figures 24-25), (2) naked polynucleotide Intradermal administration to mice without stimulating the production of detectable concentrations of antibody , Induced the generation of cytotoxic T cells (see Example 15 and FIG. 21), and And (3) long-term immune memory is elicited against polynucleotides as antigens. And (Example 16 and Figures 22-23) corroborated by the study results.   If inflammation plays a clear role in this method of the invention, it is associated with inflammation. Uptake of naked polynucleotides (especially skin) Uptake over barriers such as skin and mucous membranes) It will be appreciated by those skilled in the art.   The ideal target tissue is the skin or mucous membranes. these Tissue is an infection or disease in which it is desirable to elicit a localized therapeutic or immune response. It is particularly preferred if the treatment is for a disease. For example, the mucosal route of administration is Sexual sensations of treatment to boost the immune response to antigens in infected tissues Preferred for the treatment of blemishes. Administration via the intranasal route (by inhalation or insufflation) is It is particularly useful for therapy to treat the disease and its related diseases. In addition, mucous membranes or The dermal route is useful for immunizing against allergens. Also these Tissue has the ability to regenerate, so that the introduced substance stays at the entry point. It is preferable because the interval is limited.   Antigen-presenting cells present in target tissue mediate expression of naked polynucleotides The method of the present invention is useful for eliciting a localized response. It is not useful in eliciting a systemic response to moderately expressed peptides. I However, if the dose is sufficient, a transient systemic effect can be induced. But Useful in this aspect of the invention to induce a systemic response to the expressed peptide. A particular use would be as an adjuvant for other systemic therapies.   In another aspect of the invention, the APC acts as a carrier and the naked polynucleotide Are delivered to lymphoid organs and mucosal tissues other than the point of entry. This embodiment is described below. However, the mechanism described limits the present invention. Should not be construed as prescriptive.   In this embodiment, the APC introduces the naked polynucleotide into the entry point or its Absorbed nearby and then sent to the lymphatic circulation. When APC reaches the lymph nodes, Present the expressed protein as an antigen to stimulate an immune response. From there, These APCs carrying "homing" receptors, for example from the mucosa, are It reenters the system and circulates until it colonizes target cells other than the tissue at the point of entry. Desired By homing receptors (specific membrane proteins that bind to target cell ligands) Was sequenced and incorporated into the naked polynucleotide.   For expression in the lymphatic system, this embodiment delivers cytokines Enhances the responsiveness of the host and increases the concentration of specific cytokines present in the host. It also provides a method of increasing the degree. Especially in lymphoid organs The host concentration of the drugs (administered with the challenge or shortly thereafter) Larger amounts can increase the host's immune response to pathogen antigens further, and And (1) acts as an adjuvant for the vaccine, and (2) autoimmunity. Reduce the immune response to self-antigens, or (3) alloantigens (eg tissue or Reduce the immune response to (produced after organ transplantation).   APC carrying the gene of interest migrates from the lymph node, homing APC When it circulates to the tissue that has the receptor, the gene It can be administered and expressed at sites that are inconvenient and difficult to access. For example, in the nasal cavity The delivered naked polynucleotide is expressed in the genital mucosa under appropriate conditions .   Another application of the present invention is to alleviate allergic reactions to antigens. This The nasal route of administration is particularly useful in this regard.   For example, IL-2, γ interferon and / or transforming growth factor (T The gene for GFβ) can be administered to suppress the production of IgE molecules. Recently Study shows that IL-2 and γ-interferon interfere with IgE production The above method is of particular interest as it was confirmed to be toxic at sufficient doses. So In addition, since the IgE molecule is predominantly present in the skin and mucous membrane, the IgE molecule of the present invention is Using these pathways as an entry point relieves allergic reactions in these tissues. It can be expected to be particularly effective in deriving.   Examples exist where it is useful to induce a localized response in the skin or mucous membranes. In particular, administration by the mucosal route is preferable when treating sexually transmitted diseases. This therapy is HIV, human papilloma virus (viruses involved in the formation of genital warts, etc. ) Such as infectious agents or skin It can be used to regulate the local immune response to skin viral infections. Ma In addition, if immunosuppression is therapeutically valuable, it may have immunosuppressive factors (eg TGFβ). Genes encoding efficacy can also be provided by the method of the invention. This way An example where is useful is in treating inflammatory bowel disease.   A particularly useful aspect of the present invention is that cytokines associated with the development of diseases associated with aging. And biochemicals of the invention for long term delivery to the host in subtherapeutic concentrations. Use. In this aspect, the naked polynucleotide is a cytokine or related It operably encodes growth factor-like proteins, and these proteins Presence or absence in the circulatory system of humans facilitates or delays the development of aging-related diseases. Stimulates the immune system, such as by letting it down. Such diseases are concentrated in the serum. Peptides whose degree usually decreases with age, such as cytokines, growth hormone And enzymes (eg, human α-L fucosidase, which is a Mediated inflammatory response) can be suppressed.   Another particular advantage of the present invention is that it provides relatively low doses of antigen. is there. More specifically, the polynucleotide that will operably encode the antigen. Since octide is administered instead of the antigen itself, the amount of foreign substance introduced into the host is proportional. Relatively few. Furthermore, the route of administration of the naked polynucleotide through the skin or mucous membranes Is an intramuscular route of administration that results in the concentration of DNA required to elicit an immune response of the same strength. 2 (for example, about 1/10 to 1/50. For example, Example 16 and FIG. 2-23). As a result, the present invention is for use as, for example, a multivalent vaccine. , Useful for administering naked polynucleotides encoding hundreds of different antigens .   Another particular advantage of the present invention is its use in antisense therapy. Simply put , If a particular disorder is associated with the expression of a particular mutated nucleic acid sequence, Gene is specific at the transcription or translation stage Nucleotide sequences that interfere with proper expression can be used. This technique Utilizes, for example, antisense oligonucleotides and / or ribozymes , Mask specific mutant mRNA with antisense nucleic acid or Cleavage with ribozyme blocks transcription or translation of the mRNA.   The antisense nucleic acid is complementary to at least a portion of a specific mRNA molecule. DNA or RNA molecule (Weintraub, Scientific c American, 262, 40, 1990). How many to date Genes or oncogenes for suppression or down regulation It has been targeted and includes: That is, but not limited to, p53 (V . S. Prasolov et al., Mol. Biol. (Moscow), Volume 22, 110 5-1112, 1988), ras (SK Anderson et al., Mol. . Immunol. 26, 985-991, 1989, D.M. Brown Oncogene Res. 4, pp. 243-249, 1989), f os (B. Levi et al., Cell. Differ. Devl, 25 volumes (Supp l), pp. 95-102, 1988, D.I. Mercola et al., Gene, Volume 72 , 253-265, 1988), and myc (SO Freytag, Mol. Cell. Biol. , 8: 1614-1624, 1988, E . V. Prochonik et al., Mol. Cell. Biol. , Volume 8 368 Pp. 3-3695, 1988, S.M. L. Loke et al., Curr. Top. Mic robiol. Immunol. , 141, 282-288, 1988) It is.   It is sufficient to block the production of the targeted mutant gene in all cases. There is no. As reported by Levine et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1032, 119-136, 1990. ), Contribute to tumor phenotype There are at least 5 types of mutations. Therefore, of multiple mutation gene disorders Optimize the benefits of antisense therapy by targeting each mutation Must. The method of the invention is particularly suitable for delivering a mixture of polynucleotides. Therefore, it is particularly useful for multisense antisense therapy.   Also, antisense therapy is described, for example, in Type III, Type IV and Levine et al., Supra. Probability of producing neoplastic cells with a type V mutation similar to type III described in the literature Can also be used to block the production of mutant proteins that act directly to increase . Also, antisense polynucleotides may be used if the mutations are not significant, eg If a non-mutated allele encoding the correct protein remains, the therapeutic It is effective. However, when the mutation is prominent, as in the case of type I mutations, And whether both alleles are deleted, as in some type III mutations Or when one is deleted and the other is mutant, following antisense therapy It is preferred to perform replacement therapy.   Targets identified as having a mutated or protooncogene in replacement therapy Allow cells to develop a disorder or overgrowth associated with the identified mutated gene. A wild-type gene that produces the wild-type protein needed to prevent You.   In the case of tumor suppressor gene, introduce suppressor gene into cultured cells And cell death occurs or no discernible changes occur, but these cells Is known to be no longer tumorigenic in animals. Therefore, Riboza Immunity and / or antisense therapy with gene replacement therapy Contains mutated genes for which the bozyme or antisense oligonucleotide is specific. The cell populations they have no longer contribute to the development of overgrowth in the treated patient Opportunities increase.   In addition, the present invention also relates to a cancer state, that is, a deletion of a specific gene or Remnants of treating cell proliferative disorders mediated by polymorphism It provides gene therapy. This therapy is a proliferative disorder caused by a mutated gene Cells that are confirmed to be harmful by the method of the present invention contain specific antisense By introducing a nucleotide and / or a substituted wild-type gene, its effect Achieve the fruit. To prevent the replication of polymorphic genes, Whether it is necessary to replace wild type genes as well as antisense therapy , And whether the mutation has a significant effect, That is, both alleles of the wild-type gene are destroyed and the gene is completely destroyed. It depends on whether its absence has a cell-proliferating effect.   The preferred route of administration that induces local immunity to or near the skin is transdermal penetration. , Intradermal injection, or scratching or stimulating the surface of the outermost layer of epidermal cells. Subcutaneous injection can also be used for certain applications. Call The preferred route of administration for inducing local immunity to the respiratory tract is by inhalation or insufflation. However, the route of administration to other mucosal tissues depends on its location.   If naked polynucleotides should be introduced into the skin or mucous membranes, detergents, absorption Use of accelerators, chemical stimulants (eg keratolytic agents) or mechanical stimulants Preferably allows easy delivery of polynucleotides without the need for injection. Yes. Surfactants and absorption enhancers that facilitate uptake of small molecules other than genes , Known in the art, to allow gene uptake without undue testing. Can be adapted for use for ease of use. Guided naked polynucleotides Other substantially non-invasive techniques to enter have been successfully used for transdermal penetration of peptides. Percutaneous permeation (preferably iontophoresis).   Embodiments of the invention that stimulate the production of circulating cytokines and related peptides In such cases, parenteral routes of administration can be used, but the host tissue is most invasive. Do not use a route that does not And are very preferable. However, naked polynucleotides need to be repeatedly administered. As such, intramuscular injection is not preferred. Instead, strip the naked polynucleotide Introducing into regenerating body areas such as the skin and mucous membranes makes these areas Because it has the ability to replace cells that are directly affected by the trauma associated with each dose, preferable. Ensure that the proteins expressed in these embodiments of the invention are secreted. Thus, sequences that regulate secretion known to those of skill in the art are Naked polynucleotides to be administered if the desired sequence is not already present in the full-length gene. Included in octid.   Further, the polynucleotides of the invention deliver peptides at sub-therapeutic concentrations. When used in accordance with the present invention, it is conjugated to liposomes or in vitro. It may be delivered in cells transfected with nucleotides. It should be understood. However, for the reasons discussed above, these embodiments , It is still preferred to use the naked polynucleotide and the mucosal or dermal route of administration. New In particular, the use of liposomes appears to reduce expression levels. This present The elephant is caused by the poor performance of APC that recognizes liposome as an antigenic substance. It is.Brief description of the drawings   FIG. 1 shows chronic inflammation after intramuscular injection of pREVk3 and pRSVIL-2. (Panel A) and a cross section of muscle tissue showing muscle necrosis (Panel B). Panel C is p Sections of similar muscle tissue after subcutaneous injection of REVK3 or pRSVIL-2 Show.   Figure 2A: E of serum anti-NP IgG after intradermal injection of naked pCMVRNP. FIG. 2B shows LISA analysis results, FIG. 2B after intramuscular injection of naked pCMVRNP. The results of ELISA analysis of anti-NP IgG in serum are shown.   FIG. 3 shows the resistance of naked pCMVRNP prior to the intranasal transfer of Balb / c mice. The ELISA analysis result of NPIgG is shown.   FIG. 4 is an ELISA of anti-NP IgG of Balb / c mice in the non-paralyzed group. A analysis result is shown.   Figure 5: ELISA analysis of anti-NP IgG of Balb / c mice in anesthetized group. The results are shown.   FIG. 6 shows pRSVIL-2 and pRSVIL-4 (panel A) and pRSVT. Concentration of anti-KLH in serum of mice injected intramuscularly with GFβ1 (panel B) E The LISA analysis result is shown.   FIG. 7 shows pRSVIL-2 (panel A) and pRSVTGFβ1 (panel B). And anti-toxin in the serum of mice after intramuscular injection of pRSVTGFβ (panel C) The result of ELISA analysis of the concentration of lanceferin is shown.   Figure 8 (in mice injected with pRSVIL2 and pRSVTGFβ). The result of the footpad tumor test after the antigen administration (antigen challenge) is shown. .   Figure 9: MRL / lp injected with pRSVIL-2 and pRSVTGFβ The result of ELISA analysis of the anti-chromatin serum concentration of r / lpr mouse is shown.   FIG. 10 shows the IL-2 expression level of individual AKR / J mice over time. The result of the ELISA analysis of is shown.   FIG. 11 shows the long-lived data of the mouse described in FIG.   FIG. 12 shows that administration at a subtherapeutic concentration is sufficient to cause expression of the IL-2 gene. AKR / J mouse (mouse lymphoma after introduction of naked polynucleotide in high dose) Model) of NK cell cytolytic activity51The result of a Cr release verification test is shown.   13 (a)-(b) show young Balb / c mice and old Balb / c mice. The level of IL-2 expression after different doses of naked pRSVIL-2 Show.   FIG. 14 shows that it was detected in serum after administration of pRSVIL-2 at different entry points. The level of IL-2 expression is shown.   FIG. 15 shows the histology of the skin at the entry point of pCMVRNP in Balb / c. It is the photograph which shows the result of the test, uptake of the plasmid by the mononuclear cell (APC) Is shown. APCs are indicated by arrows, tissue cells (does not contain plasmid) Is indicated by a slashed line.   FIG. 16 shows that naked pCMVRNP was mechanically epidermally administered to Balb / c mice. The result of ELISA analysis of anti-NP IgG after exposure is shown.   Figure 17: Naked pCMVRNP was chemically administered to Balb / c mice epidermally. The result of ELISA analysis of anti-NP IgG after exposure is shown.   FIG. 18 shows the time course after administration of a naked polynucleotide encoding IL-2. 1 shows the stability of IL-2 expression detected in serum over time.   Figure 19 shows Balb / c mice injected intradermally with naked pCMVRNP. A Kaplan-Meier survival curve showing the period of survival after the administration of Ils is shown. You.   Figure 20. Naked plasmid containing CMV or RSV promoter sequences Figure 5 shows a graphical comparison of the expression of the NP gene after separately injecting into the dermis.   FIG. 21 shows detection in mice after injection of various naked plasmids into the dermis. The level of cytotoxic T cells is shown.   FIG. 22 shows (1) the polynucleotide encoding β-galactosidase in muscle. Intraperitoneally or intradermally, and (2) β-galactosidase ELISA analysis of anti-β-galactosidase antibody after intradermal injection and administration The results are shown.   FIG. 23 shows mouse-derived serum shown in FIG. 22 after booster injection of antigen. The result of the ELISA analysis of the medium anti-β-galactosidase antibody is shown.   FIG. 24 shows that (1) a polynucleotide encoding β-galactosidase is dermised. Mice injected intramuscularly or intramuscularly (2) Mice injected intradermally with the enzyme The result of the ELISA analysis of IgG2A type antibody in serum of is shown.   FIG. 25 shows that (1) a polynucleotide encoding β-galactosidase is dermised. Mice injected intramuscularly or intramuscularly (2) Mice injected intradermally with the enzyme 2 shows the results of ELISA analysis of IgG1 type antibody in serum of.   FIG. 26 shows the serum of the mouse described in FIG. 25 after booster injection of the antigen. The result of ELISA analysis of IgG2A type antibody is shown.   FIG. 27 shows the serum of the mouse described in FIG. 24 after booster injection of the antigen. The result of ELISA analysis of IgG1-type antibody is shown.   FIG. 28 shows a polynucleotide encoding (1) β-galactosidase. Mouse introduced by scratching the skin with a sharp pointed tip or ( 2) ELISA of IgG2A type antibody in serum of mouse in which the enzyme was intradermally injected The analysis results are shown.   FIG. 29 shows a polynucleotide encoding (1) β-galactosidase. Mouse introduced by scratching the skin with a sharp pointed tip or ( 2) ELISA content of IgG1 type antibody in the serum of mice injected with the enzyme into the dermis The analysis results are shown.Detailed description of the invention   The embodiments and examples presented throughout this description should be considered representative. It is not intended to limit the invention. I.Directing naked polynucleotides to target tissues with appreciable concentrations of antigen presenting cells Entering A. Manufacture of naked polynucleotides   The polynucleotide used in the present invention may be DNA or RNA, but Complementary DNA (cDNA) sequences are preferred. Polynucleotide used in the present invention The sequence is (a) expressible and (b) nonreplicating (nonreplicat). ing) or known in the art not to replicate in the host genome Must be processed by. Polynucleoties suitable for use in the present invention The manufacture of a specific polynucleotide is described below, followed by the manufacture of a composition of a particular polynucleotide. Specific examples illustrating the method are provided below. However, non-replicating polynucleotides It will be apparent to those skilled in the art that other known manufacturing methods of are also suitable. It is easy.   The polynucleotide used in the present invention is a hybrid form known in the art. It can be obtained using a synthetic method. Also, DNA and RNA are known in the art. It can also be synthesized using the automatic nucleic acid synthesizer of. Mixture of polynucleotides It is particularly advantageous to use the known polymerase chain reaction (PCR) to generate Preferred. Genomic nucleic acids are described in Ausubel et al., Current Proto. cols in Molecular Biology, Chapters 2 and 4 (Wile y Interscience, 1989), etc. Can be produced by a method known in the art. CDNA is the relevant technology Can be prepared by methods known in the art (eg, Maniatis et al., Mol. ecular   Cloning, A Laboratory Manual (Cold S pring Harbor Lab) New York, USA (1982)). . A cDNA expression library containing the polynucleotide of interest is also used in the technique. It can be selected by a method known in the art. For reference, of the above method An example is described by the following consideration.   Preferred polynucleotides for particular applications are described in the Summary of the Invention section above. Has been proposed. For example, the naked polynucleotides of the present invention may contain therapeutic peptides. Can be operatively encoded but acts as an antigen to respond to humoral and / or cellular responses It is preferred to encode an immunogenic peptide which is capable of stimulating. Also naked The polynucleotide of can operably encode an antibody. in this regard , "Antibody" includes all immunoglobulins of all classes, chimeric antibodies Hybrid antibodies having dual or multiple antigen specificity, and hybrid Fragment containing the fragment fragment is included. Also, the meaning of "antibody" Conjugates of such fragments are found in, and, for example, US Pat. No. 4,704. , 692, so-called antigen-binding proteins (single chain anti-proteins). Body types) are also included. Instead, the encoded antibody is described, for example, in US Pat. Anti-idiotypic antibodies (such as those described in 699,880). Antibody).   However, one of ordinary skill in the art will appreciate that the methods of the invention are for treating and / or treating a subject. Or a polynucleotide operatively encoding an immunogenic peptide or mixtures thereof It will be appreciated that it is adapted for use in administering an article. Therefore The present invention is not limited to the use of particular polynucleotides.   As used herein, the term "polynucleotide" refers to a distinct fragment. Deoxyribonucleotides as component of morphology or larger structure Or, it means ribonucleotides. The DNA encoding the therapeutic and / or immunogenic peptide of the present invention has a cDNA of cD Provide synthetic genes that can be expressed from NA fragments or into recombinant transcription units Can be assembled from the oligonucleotides. Polynucleo of the present invention Tide sequences include DNA, RNA and cDNA sequences. Polynucleus The sequence of ochido can be deduced from the genetic code, but considering the degeneracy of the genetic code, There must be. The polynucleotides of the invention include the results of their genetic code and Degenerate sequences are included, which sequences are within the ordinary skill in the art. It can be easily decided.   Polynucleotides encoding desired therapeutic and / or immunogenic peptides The sequence can be expressed in eukaryotes or prokaryotes. As a host , Microorganisms, yeasts, insects and mammalian organisms. Eukaryote or Methods for expressing DNA sequences having viral sequences in prokaryotes are described in the art. Known in the field. Biologically functional that can be expressed and replicated in the host Viral and plasmid DNA vectors are also known in the art. this Such vectors are used to incorporate the DNA of the invention.   The polynucleotide of the present invention may be a therapeutic and / or immunogenic agent of a subject. There are functional derivatives of known polynucleotides that operably encode peptides. " The term "functional derivative" refers to "fragments," "variants," " By "analogs" or "chemical derivatives" is meant. Any of the DNA sequences of the invention Such a "fragment" of a molecule is any nucleotide of that molecule. Contains a subset. A "variant" of such a molecule is a whole molecule or a whole molecule thereof. A naturally occurring molecule that is substantially similar to a fragment of A certain amount An offspring "analog" is one that is substantially similar to the entire molecule or fragment thereof. A non-natural molecule.   As used herein, a molecule is usually not part of that molecule. A "chemical derivative" of another molecule, if that molecule contains additional chemical moieties. It is said to be. Such moieties may help the molecule's solubility, absorption, biological The half-life etc. can be improved. Alternatively, these parts are the poisons of the molecule. To reduce or eliminate unwanted side effects of the molecule, etc. it can. Portions known in the art that can mediate such effects include, for example, Re Mington's Pharmaceutical Sciences, 16 Edition, Mack Publishing Co. Ys, Pennsylvania, USA Ton (1980).   Thus, the term "polynucleotide" as used herein, Substantially similar to and similar activity to the polynucleotides described herein. Having, functional derivatives, fragments, variants, analogs and chemical derivatives Is included.   Also used for producing the therapeutic and / or immunogenic peptides of the invention The resulting DNA sequence can be obtained in a number of ways. For example, the DNA , Can be isolated using hybridization methods known in the art. This These methods include, but are not limited to, 1) genomic or cDNA libraries and Detects shared nucleotide sequences by hybridizing probes 2) The expression library is selected with an antibody to examine the characteristics of the shared structure. And 3) Polymerase chain reaction (PCR) synthesis. Ma The specific DNA sequence encoding the fragment is 1) double-stranded DNA sequence. Is isolated from genomic DNA, 2) the DNA sequence is chemically produced and the polypeptide Provide the required codons for the peptide, and 3) isolated from the donor eukaryotic cell In vitro synthesis of double-stranded DNA sequences by reverse transcribing mRNA Can be obtained by In the latter case, mRNA, commonly called cDNA The double-stranded DNA complement of is finally formed.   The hybridization method is such that each probe is potentially a heterogeneous mixture of denatured double-stranded DNA. If it is the complete complement of the specific DNA sequence in the hybridized sample containing the compound. If the probe is a mixed synthetic oligonucleotide labeled with It is useful for selecting When performing such selection, hybridization is Preferably, it is carried out on single-stranded DNA or denatured double-stranded DNA. Yes The bridging method involves extremely low abundance of mRNA associated with the polypeptide of interest. If not present, it is particularly useful for detecting cDNA clones of origin. In other words Then use stringent hybridization conditions aimed at avoiding non-specific binding. This allows, for example, target DNA to hybridize with a single probe in a mixture. Specific cDNA clones can be autoradiographed by formation. Can be visualized.   A cDNA library that is believed to contain the polynucleotide of interest is , Various cDNA-derived mRNAs were injected into oocytes, and cDNA gene products were expressed. Allow sufficient time to reveal and then encode, for example, the polynucleotide of interest. Antibody specific for the peptide Characteristic tissue expression of peptides encoded by lobes and polynucleotides of interest The pattern is used to test for the presence of the expression product of the desired cDNA. Can be tested and selected. Alternatively, the cDNA library is at least Expression of therapeutic and / or immunogenic peptides with one epitope Can be indirectly screened using an antibody specific for the peptide. Wear. Such an antibody can be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Can be used to detect an expression product that is induced and indicates the presence of the cDNA of interest it can.   Screening depending on nucleic acid hybridization method, if appropriate probe available Method isolates any gene sequence from any organism can do. An orient corresponding to a portion of the sequence encoding the protein in question. Gonucleotide probes can be chemically synthesized. To do that, The short oligopeptide stretch of the mino acid sequence must be known. Ta The DNA sequence encoding the protein can be deduced from its genetic code, but The degeneracy of the card must be taken into consideration. Mixed addition reaction when the sequence is degenerate Can be implemented. This includes a heterogeneous mixture of denatured double-stranded DNA . When performing such a selection, hybridization may be single-stranded DNA or denatured double-stranded DNA. Preference is given to working with double-stranded DNA.   The naked polynucleotides of the present invention regulate the expression of these polypeptides. It is conjugated to or is linked to another polynucleotide that operably encodes the protein. May be used in combination with other polynucleotides such as It may contain a lomomotor and a secretory sequence. Those skilled in the art will appreciate The regulatory polynucleotides are selected and tested for the naked polynucleotides of the invention without further testing. Incorporated into a nucleotide (if the regulatory polynucleotide is not already present) )be able to. For example, with a suitable promoter for use in the mouse or human system For its use, see Current Protocols in M, supra. It is described in Chapter 1 of the Molecular Biology.   A particularly preferred form of naked polynucleotide for use in the present invention is a plasmid vector. It is in the form of being built into a computer. Plasmid vector, especially replicator Expression of the gene in the target tissue using a plasmid vector containing Is extended. In addition, some plasmid vectors also contain peptides encoding peptides. High levels of expression are achieved when the gene is integrated into this vector, so It is an excellent mediator of the immune response to the prototypical peptide.   Suitable plasmid vectors are known in the art and are No. Current Protocols in Molecular Bi Examples include the vectors described in Chapter 1 of the OLOGY. Two particularly preferred types The rasmid vector contains pRSV (Rous sarcoma virus) and pCMV (cytomega). (Rovirus) promoter vector. CM among these promoters V is preferred for polynucleotides introduced into tissues other than muscle. This good The advantage is that using the CMV promoter, in the context here, high level It is based on the observation that expression of the protein is achieved.   Appropriate protocol and plasmid vector for isolating RSV promoter For usage of the promoter in construction, see Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 79, 6777 (1982). Have been described. Other preferred plasmid vectors are pREP7 and pREV. Yes, these are Invitrogen, San Diego, CA, USA Marketed by the company. When cloning a polynucleotide, A particularly suitable plasmid for construction is Kreig et al., Nucleic Acid. s Res. Vol. 12, pp. 7057-7070 (1984). pSP64T cloning vector. Any cDNA containing a start codon A can be introduced into this plasmid and mRNA is expressed DN Manufactured from A mold using conventional techniques.   Various viral vectors that can be used in the present invention include adenovirus and herpes. RNA viruses such as pesvirus, vaccinia, or preferably retroviruses There is Ilsu. Vectors for this retrovirus include mouse or avian strains. Derivatives of Torovirus vectors are preferred. You can insert a single heterologous gene. Examples of torovirus vectors include, but are not limited to, Moloney mouse leukemia virus. Irs (MoMuLV), Harvey Mouse Sarcoma Virus (HaMu SV), mouse mammary tumor virus (MuMTV) and Rous sarcoma virus (RSV) ). Many additional retroviral vectors incorporate multiple genes. Can be. These vectors all carry genes for selectable markers or It can be integrated so that transduced cells can be identified and generated. Wear.   For example, a ligand for a receptor on a specific target cell is added to the viral vector. By inserting one or more sequences of interest along with other encoding genes, The vector becomes target specific. Retrovirus vectors include, for example, sugars and Target by inserting a polynucleotide encoding a quality or protein Can be specific. Preferred targeting is to use antibodies to retrograde This is accomplished by targeting the Ils vector. Those of ordinary skill in the art , A retrovirus containing the polynucleotide of interest inserted into the retrovirus genome Specific polynucleotides capable of target-specific delivery of viral vectors You should know the sequence, or it should be easy to verify without undue experimentation. U. If necessary, another vector can be used to target the replacement gene to cells. it can. In antisense therapy, antisense oligonucleotides are polymorphic. Since it is only specific to the target gene Tide and the replacement gene can also be delivered in the same vector.   Recombinant retroviruses are defective and are not suitable for the production of infectious vector particles. Needs assistance. This help can be retroreduced, for example, under the control of regulatory sequences within the LTR. Use a helper cell line containing a plasmid that encodes the entire viral structural gene. Provided by. These plasmids have a packaging mechanism Can recognize RNA transcripts for encapsidation It lacks the nucleotide sequence that causes it. Missing packaging signal The helper cell line to be used is not limited, for example, There are Ψ2, PA317 and PA12. The genome of these cell lines is packaged. Since it has not been digested, it produces hollow virions. Retrovirus vector Packaging signal is introduced into helper cells that are intact, but If the gene is replaced by another gene of interest, the vector will be packaged. Can produce vector virions.   To monitor expression, these vectors were modified with a known reporter gene. It may be contained. For example, Norton et al., Mol. Cell. Biol. , 5, p281 (1985), pRSV lac-Z DNA. The vector is capable of producing β-galactosidase by protein expression. Wear. Luciferase and chloramphenicol acetyltransferase ("CAT", before Gorman et al. For the construction of the pRSV-CAT plasmid. (See the references listed above) can also be used. Simple plasmid propagation should be performed in E. coli. (Eg, Molecular Cloning, A Lab, supra) (See the Oratory Manual).   Used as a tolerizing vaccine When used, a mixture of polynucleotides or the Occasionally administered group is operative due to immunosuppressive cytokines (eg TGFβ) Operatively for the gene encoding It may contain another encoding gene. This method B) (including antigens) and self-antigens ing.   For use in antisense therapy, synthetic antisense oligonucleotides are , Generally 15 to 25 bases in length. Human genome is a random organization Then, statistically, the 17-mer has a unique sequence in the cellular mRNA of human DNA. Formed and the 15-mer is a cell m It is suggested to form non-repetitive sequences in the components of RNA. Therefore, the selection Substantial specificity for a selected genetic target is demonstrated using the synthetic oligomers of the invention. You can get it easily.   In the cell, the antisense nucleic acid hybridizes with the corresponding mRNA. Generates a double-stranded molecule. Since the cell does not translate double-stranded mRNA, The sense nucleic acid interferes with the translation of mRNA. Ann consisting of about 15 nucleotides Thisense oligomers are easily synthesized and produce targeted nucleotide mutants. When introduced into cells, they appear to cause less problems than larger molecules. Is preferred. The use of antisense methods to inhibit the in vitro translation of genes. Are known in the art (Marcus-Sakura, Anal. B. iochem. 172, 289, 1988). Less common Antisense molecules that directly bind to DNA can also be used.   Ribozymes are similar to DNA restriction endonucleases in the presence of other single-stranded R It is an RNA molecule capable of specifically cleaving NA. Coat these RNAs Mutant carcinogens in RNA molecules by modifying the Specific nucleotide sequence associated with the production of a gene or tumor suppressor gene Molecules that recognize and cleave can be made (Cech, J. Amer. . Med. Assn. 260, page 3030, 1988). The main method The advantage is that the ribozyme is sequence specific and therefore the target mR with a particular mutated sequence Only NA is inactivated.   There are two basic types of ribozymes. That is, the tetrahymena type (tet rahymena-type) (Hasselhoff, Nature, 334) Vol. 585, 1988) and "hammerhead" type ("hammerhead"). "-Type). Tetrahymena type ribozyme recognizes a sequence of 4 bases long. On the other hand, the "hammerhead" ribozyme has a sequence of 11-18 bases in length. recognize. The longer the recognition sequence, the more that sequence is excluded into the target mRNA species. The possibility of other appearances increases. Thus, inactivating specific mRNA species Hammerhead ribozymes are more effective than tetrahymena ribozymes More preferred, and 18 base recognition sequences are preferred over shorter recognition sequences.   Unmodified oligodeoxyribonucleotides are used in serum and cellular nucleases. Easily disassembled by. Therefore, as is well known in the art. In addition, certain modifications were made to the phosphate skeleton, and Zero resistance was given. For example, phosphorothioate, methylphosphonate and α -Skeletal-modified oligomers, such as anomeric sugar phosphates, are Increased resistance to leases. Moreover, methylphosphonate is a non-iodine. It is lipophilic and increases lipophilicity, improving uptake through cell membranes. Anti When using modified oligonucleotides as sense agents, Short sequences will be needed. The reason is that chemical changes in molecular structure form hybrids. (LA Chrysey et al., BioPharm, Volume 4, 36-42, 1991). Oligos with these modified backbones bind to the target sequence. Block the translational machinery of the cell from binding to a specific RNA or RN Ribonuclease H activity by forming an A / DNA duplex structure It exerts its inhibitory effect by inducing. B.Pharmaceutical formulations of naked polynucleotides   Naked polynucleotide compositions and mixtures of polynucleotides are medicinal products. Acceptable suspension, solution or emulsion. As a suitable medium Saline exists, but relies on antigen-presenting cells to deliver the polynucleotide to the target tissue. In those nonexistent embodiments, liposomal formulations may be used.   More specifically, as a pharmaceutically acceptable carrier, There are sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions and emulsions. Of non-aqueous solvent Examples are plants such as propylene glycol, polyethylene glycol and olive oil. Oils and injectable organic esters such as ethyl oleate. With an aqueous carrier Can be water, alcohol / water solutions, emulsions or suspensions, buffered with saline Media is included. Parenteral vehicles include sodium chloride solution, Ringer's dext Lactose, dextrose and sodium chloride, lactated Ringer's solution (lac Tate Ringers') or non-volatile oils. As an intravenous medium , Fluid and nutritional supplements, electrolyte supplements (eg based on Ringer's dextrose) There is). Preservatives and other additives such as antibacterial agents, antioxidants, Chelating agents and inert gases etc. may also be present. In addition, naked polynuclear Ochid's composition was prepared according to the present invention for later reconstitution and use according to the present invention. It may be lyophilized by a known method in the field.   In the case of an embodiment of the invention that does not rely on APC recognition as an antigen of naked polynucleotides. In addition to the previously discussed targeted vector delivery system, colloidal dispersion for targeted delivery The system could also be used. But was the naked nucleotide administered Using the method of the present invention to Although there is an advantage of administering to tissues having antigen presenting cells, the polynucleotide The use of colloidal dispersions for delivery may not be the preferred method. As will be appreciated by those skilled in the art. Therefore , The following discussion of such a system has particular application in the preferred method of the invention. Mainly for reference to determine that it cannot be used for disease To provide.   Colloidal dispersion systems include macromolecular complexes, nanocapsules, and microspheres. Cores, beads, oil-in-water emulsions, micelles, mixed micelles, And lipid-based systems including liposomes There is. The preferred colloid system of the present invention is a liposome.   Liposomes are artificial membrane vesicles that are useful as delivery vehicles in vitro and in vivo. is there. Large single membrane vesicles (LUV) with a size in the range of 0.2 to 4.0 μm It was found that a significant percentage of aqueous buffer containing macromolecules of the type can be encapsulated. I'm sorry. RNA, DNA and intact virions can be placed in aqueous contents Can be encapsulated and delivered to cells in a biologically active form (Fraley et al. , Trends Biochem. Sci. , 6, p. 77, 1981). Re Posomes are polynuclear in mammalian, as well as in plant, yeast and bacterial cells. It has been used to deliver Otide. Liposomes are efficient gene delivery vehicles To be a body, you must have the following characteristics: That is, (1) Antisense polynucleotides can be co-produced with high efficiency without reducing their biological activity. Encapsulating the targeting gene, (2) target cells have priority over non-target cells And (3) binding the aqueous contents of the vesicles to the cytoplasm of the target cells. Highly efficient delivery, and (4) accurate and effective expression of genetic information , Mannino et al., Biotechniques, Volume 6, 682, 1988).   The composition of liposomes is usually determined by the combination of phospholipids, especially phospholipids having a high phase transition temperature. Combined, usually in combination with steroids, especially cholesterol . Other phospholipids or other lipids can also be used. Liposomes Physical properties are dependent on pH, ionic strength and the presence of divalent cations.   Examples of lipids useful for making liposomes include phosphatidyl compounds Classes such as phosphatidylglycerol, phosphatidylcholine, phosphatidyl Lucerin, phosphatidylethanolamine, sphingolipids, cerebroside And gangliosides. Particularly useful is the diacylphosphatidyl group. Lyseroles, the lipid portion of which contains 14 to 18 carbon atoms It contains in particular 16 to 18 carbon atoms and is saturated. Phospholipids and examples For eggs, phosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine and And distearoylphosphatidylcholine.   Targeting of liposomes is based on anatomical and mechanistic factors. Can be similar. Anatomical classifications include, for example, organ-specific, cell-specific and It is based on the level of organelle-specific selectivity. Mechanistic targeting , Can be differentiated based on whether they are passive or active. passive Targeting is cells of the reticuloendothelial system (RES) in organs with sinusoidal capillaries It utilizes the natural tendency of liposomes to be distributed within. On the other hand, active target In liposomes, liposomes are used as monoclonal antibodies, sugars, glycolipids or proteins. Localized to a specific ligand, such as Composition of liposomes to achieve targeting to organs and cell types other than By changing the size or size, the liposome is modified.   The surface of the targeted delivery system can be modified in various ways. Liposome target In the case of delivery systems, the lipid group is incorporated into the lipid bilayer of the liposome and the targeting Singing ligands remain stable bound to the liposome bilayer. Lipid chain Various linking groups can be used to attach the to the targeting ligand.   For those embodiments of the invention that rely on the expression of APCs, liposomal formulations Should be used because it considerably limits the in vivo uptake of naked polynucleotides. is not. In such an embodiment, the isotonic buffer solution may instead be the naked polynucleotide. It is the preferred medium for maximizing octide uptake. In addition, absorption promoters, Surface-active agents, chemical stimulants or mechanical stimulants can also be applied to the naked polynucleotide composition. Preferred to facilitate penetration through the point of entry. Organic drugs or peptides Successful promotion using mucosal delivery of base-based drugs For general principles regarding agents and surfactants, see Chien, Novell Dru. g Delivery Systems, Chapter 4 (Marcel Dekker , 1992). Relates to known means and principles of intranasal delivery of medicines Specific information can be found in Chapter 5 of Chien, supra. Suitable nasal cavity Examples of internal absorption enhancers are listed in Tables 2 and 3 of Chapter 5, but more mild agents Is preferred. In addition, the known means and principles of transdermal drug delivery are also described in Chien, supra. It is discussed in Chapter 7 of the literature. Also, in the method of the present invention for mucosal / intranasal delivery. Suitable agents for use include Chang et al., Nasal Drug Delivery. , "Treatise on Controlled Drug Deliver 9 "and Table 3-4B (Marcel Dekker, 1992). Have been described. Known to promote absorption of medication through the skin Suitable Drugs by SloanUse of Solubility Para meters from Regular Solution Theory to Describing Partitioning-Driven Proc esses , Chapter 5, "Prodrugs: Topical and Ocul." ar Drug Delivery "(Marcel Dekker, 1992) Year) and other parts of the text.   These methods (and other methods conveniently used to facilitate drug delivery) Are used in the methods of the invention without undue experimentation by one of ordinary skill in the art. It could be adapted to produce a naked polynucleotide. Special According to the findings of the inventor of the present invention, the method discussed in the above paragraph Not previously used to deliver cleotide, but suitable for use for this purpose It is thought that it is. For that reason, the above cited references are essential for the method of the present invention. No, but is hereby incorporated by reference. A concrete explanation of this suitability Specific examples will be described below. C.Means and Routes for Administration of Naked Polynucleotides   In the case of the dermal administration route, the means of introduction is epidermal administration, subcutaneous injection or intradermal injection. Method. Of these means, epidermal administration is a high concentration of AP in dermal tissue. Preferred if C is considered to be present.   However, the most preferred introduction route for the dermal route of administration is the least invasive. It is a means. Among these means, transdermal permeation method and epidermal administration method are preferable. You.   In the case of the transdermal permeation method, the iontophoresis method is a suitable method. The iontophoretic penetration is This can be done using commercially available "patches", but this patch , Delivered continuously over intact skin for several days or longer. Use this method Then, the permeation of a relatively concentrated pharmaceutical composition can be controlled, and the combination drug Injection can be performed and the absorption enhancer can be used simultaneously.   A typical patch product used in this method is Los Angeles, CA, USA. Trademark products of General Medical Company, Inc. It is LECTRO PATCH. This product has a storage electrode (r Keep the ervoir electrode at neutral pH and Doses and is adapted to be administered continuously and / or cyclically be able to. The preparation and use of the patch should be as specified in the LECTRO PATCH product. It must be carried out according to the manufacturer's instructions for printing. In addition, Are incorporated herein by reference.   The epidermal administration method is basically sufficient to induce an immune response to the stimulator. It stimulates the outermost layer of the skin mechanically or chemically. Specifically, the stimulus is , Must be sufficient to attract the APC to the stimulation site. Considered earlier As can be seen, the APC then took up the administered naked polynucleotide and Considered to occur available.   Typical mechanical stimulation methods use many tines with very small diameters and short lengths. And use the tines to irritate the skin and draw the APC to the site of stimulation, The naked polynucleotide transferred from the end of the fork is incorporated. For example, France MONO-VACC manufactured by Pasteur Merieux in Lyon The old tuberculin test included a device suitable for introducing naked polynucleotides. It is rare.   The equipment (Conna, Swiftwater, PA, USA) ug Laboratories, Inc. Sold by the company) It has a syringe plunger at the end and a tine di at the other end. It consists of a plastic container with sk). The tine desk , Possesses many small diameter tines that scratch the outermost layer of epidermal cells. MON Each of the O-VACC kit tines is coated with old tuberculin, In the case of the present invention, each needle is a pharmaceutical composition of the naked polynucleotide or a mixture thereof. It is coated with things. This device is included in the product of this device. Is used according to the instructions described in. These instructions for use and administration Is incorporated herein by reference to describe the normal use of this device. A similar device that can be used in this embodiment is currently used to perform allergy testing. This is the device being used.   Another suitable method of administering a naked polynucleotide to the epidermis is the outermost epidermis. APCs are stimulated by using chemical agents that stimulate the cells of It is a method to attract to the area. One example is a keratolytic agent, such as Noxem a Commercial topical desorption sold under the registered trademark NAIR by a Corporation. There is salicylic acid used in hair cream. This method is applied to the mucosal epithelium Can also be used to administer. This chemical stimulant is a mechanical stimulant May be applied together (for example, a MONO-VACC type tine is a chemical stimulant It will be like this if it is also started). Naked polynucleotides also contain chemical stimulants. Suspended in a carrier that it has, or may be co-administered with the stimulant Yes.   For mucosal administration, the method of introduction will depend on the location of the point of entry. In particular, respiratory sensation Intranasal administration is the most preferred method for immunization and treatment of dyschromia. these As a method of absorption, aerosol suspensions of naked polynucleotides or mixtures thereof can be absorbed. Inject or infuse naked polynucleotides or mixtures thereof. Suppository and topical The agent is also suitable for introduction into certain mucous membranes, such as the genital and ocular cell sites You. Of particular interest for vaginal delivery of naked polynucleotides is the vaginal sandwich type. A ring and a pessary. For examples of these devices and how to use them, see Chi. En., cited above, Chapter 9.   Each naked polynucleotide or mixture thereof provided using the method of the invention is dispensed. The dose will vary depending on the response desired by the host and the polynucleotide used. . Generally, up to 100-200 μg of DNA can be administered in a single dose, but A small amount of about 0.3 μg of DNA is administered through the skin or mucous membranes to maintain long-term immunity. It is believed that it can trigger an epidemiological response.   However, in order to achieve the object of the present invention, a naked polynucleotide is Sufficient to express the biologically active peptide encoded by cleotide It suffices to be provided in doses. For special conditions (e.g. sub-therapeutic doses) Dosages suitable for itocaine) are described in the discussion and examples below. .   These doses may be at therapeutic, sub-therapeutic or immunogenic levels. It may be modified to achieve expression. Confirm the presence and quantity of expressed peptide Methods of doing so are well known to those of skill in the art and will not be described in detail. . Some of these methods Those are described in the examples below, and these methods generally include immunoassays (eg, For example, enzyme-linked immunosorbent assay method), PCR method, and publicly known in the technical field. Immunohistological analysis method (immunohistol) performed according to known methods. There is an optical analysis). Administration of administered polynucleotides Amounts are known to those of skill in the clinical arts as well as these assays and quantification methods. Achieve desired expression levels based on information provided by in vivo clinical manifestations It can be adjusted to II.Cytokines important in the development of age-related epidemics         And other proteins expressed at subtherapeutic levels         Introduction of naked polynucleotides for   The above methods for producing and introducing naked polynucleotides are described in this embodiment of the invention. Suitable for use in In this embodiment, the method described herein is a therapeutic amount. Adopted to produce the following levels of circulating cytokines and related proteins . As can be seen above, it is necessary to produce sub-therapeutic levels of expressed protein. The amount of naked polynucleotide required is easily determined and needed by the skilled clinician. It can be adjusted accordingly.   This aspect of the invention provides for the operably encoding poly for the desired protein. Nucleotides or recombinant mixtures thereof are preferably depleted of biological defects associated with aging. It is carried out by administering to the mammal before it develops. For example, the immune system is weak Patients who are at high risk of developing a plague associated with Protein at a continuous level prior to the onset of disease as determined by observation of surrogate endpoints To effect expression, subtherapeutic levels of immunostimulatory interleukins (eg I L-2) is administered. For patients at high risk of disease, this treatment should It can be continued through the body. To get patients to accept this long course of treatment , Individual polynucleotides Low dose (and resulting level of protein expression) (ie sub-therapeutic dose) Must. But polynucleotides are much more It breaks up slowly (ie, a few months difference), so it is less frequent. It is not necessary to administer the drug to the patient, thus minimizing toxicity to the patient and risk of trauma. You.   More specifically, aging-related disease states or HIV-1 infection. Other biological events due to weakening of the immune system, such as moderate loss of CD4 T cells Administration of the desired polynucleotide is initiated prior to or simultaneously with development. Illness A diseased state or loss of immune function occurs. Disease state or loss of immune function occurs It is preferable to start a long-term continuous treatment before. Treatment is the gene of interest , Especially for cytokines (eg interleukins and lymphotoxins) Has been achieved by sub-therapeutic expression of a gene with a code for You.   Most preferably, at least one of the genes of interest comprises IL-1, IL-2, Long hormone (GH), somatomedins (eg, insulin-like growth factor [IGF -1]) and / or a gene having a code for TGFβ . These proteins have a magnitude of immune response (eg, IL-2, IL-1, G H and IGF-1), systemic responses to stress or loss (eg IL -1), tissue cellularity (GH and IGF-1) and extracellular matrix protein Controls or affects the deposition of protein and connective tissue (TGFβ) . And the latter, as the activity of IL-1 and IL-2 diminishes, becomes even more viable. Exert a physical effect.   This particular method of the invention is described in part in Section I above. Is a subset of the methods described below. However, one of ordinary skill in the art will appreciate this practice of the invention. Embodiments are coupled to non- "naked" polynucleotides or colloidal dispersions. It will be appreciated that the present invention can be carried out using the polynucleotide. But above Section I Although the method disclosed in [1] is excellent, its practice (ie (Using a "naked" polynucleotide introduced into a tissue containing APC) Much better. III.Administration of naked polynucleotide reaction mixture (cocktail)   Other aspects of the invention are under the control of a single promoter, eg up to 200 Through expression of the gene construct containing the polynucleotide sequence, Administering a tide reaction mixture (ie, a mixture of polynucleotides). This embodiment is for treating infections by different species of substances that cause similar symptoms. Especially useful for. For example, a rhino that causes respiratory illness with similar clinical symptoms. There are over 100 known species of Wills. The same infectious species Method of the present invention, rather than performing a constant (a laborious and often inaccurate process) The cocktail vaccine can be administered according to It can stimulate an immune response against noviruses. Also, this way And envelope genes from different patients (this gene can be amplified if needed). Vaccines against various strains of HIV using pooled isolates of Can be built.   Administration of a mixture of polynucleotides will produce peptides with more than one biological activity. Also useful for delivery. For example, operably coding for an immunogenic peptide Linking a naked polynucleotide with a naked polynucleotide operatively encoding an antibody Or co-administered so that both peptide and antibody are expressed Can be.   Illustratively, genes that jointly express IL-2 and anti-gp71 are administered. Murine leukemia in mice (based on the results obtained with the IL-2 protein) The result was that the antibody was localized in the tumor tissue generated in response to the virus (MuLV). (For the results obtained by co-administration of IL-2 / anti-gp71 mAb) , Schulz Others, Cancer Res. , 50, 5421-5425, 1990. See).   Examples showing aspects of each embodiment of the present invention are shown below. These examples are illustrative Should not be regarded as limiting the invention.                               An example   Localized in mice after intramuscular injection of naked polynucleotide   Delayed hypersensitivity occurs   When a naked plasmid cDNA is injected intramuscularly, the polynucleotide Peptide is expressed (consistent with previously reported results) but in muscle tissue Induces an immune response against the gene (contrast to the previously reported results) . When two plasmids are injected simultaneously, this inflammatory response becomes chronic and muscle necrosis Appears. Both responses depend on the gene entry point, that is, the gene at the muscle tissue. Is consistent with the diagnosis of localized delayed-type hypersensitivity response to. Contrary to the previous expectation This inflammatory response, rather than uptake by muscle cells, is secondary to its intramuscular injection. The cause (if not the only cause) of the naked polynucleotide being expressed But it seems.   To explain the immune response caused by intramuscular injection of naked cDNA, pREV k3 and pRSVIL2 were adjusted as follows.Manufacture of plasmids   Rearranged Kappalite from a human patient with chronic lymphocytic leukemia A gene (rearranged kappa light gene) was isolated. This gene is Humkv Containing 325, this Humkv 325 contains IgM autoantibodies and chronic lymphocytic white blood cells. Co-expressed 17.109 cross-reactive idiotypes commonly expressed by diseased cells Is loaded. This gene is known in the art and is described, for example, in Marti. n et al., J. Exp. Med. 175, p. 983 (1992). I have. This document is incorporated herein by reference.   1040 bp HindIII-XhoI containing the VJ region of this gene The fragment was excised and the mammalian expression vector pREP7 (California, USA) (Invitrogen, San Diego) contains a Vector inserted into the downstream of Usus sarcoma virus (RSV) long terminal repeat (LTR) Was prepared and named pREVk3. Under the rearranged JK1 segment There are natural stop codons in the stream that terminate translation.   To produce an IL-2 expression vector named pRSVIL-2, a vector -PRSVL (Wolff et al., Science, 247, 1465, p. 199) Luciferase cDNA in Year 0), Cullen, Cell, 46, 93 PBC12 / HIV / IL according to the method taught on page 7 (1986). -2 (American Type Culture Collection, No. 67618) HindIII-BamHI fragment of 680 bp Replaced. The Wolff et al. And Cullen references refer to these expression vectors. Incorporated herein to indicate knowledge in the art regarding the construction of You.Intramuscular injection of plasmid cDNA into mice   Eight week old BALB / c mice were Anesthetized with Toxiflurane. 100 plasmid cDNA (100 μg / injection) Depleted in μl saline, then quadriceps using a 28 gauge needle for 1 week Four separate injections were made. A group of 6 mice was injected with 100 μg of pREVk3. Was. Another group of 6 mice contained 100 μg each of pREVk3 and pRSVIL. -2 and the third group of mice were injected with 100 μg saline only. This Blood samples were collected from the medial frontal basilar artery just prior to making these injections.ELISA method for confirming in vivo gene expression by plasmids   Humk ELISA for antibody against v325 product (enzyme-linked immunosorbent assay) It was measured at. IgM rheumatoid factor Glo Is encoded by the Humkv325 gene and has the 17.109 idiotype It has a positive kappa light chain. The purified protein is . PH 8.2 buffered borate salt containing 1M borate, 0.2M Nacl Dissolved in water or BBS at a concentration of 10 μg / ml, then 100 μl One was added to the wells of a plastic microtitration plate. Ink overnight at 4 ° C After incubation, the plates were placed in B containing 0.5% Tween-20. Wash twice with BS (BBS / Tween), then supplement with 1% bovine serum albumin Quenched with BBS (BBS / BSA) at room temperature for 4 hours. BBS / T After washing twice with ween, serially dilute the samples with BBS / BSA in duplicate. Distributed to wells. After incubating for 3 hours at room temperature, the plate is BBS / T Biotin washed 4 times with ween, then diluted 1: 2000 in BBS / BSA Nylated gout anti-mouse IgG (Kir, Gaithersburg, MD, USA) Kegaard & Perry). One hour later, The plates were washed 4 times with BBS / Tween, then 25 μl TMB pellet. With a substrate for oxidase (Kirkegaard & Perry) Incubated. After 30 minutes, the absorbance of 450 nm wavelength light was measured using a microplate. Leader (Molecular De, Mellon Park, CA, USA) Vices). A test result was obtained to estimate the antibody content in the immune serum. Fruits were compared to a standard curve generated with monoclonal antibody 17.109 (eg Carson et al., (1983) Mol. Immunol. , Volume 20, 108 (See description of this mAb on pages 1-1087).   The results of these assays show that the production of the antibody of interest is increased, which results in It supports the expression of genes by rasmid.Histological evaluation   Mice injected intramuscularly were killed on day 49. Gene injected Histologically, fixing fixed muscle with 10% formalin Processed for.   The part of the muscle that was simultaneously injected with pREVk3 and pRSVIL2 is chronic Inflammation and myonecrosis were demonstrated, which was consistent with the response of localized delayed type hypersensitivity (Fig. 1A and And 1B). In contrast, pREVk3 or pRSVIL2 injected alone The muscle was localized with lymphoid infiltrates localized at the site of subcutaneous injection (Fig. 1C).                                 Example II   Gene expression after intradermal injection of naked polynucleotide   Naked mice were used to explore alternatives to intramuscular injections of naked polynucleotides. An intradermal injection of DNA plasmid was made. Measured because expression of the gene was observed Was done.   The gene for influenza ribonucleoprotein (RNP) was transformed into pC Subcloned into MV plasmid. Derived from numerous strains of influenza The RNP gene is known in the art and is highly conserved in sequences within various strains. (For example, Gorman et al., J. Virol, 65, 3704, See 1991).   Four 8-week-old Balb / c mice were depleted in 100 μl HBSS. Three injections of 15 μg of pCMV-PNP were made. Injected intradermally at the base of the tail every 2 weeks Fired. Cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are presented by class I MHC molecules It plays an important role in eliminating the virus-infected cells. Intramuscular (im) immunization with a cDNA expression vector was performed with the antigen of Class I M It was considered as an effective way to introduce into the HC molecule and stimulate the CTL response. this Studies Contain the Influenza Nucleoprotein (NP) Antigen Gene Plus Intradermal (id) injection of Mido resulted in NP-specific CTL and high titer Of the anti-NP antibody of E. coli. These antibodies can be injected without local inflammation Reached maximum after 6 weeks and remained unchanged for at least 28 weeks.   Plasmid DNA was stained with CsCl (ba) in the presence of ethidium bromide. purified by freezing, frozen and 10 mM Tris-HCl, 0.1 mM ED Stored in TA, pH 8.0. injection The plasmid was ethanol precipitated and 0.1 mM EDTA was added prior to It was dissolved in the normal saline solution containing it.   Viera et al., Int. Immunl. Volume 2, p. 487, (1990) Substantially the same as described, the presence of anti-NP IgG in serum was determined by ELISA. The abundance was measured. The test results of this assay are shown in Figure 2A. All of these animals are high strength A high titer of anti-NP antibody developed and was maintained for more than 20 weeks. As shown in FIG. 2B, the dermis The intra-injection was given by intramuscular injection of an equivalent amount of plasmid (performed as described in Example I). In comparison, the antibody titer appeared to be about 4-fold higher.   The coordinate axes in Figure 2 are ELSA titers against time (average, 1 ounce). Is shown. The serum dilution for all graph points is 2560.                                 Example III   Gene expression after intranasal induction of naked polynucleotides The same plasmid (pCMV-RN) in the same HBBS suspension as described in Example II. P) with a naked polynucleotid encoding an influenza ribonucleoprotein Were introduced intranasally into Balb / c mice in 3 groups of 6 animals each. Species by serum The concentration of anti-NP IgG in the peripheral blood before and after the introduction of various dilutions of the plasmid, It was measured by ELISA as described in Example II. Blood introduced into the nasal cavity 6 weeks later, each mouse was harvested.   Figure 3 shows the results of ELISA assay performed before and after introducing the plasmid into the nasal cavity. Is shown by a graph. Plot ELISA titer against serum dilution in the graph is there. In FIG. 3, the numerical values are the values (# 1-3) for individual mice in each group. And all mice in each group The average value (# G1-G3) is shown.   Without anesthesia, a second group of mice injected with 3 × 7.5 μg of plasmid were treated with The antibody showed a higher titer compared to the Cukground (FIG. 3). These data are shown in Figure 4. Shown in   A third group of mice was anesthetized and injected with the same weight of plasmid. these Expression of RNPs in mice by anti-NP IgG titers was shown in unanesthetized mice. Substantially similar to the expression achieved in S. Data for anesthetized mice The data is shown in FIG.   Expression can be enhanced by the additional use of absorption enhancers and Sex promoters can extend the period. The characteristics and usage of the aging promoter are , Known in the art, as suggested in Chapter 5 of the reference article by Chien. It is.                                 Example IV   After administration of the naked genes for IL-2, TGF-β1 and IL-4   Expression of cytokines at sub-therapeutic levels and their   Systemic response to tokines Construction of expression vectors for IL-2, TGF-β1 and IL-4   Human (h ) IL-2 (ATCC 67618), TGF-β1 (ATCC 59954) And the cDNA for mouse IL-4 (ATCC 37561), pBSII SK (Invitrog, San Diego, CA, USA 5'-HindIII and 3'-S. The site of ma1 was generated. These sites were used to express the expression vector described in Example I. HindIII-BamH1 luciferase cDNA flag in pRSVL Ment was replaced. The obtained expression vector -Types (pRSVIL2, pRSVTGFβl and pRSVIL4) are rous Sarcoma virus (RSV) long terminal repeat (LTR) promoter and SV40 Contains a readenylation site. Plasmid DNA is available in California, USA Using the QIAGEN kit obtained from Qiagen, Chatsworth Purified from transformed DH5α E. coli.   The behavior of these three vectors is described by Lotz et al. Exp. Med. 1 67, 1253, (1988), as described in Mouse C.2 C12Myoblasts (ATCC [American Type Culture Collection, USA) CRL 1772], Rockford, Do. Transient lipofection (tran sient lipofection). Note that the above-mentioned Lotz et al. Incorporated in the booklet. In each case, 48 hours after lipofection The supernatant obtained after a short period of time was diluted with an appropriate specific neutralizing antibody (Minneapolis, Minnesota, USA). C3H / H in the presence or absence of R & D Systems, Inc.) measured by lymphocyte activation factor (LAF) assay using eF thymocytes Around the time it contained bioactive cytokines.Experimental guidelines   Five-week-old Balb / c mice were treated with a Jackson Laboratory. Purchased from Company y (Bar Harbor, Maine, USA). At the age of 6 weeks (Day 0 ), The animals were divided into 4 groups of 4 mice each. Day 0, Day 7 and On the 14th day, 100 μl of normal group was added to 5 groups on the right thigh in the 2nd to 4th groups. A total of 100 μg of plasmid DNA (pRSVIL2, PRS) dissolved in saline VTGFβ1 or pRSVIL4) intramuscularly (im) with a 28 gauge needle I made an injection. Days 3, 10 and 17 (Cytokai 3 days after the gene injection, 100 μl of IMJECT ALUM (water Aluminum oxide, Pierce of Rockford, IL, USA) 100 μg of keyhole limpet hemocyanin (KLH) (US) (Sigma, St. Louis, Mo.) was injected intramuscularly in the same thigh The animals were immunized.   The second set of experiments was performed with a similar protocol. 5 groups of 8 mice each 100 μg of plasmid DNA (groups 2 to 4 were placed in the right thigh of each mouse). PRSVIL2, pRSVTGFβ1 or pRSVIL4), respectively . The first group was injected with normal saline, while the fifth group was injected with 100 μg of pRSVIL. 2 and 100 μg of pRSVTGFβ were injected.   Unlike the first experiment, the antigen (human transferrin (Sigma)) Injected intramuscularly in the left shoulder under the same conditions. On day 56 or 63, 50 μl of positive 50 μg of antigen (KLH or transfection, respectively) suspended in normal saline. Phosphorus) was boosted subcutaneously. All animals receive blood from the retro-orbital plexus for 1 week. The antibody level was measured by collecting the cells at the same time.   6-week-old MRL / lpr / lpr mouse (Jackson Laborato ry, 10 mice / group) in the same manner with 100 μg of pRSVIL2, pRSV TGFβ1 or pRSVnull (ie no transgene) every 4 weeks Was injected 3 times. Mice were at 16 weeks, 2 weeks after the last injection Blood was collected and the level of anti-chromatin antibody was measured. In transferrin experiments Are 3 mice of pRSVTGFβ1 group, 1 mouse of control group and pRS One mouse in the VIL2 group died during blood collection or anesthesia It is.To the antigen response caused by the expression of cytokines by the cDNA plasmid Antibody assay to confirm the effect against   Microtitration plate wells (Costar # 3 590, Cambridge, Mass., USA with human transferrin. (100 μl / well, 10 μl in borate buffered saline (BBS) pH 8.0) g / ml, overnight), and then washed with the same buffer, then 1% bovine serum albumin Quenched with BBS solution of (BSA). 2 with 0.5% Tween 20 from BBS After washing twice, dilute 1: 1000 with phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS). Serum samples were added to double the wells. After incubating at 4 ° C overnight, The plates were washed with BBS / Tween and then diluted 1: 8000 with BBS. Biotinylated anti-mouse IgG and anti-mouse IgM (West, PA, USA) ・ Inside with Jackson Laboratories of Globe I had a cube. Peru diluted 1: 2000 in BBS containing 1% BSA Xydase labeled streptavidin (Gaithersburg, Maryland, USA) (Kirkegaard & Perry) for 1 hour After that, the plate was washed 4 times with BBS / Tween and then with TMB peroxidase. Incubate with ze substrate (Kirkegaard & Perry) Was. After 30 minutes, the absorbance of 450 nm wavelength light was measured by TITERTEK MULTI. SCAN METER (Flow La, Rockville, MD, USA) (Boratories). For each test, start at 1: 5000 Included serially diluted standard mouse anti-KLH or anti-transferrin antiserum . In transferrin experiments, absorbance values were converted to relative antibody concentrations. In the description of the test results below, 1 is the standard antiserum in 1: 5000 dilution It is defined as the level of antibody in the   The concentrations of total IgG and total IgG1 were determined by the manufacturer in transferrin experiments. Radial Immunodiffusion Kit (Sandier, CA, USA) It was measured using the The Binding Site, Inc. of Go.   Antibodies to chromatin were added to ELI as described in each of the above examples. It was measured by the SA method. The OD value in the ELISA table is based on the strongly positive reference serum (str About only positive positive reference serum) It was obtained by reference to a standard curve made. The test results obtained are the same as those of the test serum. 106Of the standard curve, given as a measure of the amount of antibody present. It is a grade. The absolute unit is arbitrary, and the equivalent dilution ratio (equal) in FIGS. ent dilution factor).Measurement of circulating concentration of TGF-β1 protein   Circulation by administering the gene To determine if the increase in cytokine concentration is sustained, 6 weeks after the mouse, that is, 4 weeks after the first gene injection, blood was collected. Plasma samples were tested for TGF-β1 activity using the CCL64 mink lung cell proliferation assay. Specified. This assay method is described in Latz et al. Immunol. Volume 144, This is a method in which what is described on page 4189 is slightly modified. In addition, this document It is incorporated herein by reference. It specifically neutralizes TGF-β1, but TGF-β Rabbit antibodies that do not neutralize 2 or TGF-β3 are R & D Systems ( Purchased from Minneapolis, Minnesota, USA).Measuring delayed hypersensitivity response   Cells by injection of cytokine genes To determine if sexual immunity is regulated, delayed type hypersensitivity (DTH) response It was tested by footpad swelling 48 hours after challenge. On the 70th day, 1 Injection of 100 μg of transferrin in 00 μl of normal saline into the footpad of the right hind paw did. Measure the thickness of the foot pad with a caliper before and 48 hours after injection, The difference between these measurements was calculated.Test results Effect of cytokine gene injection on antibody response to foreign antigens   In the first set of experiments, a heterologous antigen, key hold limpet hemocyanin (K LH), which is injected at the same site as the plasmid but affects the antibody response to The effect of intramuscular injection of the cytokine gene was measured. The antibody against KLH is p The RSVIL2 and pRSVIL4 groups reached higher levels than the control group ( FIG. 6, panel A). In contrast to this, anti-KLH antibodies were found in the pRSVTGFβ1 group. Was lower than the control group (Fig. 6, panel B). The effect of the cytokine gene To measure whether the fruits were exerted not only in the regional lymph nodes but also in the whole body, Injection of antigen (transferrin) and cytokine vector at two different sites A second set of experiments was conducted. Antibodies to transferrin are pRSVIL2 group In the pRSVTGFβ1 group (Fig. 7, panel A) and the lowest in the pRSVTGFβ1 group (Fig. 7, panel B). These test results show that injection of the above two plasmids resulted in antibody response. It has been shown to be able to stimulate or inhibit.   In some in vitro systems, TGFβ counteracts the effects of IL-2. TGFβ It is not known whether they have the same activity in vivo. Therefore, IL -2 or TGF-β1 encoding An experiment was performed in which the rasmid was injected simultaneously. pRSVIL2 and pRSVTGFβ The level of anti-transferrin antibody in the group injected with both 1 and pRSVTGFβ Indistinguishable from group (Figure 10) panel C). That is, the expression of TGF-β1 It demonstrates that the effect of IL-2 was completely neutralized. pRSVIL4 group Mean levels of lanceron antibodies were higher than controls, but not significantly different (2.3 ± 0.4 vs. 1.7 ± 0.36 mg / L at 11th week).Total IgG and IgG1 levels   Blood from mice injected with transferrin The level of total IgG in the serum was measured. The highest IgG level is pRSVIL2 group And in the pRSVIL4 group after 10 and 11 weeks. While the worst Levels were found in the pRSVTGFβ1 group (Table I). TGF-β1 plasmid Injection completely inhibited the increase by IL-2. pRSVIL2 / pRS The level of total IgG in the VTGFβ1 group was similar to the pRSVTGFβ1 group. Mice injected with pRSVIL4 had significantly higher IgG1 concentrations than the other groups Was. Delayed type hypersensitivity (DTH)  Modulates cellular immunity by injecting cytokine genes Tested with a footpad swelling assay after challenge to determine if . As shown in FIG. 8, pRSVIL2-injected mice were highly absent compared to the control group. There was an increase in voluntary footpad swelling. Co-injection with pRSVTGFβ1 resulted in IL- The effect of 2 was completely blocked.Circulating TGF-β1 levels   Week 6 or the last injection of pRSVTGFβ1 The mean plasma concentration of TGFβ1 4 weeks after injection was pRSVIL2 injected. Or 2 compared to only 0.32 ng / ml in untreated animals . 6 ng / ml, which represents an 8-fold difference. The activity of TGF-β , Was neutralized by a specific antibody against TGF-β1 (Table II).   4 weeks after injection of the last plasmid, pRSVTGF-β1 or pRS Plasma samples were collected from mice injected with either VIL-2. These trials Dilute 1:10, acidify to pH 4, neutralize, then CCL64 assay Method was tested for TGF-β activity in triplicate. In addition, some of these samples are CL64 test Prior to the method, a rabbit neutralizing antibody specific for TGF-β1 (10 ng / m 2 Incubated with l). Pre-immune rabbit IgG shows TGFβ activity I didn't change the level. The level of TGFβ is the same as that of recombinant TGF-β1 (R & D S system), and is expressed in units of ng / ml and expressed in units of ng / ml. The average value of 3 samples per ± SE is shown.Anti-chromatin antibody   The test results obtained from the transferrin test are plasmid D Three types of NA or humoral immune responses against heterologous antigens by injection of NA It was shown that the biological effects characteristic of the cytokines were induced. This way To determine if it is also effective in modulating the ongoing pathological immune response , IL-2 and TGF-β1 plasmids by intramuscular injection in MRL / lpr / lpr Introduced to Us. In addition, this mouse produces high titer autoantibodies, It is used as a model of Thematosus. In MRL / lpr / lpr mice The titer of autoantibodies against Chromatin was significantly increased in the pRSVIL2 group. The lowest titer was found in the pRSVTGFβ1 group. Mean difference between these two groups Was almost 7 times (FIG. 9).   Gene expression in muscle tissue after injection of plasmid cDNA is Experiments with child structures, previously described by Wolff et al., Nature, supra. Has been proven to. However, the test results provided herein herein are not Direct injection of the current vector intramuscularly results in a bioactive protein with systemic effects It demonstrates for the first time that it can induce the production of quality. Cytokine genes And antigen were injected into experimental animals at different sites at different times. In addition, these services The immunity of the itocaine gene is maintained for weeks after administration. Continued. These test results show that the effects of these cytokine genes are systemically exerted. It indicates that it was done.                                 Example V   Subtherapeutic expression of naked polynucleotides in a mouse lymphoma model Preventive IL-2 gene immunotherapy (the expressed protein also prevents the onset of disease Test whether it can be delayed or not) Experimental design and injection into mice   6 month old AKR / J retired breeder Female mouse, 16 month old retired female ICR outbred mouse, 16 month old BALB / C. old-breeding female mice and 6-week-old BALB / c female mice in Jackson   Purchased from Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA). A By the age of 9 months, 90% of KR female mice develop lymphoma. Before conducting the experiment AKR / J mice show the presence of circulating lymphoblasts by analysis of blood smear slides. Was previously selected. 23 non-lymphoma free animals for DNA injection The mice were divided into two groups. AKR and ICR mice were DN 3 times per week A was subsequently injected once every two weeks during the experiment.   The gene for IL-2 is expressed in the appropriate expression vector as described in the example above. Subcloned into the target. As described in the above experimental examples, pRS The vector called VIL-2 is a long terminal repeat promoter of Rous sarcoma virus. The IL-2, which is sandwiched between the sequence of the RNA and the SV40 polyadenylation sequence. Sequence (ATCC CRL # 67618, Rockville, MD, USA) ) Is included.   The control vector, pRSV, lacks the IL-2 coding sequence. Step Rasmid DNA is available in the Promega MEGAPREP Kit (Wisco USA). (Madison, N.S.) was used for large-scale purification. Purified plasmid DNA ( 25 μg / injection) in 0.9% NaCl solution (100 μl / injection), Each mouse was then directly injected into the right quadriceps muscle using a 28 gauge needle.Protein expression and detection   Serum samples were taken from Advanced Magnetics , Inc. (Obtained from Cambridge, Massachusetts, USA) -2 ELISA kit was used to assay for human IL-2. 2 for each sample Assays were done in duplicate and compared to a standard curve using recombinant human IL-2 serum concentrations. The lowest limit of detection for this assay is 75 pg / ml. Interchange with mouse IL-2 The differential reactivity was observed very minutely.   The results of these tests are reported in Figure 10 (time course of expression in individual mice).Effects on longevity of animals   Animal survival was measured from birth to the time of killing . Animals were killed by: a) when they lost significant weight (ie, 30 in 2 weeks). %), B) thymus hypertrophy causes hunching or respiratory disorders. Or c) when a large number of lymphoblasts were found in the peripheral blood. General In the meantime, peripheral lymphoblasts emerged suddenly and became a physical sign of aging. The symptoms became detectable 7-10 days before death.   Statistical analysis of survival curve data is performed using Kaplan-Meier raw materials known in the art. It carried out using the existing curve estimator. Significance between groups is determined by man- Using the Tertel-Haentzel test method I asked.   The data on the longevity of the animals used in this experiment are summarized in FIG. Contrast Half of the animals in the group died of lymphoma at 7 months and 20 days, and all died at 9 months. . In contrast, 4 of the 6 animals that received pRSVIL-2 naked He was alive after 9 months.I on cytolytic activity against lymphoblasts in young AKR / J mice Of natural killer (NK) cell population for measuring the effect of L-2 gene expression analysis   The natural killer cytolytic activity of injected mice was tested in the art. Standard of knowledge51It was measured using the Cr release assay. YAC-1 (NK sensitive Maloney Mouse leukemia virus-induced mouse lymphoma cell line) and P815 (NK-resistant mouse) (Us mast cell tumor cell line) from ATCC (Rockville, MD, USA) Obtained and used as target cells.51Round bottom 96 well trace amount of Cr labeled target cells Add to the wells of a titration plate, then add various effector to target ratios (E / T ratios) ) Were obtained, the effector cells were plated in triplicate. Non-stick mau S-PBLs (effector cells) on lymphocytes M (Horn, Ontario, Canada) B. Cedarlane Laboratories Ltd. Company) Isolate by centrifugation and then incubate overnight in culture dishes. Then, the mononuclear cells were exhausted. The effector cells and target cells are simultaneously read for 4 hours. Incubated. The supernatant is harvested and counted in a gamma counter to determine the isotope The amount released was measured.   The test results were calculated by the following formula: 100 × [(average cpm experimental amount−average cpm spontaneous release Amount) / (average cpm total release-average cpm spontaneous release)]51 The amount of released Cr is shown in FIG. The values shown are for the specified E / T ratio and display. For all samples at time point Is the average value of + SEM. The spontaneous release was measured after adding 2% SDS. The test results of this assay showed that plasmids of AKR / J mice were injected with A natural killer activity against pablasts has been confirmed. This activity is normal Would be virtually absent in these mice.                                 Example VI   Changes in the administration level when the naked IL-2 gene was introduced into young and old mice Response to   Balb / c mice and the plasmids described in Example V were used in 0.9% saline. PRSVIL2 of 0 (ie, pRSVIL2) in separate mice once a week. V only) injected at doses of 5, 12.5, 25, 50 and 100 μg / injection Was. For each dose, 3 young mice (about 16 weeks old) and 3 aged mice ( (16 months old or older) was injected intramuscularly in the right hind paw.   IL-2 expression was assayed for each group of mice as described in Example V. . These data are shown in (a)-(b) of FIG. The weight and appearance of the animal Monitored for signs of toxicity. Some at test dose levels of 50 μg and 100 μg Appeared toxic.   The best results were obtained with these mice in 1 of 100 ml of 0.9% saline. This is the case of 2.5 to 25 μg. Expression is slightly lower in aged mice as of 1 month However, young mice were slightly larger at 2 weeks.                                 Example VII   Whole body after introducing the naked polynucleotide through various entry points Expression   Groups of young Balb / c mice received naked pRSVIL2 (1 ) Subcutaneous (back), (2) intramuscular (right hind leg), (3) intradermal (base of tail), or (4) It was injected intranasally. The plasmid used was the same as that described in Example V. there were.   Of the systemic expression obtained by administration of naked pRSVIL2 via each of these routes The data regarding the level are shown in FIG.                                 Example VIII   Human IL-2 or expression in ICR mice and mouse natural killer cell collection Correlation with specific stimulation and swelling of the group   Natural killer in mice injected with IL-2 in AKR cancer model Specific swelling and stimulation of cell populations is important for immune surveillance of tumor cells in this group. Is a factor that gives an advantageous effect on. Therefore, in Example V, the level of IL-2 ( (Measured by ELISA) had a correlation with the natural killer activity. Value of both Was significantly increased compared to the value of the control injected group. And the increase is It was experienced during the same time interval (0-3 months of injection). Peripheral lymphocytes at the same time Or changes in granulocyte levels can be analyzed in blood smear slides of treated animals. Therefore, it was not detected. The finding was that there was no inflammation after injection. , And a subset of the immune system other than the NK cell population levels of IL-2 expression after injection. It is important because it shows that it was not affected by Le.   The same information was sought for older animals as follows.   Each group of animals consisted of 10 aged ICR mice (outbred mice with no specific pathology). S series). Same as AKR animal in the above example Animals were injected with pRSV or pRSV-IL-2 using the protocol. The relative white blood cell counts of these animals (0-4 months after injection) were measured. The result The results are shown in Table II below.   NK cell activity was determined as described in Example V,51Measured by Cr release assay did. Target cells are p815 (NK-resistant mouse mastocytoma) or YAC-1 ( NK-sensitive mouse lymphoma). Effector cells are lymphocyte M centrifugal fraction Isolated by separation method. The formula used to measure NK cell activity is as follows: .   These data are shown in Table IV below.                                 Example IX   Cellular uptake of naked polynucleotides by mononuclear cells at the skin entry point Histological examination   3 days after injection of naked pCMVlacz into the tail dermis of Balb / c mice I killed the mouse. A tissue culture of the entry point of the plasmid was obtained and E. coli β-gala was obtained. Staining was performed to determine the activity of ctosidase. Strains obtained from histological examination of these cultures A photograph (40 times) of the ride is shown in FIG.   As shown in FIG. 15, the plasmid was taken up by mononuclear cells. I understand (blue). Since fibroblasts in the tissue sample are not stained, the plasmid Indicates that they were not taken up by these cells. Exactly the plasmid Rounded-up mononuclear cells that have taken up macrophages and / or other antigen presentation It looks like a cell. This means that the uptake of the plasmid is due to predation. Can be said to indicate that.                                 Example X   Epidermal administration of naked polynucleotides that elicit an immune response using mechanical stimulators   FIG. 16 shows anti-NP after epidermal administration of pCMVRNP by mechanical means. The serum concentration of IgG was determined by ELISA as described in Example I. The results of the analysis are shown.   The plasmid was prepared as described above, using the uncoated MONO-VAC as described above. Coated on the tine of C device (or for stable storage for a long time, It is also possible to freeze-dry the naked polynucleotide on the tines of the device. It should be understood). The device The total plasmid concentration on the entire tine of the mouse was about 50 μg in isotonic normal saline carrier. (About 150 μg plasmid / ml). Shaving the hair on the back of Balb / c mice Then the shaved skin was gently scratched with the tine device. Shown in Figure 16 As such, anti-NP IgG was subsequently detected in the serum (eg Mouse sera contained antibody with a titer of 1: 10240).                                 Example XI   Epidermal administration of naked polynucleotides that elicit an immune response using chemical agents   Anti-NP IgG after application of chemical agent and epidermal administration of pCMVRNP Was analyzed by ELISA for serum concentrations of The results are shown in FIG.   The plasmid was suspended in 40 μg of isotonic normal saline solution to give about 150 ml / ml. μg of plasmid was included. Apply this solution to a BAND-AID brand bandage Absorbed on a non-adhesive pad (Johnson & Johnson).   Balb / c mouse hair was shaved as described in Example X, Commercially available keratolytic agents (ie, the previously mentioned products sold under the trade name NAIR) Hair cream) was applied to the shaved skin. After a few minutes, the keratolytic agent It was washed off the skin and then a bandage containing the plasmid was applied to the skin. Figure As shown in 17, treated animals developed serum anti-NP IgG at a titer of 1: 640. Alive                                 Example XII   Stability of IL-2 expression after administration of naked pRSV-IL-2   The stability of IL-2 expression was measured in the mice described for Example VII. pRS After two injections of V-IL-2 at weekly intervals, serum levels of IL-2 were changed to Example V. Measured as described. In aged mice, the serum concentration of IL-2 is It decreased more slowly than young mice. These data are shown in FIG. Introduce naked polynucleotides into tissues where the concentration is relatively high compared to muscle tissue It is shown that relatively stable gene expression can be achieved.                                 Example XIII   Against viral challenge by mice injected intradermally with naked pCMVRNP Immune response   Immunity generated by vaccination with an appropriate naked polynucleotide is fatal Flu virus to test whether it can protect animals from H1N1 strain (A / PR / 8/34, Baylor Collage, USA) of Medicine Inocent N.M. Provided by Dr. Mbawvike 15 μg of pCMVRNP plasmid containing the NP gene derived from A group of 10 Balb / c mice was given an intradermal injection. Note for control group Includes animals injected with plasmid (pnBL3) that is not related to non-irradiated animals Have been.   6 weeks after the first plasmid injection, LD90Dosage of H3N2 influenza Enza strain (A / HK / 68, this strain was also provided by Dr. Mbawaike) Animals were dosed. Mice vaccinated intradermally, unvaccinated controls Attack above compared to mouse Was significantly protected against (p <0.01). Figure 19 (Kaplan-Meier survival See curve).                                 Example XIV   Contains a naked cytomegalovirus or Rous sarcoma virus promoter Levels of gene expression after intradermal injection of active naked plasmids   The possible effects of the promoter region used in the expression vector are described in Example II. It was evaluated by testing two plasmids containing the NP gene. one The other plasmid, pCMVRNP, is an immediate early promoter of cytomegalovirus. -(Immediate early promoter), enhancer and intron region Was. The other plasmid is a promoter derived from the LTR region of Rous sarcoma virus. (PRSVRNP). As shown in Figure 20, these plasmids Thus, the antibody response to the expressed NP protein is CMV after dermal injection. The promoter was consistently higher. In addition, this means that the NP gene Produced by two plasmids, which differ from the response seen after injection The levels of antibody released are almost equivalent (data not shown).                                 Example XV   Selective induction of cytotoxic T lymphocyte responses after intradermal administration of naked polynucleotides Departure   The CDM8 ova plasmid (for details, Sh Astri et al. Immunol. 150, pp. 2724-2736, 19 (Reported in 1993) 100 μg of naked DNA was intradermally injected at 2-week intervals. This CDM8 The ova plasmid is a full-length (1.8 kb) cDNA for ovalbumin. Contains.   Two weeks after the second gene administration, the spleen of the mouse was removed, and then Pre-pulsed with a synthetic ovalbumin peptide, which is deadly to radiation ( 3000 rads) were cultured in vitro with irradiated common gene splenocytes. This Peptide is a class I restricted target for cytotoxic T cells in mice, Histocompatibility haplotype K described in Shastri et al.bhave.   After culturing for 5 days, incubate these cells with two types of targets Then, the cytotoxic T caused by the mouse introduced with the gene encoding ovalbumin Tested for cell generation. These targets are synthetic ovalbumin peptides. Stable mouse EL-4 lymphocytes or ovalbumin cDNA These were transfected EL-4 cells (see Figure 21. Ovalbumin c). DNA is designated as "EG7" in the figure). The percent lysis of these two targets For different effector to target ratios (shown as E: T ratio in Figure 21) I measured it. As shown in FIG. 21, the naked CDM8 ova plasmid was introduced. The animals exposed to the ovalbumin target (ie EL with ovalbumin peptides -4 and EG7), but control EL-4 cells (ie, Not specific for ovalbumin peptide-free EL-4 cells) Produced cytotoxic T cells.   Also C57 / B6 mice intradermally vaccinated with the CDM8 ova plasmid , Were screened for antibodies to ovalbumin. CDM8 ova plasmid The serum collected 6 weeks after the administration of It did not contain detectable levels of antibody (trace amounts coated with ovalbumin) It was measured using an enzyme-linked immunosorbent assay on the titration plate). Taken together, these data show that the method of administration of the naked polynucleotide of the invention MHC class I restricted cytotoxic T cells (in this case It is shown to induce T cells against rubumin).                                 Example XVI   True of naked polynucleotides induced by antigenic stimulation of T cells Prolonged immune memory after intradermal administration   Encodes the Escherichia coli enzyme β-galactosidase under the control of the CMV promoter Plasmid type naked polynucleotide ("pCMV Lac-Z") (0.5-5) ng / 1 mg DNA endotoxin content) of 0.1, 1, 10 and 100 μg Intramuscular ("IM") or intradermal ("ID") groups of head-to-head mice It was administered by the route of administration. For comparison, 100 μg in another group of 4 mice Β-galactosidase protein (“PR”) was administered intradermally. Injection All were carried out using 50 μl normal saline as carrier. IM and ID injection Was performed with a 0.5 ml syringe and a 28.5 gauge needle. Then two weeks Antibodies were measured by enzyme-linked immunosorbent assay at intervals.   In summary, whole antibodies are labeled with β-galactosidase (US californica) as a solid phase antigen. It measured using Calbiochem company of Lunia. Microtitration plate (Costar) Cambridge, Mass., USA, 90 mM borate (PH 8.3) + 89 mM NaCl (ie borate buffered saline: BBS) Dissolved anti 5 μg of stock was coated overnight at room temperature and then 10 mg / ml of bovine serum albumin Blocked overnight with BBS containing   Serum samples started at a dilution of 1:40 for the first 8 weeks and then 1:32 thereafter. It was serially diluted with BBS at a dilution of 0. Add these samples to the plate overnight Stored at room temperature. Wash these plates with BBS + 0.05% polysorbate 20. Then goat anti-mouse IgG antibody labeled with alkaline phosphatase (US Pens Jackson Immunoresearch located in West Grove, RUBE ch Labs. Company) 1: 2000 dilution solution at room temperature for 1 hour, or Under the same conditions, goat anti-mouse IgG antibody labeled with alkaline phosphatase (US Southern Bio-tech, Alabama) at 1: 2000 dilution. Reacted or labeled with alkaline phosphatase rat anti-mouse IgG2A With 1: 500 dilution of antibody (Pharmingen, CA, USA) Reacted. Wash plate again, then 1 mM MgCl 2.2Containing 0 . 1 mg / ml p-nitrophenol in 05M carbonate buffer (pH 9.8) Phosphate (Boehring, Indianapolis, Indiana, USA er-Mannheim) was added. Substrate added to plate One hour after that, the absorbance of light having a wavelength of 405 nm was read.   As shown in Figure 22, pCMV Lac-Z plasmid was administered by ID injection. Equivalent magnitude antibody responses were elicited in the animals treated with On the other hand, for animals that received pCMV Lac-Z plasmid by IM injection, A smaller antibody response was measured.   To assess T cell memory, animals were injected with ID injection at another site. 5 μg of PR was boosted (boost). If these animals have memory T cells It occurred and controlled the production of antibodies against β-galactosidase. For example, these animals were initially challenged with a soluble protein antigen prior to the initial challenge. It is believed that it will result in a much more vigorous immune response than was shown in the response to feeding.   As shown in FIG. 23, pCMV Lac-Z plasmid was injected by ID injection. Animals given are more comparable than animals given IM injections of plasmid or PR It is clear that they developed excellent immune memory. In addition, I received an ID injection The memory developed by the animals lasted for at least about 12 weeks.                                 Example XVII   Selective induction of TH1 response after intradermal administration of naked polynucleotide  On the mouse IgG2A antibody is a serum marker for TH1-type immune response. The lgG1 antibody suggests a TH2-type immune response. TH2 response is allergic -TH2 response including soluble IgE antibody class and relatively strong soluble protein antigen Tend to stimulate. In contrast, TH1 responses are associated with macrophages and trees. Triggered by an antigen that binds to striated cells. TH1 response is associated with allergies and AI Of particular importance in treating DS.   Which response, if any, is the response to the administration of the naked polynucleotide of the invention. To determine if it might be caused by the mousse, mice were given pCMV Vaccinated with Lac-Z or the proteins described in the previous example. Β every 2 weeks -If any IgG2a and IgG1 for galactosidase is present, Enzyme-linked immunosorbent assay (Ig Using antibodies specific for the G1 and IgG2A subclasses), Its presence was measured.   As shown in FIG. 24, only mice that received the plasmid by ID injection had high titers. IgG2A antibody was produced. As shown in FIG. 25, the enzyme itself immunizes mice. When activated (“PR”), it induced the production of relatively high titers of IgG1 antibody. I In the case of mice injected with M, both IgG2A and IgG1 antibodies have low potency. It was produced at no cost and no apparent selectivity. The data shown in these figures are 4 animals each The average value obtained from each group of mice.   To determine the stability of the antibody response over time, animals of the same group were challenged with 0. Additional doses were given by intradermal injection of 5 μg of enzyme. As shown in Figures 26 and 27 , Boosting the enzyme to pre-ID injected animals resulted in an IgG2A antibody response of 10 Triggered a nearly fold increase (ie, antibody titers from 1: 640 to 1: 5120). , But did not stimulate the IgG1 response. These data are for the naked Polynu Selective TH1 response elicited by ID administration of cleotide leads to subsequent antigen It has been shown to be maintained in the host despite exposure.                                 Example XVIII   TH1 response in mice after administration of naked polynucleotide by mechanical stimulator   The experiment described in Example XVII was performed on another group of mice with the following differences. I repeated. That is, the difference is that (1) only the initial challenge was tested. , And (2) pCMV Lac-Z plasmid in a group of 4 mice The tine device described in Example X While the β-galactosidase protein (10 μg) was administered to 4 mice. Another group of mice were administered by intradermal (ID) injection.   As shown in FIG. 28, the mice that received the plasmid received the protein. Produced a relatively low titer of IgG1 antibody compared to the isolated mice. On the contrary As shown in FIG. 29, the mice administered with the plasmid were treated with the protein. Produced significantly higher titers of IgG2A antibody.   These test results are similar to the results obtained in Example XVII, but are of interest There are the following differences. That is, by scratching the skin with a tine device Mice that received the plasmid were mice that received the same plasmid by ID injection. Produced an even higher titer of IgG2A antibody (both of these groups received IM injections). Produced a higher titer of IgG2A antibody than mice that received the plasmid in . These test results show that when the skin is scratched with a tine device, Shows that a large number of APCs are attracted to the "damaged" entry point for APCs are more effective at delivering and expressing genes than muscle and other somatic cells. It is consistent with the theory that it is a fruitful target.   The data shown in these figures is the average of the numbers obtained from each group of 4 mice. It consists of values.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/00 9284−4Ｃ Ａ６１Ｋ 39/00 Ａ Ａ６１Ｎ 1/30 8825−4Ｃ Ａ６１Ｎ 1/30 // Ｃ１２Ｎ 5/10 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 15/09 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ラズ イーヤル アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92122 サンディエゴ カミノフエルタ 7965 (72)発明者 ハウエル メレディス エル. アメリカ合衆国 オレゴン州 97331 コ ーバリス ノースウェストグラントプレイ ス 3009─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI A61K 39/00 9284-4C A61K 39/00 A A61N 1/30 8825-4C A61N 1/30 // C12N 5 / 10 9162-4B C12N 15/00 A 15/09 9281-4B 5/00 B (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, MW, SD), AM, AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, HU, JP, KE, KG, KP, KR, KZ , L , LT, LU, LV, MD, MG, MN, MW, NL, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SI, SK, TJ, TT, UA, US, UZ, VN ( 72) Inventor Raz Iyal California, USA 92122 San Diego Camino Fuerta 7965 (72) Inventor Howell Meredith El. Oregon, United States 97331 Cobalis Northwest Grant Place 3009

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．生物活性ペプチドを宿主に導入する方法であって、 宿主の他の組織に比べて高濃度の抗原提示細胞を含有する宿主の組織に、医薬 として許容される担体中に含ませて裸ポリヌクレオチドを投与することからなり 、 前記裸ポリヌクレオチドは、生物活性ペプチドを作動的にコードしており、そ して 前記抗原提示細胞が裸ポリヌクレオチドを発現し、次いで前記生物活性ペプチ ドが少なくとも一つの標的組織中に分泌される ことを特徴とする方法。 ２．請求の範囲１に記載の方法であって、 前記裸ポリヌクレオチドが投与される組織が皮膚または粘膜である ことを特徴とする方法。 ３．請求の範囲１に記載の方法であって、 前記生物活性ペプチドが免疫原性抗原である ことを特徴とする方法。 ４．請求の範囲２に記載の方法であって、 前記医薬として許容される担体が吸収促進剤を含有している ことを特徴とする方法。 ５．請求の範囲２に記載の方法であって、 投与経路が経皮透過を包含する ことを特徴とする方法。 ６．請求の範囲２に記載の方法であって、 投与経路が、医薬として許容される局所組成物中の裸ポリヌクレ オチドを宿主の表皮または粘膜上皮に塗布すること、および裸ポリヌクレオチド の侵入点において自己に対する免疫応答を誘発できる化学刺激剤を実質的に同時 に投与することを包含する ことを特徴とする方法。 ７．請求の範囲２に記載の方法であって、 裸ポリヌクレオチドが、刺激に対する免疫応答を誘発するのに充分に、宿主の 表皮または粘膜上皮を機械的に刺激する手段を用いて投与され、該手段がさらに 前記裸ポリヌクレオチドを、刺激部位の表皮に転移させる ことを特徴とする方法。 ８．請求の範囲１に記載の方法であって、 投与経路が真皮内注射または皮下注射を包含する ことを特徴とする方法。 ９．請求の範囲５に記載の方法であって、 前記透過がイオン導入法のパッチを用いて達成される ことを特徴とする方法。 １０．請求の範囲１に記載の方法であって、 投与経路が医薬として許容されるエーロゾル組成物の吸入を包含し、前記組成 物が裸ポリヌクレオチドを含有している ことを特徴とする方法。 １１．請求の範囲１に記載の方法であって、 生物活性ペプチドが宿主に対し治療効果を有すると期待される ことを特徴とする方法。 １２．請求の範囲１に記載の方法であって、 ２００まで作動的にコードしている裸ポリヌクレオチドが混合物において投与 される ことを特徴とする方法。 １３．請求の範囲１２に記載の方法であって、 前記混合物中のポリヌクレオチドの少なくともいくつかが、異なる生物活性ペ プチドを別個にかつ作動的にコードしている ことを特徴とする方法。 １４．請求の範囲１に記載の方法であって、 前記裸ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡからなる分子の群 から選択される ことを特徴とする方法。 １５．請求の範囲１４に記載の方法であって、 前記裸ポリヌクレオチドがＤＮＡのアンチセンス鎖である ことを特徴とする方法。 １６．請求の範囲１４に記載の方法であって、 前記裸ポリヌクレオチドがＤＮＡのセンス鎖である ことを特徴とする方法。 １７．請求の範囲１９に記載の方法であって、 前記生物活性ペプチドが、免疫原性抗原、抗体、酵素、サイトカインおよびホ ルモンからなる群から選択される ことを特徴とする方法。 １８．（ａ）抗原提示細胞による認識が可能で、かつ生物活性ペプチドを作動的 にコードしている少なくとも一つの裸ヌクレオチドと、（ｂ）前記裸ポリヌクレ オチドを含有する医薬として許容される担体と、そして（ｃ）皮膚または粘膜に よる組成物の吸収を容易にする吸収促進剤と を含有してなる組成物。 １９．（ａ）抗原提示細胞による認識が可能で、かつ生物活性ペプ チドを作動的にコードしている少なくとも一つの裸ヌクレオチドと、（ｂ）前記 裸ポリヌクレオチドを含有する医薬として許容される担体と、そして（ｃ）哺乳 類の表皮または粘膜上皮を刺激しかつ自己に対する免疫応答を誘発することがで きる化学薬剤と を含有してなる組成物。 ２０．老化に伴う宿主の生物学的欠陥を遅らせるかまたは予防する方法であって 、 医薬として許容される担体中に含ませて裸ポリヌクレオチドを哺乳類に投与す ることを包含し、 前記裸ポリヌクレオチドが、老化に伴う宿主の生物学的欠陥を遅らせるかまた は予防するのに充分な生物活性を有するペプチドを作動的にコードしており、 前記生物活性ペプチドが治療量以下のレベルで宿主内で発現され、 前記裸ポリヌクレオチドの投与が、生物的欠陥の代理終点が発生する前、実質 的に同時に、または後に始まる ことを特徴とする方法。 ２１．請求の範囲２０に記載の方法であって、 前記投与の経路が非経口の経路である ことを特徴とする方法。 ２２．請求の範囲２０に記載の方法であって、 前記生物活性ペプチドが免疫原性抗原、抗体、酵素、サイトカインおよびホル モンからなる群から選択される ことを特徴とする方法。 ２３．請求の範囲２０に記載の方法であって、 前記裸ポリヌクレオチドの宿主への侵入点が、宿主の他の組織に比べて高い濃 度の抗原提示細胞を含有する組織である ことを特徴とする方法。 ２４．請求の範囲２０に記載の方法であって、 ２００まで作動的にコードしている裸ポリヌクレオチドが混合物において投与 される ことを特徴とする方法。 ２５．請求の範囲２４に記載の方法であって、 前記混合物中の裸ポリヌクレオチドの少なくともいくつかが、異なる生物活性 ペプチドを別個にかつ作動的にコードしていることを特徴とする方法。 ２６．宿主に予防接種を行う方法であって、 医薬として許容される担体中に含ませて裸ポリヌクレオチドを、皮膚または粘 膜を通じて宿主に投与することからなり、その裸ポリヌクレオチドが免疫原性抗 原を作動的にコードしており、 前記抗原が皮膚または粘膜中の抗原提示細胞によって発現されて、皮膚または 粘膜内で免疫原性抗原による攻撃に対する宿主の免疫応答を誘発または強化する ことを特徴とする方法。 ２７．請求の範囲２６に記載の方法であって、 ２００まで作動的にコードしている裸ポリヌクレオチドが混合物において投与 される ことを特徴とする方法。 ２８．請求の範囲２７に記載の方法であって、 前記混合物中の裸ポリヌクレオチドの少なくともいくつかが、異なる免疫原性 抗原を別個にかつ作動的にコードしている ことを特徴とする方法。 ２９．アレルゲンに対する宿主の免疫応答を和らげる方法であって、 医薬として許容される担体中に含ませて裸ポリヌクレオチドを、宿主の皮膚ま たは粘膜を通して宿主に投与することを包含し、 前記裸ポリヌクレオチドが、皮膚または粘膜でアレルゲンによる抗原投与に対 して応答して宿主がＩｇＥを産生するのを抑制する生物活性ペプチドを作動的に コードしている ことを特徴とする方法。 ３０．請求の範囲２９に記載の方法であって、 ２００まで作動的にコードしている裸ポリヌクレオチドが混合物において投与 される ことを特徴とする方法。 ３１．請求の範囲３０に記載の方法であって、 前記混合物中の裸ポリヌクレオチドの少なくともいくつかが、異なる免疫原性 抗原を別個にかつ作動的にコードしている ことを特徴とする方法。 ３２．請求の範囲２９に記載の方法であって、 前記生物活性ペプチドが、インターロイキン−２、γインターフェロンまたは 形質転換成長因子βからなる群から選択される ことを特徴とする方法。 ３３．裸ポリヌクレオチドを経皮透過させる装置であって、 医薬として許容される担体中含ませた効果的量の裸ポリヌクレオチドを含有す るイオン導入法のパッチを具備している ことを特徴とする装置。 ３４．請求の範囲３３に記載の装置であって、 前記パッチがさらに吸収促進剤を含有している ことを特徴とする装置。 ３５．裸ポリヌクレオチドを宿主に導入する装置であって、 宿主の表皮の最外層の予想される厚みと同等の長さの多数の針が取り付けられ たハンドル手段を具備し、 各針が裸ポリヌクレオチドを含有する医薬として許容される担体でコートされ 、 各裸ポリヌクレオチドが生物活性ペプチドを作動的にコードしている ことを特徴とする装置。 ３６．請求の範囲３５に記載の装置であって、 前記担体がさらに吸収促進剤を含有する ことを特徴とする装置。 ３７．請求の範囲３５に記載の装置であって、 前記担体がさらに化学刺激剤を含有し、その量が化学刺激剤に対する宿主の免 疫応答を誘発するのに充分な量である ことを特徴とする装置。 ３８．治療薬剤に対する宿主の応答を高める方法であって、 治療薬剤を宿主に投与することと、 治療薬剤に対して生体内アジュバントとして作用するペプチドを作動的にコー ドしている裸ポリヌクレオチドを宿主に実質的に同時に投与することを包含し、 前記裸ポリヌクレオチドが請求の範囲１に記載の方法にしたがって宿主に投与 される ことを特徴とする方法。 ３９．宿主内で治療用ペプチドに対する一過性の全身応答を誘発する方法であっ て、 医薬として許容される担体中に含ませて裸ポリヌクレオチドを宿主にその皮膚 または粘膜を通して投与することを包含し、 前記裸ポリヌクレオチドが治療用ペプチドを作動的にコードしており、 前記裸ポリヌクレオチドが該ペプチドを分泌させる調節配列の制御下にあり、 そして 前記治療用ペプチドが皮膚または粘膜内で抗原提示細胞によって取り込まれて 発現され、次いで宿主の循環系中に分泌される ことを特徴とする方法。 ４０．請求の範囲６に記載の方法であって、 前記化学刺激剤が本質的に角質溶解剤からなる ことを特徴とする方法。 ４１．請求の範囲１９に記載の方法であって、 前記化学刺激剤が本質的に角質溶解剤からなる ことを特徴とする方法。 ４２．請求の範囲３７に記載の方法であって、 前記化学刺激剤が本質的に角質溶解剤からなる ことを特徴とする方法。[Claims] 1. A method of introducing a bioactive peptide into a host, comprising:   The tissue of the host containing a higher concentration of antigen-presenting cells than other tissues of the host Consisting of administering the naked polynucleotide in an acceptable carrier ,   The naked polynucleotide operatively encodes a bioactive peptide, do it   The antigen presenting cells express the naked polynucleotide and then the bioactive peptide. Is secreted into at least one target tissue A method characterized by the following. 2. The method according to claim 1, wherein   The tissue to which the naked polynucleotide is administered is skin or mucous membrane A method characterized by the following. 3. The method according to claim 1, wherein   The bioactive peptide is an immunogenic antigen A method characterized by the following. 4. The method according to claim 2, wherein   The pharmaceutically acceptable carrier contains an absorption enhancer. A method characterized by the following. 5. The method according to claim 2, wherein   Routes of administration include transdermal penetration A method characterized by the following. 6. The method according to claim 2, wherein   The route of administration is such that the naked polynucleotide in a pharmaceutically acceptable topical composition Applying Otide to the epidermis or mucosal epithelium of the host, and naked polynucleotides Chemical stimulants that can elicit an immune response against self at the point of entry Including administering to A method characterized by the following. 7. The method according to claim 2, wherein   The naked polynucleotide is sufficient for the host to elicit an immune response to the stimulus. Administered by means of mechanically stimulating the epidermis or mucosal epithelium, which means Transfer the naked polynucleotide to the epidermis at the stimulation site A method characterized by the following. 8. The method according to claim 1, wherein   Routes of administration include intradermal or subcutaneous injection A method characterized by the following. 9. A method according to claim 5, wherein   The permeation is achieved using an iontophoretic patch A method characterized by the following. 10. The method according to claim 1, wherein   The route of administration includes inhalation of a pharmaceutically acceptable aerosol composition, said composition comprising: The object contains a naked polynucleotide A method characterized by the following. 11. The method according to claim 1, wherein   Bioactive peptides are expected to have therapeutic effects on the host A method characterized by the following. 12. The method according to claim 1, wherein   Naked polynucleotides operatively encoding up to 200 administered in a mixture Be done A method characterized by the following. 13. 13. The method according to claim 12, wherein   At least some of the polynucleotides in the mixture are different biologically active peptides. Code the peptide separately and operatively A method characterized by the following. 14． The method according to claim 1, wherein   The naked polynucleotide is a group of molecules consisting of DNA, RNA or cDNA Selected from A method characterized by the following. 15. The method according to claim 14, wherein   The naked polynucleotide is the antisense strand of DNA A method characterized by the following. 16. The method according to claim 14, wherein   The naked polynucleotide is the sense strand of DNA A method characterized by the following. 17． 20. The method of claim 19, wherein   The bioactive peptides are immunogenic antigens, antibodies, enzymes, cytokines and Selected from the group consisting of Lumon A method characterized by the following. 18. (A) Recognizable by antigen-presenting cells and activating bioactive peptides At least one naked nucleotide encoding: (b) said naked polynucleotide; A pharmaceutically acceptable carrier containing otide, and (c) on the skin or mucous membranes An absorption enhancer that facilitates absorption of the composition according to A composition comprising: 19. (A) A biologically active peptide capable of being recognized by antigen-presenting cells At least one naked nucleotide operably encoding a tide, (b) wherein A pharmaceutically acceptable carrier containing a naked polynucleotide, and (c) a mammal It can stimulate epidermis or mucosal epithelium of primates and induce an immune response against self. Chemical agents A composition comprising: 20. A method of delaying or preventing host biological defects associated with aging, comprising: ,   Administration of naked polynucleotides to mammals in a pharmaceutically acceptable carrier Including that,   Whether the naked polynucleotide delays host biological defects associated with aging. Operatively encodes a peptide with sufficient biological activity to prevent,   The bioactive peptide is expressed in the host at sub-therapeutic levels,   The administration of the naked polynucleotide is substantially effective before the surrogate endpoint of the biological defect occurs. Start at the same time or later A method characterized by the following. 21. 21. The method of claim 20, wherein   The route of administration is parenteral A method characterized by the following. 22. 21. The method of claim 20, wherein   The bioactive peptides are immunogenic antigens, antibodies, enzymes, cytokines and Selected from the group consisting of Mont A method characterized by the following. 23. 21. The method of claim 20, wherein   The point of entry of the naked polynucleotide into the host is higher than in other tissues of the host. Is a tissue containing multiple antigen presenting cells A method characterized by the following. 24. 21. The method of claim 20, wherein   Naked polynucleotides operatively encoding up to 200 administered in a mixture Be done A method characterized by the following. 25. 25. The method of claim 24, wherein   At least some of the naked polynucleotides in the mixture have different biological activities. A method characterized in that the peptides are separately and operatively encoded. 26. A method of vaccination of a host, comprising:   Naked polynucleotides can be incorporated into a pharmaceutically acceptable carrier to remove skin or Consists of administration to the host through a membrane, the naked polynucleotide of which is immunogenic. Coded Hara operatively,   The antigen is expressed by antigen presenting cells in the skin or mucosa, Induces or enhances the host's immune response within the mucosa to attack by immunogenic antigens A method characterized by the following. 27. 27. The method of claim 26, wherein   Naked polynucleotides operatively encoding up to 200 administered in a mixture Be done A method characterized by the following. 28. A method according to claim 27, wherein:   At least some of the naked polynucleotides in the mixture have different immunogenicity. Encodes the antigen separately and operatively A method characterized by the following. 29. A method of softening a host immune response to an allergen, comprising:   The naked polynucleotide is contained in a pharmaceutically acceptable carrier and is applied to the skin of the host. Or to the host through the mucosa,   The naked polynucleotide is directed against allergen challenge on the skin or mucous membranes. In response to a biologically active peptide that suppresses the host from producing IgE Have code A method characterized by the following. 30. A method according to claim 29, wherein   Naked polynucleotides operatively encoding up to 200 administered in a mixture Be done A method characterized by the following. 31. 31. A method according to claim 30, wherein   At least some of the naked polynucleotides in the mixture have different immunogenicity. Encodes the antigen separately and operatively A method characterized by the following. 32. A method according to claim 29, wherein   The bioactive peptide is interleukin-2, gamma interferon or Selected from the group consisting of transforming growth factor β A method characterized by the following. 33. A device for percutaneously penetrating a naked polynucleotide,   Contains an effective amount of naked polynucleotide in a pharmaceutically acceptable carrier Equipped with an iontophoretic patch An apparatus characterized in that: 34. The device of claim 33, wherein:   The patch further contains an absorption enhancer An apparatus characterized in that: 35. A device for introducing a naked polynucleotide into a host, comprising:   A large number of needles with a length equivalent to the expected thickness of the outermost layer of the host's epidermis were attached. Equipped with a handle means,   Each needle is coated with a pharmaceutically acceptable carrier containing the naked polynucleotide. ,   Each naked polynucleotide operably encodes a bioactive peptide An apparatus characterized in that: 36. 36. The device according to claim 35,   The carrier further contains an absorption enhancer An apparatus characterized in that: 37. 36. The device according to claim 35,   The carrier further contains a chemical stimulant, the amount of which is host immune to the chemical stimulant. Enough to provoke an epidemiological response An apparatus characterized in that: 38. A method of enhancing a host's response to a therapeutic agent, the method comprising:   Administering a therapeutic agent to the host,   A peptide that acts as an in vivo adjuvant to a therapeutic drug is operatively coated. Administering the naked polynucleotide to the host at substantially the same time,   Administration of the naked polynucleotide to a host according to the method of claim 1. Be done A method characterized by the following. 39. A method of inducing a transient systemic response to a therapeutic peptide in the host. hand,   When the naked polynucleotide is contained in a pharmaceutically acceptable carrier as a host, the skin Or including administration through the mucosa,   The naked polynucleotide operatively encodes a therapeutic peptide,   Said naked polynucleotide is under the control of regulatory sequences which secrete said peptide, And   The therapeutic peptide is taken up by antigen presenting cells in the skin or mucosa Expressed and then secreted into the host circulatory system A method characterized by the following. 40. The method according to claim 6, wherein   The chemical stimulant consists essentially of keratolytic agents A method characterized by the following. 41. 20. The method of claim 19, wherein   The chemical stimulant consists essentially of keratolytic agents A method characterized by the following. 42. The method of claim 37, wherein   The chemical stimulant consists essentially of keratolytic agents A method characterized by the following.
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