JPH08507747A - Reusable macroencapsulation system that protects biologically active material packets and is biocompatible - Google Patents

Reusable macroencapsulation system that protects biologically active material packets and is biocompatible

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JPH08507747A
JPH08507747A JP5514378A JP51437893A JPH08507747A JP H08507747 A JPH08507747 A JP H08507747A JP 5514378 A JP5514378 A JP 5514378A JP 51437893 A JP51437893 A JP 51437893A JP H08507747 A JPH08507747 A JP H08507747A
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− シオング，パトリック ソーン
ピー． デサイ，ネイル
エイ． ハインツ，ロスウィサ
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クローバー コンソリデイテッド，リミテッド
− シオング，パトリック ソーン
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Abstract

(57)【要約】 本発明は生物学的活性物質、例えば生細胞、を含むマイクロカプセルまたは遊離の生細胞を内部に封入するためのマクロカプセルに関するものであり、これはマイクロカプセルに封入された生体物質の表面積と表面の粗さを減少させることにより、マイクロカプセルに封入した生体物質の機械的安定度を増加させることにより、生体内で分泌される細胞毒素から、カプセル封入された生体物質の拡散距離を増して細胞保護効果を大きくすることにより、マイクロカプセル封入物質に回収可能性を与えることにより、および細胞生産物の持続された放出のシステムを与えることにより前記システムの生体適合性を高めんとするものである。マイクロカプセルを含むそのようなマクロカプセルを製造する方法も開示される。 (57) Summary The present invention relates to a microcapsule containing a biologically active substance such as living cells or a macrocapsule for encapsulating free living cells therein, which is encapsulated in microcapsules. By reducing the surface area and surface roughness of the biomaterial, increasing the mechanical stability of the biomaterial encapsulated in the microcapsule, the cytotoxin secreted in vivo from the encapsulated biomaterial Enhance the biocompatibility of the system by increasing the diffusion distance to increase the cytoprotective effect, by providing recoverability to the microencapsulated material, and by providing a system of sustained release of cell products. It is intended. Methods of making such macrocapsules, including microcapsules, are also disclosed.

Description

【発明の詳細な説明】 生物学的活性物質用の細胞を保護し生体に適合する、 再利用可能なマクロカプセル封入システム 本発明はカプセルに封入されたまたは遊離の細胞を包んで免疫障壁を与える新 しい形の生体適合性材料に関する。その結果カプセル封入された材料は一般に小 さいが、しかし巨視的であるので、それは現場で再利用できる。さらに詳細には 本発明は糖尿病の治療用の組成物およびシステムに関する。 発明の背景 糖尿病（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ）は世界中で１億人を超える人 人を悩ませている重要な病気である。アメリカ合衆国において１千２百万人以上 の糖尿病患者がおり、また毎年６０万人の新しい患者が糖尿病と診断されている 。インシュリン依存の、すなわちタイプＩの糖尿病患者は、昏睡に陥ることを防 ぐために毎日インシュリンの注射を必要とする。 １９２８年のインシュリンの発見と共に、糖尿病は治されてしまったと考えら れた。不幸なことに、インシュリン治療にもかかわらず、高い血糖濃度により起 されるこの病気の主要な合併症が残存する。毎年、アメリカ合衆国内で糖尿病は 4万人の手足切断および５千人の新しい盲目の患者を数える。ティーンエイジャ ーの間で、糖尿病は腎不全の一番の原因である。国立保健研究所（Ｎａｔｉｏｎ ａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）からのデータは心臓病と心臓 発作の割合は糖尿病患者中で一般人口中の２倍である。 糖尿病患者は３０％減少した寿命に直面する。一日中に定期的に与えられた多 数回のインシュリン注射は膵臓からのインシュリン分泌の精確な分泌量調節を模 倣することができない。分刻みに絶えずグルコースの調節を達成する現在唯一の 方法は膵臓移植による方法である。 全器官膵臓移植は糖尿病治療法における重要な進歩であるが、その手術は技術 的に難しく、拒絶の問題のために成功と使用を限定されるものであり、またそれ はいまだに患者に対してかなりの危険を提示する。魅力ある代りの方法は提供者 の膵臓からインシュリンを生産する細胞（アイレット）を抽出して、これらの細 胞を糖尿病患者に注射し、かくして治癒効果をあげることであろう。しかし、そ のような細胞の使用はなお受容者による拒絶の危険を冒すことになろう。 アルギン酸塩−ＰＬＬ−アルギン酸塩膜（すなわち、アルギン酸塩−ポリ−Ｌ −リジン−アルギン酸塩膜）によるアイレットのマイクロカプセル化は受容者の 免疫系による拒絶の防止のため可能性ある方法である。この技術により、研究者 たちは、生きているアイレットを保護膜の中に閉じ込めることができ、その保護 膜はインシュリンの分泌を許すが、しかし抗体がアイレットに到達して細胞の拒 絶を起すことを防ぐ。この膜（またはマイクロカプセル）はアイレットを拒絶か ら保護しかつインシュリンをその「細孔」を通して分泌されることを許してイン シュリン患者を正常なグルコース調節に維持する。 マイクロカプセル化したアイレットの成功した移植は今までのところ臨床的に 実行可能になっていないが、それは移植拒絶および／またはマイクロカプセル膜 に対する線維形成反応の基本的問題のためである。ＬｉｍとＳｕｎ，１９８０． は糖尿病のラットにおいてマイクロカプセル化したアイレットの最初の成功した 移植を報告しかつ血糖の規定化を記述した。しかし、マイクロカプセル化したア イレットが人間において臨床上有効かつ適用可能になるためには、その免疫保護 膜が生体適合性であり、カプセル封入された細胞が刺激信号に適宜応答するため 適当な拡散を許し、カプセル封入された細胞に必要な栄養物を与えかつ回収可能 であることが重要である。回収可能性はいろいろな理由のために望ましい。例え ば、移植された物質の蓄積を避けることができる。カプセル封入した細胞をそれ がもはや必要でないかまたは望ましくない場合に（例えば、カプセル封入した細 胞がもはや必要でないとき、もしカプセル封入した細胞が望ましい働きをしない 、などの場合に）受容者からカプセル封入した細胞を除去することができる。も しカプセル封入した細胞が生育不能になる場合にそれらを除去することができる 。およびその他の理由である。現在、人間においてカプセル化したアイレットの 移植による糖尿病の逆転に成功したという報告はない。 カプセル封入されたアイレットの生体適合性は依然として基本的問題である。 ここで用語「生体適合性」はその広い意味で用いられており、そして移植された 生体用材料の長期の生体内機能を結果としてもたらすその材料の性能、並びに異 体、線維形成応答を避けるその性能に関する。マイクロカプセル封入技術の主な 問題はカプセル外表面の線維異常増殖が起り、その結果細胞の死および早期の機 能停止をもたらすことであった。広範な研究にもかかわらず、アルギン酸塩基材 のカプセルにおけるこの問題の病理学上の根據は殆ど理解されないままになって いる。しかし、若干の因子は最近において移植片の機能不全、例えば、使用され るアルギン酸塩のグルロン酸／マンヌロン酸含量、マイクロカプセルの欠陥（ポ リ−Ｌ−リジンを生体内環境へ露出させること）、カプセル封入された細胞を完 全に被覆するためにマイクロカプセルが不十分なこと（それにより細胞を生体環 境に露出させること）などに含まれると確認された。 アルギン酸塩は海の褐色藻類、例えば、Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｈｙｐｅｒｂｏ ｒｅａ，Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｄｉｇｉｔａｔａ，Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ ｎ ｏｄｏｓuｍおよびＭａｃｒｏｃｙｔｉｓ ｐｙｒｉｆｅｒａ，から単離された 多糖である。アルギン酸塩は大低の二価および多価陽イオによりイオン的に橋か けされたゲルを形成する。カルシウム陽イオンは最も広く用いられ、そしてＧ− ブロックの間の鎖間結合によりイオン的橋かけゲルの形で三次元網目を生じさせ る。（Ｓａｊａｋ−Ｂｎａｅｋ，１９８８）。 最近証明されたことは、マンヌロン酸残基はアルギン酸塩において活性のシト キン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）誘導物質であり、そしてこれらのシトキン（ＩＬ−１ とＴＮＦ）は線維芽細胞増殖の潜在的促進剤であることが知られているので（Ｏ ｔｔｅｒｌｅｉら、１９９１）、マンヌロン酸含量（Ｍ−含量）の高いアルギン 酸塩カプセルは過去において報告された線維形成反応（Ｓｏｏｎ−Ｓｈｉｏｎら 、１９９１）につき一部原因となっていると推論されることである。さらに重要 なことに、グルロン酸は免疫刺激性であるとは見えないのでアルギン酸塩カプセ ルのグルロン酸含量（Ｇ−含量）を増すことによりこの反応を改善することはで きないことが判明した。さらに、シクロスポリンＡは試験管内でヒトの単核細胞 のマンヌロン酸誘導のＴＮＦおよびＩＬ−１刺激の投与量依存阻害を結果として 生ずることが証明された。この情報に基づき、マイクロカプセルの線 維形成反応は、グルリン酸含量の高いアルギン酸塩配合により、並びにシトキン 刺激を阻害するためのシクロスポリンＡの副治療コースにより、一部改善され得 ることが仮定された。この方法により、自発的糖尿病のイヌモデルにおける糖尿 病は、高いＧ−含量のアルギン酸塩中にカプセル封入された提供者のアイレット の移植により逆転に成功した（Ｓｏｏｎ−Ｓｈｉｏｎｇら、１９９１）。 ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、またポリエチレンオキシド、ＰＥＯ、とも 呼ばれる）は近年広い範囲に、生体適合性の、タンパク質の反発性の、非炎症性 の、および非免疫原性の、医薬、タンパク質、酵素、および移植材料表面のため の改質剤として使用について研究されてきた。これらの異常な特徴の根據はポリ マー背骨の柔軟さ、および溶液中のまたは表面に固定されたときのこのポリマー の体積排除効果に帰せられた。水、並びに多数の普通の有機溶媒、の中における ＰＥＧの溶解度は多種の化学反応による改質を容易にする。最近のある評論（Ｈ ａｒｒｉｓ，１９８５）は多数のＰＥG誘導体の合成およびその各種表面、タン パク質、および医薬に対する固定化を記載している。 ウシの血清アルブミンに結合されたＰＥＧはラビットにおいて減少した免疫原 性と増加した循環時間を示した（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、１９７７）。ペニシ リン、アスピリン、アンフエタミン、キニジン、プロカイン、およびアトロピン のような医薬は、低速の放出の結果としてそれらの活性の持続を増すためにＰＥ Ｇに添付されたことがある（Ｗｅｉｎｅｒら、１９７４；Ｚａｌｉｐｓｋｙら、 １９８３）。ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）に共有結合により結ばれたＰＥＧは、 細胞のカプセル封入のために使用されたアルギン酸塩−ＰＬＬマイクロカプセル の生体適合性を増すために用いられたことがある。ＰＥＧは共有結合により多糖 類、例えばデキストラン（Ｐｉｔｈａら、１９７９；Ｄｕｖａｌら、１９９１） 、キトサン（Ｈａｒｒｉｓら、１９８４）およびアルギン酸塩（Ｄｅｓａｉら、 １９９１）に結合されたことがある。これらの改質は前記多糖類に有機溶解性を 与える。 ＰＥＧにより改質された表面は極めて非トロンボゲン形成性であり（Ｄｅｓａ ｉとＨｕｂｂｅｌｌ，１９９１ａ；ＮａｇｏａｋａとＮａｋａｏ，１９９０）、 生体内の線維異常増殖に対して抵抗性があり（ＤｅｓａｉとＨｕｂｂｅｌｌ，１ ９９２ａ）および細菌付着に対して抵抗性がある（ＤｅｓａｉとＨｕｂｂｅｌl ，１９９２ｂ）ことが見いだされた。ＰＥＧを含む溶液もまた移植のための器官 の保存を強化することが見いだされた（Ｃｏｌｌｉｎｓら；Ｚｈｅｎｇら、１９ ９１）。保存作用力の根據は明らかに理解されないが、細胞表面の分子にＰＥＧ が付着し、その結果免疫応答の特性を変えるように抗原の提供に変化を生じるこ とに帰せられた。 橋かけされたＰＥＧゲルが調製されて酵素および微生物細胞の不動化のために 利用されたことがある。ＦｕｋｕｉとＴａｎａｋａ（１９７９）およびＦｕｋｕ ｉら（１９８７）はＰＥＧの重合性誘導体（例えば、ジメチルメタクリラート） を調製してからそれを適当な開始剤の存在で紫外光により光重合させて共有結合 で橋かけしたゲルを作った。ＫｕｍａｋｕｒａとＫａｅｔｓｕ（１９８３）は微 生物細胞の不動化の目的でガンマ線によるＰＥＧのジアクリラート誘導体の重合 と橋かけを報告した。光重合の温和な性質のために、すなわち、加熱のないため に、ｐＨが極端な値に移動することなく、毒性化学薬品を使用することもないの で、ＦｕｋｕｉとＴａｎａｋａ（１９７６）の発表は、この技術が酵素のみなら ず細胞および細胞器官を閉じ込めるために望ましいことを教示している。 Ｄｕｐｕｙら（１９８８）は最近に、橋かけしたアクリルアミドの微小球の中 にアガロースで埋め込んだ膵臓アイレットを閉じ込めるための光重合法を報告し た。しかし、この文献は個々の微小球の閉じ込めを述べているが、しかしさらに これらの既に閉じ込められた細胞をさらに閉じ込めることを述べていない。重合 を開始させる放射線として可視光が光化学増感剤（ビタミンＢ２、すなわち、リ ボフラビン）、および助触媒（Ｎ−Ｎ−Ｎ′Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミ ン）の存在で使用された。可視光線源として高圧水銀灯が使用され、そしてそれ らのアイレットは重合工程の後に試験管内で良好な生存状態を維持することが証 明された。 波長４００−７００ｎｍの間の可視光線は生細胞に対して非毒性であることが 確認されている（Ｋａｒｕ，１９９０；Ｄｕｐｕｙら、１９８８）。最近の評論 （Ｅａｔｏｎ，１９８６）は、適当な可視光線の存在での重合開始剤としての使 用されることのできる多種の染料および助触媒を記載している。 近年において重合法のためレーザーの使用にかなりの関心が示されてきた（Ｗ ｕ，１９９０）。これらの重合は極めて速く、そして数ミリ秒で完了することが ある。（ＤｅｃｋｅｒとＭｏｕｓｓａ，１９８９：Ｈｏｙｌｅら、１９８９；Ｅ ａｔｏｎ，１９８６）。コヒーレント放射線の使用はしばしば生細胞に対して無 害な重合を結果としてもたらす。これは重合開始剤として波長特有の発色団の使 用から生じ、そしてこれらの発色団は一般に入射する放射線を吸収する、ポリマ ー／細胞懸濁液中の唯一の種である。 発明の要約 従来既に、タイプＩのインシュリン依存糖尿病はラットとイヌにおいてマイク ロカプセルに封入された膵臓アイレットをこれらの動物の腹膜腔内に同種移植片 （イヌのアイレットをイヌの受容者に）および異種移植片（イヌのアイレットを ラットの受容者）モデルの両者を用いて移植することにより逆転され得ることが 証明された（Ｓｏｏｎ−Ｓｈｉｏｎｇら、１９９１）。これらの研究に使用され たアルギン酸塩マイクロカプセルは免疫保護生を与え、そして免疫抑制剤の不在 で数か月間同種移植片の移植生存をもたらす。しかし、アルギン酸塩ゲルはイオ ン的に橋かけされているので、従って生体内でのイオン的平衡の結果として分裂 と再収着にあう。その上、遊離のマイクロカプセルはそれらの小さなサイズ（２ ００−６００μｍ）および腹膜腔内の非局部化のために回収することが難しい。 使用されるアルギン酸塩のマヌロン酸−グルロン酸（Ｍ−Ｇ）比が線維形成の 防止に重要な役割をなすことが知られているが、本発明によれば、従来の技術の マイクロカプセルにおけるいろいろな欠陥を含むその他の因子が確認されており 、それらは移植片の長期の生育性において重要な役割を果す。これら従来技術の マイクロカプセルにおいて従来確認されなかった欠陥を顕微鏡写真が証明する。 本発明によれば、カプセル欠陥に関する多くの因子、すなわち、免疫応答を誘 導する可能性、カプセル封入された細胞の死による機能喪失の可能性、カプセル 封入された細胞に与えられる保護の程度など、は既に確認された。すなわち、 （ｉ）マイクロカプセルの機械的および化学的安定性の両者ともが線維異常増殖 において重要な役割をなす。水溶性の膜は生体内で長期間露出されると溶 解して、その結果カプセルに封入された物質を受容者の免疫系に露出させ、そし て拒絶反応を開始させることが発見された。 （ii）カプセル膜の「粗さ」、並びに欠陥のあるマイクロカプセルは、結果とし てマクロファージ活性化、細胞付着、細胞の異常増殖および究極的な線維形成を 生じさせる。 （iii）カプセル膜のひび割れを伴うマイクロカプセルの破壊または破裂は結果 として線維形成をもたらす。 （iv）アルギン酸塩、特に高いＧ−含量のアルギン酸塩、は比較的生体適合性で あるが、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）は生体内の線維異常増殖について潜在的刺 激剤である。確かに、従来の技術もこの異常増殖問題を予防するためにＰＬＬの 外被をアルギン酸塩の外層で被覆する試みを記載している。しかし、本発明によ り、膜のいかなる破壊も、または膜のコーティングのいかなる不完全も、ＰＬＬ のようなポリマー材料が露出しているときに線維形成を結果として生ずることが 発見された。および （ｖ）マイクロカプセルの表面上における生物学的活性物質の露出は（そのよう な物質がマイクロカプセルを形成するゲルの中に適当に閉じ込められていないの で）そのような物質を受容者の免疫系にさらして、免疫反応を開始させる。 本発明により、さらに個々の球形のマイクロカプセルは大きな露出表面積を与 え、膜を通して栄養物の輸送を容易にするが、他方で細胞の付着と線維異常増殖 の確率を増すことが発見された。この露出したマイクロカプセル表面積を減少さ せることによりおよび／またはすべての束縛されない正に荷電したポリリジンの 露出を減ずることにより、その間免疫保護膜の限界拡散容量を維持することによ り、増加した生体適合性が結果として得られるであろうということが発見された 。露出したマイクロカプセル表面積を減少させることにより、各個のマイクロカ プセルに伴う「粗さ」の百分率は低下し、その結果改良された生体適合性を得る であろう。その上、本発明により、カプセルの機械的完全さを改良することは長 期の移植片機能の達成における重要な段階であることが認められた。 本発明により、生体適合性であるマクロカプセルの中に生物学的活性物質（任 意にマイクロカプセル内に収容されている）（例えば、個々のマイクロカプセル に封入された細胞）を閉じ込めるまたは収納することにより長期の移植片機能が 達成され得ることが発見された。 それにより、（ｉ）閉じ込められた個別にカプセル封入された細胞の細胞保護 性を増加させ、（ii）受容者生体内環境に対する束縛されない正電荷のポリリジ ンの露出を減じ、（iii）カプセル膜の機械的安定性を強化し、（iv）露出した マイクロカプセル表面域の粗さを減じ、および（ｖ）受容者生体内環境に対する 、マイクロカプセルの表面に付着する細胞の露出を減じる。上記の利点のすべて はカプセル化のために使用されるポリマー材料の拡散容量を維持し、それにより 閉じ込められたカプセル封入した細胞が栄養補給されかつ刺激信号に応答するこ とを可能ならしめることにより得られる。 その上、本発明のマクロカプセルはカプセル封入された細胞により造られかつ 分泌された物質の速やかでしかも持続した放出のシステムを提供し、そしてそれ が今度は生理学的プロセス（例えば、カプセル封入したアイレットの場合には血 糖濃度）のより規制された調節を与える。特に、静脈内グルコース刺激に応答し て、インシュリンの放出が、自由に浮流するマイクロカプセルに封入されたアイ レットからよりも速やかにマクロカプセル内に閉じ込められたカプセル封入した アイレットから起る。それは以下にあげる例９に述べられる生体内の静脈内グル コース刺激研究により証明された通りである。さらに、これらのゲルに閉じ込め られたマイクロカプセルからのインシュリン放出は、下の例８に記載した生体内 のグルコース刺激研究により証明されるように、より長い時間に亘って持続され る。 本発明はまた移植物の回収を可能にするが、それはその巨視的な大きさおよび いろいろなマイクロカプセル封入アイレットを単一の包装または複数の巨視的包 装の中に集団化することによるからである。回収可能性はいろいろな理由から望 ましいことである。例えば、移植された物質の蓄積を避けることができる。カプ セル封入した細胞を、もはや必要でないまたは望まれないとき（例えば、カプセ ル封入した細胞の生産物がもはや必要でないとき、もしカプセル封入した細胞が 望ましいように活動しなくなった場合、その他）受容者から除去することができ る。カプセル封入した細胞がもし生育しなくなるならばまたはなる時それを除く ことができる。その他同様の理由である。 本発明は移植された生物学的システムの細胞保護性および生体適合性を改良す ることにより従来の技術の問題を克服する。本発明はまた、ゲルに閉じ込められ たシステムを提供するが、そのシステムは刺激信号に対して閉じ込められた細胞 の速やかな応答を与える。本発明はさらにマクロカプセルにさらに包まれている マイクロカプセルから成る持続される放出システムを提供する。本発明はまたマ イクロカプセルをある特別の区域（例えば、大網のような高血管新生の区域）内 に局在するシステム、並びにマイクロカプセルの破裂を最小にする、そしてそれ らの速やかな回収を容易にするシステムもまた提供する。 当業者には容易に判るように、本発明のマクロカプセルはカプセル封入された または封入されない生細胞を閉じ込めるのみならず、ここに開示されたシステム により持続した放出を行う際に薬理学的または生理学的効果を有することのある すべての化学薬品を閉じ込めるために使用されることができる。 図面の簡単な説明 図１は、カプセル封入された生物学的物質を収容している本発明のマクロカプ セルの一実施態様の図である。 図２は、本発明による閉じ込められたカプセル化アイレット（黒い円●）、自 由に浮流するカプセル化アイレット（黒い三角形）およびカプセル化されないア イレット（白い円○）を移植されたラットの血糖（血中グルコース）の時間に対 するグラフであり、それらのアイレットが異種移植片（イヌのアイレット）であ る場合である。 図３は、本発明に従ってマクロカプセルに封入されたイヌのアイレットで処置 されたラットにおける静脈内グルコース誘発（ＩＶＧＴＴ）に対する血清グルコ ース応答のグラフであり、自由に浮流するマイクロカプセルに封入されたイヌの アイレットを移植されたラットにおけるその応答と比較されているが、いずれも マイクロカプセルおよびマクロカプセルの移植の後７日目の試験である。 図４は、本発明に従ってマクロカプセルに封入されたイヌのアイレットで処置 さたラットにおける静脈内グルコース誘発（ＩＶＧＴＴ）に対する血清グルコー ス応答のグラフであり、自由に浮流するマイクロカプセルに封入されたイヌのア イレットを移植されたラットにおけるその応答と比較されている。 図５は、本発明に従って閉じこめられたカプセル封入したアイレットで移植さ れたラット血糖濃度（黒い円●）の時間に対するグラフであり、そのアイレット が異種移植片（イヌのアイレット）である場合である。１４日目に、閉じ込めら れたアイレットは回収された。その閉じ込められたカプセル封入したアイレット の回収の後２４時間以内に糖尿病状態が再発したので、本発明のマクロカプセル 内に閉じ込められたアイレットの生活能力を証明した。 発明の詳細な説明 以下の明細書は生物学的活性物質、例えば生細胞、をマクロカプセルに封入す る材料および方法を説明するものであって、これらは、例えば、細胞の封じ込み および移植に有用な高い生体適合性を有しかつ回収可能なシステムを提供するも のである。以下の説明において特有の材料および方法のような多くの詳細は本発 明のより完全な理解を与えるために述べられる。本発明はこれらの特別の詳細事 項なしに実施され得ることは当業者により理解されるところである。他の場合に おいて、周知の材料および方法は、本発明を不明瞭にしないように詳細には述べ られない。さらに、次の説明は多くの場合においてアイレットと糖尿病の治療に 特別の言及される。この説明は本発明の特に好ましい適用として与えられる。そ れにもかかわらず、本発明が単一の病状の治療に限定されないことは明らかであ る。本発明は同等に他の種類の細胞および他の病気の治療のためまたは他の生理 学上の目的に用いることができ、そしていかなる形のマイクロカプセルに封入さ れた細胞または封入されない細胞にも使用されることができた。 本発明に従って行われた作業の一部として、顕微鏡写真が従来技術のアルギン 酸塩-ＰＬＬ−アルギン酸塩マイクロカプセルについてその中の障害と欠陥を確 認するためにとられた［例えば、従来技術のマイクロカプセルの説明のため、Ｃ ｌａｙｔｏｎ，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ８：２２１−２３ ３（１９９１）およびＷｉｊｓｍａｎら、Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５４：５８８−５９２（１９９２）を参照さ れたい］。その結果得られた顕微鏡写真は従来技術のマイクロカプセル中の障害 と欠陥を容易に明らかにする。例えば、ある空のアルギン酸塩−ＰＬＬ−アルギ ン酸塩マイクロカプセルの顕微鏡写真（４０×）（ラットの腹膜腔からとられた ）は細胞の異常増殖（暗色部として見える）がカプセル膜の完全性の失なわれる ときに露出したマイクロカプセルゲルの区域または露出したポリリジンの区域に 起ることを証明している。あるアルギン酸塩−ＰＬＬ−アルギン酸塩カプセルに 封入されたアイレットの顕微鏡写真（１００×）は個々のマイクロカプセルに伴 う「粗さ」または「ストレスマーク」の区域を示している。そのような個々のマ イクロカプセルの表面積は大きく、従ってこん度は、「粗い」表面の露出は莫大 であり、そして細胞の異常増殖の危険を増す。その上、アルギン酸塩の外被によ るポリリジンの不完全な被覆は結果として潜在的増殖をもたらす。 あるラットの腹膜腔からすべて同時に回収された、完全に空のアルギン酸塩マ イクロカプセルの中で、欠陥ある空のマイクロカプセルの顕微鏡写真（４０×） は細胞異常増殖（暗色部として現われている）を証明している。激しい異常増殖 は欠陥のあるカプセルにのみ伴われていることが観察される。これはさらに、比 較的小さい欠陥が欠陥のあるカプセルにそして露出したカプセル材料、特にＰＬ Ｌ、に対して異体反応を惹き起す証拠を与える。 糖尿病の逆転に失敗したとき糖尿病のイヌの腹膜腔から回収されたイヌのアイ レットを収容するアルギン酸塩マイクロカプセル（腹膜腔内へ自由浮流で移植さ れた）の破壊したものの顕微鏡写真（４０×）は破壊したカプセルの存在を示し 、機械的安定性の喪失が移植片の機能停止に重要な役割を演じるという証拠を与 えている。これらのマイクロカプセルに封入されたイヌのアイレットは糖尿病の 逆転に成功したが、しかしそれは短期間のみであった。 ここで用いられるとき、用語「マクロカプセル」は生物学的活性物質を包むゲ ル材料のカプセルを意味し、前記活性物質は任意にマイクロカプセル（例えば、 一つ以上のマイクロカプセルで、各マイクロカプセルは少なくとも一つの生細胞 、例えばアイレット、またはその他の薬理学的薬剤を生産する細胞、あるいはあ る種の医薬または生理学上有効な薬剤を収容している）の中に含まれている。前 記用語「マクロカプセル」は「マクロ膜」、「マクロゲル」、「ゲル封入マイク ロ カプセル」、「レース」、「ヌ一ドル」、「ティーバッグ」「より糸」、「うじ 虫」などを含むことがある。それらを当業者はここに述べられた一般的種類の組 成物について理解するであろう。本発明の粒子のいろいろな成分の実際の寸法は 決定的に重要でないが、用語「マイクロカプセル」は一般に、その最大の寸法が 約５〜４０００ミクロンの範囲内にある粒子に関して用いられているが、一方用 語「マクロカプセル」は一般にその最大の寸法が約５００ミクロンから約５０ｃ ｍまでの範囲内にある粒子に関して用いられる。本発明に従って重要なことはマ イクロカプセルの内容物がさらにマクロカプセルの中に封入されることであり、 それにより、ここで述べられるように、マクロカプセルに封入するポリマーの付 加する諸利点を与えるのである。 本発明によれば、生物学的活性物質、例えば、多数の細胞を収容するマイクロ カプセル、はゲル化した物質の厚い層で被覆されて、マイクロカプセル収納マク ロカプセルを形成する。そのようなマクロカプセルの断面を示す略図が図１に与 えられている。この図を調べると、マクロカプセル自身はポリカチオンまたはそ の他の線維原表面を含まないことが判る。その代りに、免疫保護膜（すなわち、 ＰＬＬのようなポリカチオン）がマイクロカプセルの表面に局在しており、それ らのマイクロカプセルはマクロカプセルの内に深く埋め込まれている（そして何 千もの分子層により生体内環境に露出することから保護されている）。マイクロ カプセル（並びにマクロカプセル自身）の核心はゲル化状態（すなわち、橋かけ されたまたは不溶の形）に維持されており、これは従来技術のカプセル封入系と 対照的で、後者では核心材料は液化している。 一般に本発明のマクロカプセル内のゲル化材料の層は少なくとも約１ミクロン の厚さを有するが、少なくとも約２０−４０ミクロンの厚さを有するものが好ま しく、少なくとも５０ミクロンまたはそれ以上の厚さが特に好ましい。これは従 来技術のマイクロカプセルの製造において達成された数分子の厚さ（アルギン酸 塩外層の）よりも効果のある、マイクロカプセル上のポリカチオン層のマスキン グを与える。本発明のマクロカプセル内のゲル化材料の層はマイクロカプセル表 面のすべての免疫原薬剤（例えば、ポリカチオン、カプセル封入されない細胞な ど）の生体内環境への直接露出を防ぎ、それにより従来技術のマイクロカプセル により発動された免疫反応を予防する。さらに、ゲル化材料の層は生理学的諸条 件への長期露出に対して例外的に安定である。それはゲル化材料がイオン的およ び／または共有結合的にそれ自身に橋かけされており、そして強度と安定度につ いて混入された材料との相互作用に依存しないからである。これは従来技術のマ イクロカプセルに使用されるアルギン酸塩外層と全く対照的である。後者におい てはカプセルへのアルギン酸塩外層の投錨の全手段はアルギン酸塩とポリカチオ ン免疫保護層の間の荷電錯体の形成（すなわち、イオン的相互作用）である。 本発明の好ましい実施態様において、マイクロカプセルがマクロカプセルの中 に取り入れられるとき、マイクロカプセル（およびマクロカプセル自身）はゲル 化状態に維持される（すなわち、イオン的および／または共有結合的に橋かけさ れる）。これは従来技術の教示と反対である。後者においてはマイクロカプセル のカプセル封入マトリックスは移植前に液化される。本発明により意外にも本発 明のマクロカプセル内への栄養物の拡散およびカプセル封入された細胞の生産物 のマクロカプセル外への拡散は高能率に行われることが発見された。 本発明のマクロカプセルはいろいろな形に製造されることができる。すなわち 、円箇（すなわち、その一辺の周りに長方形の回転により生じる幾何学的固体） 、球（その直径の周りに半円の回転により生じる固体の幾何学的形体）、円板（ すなわち、一般に平たい、円い形）、平板（すなわち、一般に平たい多角形、好 ましくは正方形または長方形）、ウエフアー（すなわち、不規則の平たいシート ）、ドッグボーン（すなわち、中央の幹と両端を有し、その両端は中央の幹より 直径の大きい形、例えば亜鈴）などの形に作ることができる。 そのような閉じ込めに用いられる材料はアルギン酸塩（好ましくは高いＧ−値 のアルギン酸塩）、またはその生体適合性と安定性を改良するためにそのような アルギン酸塩の改質品、例えば、共有結合橋かけを許す重合性アルギン酸塩、ま たは橋かけ可能のまたは重合可能の、水溶性のポリアルキレングリコール、また はこれらの材料の組み合わせであることができた。そのような材料のゲル閉じ込 みを起させる方法はイオン的または共有結合的橋かけのいずれかにより達成され ることができる。 本発明の実施において使用を予期されているマクロカプセルはその内に生物学 的活性物質を収容する。その場合に前記生物学的活性物質は任意にマイクロカプ セル内に収容される（すなわち、前記マクロカプセル内に多数のマイクロカプセ ルが収容される）。本発明のマクロカプセルはいろいろのポリマー材料から製造 することができる。例えば、共有結合で橋かけできるまたは重合性の線状または 枝分れ鎖のＰＥＧ、異なる分子量の共有結合橋かけ性または重合性の線状または 枝分れ鎖のＰＥＧの混合物、イオン的橋かけ性アルギン酸塩、アルギン酸塩と共 有結合橋かけ性または重合性のＰＥＧの組み合わせ、および共有結合的およびイ オン的に橋かけされることのできる改質アルギン酸塩などから製造できる。 本発明に従って製造されるマクロカプセルは上記の生体適合性の材料の中にカ プセル封入された生物学的活性物質から成る。その際マクロカプセルは、その中 で最大の物理的寸法が１ｍｍより大きい容積を有する。マクロカプセルは「遊離 の」（すなわち、いかなるコーティングによっても改質されていない）細胞また は細胞群をその中に収容することができる。あるいは、マクロカプセルは、マク ロカプセルの内にそれ自身封入されている細胞または細胞群を収容することもあ り得る。 本発明に従って（マイクロカプセルおよび／またはマクロカプセルを製造する ）カプセル封入のために予期されている生物学的活性物質に含まれるものは個個 の生細胞または生細胞のグループ、生物学的物質（診断目的の、例えば、そのよ うな生物学的物質の生物への効果、および反対に、それらの物質の生物への効果 の生体内評価のための）、腫瘍細胞（化学治療薬剤の評価のための）、ＨＩＶの 細胞変性効果に敏感なヒトのＴ−リンパ芽球状物細胞、薬理学上有効な薬品、診 断薬剤などである。ここで用いられるとき用語「生細胞」は、その出所を問わず 、すべての生育力ある細胞物質のことを言う。したがって、ウイルス細胞、原核 生物の細胞、および真核生物の細胞が予期されている。特に予期されている細胞 に含まれるものはランゲルハンス島（糖尿病の治療用の）、ドパミン分泌細胞（ パーキンソン病の治療用）、神経生長因子を分泌する細胞（アルツハイマー病の 治療用）、肝細胞（肝臓の機能不全の治療用）、アドレナリン／アンギオテンシ ンを分泌する細胞（低／高血圧の調整用）、甲状腺労の細胞（甲状腺機能の代替 用）、ノルエピネフリン／メテンセフアリン分泌細胞（痛みの制御用）、ヘモ グロビン（人工血液の製造用）などである。 本発明の実施において使用を予期されている共有結合橋かけ性のおよび／また は重合性のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に含まれるものは線状または枝分 れ鎖のＰＥＧ（ＳＴＡＲ ＰＥＧを含む）でフリーラジカル重合を受けることの できる置換基Ｘにより改変されたものである（Ｘはフリーラジカル重合のできる 炭素−炭素二重結合を含む部分である。そしてＸは前期ＰＥＧに、エステル、エ ーテル、チオエーテル、ジスルフイド、アミド、イミド、第二級アミン、第三級 アミン、直接炭素−炭素（Ｃ−Ｃ）結合、硫酸エステル、スルホン酸エステル、 リン酸エステル、ウレタン、カルボナートなどから選択される結合を通して共有 結合でつなげられている）。そのような共有結合で橋かけできるポリエチレング リコールの例に含まれるものはポリエチレングリコールのビニルおよびアリルエ ーテル、ポリエチレングリコールのアクリラートおよびメタクリラートエステル などである。 広い範囲の分子量を有するＰＥＧを本発明の実施において使用することができ るので、従って本発明の実施において使用を予期されるいろいろな分子量の共有 結合で橋かけされ得るＰＥＧの混合物に含まれるものは約２００から１，０００ ，０００までの範囲のＭＷを有するＰＥＧである（特に約５００から１００，０ ００までの範囲の分子量を有するＰＥＧが好まれ、そして現在約１０００から５ ０，０００までの範囲の分子量を有するＰＥＧが最も好まれる）。そのようなＰ ＥＧは線状または枝分れ鎖であることができる（ＳＴＥＲ ＰＥＧも含む）。Ｓ ＴＥＲ ＰＥＧはある中心核（例えば、ジビニルベンゼン）を有する分子であっ て、その中心核は調節された条件の下でアニオン重合することができ、予め決め られた数の活性部位を有する生きている核を形成する。エチレンオキシドがその 生きている核に付加されて重合し、既知数のＰＥＧの「腕」を生み、それらは望 みの分子量に達するとき水で停止される。あるいは、前記の中心核はエトキシル 化されたオリゴマーのグリセロールであることができ、後者はエチレンオキシド の重合を開始して望みの分子量のＳＴＥＲ ＰＥＧを製造するために使用される ものである。 本発明の実施において使用を予期されているアルギン酸に含まれるものは高い Ｇ−含量のアルギン酸塩、アルギン酸塩ナトリウムなどである。本発明の実施に おいて使用を予期されている共有結合で橋かけできるアルギン酸塩に含まれるも のはフリーラジカル重合を受けることのできる置換基により改変されたアルギン 酸塩である（Ｘはフリーラジカル重合のできる炭素−炭素二重結合または三重結 合を含む部分であり、そしてＸはエステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフ ィド、アミド、イミド、第二級アミン、第三級アミン、直接炭素−炭素（Ｃ−Ｃ ）結合、硫酸エステル、スルホン酸エステル、リン酸エステル 、ウレタン、カ ルボナートなどから選択される結合を介して前記アルギン酸塩に共有結合してい る）。共有結合で橋かけできるアルギン酸塩に含まれるものはアルギン酸塩のア リルおよびビニルエーテル、アルギン酸塩のアクリラートおよびメタクリラート エステルなどである。 本発明の実施において使用を予期されているアルギン酸塩（イオン的および／ または共有重合的橋かけ可能な）と共有結合で橋かけ可能なＰＥＧの組み合せは 上記のアルギン酸塩およびＰＥＧのすべての二つ以上の組み合せを含む。 少量のコモノマーを重合速度を増すために橋かけ反応に添加することができる 。適当なコモノマーの例に含まれるものはビニルピロリジノン、アクリルアミド 、メタクリルアミド、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸ナトリウム、メタ クリル酸ナトリウム、ヒドロキシエチルアクリラート、ヒドロキシエチルメタク リラート（ＨＥＭＡ）、エチレングリコールジアクリラート、エチレングリコー ルジメタクリラート、ペンタエリトリトールトリアクリラート、ペンタエリトリ トールトリメタクリラート、トリメチロールプロパントリアクリラート、トリメ チロールプロパントリメタクリラート、トリプロピレングリコールジアクリラー ト、トリプロピレングリコールジメタクリラート、グリセリルアクリラート、グ リセリルメタクリラートなどである。 上記の改質材料のフリーラジカル重合はいろいろな方法で行われる。例えば、 適当な波長の電磁放射線（例えば、可視又は紫外線）で適当な光開始剤、および 任意に、助触媒および／またはコモノマーの存在において照射することにより開 始されて行われる。あるいは、フリーラジカル重合は適当なフリーラジカル触媒 による熱開始により開始されることもできる。 当業者により容易に認められることができるように、いろいろなフリーラジカ ル開始剤を本発明の実施において使用できる。したがって、光開始剤、熱開始剤 などを使用できる。例えば、適当なＵＶ開始剤に含まれるものは２，２−ジメト キシ、２−フエニルアセトフエノンおよびその水溶性誘導体、ベンゾフエノンお よびその水溶性誘導体、ベンジルおよびその水溶性誘導体、チオキサントンおよ びその水溶性誘導体などである。可視光重合のためには、染料（また開始剤また は光増感剤としても知られている）および助触媒（また助相乗剤、活性化剤、開 始中間体、停止相手、またはフリーラジカル発生剤として知られている）のシス テムが使用される。適当な染料の例はエチルエオシン、エオシン、エリトロシン 、リボフラビン、フルオレシン、ローズベンガル、メチレンブルー、チオニンな どである。適当な助触媒の例はトリエタノールアミン、アルギニン、メチルジエ タノールアミン、トリエチルアミンなどである。 本発明の実施において使用を予期されているマイクロカプセルはいろいろな生 体適合性ゲル材料、例えば、アルギン酸塩、共有結合で橋かけできるアルギン酸 塩（すなわち、共有結合的におよびイオン的に橋かけできる改質アルギン酸塩） 、共有結合で橋かけできるＰＥＧ、上記のアルギン酸塩のいずれかと上記のＰＥ Ｇのいずれかとの組み合せから、並びに前記のような、一種以上のコモノマーの 任意の存在で形成されることができる。 本発明の実施において使用されるマイクロカプセルは任意に、米国特許第４， ３５２，８８３号にＬｉｍにより記載されているように、（ここに引用により組 み入れられる）、免疫保護コーティングで処理される（Ｌｉｍはこのコーティン グを「永久的半透膜」と呼んでいる）。本発明の実施において使用を予期されて いる免疫保護材料に含まれるものはポリカチオン（例えば、ポリアミノ酸［例え ば、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリオルニチンなど］、第一級アミン基、第 二級アミン基、第三級アミン基またはピリジニル窒素を含むポリマー、例えばポ リエチレンイミン、ポリアリルイミン、ポリエーテルアミン、ポリビニルピリジ ンなど）である。そのような免疫保護材料による処理はいろいろな方法で行うこ とができる。例えば、カプセル封入した細胞を収容するアルギン酸塩のゲル化し た核の表面層を、アミンまたはイミン基のような酸反応性基を有するポリマーと 共に橋かけさせることにより行われる。これは一般に選択された免疫保護性ポリ マーの希薄溶液の中で行われる。限界内で、免疫保護性コーティングの半透過性 は免疫性ポリマーの分子量、その濃度、および下敷きのゲルとの橋かけ度の適当 な選択により調節することができる。免疫保護性ポリマーの分子量はまた望みの 透過度に関係して変る。一般的に分子量は約１，０００と１００，０００の間か またはそれより高くなろう。現在本発明の実施において使用される特に好ましい 免疫保護性ポリマーは約１０，０００から５０，０００までの範囲内にある。免 疫保護コーティングの任意の処理は特に、マクロカプセルのまたはマイクロカプ セルの材料が共有結合で橋かけできる場合に省略することができる。その場合に は望みの多孔度（または免疫保護度）が使用される重合性のマクロモノマー（す なわち、重合性アルギン酸塩、重合性ＰＥＧなど）、並びにそれらのモノマーの 混合物の賢明な選択により達成されることができるであろう。 本発明の現在特に好ましい実施態様においては、多数のアルギン酸塩−ＰＬＬ −アルギン酸塩マイクロカプセルが一つのアルギン酸塩マクロカプセル内に閉じ 込められる。使用されるそれらのマイクロカプセルは固体ゲル核を有することが 好ましい。使用されるアルギン酸塩はイオン的および／または共有結合的橋かけ 性であることができる。改質された、共有結合橋かけ性アルギン酸塩について、 マイクロカプセルの多孔度を調節するためおよび／または免疫保護障壁を与える ためにポリカチオンを導入することは任意である。それは望みの多孔度（または 免疫保護度）は適当な濃度の改質アルギン酸塩を使用することにより、またはＸ 部分によるいろいろな置換率を有する改質アルギン酸塩、またはそのような改質 アルギン酸塩の混合物を使用することにより達成されることができるからである 。 他の一つの現在特に好ましい本発明の実施態様は、懸濁されたアルギン酸塩マ イクロカプセル（例えば、アルギン酸塩−ＰＬＬ−アルギン酸塩）を収容する生 理学的の、共有結合橋かけ性の、線状または枝分れ鎖のＰＥＧ水溶液（例えば、 ＰＥＧ−ジアクリラート溶液、または重合性の同等物）の光重合を含む。それら のマイクロカプセルは固体ゲル核を有することが好ましい。適当なフリーラジカ ル開始剤と助触媒が、レーザーまたは水銀灯のような可視光源と共に使用される 。ＰＥＧの固体（すなわち、液化されない）ゲルがアルギン酸塩マイクロカプセ ル の周囲に形成され、そしてそれは機械的支持と回収可能性を与えるのに加えて、 非線維形成性の、細胞に非粘着性の、および免疫保護性の被覆をマイクロカプセ ルの周囲に形成する。この実施態様において、ポリカチオン層は任意である。な ぜなら前記ＰＥＧマクロカプセルは、橋かけ性ＰＥＧの適当な分子量と濃度の選 択により免疫保護性を容易に与えることができるからである。 さらに他の一つの現在好ましい実施態様においては、多数のアルギン酸塩、Ｐ ＬＬ−アルギン酸塩マイクロカプセルが、イオン的および／または共有結合的に 橋かけ可能なアルギン酸塩、および共有結合で橋かけできるＰＥＧから成るマク ロカプセルの中に閉じ込められている。この実施態様では同様に、ポリカチオン 層は任意である。なぜならこのＰＥＧマクロカプセルは、橋かけ可能なＰＥＧの 適当な分子量と濃度を選択することにより免疫保護性を容易に与えることができ るからである。 なおさらに現在好ましい実施態様において、多数のアルギン酸塩−ＰＬＬ−ア ルギン酸塩マイクロカプセルが（イオン的および／または共有結合的に橋かけ可 能な）アルギン酸塩マクロカプセル内に閉じ込められ、次いでＰＥＧの被覆が施 されてＰＥＧとアルギン酸塩か密接に接触するようになり、そしてそのＰＥＧは マクロカプセルの表面に露出している。この実施態様においても同様に、ポリカ チオン層は任意である。なぜならば橋かけ可能なＰＥＧの適当な分子量と濃度の 選択によりＰＥG外被は容易に免疫保護性を与えることができるからである。 さらに他の一つの現在好ましい実施態様において、生物学的活性物質は、イオ ン的および／または共有結合的に橋かけ可能なアルギン酸塩、および／または共 有結合により橋かけできる線状または枝分れ鎖のＰＥＧから成るマクロカプセル 内に直接閉じ込められている。 本発明はこれから次の非限定的実施例によりなお詳細に説明されるであろう。 例１ アクリロイルクロリドを用いるＰＥＧジアクリラートの製造 分子量１８５０００ＰＥＧ（略称１８．５Ｋ、またＰＥＧ２０Ｍとしても市販 されている）を次の手順を用いて化学的に改質してその分子を重合可能にするア クリラート官能基を分子中に導入した。他のＰＥＧでその分子量が２００程の低 いものから３５０００程の高いもの（しかしこれに限定されない）の範囲内のＰ ＥＧも同じ手順で改質することができた。 ＰＥＧＩ８．５Ｋを真空オーブンの中で８０℃に２４時間加熱することにより 完全に乾燥した。またはその代りに、ＰＥＧをトルエン中に溶解してからその溶 液を蒸留すると、すべての湿分をトルエンとの共沸混合物として除去することが できた。２０ｇの乾燥ＰＥＧを２００−２５０ｍｌの乾燥トルエン（アセトン、 ベンゼン、およびその他の有機溶媒もまた使用されてよい）の中に溶解した。２ 倍のモル過剰のアクリロイルクロリドを使用し（０．３５ｍｌ）、そしてトリエ チルアミン（０．６ｍｌ）を加えて生成するＨＣＩを除いた。アクロイルクロリ ドを加える前に、前記の溶液を氷浴中で冷却させた。反応は丸底フラスコ内でア ルゴン下に絶えず還流させながら２４時間行われた。その反応混合物を濾過して 不溶のトリエチルアミン塩酸塩を除去し、一方濾液を過剰のエーテルに加えてＰ Ｅジアクリラートを沈殿させた。生成物を再溶解と沈殿を２回行ってさらに精製 してから、すべて残る溶媒を真空中で除いた。他の精製方式、例えばＰＥＧ−水 溶液を脱イオン水に対して透析してから次に凍結乾燥することもまた採用できる 。 収率：１７ｇ。 例２ 重合可能のＰＥＧの他の製造方法 ＰＥＧ鎖の末端に不飽和基を導入することより重合可能のまたは橋かけ可能の 改質ＰＥＧを製造するために数種の他の方法を使用することもできる。これらの 方法の若干を以下に簡単に要約する。 ＰＥＧとアクリル酸（またはより高級の同族体またはその誘導体）の間のエス テル化反応はトルエンのような有機溶媒中で行うことができる。少量の酸、例え はｐ−トルエンスルホン酸を用いて反応の触媒とすることもできる。反応物の一 つ（アクリル酸）の過剰は反応を生成物の方へ追いやるであろう。反応は数時間 還流される。反応の生成物として水が生じるので、平衡を生成物の方へ追いやる ために、それをトルエンとの共沸混合物の蒸留により連続的に除去することもで きる。標準的精製方式が用いられてもよい。メタクリル酸またはメタクリラート もＰＥＧと同様にして反応させられて重合可能な誘導体を得ることができる （ＦｕｋｕｉとＴａｎａｋａ，１９７６）。 あるいはその代り、ＰＥＧのビニルエーテルを生成するＰＥＧアルコキシドと アセチレンガスとの反応を含むＭａｔｈｉａｓらの方法（１９８２）も重合可能 なＰＥＧ誘導体を製造するために使用できる。 乾燥した溶媒中で少量の塩化第二スズを触媒とするＰＥＧとアリルクロリドの 間の反応もまた結果として重合可能なＰＥＧを生成する。 その他数種の技術が重合可能なＰＥＧ誘導体を得るために利用されることがあ る。Ｈａｒｒｉｓ（１９８５）は、それから他にとるべき合成方式が与えられる ＰＥＧ化学を含む多数の論文を書いている。 例３ ＰＥＧゲルを製造するための可視光光重合 例１および２に要約された技術により製造されたＰＥＧ誘導体を重炭酸塩緩衝 水溶液（例えば４−５０重量％、またはその他の緩衝液）中に溶解した。光増感 剤、エチルエオシン（０．０１μＭ〜０．１Ｍ）、助触媒、トリエタノールアミ ン（０．０１μＭ〜０．１Ｍ）、およびコモノマー、ビニルピロリドン（０．０ ０１〜１０％、しかし不可欠ではない）がその溶液に加えられ、溶液は光重合反 応まで光から保護された。その代りに、その他の開始剤、助触媒、コモノマーお よび数波長のレーザー線が使用されてもよい。それらの選択は当業者に周知のこ とである。 調整された溶液の少量を試験管の中に取って、１０ｍＷ〜２Ｗの出力で５１４ ｎｍの波長のアルゴンイオンレーザーからか、または１００ワット水銀アーク灯 （約５１４ｎｍのかなり強い発光を有する）からの可視光に露出させた。ゲル化 時間が記録され、そしてレーザーによれば極めて速い（ミリ秒の程度）ことおよ び水銀灯によればかなり速い（大体数秒で）こと、またその系内のポリマー、開 始剤、助触媒、およびコモノマーの濃度により変ることが伴った。 例４ ＰＥＧゲルを製造するための紫外線光重合 前記と異なる開始システムがＰＥＧゲルを製造するために用いられた。ＵＶ光 開始剤、２，２−ジメトキシ−２−フエニルアセトフエノンを１０００−１５０ ０ｐｐｍの濃度で水性緩衝液中の重合性ＰＥＧ溶液に加えた。この溶液を１００ ワットＵＶランプからの長波長紫外線に露光させた。ゲル化に要した時間は大体 数秒であり、そして開始剤の濃度およびビニルピロリドンのような他の重合性モ ノマーの添加（０．００１〜１０％）の関数であった。ＵＶレーザーもまたその 光重合のために使用されてよい。その他の光開始剤もまた使用することができる （例えば、ベンゾインエチルエーテル）。 例５ 移植用マイクロカプセル内蔵ＰＥＧゲルの形状寸法 細胞または酵素または医薬を内蔵するアルギン酸塩またはその他の材料のマイ クロカプセルはいろいろな形状寸法のマイクロカプセルを収容するＰＥＧゲルを 用いて移植組織から解放および回収されることができる。多数の個々のマイクロ カプセルを橋かけされたＰＥＧゲル内にこれらのマイクロカプセルを埋め込むこ とにより腹膜腔（または他の移植部位）内の特に好ましい区域に局在化させるこ とができよう。移植のためにいろいろな形状、例えば、円筒棒、円板、平板、ド ッグボーン、および長円箇の「レース」または「より糸」または「うじ虫」のよ うな形状が考えられてよい。 形状の如何にかかわらず、最終的な移植できる製品は同様の加工技術を必要と した。細胞を内蔵するマイクロカプセルを、トリエタノールアミン（０．０１μ Ｍから０．１Ｍまで）、エチルエオシン（０．０１μＭから０．１Ｍまで）、お よびビニルピロリドン（０．００１〜１０％）を含むＰＥＧ１８．５Ｋジアクリ ラートの生理学的溶液（３０重量％、いろいろな分子量のＰＥＧが使用されてよ い）の中に懸濁させた。この懸濁液をレーザーまたは水銀灯からの可視光に露光 させると、それは速やかなＰＥＧ−ジアクリラートの橋かけを生じさせ、その結 果ＰＥＧゲル内に埋め込ましたマイクロカプセルを作る。 円箇形の「レース」を造るためには、懸濁液を適当なゲージの針またはカニュ ーレを有する皮下注射針の中に入れ、そして出現する流れを緩衝液（もしアルギ ン酸塩が懸濁液中に使用されているならばそれは多価カチオンを有することにな る）の中に押出し、同時にもし光重合が反応に必要ならば、適当な灯源からのレ ーザー放射線に露出させる。そのランプは重合させられる物質および、当業界周 知のような、使用される光開始剤に応じてレーザー光源またはＵＶ光源であるこ とができた。橋かけは瞬間的である。すなわち、出てくる流れは、それが押し出 されるのと同じ速さで光橋かけされ、その結果「レース」または「ヌードル」を 形成する。ゲルまたはその他の形状はその目的のために製作された適当な金型か ら製造されることができる。 例６ マイクロカプセル封入されたアイレットのアルギン酸塩閉じ込め イヌのアイレットを提供者の膵臓からコラーゲナーゼ消化により分離してから 、生理学的アイレット精製液を用いて精製した。次にアイレットをアルギン酸塩 −ポリリジン−アルギン酸塩マイクロカプセルの中に次の方法により封入した。 １万個の精製したアイレットをアルギン酸ナトリウムの１．８％溶液（Ｇ含量 ６４％）の中に懸濁させてから、空気−小滴発生装置を経由して、アルギン酸塩 を０．８％ＣａＣｌ2溶液中で橋かけすることによりアイレットをアルギン酸塩 ゲルビーズの中に閉じ込めた。ポリリジン膜がこれらのアルギン酸塩カプセル封 入されたアイレットを０．１％ポリリジン溶液中に４−８分間懸濁させた後に形 成された。そのカプセル封入されたアイレットを次に０．２％アルギン酸溶液中 に５分間懸濁させることによりアルギン酸塩の外層で被覆した。 次にこれらのマイクロカプセル封入したアイレットを包むアルギン酸塩の円箇 形管（すなわち、レース、直径約１−５ｍｍ）を以下のようにして造った。 マイクロカプセル封入したアイレットを１．８％アルギン酸塩液中に４容積の アルギン酸塩に対して１容積のマイクロカプセルペレットの比率で懸濁させてか ら、ＣａＣｌ2のみを含む二価陽イオンの溶液中に、またはバリウムとカルシウ ムの塩化物の組み合せの溶液中に押し出した。二価陽イオン橋かけ剤の組み合せ としての塩化バリウムと塩化カルシウムの比率は１：１０から１：１００まで（ バリウム：カルシウム）変ることができ、そして特に好ましい比率は１：５０か ら１：１００までの範囲内にある。バリウムとカルシウムを組み合せることによ り、より高い強度のゲルを結果として生じる。したがって、このイオン的橋かけ の方法により、約８０００個のマイクロカプセルに封入されたアイレットが１６ ｃｍの長さのアルギン酸塩ゲルの円筒管の中に閉じ込められる。 またその代りに、マイクロカプセル封入したアイレットを収容する球形のマク ロカプセルを、上記の溶液の小滴（すなわち、アルギン酸塩溶液中のマイクロカ プセル封入アイレット）を、前記のように、多価陽イオン（例えば、Ｃａ++）を 含む浴の中へ導入することにより製造することができる。 例７ 回収可能なシステムの組成における変態 回収可能なシステムの設計において用いられる組成と材料における数の変態が 受け入れられかつ有益である。アルギン酸塩マイクロカプセルを内蔵する橋かけ されたアルギン酸塩またはＰＥＧ球（またはレース）は適当な状況においてイオ ン的および／または共有結合的に橋かけしたアルギン酸塩球と取り替えられるこ ともできる。次の変態は、その他のものの中で、可能である。 （ｉ）ＰＥＧ単独、前記のように橋かけされたもの、いろいろな分子量の橋かけ 可能なＰＥＧ（線状または枝分れ鎖）の混合物が結果として生成するゲルの透過 度を調整するために用いられることができる。 （ii）アルギン酸塩単独、イオン的に橋かけされたもの。 （iii）アルギン酸塩単独、イオン的および共有結合的両方で橋かけできるよう に改質されたもの。 （iv）イオン的橋かけ可能なアルギン酸塩と共有結合的に橋かけ可能なＰＥＧ（ 線状または枝分れ鎖）の組み合せ。 （ｖ）改質されたアルギン酸塩（すなわち、イオン的および共有結合的に橋かけ 可能な）および共有結合で橋かけ可能なＰＥＧ（線状または枝分れ鎖）の組み合 せ。および （vi）イオン的および／または共有結合的に橋かけされたアルギン酸塩マクロカ プセル（例えば、球またはレース）であり、共有結合で橋かけされたＰＥＧ（線 状または枝分れ鎖）の被覆により包まれ、後者はＰＥＧとアルギン酸塩が密接に 接触するように外側を覆っている。 アルギン酸塩のイオン的橋かけはＣａ++単独でかまたはＢａ++とＣａ++の１： １０〜１：１００（Ｂａ：Ｃａ）の比率の組み合せかいずれによっても達成され ることができる。 前節において述べたアルギン酸塩は、そのイオン的ゲル化性能に加えて化学的 に橋かけできる改質アルギン酸塩で代替されてもよい。ここに述べた改質アルギ ン酸塩は同時係属特許出願第０７／７８４，２６７号に詳細に記載されている（ その全体を引用によりここに組み入れられる）。 前記のＰＬＬもまた共有結合で橋かけできる改質ＰＬＬにより代替されてもよ い。ここに述べた改質ＰＬＬは同時係属特許出願第０７／７８４，２６７号に詳 細に記載されている（その全体を引用によりここに組み入れられる）。 例８ ゲルに閉じ込められたカプセル封入アイレットからのインシュリン拡散の動力学 、試験管内の研究 ゲルに閉じ込められたカプセル封入アイレットからのインシュリン分泌の動力 学は個々のマイクロカプセル封入アイレットまたはカプセル封入されなかったイ ヌのアイレットと次のように比較された。遊離のカプセル封入されないイヌのア イレット（対照）またはカプセル封入されたイヌのアイレットまたはゲルに閉じ 込められたカプセル封入されたイヌのアイレットのいずれも基底濃度の６０ｍｇ ％グルコースを含むＲＰＭＩ培地に６０分間保温し、それから刺激濃度の４５０ ｍｇ％グルコースを含む培地に６０分間移し、そして基底培地（６０ｍｇ％グル コース）にさらに６０分間戻した。これらの試験は三通りに行われた。上澄液を 各６０分間の終りに採集した。インシュリン分泌は、ＲＩＡを使用して、上澄液 中のインシュリン濃度（アイレット相当計数につきμＵ／ｍｌ）を測定すること により評価された。 この試験は繰返し行われたか、しかしさらに、１０ｍＭのテオフイリンがイン シュリン分泌の追加刺激として前記４５０ｍｇ％のグリコースに加えられた。こ れらの試験の結果が表１に示されている。 当業者は、カプセル封入したイヌのアイレットをさらにポリマー材料の外被の 内に閉じ込めることは結果として刺激に対する応答を弱めかつインシュリンの拡 散を減少させることを期待しただろう。すなわち、カプセル封入したアイレット をさらに第二のポリマー材料の層の中に閉じ込める［マイクロカプセル・プラス ・マクロカプセル］ことはカプセル封入されたアイレットの外部刺激に対する敏 感度を減少させると期待されたであろう。意外なことに、本発明により、ゲルに 閉じ込められたマイクロカプセル封入アイレットの試験管内における応答は、自 由浮流のカプセル封入アイレットに比較して、より良いとは言えないとしても、 同等であることが判明した（表１参照）。 ４５０ｍｇ％グルコース単独による刺激の後、マクロゲル内に固定されたマイ クロカプセル封入アイレット（「閉じ込められたＭＣ」）からのインシュリン応 答（表１参照）は、自由浮流マイクロカプセル封入アイレット（「自由ＭＣ」） 並びに自由なカプセル封入されないアイレット（「自由アイレット」）と比較し て、もしそれらより良いと言えないにせよ、同等であった。この現象はまた４５ ０ｍｇ％グルコース＋１０ｍｇテオフイリン刺激に対する応答においても見られ た。いかなる特定の理論にも束縛されたくないが、現在仮定されることは、この 驚くべき結果はインシュリンが負に荷電したタンパク質であり、そしてグルコー ス刺激に反応して閉じ込められたマイクロカプセルに封入された細胞からのイン シュリンの放出と共に、負荷電のインシュリンは負に荷電した閉じ込めているゲ ル材料から静電気的に排出され、かくしてインシュリン放出の応答時間を加速す るという事実により説明されることである。マクロゲル内のマイクロカプセル封 入アイレットからのインシュリン放出が、個々のカプセル封入アイレットからの インシュリン放出に比較して、高められることはまた、マイクロカプセル膜内に 正に荷電したＰＬＬの存在のために、マイクロカプセルがマクロカプセルよりも さらに中性に荷電している事実によっても説明されることができる。この予期さ れなかった結果は生体内試験（例９に記載の）において確証された。その場合に 静脈内グルコース注射に反応する血清グルコースの低下は、ゲルに閉じ込められ たマイクロカプセル封入したイヌのアイレットで処置された糖尿病のラットにお いて急速に起った（図３参照）。このことはゲル閉じ込めは全身的なグルコース 信号に対する改良されたインシュリン応答という追加された利点を与えることを 暗示する。 表１に示された諸結果は、カプセル封入されたイヌのアイレットをゲルに閉じ 込めることは、グルコース刺激に反応するまたはグルコース＋テオフイリンに反 応するインシュリン分泌を損わないことを証明している。インシュリン濃度の基 底状態への復帰は、しかし、マクロカプセル実験において遅らされ、そして外側 ゲル内のインシュリンの閉じ込めと一致し、その結果実質的に持続した放出薬送 り出しシステムをもたらす。生体内の適用において、この持続したインシュリン 放出はより安定な恒常性のメカニズムを提供することができよう。 したがってマイクロカプセル封入アイレットのゲル閉じ込めはインシュリン分 泌に関していくつか予期せぬ利点を提供する。 （ｉ）グルコース刺激に対するインシュリン放出の速やかな反応、および （ii）一度インシュリンが放出されると、基底状態への復帰が遅いので、より長 い期間に亘り持続しかつ連続した放出を与える。 これらの反応のいずれもが糖尿病受容者におけるグルコース代謝の恒常的調節 を改善する上で重要である。 例９ ゲルに閉じこめたマイクロカプセル封入アイレットの生体内試験 ゲルに閉じこめたマイクロカプセル封入アイレットの有効性を自由浮流マイク ロカプセル封入アイレットとストレプトゾチシン誘導（ＳＴＺ）糖尿病のラット の治療において比較した。８千個のカプセル封入したイヌのアイレット（自由浮 流の、またはアルギン酸塩の円筒管の中に閉じこめられた）を４匹のＳＴＺ糖尿 病ラットの腹膜腔内に移植し、そして同じ方法で移植された８千個のカプセル封 入されないアイレット（対照）と比較した。 生育力、純度および機能に変動性のないことを確実にするため、同じイヌの膵 臓提供者からのアイレットが自由浮流マイクロカプセル封入およびゲル閉じ込め マイクロカプセル封入の両群に使用された。さらにマイクロカプセル自身の完全 さと構造に変動性のないことを確実にするため、アイレットはワンバッチ法です べてカプセル封入され、それから二つに分割された。一つの半分は自由浮流移植 のために使用され、残りの半分は移植の前にアルギン酸塩マクロカプセルの中に 閉じ込められた（すなわち、ゲル閉じ込めマイクロカプセル封入アイレット）。 カプセル封入されない（自由の）アイレットの免疫保護性、生体適合性、機能 および移植片生存が自由浮流カプセル封入アイレット（マイクロカプセルに入っ ているだけの）と比較して、閉じ込められたカプセル封入アイレット（その中に マイクロカプセルを有するマクロカプセルの中の）と比較して測定により比較さ れた。 （ｉ）毎日の血清グルコース濃度（表２参照） 糖尿病がラットにおいてＳＴＺ注射により誘発された。注射されたラットは、 もし血清グルコース濃度が２００ｍｇ％より大きいならば糖尿病とみなされる。 カプセル封入しないイヌのアイレット（自由アイレット）は糖尿病のラットにお いて正常血糖値（２００ｍｇ％以下の血清グルコース濃度）を回復することがで きなかった。自由浮流マイクロカプセル封入アイレットとマクロカプセル封入ア イレットは両者共これらの糖尿病ラットにおいて第３〜第４日により正常血糖値 を回復した。７日で、自由浮流マイクロカプセル封入アイレットは衰え始めて、 血清グルコース濃度がこれらの受容者において２００ｍｇ％以上に上った。対照 的に、ゲル閉じ込めマイクロカプセル（マクロカプセル）を受容しているラット はその正常血糖状態を続け、血清グルコース濃度は１００ｍｇ％以下を保った（ 図２）。それ故これらの生体内試験は、（自由浮流マイクロカプセル封入アイレ ットに比較して）マイクロカプセル封入したアイレットのゲルに閉じ込められた ものは、移植片の生存を、多分細胞保護性および生体適合性を高めることにより 、期間延長するという証拠を提供する。 （ii）毎日の尿量 糖尿病の発病と共に、尿量は増加する。ＳＴＺ注射の後、尿量は３０ｃｃ／日 を超えて糖尿病状態を示す。糖尿病の消散と共に、尿量は正常水準に落ちる。尿 量の減少は血清グルコースの低下と一致して、移植片機能およびマクロカプセル 封入アイレットの生存は自由なカプセル封入されないアイレットおよび自由浮流 マイクロカプセル封入アイレットの両者に優っていた。７日目に、自由浮流マイ クロカプセル封入グループの尿量は糖尿病水準（＞３０ｍｌ）に上って、移植片 の機能停止を示したが、その一方でゲルに閉じ込められたマイクロカプセル（す なわち、マクロカプセル）を受容しているラットは排尿量の正常水準を維持して 、継続している移行片機能を示した。 （iii）体重 ＳＴＺ注射の後、糖尿病のラットは劇的に体重を減らした。体重の維持または 体重増加は移植されたアイレットの機能の優れたパラメーターである。尿量と血 清糖濃度の間の関係と同様に体重の変化は上記の分析に確証を与えて、さらにマ クロカプセル封入アイレットを受容しているラットは、自由なカプセル封入され ないアイレットを受容しているラットおよび自由浮流マイクロカプセル封入アイ レットを受容しているラットにおける移植片機能停止に比較して、正常な移植片 機能を維持するという証拠を提供した。ゲルに閉じ込められたマイクロカプセル （すなわち、マクロカプセル）を受容する動物において体重は著しく向上したが 、その一方で糖尿病の結果としての体重減少は自由なカプセル封入されないアイ レットを受容した動物で続き、また自由浮流するカプセル封入アイレットを受容 した動物では７日後に起った。 （iv）系統的グルコース誘発に対するグルコース応答 （静脈内でグルコース許容度試験、ＩＶＧＴＴ、図３参照） ＩＶＧＴＴは静脈内グルコース誘発に反応するインシュリン放出の動力学の生 体内評価を与える。時間に対してグルコースの低下速度を計算することにより、 数値（Ｋ−値）を確定し、そして正常な糖尿病でないラットに比較することがで きる。グルコース誘発の後に続く血清グルコースの低下が速いほど、Ｋ−値はそ れだけ高くなる。静脈内グルコース誘発に反応する血清グルコースの低下はラッ トのマクロカプセル封入アイレットを受容したものと自由浮流マイクロカプセル 封入アイレットを受容したものの両者において試験された。血清グルコースはｋ ｇ当たり０．５ｃｃの５０％デキストロースの静脈内注射に続いて１、４、１０ 、２０、３０、６０および９０分に測定された。図３に見ることができるように 、静脈内注射の後で、血清グルコースはマクロカプセルに封入した群では４８９ ｍｇ％に上がって、それから１０分以内に正常濃度まで急速に低下し、系統的グ ルコース誘発に対して優れた生体内インシュリン応答を示した。Ｋ−値 （それは時間に対するグルコースの低下％を表わす）はこの動物において正常（ ３．８１±０．５６）であった。この意外に急速なインシュリン応答は例８に記 載の試験管内の所見、すなわち、アルギン酸塩ゲルに閉じ込められたマイクロカ プセルはグルコース刺激に対して速やかに反応することに確証を与え、そしてア ルギン酸塩閉じ込めの潜在的利点はカプセル内からの負荷電インシュリンの静電 的反発であり、したがって系統的誘発に反応する急速なグルコースの生理学的低 下である証拠をさらに提供する。 マクロカプセルを受容しているラットのＫ値は、自由浮流カプセル封入アイレ ットを受容しているラットのそれ（Ｋ＝０．６±０．７３）よりも著しく良い（ Ｋ＝３．８±０．５６）ので、自由浮流カプセル封入アイレットを受容している ラットにおける移植片機能の損失を示す。両群に移植されたアイレットは同じイ ヌの提供者であり、かつ使用されたアイレットの容量は同一であるので、この応 答における差異はマクロカプセルの改良された免疫保護性を反映する。 別の実験において、自由浮流カプセル封入したイヌのアイレットが糖尿病のラ ットに移植され、そしてＩＶＧＴＴがこれらの受容者において行われたが、その 間移植片の機能は正常（１００ｍｇ％以下の血清グルコース）であった。図４に 見ることができるように、デキストロースの静脈内注射の後の血清グルコースの 正常濃度への低下はやっと３０分後であった（Ｋ値２．４±０．９）がこれに比 較してマクロカプセルに封入されたアイレットを受容しているラットにおけるグ ルコースの低下はもっと速く（１０分以内）であった（Ｋ値３．８１±０．５６ ）。 上記の生体内試験から、以下のことが結論される。 （ｉ）マイクロカプセルに封入されたアイレットをゲルに閉じ込めることはグル コース刺激に反応するインシュリンの拡散速度を試験管内および生体内の両方に おいて減少させない。 （ii）マイクロカプセルに封入されたアイレットをゲルに閉じ込めることは実際 にインシュリンの放出を促進する。 （iii）マイクロカプセルに封入されたアイレットをゲルに閉じ込めることは移 植片機能を延長する。 例10 ゲルに閉じ込められたマイクロカプセル封入アイレットの回収 ゲルに閉じ込められたマイクロカプセル封入アイレットをＳＴＺに誘導された 糖尿病のラットに移植して、１４日間追跡調査した。正常血清グルコース濃度は ３日以内に達成され、そして全観察期間に維持された。１４日目に、マクロゲル 化されたカプセル封入アイレットは回収されて、顕微鏡で検査された。 顕微鏡写真で観察されたとき、閉じ込められたマイクロカプセル内の生育し得 る完全なアイレットかマクロゲルの外側表面層の細胞異常増殖の証拠なしに見い だされた。本発明によるイヌのアイレットを内蔵するマクロカプセルを移植の１ ４日後にＳＴＺ−糖尿病Ｌｅｗｉｓラットの腹膜腔から回収して撮影した顕微鏡 写真（１００×）はマクロカプセルの外側露出層上に、細胞異常増殖の証拠のな い滑らかな表面を示した。カプセルに封入された生育し得る個々のイヌのアイレ ットがマクロカプセル内に含まれているのを見ることができる。その回収時にお いて、この糖尿病ラットは正常血糖性であった。 マクロゲル化されたカプセル封入アイレットの回収の後ラットにおける血清グ ルコース濃度を監視した。図５に見ることができるように、マクロカプセルの回 収後２４時間以内に血清グルコース濃度は２００ｍｇ％以上に上り、マクロゲル 化カプセル封入アイレットが血清グルコースの正常化の原因になっていることを 示し、そしてさらにマクロカプセルの免疫保護性および生体適合性の証拠を与え た。 これらの試験から、次のことを結論することができる。 （ｉ）ゲルに閉じ込めることは、自由浮流するマイクロカプセルに封入されたア イレットよりも滑らかな表面、減少した露出表面積および従って増加した生体適 合性を与える。 （ii）ゲルに閉じ込めることはカプセル封入されたアイレットの機械的安定性を 増加しかつたとえ個々のカプセルが壊れたとしても保持するマトリックスを与え る。 例11 発明のマクロカプセルを移植された自発的糖尿病のイヌにおける糖尿病症状の緩 和 診断の時にタイプＩの真性糖尿病の古典的病状、すなわち、多尿症、多食多渇 症、多食症、体重損失、持続性の空腹時高血糖症（すなわち、血糖＞２５０ｍｇ ／ｄｌ）、持続性糖尿、急速な代償不全を防ぐために毎日１−２回のインシュリ ン注射の必要などのような臨床徴候を有する自発的糖尿病のイヌが本発明のマク ロカプセル（多数のマイクロカプセル封入アイレットを収容する）の移植のため の受容者として選ばれた。 健康なイヌの提供者からのアイレットを従来の方法（例えば、コラーゲナーゼ 消化）を用いて分離した。次にアイレットを前記のように（例えば、例６参照） 、従来慣用のアルギン酸塩−ＰＬＬ−アルギン酸塩マイクロカプセル（直径約６ ００ミクロン）の中に封入した。それらのマイクロカプセルをそれからさらに、 塩化カルシウムを含む浴の中へアルギン酸塩溶液中マイクロカプセル懸濁液を押 し出すことによりイオン的に橋かけられたアルギン酸塩のマクロカプセル（約４ ０００−８０００ミクロンの球形ビーズ）の中に閉じ込めた（すなわち、カプセ ル封入した）。約６０−８０個のマイクロカプセルが単独のマクロカプセルの中 に閉じ込められた。 移植の前に、その犬は毎日１２単位のインシュリン食飼療法に維持されていた 。移植は一般的麻酔下に１．５腹正中切開を通して行われ、そしてそれらのマク ロカプセルはステンレスの漏斗を通って腹膜腔の中へ導入された。イヌは約２０ ，０００アイレット／ｋｇ体重の移植投与量を受容した。切開はそれから縫合に より閉じられた。プレドニゾロンの食飼療法が移植後１４日間抗炎症薬として維 持された。空腹時血糖値、血漿Ｃ−ペプチド、排尿量および体重が移植後１４日 間毎日、そしてその後７日毎に測定された。静脈内グルコース許容度試験（ＩＶ ＧＴＴ）が移植前７日、移植後1４および３０出その後３０日毎に行われた。 すべての測定されたパラメーターは移植後３日以内に正常の非糖尿病値に戻っ た。血糖は２００ｍｇ／ｄｌ以下によく保たれ、そしてそのイヌは移植後１５０ 日以上、外因性のインシュリンの必要なしに、正常血糖濃度のままであった。 ＩＶＧＴＴの結果は正常でありかつグルコースの大粒の丸薬による誘発の後で速 やかなグルコースクリアランスを示した。 例12 グン・ラット・モデル（Ｇｕｎｎ Ｒａｔ Ｍｏｄｅｌ）におけるカプセル封入 肝細胞の移植による肝欠損症の逆転 肝臓酵素ウリジンジホスファートグルクロニルトランスフェラーゼ（ＵＤＰＧ Ｔ）の欠損およびその結果の高い血清ビリルビン濃度（一般に黄疸として知られ ている状態）を有する同型接合のグンラット（Ｇｕｎｎ ｒａｔ）が肝欠損症の モデルとして選ばれた。異常遺伝子を持つが、黄疸のない異型接合のグンラット が細胞移植のための肝細胞の提供者として選ばれた。 提供者の肝臓は門脈を経由してシリコーン管（内径０．０２５インチ、外径０ ．０４７インチ）と共にカニューレを挿入され、そして１５分以内に１００ｍｌ の０．０５％コラーゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ，タイプＩＶ）で灌流された。その肝 細胞は無菌のビーカーに取入れられ、そして３回ＲＰＭＩ媒液で洗われた。分離 された肝細胞の生育力はアクリジンオレンジ／ヨウ化プロピジウム染色により試 験されて、８０％以上であることが伴った。 それらの肝細胞は従来慣用のアルギン酸塩−ＰＬＬ−アルギン酸塩マイクロカ プセルの中へ前記のように封入された。これらのマイクロカプセルはさらに、前 記のように、イオン的に橋かけされたアルギン酸塩の球形マクロカプセルの中に 閉じ込められた（またはカプセル封入された）。約５０−１００個のマイクロカ プセルが単独のマクロカプセルの中に閉じ込められた。各受容者は〜１０7のカ プセル封入された肝細胞を受容した。それらのマクロカプセルは受容者の腹膜腔 内に移植された。 移植の前に、受容者のビリルビン濃度は５．３±０．３ｍｇ％であった。移植 後第２週までに、血清ビリルビン濃度は２．０５±１．０５ｍｇ％に減少した。 これは移植前の濃度より著しく低いものであった。これらの減少した濃度は平均 ７３±４日の間維持された。すべての受容者は抗炎症剤としてシクロスポリンＡ を受容した（１０ｍｇ／ｋｇ，すなわち、免疫拒絶を防ぐために必要なよりも低 い水準で）。従って、本発明のマクロカプセルの可能性と効率は肝細胞の生体内 移植について証明される。 本発明は若干の特に好ましいその実施態様に関して詳細に説明されたが、一部 の修正および変形は記載されおよび請求されている精神と範囲の内にあることは 理解されるであろう。 Detailed Description of the Invention             Protects cells for biologically active substances and is biocompatible,                 Reusable macro encapsulation system   The present invention provides a novel method for encapsulating encapsulated or free cells to provide an immune barrier. A new form of biocompatible material. As a result, the encapsulated material is generally small. Luckily, but macroscopically, it can be reused in the field. In more detail The present invention relates to compositions and systems for the treatment of diabetes.                               Background of the Invention   Diabetes Mellitus has more than 100 million people worldwide It is an important illness that bothers people. Over 12 million in the United States Diabetes patients, and 600,000 new patients are diagnosed with diabetes each year . Insulin-dependent or Type I diabetic patients are prevented from falling into a coma. Needs daily insulin injections to bolster.   With the discovery of insulin in 1928, diabetes may have been cured It was Unfortunately, despite insulin treatment, high blood glucose levels cause There remain major complications of this disease. Every year in the United States, diabetes Count 40,000 limb amputations and 5,000 new blind patients. Teenager Among them, diabetes is the leading cause of renal failure. National Institutes of Health Data from al Institute of Health) is heart disease and heart Stroke rates are twice as high in the diabetic population as in the general population.   Diabetics face a 30% reduced lifespan. Many given regularly throughout the day Several injections of insulin imitate precise regulation of insulin secretion from the pancreas. I cannot copy. Currently the only one that achieves constant glucose regulation in minutes The method is by pancreas transplantation.   Although whole-organ pancreas transplantation represents an important advance in diabetes treatment, its surgery Difficult and limited in success and use due to rejection issues, and Yes, it still presents a considerable risk to the patient. An attractive alternative is the provider Insulin-producing cells (eyelets) were extracted from the pancreas of The cysts would be injected into diabetic patients, thus providing a curative effect. But that Use of cells such as will still risk rejection by the recipient.   Alginate-PLL-alginate membrane (i.e. alginate-poly-L -Lysine-alginate membrane) It is a potential method for preventing rejection by the immune system. With this technology, researchers Can trap live eyelets in a protective membrane and The membrane allows the secretion of insulin, but the antibody reaches the eyelet and blocks the cell. To prevent severance. Does this membrane (or microcapsule) reject the eyelet? The insulin and allowing insulin to be secreted through its “pore”. Maintain the patient with normal glucose control.   Successful implantation of microencapsulated eyelets has so far been clinical Not feasible, but it is transplant rejection and / or microcapsule membrane This is because of the fundamental problem of the fibrogenic response to Lim and Sun, 1980. First successful microencapsulated eyelet in diabetic rats The transplant was reported and the blood glucose regulation was described. However, microencapsulated In order for ilette to be clinically effective and applicable in humans, its immune protection The membrane is biocompatible and the encapsulated cells respond appropriately to stimulatory signals Allows proper diffusion and allows encapsulated cells to receive and recover the required nutrients Is important. Retrievability is desirable for a variety of reasons. example For example, the accumulation of transplanted substances can be avoided. The encapsulated cells Is no longer needed or desired (eg, encapsulated capsules). Encapsulated cells do not work as desired when cells are no longer needed , Etc.) encapsulated cells can be removed from the recipient. Also Can remove encapsulated cells if they become non-viable . And for other reasons. Currently, in humans, of encapsulated eyelets There have been no reports of successful transplant reversal of diabetes.   The biocompatibility of encapsulated eyelets remains a fundamental issue. The term "biocompatible" is used here in its broadest sense and The performance of biomaterials as a result of the long-term in vivo function, as well as the Regarding the body, its ability to avoid the fibrogenic response. Main of microencapsulation technology The problem is that abnormal fibrosis of the outer surface of the capsule occurs, resulting in cell death and early mechanism. It was to bring a stoppage. Despite extensive research, alginate-based materials The pathological roots of this problem in capsules of the United States remain poorly understood There is. However, some factors have recently been used in implant dysfunction, such as Gluronic acid / mannuronic acid content of alginate, defects in microcapsules (po Exposure of Li-L-lysine to the in-vivo environment) to complete encapsulation of cells Insufficient microcapsules for full coverage (which allows cells to It has been confirmed that it is included in (exposing to the boundary).   Alginates are sea brown algae, such as Laminaria hyperbo. rea, Laminaria digita, Ascophyllum n isolated from odosum and Macrocytis pyrifera It is a polysaccharide. Are alginates ionically bridged by large and low divalent and polyvalent cations? Form a rubbed gel. Calcium cations are the most widely used, and G- Interchain bonds between blocks give rise to a three-dimensional network in the form of an ionic crosslinked gel. It (Sajak-Bnaek, 1988).   Recently proved that mannuronic acid residues are active cytosines in alginates. Cytokine inducers, and these cytokins (IL-1 And TNF are known to be potential promoters of fibroblast proliferation (O Tterlei et al., 1991), algin with high mannuronic acid content (M-content). The citrate capsules were used in the fibrogenic response previously reported (Soon-Shion et al. , 1991), it is inferred that this is partly the cause. More important Notably, guluronic acid does not appear to be immunostimulatory, so alginate capsules It is possible to improve this reaction by increasing the guluronic acid content (G-content) of It turned out that I couldn't. In addition, cyclosporin A was tested in vitro on human mononuclear cells. Results in dose-dependent inhibition of mannuronic acid-induced TNF and IL-1 stimulation It was proven to occur. Based on this information, the line of microcapsules The fibrosis reaction is due to the addition of alginate with high gluulinic acid content Auxiliary courses of cyclosporine A to inhibit irritation may partially improve It was assumed that By this method, diabetes in a canine model of spontaneous diabetes was diagnosed. Disease is donor eyelet encapsulated in a high G-content alginate Was successfully reversed by transplantation (Soon-Shiong et al., 1991).   Polyethylene glycol (PEG, also polyethylene oxide, PEO, Has been widely used in recent years, biocompatible, protein repulsive, non-inflammatory For non-immunogenic, pharmaceutical, protein, enzyme, and implant material surfaces Has been studied for use as a modifier of The root of these unusual features is poly The flexibility of the Mer spine and this polymer in solution or when fixed to the surface It was attributed to the volume elimination effect of. In water, as well as many common organic solvents The solubility of PEG facilitates modification by various chemical reactions. A recent review (H arris, 1985) have synthesized many PEG derivatives and their various surfaces, It describes immobilization for proteins and drugs.   PEG conjugated to bovine serum albumin is reduced immunogen in rabbits Showed increased sex and increased circulation time (Abuchowski et al., 1977). Penis Phosphorus, aspirin, amphetamine, quinidine, procaine, and atropine Medications such as PE may increase the duration of their activity as a result of slow release of PE. Have been attached to G (Weiner et al., 1974; Zalipsky et al., 1983). PEG covalently attached to poly-L-lysine (PLL) Alginate-PLL microcapsules used for encapsulation of cells Has been used to increase the biocompatibility of the. PEG is a covalent polysaccharide , Eg dextran (Pitha et al., 1979; Duval et al., 1991). , Chitosan (Harris et al., 1984) and alginate (Desai et al., 1991). These modifications add organic solubility to the polysaccharide. give.   The surface modified by PEG is extremely non-thrombogenic (Desa i and Hubbell, 1991a; Nagoaka and Nakao, 1990), Resistant to in-vivo fibrotic overgrowth (Desai and Hubbell, 1 992a) and resistant to bacterial attachment (Desai and Hubbelll) , 1992b) was found. Solution containing PEG is also an organ for transplantation Was found to enhance the conservation of E. coli (Collins et al .; Zheng et al., 19 91). Although the root of the conservative action is not clearly understood, PEG is attached to the cell surface molecule. Are attached, resulting in changes in the presentation of antigens that alter the characteristics of the immune response. Was attributed to.   A cross-linked PEG gel was prepared for the immobilization of enzymes and microbial cells Have been used. Fukui and Tanaka (1979) and Fuku i et al. (1987) disclosed a polymerizable derivative of PEG (eg, dimethyl methacrylate). And then photopolymerized by UV light in the presence of a suitable initiator to form a covalent bond I made a crosslinked gel. Kumakura and Kaetsu (1983) are fine Polymerization of diacrylate derivatives of PEG with gamma rays for the purpose of immobilizing biological cells And reported the bridging. Due to the mild nature of photopolymerization, ie without heating In addition, the pH does not shift to extreme values and no toxic chemicals are used. So Fukui and Tanaka (1976) announced that if this technology is only enzymes It teaches the desirability of trapping cells and organelles.   Dupuy et al. (1988) recently reported in crosslinked acrylamide microspheres. We reported a photopolymerization method for confining pancreatic eyelets embedded in agarose It was However, this document describes the confinement of individual microspheres, but It does not mention further confinement of these already confined cells. polymerization Visible light is the photosensitizer (vitamin B2, namely Boflavin), and a cocatalyst (NNNN'N'-tetramethylethylenediami) Used in the presence of. A high pressure mercury lamp is used as a visible light source, and it These eyelets proved to maintain good viability in vitro after the polymerization process. Revealed   Visible light between 400-700 nm wavelength is non-toxic to living cells Have been confirmed (Karu, 1990; Dupuy et al., 1988). Recent reviews (Eaton, 1986) used as a polymerization initiator in the presence of suitable visible light. It describes a wide variety of dyes and cocatalysts that can be used.   In recent years there has been considerable interest in the use of lasers due to the polymerization process (W u, 1990). These polymerizations are extremely fast and can be completed in a few milliseconds. is there. (Decker and Moussa, 1989: Hoyle et al., 1989; E. Aton, 1986). The use of coherent radiation often has no effect on living cells. This results in harmful polymerization. This uses a wavelength-specific chromophore as a polymerization initiator. Resulting from use, and these chromophores are generally polymers that absorb incident radiation. -/ Is the only species in the cell suspension.                               Summary of the Invention   In the past, type I insulin-dependent diabetes mellitus has been reported in rats and dogs in mice. Pancreatic eyelets encapsulated in b capsules were allografted into the peritoneal cavity of these animals. (Dog eyelets to dog recipients) and xenografts (dog eyelets Can be reversed by transplantation with both the rat recipient model Proven (Soon-Shiong et al., 1991). Used in these studies Alginate microcapsules provide immunoprotective life and the absence of immunosuppressants Results in allograft transplant survival for several months. However, alginate gel Are cross-linked, and therefore split as a result of ionic equilibrium in vivo. Re-sorb. Moreover, the free microcapsules have their small size (2 00-600 μm) and is difficult to retrieve due to delocalization within the peritoneal cavity.   The manuronic acid-guluronic acid (MG) ratio of the alginate used is of fibrogenicity. Although it is known to play an important role in prevention, according to the present invention, Other factors have been identified, including various defects in microcapsules , They play an important role in the long-term viability of the graft. Of these conventional technologies Micrographs demonstrate defects not previously identified in microcapsules.   According to the present invention, many factors related to capsule defects, i.e. eliciting an immune response, are elicited. Potential to lead, loss of function due to death of encapsulated cells, capsule The degree of protection given to the encapsulated cells has already been confirmed. That is, (I) Fibrous overgrowth in both mechanical and chemical stability of microcapsules Plays an important role in. Water-soluble membranes dissolve after long-term exposure in vivo. To expose the encapsulated substance to the recipient's immune system and It was discovered that this would initiate a rejection reaction. (Ii) The "roughness" of the capsule membrane, as well as the defective microcapsules, results in Macrophage activation, cell attachment, cell overgrowth and ultimate fibrosis Give rise to. (Iii) Fracture or rupture of microcapsules with cracks in the capsule membrane results Results in fibrosis. (Iv) Alginates, especially high G-content alginates, are relatively biocompatible. However, poly-L-lysine (PLL) is a potential stimulator of fibrotic overgrowth in vivo. It is an irritant. Certainly, the conventional technology also uses PLL to prevent this abnormal growth problem. Attempts to coat the jacket with an alginate outer layer are described. However, according to the invention , Any damage to the membrane, or any imperfections in the membrane's coating Fibrosis can result when polymer materials such as are exposed It's been found. and (V) the exposure of biologically active substances on the surface of the microcapsules (such as Substances are not properly enclosed in the gel that forms the microcapsules (At) exposing such a substance to the immune system of the recipient to initiate an immune response.   According to the invention, the individual spherical microcapsules also provide a large exposed surface area. Yes, it facilitates the transport of nutrients through the membrane, while on the other hand cell attachment and fibrotic overgrowth Was found to increase the probability of. Reduces this exposed microcapsule surface area And / or of all unbound positively charged polylysine By reducing the exposure, meanwhile maintaining the limiting diffusion capacity of the immunoprotective membrane. It was discovered that increased biocompatibility would result. . By reducing the exposed microcapsule surface area, each individual microcapsule can be The percentage of "roughness" associated with Pucelle is reduced resulting in improved biocompatibility Will. Moreover, according to the invention, it is long-term to improve the mechanical integrity of the capsule. It was found to be an important step in the achievement of graft function in the early stages.   According to the invention, the biologically active substance (optional) in a macrocapsule which is biocompatible. Intentionally contained within microcapsules) (eg individual microcapsules) Long-term graft function by confining or storing the cells encapsulated in It has been discovered that this can be achieved.   Thereby, (i) cytoprotection of entrapped individually encapsulated cells And (ii) an unconstrained positively charged polylysine for the recipient in vivo environment. Exposure, reducing the (iii) mechanical stability of the capsule membrane and (iv) exposing Reduces the roughness of the microcapsule surface area and (v) to the recipient's in vivo environment , Reduce the exposure of cells adhering to the surface of microcapsules. All of the above benefits Maintains the diffusion capacity of the polymeric material used for encapsulation, and Entrapped encapsulated cells can be nourished and respond to stimulatory signals. It is obtained by enabling and.   Moreover, the macrocapsules of the present invention are made of encapsulated cells and Provides a system for the rapid and sustained release of secreted substances, which Is now a physiological process (eg blood in the case of encapsulated eyelets). It gives a more regulated regulation of sugar concentration). Especially in response to intravenous glucose stimulation Insulin release, the free-floating microencapsulated eye Encapsulated inside the macrocapsule faster than from the let It originates from the eyelet. It is an intravenous globule in vivo as described in Example 9 below. As evidenced by course stimulation studies. Further trapped in these gels Insulin release from the prepared microcapsules was measured in vivo as described in Example 8 below. Sustained over a longer period of time, as evidenced by a glucose stimulation study It   The present invention also allows for the retrieval of implants, which have a macroscopic size and Various microencapsulated eyelets in a single package or multiple macroscopic packages This is because they are grouped in a costume. Recoverability is desired for various reasons It is a bad thing. For example, accumulation of implanted material can be avoided. Cap When cell-encapsulated cells are no longer needed or desired (eg, capsule When the product of encapsulated cells is no longer needed, if encapsulated cells are If it ceases to act as desired, it can be removed from the recipient) It Remove the encapsulated cells if or when they stop growing be able to. Other reasons are the same.   The present invention improves cytoprotection and biocompatibility of transplanted biological systems By overcoming the problems of the prior art. The present invention is also confined to the gel A system that is confined to the stimulation signal Give a prompt response. The present invention is further encapsulated in macrocapsules Provided is a sustained release system consisting of microcapsules. The present invention is also Ikuro capsule in a specific area (for example, a highly neovascularized area such as omentum) Localized system, as well as minimizing microcapsule rupture, and Also provided is a system that facilitates the rapid recovery of these.   Macrocapsules of the present invention are encapsulated, as will be readily apparent to those skilled in the art. Or the system disclosed herein as well as confining unencapsulated live cells May have pharmacological or physiological effects in providing sustained release by Can be used to contain all chemicals.                             Brief description of the drawings   FIG. 1 shows a macrocap of the present invention containing an encapsulated biological material. FIG. 6 is a diagram of an embodiment of a cell.   FIG. 2 shows a trapped encapsulated eyelet (black circle) according to the present invention, A floating encapsulation eyelet (black triangle) and a non-encapsulated eyelet The time of blood glucose (blood glucose) of rats transplanted with illette (white circle) And the eyelets are xenografts (dog eyelets). Is the case.   FIG. 3 shows treatment with a dog eyelet encapsulated in a macrocapsule according to the present invention. Glucose to Intravenous Glucose Induction (IVGTT) in Rats Is a graph of the source response of a dog in free-floating microcapsules. It has been compared to its response in rats transplanted with eyelets, both of which It is a test 7 days after implantation of microcapsules and macrocapsules.   FIG. 4 shows treatment with a dog eyelet encapsulated in a macrocapsule according to the invention. Serum Glucose for Intravenous Glucose Induction (IVGTT) in Rats FIG. 2 is a graph of the response of a dog to a free-floating microencapsulated dog. It has been compared to its response in rats transplanted with illette.   FIG. 5 shows an implanted eyelet encapsulated according to the present invention. Is a graph of the blood glucose concentration of the rat (black circle ●) against time, and its eyelet Is a xenograft (dog eyelet). On day 14, trapped The eyelets that were removed were collected. The enclosed eyelet Since the diabetic condition recurred within 24 hours after the recovery of Proved the life ability of the eyelet trapped inside.                             Detailed Description of the Invention   The following specification encloses biologically active substances, eg living cells, in macrocapsules. Materials and methods, such as cell entrapment. And a highly biocompatible and retrievable system useful for transplantation. Of. Many details, such as specific materials and methods, are discussed below. Described to give a more complete understanding of Ming. The present invention addresses these special details. It will be appreciated by those skilled in the art that it can be implemented without terms. In other cases In the following, well-known materials and methods have been described in detail so as not to obscure the present invention. I can't. In addition, the following explanation is often used to treat eyelets and diabetes. Specially mentioned. This description is given as a particularly preferred application of the invention. So Nevertheless, it is clear that the present invention is not limited to the treatment of a single medical condition. It The invention is equally applicable for the treatment of other cell types and other diseases or for other physiology. It can be used for academic purposes and is encapsulated in microcapsules of any shape. It could also be used on cells that have become entrapped or not encapsulated.   As part of the work done in accordance with the present invention, micrographs were obtained from prior art algins. Of acid-PLL-alginate microcapsules [E.g., for the description of prior art microcapsules, C layton, J .; Microencapsulation8: 221-23 3 (1991) and Wijsman et al., J. Am. Transplantation   54: 588-592 (1992). I want to be). The resulting micrograph shows the obstacles in prior art microcapsules. And easily reveal defects. For example, one empty alginate-PLL-algi Photomicrograph of phosphate microcapsules (40x) (taken from rat peritoneal cavity) ) Is the abnormal growth of cells (visible as a dark area) and the integrity of the capsule membrane is lost. When exposed to areas of microcapsule gel or exposed areas of polylysine Prove that it will happen. In an alginate-PLL-alginate capsule A micrograph (100x) of the enclosed eyelet is attached to each microcapsule. “Roughness” or “stress mark” area. Such an individual The surface area of the microcapsules is large, and thus the exposure of the "rough" surface is enormous. And increases the risk of cell overgrowth. Besides, the alginate jacket Incomplete coverage of polylysine that results in potential growth.   A completely empty alginate matrix, all collected simultaneously from a rat peritoneal cavity. Micrograph (40x) of a defective empty microcapsule among micro capsules Proves cell overgrowth (appearing as dark areas). Violent overgrowth It is observed that is only associated with defective capsules. This is the ratio Capsules with relatively small defects and exposed capsule material, especially PL This gives evidence that L elicits an allergic reaction.   Canine eyes recovered from the peritoneal cavity of diabetic dogs when failure to reverse diabetes Alginate microcapsules containing a lett (free floating in the peritoneal cavity) Photomicrograph (40x) of the disrupted one shows the presence of the disrupted capsule. Provide evidence that loss of mechanical stability plays an important role in graft dysfunction. I am. Dog eyelets encapsulated in these microcapsules are diabetic The turnaround was successful, but only for a short time.   As used herein, the term "macrocapsule" refers to a gel containing a biologically active substance. Means a capsule of a solid material, the active substance being optionally a microcapsule (eg, One or more microcapsules, each microcapsule containing at least one living cell , Cells producing, for example, eyelets, or other pharmacological agents, or Containing some kind of medicinal or physiologically effective drug). Before The term "macro capsule" means "macro membrane," "macro gel," and "gel-filled microphone." B "Capsule", "Lace", "Noodle", "Tea bag", "Twist", "Uji" Insects, etc. may be included. Those of ordinary skill in the art will recognize them as a set of general types described herein. You will understand the product. The actual dimensions of the various constituents of the particles of the invention are Although not critical, the term "microcapsule" generally means that its largest dimension is Used for particles in the range of about 5 to 4000 microns, but for one The term "macrocapsule" generally has a maximum dimension of about 500 microns to about 50c. Used for particles in the range up to m. What is important according to the present invention is The contents of the ikuro capsule are to be further enclosed in a macro capsule, Thereby, as described here, the attachment of the polymer to be encapsulated in the macrocapsule. It provides the added benefits.   According to the present invention, biologically active substances, such as micro-cells containing a large number of cells. The capsules are coated with a thick layer of gelled material, Form a capsule. A schematic diagram showing the cross section of such a macrocapsule is given in FIG. It is obtained. Examination of this figure reveals that the macrocapsules themselves are polycations or It can be seen that it does not contain other fibrotic surfaces of. Instead, an immunoprotective membrane (ie, Polycations such as PLL) are localized on the surface of the microcapsules, which These microcapsules are deeply embedded within the macrocapsule (and what Protected from exposure to the in vivo environment by a thousand molecular layers). micro The core of the capsule (as well as the macrocapsule itself) is the gelled state (ie cross-linking). Retained or insoluble form), which is the same as prior art encapsulation systems. In contrast, in the latter, the core material is liquefied.   Generally, the layer of gelling material within the macrocapsules of the present invention is at least about 1 micron. But with a thickness of at least about 20-40 microns. However, a thickness of at least 50 microns or more is particularly preferred. This is subordinate Several molecular thicknesses achieved in the production of state-of-the-art microcapsules (alginate Massin of the polycationic layer on the microcapsules is more effective than (of the outer salt layer) Give. The layer of gelling material within the macrocapsules of the present invention is a microcapsule surface. All immunogenic agents (eg, polycations, non-encapsulated cells) Direct exposure to the in-vivo environment, which results in prior art microcapsules Prevent the immune response triggered by. In addition, the layer of gelling material is Exceptionally stable to long-term exposure to incidents. It is because the gelling material is ionic And / or covalently bridged to itself, and strength and stability. This is because it does not depend on the interaction with the mixed material. This is a conventional technology In sharp contrast to the alginate outer layer used for Ikuro capsules. The latter smell For anchoring of the outer layer of alginate into capsules, alginate and polycatio are all means. Formation of charged complexes between the immunoprotective layers (ie, ionic interactions).   In a preferred embodiment of the present invention, the microcapsules are macrocapsules. Microcapsules (and macrocapsules themselves) are gels when incorporated into Maintained in the activated state (ie bridged ionicly and / or covalently). Is). This is contrary to the teaching of the prior art. Microcapsules in the latter The encapsulation matrix of is liquefied prior to implantation. Unexpectedly due to the present invention Diffusion of nutrients into the Ming macrocapsules and production of encapsulated cells It has been discovered that the diffusion of P. out of the macrocapsule is performed with high efficiency.   The macrocapsule of the present invention can be manufactured in various shapes. Ie , Circles (ie, geometric solids created by the rotation of a rectangle around its side) , A sphere (a solid geometrical feature created by the rotation of a semicircle around its diameter), a disc ( That is, generally flat or circular, flat (ie generally flat polygon, More preferably square or rectangular), wafer (that is, irregular flat sheet) ), Dogbone (ie, it has a central trunk and both ends, and both ends are It can be made into a shape with a large diameter, such as a dumbbell.   The material used for such confinement is alginate (preferably a high G-value. Alginate), or such to improve its biocompatibility and stability Modified alginates, such as polymerizable alginates that allow covalent cross-linking, or Or crosslinkable or polymerizable water-soluble polyalkylene glycol, Could be a combination of these materials. Gel confinement of such materials The method of inducing only the effect is achieved by either ionic or covalent crosslinking. Can be   Macrocapsules that are expected to be used in the practice of the present invention include biological Contain a biologically active substance. In that case the biologically active substance is optionally microcapped. It is contained within a cell (ie, a large number of microcapsules within the macrocapsule). Is accommodated). The macrocapsules of the present invention are made from various polymeric materials. can do. For example, covalently crosslinkable or polymerizable linear or Branched PEG, different molecular weight covalent crosslinkable or polymerizable linear or A mixture of branched PEGs, ionically crosslinkable alginates, alginates A combination of conjugated crosslinkable or polymerizable PEG, and covalent and It can be produced from modified alginate or the like which can be cross-linked on-site.   The macrocapsules produced according to the present invention are encapsulated in the above biocompatible materials. It consists of a biologically active substance encapsulated in a capsule. At that time, the macro capsule is Has a volume whose largest physical dimension is greater than 1 mm. Macro capsules are "free Of cells (ie not modified by any coating) or Can contain a population of cells therein. Alternatively, the macro capsule is It may also contain cells or groups of cells that are themselves encapsulated within the capsule. Can be   According to the present invention (manufacturing microcapsules and / or macrocapsules ) The biologically active substances expected for encapsulation contain individual Living cells or groups of living cells, biological substances (for diagnostic purposes, eg The biological effects of such biological substances, and conversely, the biological effects of those substances In vivo), tumor cells (for evaluation of chemotherapeutic agents), HIV Human T-lymphoblastoid cells sensitive to cytopathic effect, pharmacologically effective drugs, diagnostics For example, the drug is off. As used herein, the term "living cell" refers to any source , Refers to all viable cellular material. Therefore, viral cells, prokaryotic Biological cells and eukaryotic cells are expected. Especially expected cells Included in islets of Langerhans (for treatment of diabetes), dopamine-secreting cells ( For the treatment of Parkinson's disease), cells secreting nerve growth factor (of Alzheimer's disease) Therapeutic), hepatocytes (for the treatment of liver dysfunction), adrenaline / angiotensi Cells that secrete insulin (for regulation of low / high blood pressure), cells of thyroid labor (replacement of thyroid function) ), Norepinephrine / methensephalin-secreting cells (for pain control), hemo For example, globin (for manufacturing artificial blood).   Covalent cross-linkable and / or expected to be used in the practice of the present invention Polymeric polyethylene glycol (PEG) contains linear or branched Of free-radical polymerization with long-chain PEGs (including STAR PEGs) Modified by a possible substituent X (where X is free radical polymerisable) A portion containing a carbon-carbon double bond. And X is PEG, ester, d Ether, thioether, disulphide, amide, imide, secondary amine, tertiary Amine, direct carbon-carbon (C-C) bond, sulfate ester, sulfonate ester, Shared through a bond selected from phosphate ester, urethane, carbonate, etc. Are connected by a bond). Polyethylene that can be crosslinked by such covalent bonds Examples of recalls include polyethylene glycol vinyl and allyl ether. Ether, acrylate and methacrylate esters of polyethylene glycol And so on.   PEGs having a wide range of molecular weights can be used in the practice of this invention. Therefore, various molecular weight shares that are therefore expected to be used in the practice of the present invention. Included in the mixture of PEGs that can be crosslinked by conjugation is about 200 to 1,000. Is a PEG with a MW in the range of up to 1,000 (especially about 500 to 100,0) PEGs with molecular weights in the range of up to 00 are preferred and are currently about 1000 to 5 Most preferred is PEG with a molecular weight in the range of up to 10,000). Such P EG can be linear or branched (including STER PEG). S TER PEG is a molecule with a central nucleus (eg, divinylbenzene) , Its core can undergo anionic polymerization under controlled conditions, Form a live nucleus with a defined number of active sites. Ethylene oxide When added to living nuclei, they polymerize to give rise to a known number of PEG “arms,” which are desired. When it reaches the desired molecular weight, it is stopped with water. Alternatively, the central nucleus is ethoxyl Can be a modified oligomeric glycerol, the latter of which is ethylene oxide. Used to initiate the polymerization of PEG to produce STER PEG of the desired molecular weight It is a thing.   The high content of alginic acid expected to be used in the practice of the present invention Examples include G-content alginate, sodium alginate, and the like. To implement the present invention Included in the covalently crosslinkable alginates expected for use in Is an algin modified by a substituent capable of undergoing free radical polymerization (X is a carbon-carbon double bond or triple bond capable of free radical polymerization) And X is ester, ether, thioether, disulfate Amide, amide, imide, secondary amine, tertiary amine, direct carbon-carbon (C-C ) Bonds, sulfates, sulfonates, phosphates, urethanes, Covalently bonded to the alginate via a bond selected from lubonate, etc. ). Included among the alginates that can be cross-linked by covalent bonds are alginate salts. Ryl and vinyl ethers, acrylates and methacrylates of alginates Esters and the like.   Alginates (ionic and / or Or a covalently crosslinkable PEG) Includes all two or more combinations of the above alginates and PEGs.   Small amounts of comonomers can be added to the cross-linking reaction to increase the rate of polymerization . Examples of suitable comonomers include vinylpyrrolidinone, acrylamide. , Methacrylamide, acrylic acid, methacrylic acid, sodium acrylate, meta Sodium acrylate, hydroxyethyl acrylate, hydroxyethyl methacrylate Lilate (HEMA), ethylene glycol diacrylate, ethylene glycol Rudimethacrylate, pentaerythritol triacrylate, pentaerythritol Tall trimethacrylate, trimethylolpropane triacrylate, trime Tyrole propane trimethacrylate, tripropylene glycol diacryl , Tripropylene glycol dimethacrylate, glyceryl acrylate, Lysyl methacrylate and the like.   Free radical polymerization of the above modifying materials can be accomplished in various ways. For example, A suitable photoinitiator with electromagnetic radiation of a suitable wavelength (eg visible or ultraviolet), and Optionally by irradiation in the presence of cocatalyst and / or comonomers. It is started and done. Alternatively, free radical polymerization is a suitable free radical catalyst. It can also be initiated by thermal initiation by.   A variety of free radicals, as will be readily appreciated by those skilled in the art. Initiators can be used in the practice of the present invention. Therefore, photoinitiator, thermal initiator Can be used. For example, a suitable UV initiator includes 2,2-dimeth. Xy, 2-phenylacetophenone and its water-soluble derivatives, benzophenone and And its water-soluble derivatives, benzyl and its water-soluble derivatives, thioxanthone and And its water-soluble derivatives. For visible light polymerization, dyes (also initiators or Are also known as photosensitizers) and cocatalysts (also synergists, activators, Cis), known as the initial intermediate, termination partner, or free radical generator System is used. Examples of suitable dyes are ethyl eosin, eosin, erythrosine , Riboflavin, fluorescein, rose bengal, methylene blue, thionine How is it? Examples of suitable cocatalysts are triethanolamine, arginine, methyldie. Examples include tanolamine and triethylamine.   Microcapsules that are expected to be used in the practice of the present invention have various raw forms. Biocompatible gel materials, eg alginates, covalently crosslinkable alginates Salts (ie modified alginates that can be covalently and ionically crosslinked) Covalently cross-linkable PEG, any of the above alginates and above PE G in combination with any of G, as well as one or more comonomers, as described above. It can be formed in any presence.   Microcapsules used in the practice of the present invention are optionally described in US Pat. 352,883, as described by Lim (see Treated with an immunoprotective coating (Lim uses this coating) Is called the "permanent semipermeable membrane"). Expected to be used in the practice of the invention Included in the immunoprotective material are polycations (eg polyamino acids [eg , Polyhistidine, polylysine, polyornithine, etc.], primary amine groups, primary Polymers containing secondary amine groups, tertiary amine groups or pyridinyl nitrogen, such as Polyethyleneimine, polyallylimine, polyetheramine, polyvinylpyridin Etc.). Treatment with such immunoprotective materials can be performed in various ways. You can For example, gelation of alginate containing encapsulated cells The surface layer of the nucleus with a polymer having acid-reactive groups such as amine or imine groups. It is done by bridging together. This is a commonly selected immunoprotective poly It is carried out in a dilute solution of Marr. Semi-permeability of immunoprotective coatings within limits Is suitable for the molecular weight of the immunopolymer, its concentration, and the degree of cross-linking with the underlying gel. It can be adjusted by various choices. The molecular weight of the immunoprotective polymer is also the desired It changes depending on the transparency. Generally the molecular weight is between about 1,000 and 100,000 Or it will be higher. Particularly preferred currently used in the practice of the invention The immunoprotective polymer is in the range of about 10,000 to 50,000. Exemption Any treatment of the epidemic protection coating is especially applicable to macrocapsules or microcapsules. It can be omitted if the material of the cell is covalently crosslinkable. In that case Is the polymerizable macromonomer (that is, the desired porosity (or immunoprotection)) That is, polymerizable alginate, polymerizable PEG, etc.) It could be achieved by judicious selection of the mixture.   In a presently particularly preferred embodiment of the invention, a large number of alginate-PLL -Alginate microcapsules closed within one alginate macrocapsule Can be placed. Those microcapsules used may have a solid gel core preferable. The alginate used is an ionic and / or covalent crosslinker Can be sex. For the modified, covalently crosslinkable alginate, To control the porosity of microcapsules and / or provide an immunoprotective barrier Introducing a polycation for this is optional. It has the desired porosity (or The degree of immunoprotection is determined by using an appropriate concentration of modified alginate, or X Modified alginates with various substitution rates by moieties, or such modifications Because it can be achieved by using a mixture of alginates. .   Another currently particularly preferred embodiment of the present invention is a suspended alginate matrix. Raw containing microcapsules (eg alginate-PLL-alginate) A physical, covalently bridged, linear or branched PEG aqueous solution (eg, PEG-diacrylate solution, or polymeric equivalent). Those It is preferable that the microcapsules of 1 have a solid gel core. Suitable free radical Initiators and co-catalysts are used with visible light sources such as lasers or mercury vapor lamps . The solid (ie, non-liquefied) gel of PEG is alginate microcapsule Le Formed around, and in addition to giving mechanical support and retrievability, Microcapsule non-fibrogenic, cell non-adhesive, and immunoprotective coatings Form around the circumference. In this embodiment, the polycation layer is optional. What In the case of PEG macrocapsules, the appropriate molecular weight and concentration of the crosslinkable PEG should be selected. This is because immunoprotection can be easily imparted by selection.   In yet another presently preferred embodiment, multiple alginates, P LL-alginate microcapsules are ionically and / or covalently bonded. Mac consisting of a crosslinkable alginate and a covalently crosslinkable PEG It is locked in a capsule. In this embodiment as well, the polycation The layers are optional. Because this PEG macrocapsule is a cross-linkable PEG Immunoprotection can be easily provided by selecting appropriate molecular weight and concentration. This is because that.   In an even more presently preferred embodiment, a number of alginate-PLL-acetates are used. Luginate microcapsules (can be crosslinked ionicly and / or covalently) (Encapsulated) alginate macrocapsules, followed by PEG coating. The PEG and the alginate come into intimate contact, and the PEG is It is exposed on the surface of the macro capsule. In this embodiment as well, The thione layer is optional. Because of the suitable molecular weight and concentration of cross-linkable PEG This is because the PEG coat can be easily given immunoprotective property by selection.   In yet another presently preferred embodiment, the biologically active agent is io And / or covalently crosslinkable alginates, and / or Macrocapsules composed of linear or branched PEGs that can be crosslinked by conjugation It is directly confined inside.   The invention will now be described in more detail by the following non-limiting examples.                                   Example 1 Preparation of PEG diacrylate using acryloyl chloride   Molecular weight 185000 PEG (abbreviation 18.5K, also commercially available as PEG20M Are chemically modified using the following procedure to render the molecule polymerizable. A acrylate functional group was introduced into the molecule. The molecular weight of other PEGs is as low as 200. P in the range from high to high (but not limited to) 35,000 EG could also be modified by the same procedure.   By heating PEGI8.5K to 80 ° C. in a vacuum oven for 24 hours Dry completely. Alternatively, dissolve PEG in toluene and then Distillation of the liquid removes all moisture as an azeotrope with toluene. did it. 20 g of dry PEG was added to 200-250 ml of dry toluene (acetone, Benzene, and other organic solvents may also be used). Two Double the molar excess of acryloyl chloride (0.35 ml) and use Cylamine (0.6 ml) was added to remove HCI formed. Acroyl The solution was allowed to cool in an ice bath before the addition of sodium chloride. The reaction is performed in a round bottom flask. It was held for 24 hours under constant reflux under Lgon. The reaction mixture is filtered The insoluble triethylamine hydrochloride was removed, while the filtrate was added to excess ether to remove P The E diacrylate was precipitated. The product is redissolved and precipitated twice for further purification Then all remaining solvent was removed in vacuo. Other purification methods such as PEG-water It is also possible to employ dialysis of the solution against deionized water followed by lyophilization. . Yield: 17 g.                                   Example 2 Another method for producing polymerizable PEG   Polymerizable or crosslinkable by introducing an unsaturated group at the end of the PEG chain Several other methods can also be used to make the modified PEG. these Some of the methods are briefly summarized below.   Between PEG and acrylic acid (or higher homologues or derivatives) The tellurization reaction can be carried out in an organic solvent such as toluene. A small amount of acid, for example Can also be catalyzed by p-toluenesulfonic acid. One of the reactants An excess of one (acrylic acid) will drive the reaction towards the product. Reaction for several hours Is refluxed. Water is generated as a product of the reaction, driving equilibrium towards the product For that, it can also be removed continuously by distillation of the azeotrope with toluene. Wear. Standard purification methods may be used. Methacrylic acid or methacrylate Can be reacted similarly to PEG to obtain a polymerizable derivative. (Fukui and Tanaka, 1976).   Alternatively, instead of a PEG alkoxide that produces a vinyl ether of PEG The method of Mathias et al. (1982) involving the reaction with acetylene gas can also be polymerized. Can be used to produce various PEG derivatives.   Of PEG and allyl chloride catalyzed by small amounts of stannous chloride in dry solvent The reaction between also produces a polymerizable PEG.   Several other techniques may be used to obtain polymerizable PEG derivatives. It Harris (1985) is then given a synthetic approach that should be taken elsewhere. He has written numerous papers including PEG chemistry.                                   Example 3 Visible light photopolymerization for producing PEG gels   PEG derivatives prepared by the techniques summarized in Examples 1 and 2 were bicarbonate buffered. Dissolved in an aqueous solution (eg 4-50% by weight, or other buffer). Photosensitization Agent, ethyl eosin (0.01 μM to 0.1 M), cocatalyst, triethanolamine (0.01 μM to 0.1 M), and the comonomer vinylpyrrolidone (0.0 01-10%, but not necessarily) is added to the solution and the solution is photopolymerized. It was protected from light. Instead, other initiators, co-catalysts, comonomers and And laser beams of several wavelengths may be used. Those choices are well known to those skilled in the art. And.   Take a small amount of the conditioned solution into a test tube and output 514 at a power of 10 mW to 2W. from a 100 nm wavelength argon ion laser or a 100 watt mercury arc lamp Exposed to visible light from (having a fairly strong emission around 514 nm). Gelation The time is recorded and very fast (on the order of milliseconds) by the laser and And mercury lamps are fairly fast (in a matter of seconds), and the polymers in the system It was accompanied by varying concentrations of initiator, cocatalyst, and comonomer.                                   Example 4 Ultraviolet photopolymerization for producing PEG gel   A different starting system was used to produce the PEG gel. UV light Initiator, 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone 1000-150 It was added to the polymerizable PEG solution in aqueous buffer at a concentration of 0 ppm. 100 parts of this solution Exposed to long wavelength UV light from a Watt UV lamp. The time required for gelation is roughly It takes a few seconds, and the concentration of the initiator and other polymerizable moieties such as vinylpyrrolidone It was a function of the addition of the nomer (0.001-10%). UV laser is also It may be used for photopolymerization. Other photoinitiators can also be used (For example, benzoin ethyl ether).                                   Example 5 Shape of PEG gel with microcapsules for transplantation   The mycelium of alginate or other material containing cells or enzymes or drugs Black capsules are PEG gels containing microcapsules of various shapes and sizes. Can be used to release and recover from transplanted tissue. Large number of individual micro Embedding these microcapsules in PEG gels with cross-linked capsules. To localize to a particularly preferred area within the peritoneal cavity (or other implant site). I can do it. Different shapes for implantation, such as cylindrical rods, discs, flat plates, It's a gibbon, and an oval “race” or “twist” or “maggot”. Convex shapes may be considered.   Regardless of shape, the final implantable product will require similar processing techniques. did. The microcapsules containing the cells were placed in triethanolamine (0.01 μm). M to 0.1 M), ethyl eosin (0.01 μM to 0.1 M), And PEG18.5K diacryl containing vinylpyrrolidone (0.001-10%) Physiological solution of lat (30% by weight, various molecular weight PEGs should be used) Suspension). Exposing this suspension to visible light from a laser or mercury lamp When it is caused, it causes a rapid PEG-diacrylate cross-linking, and Make microcapsules embedded in PEG gel.   To create a circular "lace", the suspension is placed in a needle or cannula of suitable gauge. Into a hypodermic needle with a needle and the emerging stream is buffered (if algi If phosphate is used in suspension it will have polyvalent cations. If, at the same time, photopolymerization is required for the reaction, then the light from a suitable light source Laser exposure. The lamp is made of polymerized material and As is known, depending on the photoinitiator used, it may be a laser light source or a UV light source. I was able to. The bridge is instantaneous. That is, the flow that emerges is that it extrudes The light is bridged as fast as it is done, resulting in a "race" or "noodle" Form. Is the gel or other shape a suitable mold made for that purpose? Can be manufactured from                                   Example 6 Microcapsulated eyelet alginate confinement   After the dog eyelet was isolated from the donor's pancreas by collagenase digestion Purified using physiological eyelet purification solution. Next, eyelet the alginate Encapsulation in polylysine-alginate microcapsules by the following method. 10,000 purified eyelets were added to a 1.8% solution of sodium alginate (G content 64%) and then alginate via an air-droplet generator. 0.8% CaCl2Alginate eyelets by crosslinking in solution Locked in gel beads. The polylysine membrane encapsulates these alginates. The eyelet was suspended in a 0.1% polylysine solution for 4-8 minutes, and then shaped. Was made. The encapsulated eyelet is then placed in a 0.2% alginic acid solution. Coated with an outer layer of alginate by suspending for 5 minutes.   Next, the circle of alginate wrapping these microencapsulated eyelets. Shaped tubes (i.e., lace, diameter about 1-5 mm) were made as follows.   A microcapsulated eyelet was added to 4% volume of 1.8% alginate solution. Suspend at a ratio of 1 volume microcapsule pellets to alginate Et al, CaCl2In a solution of divalent cations containing only, or barium and calcium Extruded into the solution of the combination of the chlorides of corn. Combination of divalent cation cross-linking agents The ratio of barium chloride to calcium chloride is from 1:10 to 1: 100 ( Barium: calcium) can vary and a particularly preferred ratio is 1:50 It is in the range from 1: 100 to 1: 100. By combining barium and calcium Which results in a higher strength gel. Therefore, this ionic bridge By the method of, the number of eyelets encapsulated in about 8000 microcapsules is 16 Enclosed in a cylindrical tube of alginate gel of cm length.   Instead, a spherical mac containing a microencapsulated eyelet is used. The capsules are placed in a droplet of the above solution (i.e. microcapsules in alginate solution As described above, a polyvalent cation (for example, Ca++) It can be produced by introducing it into a bath containing it.                                   Example 7 Transformations in the composition of recoverable systems   The number of transformations in the composition and materials used in the design of recoverable systems Acceptable and informative. Cross-linking with built-in alginate microcapsules Alginate or PEG spheres (or races) may be iodinated in appropriate circumstances. Can be replaced with alginate spheres that are chemically and / or covalently crosslinked. Can also be. The next transformation is possible, among other things. (I) PEG alone, crosslinked as described above, crosslinked with various molecular weights Permeation of the resulting gel with a mixture of possible PEGs (linear or branched) It can be used to adjust the degree. (Ii) Alginate alone, ionically crosslinked. (Iii) to allow cross-linking alginate alone, both ionicly and covalently Modified to. (Iv) an ionically crosslinkable alginate and a covalently crosslinkable PEG ( Combination of linear or branched chains. (V) modified alginate (ie, ionic and covalently cross-linked) Possible) and covalently crosslinkable PEG (linear or branched) combinations Let me. and (Vi) Ionic and / or covalently crosslinked alginate macroca Cells (eg spheres or races), covalently cross-linked PEG (line Or a branched chain), the latter being closely packed with PEG and alginate. It covers the outside to make contact.   The ionic bridge of alginate is Ca++Alone or Ba++And Ca++Of 1: Achieved by any combination of ratios of 10 to 1: 100 (Ba: Ca) Can be   The alginate described in the previous section has chemical properties in addition to its ionic gelation ability. It may be replaced by a modified alginate which can be crosslinked. Modified algi mentioned here Phosphates are described in detail in co-pending patent application Ser. No. 07 / 784,267 ( Incorporated herein by reference in its entirety).   The above PLL may also be replaced by a modified PLL that can be covalently crosslinked. Yes. The modified PLL described here is detailed in co-pending patent application 07 / 784,267. Detailed (incorporated herein by reference in its entirety).                                   Example 8 Kinetics of insulin diffusion from gel-encapsulated encapsulated eyelets. , In-vitro research   Dynamics of insulin secretion from gel-encapsulated eyelets The science is based on individual microencapsulated eyelets or non-encapsulated eyelets. It was compared with Nu's eyelet as follows. Free unencapsulated dog Closed to illette (control) or encapsulated dog eyelet or gel Basal concentration of 60 mg for both encapsulated dog eyelets Incubate in RPMI medium containing 60% glucose for 60 minutes and then stimulate at 450 Transfer to medium containing mg% glucose for 60 minutes, and basal medium (60 mg% glucose It was returned to the course) for another 60 minutes. These tests were done in triplicate. The supernatant Collected at the end of each 60 minutes. Insulin secretion was confirmed by using RIA Measuring insulin concentration (μU / ml per eyelet equivalent count) It was evaluated by.   This test was repeated, but in addition 10 mM theophylline was added. It was added to the 450 mg% of glucose as a booster of the secretion of shrine. This The results of these tests are shown in Table 1.   Those skilled in the art will appreciate that the encapsulated dog eyelet may be further coated with a polymeric material. Encapsulation results in a diminished response to stimuli and spread of insulin. Would have expected to reduce the loss. That is, the encapsulated eyelet Is further confined within the second layer of polymeric material [Microcapsule Plus ・ Macrocapsule] means that the encapsulated eyelet is sensitive to external stimuli. It would have been expected to reduce sensitivity. Surprisingly, the present invention provides gels The in vitro response of a confined microencapsulated eyelet is It's not as good as Yukifuru's encapsulated eyelet, It was found to be equivalent (see Table 1).   After stimulation with 450 mg% glucose alone, myelin immobilized in macrogels Insulin response from black capsule-encapsulated eyelets ("Collapsed MC") The answer (see Table 1) is a free-floating microencapsulated eyelet (“free MC”). And compared to free unencapsulated eyelets (“free eyelets”) And, if not better than them, they were equal. This phenomenon is also 45 Also seen in response to 0 mg% glucose + 10 mg theophylline stimulation It was I don't want to be bound to any particular theory, but the current assumption is that The surprising result is that insulin is a negatively charged protein, and glucose In the microencapsulated cells in response to the With the release of insulin, negatively charged insulin is trapped in a negatively charged trap. Electrostatically discharged from the material, thus accelerating the response time of insulin release It is explained by the fact that Micro-encapsulation in macro gel Insulin release from the input eyelet is Elevated compared to insulin release is also within the microcapsule membrane Due to the presence of positively charged PLL, microcapsules are better than macrocapsules. It can also be explained by the fact that it is neutrally charged. This expectation The unsuccessful results were confirmed in an in vivo test (described in Example 9). In that case The drop in serum glucose in response to intravenous glucose injection is trapped in the gel In diabetic rats treated with microencapsulated canine eyelets. Occurred rapidly (see Figure 3). This means that gel confinement is a systemic glucose To give the added benefit of an improved insulin response to the signal. Imply.   The results, shown in Table 1, demonstrate that encapsulated dog eyelets were gel closed. Swallowing responds to glucose stimulation or counteracts glucose + theophylline. It proves that it does not impair the corresponding insulin secretion. Base of insulin concentration Return to bottom state, however, was delayed in macrocapsule experiments and Consistent with insulin entrapment in the gel, resulting in a substantially sustained release drug delivery. Bring out the system. In vivo application, this sustained insulin Release could provide a more stable homeostatic mechanism.   Therefore, the gel confinement of the microencapsulated eyelet is equivalent to insulin. It offers some unexpected benefits with regard to lactation. (I) rapid response of insulin release to glucose stimulation, and (Ii) Once insulin is released, it takes a longer time to recover because it returns slowly to the ground state. It gives a sustained and continuous release over a period of time.   Both of these responses constitutively regulate glucose metabolism in diabetic recipients. Is important for improving.                                   Example 9 In vivo testing of microencapsulated eyelets enclosed in gel.   Free-floating microphone demonstrates the effectiveness of microencapsulated eyelets enclosed in gel Rat with encapsulated eyelet and streptozotocin-induced (STZ) diabetes In the treatment of. 8,000 capsules of dog eyelets (free floating 4 STZ diabetics (confined in a flowing or alginate cylindrical tube). 8000 encapsulations implanted in the peritoneal cavity of diseased rats and implanted in the same manner Compared to unfilled eyelet (control).   Pancreas from the same dog to ensure consistent viability, purity and function Free-flowing microencapsulation and gel confinement of eyelets from organ donors Used for both groups of microencapsulation. Furthermore, the completeness of the microcapsules themselves Eyelet is a one-batch method to ensure that there is no variability in structure and structure Everything was encapsulated and then divided into two. One half free floating transplant The other half is used in alginate macrocapsules before transplantation Entrapped (ie, gel-encapsulated microencapsulated eyelets).   Immunoprotection, biocompatibility, function of non-encapsulated (free) eyelets And free graft survival free floating encapsulation eyelets (in microcapsules Encapsulated eyelet (within it) compared to Compared by measurement (in macrocapsules with microcapsules) It was   (I) Daily serum glucose concentration (see Table 2)   Diabetes was induced in rats by STZ injection. The injected rat Diabetes is considered if the serum glucose concentration is greater than 200 mg%. Unencapsulated dog eyelets (free eyelets) are used in diabetic rats. And recover normal blood sugar level (serum glucose concentration below 200 mg%). Didn't come Free-floating micro-encapsulated eyelet and macro-encapsulated a Both illets showed normal blood sugar levels depending on the 3rd to 4th day in these diabetic rats. Recovered. In 7 days, free-floating microencapsulated eyelets began to decline, Serum glucose concentrations were above 200 mg% in these recipients. Contrast Rats Receiving Gel Confined Microcapsules (Macrocapsules) Kept his euglycemic state, and kept his serum glucose concentration below 100 mg% ( (Fig. 2). Therefore, these in-vivo tests were performed using (free-floating microencapsulated eyelets). Encapsulated in microencapsulated eyelet gel (compared to By increasing the survival of the implant, perhaps by improving its cytoprotection and biocompatibility. , Provide evidence that the period will be extended. (Ii) Daily urine volume   With the onset of diabetes, urine output increases. Urine volume is 30 cc / day after STZ injection Indicates a diabetic condition. With the resolution of diabetes, urine output falls to normal levels. urine A decrease in volume is consistent with a decrease in serum glucose, indicating graft function and macrocapsule Encapsulated eyelet survival is free unencapsulated eyelet and free float Superior to both microencapsulated eyelets. On the 7th day, free floating Mai The amount of urine in the black encapsulation group reached the diabetic level (> 30 ml) and the graft Of the microcapsules entrapped in the gel ( That is, rats receiving macrocapsules maintain normal urinary output. , Showed ongoing transition piece function. (Iii) Weight   After STZ injection, diabetic rats lost weight dramatically. Weight maintenance or Weight gain is an excellent parameter of the function of transplanted eyelets. Urine volume and blood Changes in body weight, as well as the relationship between glucose concentrations, confirmed the above analysis, and Rats receiving the black-encapsulated eyelet are free-encapsulated. Rat receiving free eyelets and free-floating microencapsulated eyes Normal grafts compared to graft dysfunction in rats receiving lett Provided evidence to maintain function. Microcapsules trapped in gel Weight gained significantly in animals receiving (ie macrocapsules) , On the other hand, weight loss as a result of diabetes is free unencapsulated eye Receiving the Recipient-Receiving Animal and Receiving Free-Floating Encapsulated Eyelets It happened after 7 days in the animals. (Iv) Glucose response to systematic glucose induction (Intravenous glucose tolerance test, IVGTT, see FIG. 3)   IVGTT is the source of the kinetics of insulin release in response to intravenous glucose induction. Give an in-vivo assessment. By calculating the rate of glucose drop over time, The numerical value (K-value) can be established and compared to normal, non-diabetic rats. Wear. The faster the decrease in serum glucose following glucose induction, the lower the K-value. This will be higher. The drop in serum glucose in response to intravenous glucose induction is Free-floating microcapsules that received eyelets and macro-encapsulated eyelets Tested on both receiving encapsulated eyelets. Serum glucose is k Intravenous injection of 0.5 cc of 50% dextrose per gram followed by 1, 4, 10 , 20, 30, 60 and 90 minutes. As you can see in Figure 3 , Serum glucose was 489 in the macroencapsulated group after intravenous injection It increased to mg% and then rapidly decreased to normal concentration within 10 minutes. It showed excellent in vivo insulin response to the induction of lucose. K-value (Which represents the% decrease in glucose over time) was normal in this animal ( It was 3.81 ± 0.56). This unexpectedly rapid insulin response is described in Example 8. The in-vitro findings shown above, i.e., microcapsules trapped in alginate gel. Psell provides confirmation that it responds quickly to glucose stimulation, and The potential benefit of luginate entrapment is the electrostatic charge of negatively charged insulin from within the capsule. Repulsion and therefore a rapid physiological decrease in glucose in response to systemic induction. Provide further evidence below.   The K value of rats receiving macrocapsules is Significantly better than that of rats receiving Ket (K = 0.6 ± 0.73) ( K = 3.8 ± 0.56), so it accepts a free-floating encapsulated eyelet 3 shows loss of graft function in rats. The eyelets implanted in both groups are the same This is because the eyelet provider is the same as the The differences in the answers reflect the improved immunoprotective properties of the macrocapsules.   In another experiment, a free-floating encapsulated dog eyelet was used to diagnose diabetic rats. And IVGTT was performed in these recipients, Intergraft function was normal (100 mg% or less serum glucose). In Figure 4 As can be seen, serum glucose levels after intravenous injection of dextrose The decrease to the normal concentration was only after 30 minutes (K value 2.4 ± 0.9). In comparison, rats in rats receiving eyelets encapsulated in macrocapsules The decline of lucoose was faster (within 10 minutes) (K value 3.81 ± 0.56) ).   From the above in-vivo tests, the following can be concluded. (I) Encapsulating the eyelet encapsulated in the microcapsule in the gel is Insulin diffusion rate in response to course stimulation both in vitro and in vivo I will not reduce it. (Ii) It is actually confined in the gel of the eyelet encapsulated in the microcapsule. Promotes insulin release. (Iii) Encapsulating the microcapsulated eyelet in a gel is Extend the function of the plant.                                 Example 10 Collection of microencapsulated eyelets trapped in gel   STZ-guided gel-encapsulated microencapsulated eyelets It was transplanted to diabetic rats and followed up for 14 days. Normal serum glucose concentration Achieved within 3 days and maintained for the entire observation period. Macro gel on day 14 The encapsulated encapsulating eyelets were collected and examined microscopically.   Can grow inside enclosed microcapsules when observed in micrographs Seen without evidence of cell overgrowth of the outer surface layer of complete eyelets or macrogels Was issued. 1 of transplantation of a macrocapsule containing a dog eyelet according to the present invention A microscope photographed after collecting from the peritoneal cavity of STZ-diabetic Lewis rat 4 days later The photo (100x) shows no evidence of abnormal cell growth on the outer exposed layer of the macrocapsules. It showed a smooth surface. Encapsulated individual viable individual dog eyelets You can see that the packets are contained within the macrocapsule. When you collect it Moreover, the diabetic rat was euglycemic.   Serum groups in rats after recovery of macrogelled encapsulated eyelets The concentration of lucose was monitored. As you can see in Figure 5, the macrocapsule times Within 24 hours after collection, serum glucose concentration increased to over 200 mg%, That the encapsulated eyelets cause normalization of serum glucose Shown, and further provides evidence of immunoprotection and biocompatibility of macrocapsules It was   From these tests the following can be concluded: (I) Encapsulation in a gel means that the microcapsules enclosed in free-floating microcapsules are Smoother surface than illette, reduced exposed surface area and therefore increased biocompatibility Give compatibility. (Ii) Encapsulation in a gel improves the mechanical stability of the encapsulated eyelet. To provide a matrix that increases and holds even if individual capsules break It                                 Example 11 Relaxation of diabetic symptoms in spontaneously diabetic dogs implanted with the inventive macrocapsules sum   The classic pathology of type I diabetes mellitus at diagnosis: polyuria, polydigestion , Polyphagia, weight loss, persistent fasting hyperglycemia (ie blood glucose> 250 mg / Dl), persistent diabetes, 1-2 times daily insulin to prevent rapid decompensation Spontaneously diabetic dogs with clinical signs such as need for injection For implantation of microcapsules (containing a large number of microencapsulated eyelets) Was chosen as the recipient of the.   Eyelets from a healthy dog donor are treated in the conventional manner (eg, collagenase). Digestion) was used to separate. Then eyelets as described above (see, eg, Example 6). , Conventional alginate-PLL-alginate microcapsules (diameter about 6 00 micron). And then those microcapsules, Push the microcapsule suspension in the alginate solution into a bath containing calcium chloride. Macrocapsules of alginate ionically cross-linked by extrusion (about 4 000-8000 micron spherical beads). Enclosed). About 60-80 microcapsules in a single macrocapsule Trapped in.   Prior to transplant, the dog was maintained on 12 units of insulin diet daily. . Transplantation was performed through a 1.5 midline midline incision under general anesthesia and Rocapsules were introduced into the peritoneal cavity through a stainless funnel. About 20 dogs A transplant dose of 1,000 eyelets / kg body weight was received. Incision then to suture More closed. Prednisolone diet was used as an anti-inflammatory drug for 14 days after transplantation. Carried Fasting blood glucose, plasma C-peptide, urine output and body weight 14 days after transplantation It was measured daily and every 7 days thereafter. Intravenous glucose tolerance test (IV GTT) was performed 7 days before transplantation, 14 and 30 days after transplantation, and every 30 days thereafter.   All measured parameters returned to normal non-diabetic levels within 3 days after transplantation It was Blood sugar was well kept below 200 mg / dl, and the dog was 150 post-transplant. Over the day, euglycemic levels remained without the need for exogenous insulin. The results of IVGTT are normal and rapid after induction with large pills of glucose. It showed a mild glucose clearance.                                 Example 12 Encapsulation in the Gunn Rat Model Reversal of liver deficiency by transplantation of hepatocytes   Liver enzyme uridine diphosphate glucuronyl transferase (UDPG T) deficiency and the resulting high serum bilirubin concentration (commonly known as jaundice Homozygous Gunn rat with a hepatic deficiency Selected as a model. Heterozygous Gunrat with an abnormal gene but no jaundice Was selected as the donor of hepatocytes for cell transplantation.   The donor's liver was passed through the portal vein to a silicone tube (inner diameter 0.025 inch, outer diameter 0 ． Cannulated with 047 inch) and within 15 minutes 100 ml Of 0.05% collagenase (Sigma, type IV). Its liver The cells were placed in a sterile beaker and washed 3 times with RPMI medium. Separation The viability of the hepatocytes was tested by acridine orange / propidium iodide staining. It was tested and was associated with greater than 80%.   The hepatocytes are conventional alginate-PLL-alginate microcapsules. Encapsulated as above in a pscel. These microcapsules further As described above, in an ionically cross-linked alginate spherical macrocapsule. Entrapped (or encapsulated). About 50-100 microcars Pucsel is enclosed in a single macrocapsule. Each recipient is -107Mosquito Received hepatocytes encapsulated in pucelle. The macrocapsules are the peritoneal cavity of the recipient Transplanted in.   Prior to transplantation, recipient bilirubin concentration was 5.3 ± 0.3 mg%. Transplantation By the second week afterward, serum bilirubin concentration had decreased to 2.05 ± 1.05 mg%. This was significantly lower than the concentration before transplantation. These reduced concentrations are average It was maintained for 73 ± 4 days. Cyclosporine A as an anti-inflammatory drug for all recipients (10 mg / kg, ie, lower than required to prevent immune rejection) Level). Therefore, the potential and efficiency of the macrocapsules of the present invention are Proved for transplantation.   Although the present invention has been described in detail with respect to some particularly preferred embodiments thereof, in part Modifications and variations of are within the spirit and scope described and claimed. Will be appreciated.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 デサイ，ネイル ピー. アメリカ合衆国90036 カリフォルニア州 ロスアンジェルス，アランデル アベニュ ー 847 (72)発明者 ハインツ，ロスウィサ エイ. アメリカ合衆国90025 カリフォルニア州 ロスアンジェルス，マルコム アベニュー 1940─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page    (72) Inventor Desai, Nailpee.             United States 90036 California             Los Angeles, Arundel Avenue             -847 (72) Inventor Heinz, Ross Weisa.             United States 90025 California             Los Angeles, Malcolm Avenue               1940

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．生物学的活性物質を封入するためのマクロカプセルであり、前記マクロカ プセルは生物学的活性物質を包囲する多数のマイクロカプセルから成り、前記マ イクロカプセルは生体適合性のゲルから形成されており、前記マイクロカプセル は任意に免疫保護性のコーティングにより処理されており、前記マクロカプセル はその中に多数の前記マイクロカプセルを含んでいる、および前記マクロカプセ ルは生体適合性のゲルから形成されている、生物学的活性物質を封入するための マクロカプセル。 ２．該生体適合性ゲルは、共有結合的におよび／またはイオン的に橋かけ可能 なアルギン酸塩、共有結合的に橋かけ可能な線状または枝分れ鎖のＰＥＧ、いろ いろ異なる分子量の共有結合的に橋かけ可能な線状または枝分れ鎖のＰＥＧの混 合物、アルギン酸塩とＰＥＧの組み合わせ、並びにそれらのいずれか二種以上の 混合物から選択される請求項１に記載のマクロカプセル。 ３．該免疫保護性のコーティングはポリカチオンである請求項１に記載のマク ロカプセル。 ４．該ポリカチオンはポリリジンである請求項３に記載のマクロカプセル。 ５．該マイクロカプセルは固体ゲル核を有する請求項１に記載のマクロカプセ ル。 ６．該マクロカプセルは固体ゲル核を有する請求項１に記載のマクロカプセル 。 ７．マイクロカプセルを封入するためのマクロカプセルを製造する方法におい て、それぞれの中に生物学的活性物質を含む多数のマイクロカプセルを共有結合 的におよび／またはイオン的に橋かけできる生体適合性の、液状ゲル化性物質の 中に懸濁させること、前記の懸濁されたマイクロカプセルを前もって決められた 形に配置すること、および前記ゲル化性物質を共有結合的および／またはイオン 的に橋かけさせることから成る前記の製造方法。 ８．糖尿病患者の治療において、該患者の特定の区域に請求項１に記載のマク ロカプセルを挿入することから成る方法において、該マクロカプセルがアイレッ ト（ｉｓｌｅｔｓ）から成るマイクロカプセルを内に含んでいる前記の治療方法 。 ９．マクロカプセルがもはや効果のないとき該患者より該マクロカプセルを除 去することおよびそれを新しいマクロカプセルと取り替えることからさらに成る 請求項８に記載の方法。 １０．該マクロカプセルが円箇、球、円板、平板、ウエフアースまたはドッグ ボーンの形に作られている請求項１に記載のマクロカプセル。 １１．該生物学的活性物質が薬理学的に有効な薬剤である請求項１に記載のマ クロカプセルから成る薬理学的に有効な薬剤の投与システム。 １２．該生物学的活性物質が生細胞である請求項１に記載のマクロカプセルか ら成る薬理学的に有効な薬剤の投与システム。 １３．アルギン酸塩が高いＧのアルギン酸塩である請求項１に記載のマクロカ プセル。 １４．該マクロカプセルが多数のアルギン酸塩／ＰＬＬ／アルギン酸塩マイク ロカプセルから成る請求項１に記載のマクロカプセル。 １５．該多数のアルギン酸塩／ＰＬＬ／アルギン酸塩マイクロカプセルは、 イオン的および／または共有結合的に橋かけされたアルギン酸塩、 共有結合的に橋かけされた線状または枝分れ鎖のポリエチレングリコール、ま たは それらの混合物 の中に閉じ込められている請求項１４に記載のマクロカプセル。 １６．該生体適合性のゲルは、２００より１，０００，０００までの範囲の分 子量を有する線状または枝分れ鎖のポリエチレングリコールである請求項１に記 載のマクロカプセル。 １７．該アルギン酸塩は多価カチオンによりイオン的に橋かけされている請求 項１に記載のマクロカプセル。 １８．該マイクロカプセルは、 イオン的および／または共有結合的に橋かけされたアルギン酸塩、 共有結合的に橋かけされた線状または技分れ鎖のポリエチレングリコール、ま たは それらの混合物 の中に閉じ込められている請求項１に記載のマクロカプセル。 １９．該マクロカプセルがそれから製造される生体適合性の材料は、共有結合 的に橋かけ可能な線状または枝分れ鎖のポリエチレングリコールである請求項１ ８に記載のマクロカプセル。 ２０．該マクロカプセルがそれから製造される生体適合性の材料は、イオン的 および／または共有結合的に橋かけ可能なアルギン酸塩および／または共有結合 的に橋かけ可能な線状または技分れ鎖のポリエチレングリコールの組み合わせか ら成る請求項１８に記載のマクロカプセル。 ２１．その中に生物学的活性物質を閉じ込めているマクロカプセルにおいて、 前記生物学的活性物質が生体適合性ゲルに包囲されている前記のマクロカプセル 。[Claims]   1. A macrocapsule for enclosing a biologically active substance. The capsule consists of a number of microcapsules that surround the biologically active substance. Microcapsules are formed from biocompatible gels, Is optionally treated with an immunoprotective coating, said macrocapsules Contains therein a number of said microcapsules, and said macrocapsule Is formed from a biocompatible gel for encapsulating biologically active substances Macro capsule.   2. The biocompatible gel is covalently and / or ionically crosslinkable Alginate, covalently crosslinkable linear or branched PEG, yellow A mixture of covalently crosslinkable linear or branched PEGs of different molecular weights Compound, a combination of alginate and PEG, as well as any two or more thereof. The macrocapsule according to claim 1, selected from a mixture.   3. The mac of claim 1 wherein the immunoprotective coating is a polycation. Rocapsules.   4. The macrocapsule according to claim 3, wherein the polycation is polylysine.   5. The macrocapsule according to claim 1, wherein the microcapsules have a solid gel core. Le.   6. The macrocapsule according to claim 1, wherein the macrocapsule has a solid gel core. .   7. In the method of producing macrocapsules for encapsulating microcapsules And covalently attach a number of microcapsules, each containing a biologically active substance Of biocompatible, liquid gelling substances that can be crosslinked ionicly and / or ionically Suspended in the above suspended microcapsules were predetermined The gelling substance covalently and / or ionically. The method of manufacturing, wherein the method comprises cross-linking.   8. The treatment of a diabetic patient according to claim 1 in a specific area of the patient. A method comprising inserting microcapsules, the macrocapsules being A method of treatment as defined above, which comprises microcapsules of islets. .   9. Remove the macrocapsule from the patient when the macrocapsule is no longer effective. Further consisting of leaving and replacing it with a new macrocapsule The method of claim 8.   10. The macrocapsule is a circle, a sphere, a disc, a flat plate, a wafer or a dog. The macrocapsule according to claim 1, which is made in the shape of a bone.   11. The drug according to claim 1, wherein the biologically active substance is a pharmacologically effective drug. A pharmacologically effective drug delivery system consisting of black capsules.   12. The macrocapsule according to claim 1, wherein the biologically active substance is a living cell. A pharmacologically effective drug delivery system comprising.   13. A macroca according to claim 1, wherein the alginate is a high G alginate. Pucsel.   14. The macrocapsule contains a large number of alginate / PLL / alginate microphones. The macrocapsule according to claim 1, which comprises a capsule.   15. The numerous alginate / PLL / alginate microcapsules are:   Ionic and / or covalently crosslinked alginate,   Covalently cross-linked linear or branched polyethylene glycol, or Or   A mixture of them 15. The macrocapsule according to claim 14, which is encapsulated within.   16. The biocompatible gel has a content in the range of 200 to 1,000,000. A linear or branched polyethylene glycol having a molecular weight, according to claim 1. The listed macro capsule.   17． Claim: The alginate is ionically bridged by a polyvalent cation. Item 1. The macrocapsule according to Item 1.   18. The microcapsules are   Ionic and / or covalently crosslinked alginate,   Covalently cross-linked linear or branched polyethylene glycol, or Or   A mixture of them The macrocapsule according to claim 1, wherein the macrocapsule is confined within.   19. The biocompatible material from which the macrocapsules are manufactured is covalently bonded. 6. A linear or branched polyethylene glycol which is crosslinkable. The macrocapsule according to 8.   20. The biocompatible material from which the macrocapsules are manufactured is ionic And / or covalently crosslinkable alginate and / or covalent bond A combination of linear or branched polyethylene glycols that can be crosslinked mechanically The macrocapsule according to claim 18, which comprises:   21. In a macrocapsule enclosing a biologically active substance in it, The macrocapsule, wherein the biologically active substance is surrounded by a biocompatible gel. .
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