JPH09500723A

JPH09500723A - 正常細胞の転形または変性によって製造された保存加工した非感染性対照標準細胞

Info

Publication number: JPH09500723A
Application number: JP7502021A
Authority: JP
Inventors: ジョンエイメイプルス; パトリシアエイロス; メリッサジェイスティグリッツ
Original assignee: クールターコーポレイション
Priority date: 1993-06-08
Filing date: 1994-06-03
Publication date: 1997-01-21
Also published as: US5622855A; WO1994029691A1; EP0702785A4; US5861311A; US5409826A; CA2164131A1; EP0702785A1; AU7054894A

Abstract

(57)【要約】本発明は、保存加工した非感染性対照標準細胞の製造に関するものである。この対照標準細胞は、選定した正常な白血球細胞、組織培養細胞または免疫抑制動物におけるゼノジェニック移植片を、異常細胞の特性を有するように変性、活性化または他の方法で変化させることにより、あるいは同様に変性または活性化されている樹立細胞系からの細胞を正常な白血球集団に添加することにより、製造される。

Description

【発明の詳細な説明】正常細胞の転形または変性によって製造された保存加工した非感染性対照標準細胞技術分野本発明は、臨床的および免疫学的分析方法に使用する対照標準細胞（control cell）およびその製造方法に関するものである。特に、本発明は、末梢血液細胞または樹立細胞系から得られた保存加工した非感染性対照標準細胞に関するものである。これらの細胞は異常細胞の特性を持つように変性または変化されている。これらの対照標準細胞は、所定の対照標準細胞試料中の全細胞集団または全細胞カウント（count）のなかで、（１）病気にかかっている患者から得られた異常な末梢血液細胞、または（２）骨髄細胞のような正常な末梢血液細胞およびこれから得られる赤血球のような細胞とは異なる正常な血液学的組織に特有なある量すなわちある程度の抗原（抗原結合）発現、または細胞構成成分（例えば、酵素または核酸）の発現を有する少なくとも１種の特定の細胞タイプの集団またはカウントを有する。背景技術対照標準細胞は、臨床的および免疫学的アッセイの精度および正確さにとって極めて重要である。対照標準細胞は試験装置および試験方法の信頼性および精度を保証するのに必要であり、またある期間中および実験室間における再現性を保証するのに必要である。米国においてこのようなアッセイを支配する州および連邦の規則は、装置が表示値の全範囲にわたって適正に作動していることを立証するために、多数レベルの対照標準を使用することを要求していることが多い。免疫学的アッセイでは、新鮮な正常細胞がこのような装置を試験するための標準となる対照標準細胞として使用されていた。新鮮な細胞を取得および維持するのに必要な費用および出費を避けるために、対照標準細胞として使用するために新鮮な細胞を保存加工する種々の方法が評価されている。例えば、米国特許第５，０５９，５１８号（すなわち、'518特許）明細書は、対照標準細胞として使用するために、凍結乾燥した正常細胞を使用することを開示している。また、異常な血液細胞試料も、病気の存在を確認するため、あるいは病気の段階を決めるために使用されいるが、その使用は病気にかかっている患者から得られた新鮮な試料あるいは冷凍した試料に限定されている。従って、このような試料の供給は本質的に制約され、本質的に変動しやすく、その保存寿命は限られている。さらに、また、このような血液試料の多くは感染性の病気と関係があるので、前記血液試料は健康上の理由および社会的理由ならびにある場合には技術的理由から、大規模な生産および分配には不適当であり、前記血液試料は特別な取り扱い方法を必要としている。問題のいくつかの面は、関連出願であるＳＮ第０７／９４４，６７８号明細書に開示されているように、克服することができ、前記関連出願は次の現象：（１）病気の存在による特定タイプの細胞の数の増加または減少（２）正常な血液試料中には見い出されないのが普通である細胞、すなわち大きさ、形状および他の物理的特性の異なる細胞または正常な細胞には見い出されない分子および／または抗原部位を有する細胞の存在に起因する血液細胞集団の現存の異常状態を反映する対照標準細胞を使用することを開示している。第１のタイプの対照標準細胞は、正常な状態では血液中に存在する特定細胞の血液試料を正常レベルより低いレベルまで減少させるこにとより、あるいはこのような細胞を前記正常レベルまで添加し、次いでこの試料を保存加工することにより、製造される。第２のタイプの対照標準細胞は、正常な状態では正常な血液試料中に存在していない細胞を、正常な血液試料に添加し、次いでこの試料を保存加工することによって製造される。本発明は、正常細胞あるいは正常細胞と選定した樹立細胞系との組み合わせから、患者から得た異常細胞の代替物として使用することができる対照標準細胞を製造する方法を開示する。本発明の対照標準細胞を製造するには、病気にかかっていない患者から得られる正常細胞または培養細胞を樹立細胞系から得る。次いで、これらの細胞が特定の病気にかかっているか不調になっている患者の血液中に存在する１種または２種以上の特定の細胞タイプの特性を反映するように、これらの細胞を変性、改変、あるいは変化させる。また、正常細胞または培養細胞は、末梢血液ではなく組織中に見い出されるある細胞タイプの特性を反映するように変性させることができる。例えば、正常細胞は、骨髄細胞またはこれから誘導されたものの抗原特性を反映するように変性させることができる。適当な対照標準細胞を生成するための転形（modulation）または変性は、任意の１種の特定の細胞構成成分の発現に限定されず、多くの構成成分における変化に反映される一連の結果（event）を表わす。従って、細胞の転形または変性は分析される構成成分にとって適当な対照標準細胞を生成するように行われ、分析される構成成分は、モノクローナル抗体結合性、基質の変性によって測定が行われるような酵素アッセイ、あるいはＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブによって立証されるような核酸の変化によって試験されるような抗原構成成分である。従って、抗原によって規定される構成成分は、一連の細胞における結果の終点およびＤＮＡ／ＲＮＡによって指示された生合成（ＤＮＡ／ＲＮＡ directed bios ynthesis）の産生物である。発明の開示本発明は、病気にかかっているか、不調になっているか、あるいはなかんずく細胞上または細胞中に存在する諸成分のタイプ、数または物理化学的特性における発現の変化として現われる症状を有する哺乳動物の血液試料または組織試料中の特定の細胞集団を反映する哺乳動物の対照標準細胞を提供する。抗原によって規定される成分は抗体結合性部位である。他の成分は、酵素と、ＤＮＡまたはＲＮＡのような酵素の活性核酸含有物質と、リボソームのような細胞のマクロ構造物と、核のような立体構造（configuration）の核成分とから成る。さらに、本発明はこのような対照標準細胞の製造方法を提供する。ここに記載する対照標準細胞は、感染しておらず、病変していない正常な末梢血液細胞から、あるいは樹立細胞系から、細胞自身の生合成機構を活性化または変性させるための既知手段を使用することにより製造される。また、対照標準細胞は、細胞上の特定の化学基を化学的または酵素的に変性させることによって、あるいは抗原によって規定される特性の発現を抑制することによって、製造することができる。選定した量の改変された細胞を正常細胞に添加することができる。組織試料の末梢血液中の種々の量の特定細胞が、病気の段階（進行程度）または不調（異常な身体の状態）の段階を反映してていることが多い。対照標準細胞は、細胞自身の生合成機構を活性化または抑制するか、あるいは正常な末梢血液細胞または樹立細胞系からの細胞のなかまたはその上の抗原によって規定される成分を化学的または酵素的に変性させることにより；あるいは細胞の生育を変性させるために種々の生化学試薬が使用されている免疫抑制された実験室動物において細胞を生育させることによって製造される。このように活性化、変性、抑制あるいは生育させた正常細胞または樹立細胞系からの細胞は、貯蔵寿命が長くなるように、例えば、凍結乾燥によって保存加工することができる。本発明に従って製造し、保存加工した対照標準細胞は、再構成後に、対応する新鮮な細胞の抗原性および細胞表面の構造特性および細胞構成成分のすべを保持している。抗原によって規定される成分の発現は、細胞の生合成機構と関連する細胞のＤＮＡおよびＲＮＡの反映であることが知られている。抗原によって規定される構造の検出は、一連の結果の最終生成物の検出である。検出はこのプロセスにおける種々の段階で実施できる。それはＤＮＡまたはＲＮＡの変化、あるいは種々の細胞酵素または物理的構造における改変である。検出は、モノクローナル抗体、ＤＮＡプローブおよびＲＮＡプローブ、酵素、および当業者に知られている他の生体物質および化学物質を使用して、行うことができる。また、本発明は、保存加工した哺乳動物の対照標準細胞の製造方法を提供する。この方法では、選定した白血球細胞、組織培養細胞または免疫抑制動物におけるゼノジェニック（zenogenic）移植片を、細胞上に特性が発現される病気にかかっているか不調になっているヒトにおける類似細胞上に発現される特性を発現するように、人為的に活性化および／または変性させる。この方法では、例えば、白血球細胞を使用して、正常な白血球細胞の試料を、培地、代表的な例においては培養に適した組成物の流体または溶液中で、酵素または化学試薬の存在下に培養して、選定した白血球細胞集団の抗原特性を、選定した細胞集団が選定した細胞上に上述の特性が発現される病気にかかっているかあるいは不調になっている患者における同一細胞を表わす特性をもつように、選択的に活性化または変性させる。次いで、処理した白血球細胞を培地から分離し、洗浄する。洗浄後に、適当な保存加工技術によって細胞に保存加工を施す。好ましい保存加工技術は、１０％トレハロース等張溶液中に懸濁させた後に凍結乾燥を行うことである。図面の簡単な説明図１は、３μｇ／mlのＰＨＡによって３６時間活性化された正常な末梢血液リンパ球の分布を示すヒストグラムである。図２は、ＰＨＡを使用せずに９６時間培養した正常な末梢血液リンパ球の分布を示すヒストグラムである。図３は、３μｇ／mlのＰＨＡによって３６時間活性化し、凍結乾燥し、使用前に再構成した正常な末梢血液リンパ球の分布を示すヒストグラムである。図４は、急性骨髄性白血病患者の末梢血液中のＣＤ３４陽性（positive）白血球の分布およびカウントを示すグラフである。図５は、正常な骨髄試料中のＣＤ３４陽性骨髄細胞の分布およびカウントを示すグラフである。図６は、正常な末梢血液リンパ球と混合されている凍結乾燥したＣＤ３４陽性ＫＧｌａ組織培養細胞の分布およびカウントを示すグラフである。図７は、正常な末梢血液リンパ球と混合されている再構成され、凍結乾燥され、化学的変性されたＣＤ３４陽性ＫＧｌａ組織培養細胞の分布およびカウントを示すグラフである。図８は、正常な末梢血液リンパ球と混合されている再構成され、化学的変性されたＣＤ３４陽性ＫＧｌａ組織培養細胞の分布およびカウントを示す第２のグラフである。図９は、ＰＨＡで活性化された末梢血液リンパ球を使用して得られ、細胞のインターロイキン−２産生と関連するｍＲＮＡについての系内ハイブリッド形成を示すグラフである。図１０は、ＰＨＡで活性化された末梢血液リンパ球を使用して得られ、細胞のＩＣＡＭ−１産生と関連するｍＲＮＡについての系内ハイブリッド形成を示すグラフである。図１１は、異常な対照標準細胞として使用するために細胞を転形または変性させるプロセスを説明するフローチャートである。発明を実施する最良の形態定義「抗原変性対照標準細胞」という用語は、１種または複数種の特定の細胞タイプにおける抗原の発現が正常な血液試料に見い出される細胞におけるもの、または正常血液以外の血液学的組織に見い出される細胞において発現されているものとは異なる対照標準細胞を意味する。「異常な血液試料」という用語は、病気にかかっているか不調になっている患者から採取した血液試料のことである。「異常な血液細胞」または「異常細胞」という用語は、病気にかかっているか不調になっている患者の結果として、正常細胞とは異なる抗原性または構造特性を示す血液細胞のことである。「活性化された」または「人為的に活性化された」、「変性された」または「人為的に変性された」、「抑制された」または「人為的に抑制された」、および「改変させた」または「人為的に改変させた」という用語、ならびに変化を意味する別の言葉に関連して「人為的」という単語は、ここに記載したかあるいは当業者にとって上述の変化をもたらすものとして知られている化学試薬、酵素、放射および他の試薬を使用する結果として、正常細胞と比較して、抗原としてまたは他の点で改変された特性を有する細胞を区別するために使用されている。従って、これらの細胞は、類似の特性が細胞上に存在している病気にかかっているか不調になっている患者から得られたものであるから、同じ特性を有する細胞から区別される。ここに記載した溶液濃度は特記しない限りすべて重量パーセントで表わした値である。説明本発明では、正常細胞または樹立細胞系からの培養した細胞を活性化、抑制、または変性させるために種々の手段を使用する。これらの方法のいくつかは、科学文献および技術文献に記載されている。エッチ．スタイン（H．Stein）およびアール．シュワルティング（R．Schwarting）編：「ロイコサイト・タイピング（ LEUKOCYTE TYPING）IV」（オクッス・フォード大学出版部、１９８９）、第３８４〜５１３頁に示されている刊行物中で、ダブリュ．ナップ（W．Knapp）等は、細胞を刺激して増殖させる処理は、その結果としてこれらの細胞上における細胞抗原の発現が変化すると報告している。ディー．ティー．ワイ．ユー（D.T.Y.Yu ）等は、“Peripheral blood Ia-positive Tcells：Increases in certain dise ases after immunization”という表題の発表、「J．Exp．Med.」１５１：９１〜１００（１９８０）のなかで、Ｔリンパ球の活性化はある病気にかっている患者の細胞に認められるかあるいは患者に免疫感作（immunization）を施した後に認められるように、Ｔ細胞上におけるタイプIIＭＨＣ抗原の発現を増加させることを報告している。ある植物レクチン（ＰＨＡ，ＰＷＡ）と交さ結合している抗体（ＣＤ３，ＣＤ１１，ＣＤ２８）のような既知手段による正常な末梢血液Ｔ細胞の活性化は、細胞抗原を転形（modulate）させる。すなわち、タイプIIＭＨＣ抗原を有する細胞の数を増加させる。その結果、ＭＨＣ抗原を示すように活性化または変性された細胞は、臨床状態において見い出されるタイプの細胞によく似ていることがある。活性化または変性された細胞は保存加工することができ、臨床的および免疫学的分析方法のための対照標準細胞として使用することができる。シー．アイ．シビング（C．I．Civing）等は、上述の文献「LEUKOCYTE TYPING IV」の第８１８頁に、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）にかかっている数人の患者においては、末梢血液試料が正常な血液細胞上には存在していないＣＤ３４抗原を有する細胞を含有していることを報告している。骨髄移植方法では、骨髄試料中の数えて得たＣＤ３４陽性細胞の数値を使用して、前駆物質細胞集団を評価する。エー．ピー．ギー（A.P．Gee）編「BONE MARROW PROCESSING AND PURGING： A PRACTICAL GUIDE」第１４５〜１４８頁（米国フロリダ州ボカラトン所在のＣＲＣ出版部）参照。これらの細胞におけるＣＤ３４の発現は可変であって、普通組織培養細胞、例えば、米国メリーランド州ロックビル所在のAmerican Type Cu lture Collection（ATCC）からＡＴＴＣ寄託番号ＣＣＬ246.1として入手できるＫＧｌａ細胞において認められるものより少ない。化学的手段または酵素手段によって、培養した細胞上のＣＤ３４抗原を変性させると、種々の臨床状態下に観察されるように、抗原の細胞発現をよくまねる対照標準細胞を提供することができる。特定の病気または不調と関連する特定のタイプの細胞を同定するために、いくつかの異なる分子構造を単細胞について同定する必要があることがある。広い種類の細胞を一層小さい特定のサブセットおよび一層大きい特定のサブセットにさらに再分する必要があることがある。いくつかの広い種類の細胞のうちの１つの広い種類の細胞を区別するため、さらには選定した広い種類の細胞のうちのサブセットを区別するために、現在の技術では異なる標識を有する選定したモノクローナル抗体を使用する。例えば、標識として放射性元素、酵素および染料を含有する標識分子を、単独または組み合わせて使用することができる。染料、特に蛍光染料が好ましい。このような蛍光染料の例としては、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥまたはＲＤ）、フィコエリトリン−テキサスレッド複合体（conjugate）およびアロフィコシアニンがある。系内ＤＮＡハイブリッド形成技術および系内ＲＮＡハイブリッド形成技術を適用して、特定の細胞の特性を同様にして同定することができる。この場合には、標識プローブを使用して、特定の病気または不調と関連するＲＮＡ／ＤＮＡ成分を検出する。ジー．ジェー．バウマン（G.J．Bauman）等“Fluorescent In-Situ Hybridization To Detect Cellular RNA By Flow Cytometry And Confocal Mic roscopy”，「J．Microscopy 157（Part 1）：７３−８１（１９９０年１月）」。“Fluorescent In Situ Hybridization To Interphase Cell Nuclei In Suspe nsion Allows Flow Cytometric Analysis of Chromosome Content And Microsco pic Analysis of Nuclear Organization”，ビー．タスク（B．Task）等「Human Genetics 78：２５１−２５９（１９８８）」。普通、ＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブは、関心のある分子または細胞中に存在する鎖を補足する短いオリゴヌクレオチド鎖である。例えば、ＧＧＴＡＴＡＣＣ配列のＤＮＡプローブではＣＣＡＡＴＡＴＧＧ配列を有する細胞中に存在するものを補足する。特異的に変性された抗原を発現する対照標準細胞は、白血球含有量の多い血液凝固阻止処理を施した血液から、あるいは選定したタイプの培養細胞から製造することができる。最初の例では、白血球含有量の多い血液凝固阻止処理を施した血液の試料から赤血球（ＲＢＣ）を溶解し、溶解残滓を洗浄して除去する。あるいはまた、他の適当な手段により、例えば、米国特許第４，７５２，５６３号明細書に記載されているように、不溶性基質に結合している赤血球に特異的な抗体を使用することにより、赤血球を除去することができる。また、所要に応じて、不溶性支持体に結合している追加の選択的抗体を使用することにより、血液試料から特定イタプの非赤血球細胞を除去することができる。例えば、顆粒球上にのみ存在する抗原に特異的なモノクローナル抗体を不溶性支持体に結合させることができ、生成する結合した抗体を使用して赤血球を含有していない血液試料から顆粒球を除去することができる。使用できる多くのタイプの支持体のなかには、磁性を有しているかあるいは有していないガラスビーズ、セラミックビーズまたは重合体ビーズがある。また、よく知られている密度勾配技術を使用することにより、選定した細胞を除去することができる。選定した細胞を最初の血液試料から除去することができ、これらの除去された細胞または試料中に残留する細胞を当業者に知られている手段によって活性化することができる。例えば、いくつかの細胞活性化方法が、エー．クルイスビーク（A．Kruisbeek）、ディー．マルグリース（D．Margulies）、イー．シェバチ（ E．Shevach）およびダブリュー．ストロバー（W．Strober）編「CURRENT PROTOC OLS IMMUNOLOGY，J．Coligan」（Greene Publishing Associated and Wiley-Int erscience，New York 1991）、Section 3.12“Proliferative Assays for T Cel l Function”中で議論されている。細胞を活性化した後に、参考としてここに記載する米国特許第５，０５９，５１８号明細書に開示されている方法によって、あるいは当業者に知られている他の適当な保存加工技術によって、これらの細胞を保存加工する。保存加工技術を選択する際の主な基準は、再構成またはその他の方法でアッセイに実際に使用できるように準備した場合に、保存加工した細胞が、保存加工前に細胞が持っていた抗原性または他の試験に関係のある特性を保持していることである。この方法によって製造された対照標準細胞は、抗原成分、酵素活性または病気にかかっているか不調になっている患者において自然に活性化されている白血球細胞の特性およびこれに類似している特性を有する核酸の発現を包含する細胞構成成分の発現を示す白血球細胞の範囲を与える。従って、このようにして製造された対照標準細胞は、白血球の活性化および特性に対する応答を測定する臨床的および免疫学的アッセイに使用するのに適している。また、選定した樹立細胞系からの培養細胞を使用して、本発明の対照標準細胞を製造することができる。前記細胞系の細胞を、確立された手段を使用して組織培地中で生育させ、採取し、さらに化学的および酵素的方法を使用して処理して細胞の抗原構造を変性させる。例えば、ＫＧｌａ細胞を採取し、ヨードアクトアミドで処理してＣＤ３４抗原の発現を変性させる。次いで、この変性された細胞を白血球試料に添加する。この白血球試料は白血球含有量の多い抗凝固血液から製造されたもので、この血液からはＲＢＣおよび所望に応じて他の選定した細胞が上述と同じ技術によって除去されている。生成する細胞試料は、米国特許第５，０５９，５１８号明細書または他の適当な保存加工技術に従って、対照標準細胞として使用できるよう保存加工することができる。変性されたＫＧｌａ細胞を含有する保存加工試料は、末梢血液または骨髄のなかに存在するものに類似した抗原変性を受けた白血球細胞の範囲を示す。再構成またはその他の方法で使用できるように準備した場合には、得られた細胞は臨床的および免疫学的アッセイにおいて対照標準細胞として使用するのに適している。本発明は多くの異なる形態で実施することができる。すなわち、異なる哺乳動物の種（species）からの多くのタイプの異なる細胞を対照標準細胞として使用するために製造することができる。従って、本発明は動物ならびに人間に適用することができる。ここに示す実施例は、本発明の教示および実施を例示するものであって、本発明の範囲に対する限定と解してはならない。従って、ここに示す実施例では本発明を例示するためにヒトＴ細胞を使用しているが、非Ｔ細胞または他の哺乳動物の種からの細胞を使用して、種々の種における種々の病気の分析に有用な対照標準細胞を製造することができる。図１１は、対照標準試料として使用する前に、他の細胞、例えば、正常細胞と混合するかあるいは混合しないで、細胞に対して行った種々の変性または転形を示すフロー・チャートである。上部左側から出発して左から右に進む１つの経路に従えば、正常な血液細胞、組織培養細胞または免疫抑制動物からのゼノジェニック移植片をバイオ調節剤（bioregulatory agent）で処理する。生成する細胞は、保存加工を施した後に対照標準細胞として使用することができ、あるいは保存加工を施す前に化学薬品を使用してさらに処理することができる。上部左側から出発して上から下に進む第２の経路では、具体例の細胞は変性させた後に保存加工を施し、次いで対照標準細胞として使用する。実施例１Ｔ細胞活性化の分析に使用するのに適当な対照標準細胞Ｔ細胞の活性化は種々の臨床状態を示すものである。タイプIIＭＨＣ（ＤＲ）抗原の測定を利用してＴ再の活性化を求める。活性化されたＴ細胞を含む保存加工した非感染性対照標準細胞は、Ｔ細胞の活性化を測定するアッセイに有用であることが分っている。タイプIIＭＨＣ（ＤＲ）抗原−変性Ｔ細胞を、血液凝固阻止処理を施した、白血球含有量の多い正常な末梢血液から製造した。白血球含有量の多いいくつかの正常な血液試料をプールし、密度勾配技術を使用してリンパ球を単離した。密度勾配技術では、血液をリン酸緩衝食塩水（ＰＨＳ）で希釈し、フィコール−ハイパク（Ficoll-Hypaque、登録商標）（米国ニュージャージー州ピスキャッタウエイ所在のファルマシア(Pharmacia)社）の上に層状に塗布し、遠心分離を行った。界面のリンパ球を取り出し、ＰＢＳで洗浄した。次いで、洗浄したリンパ球を３μｇ／mlの植物性血球凝集素（ＰＨＡ，ディフコ社(DIFCO Inc.)）で処理し、補足されたＲＰＭＩ培地中で約７２〜９６時間培養した。この培養期間の終りに、細胞を採取し、ＰＢＳまたは１０％トレハロース等張溶液で洗浄し、１０％トレハロース等張溶液中に懸濁させ、米国特許第５，０５９，５１８号に従って凍結乾燥した。保存加工を施した対照標準細胞を、再構成後に、新鮮な細胞と比較することにより評価した。その結果を図１〜３に示す。これらの図において、ＬＦＬ１は抗−ＣＤ₃−ＦＩＴＣモノクローナル抗体からの蛍光を示し、ＬＦＬ２は抗−ＤＲ−ＲＤ１モノクローナル抗体からの蛍光を示す。両者ともに米国フロリダ州ハイアリア所在のクールターコーポレイションから入手することができる。図１は、新鮮な、すなわちＰＨＡで処理したが保存加工してない正常な末梢血液リンパ球を使用して得たヒストグラムである。図２は、ＰＨＡで処理してない新鮮なリンパ球のヒストグラムである。図３は、ＰＨＡ（３μｇ／ml）で処理し、凍結乾燥し、対照標準細胞として使用する前に再構成した正常な末梢血液リンパ球のヒストグラムである。図１および図２は、ＰＨＡで活性化されたＴ細胞におけるタイプIIＭＨＣ抗原の発現（図１、第２象限）が、活性化されてないＴ細胞におけるもの（図２、第２象限）と比較して増加していることを示す。図３を図１および図２と比較すると、ここに記載したように活性化され保存加工を施した対照標準細胞が、図１および図２に示すと同様なＭＨＣ抗原発現の増加（第２象限参照）を示すことが明らかである。図９および図１０は、標識オリゴヌクレオチドプローブを使用して、細胞の活性化と関連する細胞ｍＲＮＡの変化を検出した結果を示す。図９は、新鮮で（すなわち、保存加工してない）ＰＨＡ処理を行った正常な末梢血液リンパ球を２０％の酢酸と７５％のエタノールと５％の水とからなる溶液中で１０分間固定したものを使用して得たヒストグラムである。次いで、この固定した細胞を７００rp mで７分間遠心分離し、上澄液から分離し、ＳＳＣ溶液（0.15ＭＮａＣｌ，0.0 15 Ｍクエン酸ナトリウム、pH 7.0、以下１ＸＳＣＣと称す）中に再懸濁させた。ヒトのインターロイキン−２ｍＲＮＡに対する６種のビオチン標識アンチセンス（anti-sense）領域特異的オリゴヌクレオチドプローブの混合物を、英国オクソン・オーエックス143 ワイエス，アディントン，バートンレーン，Ｖ−クウォードラント４−１０所在のブリティッシュ・バイオーテクノロジープロダクツ社（British Bio-technology Products Ltd.）から購入した。手順および方法は、この手順で使用する洗浄溶液を0.4Ｍグアニジンチオシアネート、0.1 ＸＳＳＣ溶液（上述の標準ＩＸ溶液を1/10に希釈したもの）および0.1％トリトンＸ−１００から構成した点を除き、製造者の指示通りとした。図９においてピークＡは正常なＰＢＬのフローサイトメリー・ヒストグラムである。ピークＢは活性化後におけるインターロイキン−２プローブによる標識細胞の増加を示す。図１０は、領域特異的オリゴヌクレオチドプローブカクテル（cocktail）がヒトのＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡ用のものである点を除き、図９のヒストグラムと同様にして得たフローサイトメトリー・ヒストグラムである。これらのプローブはブリティッシュ・バイオーテクノロジー社から入手できる。このヒストグラムにおいてピークＡは正常なＰＢＬを示し、ピークＢは活性化後におけるＩＣＡＭ−１プローブによる標識細胞の増加を示す。溶液ハイブリッド形成およびフローサイトメトリーには、下記のプロトコルを使用した。これらの指示は、一般的に、上述のプローブのためにブリティッシュ・バイオーテクノロジー社によって供給された指示通りのものである。溶液ハイブリッド形成およびフローサイトメトリーのためのプロトコルＡ．ＤＥＰＣ−水の調剤充分な量のジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）を蒸留水に添加して、最終濃度を0.1％にした。この混合物を充分振とうし、一夜静置し、殺菌温度においてオートクレーブで処理し、冷却してから使用した。この手順で使用する溶液を作るために使用する水も、使用前に同様にオートクレーブで処理した。Ｂ．細胞の固定１．細胞を取り出し、細胞懸濁液を作る。２．この懸濁液を１０％のトレハロースを含有する等張食塩水で洗浄する（参考としてここに米国特許第５，０５９，３１８号を記載する）。３．７００rpmで３分間遠心分離する。４．上澄液を除去し、廃棄する。５．得られた細胞を、１０％の酢酸、４０％のエタノールおよび５０％の水からなる１０mlの溶液中に、室温（１５〜２７℃）において１０分間で懸濁させた。（注：また、上述の２０％の酢酸と７５％のエタノールと５％の水とからなる溶液のような他の固定液も使用できる。）６．室温において７００rpmで７分間遠心分離する。７．細胞を１mlの２ＸＳＣＣ緩衝液（１ＸＳＣＣの２倍の濃度）中に再懸濁させる。Ｃ．ハイブリッド形成１．各ハイブリッド形成のたびに、１〜５０×１０⁶個の細胞を含む0.1mlの細胞懸濁液を使用する。２．この細胞懸濁液を遠心分離機にかけてペレットを形成させ、上澄液を除去する。３．得られた細胞を、９５℃で５分間加熱することにより変性させた５０μＬのハイブリッド形成カクテル中に再懸濁させる。このハイブリッド形成カクテルは次のものを含有する：・５０％ホルムアルデヒド・６００ｍＭＮａＣｌ・剪断作用を受けたサケの精子ＤＮＡ（１００mgのサケの精子ＤＮＡを１０mlの殺菌した蒸留水に添加し、サケの精子ＤＮＡを４℃において一夜溶解させることにより、製造したもの。剪断作用は超音波処理によって生じさせた）。・１×ＰＥ溶液（次の物質を６５℃において溶解させることにより得られる１０×ＰＥ溶液を希釈することによって製造したもの）。（ａ）トリス−ＨＣＬ，pH7.5 0.5Ｍ（ｂ）ピロリン酸ナトリウム１％w/v （ｃ）ポリビニルピロリドン（ＭＷ４０Ｋ）２％w/v （ｄ）フィコール（ＭＷ４００Ｋ）２％w/v （ｅ）ＥＤＴＡ（ニナトリウム） 50ｍＭ４．３に記載した懸濁液を４２℃に２時間維持する。５．この懸濁液を５０ml円錐形容器に入れ、0.4Ｍのグアニジンチオシアネート、１ＸのＳＳＣおよび0.１％のトリトンＸ−１００を含有する溶液２５mlを添加する。６．２５００rpmで１０分間遠心分離する。７．上澄液を除去し、0.１ＸのＳＣＣおよび0.1％のトリトンＸ−１００を含有する溶液２５mlを添加して、細胞を再懸濁させる。８．２５００rpmで１０分間遠心分離し、上澄液を除去し、１：１，０００のアビジン−ＦＩＴＣ（米国、ベクター社）を用いて２２℃において１５分間培養する。１mlのイソトンIII（米国フロリダ州マイアミ所在のクールター社）を添加し、２５００rpmで１０分間遠心分離し、上澄液を除去する。９．得られた細胞を、0.３mlのイソトンIIIまたはフローサイトメータに使用される同等なもののなかに再懸濁させる。実施例２ＣＤ３４陽性細胞の分析に使用するのに適当な対照標準細胞病気にかかっていない正常な提供者のＣＤ３４陽性細胞を種々のレベルの造血前駆細胞と組み合わせ、骨髄細胞の機能と関連させた。しかし、正常な血液試料中ではこれらの細胞の頻度（数なすわちカウント）が小さいので、その検出および計数が困難であった。いつくかの病気は、ＣＤ３４陽性細胞のレベルの変化によって、早期に現われた。従って、ＣＤ３４陽性細胞の検出を確認するのを助け、またその計数を助ける入手可能な対照標準細胞を持っているのが望ましい。ＣＤ３４陽性細胞は、ＡＴＣＣから寄託番号ＣＣＬ２４６．１のＫＧｌａ細胞系の試料の形態で入手した。この試料のＫＧｌａ細胞を培養し、採取し、ヨードアセトアミド（１０mg／５０ml）、レバミゾール（２００ml／リットル）、フッ化フェニルメチルスルホニル（１μｇ／ml）および0.1％のアジ化ナトリウムを含有する等張溶液からなる化学的変性培地（ＣＭＭ）中に入れた。次いで、これらの細胞を約１〜５時間、好ましくは約１〜３時間の間培養した。ＫＧｌａ細胞系に対する化学的変性の程度は培養期間の長さに正比例した。培養後に、これらの細胞を１０％トレハロース等張溶液で１回洗浄し、0.5％パラホルムアルデヒド溶液中に１２時間入れておいた。化学的に変性されたＫＧｌａ細胞をパラホルムアルデヒド溶液から遠心分離によって単離し、１０％トレハロース等張溶液中に懸濁させて、次の工程で使用した。次の工程では、先ず血液凝固阻止処理を施した、白血球含有量の多い正常な血液の複数個のパックをプールし、赤血球を溶解することにより、非感染性白血球を製造した。溶解後に、白血球細胞をヘペス（Hepes）緩衝食塩水（ＨＢＳ）で複数回洗浄した。次いで、これらの白血球細胞を最終洗浄液から分離し、１０％トレハロース等張溶液と共に容器に入れた。次いで、化学的に変性されたＫＧｌａ細胞を非感染性正常白血球に添加し、生成した混合物を凍結乾燥して、ＣＤ３４アッセイに使用するのに適当な保存加工した対照標準細胞を生成した。前記アッセイに使用する前に、対照標準細胞を蒸留水中で再構成した。これらの対照標準細胞を、蛍光標識モノクローナル抗体を使用して、フローサイトメトリーによって評価した。図４〜８は、本発明に従って製造し、保存加工した対照標準細胞を使用して得られる分析結果と、患者から得た新鮮なＣＤ３４陽性細胞とを、比較して示す。図４はＡＭＬにかかっている患者の末梢血液中のＣＤ３４陽性白血球を示す。ＬＦＬ２は、抗−ＣＤ３４−ＰＥモノクローナル抗体（米国カリフォルニア州、サンヨセ所在のベクトン−ディキンソン・イムノロジー・システムス(Becton-Di ckinson Immunology Systems)）に結合している細胞からの蛍光を示す。バックグラウンドレベルより上のＣＤ３４陽性細胞を、ヒストグラムゲートNo.１によって示す。図５は、正常な骨髄試料中のＣＤ３４陽性細胞を示す。ヒストグラムのｘ軸は抗−ＣＤ３４−ＲＤ１モノクローナル抗体（クールター・コーポレーション）に結合している細胞からの蛍光を示す。イソタイプ対照標準に基づいて、ヒストグラムゲート「Ｃ」はバックグラウンドレベルより上の陽性細胞を示す。図６は、凍結乾燥前に正常な末梢血液リンパ球と混合したＣＤ３４陽性ＫＧｌａ組織培養細胞からなる、再構成し、凍結乾燥した対照標準細胞を示す。ＬＦＬ２は、抗−ＣＤ３４−ＰＥモノクローナル抗体（ベクトン−ディキンソン社）と結合している細胞からの蛍光を示す。バックグラウンドレベルより上のＣＤ３４陽性細胞をヒストグラムゲートNo.１で示す。「平均（mean）」によって示される蛍光レベルは抗−ＣＤ−３４モノクローナル抗体結合能の発現程度を示す。図７は、凍結乾燥前に正常な末梢血液リンパ球と混合した化学的に変性されたＣＤ３４陽性ＫＧｌａ組織培養細胞からなる、再構成し、凍結乾燥した対照標準細胞を示す。ＬＦＬ２は、抗−ＣＤ３４−ＰＥモノクローナル抗体（ベクトン− ディキンソン社）に結合している細胞の蛍光を示す。バックグラウンドレベルより上のＣＤ３４陽性細胞をヒストグラムゲートNo.１で示す。「平均」チャネル（１５５）によって示される蛍光レベルは、化学的変性後に存在する抗−ＣＤ３４モノクローナル抗体結合能の発現の減少程度を示す。図８は、凍結乾燥前に正常な末梢血液リンパ球と混合した化学的に変性されたＣＤ３４陽性ＫＧｌａ組織培養細胞からなる、再構成し、凍結乾燥した対照標準細胞を示す。ＬＦＬ２は、抗−ＣＤ３４−ＰＥモノクローナル抗体（ベクトン− ディキンソン社）に結合している細胞の蛍光を示す。バックグラウンドより上のＣＤ３４陽性細胞をヒストグラムゲートNo.１で示す。「平均」チャネルによって示される蛍光レベルは、図７の試料の場合より培養期間を延長することにより化学的変性を増大させた後に、抗−ＣＤ３４−モノクローナル抗体結合能の発現程度のさらなる低下を示す。図６〜８は、変性されてないＣＤ３４陽性ＫＧｌａ細胞の増加している正常なリンパ球（図６）と、異なるＣＤ３４抗原発現程度を示すように化学的に変性されたＫＧｌａ細胞の増加している正常なリンパ球とを比較して示す。図６に示す結果はベースラインを示す。すなわち、図６〜８に示す試料においてＫＧｌａ細胞のパーセントが一定である場合には、ＣＤ３４抗原を発現する細胞の数は図６において最大になる。ＫＧｌａ細胞を化学的に変性させると、表６〜８において平均値の減少で示されるように、ＣＤ３４抗原の発現が破壊される。図１〜８の示す結果は、本発明方法を使用して種々のレベルのＣＤ３４発現を有する凍結乾燥した非感染性対照標準細胞を製造することができること、およびこれらの対照標準細胞は再構成した場合に臨床的および免疫学的アッセイに使用できることを示す。次のデータを示す表は上述の図に相当する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年５月２２日【補正内容】請求の範囲１．臨床的および免疫学的アッセイに使用する対照標準細胞において、（ａ）正常な啼乳動物白血球細胞と（ｂ）選定した白血球細胞とからなる保存加工した混合物であり、前記選定した白血球細胞は、該選定した白血球細胞上に特性が発現される病気にかかっているか不調になっているヒトにおける同じ白血球細胞上に発現される特性を発現するように、人為的に酵素的または化学的に活性化または変性されており；前記混合物は１０％トレハロース等張溶液を使用する凍結乾燥によって保存加工されていることを特徴とする対照標準細胞。２．前記活性化または変性された細胞はＴ細胞およびＢ細胞であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の対照標準細胞。３．前記活性化または変性された細胞はＴ細胞であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の対照標準細胞。４．前記対照標準細胞は、細胞のフローサイトメトリー分析における標準として、新鮮な異常啼乳動物細胞の代わりに使用するのに適していることを特徴とする請求の範囲第１項記載の対照標準細胞。５．正常な白血球細胞集団のうちの選定した白血球細胞が、該選定した白血球細胞上に特性が発現される病気にかかっているか不調になっているヒトにおける同じ白血球細胞上に発現される特性を発現するように、人為的に活性化または変性されているという特性を有する、保存加工した哺乳動物対照標準細胞混合物を製造するに当たり、（ａ）正常な白血球細胞の試料を培地中で酵素または化学試薬の存在下に培養して、前記白血球細胞の選定した集団の抗原特性を、前記選定した白血球細胞集団が、前記選定した白血球細胞上に特性が発現される病気にかかっているか不調になっている患者における同じ細胞を表わす特性を有するように選択的に活性化または変性し；（ｂ）この活性化または変性された集団を含む白血球細胞を前記培地から分離し、次いで前記白血球細胞を洗浄し；その後（ｃ）この活性化または変性された集団を含む前記白血球細胞を１０％トレハロース等張溶液を使用する凍結乾燥によって保存加工する；ことを特徴とする保存加工した哺乳動物対照標準細胞混合物の製造方法。６．工程５（ｃ）の保存加工の前に、工程５（ａ）の代わりに、 (ａ)(ｉ)選定した白血球細胞の集団を全白血球集団から分離し、（ii）前記選定した白血球細胞および前記全白血球集団の残部の両者を保留しておき、次いで（iii）前記選定した白血球細胞を前記酵素および化学試薬によって活性化または変性させる、ことからなる工程を行い；工程５（ｂ）の代わりに、 (ｂ)(ｉ)前記活性化または変性された白血球細胞を前記培地から分離し、次いで前記白血球細胞を洗浄し、その後（ii）前記洗浄した白血球細胞を病気の段階を表わす量で前記全白血球集団に添加し、前記選定した白血球細胞の正常な平衡を活性化または変性されてない細胞の添加によって達成することを特徴とする請求の範囲第５項記載の方法。７．部分（ｂ）の活性化または変性された白血球細胞は、活性化または変性されているという特性を有する部分（ａ）の正常な白血球細胞のサブセットからなることを特徴とする請求の範囲第１項記載の対照標準細胞。８．臨床的および免疫学的アッセイに使用する対照標準細胞において、（ａ）正常な哺乳動物白血球細胞と；（ｂ）前記白血球細胞上に特性が発現されるという特性を有する病気にかかっているか不調になっているヒトにおける同じタイプの白血球細胞上に発現される特性を有するように、人為的に、培養期間中抑制されているか、あるいは変性または活性化されているという特性を有する細胞とからなり、１０％トレハロース等張溶液を使用して保存加工した混合物であることを特徴とする対照標準細胞。９．部分（ｂ）の細胞はＴ細胞、Ｂ細胞および組織細胞であることを特徴とする請求の範囲第５項記載の対照標準細胞。１０．臨床的および免疫学的アッセイに使用する対照標準細胞において、（ａ）正常白血球細胞および樹立細胞系からの正常組織細胞から成る群から選定した正常な哺乳動物細胞と、（ｂ）前記（ａ）の正常な哺乳動物細胞から選定した細胞とからなる保存加工した混合物であって、前記（ｂ）の選定した細胞は、該選定した細胞上に特性が発現される病気にかかっているか不調になっているヒトにおける同じ哺乳動物細胞上に発現される特性を発現するように、人為的に活性化または変性されており；前記混合物は、（１）トレハロース等張溶液を使用する凍結乾燥、および（２）対照標準細胞として使用する保存加工した細胞を製造する際に、前記細胞の保存加工前の抗原性および構造上の特性を保持している対照標準細胞が得られる前記（１）以外の方法からなる群から選定した方法によって保存加工されている；ことを特徴とする対照標準細胞。１１．前記活性化または変性された細胞はＴ細胞およびＢ細胞であることを特徴とする請求の範囲第１０項記載の対照標準細胞。１２．前記活性化または変性された細胞はＴ細胞であることを特徴とする請求の範囲第１０項記載の対照標準細胞。１３．前記対照標準細胞は、フローサイトメトリー分析における標準として、新鮮な哺乳動物細胞の代わりに使用するのに適していることを特徴とする請求の範囲第１０項記載の対照標準細胞。１４．正常な白血球細胞集団および正常な組織細胞からなる群から選定した細胞が、該選定した細胞上に特性が発現される病気にかかっているか不調になっているヒトにおける同じ細胞上に発現される特性を発現するように、人為的に活性化または変性されているという特性を有する、保存加工した哺乳動物対照標準細胞混合物を製造するに当たり、（ａ）正常な哺乳動物細胞の試料を培地中で酵素または化学試薬の存在下に培養して、前記哺乳動物細胞の選定した集団の特性を前記選定した哺乳動物細胞集団が、前記選定した啼乳動物細胞上に特性が発現される病気にかかっているか不調になっている患者における同じ細胞を表わす特性を有するように、選択的に活性化または変性させ；（ｂ）これらの活性化または変性された細胞を含む哺乳動物細胞を前記培地から分離し；（ｃ）前記哺乳動物細胞を洗浄し；次いで（ｄ）活性化または変性された集団を含む前記哺乳動物細胞を、（１）トレハロース等張溶液を使用する凍結乾燥、および（２）対照標準細胞として使用する保存加工した細胞を製造する際に、前記細胞の保存加工前の抗原性および構造上の特性を保持している対照標準細胞が得られる前記（１）以外の方法からなる群から選定した方法によって保存加工する；ことを特徴とする保存加工した啼乳動物対照標準細胞混合物の製造方法。１５．正常な白血球細胞集団のうちの選定した白血球細胞の集団が、該選定した白血球細胞上に特性が発現される病気にかかっているか不調になっているヒトにおける同じ白血球細胞上に発現される抗原特性を発現するように、人為的に活性化または変性されているという特性を有する、保存加工した白血球対照標準細胞混合物を製造するに当たり、（ａ）全白血球細胞集団から選定した白血球細胞の集団を分離し、前記選定した白血球細胞および前記全白血球細胞集団の残部を保留しておき；（ｂ）前記選定した白血球細胞を培地中で酵素または化学試薬の存在下に培養して、前記選定した白血球細胞の抗原特性を、前記選定した白血球細胞が、該選定した白血球細胞上に抗原特性が発現される病気にかかっているか不調になっている患者における同じ細胞を表わす前記抗原特性を有するように選択的に活性化または変性させ；（ｃ）前記選定した白血球細胞を前記培地から分離し、次いで前記白血球細胞を洗浄し；（ｄ）工程（ｃ）の洗浄した白血球細胞と前記全白血球細胞集団の保留しておいた残部とを一緒にし、活性化または変性されていない細胞を添加することにより前記選定した白血球細胞の正常な平衡を達成し；次いで（ｅ）工程（ｄ）の白血球細胞を、（１）トレハロース等張溶液を使用する凍結乾燥、および（２）対照標準細胞として使用する保存加工した細胞を製造する際に、前記細胞の保存加工前の抗原性および構造上の特性を保持している対照標準細胞が得られる前記（１）以外の方法からなる群から選定した方法によって保存加工する；ことを特徴とする保存加工した白血球対照標準細胞混合物の製造方法。１６．前記選定した白血球細胞はＴ細胞およびＢ細胞であることを特徴とする請求の範囲第１５項記載の方法。１７．前記選定した白血球細胞はＴ細胞であることを特徴とする請求の範囲第１６項記載の方法。１８．免疫学的アッセイに使用する凍結乾燥した対照標準細胞において、前記対照標準細胞は、正常な白血球細胞中の選定した細胞部分が、病気にかかっているか不調になっているヒトにおける同じ白血球細胞上に発現される抗原特性を発現するように、酵素または化学試薬を使用して人為的に活性化または変性されているという特性を有する正常な白血球細胞からなり；前記細胞はＴおよびＢ細胞からなる群から選定した細胞であり；前記対照標準細胞は前記活性化または変性された細胞を含み、トレハロース等張溶液を使用する凍結乾燥によって保存加工さていることを特徴とする凍結乾燥した対照標準細胞。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ロスパトリシアエイアメリカ合衆国フロリダ州 33026 ペンブルックパインズエヌダブリュートゥエルフスコート 12381 (72)発明者スティグリッツメリッサジェイアメリカ合衆国ペンシルベニア州 19403 ジェファーソンウィロウブルックドライヴ 364エイ

Claims

【特許請求の範囲】１．臨床的および免疫学的アッセイに使用する対照標準細胞において、（ａ）正常な哺乳動物白血球細胞と（ｂ）選定した白血球細胞とからなる保存加工した混合物であり、前記選定した白血球細胞は、該選定した白血球細胞上に特性が発現される病気にかかっているか不調になっているヒトにおける同じ白血球細胞上に発現される特性を発現するように、人為的に活性化または変性されていることを特徴とする対照標準細胞。２．前記活性化または変性された細胞はＴ細胞およびＢ細胞であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の対照標準細胞。３．前記活性化または変性された細胞はＴ細胞であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の対照標準細胞。４．前記対照標準細胞は、細胞のフローサイトメトリー分析における標準として、新鮮な異常哺乳動物細胞の代わりに使用するのに適していることを特徴とする請求の範囲第１項記載の対照標準細胞。５．正常な白血球細胞集団のうちの選定した白血球細胞が、該選定した白血球細胞上に特性が発現される病気にかかっているか不調になっているヒトにおける同じ白血球細胞上に発現される特性を発現するように、人為的に活性化または変性されている保存加工した哺乳動物対照標準細胞混合物を製造するに当たり、（ａ）正常な白血球細胞の試料を培地中で酵素または化学試薬の存在下に培養して、前記白血球細胞の選定した集団の抗原特性を、前記選定した白血球細胞集団が前記選定した白血球細胞上に特性が発現される病気にかかっているか不調になっている患者における同じ細胞を表わす特性を有するように選択的に活性化または変性させ；（ｂ）この活性化または変性された集団を含む白血球細胞を前記培地から分離し、次いで前記白血球細胞を洗浄し；その後（ｃ）この活性化または変性された集団を含む前記白血球細胞を適当な保存加工技術によって保存加工する；ことを特徴とする哺乳動物対照標準細胞混合物の製造方法。６．前記保存加工技術が１０％トレハロース等張溶液を使用する凍結乾燥であることを特徴とする請求の範囲第６項記載の方法。７．工程６（ｃ）の保存加工の前に、選定した白血球細胞集団を全白血球集団から分離し、次いで前記酵素または化学試薬によって活性化または変性させ、その後病気の段階を表わす量で前記全白血球集団に添加し、前記選定した白血球細胞の正常な平衡を活性化または変性されてない細胞の添加によって達成することを特徴とする請求の範囲第６項記載の方法。８．前記保存加工技術は、１０％トレハロース等張溶液を使用する凍結乾燥であることを特徴とする請求の範囲第６項記載の方法。９．部分（ｂ）の活性化または変性された白血球細胞は、活性化または変性されている部分（ａ）の正常な白血球細胞のサブセットからなることを特徴とする請求の範囲第１項記載の対照標準細胞。１０．臨床的および免疫学的アッセイに使用する対照標準細胞において、（ａ）正常な哺乳動物白血球細胞と、（ｂ）前記白血球細胞上に特性が発現される病気にかかっているか不調になっているヒトにおける同じタイプの白血球細胞上に発現される特性を有するように、人為的に、培養期間中抑制されているか、あるいは変性または活性化されている細胞とからなる保存加工した混合物であることを特徴とする対照標準細胞。１１．部分（ｂ）の細胞はＴ細胞、Ｂ細胞および組織細胞であることを特徴とする請求の範囲第１６項記載の対照標準細胞。