JPH08511420A

JPH08511420A - Body

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Publication number: JPH08511420A
Application number: JP7501518A
Authority: JP
Inventors: モーガン、スーザン・アドリーン; エンテイジ、ジョン・スペンサー; ボドマー、マーク・ウィリアム; アスウォル、ディルジート・シン
Original assignee: セルテック・セラピューテイクス・リミテッド
Priority date: 1993-06-16
Filing date: 1994-06-15
Publication date: 1996-12-03
Also published as: WO1994029351A2; AU691811B2; WO1994029351A3; CA2163345A1; AU6934194A; EP0714409A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、改変された補体結合能を有する抗体を提供する。本発明はさらに、該抗体を含有する薬剤用、治療用および診断用組成物、そして該抗体を用いる治療法および診断法に関する。さらに本発明は、該抗体を用いる細胞表面抗原の機能を調節する方法を提供する。また該抗体を調製する方法も提供される。 (57) [Summary] The present invention provides an antibody having a modified complement-fixing ability. The invention further relates to pharmaceutical, therapeutic and diagnostic compositions containing said antibody, and therapeutic and diagnostic methods using said antibody. The invention further provides a method of modulating the function of cell surface antigens using the antibody. Also provided is a method of preparing the antibody.

Description

【発明の詳細な説明】抗体発明の分野本発明は、改変された抗体、該抗体を含有する薬剤組成物、治療用組成物および診断用組成物；該組成物の調製方法；該抗体を用いる治療方法および診断方法、該抗体を用いる細胞表面関連抗原の機能の調節方法；該抗体をコードするＤＮＡ配列；該抗体をコードするＤＮＡ配列を含有するクローニングおよび発現ベクター；該ベクターで形質転換された宿主細胞、および該抗体の調製方法に関する。発明の背景抗体が治療的に有効であるためには、有意な毒性作用を引き起こさずに必要な生理学的作用を示すことが好ましい。このような毒性作用は、例えば補体結合により媒介される。同種の抗原（cognate antigen）に結合した抗体は、補体カスケードに結合しこれを活性化することができる。補体は複雑な蛋白のシリーズよりなる。補体系の蛋白は、相互に関連した２つの酵素カスケード（古典的経路と副経路と呼ばれ、補体系の中心的反応であるＣ３の切断に至る２つの経路を提供する）を形成する。古典的補体経路よりなる反応の順序は、認識、酵素活性化、および膜の攻撃であり、細胞の死に至る。補体系の認識単位は、Ｃ１複合体である。Ｃ１補体蛋白複合体は、Ｃ３転換に至る古典的補体カスケードのユニークな特徴である。Ｃ１ｑ亜成分が免疫グロブリン抗原免疫複合体に直接結合すると、補体結合が起きる。補体結合が起きるか否かは、いくつかの制約に依存する。例えば、免疫グロブリンのあるサブクラスのみが、最適な条件下で補体に結合することができる。これらは、ヒトではＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＭであり、マウスではＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＭである。Ｃ１ｑ分子は、免疫グロブリンの補体結合部位への結合に関して多価の能力を有する。ＩｇＧのＣ_H２ドメインとＩｇＭのおそらくＣ_H４ドメインが、Ｃ１ｑへの結合部位を有する。Ｆｃを有する細胞も、関係するクラスの抗体でコートされた標的細胞に結合し、これをオプソニン化、食菌または死滅させることにより、免疫応答の効果を増強する役割を果たす。齧歯類およびヒトの白血球について、３つのＩｇＧ結合受容体（ＦｃγＲ）が記載されている。ＦｃγＲＩは、モノマーＩｇＧに対して強い親和性を有し、ＦｃγＲIIとＦｃγＲIIIは、モノマーＩｇＧに対する親和性は弱く、主に抗原と複合体を形成したＩｇＧと相互作用をする。Ｆｃ受容体の存在はこれらの免疫細胞に、液性応答のエフェクター相で重要な多くのエフェクター機構を媒介する能力を与える。ヒトＩｇＧのガンマ１イソタイプは、ＩｇＧ３のようにＦｃＲＩに結合し、その同種抗原と複合体を形成した時、補体を活性化し、ＦｃＲIIやＦｃＲIIIに結合する。逆にヒトＩｇＧ２やＩｇＧ４は比較的不活性なイソタイプであり、いずれも古典的補体経路を活性化せず、そしてＩｇＧ４はＦｃＲＩに弱く結合する［バートン・ディー・アールとウーフ・ジェイ・エム（Burton，D R and Woof，J M）、（1992），Adv．Immunol．51，１。ルキサノ・バリム・ワイ・エムとラックマン・ピー・ジェイ（Lucisano Valim，Y M and Lachmann，P J．（1991），C lin．exp．Immunol．84，１］。ヒトＩｇＧのＣ_H２ドメインでＦｃＲＩと相互作用するＩｇＧのアミノ酸残基の局在は、十分確立されている［ウーフ・ジェイ・エム（Woof，J M）ら（1986 ）Molec．Immunol．23，319。ルンド・ジェイ（Lund J）ら（1991）J Immunol， 147，2657；キャンフィールド・エス・エムとモリソン・エス・エル（Canfie1d ，S M and Morrison，S L）（1991），J．exp．Med．173，1483；チャペル・エス・エム（Chappel，S M）ら（1991）Proc．Natl．Acd．Sci．88，9036；チャペル・エス・エム（Chappel，S M）ら（1993），J．Biol．Chem268，25124；アレグレ・エム・エル（Alegre，M-L）ら（1992）J．Immunol．148，3461］。ＦｃＲＩに充分結合する異なる種およびサブクラスの抗体のＣ_H２ドメインのアミノ酸配列の比較は、残基Ｌｅｕ２３４〜Ｓｅｒ２３９よりなるＣ_H２のＮ−末端の領域（カバト（Kabat）のEu番号付け法を使用［カバト・イー・エー（Kabat，E A ）ら（1987）、免疫学的興味のある蛋白の配列（Sequences of proteins of Imm unological interest）、米国デパートメント・オブ・ヘルス・アンド・ヒューマン・サービシーズ（US Dept．of Health and Human Services）、ベセスダ（B ethesda）、メリーランド州、米国］が、ＦｃＲＩとの相互作用に決定的に重要であることを示唆した。ＦｃＲＩに対して強い親和性を有するすべてのＩｇＧイソタイプには、モチーフＬｅｕ２３４，Ｌｅｕ２３５，Ｇｌｙ２３６，Ｇｌｙ２３７，Ｐｒｏ２３８，Ｓｅｒ２３９が存在する［ウーフ・ジェイ・エム（Woof， J M）ら（1986）Molec．Immunol．23，319］。異なるＦｃエフェクター機能を有する免疫グロブリン間のドメインの交換により、ＦｃＲＩ結合に対するＣ_H２（特に残基２３５）の重要性が証明された［キャンフィールド・エス・エムとモリソン・エス・エル（Canfield，S M and Morrison，S L）（1991），J．exp．Med ．173，1483；チャペル・エス・エム（Chappel，S M）ら（1991）Proc．Natl．A cd．Sci．88，9036；チャペル・エス・エム（Chappel，S M）ら（1993），J．Bi ol．Chem268，25124］。２３５位でＬｅｕ残基をＧｌｕで置換すると、ＦｃＲＩに対するＩｇＧ３の親和性が１００倍低下する［ルンド・ジェイ（Lund J）ら（ 1991）J Immunol，147，2657；キャンフィールド・エス・エムとモリソン・エス・エル（Canfield，S M and Morrison，S L）（1991），J．exp．Med．173，148 3］。ＯＫＴ３のＩｇＧ４変種で同じＬｅｕ２３５からＧｌｕへの変更を行う［アレグレ・エム・エル（Alegre，M-L）ら（1992）J．Immunol．148，3461］と、ＦｃＲＩ結合がなくなり、従ってその分裂促進性がなくなった。ＦｃＲIII結合に対する配列の必要条件はあまり研究されていないが、サーメイ（Sarmay）ら［（1992）Molec．Immunol．29，633］は、すべての３つのＦｃ受容体へのＩｇＧ３の結合には、Ｃ_H２ドメインの残基２３４〜２３７が重要であることを証明した。各残基の相対的重要性は各Ｆｃ受容体で異なり、ＦｃＲII I媒介細胞死滅には２３５と２３７が最も重要である。これに対してもう１つのＦｃ介在機能であるＣ１ｑ結合と引き続く補体活性化は、Ｃ_H２ドメインのカルボキシ末端側の半分を必要とするようである［タオ・エム・エィチ、キャンフィールド・エス・エムおよびモリソン・エス・エル（Ta o，M H.，Canfield，S M.，and Morrison，S L）（1991）J．Exp．Med．173，10 25］。モリソン（Morrison）のグループは、ヒトＩｇＧのＣ_H２ドメインの多型性をを配列解析して、Ｃ_H２のＣ−末端領域の重要性を証明した。ＩｇＧ１の３３１位のＰｒｏをＳｅｒへ変化させて、かれらは補体結合をなくし、Ｃ１ｑ結合能を低下させた［タオ・エム・エィチ（Tao，J H）ら（1993），J．Exp．Med．1 78，661］。ＣＡＭＰＡＴＨ−１のドメイン間およびドメイン内スイッチ変種を用いて、グリーンウッド（Greenwood）ら（1993）［Eur．J．Immunol．23，1098 ］は、さらにＣ_H２のＣ−末端の重要性を支持した。Ｎ−末端側の半分や他のドメインではなく、ただＣ_H２のカルボキシ末端により、ヒトＩｇＧ４へ補体結合能が回復される。ダンカンとウィンター（Duncan and Winter）（1988）［Natur e，332，21］は、マウスＩｇＧ２ｂイソタイプのＧｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０およびＬｙｓ３２２のモチーフを同定した。これらの残基のいずれかを変化させると、この領域の配列の競合的ペプチドを使用した場合と同じように、Ｃ１ｑ結合能がなくなった。しかし補体結合をしない抗体においてもＣ１ｑモチーフ残基が見いだされるため、これらの残基は補体活性化に必要であるが充分ではないかも知れないことを示唆している。本発明者らは、抗ＨＬＡＤＲ抗体Ｌ２４３をベースとする作成した抗体（eng ineered antibody）の適合セット（matched set）を用いて、ヒトＩｇＧ１のＣ１ｑ結合およびＦｃＲ結合に必要なアミノ酸残基は、Ｃ_H２ドメインのＮ−末端領域（残基２３１〜２３８）に存在することを、見いだした。ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のＣ_H２領域のロイシン２３５をグルタミン酸に変更すると、ＦｃＲＩ結合能がなくなることはすでに公知であるが、本発明者らはＩｇＧ１においてもこの事実を確認し、同時にヒト補体結合能はなくなるがＦｃＲIII介在機能は保持されることを確認した。またＩｇＧ１の２３７位のグリシンをアラニンに変更してもＦｃＲＩ結合能がなくなり、補体結合能とＦｃＲIII介在機能が低下した。２３３〜２３６の全領域を、ヒトＩｇＧ２に存在する配列と交換すると、ＩｇＧ１のＦｃＲＩ結合能と補体結合能がなくなり、ＦｃＲIII介在機能が低下した。これに対して、前述のＣ１ｑ結合モチーフにおいて３２０位のリジンをアラニンに変更しても、ＩｇＧ１介在補体結合能には何の影響も与えなかった。記載された部位Ｌｅｕ２３４−Ｌｅｕ２３５−Ｇｌｙ２３６−Ｇｌｙ２３７− Ｐｒｏ２３８−Ｓｅｒ２３９は、ＦｃγＲＩに強い親和性を有するすべてのＩｇＧイソタイプに存在する。ＩｇＧ３抗体に対する最近の突然変異誘発実験において、この領域において点突然変異が導入され、突然変異体がＦｃＴＲＩと結合することができるか否かが試験されている［ルンド（Lund）ら（1991）J Immunol ，147，2657-2662］。最も顕著な効果は２３５位で見られ、天然に存在するＬｅｕ残基をＧｌｕ残基で置換するとＦｃγＲＩへの親和性が１００倍以上低下した免疫グロブリンが得られる。抗体の補体結合能への残基２３５の改変の効果に関する本発明者らの観察結果は、きわめて驚くべきものである。以前の蛋白工学的研究では、ＩｇＧ上のＣ１ｑ結合部位を見つけるために、種々の位置に突然変異が導入された［ダンカンとウィンター（Duncan and W inter）（1988）Nature，332，738-740］。Ｃ１ｑの結合部位は、マウスＩｇＧ２ｂのイソタイプの３つの側鎖（Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０およびＬｙｓ３２２）に局在化された。残基Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０およびＬｙｓ３２２は、すべてのヒトＩｇＧ、ラットＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ２ｃ、マウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３、モルモットＩｇＧ１およびウサギＩｇＧで保存されている。さらなる実験で、残基２３５が突然変異されたマウスＩｇＧ２ｂ抗体突然変異体に対するヒトＣ１ｑの親和性は変化しない（すなわち、野生型と同じ範囲の値である）ことが証明された。本発明者らも観察したようにＩｇＧのＣ_H２領域の残基２３５を改変するとＦｃγＲＩ結合能がなくなるが、同時に補体結合能が実質的に低下するということは、どこにも報告や示唆されておらず、まったく予想外のことであった。発明の要約本発明は、未改変抗体（unaltered antibody）に比較して、抗体の補体結合能が改変されていることを特徴とする、抗体のＣ_H２ドメインのＮ−末端領域の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が改変された改変抗体（altered antibody）を投与することよりなる、抗体介在補体結合のため抗体療法が好ましくない毒性を与える疾患の治療方法を提供する。好適な実施態様において、改変抗体は１つまたはそれ以上の細胞性Ｆｃ受容体、特にＦｃＲIIIであり、ＦｃＲＩは除かれる、に結合し、すなわち、該抗体はＦｃＲＩには有意に結合せず、さらに好ましくはＦｃＲＩにまったく結合しない。従ってさらに、本発明は、未改変抗体に比較して抗体の補体結合能が改変されていることを特徴とする、抗体のＣ_H２ドメインのＮ−末端領域の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が改変された改変抗体を提供する。従ってさらに好適な実施態様において、本発明は、未改変抗体に比較して抗体の補体結合能が改変されており、かつ該抗体は１つまたはそれ以上の細胞性Ｆｃ受容体、特にＦｃＲIIIに結合するが、ＦｃＲＩには有意に結合しないことを特徴とする、抗体のＣ_H２ドメインのＮ−末端領域の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が改変された改変抗体を提供する。本発明の改変される抗体の定常領域は動物起源であり、好ましくはヒト起源である。これはまた任意のイソタイプであるが、好ましくはヒトＩｇＧであり、最も好ましくはヒトＩｇＧ１である。本発明の好適な実施態様において、改変されるアミノ酸残基は２３１〜２３９位のアミノ酸内、好ましくは２３４〜２３９内にある。本発明の特に好適な実施態様において、改変されるアミノ酸残基はモチーフＬｅｕ２３４Ｌｅｕ２３５Ｇｌｙ２３６Ｇｌｙ２３７Ｐｒｏ２３８Ｓｅｒ２３９内にある。最も好適な実施態様において、改変されるアミノ酸残基は、Ｌｅｕ２３５および／またはＧｌｙ２３７である。発明の詳細な説明本明細書において、補体を結合する抗体の能力に関連して使用される時「改変された」という用語は、通常は出発抗体に比較して補体を結合する抗体の能力の低下を意味する。改変すべき適当なアミノ酸を選択することにより（例えば、残基Ｌｅｕ２３５を改変するように）、その補体結合能力が実質的に低下している抗体を産生することができる。また、例えばアミノ酸残基Ｇｌｙ２３７を改変することにより、中程度の補体結合能を有する抗体を産生することもできる。本明細書において、「補体結合を実質的に低下させる」という用語は、ヒト補体結合が、野生型の未改変の出発抗体で見られるレベルの、好ましくは≦３０％、さらに好ましくは≦２０％、そして最も好ましくは ≦１０％であることを意味する。ＦｃＲＩ結合に関して使用される時「有意に」という用語は、ＦｃＲＩへの抗体の結合は、未改変抗体で見られるものの典型的には≦２０％、そして最も好ましくは≦１０％であることを意味する。野生型の未改変抗体の濃度の１０倍以下の濃度で、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を媒介する能力により測定すると、本発明の改変抗体は好ましくはＦｃＲ IIIに結合する。ゲノムの主要組織適合遺伝子複合体の領域でコードされる蛋白は、免疫認識の多くの面に関与している。すべての哺乳動物とおそらくすべての脊椎動物は、基本的に同じＭＨＣ系を有し、免疫応答遺伝子がＭＨＣに連結していることは公知である。ヒトでは主要組織適合遺伝子複合体は第６染色体上のＨＬＡ遺伝子塊である。主要な領域はＤ、Ｂ、ＣおよびＡである。Ｄ領域は、免疫系の細胞間の協同作用と相互作用に関与するクラスII蛋白の遺伝子を含有する。多くの疾患が、ＨＬＡ遺伝子塊のＤ領域に関連していることが見いだされている。今日までの研究で、自己免疫疾患（例えば、ヨーロッパ特許第68790号を参照）を含む膨大な数の疾患との関連が証明されている。ヨーロッパ特許第68790号は、ＭＨＣクラスII抗原に特異的なモノクローナル抗体に調節される免疫応答を選択的に抑制することにより、ヒトのＨＬＡ−Ｄ領域のようなＭＨＣのある領域の特定の対立遺伝子（ allele）に関連する疾患を調節することを示唆している。本発明者らは、Ｃ_H２ドメインのＮ−末端領域の２３５位でＭＨＣ−クラスII 特異抗体を改変することにより、免疫抑制性を完全に保持しているがインビトロの毒性は低下しておりインビボの毒性は許容される抗体を産生することができることを見いだした。さらに好適な実施態様において、本発明は未改変抗体に比較して、抗体の補体結合能が改変されていることを特徴とする、抗体のＣ_H２ドメインのＮ−末端領域の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が改変された、ＭＨＣ特異抗体を提供する。好適な実施態様において、本発明は、抗体はＣ_H２ドメインのＮ−末端領域の２３５位で改変されていることを特徴とする、ＭＨＣ特異的モノクローナル抗体を提供する。ＭＨＣ特異的モノクローナル抗体のようなある例において、抗体のＣ_H２ドメインのＮ−末端領域の改変は、補体結合能を改変しながら、追加的にＦｃＲＩ受容体への結合を阻害することが好ましい。抗体は好ましくは、ＭＨＣクラスII抗原に対して特異的であるが、Ｃ_H２ドメインのＮ−末端領域の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の改変のため、ＦｃＲＩには有意に結合しないであろう。さらなる好適な実施態様において、本発明の改変抗体または本発明の使用のための改変抗体は、Ｃ_H２ドメインのＮ−末端領域の２３５位で改変されていることを特徴とし、ＭＨＣクラスII抗原に向けられている。特に好適な実施態様において、本発明の改変抗体または本発明の使用のための改変抗体は、ＭＨＣクラスII抗原に向けられたものであり、該抗体はＣ_H２ドメインのＮ−末端領域の２３５位で改変されており、未改変抗体に比較して抗体の補体結合能が改変されており、そして該改変抗体は１つまたはそれ以上の細胞性Ｆｃ受容体、特にＦｃＲIIIに結合し、ＦｃＲＩには有意に結合しないことを特徴とする。さらに本発明は、抗体のＣ_H２ドメインのＮ−末端領域の１つまたはそれ以上のアミノ酸を改変し、未改変抗体と比較して該抗体の補体結合能を改変することよりなる、補体結合能が改変された改変抗体の産生方法を提供する。本明細書において「改変抗体」という用語は、抗体のＦｃ領域のＣ_H２ドメインのＮ−末端領域の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基で、野生型の未改変抗体とは異なる抗体を意味するのに使用される。この改変は、例えば野生型の出発抗体のアミノ酸を別のアミノ酸により置換、またはアミノ酸残基を欠失させることよりなる。本明細書において使用される残基の番号付けは、カバト（Kabat）ら［（1991 ）免疫学的興味のある蛋白の配列（Sequences of Proteins of Immunological i nterest）、第５版、米国デパートメント・オブ・ヘルス・アンド・ヒューマン・サービシーズ（US Dept．of Health and Human Services）］の記載したEu指標による。ヒトのＩｇＧ１およびＩｇＧ３抗体において、Ｃ_H２ドメインのＮ−末端領域の２３５位の天然に存在するアミノ酸はロイシン残基である。２３５位のロイシンをグルタミン酸またはアラニンで置換する改変は、インビトロの毒性が最小でありインビボの毒性は許容できる強力な免疫抑制抗体を産生するのに、特に有効であることが見いだされた。２３７位のグリシンをアラニンで置換する改変は、ヒト補体を結合する能力が中程度、すなわち、補体結合レベルは野生型の出発未改変抗体の約１５−８０％、好ましくは２０−６０％、最も好ましくは２０−４０％である抗体を産生することが見いだされている。残基は、例えばその側鎖上に不適当な官能基を有する他のアミノ酸またはアミノ酸誘導体により、前述の方法と類似の方法を使用して、同様に置換することができるであろう。これは例えば、側鎖の電荷および／または極性を変化させることにより達成される。本発明の改変抗体はまた、例えば分子の適当な部位にグリコシル化部位を挿入することにより２３５のような残基を欠失させることにより産生することもできる。このような方法は当該分野で公知であり、例えばヨーロッパ特許出願EP-307 434号の記載を参照。本発明の改変抗体はまた、異なるイソタイプの抗体の下部ヒンジ領域を交換することにより産生することもできる。例えばＧ１／Ｇ２下部ヒンジ交換により、補体結合能がなくなり、これは本発明のさらに好適な実施態様である。これは添付の実施例に、より詳細に記載される。Ｇ１／Ｇ２下部ヒンジ交換により、１つまたはそれ以上の残基が改変および／または欠失された、Ｃ_H２ドメインのＮ−末端領域の２３１〜２３８位で改変残基を有する抗体が得られる。本発明の特に好適な実施態様において、抗体はＭＨＣクラスII抗原に向けられたヒトＩｇＧ１抗体である。さらに本発明は、未改変抗体に比較して抗体の補体結合能は改変されていることを特徴とする、抗体のＣ_H２ドメインのＮ−末端領域の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が改変されている改変抗体を投与することよりなる、補体介在毒性を避ける細胞表面関連抗原の機能を調節する方法を提供する。本発明のこの面の好適な実施態様において、該改変抗体は１つまたはそれ以上の細胞性Ｆｃ受容体、特にＦｃＲIIIに結合することができるが、ＦｃＲＩへの結合は有意に低下している。このような細胞表面抗原の例には、例えば接着分子、Ｔ細胞受容体、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ６９、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスIIおよびＣＤ２５がある。本発明はまた、本発明の改変抗体よりなる治療用、薬剤用および診断用組成物、および治療と診断におけるこれらの生成物と組成物の使用も含む。さらに本発明は、薬剤学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と組合わされた、本発明の改変抗体よりなる治療用、薬剤用および診断用組成物を提供する。本発明はまた、本発明の改変抗体を薬剤学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体に混合することよりなる、治療用、薬剤用および診断用組成物の調製法を提供する。その抗体や組成物は、使用される治療の方法に適した任意の型および量で投与される。治療用、診断用および薬剤組成物で使用するための、または抗体に介在される補体結合のために抗体療法が好ましくない毒性を引き起こす疾患の治療に使用するための改変抗体は、好ましくはＭＨＣ特異抗体であり、最も好ましくはＭＨＣクラスII抗原であり、最も好ましくはＤＲα鎖依存抗原決定基に対する特異性を有する。治療用、薬剤用および診断用組成物は投与のための適した任意の型でよく、好ましくは注射や注入（例えば、ボーラス注入または点滴）のような非経口投与に適した型でもよい。注射用または注入用の場合は、生成物は油性または水性媒体中の懸濁液、溶液またはエマルジョンの型でもよく、懸濁剤、保存剤、安定剤および／または分散剤のような製剤物質を含有してもよい。あるいは抗体または組成物は、使用前に適当な無菌液で復元するために、乾燥型でもよい。抗体または組成物が経口投与に適しているなら、製剤は活性成分以外に、デンプン、例えば、ジャガイモデンプン、トモロコシデンプンまたは小麦デンプン、またはセルロース、または微結晶セルロースのようなセルロース誘導体またはデンプン誘導体；シリカ；乳糖のような種々の糖；炭酸マグネシウムおよび／またはリン酸カルシウムのような添加剤を含有してもよい。もし製剤が経口投与用であるなら、これは患者の消化管系に充分許容されることが好ましい。このために、製剤中に粘液形成剤や樹脂を含有させることが好ましい。また抗体または組成物を胃液に不溶性のカプセル内に製剤化することにより、耐性を改善することができる。また、抗体または組成物を調節放出性製剤中に含有させることも好ましい。抗体または組成物が直腸投与に適しているならば、その製剤は結合剤および／または滑沢剤（例えば、高分子性グリコール、ゼラチン、ココアバターまたは他の植物蝋または植物脂肪）を含有してよい。本発明はまた、ヒトまたは動物の被験体に、有効量の本発明の改変抗体を投与することよりなる、治療と診断方法を提供する。本抗体または組成物は、これらが使用される治療に応じた任意の適当な型と量で投与される。抗体が投与される用量は、治療すべき症状の本質と、抗体が予防的に使用されているのかまたは現存する症状の治療に使用されているのかに依存する。用量は患者の年齢や症状に応じて選択される。本発明の抗体の治療用量は、例えば好ましくは１回の投与量が０. １−２５ｍｇ／ｋｇ体重である。本発明の抗体により治療される免疫学的疾患には、例えば強直性脊髄炎、若年性リウマチ様関節炎、リウマチ様関節炎のような関節疾患；多発性硬化症のような神経学的疾患；糖尿病、若年性糖尿病のような膵臓疾患；慢性活動性肝炎、セリアック病、潰瘍性大腸炎、クローン病、悪性貧血のような消化器系疾患；乾癬のような皮膚病；喘息のようなアレルギー病；および移植片対宿主反応、そして同種移植片拒絶のような移植関連疾患がある。他の疾患には、ヨーロッパ特許第 68790号に開示されたものがある。本発明の改変抗体はまた、感染性疾患、例えば、ウイルスまたは細菌感染、の治療および癌免疫療法にも有用である。本明細書において「抗体」という用語は、天然の抗体、キメラ抗体およびＣＤＲ移植抗体またはヒト化抗体を包含するのに使用される。キメラ抗体とは、１つの抗体の完全可変ドメインよりなる抗原結合部位が、別の抗体の定常ドメインに結合した抗体である。このようなキメラの作成法は、ＥＰ120694号（セルテック社（Celltech Limited））、ＥＰ125023号（ジェネンテク社（Genentech Inc）およびシティ・オブ・ホープ（City of Hope））、ＥＰ171496号（レス・デブ・コープ（Res．Dev．Corp.）、日本）、ＥＰ173494号（スタンフォード大学）およびＷＯ86/01533号（セルテック社（Celltech Limited））に記載されている。ＣＤＲ移植またはヒト化抗体は、ヒトでない種の免疫グロブリン由来の抗原結合部位を有し、残りの免疫グロブリン部分はヒト免疫グロブリン由来である抗体分子である。ＣＤＲ移植またはヒト化抗体を作成する方法は、ＷＯ91/09967号（セルテック社（Celltech Limited））、ＷＯ90/07861号（プロテイン・デザイン・ラボズ社（Protein Design Labs．Inc））およびＷＯ92/11383号（セルテック社（Celltech Limited））に記載されている。さらに本発明は、本発明の改変抗体をコードするＤＮＡ配列；該ＤＮＡ配列を含有するクローニングおよび発現ベクター、該ＤＮＡにより形質転換される宿主細胞、および形質転換された宿主細胞中でＤＮＡ配列を発現することよりなる本発明の改変抗体を産生する方法を含有する。さらに、本発明において：ａ．抗体の重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を有するオペロンを発現ベクター中で産生させ、ｂ．相補的な抗体の軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡＤＮＡ配列を有するオペロンを発現ベクター中で産生させ、ｃ．両オペロンで宿主細胞をトランスフェクションし、そしてｄ．トランスフェクションした細胞株を培養して、少なくとも１つの発現ベクターは、抗体のＣ_H２ドメインのＮ−末端領域の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が対応する未改変抗体のアミノ酸残基からは改変されている抗体の重鎖をコードするＤＮＡ配列を含有する抗体分子を産生することよりなる、本発明の改変抗体を産生するための方法が提供される。当業者には明らかなように、全改変抗体が発現された後、部位特異的突然変異誘発のような方法を用いて、Ｃ_H２ドメインのＮ−末端領域中の改変を行うことができる。未改変抗体を発現するためには、改変抗体について記載した前述の方法を用いてＤＮＡ配列を発現すべきである。ＤＮＡ配列は好ましくはヒト化抗体であり；ｃＤＮＡ移植重鎖および／または軽鎖またはキメラ抗体をコードする。この細胞株は２つのベクターでトランスフェクションされ、第１のベクターは軽鎖由来のポリペブチドをコードするオペロンを含有し、第２のベクターは重鎖由来のポリペプチドをコードするオペロンを含有する。各ポリペプチド鎖が同様に発現されることができるだけ確認できるように、コード配列と選択マーカーに関する限り、好ましくはこれらのベクターは同一である。あるいは、選択マーカーと、軽鎖由来と重鎖由来のポリペプチドをコードするオペロンを含有する、単一のベクターを使用することができる。種々のベクターの一般的作成方法、トランスフェクション法および培養法は公知である。そのような方法は例えば、マニアチス（Maniatis）ら、分子クローニング（Molecular Cloning）、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring H arbor）、ニューヨーク、１９８９、およびプリムローズとオールド（Primrose and O1d）、遺伝子操作の原理（Principles of Gene Manipulation）、ブラックウェル、オックスフォード、１９８０に記載されている。本発明の改変抗体は、好ましくは抗ＭＨＣ抗体Ｌ２４３（これは受理番号ＡＴＣＣＨＢ５５でアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、ロックヴィル、メリーランド州）に寄託されている）由来であり、最も好ましくはそのキメラまたはＣＤＲ移植誘導体である。Ｌ２４３はすでにランプソンとレヴィ（La mpson and Levy）［J．Immunol．（1980）125，293）］に記載されている。本発明の改変抗体をコードするＤＮＡ配列を調製するのに、分子生物学の標準的方法が使用される。オリゴヌクレオチド合成法を使用して、目的のＤＮＡ配列のすべてまたはその一部が合成される。適宜部位特異的突然変異誘発およびポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）法が使用される。例えば「ＤＮＡ増幅のためのＰＣＲ技術の原理と応用」（”PCR Technology Principles and Applications f or DNA Amplification”）（1989）、エィチ・エー・アーリッヒ（H．A．Erlich ）編、ストックトン・ブレス（Stockton Press）、ニューヨーク、ロンドンを参照。例えば、ジョーンズ（Jones）ら［Nature，321，522(1986)］が記載したオリゴヌクレオチド特異的合成を使用することができる。またクラーマー（Kramer ）ら［Nucl eic Acids Res．12，9441(1984)］が記載したオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発法を使用することもできる。改変抗体をコードするＤＮＡ配列の発現に、任意の適当な宿主細胞／ベクター系を使用することができる。細菌、例えば、大腸菌（E．coli）および他の微生物系を使用することができる。例えばＣＯＳ細胞やＣＨＯ細胞［ベビントン・シー・アール（Bebbington，C R）ら（1991）Methods２，136-145］、およびミエローマまたはハイブリドーマ細胞株［ベビントン・シー・アール（Bebbington， C R）ら（1992）Bio/Techonology 10，169-175］のような真核細胞（例えば、哺乳動物）宿主細胞発現系を使用することもできる。改変抗体がＬ２４３由来の場合は、ＣＨＯベースの発現系を使用することが好ましい。ＡＤＣＣ測定法を間接的に介するＦｃＲIII結合の測定法、補体結合およびＣ１ｑ結合の測定法は、当該分野で公知であり、下記の実施例に詳述されている。免疫機能／抗体による免疫抑制は、当該分野で公知の方法を用いて測定され、例えば混合リンパ球応答、および破傷風トキソイドに対するＴ細胞呼び出し応答（T-cell recall response）がある。これらの測定法は下記の実施例に詳述されている。本発明は、以下の非限定実施例に以下の図を参照して例示されている。図中、図１は、プラスミドｐＭＲ１５.１の地図を示す。図２は、プラスミドｐＭＲ１４の地図を示す。図３は、Ｌ２４３重鎖のヌクレオチド配列と予想アミノ酸配列を示す。図４は、（ａ）クローン４３、（ｂ）クローン１８３、（ｃ）クローン１９２のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。図５は、Ｌ２４３軽鎖のヌクレオチド配列と予想アミノ酸配列を示す。図６は、プラスミドｐＧａｍｍａ１の地図を示す。図７は、プラスミドｐＧａｍｍａ２の地図を示す。図８は、ヒトＣ−ガンマ１のヒンジ領域とＣ_H２領域のヌクレオチド配列を示す。図９は、Ｌ２４３ヒトイソタイプシリーズの抗原結合能を示す。図１０は、Ｌ２４３イソタイプシリーズのＦｃＲＩ結合を示す。図１１は、Ｌ２４３イソタイプシリーズのヒト補体結合を示す。図１２は、Ｌ２４３ヒトイソタイプシリーズへのヒトＣ１ｑの結合を示す。図１３は、Ｌ２４３イソタイプのヒト補体結合を示す。図１４は、Ｌ２４３イソタイプのモルモット補体結合を示す。図１５は、Ｌ２４３イソタイプのウサギ補体結合を示す。図１６は、ＡＤＣＣによるＬ２４３イソタイプシリーズのＦｃＲIII結合を示す。図１７は、Ｔ細胞呼び出し応答のＬ２４３イソタイプシリーズの阻害を示す。図１８は、Ｔ細胞呼び出し応答のＬ２４３イソタイプシリーズの阻害を示す。図１９は、混合リンバ球反応のＬ２４３イソタイプシリーズの阻害を示す。図２０は、Ｔ細胞呼び出し応答のＬ２４３イソタイプシリーズの阻害を示す。図２１は、混合リンバ球反応のＬ２４３イソタイプシリーズの阻害を示す。図２２は、Ｌ２４３−ｇＬ１中のＶｌ領域のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。図２３は、Ｌ２４３−ｇＬ２中のＶｌ領域のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。図２４は、Ｌ２４３−ｇＨ中のＶｈ領域のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。図２５は、Ｌ２４３移植片対ＦＩＴＣキメラＬ２４３に対する競合測定法の結果のグラフを示す。図２６は、Ｌ２４３ガンマ４のスキャチャード解析のグラフを示す。図２７は、ＡＤＣＣで測定したキメラ、移植および移植［Ｌ２３５Ｅ］Ｌ２４３のFcＲIII結合のグラフを示す。図２８は、ＭＬＲで測定したＣＤＲ移植Ｌ２４３の免疫抑制活性のグラフを示す。図２９は、ＣＤＲ移植Ｌ２４３と移植［Ｌ２３５Ｅ］Ｌ２４３Ｔ細胞リコール応答のグラフを示す。図３０は、ＣＤＲ移植Ｌ２４３とＣＤＲ移植［Ｌ２３５Ｅ］Ｌ２４３の補体介在細胞毒性能のグラフを示す。本発明の具体的な実施態様の詳細な説明実施例実施例１遺伝子クローニングと発現Ｌ２４３ハイブリドーマ細胞からのＲＮＡ調製後述のように３×１０⁷個のＬ２４３ハイブリドーマ細胞から総ＲＮＡを調製した。細胞を生理食塩水で洗浄してＲＮＡzol（１０⁶細胞当たり０.２ｍｌ）に溶解した。クロロホルム（ホモジネート２ｍｌ当たり０.２ｍｌ）を添加し、混合物を激しく１５秒間撹拌し、氷の上に１５分間置いた。得られた水層および有機層を、エッペンドルフ遠心分離機で１５分間遠心分離して、同容量のイソプロパノールを添加して水層からＲＮＡを沈殿させた。氷上で１５分間後、遠心分離によりＲＮＡをペレットにし、７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、ＲＮＡａｓｅを含まない無菌水に溶解した。ＲＮＡの収率は３５０μgであった。Ｌ２４３軽鎖のアミノ酸配列成熟Ｌ２４３軽鎖の最初の９個のアミノ酸の配列は、ＮＨ２−ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳと決定された。Ｌ２４３ＶｈとＶｌのＰＣＲクローニングＬ２４３の重鎖と軽鎖の可変領域のｃＤＮＡ遺伝子は、逆転写酵素を用いて合成して、総ＲＮＡ中に存在するｍＲＮＡの１本鎖ｃＤＮＡコピーを作成し、次に特異的オリゴヌクレオチドプライマーによりｃＤＮＡ上でポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）を行なった。ａ）ｃＤＮＡ合成ｃＤＮＡは以下の試薬を含む２０μｌの反応液中で合成した：５０ｍＭトリス −塩酸ｐＨ８.３、７５ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭジチオスレイトール、３ｍＭＭｇＣｌ₂、０.５ｍＭの各デオキシリボヌクレオシド三リン酸、２０単位のＲＮＡ sin、７５ｎｇのランダムヘキサヌクレオチドプライマー、２μｇのＬ２４３ＲＮＡおよび２００単位のモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素。４２℃で６０分間インキュベート後、９５℃で５分間加熱することにより反応を停止させた。ｂ）ＰＣＲ重鎖と軽鎖のプライマーの組合せを用いて、ｃＤＮＡの一定分量にＰＣＲを行なった。重鎖と軽鎖の５’ブライマーのヌクレオチド配列は、それぞれ表１と２に示される。これらの配列は５’末端の６つのヌクレオチドから始まる制限部位、得られるｍＲＮＡの翻訳を最適化するためにその後に配列ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ、開始コドンおよびさらに２０−３０ヌクレオチドを含有し、公知のマウス抗体のリーダーペプチド配列に基づく寄せ集めである［カバト（Kabat）ら（1991）免疫学的興味のある蛋白の配列（Sequences of Proteins of Immunological int erest）、第５版、米国デパートメント・オブ・ヘルス・アンド・ヒューマン・サービシーズ（US Dept．of Health and Human Services）］。３’プライマーは表３に示される。軽鎖プライマーは、抗体のＶ−Ｃ結合部にまたがっており、ＶｌＰＣＲ断片のクローニングを促進するために酵素Ｓｐｌ１の制限部位を含有する。重鎖３’プライマーは、抗体のＪ−Ｃ結合部にまたがるように設計された混合物である。最初の２３ヌクレオチドは、ヒトＣ−ガンマ１、２、３および４遺伝子の開始部分に見いだされたものと同一であり、これらのヒトイソタイブに共通のＡｐａ１制限部位を含む。プライマーの３’領域は、公知のマウス抗体で見いだされた配列に基づく混合配列を含有する［カバト・イー・エー、ウー・ティー・ティー（Kabat，E A，Wu，T.T.）；ペリー・エィチ・エム、ゴッテスマン・ケー・エスおよびフォエラー・エル（Perry H M，Gottesman K S，and Foeller L）；免疫学的興味のある蛋白の配列（Sequences of Proteins of Immunological Int erest）第５版、米国デパートメント・オブ・ヘルス・アンド・ヒューマン・サービシーズ（US Dept．of Health and Human Services）、(1991)］。上記のプライマーの組合せは、ＶｈとＶｌのＰＣＲ生成物を適当な発現ベクター（下記参照）上に直接クローン化して、キメラ（マウス−ヒト）重鎖および軽鎖を産生し、そしてこれらの遺伝子を哺乳動物細胞で発現して目的のイソタイプのキメラ抗体を産生することを可能にする。ＰＣＲ用のインキュベート（２０μｌ）は以下のように行なった。各反応物は１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８.３、１.５ｍＭＭｇＣｌ₂、３、５０ｍＭＫＣｌ、０.０１％ｗ／ｖゼラチン、０.２５ｍＭの各デオキシリボヌクレオシド三リン酸、１〜６ピコモルの５’プライマーミックス（表４）、６ピコモルの３’プライマー、１μｌのｃＤＮＡおよび０.２５単位のＴａｑポリメラーゼを含有する。反応物は９５℃で５分間インキュベートし、次に９４℃で１分間、５５℃で１分間そして７２℃で１分間でサイクルさせた。３０サイクル後に各反応物の一定分量をアガロースゲルの電気泳動で分析した。５’プライマーミックスＢ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ５を含有する反応物は、全長Ｖｌ断片に一致するサイズのバンドを生成し、反応物Ｂ９は、Ｖｈ遺伝子に予測されるサイズの断片を生成した。Ｂ１プライマーにより生成されたバンドはすでに、ハイブリドーマ細胞により産生される軽鎖の偽遺伝子であることが証明されていたので、このバンドはさらに追跡しなかった。ｃ）ＰＣＲ断片の分子クローニング反応物Ｂ２、Ｂ３およびＢ５中で産生されるＤＮＡ断片を酵素ＢｓｔＢ１とＳｐｌ１で消化し、エタノール沈殿により濃縮し、１.４％アガロースゲルで電気泳動し、４００塩基対の範囲のＤＮＡバンドを回収した。これらを、ＢｓｔＢ１とＳｐｌ１で制限切断したベクターｐＭＲ１５.１（図１）に結合させてクローン化した。結合後、混合物を大腸菌ＬＭ１０３５に形質転換し、得られる細菌のコロニーからのプラスミドを、ＢｓｔＢ１とＳｐｌ１で消化して挿入体についてスクリーニングした。各結合反応からの挿入体を有する代表的なプラスミドをヌクレオチド配列決定により解析した。同様の方法で、反応物Ｂ９中で産生されＨｉｎｄIIIとＡｐａ１で消化したＤＮＡ断片を、ＨｉｎｄIIIとＡｐａ１で制限切断したベクターｐＭＲ１４（図２）にクローン化した。挿入体を含有する代表的プラスミドを、再びヌクレオチド配列決定により解析した。ｄ）ヌクレオチド配列解析反応物Ｂ９からのＶｈ挿入体を含有する２つの単離体からのプラスミドＤＮＡ（ｐＥ１７０１とｐＥ１７０２）を、プライマーＲ１０５３（ｐＭＲ１４中のＨＣＭＶプロモーターの３’領域で開始する）とＲ７２０（ヒトＣ−ガンマ４の５ ’領域で開始し、ｐＭＲ１４上のＤＮＡの配列決定を可能にする）を用いて、配列決定を行なった。ｐＥ１７０２中のＬ２４３Ｖｈの決定されたヌクレオチド配列と予想アミノ酸配列を図３に示す。ｐＥ１７０１中のＶｈ挿入体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド２０（ｐＥ１７０１ではＡ）とヌクレオチド４２６（ｐＥ１７０１ではＡ）を除いて、ｐＥ１７０２と同一であった。これらの２つの差は、それぞれシグナルペプチドとＶｈのＪ領域中にあり、調べたこの２つのクローンが、ＰＣＲ工程中のオリゴヌクレオチド混合物とは異なるプライマーを使用することにより得られる独立の単離物であることを示している。軽鎖クローンを解析するために、Ｒ１０５３でプライミングすることにより得られる配列を試験した。反応物Ｂ２（クローン１８３）、Ｂ３（クローン４３）そしてＢ５（クローン１９２）から得られるＶｌ遺伝子のヌクレオチド配列と予想アミノ酸配列を、図４に示す。予想される蛋白配列の比較により、以下のことが示される：ｉ）クローン１８２、１８３、４３および４５はすべて、Ｖｌ遺伝子をコードし、シグナルペプチドを除去した時、Ｌ２４３軽鎖のアミノ酸配列解析により決定された配列と同じ配列を有する軽鎖を産生する（前述）。 ii）クローン１８２と１８３は、２０アミノ酸のシグナルペプチドをコードするＶｌ遺伝子を含有し、クローン４３と４５のＶｌ遺伝子は異なるセットのオリゴヌクレオチドによるプライミングにより得られ、わずかに１５アミノ酸のリーダー配列を有する。 iii）クローン１９２はＬ２４３Ｖｌをコードしない。そのかわり抗体配列のデータベースを調査すると、クローン１９２はＭＯＰＣ２１（Ｌ２４３ハイブリドーマの産生に使用されるＮＳ１ミエローマ融合の相手により合成される軽鎖）のＶｌ遺伝子を含有することを示していた。 iv）クローン１８２と１８３は、ヌクレオチド２６（クローン１８２ではＴであり、クローン１８３ではＣ）以外は同一である。この差はＰＣＲにおいて異なるプライマーを使用したことで説明され、これはクローン１８２と１８３は同じ遺伝子の独立した単離体であることを示している。クローン１８３からの完全なＶｌ遺伝子のヌクレオチド配列と予想アミノ酸配列を図５に示す。ヒトガンマ１およびガンマ２イソタイプの作成Ｌ２４３Ｖｈ遺伝子をＨｉｎｄIII−Ａｐａ１断片上でｐＧａｍｍａ１とｐＧａｍｍａ２（それぞれヒトＣ−ガンマ１とＣ−ガンマ２をコードするベクター）中にサブクローニングした（図６と７を参照）。ヒトイソタイプ突然変異体ＰＣＲ突然変異誘発を用いて、ベクターｐＧａｍｍａ１に含有されるヒトＣ− ガンマ１中の残基２３５をロイシンからグルタミン酸またはアラニンへ、そして残基２３７をグリシンからアラニンへ変更した。ヒトＣ−ガンマ１の下部ヒンジ領域もまた、ヒトＣ−ガンマ２の対応する領域で置換した。これらの変更をするために以下のオリゴヌクレオチドを使用した：１）Ｌ２３５Ｅ変更２）Ｌ２３５Ａ変更３）Ｇ２３７Ａ変更４）下部ヒンジ領域の交換ＰＣＲ突然変異誘発に使用した他のオリゴヌクレオチドは、以下である：Ｒ４７３２とＲ４９１２はそれぞれ、ヒトＣ−ガンマ１のヌクレオチド８３４と８５８の間と、ヌクレオチド１１５６と１１３７の間でプライムする（図８）。ＰＣＲ突然変異誘発の一般的方法は以下の通りである。各アミノ酸の変化について、２回のＰＣＲを行い、必要な置換を有するＤＮＡ断片を作成する。次にこれらの断片をＢｇｌIIとＳｔｙ１で切断し、ｐＧａｍｍａ１ベクター中に野生型配列を含有する対応する配列を置換するのに使用した（図６）。第１回目のＰＣＲでは、以下の試薬を含有する反応物（２０μｌ）を調製した：１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８.３、１.５ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＫＣｌ、０.０１％ゼラチン、０.２５ｍＭの各デオキシリボヌクレオシド三リン酸、５０ｎｇのｐＧａｍｍａ１ＤＮＡ、０.４単位のＴａｑポリメラーゼおよび６ピコモルの各プライマー。以下のプライマーの組合せを使用した：９４℃で１分間、５５℃で１分間そして７２℃で１分間を３０サイクル行なった後、反応物をクロロホルムで抽出し、新たに合成したＤＮＡをエタノールで沈殿させ、水に溶解し、１.４％アガロースゲルで電気泳動した。ＤＮＡ断片を含有するゲルスライスをゲルから切り出し、「マーメイド」（”Mermaid”）（登録商標）キット（ストラテック・サイエンティフィック社（Stratech Scientifi cLtd.）、ルートン（Luton）、イングランド）を用いてアガロースからＤＮＡを回収し、２０μｌの無菌水に溶出させた。第２回目のＰＣＲは、１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８.３、１.５ｍＭＭｇＣｌ₂ 、５０ｍＭＫＣｌ，０.０１％ゼラチン、０.２５ｍＭの各デオキシリボヌクレオシド三リン酸、２単位のＴａｑポリメラーゼ、第１回目の反応からの各対のＤＮＡ断片の１／２０、および３０ピコモルのＲ４７３２とＲ４９１２を含有する、反応物１００μｌ中で行なった。３０サイクル（前記参照）の後、反応物をフェノール／クロロホルム（１／１）で抽出し、エタノールで沈殿させた。断片をＢｇｌIIとＳｔｙ１で消化し、１.４％アガロースゲルで電気泳動し、２５０塩基対のＤＮＡバンドを、前述のようにゲルスライスから回収した。これらのＢｇｌII−Ｓｔｙ１断片を８３０塩基対のＳｔｙ１−ＥｃｏＲＩ断片（Ｃ_H２ドメインのＣ−末端部分とヒトＣ−ガンマ１の全ＣＨ３ドメインを含有する）と、ｐＧａｍｍａ１からのＢｇｌII−ＥｃｏＲＩベクター断片に、３方向結合させた（図６参照）。ＬＭ１０３５中へ形質転換後、得られたコロニーのプラスミドミニプレップをＢｇｌII−Ｓｔｙ１断片の存在についてスクリーニングし、それぞれの代表的なものを取りヌクレオチド配列解析を行なった。ここから、目的の配列を含有するプラスミドを同定し、以後の参照のために下記のように命名するした：残基２３５にグルタミン酸を含有するｐＧａｍｍａ１［Ｌ２３５Ｅ］、残基２３５にアラニンを含有するｐＧａｍｍａ１［Ｌ２３５Ａ］、残基２３７にアラニンを含有するｐＧａｍｍａ１［Ｇ２３７Ａ］、Ｃ−ガンマ２下部ヒンジ領域を含有するｐＧａｍｍａ１［ｇ１→ｇ２］。上記プラスミドはそれぞれＨｉｎｄIIIとＡｐａ１で切断し、Ｌ２４３Ｖｈを含有するＨｉｎｄIII−Ａｐａ１断片を挿入して以下のプラスミドを作成した：Ｌ２４３ガンマ１［Ｌ２３５Ｅ］Ｌ２４３ガンマ１［Ｌ２３５Ａ］Ｌ２４３ガンマ１［Ｇ２３７Ａ］Ｌ２４３ガンマ１［ｇ１→ｇ２］ａ）キメラＬ２４３抗体の産生リン酸カルシウム沈殿法を用いてチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中に同時トランスフェクションした後、適当な重鎖および軽鎖の一時的トランスフェクションにより、生理学的評価のための抗体を産生した。トランスフェクションの１日前に、ＣＨＯ−Ｌ７６１細胞がセミコンフルエンスになったフラスコをトリプシン処理し、細胞を計測し、それぞれ１０⁷個の細胞を有するＴ７５フラスコを作成した。翌日トランスフェクションの３時間前に培地を交換した。トランスフェクションのために、重鎖および軽鎖発現ベクターをそれぞれ５０μｇ含有する０.２５ＭＣａＣｌ₂の１.２５ｍｌと、１.２５ｍｌの２×ＨＢＳ（水１リットル中にＮａＣｌ１６.３６ｇ、ＨＥＰＥＳ１１.９ｇ、およびＮａ₂ＨＰＯ₄０.４ｇ、ｐＨはＮａＯＨで７.１に調整）を混合してリン酸カルシウム沈殿物を調製し、直ちに細胞上の培地に添加した。ＣＯ₂インキュベーター中で３７℃で３時間後、培地と沈殿物を除去し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の１５％グリセロール１５ｍｌを加えて１分間細胞にショックを与えた。グリセロールを除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１０ｍＭ酪酸ナトリウムを含有する培地２５ｍｌ中で４８〜９６時間インキュベートした。プロテインＡ−セファロースに結合させ溶出して培地から抗体を精製し、免疫グロブリンＥＬＩＳＡ（後述）を用いて定量した。ｂ）ＥＬＩＳＡＥＬＩＳＡのために、ヌンク（Nunc）のＥＬＩＳＡプレートを、コーティング緩衝液（１５ｍＭ炭酸ナトリウム、３５ｍＭ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ６.９）中５μｇ／ｍｌのポリクローナルヤギ抗ヒトＦｃ断片特異抗体（ジャクソン・イムノリサーチ（Jackson Immuno-research）、コード109-006-098）のＦ（ａｂ）₂ 断片で、４℃で一晩コーティングした。コーティングしなかった抗体は、蒸留水で５回洗浄することにより除去した。定量する試料と標準物質を、結合緩衝液（０.１Ｍトリス−塩酸、ｐＨ７.０、０.１ＭＮａＣｌ、０.２％ｖ／ｖツイーン２０、０.２％ｖ／ｖハマーステン（Hammersten）カゼイン）中約１μｇ／ｍｌに希釈した。マイクロタイターウェル中で試料を連続２倍希釈して各ウェルの最終液量を０.１ｍｌとして、プレートを激しく撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。最初のインキュベート後プレートを蒸留水で１０回洗浄し、次に結合緩衝液中７００倍希釈のマウスモノクローナル抗ヒトカッパ（クローンＧＤ１２）ペルオキシダーゼ結合抗体（ザ・バインディング・サイト（The Binding Site）、コードＭＰ１３５）０.１ｍｌで前と同じようにインキュベートした。プレートを再度洗浄し、基質溶液（０.１ｍｌ）を各ウェルに加えた。基質溶液は、ｐＨ６.０中１５０μｌのＮ,Ｎ,Ｎ,Ｎ−テトラメチルベンジジン（ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍｌ）、１５０μｌの過酸化水素（３０％溶液）を含有する。初めの標準物質の６３０ｎｍの吸光度が約１.０になるまで、プレートを５〜１０分間発色させる。６３０ｎｍの吸光度はプレートリーダーを用いて測定し、試料の濃度は標準物質の力価曲線と比較して求めた。実施例２作成したＬ２４３の生物学的性質以下の実験の目的は、抗−ＭＨＣ−II抗体の使用の結果としての毒性の可能性から免疫抑制作用を分離することであった。この過程において、免疫抑制にどのＦｃ有効機能が必要であるかを証明できると本発明者らは考える。阻害測定法による抗原結合能本実験の原理は、同じ結合能を有する抗体は、同種の抗原に対して標識抗体と完全に競合することである。作成したＬ２４３抗体の抗原結合能が少しでも変化すれば、この系で明らかにされるであろう。標準的方法を用いて、マウスＬ２４３（ＩｇＧ２ａ）をフルオレセン（ＦＩＴＣ）で標識した。すべての希釈、操作およびインキュベートは、０.１％アジ化ナトリウム（ビーディーエィチ（ＢＤＨ）、英国）と５％胎児牛血清（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、英国）を含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ギブコ（ＧＩＢＣＯ、英国）中で行なった。ＲＢポリスチレンチューブ（２０５２１２×７５ｍｍ）ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）、英国）中の１００μｌ中の連続希釈した作成抗体を、一定量の１００μｌ（あらかじめ決定された最適濃度で）の標識抗体と、５×１０⁴指示細胞（高レベルのＨＬＡ−ＤＲを有するＪＹＢリンパ芽球細胞株）上で前もって混合した。細胞と抗体を一緒に４℃で３０分間インキュベートし、２回洗浄し、フルオレセン活性化細胞スキャナー（ＦＡＣＳベクトンディッキンソン）を用いて結合を明らかにした。適当な解析の後、平均蛍光強度を抗体濃度に対してプロットした。結果予想されたように、この分子のＦｃ領域の変化は抗原結合能に全く影響を与えなかった（図９）。ＦｃγＲＩ結合の評価作成したＬ２４３の変種のＦｃｇＲＩへの結合能を測定した。この実験の原理は、抗体はＦｃ受容体を介して細胞に結合し、この相互作用の親和性はサブクラス、従って抗体のＦｃの構造により決定されるということである。本測定法は、ＩＦＮγ刺激Ｕ９３７細胞への結合に対して、作成抗体がＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ２ａと競合する能力に基づく。Ｕ９３７（骨髄単球性）細胞は５００μ／ｍｌのＩＦＮγ（ジェンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）、英国）で２４時間インキュベートすると、ＣＤ６４結合とモノマーＩｇＧ２ａ結合で評価したとおり、高レベルのＦｃｇＲＩ、低レベルのＦｃＴＲIIを発現し、ＦｃγＲIIIを全く発現しない。Ｕ９３７細胞を、２５ｍＭＨＥＰＥＳ（ギブコ（ＧＩＢＣＯ、英国）を含有するＤＭＥＭで充分洗浄し、ＲＰＭＩ１６４０（ギブコ（ＧＩＢＣＯ、英国）中で３７℃で２時間インキュベートし、次に２５ｍＭＨＥＰＥＳ（ギブコ（ＧＩＢＣＯ、英国）を含有するＤＭＥＭで再度洗浄して、Ｆｃ受容体に結合した牛ＩｇＧを除去した。作成抗体の連続希釈液を、Ｖ底の９６ウェルマイクロタイタープレート（アイシーエヌ／フロー（ＩＣＮ／Ｆｌｏｗ）、英国）中で０.１％アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ギブコ（ＧＩＢＣＯ、英国）中で５０μｌに調製し、５０μｌ中の５×１０⁴個のＵ９３７細胞と４℃で３０分間インキュベートした。次にすべてのウェルに、あらかじめ決定した最適濃度でＦＩＴＣ標識ＩｇＧ２ａ抗体５０μｌを加え、４℃でさらに９０分間インキュベートした。マイクロタイタートレイ中で細胞を１回洗浄し、ＲＢポリスチレンチューブ（２０５２１２×７５ｍｍ、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）、英国）に移し、もう一度洗浄し、フルオレセン活性化細胞スキャナー（ＦＡＣＳベクトンディッキンソン）を用いて結合を明らかにした。適当な解析の後、平均蛍光強度を抗体濃度に対してプロットした。結果ＩｇＧ１のＣ_H２ドメインのＮ−末端の変化は、ＦｃＲＩへの結合に対して大きな影響を与えた（図１０）。予想されるように、野生型ＩｇＧ１はＦｃＲＩに充分結合し、ＩｇＧ４は約１０倍弱く結合し、ＩｇＧ２は全く結合しなかった。本発明者らはヒトＩｇＧ４中のＬｅｕ２３５からＧｌｕへの変化は、そのＦｃＲＩへの低い結合能をゼロにし、ＩｇＧ１中の同じ変化によりＦｃＲＩ結合は全くなくなることを確認した。２３５のＡｌａはＦｃＲＩ結合を低下（約１００倍）させたが、ゼロにはならなかった。ＩｇＧ１のＧｌｙ２３７をＡｌａに変化させると、全領域２３３をＩｇＧ２で見られる配列の２３６で交換させた時のように、ＦｃＲＩ結合がなくなった。Ｇ１［Ｋ３２０Ａ］変化はＦｃＲＩ結合には影響がなかった。抗体依存性補体介在細胞障害抗体依存性補体介在細胞障害の方法を用いて、Ｌ２４３の作成抗体変種のヒト補体結合能を評価した。この実験の原理は、抗体のＦｃが（通常の古典的）補体カスケードの成分と相互作用することができるなら、抗体はその同種抗原を有する標的細胞の補体溶解を媒介することである。決定的に重要な相互作用はＣ１ｑ分子との相互作用である。これらの実験の補体の供給源は、エンドトキシンを含まないガラスビン中に採血し、次に３７℃で１時間凝固させたヒト静脈血である。ガラスから凝固塊を切り離し、次に４℃で２時間インキュベートして収縮させる。次に凝固塊を除去し、１０００ｇで遠心分離して残存する赤血球から血清を分離する。いったん調製された血清は、活性の大きな変化もなく−２０℃で１ヶ月まで保存できるが、新鮮なまま使用することが最も好ましい。すべての操作、希釈およびインキュベートは、２ｍＭグルタミン（ギブコ（ＧＩＢＣＯ、英国）と１０％胎児牛血清（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、英国）を含有するＲＰＭＩ１６４０（ギブコ（ＧＩＢＣＯ、英国）中で行なった。標的細胞（高レベルのＨＬＡ−ＤＲを有するＪＹＢリンパ芽球細胞株）を１ｍＣｉのＮａ⁵¹Ｃｒで室温で１時間（１５分毎に撹拌して）標識する。次に細胞を３回洗浄して放射標識物を除去し、２×１０⁶／ｍｌで再懸濁する。抗体の連続希釈物を、Ｖ底の９６ウェルマイクロタイタープレート（アイシーエヌ／フロー（ＩＣＮ／Ｆｌｏｗ）、英国）に２５μｌで２重に調製する。測定法のバックグランド値を与える標識物の自発的放出を確立するために、培地のみを含有する対照ウェルを調製する。標的⁵¹Ｃｒ標識ＪＹ細胞を、すべてのウェルに１０μｌ添加する。１００％放出値を確立するために、２％トリトンＸ１００を含有するすべてのウェルにも、同数のＪＹ細胞を添加する。標的細胞と抗体を一緒にインキュベートして、室温で１時間後補体源としてすべてのウェル（１００％は除く）に２５μｌの血清を加え、さらに室温で１時間インキュベートする。次に４℃で１００μｌのＥＤＴＡを加えて、さらなる細胞死滅を停止させ、マイクロタイタープレートを２００ｇで遠心分離して、完全な細胞をペレットにして、１００μｌの上澄液を取り、ガンマカウンター中で計測する。すべての値からバックグランド値を引いて細胞の死滅率を計算し、最大放出に対して補正した割合として表す。多重測定の変動は５％未満である。次に細胞溶解の割合を抗体希釈率に対してプロットする。結果Ｃ_H２ドメインのＮ−末端領域（残基２３３〜２３７）のいずれの変化も、ヒト補体を結合するＬ２４３の能力に影響を与えなかった（図１１）。野生型のＩｇＧ１は強力な死滅性を媒介し、６００ｎｇ／ｍｌが最大細胞死滅の半分を与えた（最大の６４％）。ＩｇＧ２とＩｇＧ４は２０μｇ／ｍｌでも細胞を全く死滅させなかった。２３７のＧｌｙからＡｌａへの変化は中程度の死滅を与えた（２ μｇ／ｍｌで最大死滅の２０％）。下部ヒンジ領域のすべてをヒトＩｇＧ２で見いだされる配列と交換しても、２０μｇ／ｍｌでも溶解を引き起こさなかった。ＩｇＧ１の２３５を変更すると、ヒト補体結合に対して予想外に大きな影響を与えた。Ｌｅｕ２３５をＧｌｕに変更すると、補体溶解がなくなった（２０μｇ／ｍｌでの死滅はなかった）。２３５のＡｌａでは低レベルの死滅があった。これに対して、３２０のＬｙｓからＡｌａへの前述のＣ１ｑ結合モチーフの変化［ダンカン・エー・アールとウィンター・ジー（Duncan A R and Winter G）（1988）Nature，332，21.］は、野生型ＩｇＧ１の死滅と全く変化がなかった（６００ｎｇ／ｍｌで最大の細胞死滅の７０％であり、半分の細胞が死滅した）。Ｃ１ｑの直接結合補体介在細胞障害は古典的経路の活性化によるものであることを確認するために、Ｌ２４３の異なる作成抗体変種に対するヒトＣ１ｑの直接結合の測定を確立した。精製したヒトＣ１ｑ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、英国）を、従来法を用いて直接フルオレセンイソシアネート（ＦＩＴＣシグマ）で標識した。すべての希釈、操作およびインキュベートは、０.１％アジ化ナトリウム（ビーディーエィチ（ＢＤＨ）、英国）と５％胎児牛血清（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、英国）を含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ギブコ（ＧＩＢＣＯ、英国）中で行なった。ＲＢポリスチレンチューブ（２０５２１２×７５ｍｍ、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）、英国）中で、４℃で１時間飽和濃度でインキュベートすることにより、５×１０⁴ 指示細胞（高レベルのＨＬＡ−ＤＲを有するＪＹＢリンパ芽球細胞株）を異なる作成抗体でコーティングした。洗浄後、１００μｌ中のＦＩＴＣ標識Ｃ１ｑの連続希釈物を添加し、さらに４℃で３０分間一緒にインキュベートした。洗浄後、蛍光活性化細胞スキャナー（ＦＡＣＳベクトンディッキンソン）を用いて結合を明らかにした。適当な解析の後、平均蛍光強度を抗体濃度に対してプロットした。結果Ｌ２４３ヒトイソタイプシリーズへのヒトＣ１ｑの直接結合は、補体介在細胞障害（図１２）で得られた結果を確認した。標識ヒトＣ１ｑはＪＹ細胞に結合した時、野生型ＩｇＧ１に充分結合し、ＩｇＧ４に弱く結合した。基本的にクラウゼらの記載した方法［Behring Inst．Mitt．87 56(1990)］により平衡解離定数を求め、ＩｇＧ４とＩｇＧ１についてそれぞれ１.２×１０^-7Ｍと１.５×１０^-8 Ｍであった。これらの値は、同様の機能を有するマウスの抗体ＩｇＧ１とＩｇＧ２ａで得られた値によく匹敵する［レザーバローとヅウエック（Leatherbarrow and Dwek）（1984），Molec．Immunol．21，321］。ＩｇＧ１のＬｅｕ２３５からＧｌｕへの変化は、Ｃ１ｑへの結合をＩｇＧ４と同じレベルまで低下させた。これに対して、３２０のＬｙｓからＡｌａへの前述のＣ１ｑ結合モチーフの変化［ダンカン・エー・アールとウィンター・ジー（Duncan A R and WinterG）（19 88）Nature，332，21］は、Ｃ１ｑ結合に対して何の影響も与えなかった。ＩｇＧ４のＬｅｕ２３５からＧｌｕへの変化は野生型結合を変化させなかった。ウサギとモルモット補体補体供給源としてヒトの代わりにウサギまたはモルモット血清を使用すると、Ｇ１［Ｌ２３５Ｅ］およびＧ１［Ｌ２３５Ａ］修飾の挙動は異なっていた。ウサギＣ’では、野生型Ｇ１と同レベルの溶解を引き起こした。モルモットでは、ＩｇＧ１野生型の８０％の死滅に対して、それぞれ４０％と４９％のプラトーレベルの死滅を引き起こした。２３５の変化はヒトの補体へのみ変化を与え、これはウサギとモルモットの補体は、ヒトのＩｇＧ１とは相互作用が異なることを示している（図１３〜１５を参照）。抗体依存性細胞介在細胞障害Ｌ２４３の作成抗体変種のＦｃＲIIIへの結合能を、抗体依存性細胞介在細胞障害（ＡＤＣＣ）を用いて評価した。この実験の原理は、抗体のＦｃが細胞障害能を有するエフェクター細胞を有するＦｃ受容体と相互作用することができるなら、同種の抗原を有する標的細胞の溶解を媒介することである。決定的に重要な相互作用は、抗体Ｆｃと細胞性Ｆｃ受容体の間の相互作用である。各実験でエフェクター細胞は新たに調製される。ヒト静脈血を、エンドトキシンを含まないヘパリン入りチューブに採取する。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、製造業者（ファルマシア（Pharmacia））の指示に従い、密度勾配遠心分離法により調製した。ＰＢＭＣは、２ｍＭのグルタミン（ギブコ（ＧＩＢＣＯ、英国）と１０％胎児牛血清（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、英国）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ（ＧＩＢＣＯ、英国）中（この培地中ですべての操作、希釈およびインキュベートを行う）で１×１０⁷細胞／ｍｌに調製した。標的細胞（高レベルのＨＬＡ−ＤＲを有するＪＹＢリンパ芽球細胞株）を１ｍＣｉのＮａ⁵¹で室温で１時間（１５分毎に撹拌して）標識する。次に細胞を３回洗浄して遊離の放射標識物を除去し、２×１０⁶／ｍｌで再懸濁する。抗体の連続希釈液を、無菌のＵ底９６ウェルマイクロタイタープレート（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）、英国）に２５μｌで２重に調製する。測定法のバックグランド値を与える標識物の自発的放出を確立するために、培地のみを含有する対照ウェルを調製する。標的⁵¹Ｃｒ標識ＪＹ細胞を、すべてのウェルに１０μｌ添加する。１００％放出値を確立するために、水中２％トリトンＸ１００を含有するウェルにも、同数のＪＹ細胞を添加する。標的細胞と抗体を一緒にインキュベートして、室温で３０分後すべてのウェル（１００％は除く）に２５μｌのエフェクター細胞を加え、さらに３７℃で４時間インキュベートする。次に４℃で１００μｌのＥＤＴＡ生理食塩水を加えて、さらなる細胞死滅を停止させ、マイクロタイタープレートを２００ｇで遠心分離して完全な細胞をペレットにして、１００μｌの上澄液を取り、ガンマカウンター中で計測する。すべての値からバックグランド値を引いて細胞の溶解率を計算し、最大放出の割合として表す。多重測定の変動は５％未満である。次に細胞溶解の割合を抗体希釈率に対してブロットする。結果Ｃ_H２ドメインのＮ−末端領域（残基２３３〜２３７）の必ずしもすべての変化が、ＦｃＲIII介在機能に影響を与えなかった（図１６と表５と７）。Ｌ２４３ＩｇＧ２は、１００γ／ｍｌまでの濃度でＨＬＡ−ＤＲ陽性ＪＹリンパ芽球の末梢血単核細胞細胞障害（ＡＤＣＣ）を媒介しなかった。ＩｇＧ４は低レベルのＡＤＣＣ（１γ／ｍｌで最大死滅の２０％）を引き起こし、これはＬｅｕ２３５からＧｌｕへの変更によりなくなった。野生型のＩｇＧ１は細胞死滅の強力なメディエーターであり、５ｎｇ／ｍｌ抗体で５０％細胞死滅を与えた。２３７のＧｌｙからＡｌａへの変化は、ＩｇＧ１野生型による死滅ををＩｇＧ４で見られるレベルまで低下させた。下部ヒンジ領域のすべてをヒトＩｇＧ２で見いだされる配列と交換すると、５０％細胞死滅に５００ｎｇ／ｍｌを必要とする中程度のレベルの死滅を与えた。これに対してＩｇＧ１の２３５の変更は、ＡＤＣＣに対して最小の影響を与えた。Ｌｅｕ２３５をＡｌａに変更すると、Ｇ１野生型に匹敵する死滅のレベル（５０％細胞死滅について９ｎｇ／ｍｌ）であり、Ｌｅｕ２３５のＧｌｕへの変更はＡＤＣＣを少し低下させた（５０％の細胞死滅について４０ｎｇ／ｍｌ）。３２０のＬｙｓからＡｌａへの前述のＣ１ｑ結合モチーフの変化は、ＡＤＣＣを媒介するＩｇＧ１の能力に全く影響を与えなかった。免疫機能エクス・ビボ（ex vivo）のＴ細胞機能実験を行なった（ここでＭＨＣ−IIとＴ細胞受容体の相互作用がＴ細胞活性化に必須の条件である）。Ｌ２４３イソタイプシリーズを混合リンパ球反応（これは未変性および記憶Ｔ細胞活性化の両方を測定する）と、記憶Ｔ細胞応答のみを測定する破傷風トキソイドに対する呼び出し応答で試験した。混合リンパ球反応Ｌ２４３の作成抗体変種の免疫抑制能を、混合リンパ球反応で評価した。この実験の原理は、ある個人の白血球を異なるＨＬＡアレレを発現する別の個人の白血球と混合すると、これらはお互いを異物として認識して活性化されるということである。この活性化は主に、Ｔ細胞上のＣＤ３／ＴｃＲ複合体と抗原提示細胞上のＭＨＣクラスII分子との相互作用に依存する。ＭＨＣ−IIに結合する抗体はこの反応を阻害することは公知である。各実験で白血球は新たに調製される。２人の個人のヒト静脈血を、エンドトキシンを含まないヘパリン入りチューブに採取する。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、製造業者（ファルマシア（Pharmacia））の指示に従い、密度勾配遠心分離法により調製した。ＰＢＭＣは、２ｍＭのグルタミン（ギブコ（ＧＩＢＣＯ、英国）、１００μｇ／ｍｌ／１００μｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（ギブコ（ＧＩＢＣＯ、英国）、および１０％胎児牛血清（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、英国）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ（ＧＩＢＣＯ、英国）中で２ ×１０⁶細胞／ｍｌに調整する。この培地中ですべての操作、希釈およびインキュベートを行なった。１人の個人のＰＢＭＣに３０００ｒａｄの照射を行う。これらの細胞は、他の個人からの応答を刺激する。抗体の連続希釈液を、無菌のＵ底９６ウェルマイクロタイタープレート（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）、英国）に２５μｌで３重に調製する。最大の応答と最大の阻害を確立するために、それぞれ培地のみと最適レベルのシクロスポリン（サンディミュン（Sandimmu n）（登録商標）、サンド（Sandoz））を含有する対照ウェルを調製する。同数の照射刺激物質と応答物質を混合し、各ウェルに１００μｌ添加する。刺激物質のみおよび応答物質のみのウェルも、対照として準備する。実験は３７℃で湿度１００％で５％ＣＯ₂で５日間インキュベートする。１μＣｉ／ウェルの³Ｈ−チミジン（アマーシャム（Amersham）、英国）とインキュベートして、ガラスフィルターマット上で採取して、ベータカウンターを用いて計測して、最後の１８時間の培養中の増幅を評価することにより、応答を測定する。抗体濃度に対するＣＰＭとして結果をプロットする。多重測定の変動は１０％未満である。破傷風トキソイドに対するＴ細胞呼び出し応答２次応答を抑制するＬ２４３の作成抗体変種の能力を、破傷風トキソイドに対する呼び出し応答を用いて評価した。この実験の原理は、あらかじめ破傷風トキソイド（ＴＴ）で免疫したある個人のＴ細胞は、エクス・ビボ（ex vivo）で再暴露するとＴＴに応答することである。この活性化は、Ｔ細胞上のＣＤ３／ＴｃＲ複合体と、抗原を有しこれを提示する細胞上のＭＨＣ−II分子との相互作用に依存する。ＭＨＣ−IIに結合する抗体はこの反応を阻害することは公知である。各実験でリンパ球は新たに調製される。ヒト静脈血を、エンドトキシンを含まないヘパリン入りチューブに採取する。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、製造業者（ファルマシア（Pharmacia））の指示に従い、密度勾配遠心分離法により調製した。ＰＢＭＣは、２ｍＭのグルタミン（ギブコ（ＧＩＢＣＯ、英国）、１００μｇ／ｍｌ／１００μｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（ギブコ（ＧＩＢＣＯ、英国）、および１０％胎児牛血清（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、英国）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ（ＧＩＢＣＯ、英国）中、すべての操作、希釈およびインキュベートを行なった。この培地中で２×１０⁶細胞／ｍｌに調整する。抗体の連続希釈液を、無菌のＵ底９６ウェルマイクロタイタープレート（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）、英国）に１００μｌで３重に調製する。あらかじめ実験で決定した最適濃度のＴＴを含有する５０μｌをすべてのウェルに添加する。最大の応答と最大の阻害を確立するために、それぞれ培地のみと最適レベルのシクロスポリン（サンディミュン（Sandimmun）（登録商標）、サンド（Sandoz））（１００ｎＭ）を含有する対照ウェルを調製する。次に５０μｌのＰＢＭＣを各ウェルに加える。実験は３７℃で湿度１００％で５％ＣＯ₂で７日間インキュベートする。１μＣｉ／ウェルの³Ｈ−チミジンとインキュベートして、ガラスフィルターマット上で採取して、ベータカウンターを用いて計測して、最後の１８時間の培養中の増幅を評価することにより、応答を測定する。抗体濃度に対するＣＰＭとして結果をブロットする。多重測定の変動は１０％未満である。結果（図１７−２１）ＭＬＲとＴＴ応答の間のＬ２４３ヒトイソタイプシリーズの効果の間に有意のまたは定性的な差はなかった。最大阻害率は、Ｇ１、Ｇ１［Ｌ２３５Ｅ］およびＧ１［Ｌ２３５Ａ］で達成された。同様の阻害率を得るために、約２桁多いＧ２、Ｇ４およびＧ１［Ｌ２３５Ａ］が必要であった。Ｇ１／Ｇ２Ｌヒンジ交換突然変異体は、中程度の免疫抑制能であった。補体結合またはＦｃＲＩ結合と免疫抑制の間に相関はなく、Ｇ１はＦｃＲＩに充分結合し補体結合したが、Ｇ１［Ｌ２３５Ｅ］はいずれの作用もなかった。しかしいずれも良好な免疫抑制能を示した。しかし、ＦｃＲIII結合との間には良好な相関があった。ヒトＧ１とＧ１［Ｌ２３５Ｅ］はＦｃＲIIIと相互作用し、良好な免疫抑制を示す。Ｇ１／Ｇ２Ｌヒンジは、中程度のＦｃＲIII結合と免疫抑制を示した。これに対して、ヒトＧ１のＧ２３７Ａ突然変異は、報告されている観察結果と一致してＦｃＲIII結合能を低下させる。この抗体は免疫抑制能は小さかった（表５）。表６は、いくつかのＬ２４３イソタイプ突然変異体を示す。結論本発明者らは、抗ＨＬＡＤＲ抗体Ｌ２４３をベースにした作成抗体の適合セットを用いて、ヒトＩｇＧ１のＣ１ｑとＦｃＲ結合に必要なアミノ酸残基は、Ｃ_H ２ドメインのＮ−末端領域（残基２３１〜２３８）に位置することを見いだした。ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のＣ_H２ドメインのロイシン２３５をグルタミン酸に変化させると、ＦｃＲＩ結合能がなくなることはすでに公知であるが、本発明者らはこれを確認し、また同時に、ＦｃＲIII介在機能を保持したままヒト補体結合能がなくなることを見いだした。ＩｇＧ１の２３７のグリシンをアラニンに変化させると、またＦｃＲＩ結合能がなくなり、補体結合能とＦｃＲIII介在機能が低下した。２３３〜２３６の全領域を、ヒトＩｇＧ２中の配列で交換すると、ＦｃＲＩ結合能と補体結合能がなくなり、ＩｇＧ１のＦｃＲIII介在機能が低下した。これに対して、前述のＣ１ｑ結合モチーフを３２０のリジンをアラニンに変化させても、ＩｇＧ１介在補体結合には何の影響も与えなかった。ＩｇＧ１の変化のＦｃＲＩ結合への影響は、ＩｇＧ３やＩｇＧ４を用いて得られた報告された観察結果、つまり下部ヒンジ／Ｎ−末端Ｃ_H２領域の２３５と２３７の変化はＦｃＲＩ結合能を著しく低下させる［ルンド・ジェイ（Lund J）ら、J Immunol，1991．147，265：そしてアレグレ・エム・エル（A1egre，M-L）ら、Ｊ．Immunol．1992．148，3461］と同じである。これらのイソタイプ間の類似性は、これらが同様の方法でＦｃＲＩと相互作用することを強く示唆する。本発明者らは、Ｃ_H２領域の下部ヒンジ／Ｎ−末端内に、ヒトＩｇＧ１のＦｃＲIII結合に必要な残基を見いだした。２３７を修飾し下部ヒンジをＩｇＧ２残基で交換すると、それぞれ低および中程度のＦｃＲIII介在死滅を引き起こした。これらの作用は、ヒトＩｇＧ３についてサーメイ（Sarmay）らが報告したもの［Molec．Immunol．1992．29，633］と同様である。ＩｇＧ３を用いるサーメイらの方法に対して、ＩｇＧ１の残基２３５での本発明者らの変化はＦｃＲIII介在機能に対してほとんど影響を与えなかった。グリーンウッド（Greenwood）ら［Eur．J．Immunol．1993．23，1098］は、ＩｇＧ１とＩｇＧ４の間のドメイン内およびドメイン間のスイッチ変種を用いて、２９２を越えるＣ_H２ドメインのＣ−末端中でＦｃＲIII結合に必要なＩｇＧ１内の残基を同定している。これは、Ｃ_H２領域の下部ヒンジ／Ｎ−末端内に本発明者らが同定した残基は、ヒトＩｇＧ１の結合を経由して介在されるＦｃＲIIIエフェクター機能に必要であるが、充分ではないことを示している。２３５が変化したＩｇＧ１変種は、ヒト補体による溶解を媒介せず、精製したヒトＣ１ｑに結合しなかった。本発明者らはまた、３２０が変化したＩｇＧ１分子は、ＩｇＧ１野生型と同等の補体介在死滅を与えることを見いだした。残基Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０およびＬｙｓ３２２は、蛋白工学的研究によりマウスＩｇＧ２ｂでＣ１ｑ結合に必要であることが証明された［ダンカン・エー・アールとウィンター・ジー（Duncan A R andWinter G），Nature，1988．332，21］。同じ研究でまた、マウスＩｇＧ２ｂの２３５の変化はヒトＣ１ｑに対する親和性に対して影響を与えないことが証明された［ダンカン・エー・アールとウィンター・ジー（Duncan A R and Winter G），Nature，1988．332，21］。これらの観察結果の見かけの矛盾は、おそらくヒトＩｇＧ１とマウスＩｇＧ２ｂの間のＣ１ｑ接触の差によるものであろう。本発明者らは、Ｃ_H２ドメインの下部ヒンジ／Ｎ−末端のほとんどの変化はＣ１ｑ結合に影響を与えることを見いだした。Ｇ１／Ｇ２下部ヒンジ交換は補体結合能をなくし、２３７の変化はまたこれを有意に低下させる。これに対して、グリーンウッド（Greenwood）ら［Eur．J．Immunol．1993．23，1098］は、Ｃ_H２ドメインのＣ−末端側半分にヒト補体結合に必要な残基を見いだした。タオ（Ta o）ら［J．Exp．Med．1993，178，661］はまた、Ｃ_H２ドメインのＣ−末端側半分が補体結合に必要であることを見いだしている。彼らはまた、Ｃ１ｑ結合を補体介在溶解から分離することが可能である。Ｃ_H２ドメインのＣ−末端側半分中の３３１がＰｒｏからＳｅｒへ変化したＩｇＧ１はまた、野生型と同様にヒトＣ１ｑに結合できるが、補体を活性化することは不可能である。これは、Ｃ_H ２領域の下部ヒンジ／Ｎ−末端内で本発明者らが同定したアミノ酸が、Ｃ１ｑ結合に必要であること、そしてＣ−末端残基が、Ｃ１ｑを越える抗体依存性補体カスケードの結合と活性化に必要であることを予測している。実施例３Ｌ２４３は、ヒトＭＨＣクラスIIに対するマウスモノクローナル抗体である。Ｌ２４３のＶｌとＶｈのヌクレオチド配列とアミノ酸配列は、それぞれ図５と３に示す。以下の実施例は、Ｌ２４３抗体のヒト化（ＣＤＲ移植）を説明する。Ｌ２４３軽鎖のＣＤＲ移植Ｌ２４３軽鎖の枠組み構造領域をヒト軽鎖サブグループと整列させる［カバト・イー・エー、ウー・ティー・ティー、ペリー・エィチ・エム、ゴッテスマン・ケー・エスおよびフォエラー・シー（Kabat，E.A.，Wu，T.T.，Perry H.M.，Got tesman K.S.，and FoellerC.），1991、免疫学的興味のある蛋白の配列（Sequen ces of Proteins of Immunological interest）第５版］と、Ｌ２４３はヒト軽鎖のサブグループ１に最も相同性が高いことが明らかになった。従ってＣＤＲ移植軽鎖を作成するために、選択した枠組み構造領域はヒトグループ１コンセンサス配列の枠組み構造領域に対応する。Ｌ２４３とコンセンサスヒトグループ１軽鎖との枠組み構造領域のアミノ酸配列の比較は以下に示されており、２つの配列の間に２１の差（下線）があることを示している。抗原結合に対するこれらの枠組み構造の差が与える寄与を解析（公開国際特許出願ＷＯ91/09967号を参照）すると、研究のために４つの残基が同定された：これらは４５、４９、７０および７１位である。この解析に基づき、２つのＣＤＲ移植軽鎖を作成した。この最初のもの（Ｌ２４３−ｇＬ１）では、残基４５、４９、７０および７１がＬ２４３軽鎖由来であり、第２のもの（Ｌ２４３−ｇＬ２）では、すべての残基はヒトコンセンサスである。軽鎖比較ＣＤＲ移植軽鎖Ｌ２４３−ｇＬ１の作成Ｌ２４３−ｇＬ１の作成を以下に詳述する。キメラ軽鎖の枠組み構造領域に変更を導入するために、以下のオリゴヌクレオチドをポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）に使用した：それぞれ、１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８.３、１.５ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＫＣｌ、０.０１％ｗ／ｖゼラチン、０.２５ｍＭの各デオキシリボヌクレオシド三リン酸、０.１μｇのキメラＬ２４３軽鎖ＤＮＡ、６ピコモルのＲ５０４３／Ｒ５０４４、またはＲ５０４５／Ｒ５０４６、またはＲ５０４７／Ｒ５０４８、および０.２５単位のＴａｑポリメラーゼを含有する、各２０μｌの３つの反応物を準備した。反応物を９４℃で１分間、５５℃で１分間そして７２℃で１分間でサイクルさせた。３０サイクル行なった後、反応物をアガロースゲルで電気泳動し、ＰＣＲ断片をゲルから切り出し、「マーメイド」（”Mermaid”）キットを用いて回収した。これらの一定分量に第２回目のＰＣＲを行なった。反応物１００μｌは、１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８.３、１.５ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＫＣｌ、０.０１％ｗ／ｖゼラチン、第１回目の反応からの３つのＰＣＲ断片のそれぞれの１／１０、およびＲ５０４３とＲ５０４８を各３０ピコモル、そして２.５単位のＴａｑポリメラーゼを含有していた。反応温度は前述の通りである。ＰＣＲ後、混合物をフェノール／クロロホルム、次にクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。エタノール沈殿物を遠心分離により回収し、適当な緩衝液に溶解し、ＢｓｔＥIIとＳｐIIで切断した。得られた生成物を最後にアガロースゲルで電気泳動し、２７０塩基対のＤＮＡ断片をゲルスライスから回収し、あらかじめ同じ酵素で消化したベクターｐＭＲ１５.１（図１）に結合させた。結合混合物を使用して大腸菌ＬＭ１０３５を形質転換し、得られたコロニーをＰＣＲで解析し制限酵素で消化し、そしてヌクレオチド配列決定を行なった。Ｌ２４３−ｇＬ１のＶｌ領域のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を図２２に示す。ＣＤＲ移植軽鎖Ｌ２４３−ｇＬ２の作成ＰＣＲを利用してＬ２４３−ｇＬ１からＬ２４３−ｇＬ２を作成した。アミノ酸の変更を導入するために、以下のオリゴヌクレオチドを使用した：１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８３、１.５ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＫＣｌ、０ .０１％ｗ／ｖゼラチン、０.２５ｍＭの各デオキシリボヌクレオシド三リン酸、０.１μｇのＬ２４３−ｇＬ１、６ピコモルのＲ１０５３／Ｒ５３５０またはＲ５３４９／Ｒ６８４、および０.２５単位のＴａｑポリメラーゼを含有する、各２０μｌの２つの反応物を準備した。反応物を９４℃で１分間、５５℃で１分間そして７２℃で１分間でサイクルさせた。３０サイクル後、反応物をアガロースゲルで電気泳動し、ＰＣＲ断片をゲルから切り出し、「マーメイド」（”Mermai d”）キットを用いて回収した。これらの一定分量に第２回目のＰＣＲを行なった。反応物１００μｌは、１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８.３、１.５ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＫＣｌ、０.０１％ｗ／ｖゼラチン、第１回目の反応からのＰＣＲ断片のそれぞれの１／５、およびＲ１０５３とＲ６８４を各３０ピコモル、そして２.５単位のＴａｑポリメラーゼを含有していた。反応温度は前述の通りである。ＰＣＲ後、反応物をフェノール／クロロホルム、次にクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。エタノール沈殿物を遠心分離により回収し、適当な緩衝液に溶解し、ＢｓｔＥIIとＳｐIIで切断した。得られた生成物を最後にアガロースゲルで電気泳動し、２７０塩基対のＤＮＡ断片をゲルスライスから回収し、あらかじめ同じ酵素で消化したベクターｐＭＲ１５.１（図１）に結合させた。結合混合物を使用して大腸菌ＬＭ１０３５を形質転換し、得られたコロニーをＰＣＲで解析し制限酵素で消化し、そしてヌクレオチド配列決定を行なった。Ｌ２４３−ｇＬ２のＶｌ領域のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を図２３に示す。Ｌ２４３重鎖のＣＤＲ移植軽鎖について記載した方法と同じ方法を用いて、Ｌ２４３重鎖のＣＤＲ移植を行なった。Ｌ２４３重鎖は、サブグループ１に属するヒト重鎖に最も相同性が高いことが明らかになり、従ってＬ２４３重鎖ＣＤＲを受け入れるために、ヒトサブグループ１枠組み構造のコンセンサス配列を選択した。２つの構造の枠組み構造領域の比較を以下に示す。ここで、Ｌ２４３はヒトコンセンサスとは２８個の位置（下線）で異なることがわかる。抗原結合に対してこれらが与える寄与を解析すると、ＣＤＲ移植重鎖であるＬ２４３−ｇＨでは、２７、６７、６９、７１、７２および７５の残基のみが保持されていた。重鎖比較ＣＤＲ移稙重鎖Ｌ２４３ｇＨの作成適当なプライマーの存在下で、重複するオリゴヌクレオチドをＰＣＲに付してＬ２４３ｇＨを組み立てた。ＰＣＲには以下のオリゴヌクレオチドを使用した：組立反応物（５０μｌ）は、１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８.３、１.５ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＫＣｌ、０.０１％ｗ／ｖゼラチン、０.２５ｍＭの各デオキシリボヌクレオシド三リン酸、１ピコモルの各Ｒ４８９７〜Ｒ４９０５、１０ピコモルの各Ｒ３００４とＲ３００５、および２.５単位のＴａｑポリメラーゼを含有していた。反応物を９４℃で１分間、５５℃で１分間そして７２℃で１分間でサイクルさせた。３０サイクル後、反応物をフェノール／クロロホルム（１／１）、次にクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。遠心分離後、ＤＮＡを適当な切断緩衝液に溶解し、ＨｉｎｄIIIとＡｐａ１で消化した。得られた断片をアガロースゲルから回収し、あらかじめ同じ酵素で消化したベクターｐＭＲ１４（図２）に結合させた。ｐＭＲ１４はヒトガンマ４重鎖定常領域を含有し、従ってこのベクターにより発現される重鎖はガンマ４イソタイプである。結合混合物を使用して大腸菌ＬＭ１０３５を形質転換し、得られた細菌コロニーを制限消化によりスクリーニングし、そしてヌクレオチド配列決定を行なった。こうしてＬ２４３ｇＨの正しい配列を含有するプラスミドが同定された（図２４）。ガンマ１型のキメラおよびＣＤＲ移植Ｌ２４３重鎖の作成マウスおよびＣＤＲ移植重鎖の可変領域をＨｉｎｄIIIからＡｐａ１への断片として、ベクターｐＧａｍｍａ１（図６）に移すことにより、ヒトガンマ１型のＬ２４３重鎖を作成した。このベクターは、ヒトガンマ１重鎖定常領域を有する。ＣＤＲ移植遺伝子の活性の評価ＣＤＲ移植遺伝子の活性は、これらを哺乳動物中で発現させ、新たに合成された抗体を精製し定量することにより評価した。この方法は後述し、それに引き続き抗体の生化学的性状解析に使用される生化学的および細胞ベースの測定法を記載する。ａ）ＣＨＯ細胞中の遺伝子発現キメラＬ２４３の産生について前述したように、リン酸カルシウム沈殿法を用いてチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中に同時トランスフェクションした後、重鎖および軽鎖対の一時的トランスフェクションにより、生物学的評価のためのキメラおよびＣＤＲ移植Ｌ２４３を産生した。抗体濃度は、ヒト免疫グロブリンＥＬＩＳＡ（下記）を用いて定量した。ｂ）ＥＬＩＳＡＥＬＩＳＡのために、ヌンク（Nunc）のＥＬＩＳＡプレートをーティング緩衝液（１５ｍＭ炭酸ナトリウム、３５ｍＭ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ６.９）中５ μｇ／ｍｌのポリクローナルヤギ抗ヒトＦｃ断片特異抗体（ジャクソン・イムノリサーチ（Jackson Immuno-research）、コード109-006-098）のＦ（ａｂ）₂断片で、４℃で一晩コーティングした。コーティングしなかった抗体は、蒸留水で５回洗浄することにより除去した。定量する試料と標準物質を、結合緩衝液（０ .１Ｍトリス−塩酸、ｐＨ７.０）０.１ＭＮａＣｌ、０.２％ｖ／ｖツイーン２０、０.２％ｗ／ｖハマーステン（Hammersten）カゼイン）中約１μｇ／ｍｌに希釈した。マイクロタイターウェル中で試料を連続２倍希釈して各ウェルの最終液量を０.１ｍｌとして、プレートを激しく撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。最初のインキュベート後プレートを蒸留水で１０回洗浄し、次に結合緩衝液中７００倍希釈のマウスモノクローナル抗ヒトカッパ（クローンＧＤ１２）ペルオキシダーゼ結合抗体（ザ・バインディング・サイト（The Binding Site ）、コードＭＰ１３５）０.１ｍｌで前と同じように１時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、基質溶液（０.１ｍｌ）を各ウェルに加えた。基質溶液は、１０ｍｌの０.１Ｍ酢酸ナトリウム／クエン酸ナトリウム、ｐＨ６.０中１５０μｌのＮ,Ｎ,Ｎ,Ｎ−テトラメチルベンジジン（ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍｌ）、１５０μｌの過酸化水素（３０％溶液）を含有する。初めの標準物質の６３０ｎｍの吸光度が約１.０になるまで、プレートを５〜１０分間発色させた。６３０ｎｍの吸光度はプレートリーダーを用いて測定し、試料の濃度は標準物質の力価曲線と比較して求めた。ｃ）競合測定法本測定法の原理は、抗原結合領域がマウスからヒト枠組み構造に正しく移行したなら、ヒトＭＨＣクラスIIへの結合に対して、ＣＤＲ移植抗体は標識キメラ抗体と等しく競合するということである。この系で抗原結合能の変化があれば明らかになるであろう。ウッド（Wood）らの方法［ウッド・ティー、トンプソン・エスおよびゴールドスタイン・ジー（Wood，Ｔ.，Thompson，S and Goldstein，G）、1965，J．Immu nol 95，225-229］を用いて、キメラＬ２４３をフルオレセン（ＦＩＴＣ）で標識し、前述の競合測定法に使用した。図２５は、ＪＹ細胞への結合に対してＦＩＴＣ標識キメラＬ２４３と競合する、Ｌ２４３重鎖および軽鎖のすべての組合せの能力を比較している。すべての組合せは有効な競合物質であるが、ＣＤＲ移植重鎖または軽鎖を含有するものはいずれもキメラ抗体自身ほど有効ではなかった。すなわち、本測定法で組合せｃＨ／ｇＬ１、ｇＨ／ｃＬおよびｇＨ／ｇＬ１は、キメラＬ２４３に対してそれぞれ８９％、７８％および６４％の有効性であった。ｄ）スキャチャード（Scatchard）解析による親和性定数の決定Ｌ２４３抗体を、ＰＢＳ、５％胎児牛血清、０.１％アジ化ナトリウム中１０ μｇ／ｍｌから連続１.５倍希釈（各１５０μｌ）してから、測定点当たり５× １０⁴個のＪＹ細胞と氷上で１時間インキュベートした。あらかじめ細胞を数え、洗浄し、試料と同じ緩衝液に再懸濁した。インキュベート後細胞を前記培地５ｍｌで洗浄し、遠心分離し、上清液を廃棄した。結合した抗体は、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＦｃモノクローナル（ザ・バインディング・サイト（The Binding Site）、コードＭＦ００１）の１／１００希釈液１００μｌを添加して、明らかにした。次に細胞を氷の上で１時間インキュベートし、前述のように過剰のＦＩＴＣ結合体を洗浄して除去した。同じ緩衝液２５０μｌ中に細胞を分散し、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトンディッキンソン）を用いて、細胞当たりの平均蛍光強度を測定し、標準ビーズ（フロー・サイトメトリー・スタンダード社（ Flow Cytometry standards Corporation））を用いて較正した。こうして各細胞濃度で、細胞当たり結合した抗体の分子数を求め、スキャチャードプロットを作成するのに使用した。計算のために、Ｌ２４３に対するＦＩＴＣ結合体の結合価は１：１であると仮定し、Ｆ／Ｐは３.３６であった（製造業者の提供による）。キメラＬ２４３（ｃＨ／ｃＬ）、Ｌ２４３−ｇＨ／Ｌ２４３−ｇＬ１およびＬ２４３ｇＨ／Ｌ２４３−ｇＬ２の親和性を比較するスキャチャードプロットを、図２６に示す。キメラＬ２４３の見かけのＫｄは４.１ｎＭであり、ｇＬ１とｇＬ２軽鎖を含有するＣＤＲ移植抗体の見かけのＫｄは、それぞれ６.４ｎＭと９. ６ｎＭであった。２つのＣＤＲ移植軽鎖を有する抗体のＫｄ値の差は、親軽鎖からＬ２４３−ｇＬ１に保持された残基４５、４９、７０および７１の寄与を反映している。ｅ）抗体依存性細胞介在細胞障害抗体依存性細胞介在細胞障害（ＡＤＣＣ）を媒介するキメラとＣＤＲ移植Ｌ２４３の能力を、前述のように比較した。この実験の原理は、抗体のＦｃが、細胞障害が可能なエフェクター細胞を有するＦｃ受容体と相互作用することができるなら、抗体は同種の抗原を有する標的細胞の溶解を媒介することである。前記測定法でのキメラ（ｃＨ／ｃＬ）とＣＤＲ移植（ｇＨ／ｇＬ１）Ｌ２４３ヒトガンマ１イソタイプの活性の比較を、図２７に示す。両抗体とも細胞溶解の有効なメディエータであり、最大活性は、１００ｎｇ／ｍｌ未満の抗体濃度で達成される。２つの抗体の活性の間に有意な差はなかった。ｆ）免疫機能試験エクス・ビボ（ex vivo）Ｔ細胞機能実験を行った（ここでＭＨＣ−IIとＴ細胞受容体の間の相互作用は、Ｔ細胞活性化の必須要件であった）。キメラとＣＤＲ移植Ｌ２４３抗体を、混合リンパ球反応（これは未変性および記憶Ｔ細胞活性化を測定する）と破傷風トキソイドに対する呼び出し応答（これは記憶Ｔ細胞応答のみを測定する）で比較した。１）混合リンパ球反応（前述記載）この実験の原理は、ある個人の白血球を異なるＨＬＡアレレを発現する別の個人の白血球と混合すると、これらはお互いを異物として認識して活性化されるということである。この活性化は主に、Ｔ細胞上のＣＤ３／ＴｃＲ複合体と抗原提示細胞上のＭＨＣクラスII分子との相互作用に依存する。Ｌ２４３はこの反応を阻害することが知られている。Ｔ細胞活性化の阻害物質としてキメラとＣＤＲ移植Ｌ２４３のガンマ１イソタイプの有効性を比較するためにＭＬＲを行っても、２つの抗体の間には有意な差は観察されなかった（図２８）。いずれの抗体も１００ｎｇ／ｍｌを用いて、９０％以上のＭＬＲの阻害が観察された。２）破傷風トキソイドに対するＴ細胞呼び出し応答２次応答を抑制するキメラおよびＣＤＲ移植Ｌ２４３の能力を、破傷風毒素に対する呼び出し応答を用いて評価した。実験の原理は前述の通りである。ＴＴへの呼び出し応答を阻害する、キメラおよびＣＤＲ移植Ｌ２４３のヒトガンマ１イソタイプの能力を比較する実験の結果を、図２９に示す。両抗体ともＴＴへのＴ細胞応答の有効な阻害物質であり、区別できない力価曲線を与えた。実施例４２３５位が変化したＣＤＲ移植Ｌ２４３、すなわち、Ｌ［２３５Ｅ］が抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を媒介する能力は、基本的に前述の実施例に記載のように測定した。その結果を図２７に示す。同様に基本的に前述の実施例に記載のように、ＣＤＲ移植Ｌ２４３［Ｌ２３５Ｅ］を混合リンパ球反応と破傷風トキソイドへの呼び出し応答で試験した。その結果を図２８と２９に示す。前述の実施例に記載のように抗体依存性補体介在細胞障害を用いて、ヒト補体を結合するＣＤＲ移植Ｌ２４３抗体［Ｌ２３５Ｅ］の能力を評価した。その結果を図３０に示す。Detailed Description of the Invention antibody Field of the invention The present invention provides modified antibodies, pharmaceutical compositions containing the antibodies, therapeutic compositions and And diagnostic composition; method for preparing the composition; therapeutic method and diagnostic method using the antibody A method for regulating the function of a cell surface-associated antigen using the antibody; DN encoding the antibody A sequence; cloning and expression vector containing a DNA sequence encoding the antibody Host cell transformed with the vector, and a method for preparing the antibody .Background of the Invention Antibodies need to be therapeutically effective without causing significant toxic effects It preferably exhibits a physiological effect. Such toxic effects are associated with, for example, complement fixation. More mediated. Antibodies that bind to the cognate antigen bind to the complement cascade It can be activated. Complement consists of a complex series of proteins. Complement system Proteins of two types are related to each other by two enzymatic cascades (called the classical pathway and the alternative pathway). , Provide two pathways leading to C3 cleavage, a central reaction of the complement system) It The order of reactions consisting of the classical complement pathway is: recognition, enzyme activation, and membrane attack. And lead to cell death. The recognition unit of the complement system is the C1 complex. C1 complement protein The white complex is a unique feature of the classical complement cascade leading to C3 conversion. C Complement binding occurs when the 1q subcomponent binds directly to the immunoglobulin-antigen immune complex It Whether complement fixation occurs depends on several constraints. For example, immunoglob Only certain subclasses of Brin can bind complement under optimal conditions. These are IgG1, IgG3 and IgM in humans and mouse Are IgG2a, IgG2b and IgM. The C1q molecule has a multivalent ability to bind to the complement binding site of immunoglobulins. Have. IgG C_H2 domains and possibly C of IgM_H4 domains move to C1q Has a binding site of. Fc-bearing cells also bind to target cells coated with the relevant class of antibody , By opsonizing, phagocytosing or killing it, the effect of immune response is increased. Play a strong role. For rodent and human leukocytes, three IgG binding receptors The container (FcγR) is described. FcγRI is strong against monomer IgG Have high affinity, FcγRII and FcγRIII have affinity for monomer IgG Is weak and mainly interacts with IgG complexed with the antigen. Existence of Fc receptors Resident in these immune cells, many effectors are important in the effector phase of the humoral response. -Gives the ability to mediate mechanisms. The gamma 1 isotype of human IgG binds to FcRI like IgG3 and When it forms a complex with the allogeneic antigen of, it activates complement and binds to FcRII and FcRIII. To meet. On the contrary, human IgG2 and IgG4 are relatively inactive isotypes. Neither activates the classical complement pathway, and IgG4 binds FcRI weakly [ Burton, D R and Woof, J M), (1992), Adv. Immunol. 51, 1. Rukisano Balim Ym and Ra Kuman P. Jay (Lucisano Valim, Y M and Lachmann, P J. (1991), C lin. exp. Immunol. 84, 1]. C of human IgG_HAmino acid residues of IgG that interact with FcRI in two domains Is well established [Woof, J M, et al. (1986 ) Molec. Immunol. 23,319. Lund J et al. (1991) J Immunol, 147, 2657; Canfield S.M. and Morrison S.L. (Canfie1d , S M and Morrison, S L) (1991), J. exp. Med. 173, 1483; Chapel et Chappel, SM et al. (1991) Proc. Natl. Acd. Sci. 88, 9036; Chape Chappel, SM et al. (1993), J. Am. Biol. Chem268, 25124; Alegre, M-L et al. (1992) J. Immunol. 148, 3461]. FcR C of antibodies of different species and subclasses that bind well to I_H2 domain amino acids A sequence comparison is made of the C consisting of residues Leu234-Ser239._HN-terminal region of 2 Use the EU numbering system of Kabat (Kabat, EA ) Et al. (1987), Sequences of proteins of Imm unological interest), US Department of Health and Hugh Man Services (US Dept. of Health and Human Services), Bethesda (B ethesda), Maryland, USA] are critical for interaction with FcRI Was suggested. All IgG antibodies with a strong affinity for FcRI For sotypes, the motifs Leu234, Leu235, Gly236, Gly2 37, Pro238, Ser239 exist [Woof, J M) et al. (1986) Molec. Immunol. 23, 319]. Has different Fc effector functions C to FcRI binding by exchanging domains between immunoglobulins_H2 ( Especially, the importance of residue 235) was proved [Canfield S. M. and Mori Son S. El (Canfield, SM and Morrison, SL) (1991), J. exp. Med ． 173, 1483; Chappel, SM, et al. (1991) Proc. Natl. A cd. Sci. 88, 9036; Chappel, SM et al. (1993), J. Am. Bi ol. Chem268, 25124]. Substitution of the Leu residue at position 235 with Glu results in FcRI The affinity of IgG3 for IgG is reduced 100-fold [Lund J et al. 1991) J Immunol, 147, 2657; Canfield S. M. and Morrison S. Elle (Canfield, SM and Morrison, SL) (1991), J. exp. Med. 173,148 3]. Same change from Leu235 to Glu in the IgG4 variant of OKT3 [ Alegre, M-L et al. (1992) J. Immunol. 148, 3461], There is no FcRI binding and therefore its mitogenicity lost. The sequence requirements for FcRIII binding have been poorly studied, but Sarmay et al. [(1992) Molec. Immunol. 29,633] are all three Fc The binding of IgG3 to the receptor requires C_HResidues 2434-237 of the two domains are important Proved that there is. The relative importance of each residue is different for each Fc receptor, and FcRII 235 and 237 are the most important for I-mediated cell killing. In contrast, another Fc-mediated function, C1q binding and subsequent complement activation Is C_HIt seems to require the carboxy-terminal half of the two domains [Tao Michi, Canfield S. M. and Morrison S. L. (Ta O, M H., Canfield, S M., and Morrison, S L) (1991) J. Exp. Med. 173, 10 twenty five]. Morrison's group is the C of human IgG_HTwo-domain polymorphism Sequence analysis of sex_HThe importance of the C-terminal region of 2 was demonstrated. IgG1 3 By changing Pro at position 31 to Ser, they abolished complement binding and C1q binding. The ability was reduced [Tao, J H, et al. (1993), J. Exp. Med. 1 78, 661]. Interdomain and intradomain switch variants of CAMPATH-1 Using Greenwood et al. (1993) [Eur. J. Immunol. 23, 1098 ] Is further C_HWe supported the importance of the C-terminus of 2. N-terminal half or other Not C, just C_HComplement binding to human IgG4 by the carboxy terminus of 2 Noh is restored. Duncan and Winter (1988) [Natur e, 332, 21] are mouse IgG2b isotypes Glu318, Lys320 and Lys320. And the Lys322 motif was identified. Change any of these residues And C1q binding as in the case of using competitive peptides of sequences in this region. Noh has disappeared. However, even in an antibody that does not fix complement, the C1q motif residue As found, these residues may be necessary but not sufficient for complement activation. It suggests something unknown. The present inventors have created an antibody (eng) based on the anti-HLA DR antibody L243. C of human IgG1 using a matched set of ineered antibody) The amino acid residues required for 1q and FcR binding are C_HN-terminal of 2 domain It was found to be in the region (residues 231-238). IgG3 and I gG4 C_HChanging leucine 235 in the 2 region to glutamic acid resulted in FcRI binding. Although it is already known that the incompatibility is lost, the present inventors have found that The fact that the human complement-fixing ability is lost at the same time, but the FcRIII-mediated function is retained I was confirmed. Also, the glycine at position 237 of IgG1 was changed to alanine. However, the ability to bind FcRI was lost, and the ability to fix complement and the FcRIII-mediated function were reduced. Replacing the entire region of 233-236 with the sequence present in human IgG2 results in IgG 1 lost the FcRI binding ability and the complement binding ability, and the FcRIII-mediated function was reduced. On the other hand, in the above-mentioned C1q binding motif, the lysine at position 320 was replaced with alanine. Was not affected by IgG1 mediated complement fixation. Sites described Leu234-Leu235-Gly236-Gly237- Pro238-Ser239 shows all Igs with a strong affinity for FcγRI. Present in the G isotype. Recent mutagenesis experiments on IgG3 antibody Thus, a point mutation was introduced in this region so that the mutant binds FcTRI. Is being tested [Lund et al. (1991) J Immunol , 147, 2657-2662]. The most prominent effect is seen at position 235, which is a naturally occurring Le Substitution of Glu residue for u residue decreased affinity to FcγRI by 100 times or more An immunoglobulin is obtained. Our observations on the effect of modification of residue 235 on the ability of the antibody to fix complement Is quite amazing. In previous protein engineering studies, C1 on IgG was Mutations were introduced at various positions to find the q-binding site [Duncan and Winter (Duncan and W inter) (1988) Nature, 332, 738-740]. The binding site of C1q is mouse IgG Two side chains of the isotype of 2b (Glu318, Lys320 and Lys32 It was localized in 2). Residues Glu318, Lys320 and Lys322 are All human IgG, rat IgG2b and IgG2c, mouse IgG2a, Conserved in IgG2b and IgG3, guinea pig IgG1 and rabbit IgG ing. In a further experiment, a mouse IgG2b antibody mutation in which residue 235 was mutated The affinity of human C1q for the body does not change (ie values in the same range as wild type) Has been proved. As observed by the present inventors, IgG C_HModification of residue 235 in region 2 results in F cγRI binding ability is lost, but at the same time, complement binding ability is substantially reduced. Was not reported or suggested anywhere and was totally unexpected.Summary of the Invention The present invention provides the ability of an antibody to fix complement as compared to an unaltered antibody. C of the antibody, characterized in that_H1 of the N-terminal region of 2 domains A modified antibody in which one or more amino acid residues are modified Administration of antibody-mediated complement fixation, which results in unfavorable toxicity of antibody therapy. A method of treating a given disease is provided. In a preferred embodiment, the modified antibody comprises one or more cellular Fc receptors. , Especially FcRIII, with the exception of FcRI, ie the antibody is No significant binding to FcRI, more preferably no FcRI at all . Therefore, the present invention is further modified in that the ability of the antibody to fix complement is modified as compared to the unmodified antibody. C of the antibody, characterized in that_HOne of the N-terminal regions of the two domains or Modified anti-body in which more amino acid residues are modified Provide the body. Therefore, in a further preferred embodiment, the present invention relates to an antibody as compared to an unmodified antibody. Has an altered complement-fixing ability, and the antibody comprises one or more cellular Fc It is characterized by binding to receptors, especially FcRIII, but not to FcRI significantly. C of antibody_HOne or more aminos in the N-terminal region of the two domains Provided is a modified antibody in which an acid residue is modified. The constant region of the modified antibodies of the invention is of animal origin, preferably of human origin. is there. It can also be of any isotype, but is preferably human IgG, Human IgG1 is also preferred. In a preferred embodiment of the invention, the modified amino acid residues are 231-239. Within the amino acids at positions 234-239, preferably. In a particularly preferred embodiment of the invention, the modified amino acid residue is the motif L eu234 Leu235 Gly236 Gly237 Pro238 Ser2 Within 39. In the most preferred embodiment, the modified amino acid residues are Leu235 and And / or Gly237.Detailed Description of the Invention "Modified" when used herein in relation to the ability of the antibody to fix complement. The term "done" refers to the ability of the antibody to fix complement as compared to the starting antibody. Means decline. By selecting the appropriate amino acid to be modified (eg Group Leu235), its complement-fixing ability is substantially reduced Antibodies can be produced. In addition, for example, the amino acid residue Gly237 is modified. Thus, an antibody having a moderate complement-fixing ability can be produced. As used herein, the term "substantially reduce complement binding" refers to human complement. The level of body binding is seen in the wild type unmodified starting antibody. %, Preferably ≦ 30%, more preferably ≦ 20%, and most preferably It means that ≦ 10%. The term “significantly” when used with respect to FcRI binding, refers to anti-FcRI Body binding is typically <20% of that seen with the unmodified antibody, and is most preferred. Specifically, it means that ≦ 10%. Antibody-dependent cellular cytotoxicity (AD) was detected at a concentration 10 times or less that of the wild type unmodified antibody. CC), as determined by their ability to mediate CC), is preferably an FcR modified antibody. Bind to III. Proteins encoded by regions of the major histocompatibility complex of the genome are responsible for immune recognition. It is involved in many aspects. All mammals and perhaps all vertebrates It is known that they have essentially the same MHC system and that immune response genes are linked to MHC. Is. In humans, the major histocompatibility complex is the HLA gene cluster on chromosome 6. The major regions are D, B, C and A. D region is a cooperative action between cells of the immune system Contains genes for class II proteins involved in interactions with. Many diseases are HLA It has been found to be associated with the D region of gene clusters. In research to date, A huge number of diseases, including autoimmune diseases (see, for example, European Patent No. 68790). The relationship with the patient is proven. European Patent No. 68790 is an MHC class II Selective suppression of immune responses regulated by primordial-specific monoclonal antibodies Allows for specific alleles of certain regions of MHC, such as the human HLA-D region ( have been suggested to regulate diseases associated with allele). We have C_HMHC-class II at position 235 in the N-terminal region of the two domains By modifying the specific antibody, it retains immunosuppression completely but in vitro. Toxicity is reduced and in vivo toxicity can produce acceptable antibodies I found a thing. In a further preferred embodiment, the invention provides the complement of the antibody compared to the unmodified antibody. C of an antibody, characterized in that the binding ability is modified_HTwo One or more amino acid residues in the N-terminal region of the domain have been modified, M An HC-specific antibody is provided. In a preferred embodiment, the invention provides that the antibody is C_HOf the N-terminal region of the two domains MHC-specific monoclonal antibody characterized by being modified at position 235 I will provide a. In some instances, such as MHC-specific monoclonal antibodies, the C of the antibody_H2 Dome Modification of the N-terminal region of the in-chain additionally modifies the ability to fix complement while additionally receiving FcRI. It is preferred to inhibit binding to the body. The antibody is preferably specific for MHC class II antigens, although C_H2 Dome FcR due to modification of one or more amino acid residues in the N-terminal region of the in It will not bind to I significantly. In a further preferred embodiment, the modified antibody of the present invention or the use of the present invention is provided. The modified antibody for_HIt is modified at position 235 in the N-terminal region of the 2 domain. And are directed against MHC class II antigens. In a particularly preferred embodiment, the modified antibodies of the invention or for use in the invention The modified antibody is directed against an MHC class II antigen, which antibody is C_H2 Dome Modified at position 235 in the N-terminal region of the in The ability to fix complement has been modified, and the modified antibody has one or more cellular It is characterized by binding to Fc receptors, especially FcRIII, and not significantly to FcRI. To collect. Furthermore, the present invention provides the antibody C_HOne or more of the N-terminal regions of the two domains The amino acid of the antibody to alter the complement-fixing ability of the antibody as compared with an unmodified antibody And a method for producing a modified antibody having a modified complement-fixing ability. As used herein, the term "modified antibody" refers to the C of the Fc region of an antibody._H2 Domei Wild-type unmodified antibody at one or more amino acid residues in the N-terminal region of Is used to mean an antibody that differs from. This modification is, for example, a wild-type starting antibody. Change your body's amino acid to another More substitutions or deletions of amino acid residues. Residue numbering as used herein is as follows: Kabat et al. [(1991 ) Sequences of Proteins of Immunological i nterest), 5th Edition, US Department of Health and Human ・ Eu finger described in [Services (US Dept. of Health and Human Services)] According to the mark. C in human IgG1 and IgG3 antibodies_HN-terminal region of 2 domains The naturally occurring amino acid at position 235 of is a leucine residue. 235th place Roishi The modifications that replace amino acids with glutamic acid or alanine have minimal in vitro toxicity. Yes In vivo toxicity is particularly effective in producing acceptable and potent immunosuppressive antibodies Was found. The modification that replaces glycine at position 237 with alanine has the ability to bind human complement. Moderate, ie, the level of complement fixation is about 15-80% of the wild-type starting unmodified antibody. Preferably produce 20-60%, most preferably 20-40% antibody Things have been found. Residues are, for example, other amino acids or amino acids that have unsuitable functional groups on their side chains. A similar substitution with a non-acid derivative can be used using a method similar to that described above. You can do it. This can, for example, change the charge and / or polarity of the side chains. Achieved by and. The modified antibodies of the present invention may also include, for example, insertion of glycosylation sites at appropriate sites in the molecule. Can also be produced by deleting residues such as 235 It Such methods are known in the art, for example European patent application EP-307. See the description of No.434. The modified antibodies of the present invention also exchange the lower hinge region of antibodies of different isotypes. It can also be produced by For example, by replacing the G1 / G2 lower hinge, It lacks the ability to fix complement, which is a further preferred embodiment of the invention. This is Additional examples are described in more detail in the accompanying examples. One by replacing the G1 / G2 lower hinge Or later C in which the above residues have been modified and / or deleted_H2 of the N-terminal region of the 2 domain Antibodies with modified residues at positions 31-238 are obtained. In a particularly preferred embodiment of the invention the antibody is directed against MHC class II antigens. Human IgG1 antibody. Furthermore, the present invention provides that the complement-fixing ability of the antibody is modified as compared to the unmodified antibody. C of the antibody characterized by_HOne or more of the N-terminal regions of the two domains Complement-mediated toxicity consisting of administering a modified antibody with modified amino acid residues A method of regulating the function of cell surface-associated antigens is provided. In a preferred embodiment of this aspect of the invention the engineered antibody comprises one or more Can bind to the cellular Fc receptors of FcRI, especially FcRIII, Binding is significantly reduced. Examples of such cell surface antigens include, for example, adhesion molecules, T cell receptors, CD4, CD8, CD3, CD28, CD69, MHC class I, MHC class II and There is CD25. The invention also relates to therapeutic, pharmaceutical and diagnostic compositions comprising the modified antibodies of the invention. And the use of these products and compositions in therapy and diagnosis. Furthermore, the present invention is combined with a pharmaceutically acceptable excipient, diluent or carrier. The present invention provides a therapeutic, pharmaceutical and diagnostic composition comprising the modified antibody of the present invention. . The present invention also provides a modified antibody of the present invention in a pharmaceutically acceptable excipient, diluent or Are mixed in a carrier to prepare a therapeutic, pharmaceutical and diagnostic composition. provide. The antibody or composition may be administered in any type and amount suitable for the method of treatment used. To be done. For therapeutic, diagnostic and use in pharmaceutical compositions, or antibody-mediated Used to treat diseases that cause unwanted toxicity due to complement fixation The modified antibody for use is preferably MHC Specific antibody, most preferably MHC class II antigen, most preferably D It has specificity for Rα chain-dependent antigenic determinants. The therapeutic, pharmaceutical and diagnostic compositions may be of any type suitable for administration, More preferably for parenteral administration such as injection or infusion (eg bolus injection or drip) Any suitable type may be used. For injection or infusion, the product is an oily or aqueous medium It may be in the form of a suspension, solution or emulsion in a suspension, preservative, stabilizer and And / or may contain formulation materials such as dispersants. Alternatively, the antibody or composition may be dried to reconstitute it with a suitable sterile solution before use. It can be a mold. If the antibody or composition is suitable for oral administration, the formulation should contain, in addition to the active ingredient, Pung, for example potato starch, corn starch or wheat starch, Or cellulose, or a cellulose derivative such as microcrystalline cellulose or Mung derivative; silica; various sugars such as lactose; magnesium carbonate and / or May contain additives such as calcium phosphate. If the formulation is for oral administration If present, it is preferably well tolerated by the patient's gastrointestinal system. For this It is preferable that the formulation contains a mucus-forming agent or a resin. Antibody or composition To improve tolerance by formulating the product in capsules that are insoluble in gastric juice it can. It may also be preferable to include the antibody or composition in a modified release formulation. Yes. If the antibody or composition is suitable for rectal administration, the formulation is a binder and / or Or lubricants (eg polymeric glycols, gelatin, cocoa butter or others Vegetable wax or vegetable fat). The present invention also includes a human or animal subject. A method of treatment and diagnosis, which comprises administering an effective amount of the modified antibody of the present invention to a test subject. provide. The antibody or composition may be in any suitable form and amount depending on the treatment for which it is used. Administered in. The dose at which the antibody is administered depends on the nature of the condition to be treated and the Used or extant Depends on whether it is being used to treat the condition. The dose depends on the age and symptoms of the patient To be selected. The therapeutic dose of the antibody of the present invention is preferably, for example, one dose of 0.1. 1-25 mg / kg body weight. Immunological disorders treated with the antibodies of the invention include, for example, ankylosing myelitis, juvenile Joint diseases such as rheumatoid arthritis and rheumatoid arthritis; like multiple sclerosis Neurological disorders; pancreatic disorders such as diabetes, juvenile diabetes; chronic active hepatitis, Gastrointestinal disorders such as riak's disease, ulcerative colitis, Crohn's disease, pernicious anemia; psoriasis Diseases such as; allergic diseases such as asthma; and graft-versus-host reaction, and There are transplant related diseases such as allograft rejection. Other diseases include European patents There is one disclosed in 68790. The engineered antibodies of the invention may also detect infectious diseases, such as viral or bacterial infections. It is also useful for treatment and cancer immunotherapy. The term "antibody" as used herein refers to naturally occurring antibodies, chimeric antibodies and CD Used to include R-grafted antibodies or humanized antibodies. One chimeric antibody The antigen-binding site consisting of the fully variable domain of another antibody is linked to the constant domain of another antibody. It is a bound antibody. Such a chimera production method is described in EP120694 (Celtech). (Celltech Limited), EP125023 (Genentech Inc) And City of Hope, EP 171496 (Less Fat) Corp. (Res. Dev. Corp., Japan), EP173494 (Stanford University) And WO 86/01533 (Celltech Limited). CDR-grafted or humanized antibodies are antigen-binding from immunoglobulins of non-human species The remaining immunoglobulin part is derived from human immunoglobulin. I am a child. A method for preparing a CDR-grafted or humanized antibody is described in WO91 / 09967 (see WO 90/07861 (Protein Design Labs (Protein Design Labs. Inc) and WO92 / 11383 (Celtech) (Celltech Limited)) Have been. Furthermore, the present invention provides a DNA sequence encoding the modified antibody of the present invention; Cloning and expression vector containing, host transformed with said DNA Cell and a book comprising expressing a DNA sequence in a transformed host cell Methods of producing the modified antibodies of the invention are included. Further in the present invention: a. Expression of an operon having a DNA sequence encoding the heavy or light chain of an antibody Produced in b. DNA DNA sequences encoding complementary antibody light or heavy chains Ron is produced in an expression vector, c. Transfecting host cells with both operons, and d. Culturing the transfected cell line to produce at least one expression vector Is the antibody C_HOne or more amino acid residues in the N-terminal region of the two domains The amino acid residue of the unmodified antibody corresponding to the group is the modified heavy chain of the antibody. Producing an antibody molecule containing a DNA sequence Methods are provided for producing the modified antibodies of the invention. As will be appreciated by those skilled in the art, site-directed mutagenesis will occur after the fully engineered antibody has been expressed. Using a method such as induction, C_HMaking modifications in the N-terminal region of the two domains Can be. In order to express an unmodified antibody, the method described above for the modified antibody should be used. The method should be used to express the DNA sequence. The DNA sequence is preferably a humanized antibody; cDNA grafted heavy chain and / or It encodes a light chain or a chimeric antibody. This cell line was transfected with two vectors, the first vector The second vector contains a heavy chain containing an operon encoding a polypeptide derived from a light chain. It contains an operon encoding the polypeptide of origin. Each polypeptide chain is similar Can be expressed in As far as the coding sequence and the selectable marker are concerned, this is preferably These vectors are identical. Alternatively, encodes a selectable marker and light chain- and heavy chain-derived polypeptides A single vector containing the operon can be used. General methods for making various vectors, transfection methods and culture methods are not known. Knowledge. Such methods are described, for example, in Maniatis et al. (Molecular Cloning), Cold Spring Harbor Arbor, New York, 1989, and Primrose and Old (Primrose and O1d), Principles of Gene Manipulation, Black Well, Oxford, 1980. The modified antibody of the present invention is preferably the anti-MHC antibody L243 (which has accession number AT CCHB55 at American Type Culture Collection (ATCC, Rockve , Md., Maryland), and most preferably Mela or CDR-grafted derivative. L243 is already Lampson and Levy (La mpson and Levy) [J. Immunol. (1980) 125, 293)]. Standards in molecular biology were used to prepare the DNA sequences encoding the modified antibodies of the invention. Method is used. DNA sequence of interest using oligonucleotide synthesis method All or part of it is synthesized. Site-directed mutagenesis and poly as appropriate The merase chain reaction (PCR) method is used. For example, "for DNA amplification PCR Technology Principles and Applications f or DNA Amplification ”) (1989), H. A. Erlich ), Visit Stockton Breath (Stockton Press), New York, London Teru. For example, the one described by Jones et al. [Nature, 321, 522 (1986)]. Rigonucleotide-specific synthesis can be used. See also Kramer ) Et al [Nucl eic Acids Res. 12, 9441 (1984)] described oligonucleotide-specific sudden changes The induction method can also be used. Any suitable host cell / vector for the expression of the DNA sequence encoding the modified antibody A system can be used. Bacteria, such as E. coli and other microbes Material systems can be used. For example, COS cells and CHO cells [Bebbington Si Bebbington, CR, et al. (1991) Methods 2,136-145], and Mie Roman or hybridoma cell line [Bebbington, C R) et al. (1992) Bio / Techonology 10, 169-175] (eg, (Mammal) host cell expression systems can also be used. If the modified antibody is derived from L243, it is preferable to use a CHO-based expression system. Good. Assay for FcRIII binding indirectly via ADCC assay, complement fixation and C Methods for measuring 1q binding are known in the art and are detailed in the examples below. Immune function / antibody-mediated immunosuppression is measured using methods known in the art, For example, mixed lymphocyte response, and T cell calling response to tetanus toxoid (T-cell recall response) is available. These methods of measurement are detailed in the examples below. ing. The invention is illustrated in the following non-limiting examples with reference to the following figures. In the figure, Figure 1 shows a map of plasmid pMR15.1. Figure 2 shows a map of plasmid pMR14. Figure 3 shows the nucleotide sequence of L243 heavy chain and the predicted amino acid sequence. FIG. 4 shows (a) clone 43, (b) clone 183, (c) clone 192. The nucleotide and amino acid sequences of are shown. FIG. 5 shows the nucleotide sequence of L243 light chain and the predicted amino acid sequence. Show. FIG. 6 shows a map of the plasmid pGamma1. FIG. 7 shows a map of the plasmid pGamma2. FIG. 8 shows the hinge region of human C-gamma1 and C._HShows the nucleotide sequence of 2 regions You FIG. 9 shows the antigen-binding ability of the L243 human isotype series. Figure 10 shows L243 isotype series FcRI binding. Figure 11 shows L243 isotype series human complement binding. FIG. 12 shows binding of human C1q to the L243 human isotype series. Figure 13 shows human complement binding of the L243 isotype. Figure 14 shows guinea pig complement binding of the L243 isotype. Figure 15 shows rabbit complement binding of the L243 isotype. FIG. 16 shows L243 isotype series FcRIII binding by ADCC. You FIG. 17 shows inhibition of the L243 isotype series of T cell calling responses. FIG. 18 shows inhibition of the L243 isotype series of T cell calling responses. FIG. 19 shows inhibition of the L243 isotype series of mixed limbasphere reactions. FIG. 20 shows inhibition of the L243 isotype series of T cell calling responses. FIG. 21 shows inhibition of the L243 isotype series of mixed limbasphere reactions. FIG. 22 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of the Vl region in L243-gL1. Is shown. FIG. 23 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of the Vl region in L243-gL2. Is shown. FIG. 24 shows the nucleotide and amino acid sequences of the Vh region in L243-gH. Show. Figure 25 shows the competition for L243 graft versus FITC chimera L243. The graph of the result of total measurement method is shown. FIG. 26 shows a graph of a Scatchard analysis of L243 gamma 4. Figure 27. Chimera, transplant and transplant [L235E] L24 measured by ADCC. 3 shows a graph of FcRIII binding of 3. FIG. 28 shows a graph of immunosuppressive activity of CDR-grafted L243 measured by MLR. You FIG. 29 shows CDR-grafted L243 and transplanted [L235E] L243 T cell recall. A graph of the response is shown. FIG. 30 shows complement mediated by CDR-transplanted L243 and CDR-transplanted [L235E] L243. The graph of cytotoxicity performance is shown. Detailed Description of Specific Embodiments of the Invention Example Example 1 Gene cloning and expression RNA preparation from L243 hybridoma cells 3 × 10 as described below⁷Total RNA from L243 hybridoma cells did. Wash the cells with saline and wash with RNAzol (10⁶0.2 ml per cell) Dissolved. Add chloroform (0.2 ml per 2 ml of homogenate) and mix. The mixture was vigorously stirred for 15 seconds and placed on ice for 15 minutes. Obtained water layer and Centrifuge the machine layer in an Eppendorf centrifuge for 15 minutes to obtain an equal volume of isoproton. RNA was precipitated from the aqueous layer by adding propanol. Centrifuge after 15 minutes on ice RNA is pelleted by, washed with 70% ethanol, dried, RNAas It was dissolved in sterile water containing no e. The RNA yield was 350 μg.Amino acid sequence of L243 light chain The sequence of the first 9 amino acids of the mature L243 light chain is NH2-DIQMTQS It was decided to be PAS.PCR cloning of L243Vh and Vl The cDNA genes for the variable regions of the heavy and light chains of L243 were combined using reverse transcriptase. To make a single-stranded cDNA copy of the mRNA present in total RNA, then Polymerase chain on cDNA with specific oligonucleotide primers Reaction (PCR) was performed. a)cDNA synthesis cDNA was synthesized in a 20 μl reaction containing the following reagents: 50 mM Tris. -Hydrochloric acid pH 8.3, 75 mM KCl, 10 mM dithiothreitol, 3 mM M gCl₂, 0.5 mM of each deoxyribonucleoside triphosphate, 20 units of RNA sin, 75 ng of random hexanucleotide primer, 2 μg of L243 R NA and 200 units of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase. 6 at 42 ° C After incubating for 0 minutes, the reaction was stopped by heating at 95 ° C for 5 minutes. . b)PCR Perform PCR on aliquots of cDNA using a combination of heavy and light chain primers. became. The nucleotide sequences of the heavy and light chain 5'brimers are shown in Tables 1 and 2 respectively. Shown in. These sequences contain restriction sites starting at the 5'terminal 6 nucleotides. , The sequence GCCGCCACC to optimize translation of the resulting mRNA Known mouse antibody containing a start codon and further 20-30 nucleotides Is a collection of leader peptide sequences of [Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological int erest), 5th Edition, US Department of Health and Humans Services (US Dept. of Health and Human Services)]. The 3'primers are shown in Table 3. The light chain primer is attached to the V-C junction of the antibody. Straddling the enzyme Spl to facilitate cloning of the Vl PCR fragment. Contains 1 restriction site. The heavy chain 3'primer spans the J-C junction of the antibody. With a mixture designed to is there. The first 23 nucleotides are of the human C-gamma 1, 2, 3 and 4 genes Identical to that found at the start and common to these human isotypes Contains the pa1 restriction site. The 3'region of the primer was found in known mouse antibodies Containing mixed sequences based on the sequence Kee (Kabat, EA, Wu, T.T.); Perry Eich M, Gottesman K. S and Feller L. (Perry HM, Gottesman KS, and Foeller L); Sequences of Proteins of Immunological Int erest) Fifth Edition, US Department of Health and Human Support Businesses (US Dept. of Health and Human Services), (1991)]. The above primer combination allows the Vh and Vl PCR products to be expressed in the appropriate expression vector. -Directly cloned onto (see below) chimeric (mouse-human) heavy and light chains Producing the chains and expressing these genes in mammalian cells to produce the desired isotype It is possible to produce a chimeric antibody of. Incubation for PCR (20 μl) was performed as follows. Each reactant is 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 1.5 mM MgCl₂3, 50 mM KCl , 0.01% w / v gelatin, 0.25 mM of each deoxyribonucleoside triphosphate Acid, 1 to 6 picomoles of 5'primer mix (Table 4), 6 picomoles of 3'plasma. Immers containing 1 μl of cDNA and 0.25 units of Taq polymerase . Reactions were incubated at 95 ° C for 5 minutes, then 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute. Cycled for 1 minute and 72 ° C. for 1 minute. Constant for each reaction after 30 cycles Aliquots were analyzed by agarose gel electrophoresis. 5'primer mix B1, B Reactions containing 2, B3 and B5 were sized to match the full length Vl fragment. Reaction B9 produced a fragment of the expected size for the Vh gene. The band generated by the B1 primer was already present in hybridoma cells. This band has been proven to be a pseudogene of the light chain produced by No further follow up. c)Molecular cloning of PCR fragments The DNA fragments produced in the reactions B2, B3 and B5 were digested with the enzymes BstB1 and S Digested with pl1, concentrated by ethanol precipitation and electrophoresed on a 1.4% agarose gel. Electrophoresis was performed and a DNA band in the range of 400 base pairs was collected. These are BstB1 And cleaved with the vector pMR15.1 (Fig. 1) which had been restricted with Spl1. Turned into After ligation, the mixture was transformed into E. coli LM1035 and the resulting bacterial Plasmids from colonies were digested with BstB1 and Spl1 for insert Screened. Representative plasmids with inserts from each ligation reaction are It was analyzed by cleotide sequencing. In a similar fashion, D produced in reaction B9 and digested with HindIII and Apa1 The vector pMR14 (Fig. 2) obtained by restriction-cutting the NA fragment with HindIII and Apa1. ). A representative plasmid containing the insert is again labeled with nucleotides. Analyzed by sequencing. d)Nucleotide sequence analysis Plasmid DNA from two isolates containing the Vh insert from reaction B9 (PE1701 and pE1702) were used as primers R1053 (H in pMR14 Starting in the 3'region of the CMV promoter) and R720 (5 of human C-gamma4) ', Which allows for sequencing of the DNA on pMR14). A row decision was made. Determined nucleotide sequence of L243Vh in pE1702 The columns and predicted amino acid sequences are shown in Figure 3. Nucleotide of the Vh insert in pE1701 The nucleotide sequence consists of nucleotide 20 (A for pE1701) and nucleotide 426 (p E1701 was identical to pE1702 except for A). The difference between these two Are in the signal peptide and in the J region of Vh, respectively. Use different primers than the oligonucleotide mix during the PCR process It shows that it is an independent isolate obtained by. Obtained by priming with R1053 to analyze light chain clones The sequences tested were tested. Reaction products B2 (clone 183), B3 (clone 43) And the nucleotide sequence of the Vl gene obtained from B5 (clone 192) and the The desired amino acid sequence is shown in FIG. By comparing the expected protein sequences, Is shown: i) Clones 182, 183, 43 and 45 all encode the Vl gene , Determined by amino acid sequence analysis of L243 light chain when signal peptide is removed Produces a light chain having the same sequence as that described (supra). ii) Clones 182 and 183 encode a signal peptide of 20 amino acids Contains the Vl gene and the Vl genes of clones 43 and 45 have different sets of oligos Leader of only 15 amino acids, obtained by priming with nucleotides -Has a sequence. iii) Clone 192 does not encode L243Vl. Instead, the antibody sequence Clone 192 showed MOPC21 (L243 hybrid Of the light chain synthesized by the NS1 myeloma fusion partner used to produce the It was shown to contain the Vl gene. iv) Clones 182 and 183 contain nucleotide 26 (T in clone 182 Clone 183 is identical except for C). This difference is different in PCR This is explained by the use of primers, which clones 182 and 183 have the same It is shown to be an independent isolate of the gene. Complete V from clone 183 The nucleotide sequence and predicted amino acid sequence of the l gene are shown in FIG.Generation of human gamma 1 and gamma 2 isotypes The L243Vh gene was cloned into pGamma1 and pG on the HindIII-Apa1 fragment. amma2 (vectors encoding human C-gamma1 and C-gamma2, respectively) Subcloned in (see Figures 6 and 7) See).Human isotype mutant Human C-contained in vector pGamma1 using PCR mutagenesis Residue 235 in gamma 1 from leucine to glutamic acid or alanine, and Residue 237 was changed from glycine to alanine. Lower hinge of human C-gamma1 The region was also replaced with the corresponding region of human C-gamma2. Make these changes The following oligonucleotides were used for: 1) Change L235E 2) Change L235A 3) Change G237A 4) Replacing the lower hinge area Other oligonucleotides used for PCR mutagenesis are: R4732 and R4912 are nucleotides 834 of human C-gamma1, respectively. And 858 and between nucleotides 1156 and 1137 (Figure 8) . The general method of PCR mutagenesis is as follows. Changes in each amino acid And carried out PCR twice and carrying the necessary substitutions. Create the A fragment. These fragments were then digested with BglII and Sty1 to generate pGam Used to replace the corresponding sequence containing the wild type sequence in the ma1 vector (Fig. 6). In the first PCR, a reaction product (20 μl) containing the following reagents was prepared. : 10 mM Tris-hydrochloric acid pH 8.3, 1.5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 0.01% gelatin, 0.25 mM of each deoxyribonucleoside triphosphate, 50 ng pGamma1 DNA, 0.4 units Taq polymerase and 6 picomo Each of the primers. The following primer combinations were used: 30 cycles of 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute and 72 ° C for 1 minute After that, the reaction product was extracted with chloroform, and the newly synthesized DNA was precipitated with ethanol. It was dissolved in water and electrophoresed on a 1.4% agarose gel. Contains DNA fragments Cut out the gel slices you have from the gel, and then add "Mermaid" Registered Trademark Kit (Stratech Scientifi cLtd.), Luton, England) to extract DNA from agarose It was collected and eluted in 20 μl of sterile water. The second PCR was 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 1.5 mM MgCl 2.₂ , 50 mM KCl, 0.01% gelatin, 0.25 mM of each deoxyribonucleotide Oside triphosphate, 2 units of Taq polymerase, D of each pair from the first reaction 1/20 of the NA fragment, and Perform in 100 μl of reaction containing 30 pmol R4732 and R4912. It was. After 30 cycles (see above), the reaction was phenol / chloroform (1 / 1) and precipitated with ethanol. The fragment was digested with BglII and Sty1 Electrophoresis was carried out on a 1.4% agarose gel, and the DNA band of 250 base pairs was detected as described above. Was recovered from the gel slice as follows. These BglII-Sty1 fragments were 830 base pair Sty1-EcoRI fragments. (C_HContains the C-terminal part of two domains and the entire CH3 domain of human C-gamma1 And the BglII-EcoRI vector fragment from pGamma1 in 3 orientations. Ligated (see Figure 6). After transformation into LM1035, the resulting colonies were Screening rasmid minipreps for the presence of the BglII-Sty1 fragment Then, representative ones were taken and subjected to nucleotide sequence analysis. from here , A plasmid containing the sequence of interest was identified and used as described below for future reference. Named it: PGamma1 [L235E] containing glutamic acid at residue 235, residue 23 PGamma1 [L235A] containing alanine at 5 and alanine at residue 237 Containing pGamma1 [G237A] containing C-gamma2 lower hinge region PGamma1 [g1 → g2]. The above plasmids were digested with HindIII and Apa1 and contained L243Vh, respectively. The HindIII-Apa1 fragment harboring this was inserted to create the following plasmid: L243 Gamma 1 [L235E] L243 Gamma 1 [L235A] L243 Gamma 1 [G237A] L243 gamma 1 [g1 → g2] a)Production of chimeric L243 antibody Chinese hamster ovary using calcium phosphate precipitation method Of the appropriate heavy and light chains after cotransfection into (CHO) cells. Transient transfection produced antibodies for physiological evaluation. One day before transfection, CHO-L761 cells were semiconfluent. The flasks that have become dry cells are trypsinized and the number of cells is counted.⁷Individual details A T75 flask with cells was made. The next day, the medium was changed 3 hours before transfection. Transfection 0.25 containing 50 μg each of the heavy and light chain expression vectors for M CaCl₂1.25 ml and 1.25 ml of 2 × HBS (N in 1 liter of water) aCl 16.36 g, HEPES 11.9 g, and Na₂HPO_Four0.4g, p H is adjusted to 7.1 with NaOH) to prepare a calcium phosphate precipitate, It was later added to the medium on the cells. CO₂After 3 hours at 37 ° C in an incubator, Remove medium and precipitates, 15% glycero in phosphate buffered saline (PBS) The cells were shocked for 1 minute by the addition of 15 ml. Remove glycerol, The cells were washed once with PBS and in 25 ml of medium containing 10 mM sodium butyrate Incubated for 48-96 hours. Bound to Protein A-Sepharose Elute and purify the antibody from the culture medium and assay using an immunoglobulin ELISA (described below). Weighed b)ELISA Coated Nunc ELISA plates for ELISA Buffer solution (15 mM sodium carbonate, 35 mM sodium hydrogen carbonate, pH 6.9) 5 μg / ml polyclonal goat anti-human Fc fragment specific antibody (Jackson Y. F (ab) of Muno Research (Jackson Immuno-research), code 109-006-098)₂ The pieces were coated overnight at 4 ° C. Diluted uncoated antibody It was removed by washing 5 times with water. Bind the sample and standard to be quantified with the binding buffer. (0.1M Tris-HCl, pH 7.0, 0.1M NaCl, 0.2% v / v Tween 20, 0.2% v / v Hammersten Casei To about 1 μg / ml. Sequentially double the sample in a microtiter well Dilute to a final volume of 0.1 ml in each well and stir the plate vigorously. Were incubated at room temperature for 1 hour. After the first incubation the plate with distilled water Wash 10 times with mouse monoclonal anti-human diluted 700-fold in binding buffer Kappa (clone GD12) peroxidase-conjugated antibody (The Binding Same as before with 0.1 ml of site (The Binding Site, code MP135) Incubated. The plate was washed again and the substrate solution (0.1 ml) was added to each wafer. Added to Le. The substrate solution was 150 μl of N, N, N, N-tetramethyl in pH 6.0. Benzidine (10 mg / ml in DMSO), 150 μl hydrogen peroxide (30% solution) Liquid). Until the absorbance at 630 nm of the first standard is about 1.0, Allow plate to develop for 5-10 minutes. Absorbance at 630 nm should be measured with a plate reader. The concentration of the sample was determined by comparison with the titer curve of the standard substance. Example 2 Biological properties of the prepared L243 The purpose of the following experiments was to determine the potential toxicity as a result of the use of anti-MHC-II antibodies. Was to separate the immunosuppressive action from. In this process, how We believe that we can prove that Fc-effective function is required.Antigen binding capacity by inhibition assay The principle of this experiment is that antibodies having the same binding ability are labeled antibodies against the same type of antigen. It is completely competing. The antigen-binding ability of the prepared L243 antibody changes even a little Then it will be revealed in this system. Mouse L243 (IgG2a) was labeled with fluorescein (FIT) using standard methods. Labeled with C). All dilutions, manipulations and incubations are 0.1% azide Sodium (BDH, UK) and 5% fetal bovine serum (Sigma ( Phosphate buffered saline (GIBCO) containing Sigma, UK) , UK). RB polystyrene tube (2052 12 × 75mm ) Serial dilutions made in 100 μl in Falcon, UK). The body is treated with a fixed volume of 100 μl (at a predetermined optimal concentration) of labeled antibody, 5 × 10^FourIndicator cells (JYB lymphoblast cell line with high levels of HLA-DR ) Premixed above. Incubate cells and antibody together at 4 ° C for 30 minutes Wash twice, fluorescein activated cell scanner (FACS Becton Dickie The binding was elucidated by using E.S. After appropriate analysis, the average fluorescence intensity is Plotted against degrees.result As expected, alterations in the Fc region of this molecule have no effect on antigen binding capacity. It was not (Fig. 9).Evaluation of FcγRI binding The binding ability of the prepared variant of L243 to FcgRI was measured. The principle of this experiment Antibodies bind to cells via Fc receptors and the affinity of this interaction is subclass. And therefore the structure of the Fc of the antibody. This measurement method For binding to IFNγ-stimulated U937 cells, the prepared antibody was FITC-labeled mouse I. Based on its ability to compete with gG2a. U937 (myelomonocytic) cells were treated with 500 μ / ml IFNγ (Genzyme (G Enzyme), UK) for 24 hours, CD64 binding and mono High levels of FcgRI, low levels of Fc as assessed by mer IgG2a binding It expresses TRII and no FcγRIII. U937 cells containing 25 mM HEPES (GIBCO, UK) Rinse thoroughly with DMEM to remove RPMI1640 (GIBCO, UK) Incubate at 37 ° C. for 2 hours, then 25 mM HEPES (GIBCO (GI BCO, UK) washed again with DMEM containing Fc receptor-bound bovine I The gG was removed. Make serial dilutions of the generated antibodies in a V-bottom 96-well microtiter plate. 0.1% in plate (ICN / Flow, UK) Phosphate buffered saline containing sodium dizide (GIBCO, UK ) In 50 μl and 5 × 10 in 50 μl^Four3 U937 cells at 4 ° C Incubated for 0 minutes. Then, in every well Add 50 μl of FITC-labeled IgG2a antibody at 90 ° C and ink for another 90 minutes at 4 ° C Was added. Wash the cells once in a microtiter tray and use RB Polystyrene. Tube (2052 12x75mm, Falcon, UK) , Wash again, and fluorescein-activated cell scanner (FACS vector (Nickinson) was used to clarify the binding. After appropriate analysis, average fluorescence intensity Degree was plotted against antibody concentration.result IgG1 C_HChanges in the N-terminus of the 2 domain are large for binding to FcRI. It had a strong influence (Fig. 10). As expected, wild-type IgG1 It bound well, IgG4 bound about 10-fold weakly and IgG2 did not bind at all. We found that the change from Leu235 to Glu in human IgG4 is due to its FcR FcRI binding was completely abolished by the same changes in IgG1 which resulted in zero binding to low I. I confirmed that it would disappear. Ala at 235 reduces FcRI binding (about 100-fold) I made it, but it did not reach zero. Change Gly237 of IgG1 to Ala Then, like when the whole region 233 was replaced with 236 of the sequence found in IgG2, , FcRI binding was abolished. G1 [K320A] changes affect FcRI binding There was noAntibody-dependent complement-mediated cytotoxicity Generation of L243 using the method of antibody-dependent complement-mediated cytotoxicity The ability to fix complement was evaluated. The principle of this experiment is that the Fc of an antibody is compatible with components of the (normal classical) complement cascade. Antibodies, if capable of interacting, complement lyse target cells bearing their cognate antigen Is to mediate. The crucial interaction is with the C1q molecule. It The source of complement for these experiments was collected in endotoxin-free glass bottles. Human venous blood which has been bled and then coagulated at 37 ° C. for 1 hour. Cut solidified mass from glass Separate and then incubate at 4 ° C. for 2 hours to contract. Then remove the clot The serum is separated from the remaining red blood cells by centrifugation at 1000 g. Once prepared The prepared serum can be stored at -20 ° C for up to 1 month without any significant change in activity. Most preferably, it is used fresh. All manipulations, dilutions and incubations were performed with 2 mM glutamine (Gibco (G IBCO, UK) and 10% fetal bovine serum (Sigma, UK) RPMI1640 (GIBCO (GIBC O, UK). Target cells (JY B with high levels of HLA-DR Lymphoblast cell line) with 1 mCi of Na⁵¹Cr at room temperature for 1 hour (stirring every 15 minutes Label) The cells were then washed 3 times to remove the radiolabel, 2 x 10⁶/ Ml Resuspend with. Serial dilutions of antibody were added to a V-bottom 96-well microtiter plate. Tone (ICN / Flow, UK) with 25 μl in duplicate To make. To establish the spontaneous release of a label that gives the background value of the assay First, control wells containing medium alone are prepared. target⁵¹Cr labeled JY cells Add 10 μl to all wells. To establish a 100% release value, 2% The same number of JY cells are added to all wells containing ton X100. target Incubate cells and antibody together for 1 hour at room temperature and use all Add 25 μl of serum to the wells (excluding 100%) and incubate at room temperature for 1 hour. To incubate. Then add 100 μl EDTA at 4 ° C. for further cell killing. Stop and centrifuge the microtiter plate at 200 g to remove intact cells. Pellet, take 100 μl of supernatant and count in a gamma counter. Subtract the background value from all values to calculate the cell death rate and determine the maximum release. It is expressed as a ratio corrected for. Variability of multiple measurements is less than 5%. Then lyse The solution rate is plotted against the antibody dilution.result C_HAny change in the N-terminal region of the 2 domain (residues 233-237) It did not affect the ability of L243 to bind to complement (Fig. 11). Wild type I gG1 mediates potent killing, 600 ng / ml gives half maximal cell killing (64% of the maximum). IgG2 and IgG4 completely kill cells even at 20 μg / ml I didn't let it. The change of 237 from Gly to Ala resulted in moderate killing (2 20% of maximum kill at μg / ml). Human I in the entire lower hinge region Replacement with the sequence found in gG2 caused lysis even at 20 μg / ml. There wasn't. Modification of IgG1 235 was unexpectedly large for human complement binding. It had a great influence. Changing Leu235 to Glu abolished complement lysis ( There was no killing at 20 μg / ml). 235 Ala had a low level of killing It was. In contrast, the above-mentioned C1q binding motif from 320 Lys to Ala Change [Duncan A R and Winter G) (1988) Nature, 332, 21.] shows no change with the death of wild-type IgG1. (70 ng of maximal cell death at 600 ng / ml, half of the cells died) ).Direct binding of C1q To confirm that complement-mediated cytotoxicity is due to activation of the classical pathway To establish a measure of direct binding of human C1q to different engineered antibody variants of L243. did. Purified human C1q (Sigma, UK) directly using conventional methods Labeled with fluorescein isocyanate (FITC Sigma). All dilutions, Manipulation and incubation was performed with 0.1% sodium azide (bead extract ( BDH), UK) and 5% fetal bovine serum (Sigma, UK) Performed in phosphate buffered saline (GIBCO, UK) RB Poly Styrene tube (2052 12 x 75 mm, Falcon, 5 x 10 by incubating at 4 ° C for 1 hour at saturation concentration in^Four Differentiating indicator cells (JY B lymphoblast cell line with high levels of HLA-DR) Coated with the prepared antibody. After washing, the FITC-labeled C1q in 100 μl Serial dilutions were added and incubated together for a further 30 minutes at 4 ° C. After washing , Using fluorescence activated cell scanner (FACS Becton Dickinson) Revealed. After appropriate analysis, the mean fluorescence intensity was plotted against antibody concentration. It wasresult Direct binding of human C1q to the L243 human isotype series shows complement-mediated cells The results obtained with the disorder (Fig. 12) were confirmed. Labeled human C1q binds to JY cells When it was bound, it bound well to wild-type IgG1 and weakly bound to IgG4. Basically crow Ze et al. [Behring Inst. Mitt. 87 56 (1990)] To obtain 1.2 × 10 for IgG4 and IgG1, respectively^-7M and 1.5 × 10^-8 It was M. These values are similar to those of the mouse antibodies IgG1 and IgG having similar functions. 2b is comparable to the value obtained in 2a [Leatherbarrow and Duwek (Leatherbarrow and Dwek) (1984), Molec. Immunol. 21, 321]. Leu235 of IgG1 To Glu reduced binding to C1q to the same level as IgG4. On the other hand, the above-mentioned change in the C1q binding motif from 320 Lys to Ala. [Duncan A R and WinterG] (19 88) Nature, 332, 21] had no effect on C1q binding. Ig The change of G4 from Leu235 to Glu did not change wild-type binding.Rabbit and guinea pig complement Using rabbit or guinea pig serum instead of human as a complement source, The behavior of G1 [L235E] and G1 [L235A] modifications was different. Rumors Guy C'caused the same level of lysis as wild type G1. In the guinea pig, I 40% and 49% plateau level, respectively, against 80% killing of gG1 wild type. Caused Le's death. The 235 alteration only affects human complement, which Rabbit and guinea pig complement showed different interactions with human IgG1 (See FIGS. 13 to 15).Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity Generation of L243 The ability of the antibody variant to bind to FcRIII It was evaluated using the disorder (ADCC). The principle of this experiment is that the antibody Fc has effector cells with cytotoxic potential. Target cells with cognate antigens, if they can interact with the Fc receptor It is to mediate lysis. The crucial interaction is the antibody Fc and cellular Fc It is the interaction between the receptors. Effector cells are freshly prepared in each experiment. Human venous blood, endotoxin Collect in a tube containing heparin that does not contain glucose. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) Density gradient centrifugation according to the manufacturer's instructions (Pharmacia) Was prepared by. PBMC is 2 mM glutamine (GIBCO, UK ) And 10% fetal bovine serum (Sigma, UK) 40 medium (GIBCO, UK) (in this medium all manipulations, dilutions and dilutions) And incubate) 1 × 10⁷Cells / ml were prepared. 1 m of target cells (JYB lymphoblast cell line with high level of HLA-DR) Ci Na⁵¹Label at room temperature for 1 hour (stirring every 15 minutes). Then the cells 3 times Wash to remove free radiolabel, 2 x 10⁶/ Ml. Antibody chain The serial dilution was added to a sterile U-bottom 96-well microtiter plate (Falcon (F Alcon), UK) in 25 μl in duplicate. Background value of measurement method Control wells containing medium alone to establish spontaneous release of labeled label To prepare. target⁵¹Add 10 μl of Cr-labeled JY cells to all wells. Wells containing 2% Triton X100 in water to establish a 100% release value Also, the same number of JY cells are added. Incubate the target cells and the antibody together After 30 minutes at room temperature, add 25 μl effector to all wells (except 100%) Cells are added and incubated at 37 ° C. for 4 hours. Then 100 μl at 4 ° C EDTA saline is added to stop further cell killing and microtiter -Complete the plate by centrifugation at 200g Pellet the cells, take 100 μl of the supernatant and count in a gamma counter. Measure. The background value was subtracted from all values to calculate the lysis rate of cells, and the maximum release was calculated. Expressed as a percentage. Variability of multiple measurements is less than 5%. Then the percentage of cell lysis Blot against dilution.result C_HNot all mutations in the N-terminal region of the two domains (residues 233-237). The activation did not affect FcRIII-mediated function (FIG. 16 and Tables 5 and 7). L24 3 IgG2 is HLA-DR positive JY lymphoblast at a concentration of up to 100 γ / ml. Did not mediate peripheral blood mononuclear cell cytotoxicity (ADCC). Low levels of IgG4 ADCC (20% of maximal killing at 1γ / ml), which is Leu23 It disappeared by changing from 5 to Glu. Wild-type IgG1 is a powerful cell killer It is a mediator and gave 50% cell killing with 5 ng / ml antibody. 237 The change from Gly to Ala was seen with IgG4 killing by the IgG1 wild type. It was lowered to a level All of the lower hinge region was found in human IgG2 With a medium sequence that required 500 ng / ml for 50% cell killing. Gave level death. On the other hand, the change of 235 of IgG1 is not compatible with ADCC. And had the least impact. Changing Leu 235 to Ala produced levels of killing comparable to G1 wild type (5 9 ng / ml for 0% cell killing, the change of Leu235 to Glu ADCC was slightly reduced (40 ng / ml for 50% cell killing). 32 The above-mentioned C1q binding motif change from 0 Lys to Ala mediates ADCC. It had no effect on the ability of IgG1 to perform.Immune function Ex-vivo T cell function experiments were performed (where MHC-II and T cell receptor interaction is essential for T cell activation is there). L243 isotype series mixed lymphocyte reaction (which is native and (Measuring both memory T cell activation) and tetanus measuring only memory T cell responses Tested with ring response to toxoid.Mixed lymphocyte reaction The immunosuppressive ability of the antibody variants of L243 was evaluated by mixed lymphocyte reaction. The principle of this experiment is that leukocytes of one individual are different from each other expressing different HLA alleles. When mixed with human white blood cells, they are recognized as foreign substances and are activated. That is what it means. This activation is mainly due to the CD3 / TcR complex on T cells and antigen presentation. It depends on interaction with MHC class II molecules on the indicated cells. Binds to MHC-II Antibodies are known to inhibit this reaction. White blood cells are freshly prepared in each experiment. Human venous blood from two individuals Collect in heparin-free tubes without syn. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) Density gradient centrifugation according to the manufacturer's instructions (Pharmacia) It was prepared by the method. PBMC is 2 mM glutamine (GIBCO, UK Country), 100 μg / ml / 100 μg / ml penicillin / streptomycin ( Gibco (UK), and 10% fetal bovine serum (Sigma) , UK) in RPMI 1640 medium (GIBCO, UK) × 10⁶Adjust to cells / ml. All manipulations, dilutions and inks in this medium Performed a cubate. Irradiate one individual PBMC with 3000 rad. This These cells stimulate responses from other individuals. Add serial dilutions of antibody to a sterile U-bottom 96-well microtiter plate Prepare in triplicate with 25 μl in Falcon, UK. Maximum response and maximum Only medium and optimal levels of cyclosporine ( Sandimmu n) Prepare control wells containing (R), Sandoz). same number The irradiation stimulant and the responder are mixed and 100 μl is added to each well. Stimulant Only wells and responder only wells are also prepared as controls. Experiment at 37 ° C and humidity 5% CO at 100%₂Incubate for 5 days. 1 μCi / well³H-chi Incubate with a daphne (Amersham, UK) to remove glass fiber. Collected on a Luther mat, measured using a beta counter, and at the last 18:00 Responses are measured by assessing amplification in culture between. Results are plotted as CPM versus antibody concentration. 10% variation in multiple measurements Is less than.T cell calling response to tetanus toxoid The ability of the engineered antibody variant of L243 to suppress the secondary response was tested against tetanus toxoid. It evaluated using the call response. The principle of this experiment is that an individual who was previously immunized with tetanus toxoid (TT) T cells of the plant respond to TT when reexposed to ex vivo. It This activation presents the CD3 / TcR complex on T cells with the antigen It depends on the interaction with the MHC-II molecule on the living cells. Anti-binding to MHC-II The body is known to inhibit this reaction. Lymphocytes are freshly prepared in each experiment. Human venous blood, containing endotoxin Collect in a tube containing no heparin. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is a manufacturing industry The density gradient centrifugation method according to the manufacturer's instructions (Pharmacia). Made. PBMC is 2 mM glutamine (GIBCO, UK), 10 0 μg / ml / 100 μg / ml penicillin / streptomycin (Gibco (G IBCO, UK) and 10% fetal bovine serum (Sigma, UK) RPMI 1640 medium containing (GIBCO, UK), all manipulations , Dilution and incubation were performed. 2 × 10 in this medium⁶Cells / ml adjust. Add serial dilutions of antibody to a sterile U-bottom 96-well microtiter plate Prepare in triplicate with 100 μl in Falcon, UK. Beforehand 50 μl containing the experimentally determined optimal concentration of TT is added to all wells. Medium alone and optimal levels of system, respectively, to establish maximum response and maximum inhibition. Crosporin (Sandimmun®, Sandoz) ) (100 nM) containing control wells. Next, add 50 μl of PBMC Add to each well. The experiment is 37 ° C, humidity is 100%, and 5% CO₂And incubate for 7 days Beate. 1 μCi / well³Incubate with H-thymidine, glass Collected on a filter mat, counted using a beta counter, the last 1 Responses are measured by assessing amplification during 8 hours of culture. Results are blotted as CPM against antibody concentration. 10% variation in multiple measurements Is less than.result (Fig. 17-21) Significant during the effect of the L243 human isotype series between MLR and TT responses Or there was no qualitative difference. The maximum inhibition rates are G1, G1 [L235E] and Achieved with G1 [L235A]. About 2 orders of magnitude higher G2 to obtain similar inhibition rate , G4 and G1 [L235A] were required. G1 / G2 L hinge replacement bump The mutant was moderately immunosuppressive. Immunization with complement or FcRI binding There was no correlation between repressions, G1 bound well to FcRI and complemented, but G1 [L 235E] had no effect. However, both show good immunosuppressive ability It was However, there was a good correlation with FcRIII binding. Human G1 and G1 [ L235E] interacts with FcRIII and shows good immunosuppression. G1 / G2 The L-hinge showed moderate FcRIII binding and immunosuppression. In contrast, human The G237A mutation in G1 was associated with FcRIII binding in line with reported observations. Reduce ability. This antibody had low immunosuppressive ability (Table 5). Table 6 Shows some L243 isotype mutants.Conclusion The inventors of the present invention have prepared a compatible antibody-based antibody-based antibody based on the anti-HLA DR antibody L243. , The amino acid residue required for FcR binding to C1q of human IgG1 is C_H Found to be located in the N-terminal region of two domains (residues 231-238) It was IgG3 and IgG4 C_H2 domain of leucine 235 to glutamic acid It is already known that the FcRI binding ability is abolished by changing the Confirmed this, and at the same time, human complement while retaining FcRIII-mediated functions. I found that the binding ability was lost. IgG1 237 glycine to alanine When it is changed, the FcRI-binding ability is lost again, and the complement-fixing ability and the FcRIII-mediated mechanism are lost. Noh has decreased. If the entire region of 233 to 236 is replaced with the sequence in human IgG2 , FcRI binding ability and complement binding ability are lost, and FcRIII-mediated function of IgG1 is low. I dropped it. On the other hand, the above-mentioned C1q binding motif was converted to 320 lysine by alanine. Changes to IgG1 mediated complement binding had no effect. The effect of changes in IgG1 on FcRI binding was obtained using IgG3 and IgG4. Reported observations: lower hinge / N-terminal C_H2 areas 235 and 2 Changes in 37 significantly reduce FcRI binding capacity [Lund J et al. J Immunol, 1991. 147,265: and Alegre M. L. et al. J. Immunol. 1992.148, 3461]. Similarities between these isotypes Gender strongly suggests that they interact with FcRI in a similar manner. We have C_HWithin the lower hinge / N-terminus of region 2, human IgG1 Fc We have found the residues required for RIII binding. 237 is modified and the lower hinge remains IgG2 Group exchange caused low and moderate FcRIII-mediated killing, respectively. . These effects were reported by Sarmay et al. For human IgG3. [Molec. Immunol. 1992, 29, 633]. Thermey using IgG3 These methods In contrast, our changes at residue 235 of IgG1 implicate an FcRIII-mediated function. It had almost no effect on it. Greenwood et al. [Eur. J. Immunol. 1993.23, 1098], I With intradomain and interdomain switch variants between gG1 and IgG4, C over 292_HWithin IgG1 required for FcRIII binding in the C-terminus of the 2 domain The residue of is identified. This is C_HThe present invention in the lower hinge / N-terminus of the two regions The residues we identified were FcRIII mediated through the binding of human IgG1. It shows that it is necessary but not sufficient for the effector function. The IgG1 variant with altered 235 did not mediate lysis by human complement and was purified It did not bind to human C1q. We also found that 320 changed IgG1 min The offspring were found to confer complement-mediated killing comparable to IgG1 wild type. Residue G lu318, Lys320 and Lys322 are mouse-derived by protein engineering research. IgG2b has been shown to be required for C1q binding [Duncan A.A. Duncan AR and Winter G, Nature, 1988.332, 21] . Also in the same study, the 235 alteration of mouse IgG2b has an affinity for human C1q. Proved to have no effect on sex [Duncan AR and Win Tarcan (Duncan AR and Winter G), Nature, 1988.332, 21]. these The apparent discrepancy in the observations is probably due to the C between human IgG1 and mouse IgG2b. This may be due to the difference in 1q contact. We have C_HMost changes in the lower hinge / N-terminus of the 2 domain are C It was found that it affects 1q binding. G1 / G2 lower hinge replacement complements Incompatibility and the 237 change also significantly reduce this. On the other hand, Greenwood et al. [Eur. J. Immunol. 1993.23, 1098] is C_HTwo Residues required for human complement binding were found in the C-terminal half of the domain. Tao o) et al. [J. Exp. Med. 1993, 178, 661] is also C_HC-terminal of 2 domains We have found that the end half is required for complement fixation. They are also C1q It is possible to separate the binding from complement-mediated lysis. C_HC-terminal side of 2 domains IgG1 with 331 in half changed from Pro to Ser was also found to be similar to wild type. It is able to bind to human C1q but is unable to activate complement. This is C_H The amino acids we identified within the lower hinge / N-terminus of region 2 are C1q Antibody-dependent complement that is required for binding and that the C-terminal residue exceeds C1q Predicts that it is required for cascade binding and activation. Example 3 L243 is a mouse monoclonal antibody against human MHC class II. The nucleotide and amino acid sequences of Vl and Vh of L243 are shown in Figures 5 and 3, respectively. Shown in. The following example illustrates humanization of L243 antibody (CDR transplantation).CDR implantation of L243 light chain Align the framework region of the L243 light chain with the human light chain subgroup [Kabato ・ EA, Woo Tea, Perry Eich M, Gottesman ・ Kas and E.A., Wu, T.T., Perry H.M., Got tesman K.S., and FoellerC.), 1991, Sequences of proteins of immunological interest (Sequen ces of Proteins of Immunological interest) 5th edition] and L243 is human Subgroup 1 of the chains was found to have the highest homology. Therefore, CDR transfer In order to create the planted light chain, the selected framework region is the human group 1 consensus It corresponds to the framework structure area of the array. L243 and consensus human group 1 light A comparison of the amino acid sequences of the framework regions with the chains is shown below and the two sequences There are 21 differences (underlined) between the two. Analyze the contribution of these framework differences to antigen binding (published international patent (See application WO 91/09967) four residues were identified for study: These are positions 45, 49, 70 and 71. Two CDRs based on this analysis A grafted light chain was created. In this first one (L243-gL1), residues 45, 4 9, 70 and 71 are from the L243 light chain and are second (L243-gL2 ), All residues are human consensus.Light chain comparison Generation of CDR-grafted light chain L243-gL1 The production of L243-gL1 is detailed below. Change to the framework structure region of the chimeric light chain The following oligonucleotides were added to the polymerase chain reaction ( PCR): 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 1.5 mM MgCl 2, respectively₂, 50 mM KCl, 0.01% w / v gelatin, 0.25 mM of each deoxyribonucleoside Dotriphosphate, 0.1 μg of chimeric L243 light chain DNA, 6 pmol R5043 / R5044, or R5045 / R5046, or R5047 / R5048 , And 0.25 units of Taq polymerase, 20 μl each of 3 replicates. I prepared the response. Reactant at 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute and 72 ° C for 1 minute Cycled between. After 30 cycles, the reaction was electrophoresed on an agarose gel. Run, cut out the PCR fragment from the gel, and then use the "Mermaid" kit. It was collected using A second round of PCR was performed on these aliquots. 100 μl of reaction product is 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 1.5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 0.01 % W / v gelatin, 1/1 of each of the three PCR fragments from the first reaction 0, and 30 picomoles of R5043 and R5048 each, and 2.5 units of Ta It contained q polymerase. The reaction temperature is as described above. After PCR, mix The product was extracted with phenol / chloroform, then chloroform, and precipitated with ethanol. Let The ethanol precipitate was collected by centrifugation, dissolved in an appropriate buffer solution, Digested with stEII and SpII. The product obtained is finally electrophoresed on an agarose gel. The DNA fragment of 270 base pairs was recovered from the gel slice, and It was ligated into the digested vector pMR15.1 (Fig. 1). The ligation mixture was used to transform E. coli LM1035 and the resulting colonies It was analyzed by PCR, digested with restriction enzymes, and nucleotide sequenced. L The nucleotide sequence and amino acid sequence of the Vl region of 243-gL1 are shown in FIG.Generation of CDR-grafted light chain L243-gL2 L243-gL1 to L243-gL2 were prepared using PCR. amino In order to introduce acid changes, the following oligonucleoti Used: 10 mM Tris-HCl pH83, 1.5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 0 0.01% w / v gelatin, 0.25 mM of each deoxyribonucleoside triphosphate, 0.1 μg L243-gL1, 6 pmol R1053 / R5350 or R Each containing 5349 / R684 and 0.25 units of Taq polymerase, 20 μl of two reactions were set up. Reactant at 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute Then cycled at 72 ° C for 1 minute. After 30 cycles, the reaction is agarose The PCR fragment was excised from the gel by electrophoresis on a gel, and "mermaid" ("Mermai") d ") recovered using the kit. A second round of PCR was performed on these aliquots. 100 μl of reaction product is 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 1.5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 0.01 % W / v gelatin, 1/5 of each of the PCR fragments from the first reaction, and And R1053 and R684 at 30 pmol each and 2.5 units of Taq polymer It contained an enzyme The reaction temperature is as described above. After PCR, the reaction product is Extracted with ethanol / chloroform, then chloroform, and precipitated with ethanol. D The tanol precipitate was collected by centrifugation, dissolved in an appropriate buffer, and added with BstEII. It was cut with SpII. The product obtained is finally electrophoresed on an agarose gel, Gel a 0 base pair DNA fragment Vector pMR15. 1 (recovered from slices and previously digested with the same enzymes 1). The ligation mixture was used to transform E. coli LM1035 and the resulting colonies It was analyzed by PCR, digested with restriction enzymes, and nucleotide sequenced. L The nucleotide sequence and amino acid sequence of the Vl region of 243-gL2 are shown in FIG.CDR grafting of L243 heavy chain CDR grafting of the L243 heavy chain was performed using the same method described for the light chain. I did. L243 heavy chain has the highest homology to human heavy chains belonging to subgroup 1. Therefore, in order to accept the L243 heavy chain CDRs, human The consensus sequence of the Bugroup 1 framework structure was selected. A comparison of the two structural framework areas is given below. Here, L243 is a human It can be seen that it differs from the consensus at 28 positions (underlined). For antigen binding When the contributions of these are analyzed, in the CDR-grafted heavy chain L243-gH, Only the 27, 67, 69, 71, 72 and 75 residues were retained.Heavy chain comparison Construction of CDR transfer heavy chain L243gH PCR of overlapping oligonucleotides in the presence of appropriate primers L243gH was assembled. The following oligonucleotides were used for PCR: The assembly reaction (50 μl) was 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 1.5 mM M. gCl₂, 50 mM KCl, 0.01% w / v gelatin, 0.25 mM deoxy. Siribonucleoside triphosphate, 1 picomole of each R4897 to R4905, 10 picomoles Comol of each R3004 and R3005, and 2.5 units of Taq polymerase Contained. Reactant at 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute and 72 ° C for 1 minute Cycled at. After 30 cycles, the reaction product was phenol / chloroform (1 / 1), then extracted with chloroform and precipitated with ethanol. After centrifugation, DN A was dissolved in an appropriate cleavage buffer and digested with HindIII and Apa1. Got The fragment was recovered from the agarose gel and digested with the same enzyme in advance. It was attached to R14 (FIG. 2). pMR14 contains the human gamma4 heavy chain constant region Therefore, the heavy chain expressed by this vector is the gamma 4 isotype. Union The mixture was used to transform E. coli LM1035 and control the resulting bacterial colonies. Screened by restriction digests and nucleotide sequencing performed. like this A plasmid containing the correct sequence of L243gH was identified (FIG. 24).Generation of gamma type 1 chimera and CDR-grafted L243 heavy chain Fragment of the variable region of mouse and CDR grafted heavy chain from HindIII to Apa1 As a result, by transferring to the vector pGamma1 (FIG. 6), The L243 heavy chain was created. This vector contains the human gamma 1 heavy chain constant region .Evaluation of activity of CDR transplant gene The activities of the CDR-grafted genes are expressed in mammals and are de novo synthesized. The antibodies were evaluated by purification and quantification. This method will be described later and will be continued. Describes biochemical and cell-based assays used for biochemical characterization of antibody List. a)Gene expression in CHO cells Calcium phosphate as described above for the production of chimeric L243. Co-transfected into Chinese hamster ovary (CHO) cells using the immunoprecipitation method. After transfection, by transient transfection of the heavy and light chain pairs, Chimera and CDR grafted L243 were produced for biological evaluation. Antibody concentration was quantified using a Human Immunoglobulin ELISA (below). b)ELISA Buffered Nunc ELISA plate for ELISA 5 in liquid (15 mM sodium carbonate, 35 mM sodium hydrogen carbonate, pH 6.9) μg / ml polyclonal goat anti-human Fc fragment specific antibody (Jackson Immuno F (ab) of Research (Jackson Immuno-research), code 109-006-098₂Disconnection Strips were coated overnight at 4 ° C. Uncoated antibody is distilled water It was removed by washing 5 times. The sample and standard to be quantified are bound to the binding buffer (0 0.1M Tris-hydrochloric acid, pH 7.0) 0.1M NaCl, 0.2% v / v Tween 20 , 0.2% w / v in Hammersten casein) at about 1 μg / ml I released it. Dilute the sample serially 2-fold in the microtiter well to obtain the final solution in each well. Adjust the volume to 0.1 ml and incubate the plate at room temperature for 1 hour with vigorous stirring. I started. After the first incubation, wash the plate 10 times with distilled water and then bind Mouse monoclonal anti-human kappa (clone GD12) diluted 700-fold in buffer ) Peroxidase-conjugated antibody (The Binding Site ), Code MP135) incubated with 0.1 ml for 1 hour as before . The plate was washed again and substrate solution (0.1 ml) was added to each well. Substrate dissolution Solution is 1 ml in 10 ml 0.1M sodium acetate / sodium citrate, pH 6.0. 50 μl of N, N, N, N-tetramethylbenzidine (10 mg / ml in DMSO ), 150 μl hydrogen peroxide (30% solution). 63 of the first standard Play until the 0 nm absorbance reaches about 1.0. Developed for 5-10 minutes. Absorbance at 630 nm is measured using a plate reader It was measured and the concentration of the sample was determined by comparison with the titer curve of the standard substance. c)Competitive assay The principle of this assay is that the antigen-binding region is correctly transferred from the mouse to the human framework. The CDR-grafted antibody against the labeled chimeric anti-body against binding to human MHC class II. It means competing equally with the body. If there is a change in antigen binding ability in this system, it will be revealed It will be The method of Wood et al. [Wood Tea, Thompson S and Gold] Stein Gee (Wood, T., Thompson, S and Goldstein, G), 1965, J. Am. Immu nol 95,225-229], the chimeric L243 was labeled with fluorescein (FITC) And used for the competitive assay described above. FIG. 25 competes with FITC-labeled chimeric L243 for binding to JY cells. , L243 heavy and light chain combinations are compared. All pairs Mating is an effective competitor, but does not contain CDR-grafted heavy or light chains The shift was not as effective as the chimeric antibody itself. That is, the combination cH in this measurement method / GL1, gH / cL and gH / gL1 are each against chimeric L243 Efficacy was 89%, 78% and 64%. d)Determination of affinity constants by Scatchard analysis L243 antibody was added to PBS, 10% in 5% fetal bovine serum, 0.1% sodium azide. Serial 1.5-fold dilutions (150 μl each) from μg / ml, then 5 × per measurement point 10^FourEach JY cell was incubated on ice for 1 hour. Count cells in advance , Washed and resuspended in the same buffer as the sample. After incubating the cells, Wash with ml, centrifuge and discard the supernatant. The bound antibody is FITC bound Anti-human Fc monoclonal (The Binding Site) , 100 μl of 1/100 dilution of code MF001) was added. And revealed. Then incubate the cells on ice for 1 hour and repeat as above. The excess FITC conjugate was removed by washing. Cells in 250 μl of the same buffer Disperse and flatten per cell using FACScan (Becton Dickinson). Measure uniform fluorescence intensity and use standard beads (Flow Cytometry Standard Co., Ltd. Flow Cytometry standards Corporation)). Thus each cell Determine the number of bound antibody molecules per cell by concentration and create a Scatchard plot. Used to make. For calculation, the valency of the FITC conjugate for L243 Assumed 1: 1 and F / P was 3.36 (provided by manufacturer) . Chimeras L243 (cH / cL), L243-gH / L243-gL1 and L A Scatchard plot comparing the affinity of 243 gH / L243-gL2, It shows in FIG. The apparent Kd of chimera L243 is 4.1 nM, and gL1 and g The apparent Kd of the CDR-grafted antibody containing the L2 light chain is 6.4 nM and 9. It was 6 nM. The difference between the Kd values of antibodies having two CDR-grafted light chains is Reflect the contribution of residues 45, 49, 70 and 71 retained in L243-gL1 are doing. e)Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity Chimera and CDR-grafted L2 that mediate antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) The 43 abilities were compared as described above. The principle of this experiment is that the antibody Fc Can interact with Fc receptors with impaired effector cells Then the antibody is to mediate the lysis of target cells bearing the cognate antigen. Chimera (cH / cL) and CDR-grafted (gH / gL1) L243 in the above assay A comparison of human gamma 1 isotype activity is shown in FIG. Both antibodies are cytolytic It is an effective mediator and its maximal activity is reached at antibody concentrations below 100 ng / ml Is made. There was no significant difference between the activities of the two antibodies. f)Immune function test Ex vivo T cell function experiments were performed (where MHC-II and T cells were tested). The interaction between vesicle receptors was an essential requirement for T cell activation). Chimera and CD R-transplanted L243 antibody, mixed lymphocyte reaction (which is native and memory T cell activity And the call response to tetanus toxoid, which is a memory T cell response. Only the answer is measured). 1) Mixed lymphocyte reaction (described above) The principle of this experiment is that leukocytes of one individual are different from each other expressing different HLA alleles. When mixed with human white blood cells, they are recognized as foreign substances and are activated. That is what it means. This activation is mainly due to the CD3 / TcR complex on T cells and antigen presentation. It depends on interaction with MHC class II molecules on the indicated cells. L243 takes this reaction Known to inhibit. Chimera and CDR-grafted L243 gamma-1 isota as an inhibitor of T cell activation Even if MLR was performed to compare the efficacy of ip, there was a significant difference between the two antibodies. Was not observed (Figure 28). Both antibodies used 100 ng / ml and Over 0% inhibition of MLR was observed. 2) T cell calling response to tetanus toxoid The ability of chimeric and CDR-grafted L243 to suppress the secondary response was transferred to tetanus toxin It evaluated using the call response with respect to. The principle of the experiment is as described above. Chimeric and CDR-grafted L243 human moths that inhibit the call response to TT. The results of an experiment comparing the potency of the comma 1 isotype are shown in FIG. Both antibodies are T It is a potent inhibitor of the T cell response to T and gave indistinguishable titer curves.Example 4 CDR-transplanted L243 at position 235, ie, L [235 The ability of E] to mediate antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) is essentially the same as described above. It was measured as described in the examples. The result is shown in FIG. Similarly essentially as described in the previous example, the CDR-grafted L243 [L235 E] was tested with mixed lymphocyte reaction and paging response to tetanus toxoid. That The results are shown in Figures 28 and 29. Using antibody-dependent complement-mediated cytotoxicity as described in previous examples, human complement The ability of the CDR-grafted L243 antibody [L235E] to bind to was evaluated. as a result Is shown in FIG.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/531 8310−2ＪＧ０１Ｎ 33/531 Ａ (31)優先権主張番号９４０２４９９．９ (32)優先日 1994年２月９日 (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号９４０６２４４．５ (32)優先日 1994年３月29日 (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ボドマー、マーク・ウィリアムイギリス国オクスフォードオーエックス１５エイエス、サウス・ヒンクセイ、マナー・ロード５、ローズ・コテイジ (72)発明者アスウォル、ディルジート・シンイギリス国ロンドンエスイー17、ニュー・クロス・ゲイト、カッセラ・ロード33─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification number Internal reference number FI G01N 33/531 8310-2J G01N 33/531 A (31) Priority claim number 9402499.9 (32) Priority date 1994 February 9, (33) Priority claim United Kingdom (GB) (31) Priority claim number 9406244.5 (32) Priority date March 29, 1994 (33) Priority claim United Kingdom (GB) (81) ) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI) , CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, ES, FI, B, GE, HU, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LU, LV, MD, MG, MN, MW, NL, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SI, SK, TJ, TT, UA, US, UZ, VN (72) Inventor Bodmer, Mark William England Oxford 15 Ayes, South Hinkusei, Manor Road 5, Rose Cottage (72) Inventor Aswold, Dilzeet Singh London England UK 17, New Cross Gate, Cassella Road 33

Claims

[Claims] 1. Modification in which one or more amino acid residues in the N-terminal region of the C _H 2 domain of the antibody is modified, characterized in that the complement-fixing ability of the antibody is modified as compared to the unmodified antibody antibody. 2. An antibody according to claim 2 which binds to one or more cellular Fc receptors but does not significantly bind to FcRI. 3. The antibody according to claim 1 or 2, wherein the modified amino acid residue is within the amino acids 231 to 239. 4. The antibody according to any of the preceding claims, which is an MHC-specific antibody. 5. Modifying one or more amino acids of the C _H 2 domain of the N- terminal region of the antibody, consisting of modifying the complement binding capacity of the antibody as compared with unmodified antibody, as compared to the unmodified antibody A method for producing a modified antibody having modified complement-fixing ability. 6. Complement binding ability of the antibody by comparing the unmodified antibody and the modified antibody is characterized in that it is modified, one or more amino acid residues N- terminal region of the C _H 2 domains of an antibody A method of modulating the function of a cell surface-associated antigen that avoids complement-mediated toxicity, comprising administering a modified antibody that has been modified. 7. The method of claim 7, wherein the modified antibody is capable of binding to one or more cellular Fc receptors, in particular FcRIII, but with significantly reduced binding to FcRI. 8. A therapeutic, diagnostic or pharmaceutical composition comprising the modified antibody according to any of the preceding claims. 9. A method for preparing a therapeutic, pharmaceutical and diagnostic composition, which comprises mixing the modified antibody according to any one of the above claims with a pharmaceutically acceptable excipient, diluent or carrier. 10. A therapeutic and diagnostic method comprising administering to a human or animal subject an effective amount of a modified antibody according to any of the preceding claims. 11. A method for producing a modified antibody according to any one of the preceding claims, comprising: a) producing an operon having a DNA sequence encoding the heavy or light chain of the antibody in an expression vector; b) complementary An operon having a DNA sequence encoding the light or heavy chain of the antibody is produced in an expression vector, c) transfecting host cells with both operons, and d) culturing the transfected cell line to express the antibody molecule. Producing. 12. The method of claim 11, wherein the DNA sequence encodes a humanized antibody. 13. 13. The method of claim 12, wherein the DNA sequence encodes a CDR-grafted heavy and / or light chain, or a chimeric antibody. 14. At least one expression vector, DNA of one or more amino acid residues N- terminal region of the C _H 2 domain has been modified from the amino acid residues of the corresponding unmodified antibody, encoding the antibody heavy chain 14. A method according to claim 11, 12 or 13 which comprises a sequence. 15. Modification of the C _H 2 domain of the N- terminal region after the unmodified antibody is expressed is made, the method according to the eleventh or 12 wherein the claims. 16. Modified antibody according to any of the preceding claims, derived from anti-MHC antibody L243 (ATCCHB55). 17． Modified antibody according to any of the preceding claims, wherein the lower hinge of the antibody is exchanged for an antibody of a different isotype. 18. 18. The modified antibody according to claim 17, wherein the IgG1 lower hinge region is replaced with the IgG2 lower hinge region. 19. One or more amino acid residues in the N-terminal region of the C _H 2 domain of the antibody have been modified, characterized in that the ability of the antibody to fix complement has been modified as compared to the unmodified antibody. A method of treating a disease in which antibody therapy imparts undesirable toxicity due to antibody-mediated complement fixation, which comprises administering a modified antibody.