JPH08503600A

JPH08503600A - Ｒｎａ配列で開始させるリガーゼ連鎖反応

Info

Publication number: JPH08503600A
Application number: JP6500658A
Authority: JP
Inventors: マーシヤル，ロナルド・エル; キヤリーノ，ジヨン・ジエイ; サスタチエク，ジヨアン・シー
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1992-05-29
Filing date: 1993-05-24
Publication date: 1996-04-23
Also published as: EP0642592A4; WO1993024656A1; AU4387193A; US5686272A; EP1262560A2; CA2136764A1; EP0642592A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、RNAの逆転写によって相補的DNA（cDNA）を調製することによりRNAを増幅する方法、及びcDNA配列の増幅に係わる。増幅した物質を解析することによって特定の核酸配列の存在に関連する病原体及び疾患状態の検出が容易となるので、本発明は医学的診断手続きにおいて重要である。所定長のcDNAを調製する方法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 RNA配列で開始させるリガーゼ連鎖反応発明の分野本発明は、特定のRNA配列を増幅及び検出する方法及びキットに係わる。本発明は特に、RNAの逆転写によって相補的DNA（cDNA）を調製する方法、及び当該DN A配列の増幅に係わる。増幅した物質を解析することによって特定の核酸配列の存在に関連する病原体及び疾患状態の検出が容易となるので、本発明は医学的診断手続きにおいて重要である。発明の背景核酸増幅技術は、標準的核酸ハイブリッド形成法ではこれまで検出不能であった、少量のDNAまたはRNAを検出する強力な手立てとして確立されている。DNAの増幅で最も普通に用いられるのは、米国特許第4,683,195号及び同第4,683,202号に開示されたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）や、ヨ一ロッパ特許出願公開第320 3 08号及び同第439 182号に開示されたリガーゼ連鎖反応（LCR）である。上記各刊行物の開示はその全体が本明細書に参考として含まれる。 PCR Protocols：A Guide to Methods and Amplifica-tions，Academic Press ，Inc．（1990）に述べてあるように、 PCRは逆転写と組み合わせれば微量のRNAの増幅及び検出を可能にする。PCR法は国際特許出願公開第91/0994号において更に検討され、この文献にはRNAを増幅し得る一酵素系が開示されている。逆転写酵素活性を有する熱安定性のDNAポリメラーゼが報告されている。逆転写酵素活性がRNAのcDNAコピーを作製し、cDNAは同じ酵素及び試薬を用いてPCRによって増幅される。 1991年５月14日付で公開された、鋳型RNA特異的PCRに関する米国特許出願第07 /504,591号（NTIS）にはSchuldiner等が、汚染性DNAの増幅を回避する方策を開示している。本発明は、LCRを用いるRNA増幅方法を提供する。本発明の方法では、複数のオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせと、RNAの増幅及び検出の感度及び信頼性をLCRで高めた増幅法とを用いる。発明の概要本発明は、多数のソースに由来するリボ核酸（RNA）を増幅及び検出するのに有用な方法及びキットに係わる。本発明は第一に、生物学的試料中に存在する既知の標的RNA配列を増幅する方法を提供し、この方法は（ａ）試料中のRNAをハイブリッド形成条件下に第一のオリゴヌクレオチドプローブで処理し、この第一のプローブは既知の標的RNAの第一の断片にハイブリダイズ可能であり、（ｂ）前記第一のプローブの3′末端を標的RNAの逆転写によって伸長させ、それによって5′末端部に前記第一のプローブを有し、伸長した3′末端部には標的 RNAの第二の断片と相補的なヌクレオチド配列を有するcDNA断片を調製し、その際前記逆転写は約30個以下のヌクレオチドの付加に制限し、（ｃ）伸長させた第一のプローブを標的RNAから解離させ、（ｄ）伸長させた第一のプローブに第二のオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズし、この第二のプローブの3′末端部は第一のプローブの伸長したcDNA 断片にハイブリダイズ可能であるが、第一のプローブを伸長させなかった場合は実質的に第一のプローブにハイブリダイズできず、（ｅ）（ｉ）第二のプローブの3′末端に第三のDNAプローブを共有結合で連結することによって、ただし第二または第三のプローブを修飾してある場合は前記連結前に当該プローブを修正して、第二のプローブの延長複合体を形成すること、及び（ii）第一のプローブの3′末端に共有結合し、第二のプローブと相補的な第四のDNA断片を調製することによって第一のプローブの延長複合体を形成することの少なくとも一方を行ない、（ｆ）第二のプローブの延長複合体及び第一のプローブの延長複合体の少なくとも一方を増幅することを含む。好ましくは、第一のプローブのcDNA伸長部の長さは全４種のヌクレオシド三リン酸のうちの３種以下のプールを設けることによって制限する。即ち、除外したヌクレオチドを要求する終結塩基（stopbase）の位置で伸長を終了させる。本発明の重要な一部分に、増幅の継続に十分な長さを有するDNAコピーをRNAから調製することが有る。本発明の方法は上記調製の実現手段を幾つか提供し、その際、実質的に第一のプローブを標的RNA上で予め伸長させた場合にのみ第二のプローブが第一のプローブとハイブリダイズすることが特に重要である。理想的には、第二の、及び伸長した第一のプローブはそれぞれの3′末端部の比較的短い部分のみに関して互いにハイブリダイズし、5′末端側に比較的長い突出部を残す。この5′末端側突出部は完全長DNA生成物を完成するのに用いる。完全長DNA生成物は、1）第一（もしくは第二）のプローブを鋳型として用いて第二（もしくは第一）のプローブを重合伸長させるか、または2）第二のプローブに（第一のプローブの5′末端側突出部と相補的な）第三のプローブを連結し、もしくは第一のプローブに（第二のプローブの5′末端側突出部と相補的な）第四のプローブを連結することによって完成する。完成した完全長DNAコピーは幾つかの技術で増幅し得、それらの技術のうちで最も有用なものは、既に述べたのと同じ４種のプローブを用いるLCRである。即ち、本発明の方法は更に、（ｉ）第二または第三のプローブを修飾してある場合は当該プローブを修正してから第二のプローブの3′末端に共有結合で連結するという条件で、第一のプローブの少なくとも一部と相補的な第三のオリゴヌクレオチドプローブから成る延長複合体、及び（ii）第一のプローブの3′末端に共有結合させた、第二のプローブの少なくとも一部と相補的な延長オリゴヌクレオチド複合体の両方を形成する反復サイクルを少なくとも一つ実施することによる増幅を含む。第二に本発明は、試料中に存在する既知の標的RNA配列から所定長のcDNAを調製する方法を提供し、この方法は、（ａ）RNAをハイブリッド形成条件下に、標的RNAの第一の断片にハイブリダイズ可能な第一のオリゴヌクレオチドプローブで処理するステップ、及び（ｂ）前記第一のプローブの3′末端を、全4種のヌクレオシド三リン酸のうちの 3種以下しか存在しないことを含む条件下での標的RNAの逆転写によって伸長させ、それによって所定長のcDNA断片を得、その際前記伸長は鋳型RNAが存在しないヌクレオシド三リン酸を要求する所定長実現時点に終了するステップを含む。最後に本発明は、生物学的試料中に存在する標的RNAを検出する診断キットを提供し、このキットは（ａ）標的RNAの一部と相補的な第一のオリゴヌクレオチドプローブと、（ｂ）第一のプローブの3′位に位置する、標的RNA領域と相補的なヌクレオシド三リン酸の供給源の存在下に第一のプローブをプライマーとして用いて標RNAを逆転写し得る伸長試薬と、（ｃ）実質的に第一のオリゴヌクレオチドプローブを逆転写によって伸長させた場合にのみ第一のプローブにハイブリダイズ可能な第二のオリゴヌクレオチドプローブと、（ｄ）（ｉ）第二のプローブの3′末端に連結可能でかつ第一のプローブの一部と相補的である5′末端を有する、第一のプローブの一部と相補的な第三のオリゴヌクレオチドプローブで、第二または第三のプローブを連結前に修正した場合は修正後の形態で第二のプローブを第三のプローブに連結し、それによって第二のプローブの延長複合体を形成することができる第三のオリゴヌクレオチドプローブ、及び（ii）第二のプローブの一部と相補的な第四のオリゴヌクレオチドプローブで、第一のプローブを伸長させた場合に第一のプローブの3′末端に共有結合で連結し、それによって第一のプローブの延長複合体を形成することができる第四のオリゴヌクレオチドプローブの少なくとも一方と、（ｅ）第二のプローブの延長複合体、第一のプローブの延長複合体、またはこれらの複合体の両方の形成に用いるアセンブリング試薬とを組み合わせて含む。図面の簡単な説明第１図は、延長した第一及び第二のオリゴヌクレオチドプローブを用いるRNA 増幅方法を一般化して示す概略的説明図である。図中、延長は伸長を表わす“くねった”線と、連結可能なプローブ３及び４を表わす“影付きの”バーとによって示す。第２図は、実施例２に説明した、標的RNA試料としてC型肝炎ウイルスを用いる RNA増幅方法の説明図である。６：２ギャップ及びプローブは、標的上に整列したものとして示してある。補填部分（C及びT）は、標的及び最終的な完全長DNA 生成物では下線を付して示し、残りのフレームでは小文字で示す。発明の詳細な説明〔定義〕 “オリゴヌクレオチド”とは、２個以上、好ましくは４個以上のデオキシリボヌクレオチドから成る分子のこととする。厳密な大きさは、オリゴヌクレオチドの最終的な機能または用途など、多くの要因に依存する。定義によれば、オリゴヌクレオチド（時に“オリゴ”と略称）は極性並びに3′及び5′末端部を有する。本明細書中に用いた“末端（terminus）”という語は、オリゴヌクレオチドの終点（endpoint）を意味する。末端は普通5′-リン酸または3′-ヒドロキシルであるが、場合によっては末端を修飾して、標的とは無関係の望ましくない（例えば内部末端との）連結を防止したり、標識またはリポーター基（例えば外部末端）を付加したりする。これに対して、オリゴヌクレオチドの“末端部（en d）”とは前記末端を含む部分もしくは断片のことであり、実際の末端のことではない。オリゴヌクレオチドは、典型的には2′-デオキシリボ-オリゴヌクレオチドであるが、リボ-オリゴヌクレオチドとデオキシリボ-オリゴヌクレオチドとの混合物であってもよい。 “プローブ”はオリゴヌクレオチドである。本発明によるプローブの厳密な長さは、温度、プローブ源、及び当該プローブの本発明方法での用い方など、多くの要因に依存する。６個または７個のヌクレオチドから成る（ゆえに通常“6〜7 マー”と呼称される）ような短いプローブ、及び数百マーのような長いプローブが他の目的で用いられているが、より典型的には、LCR用のプローブは10マーから40または50マーである。例えば、プローブは標的RNA配列の複雑さに応じて典型的には15〜40個のヌクレオチドを有するが、これより多数または少数のヌクレオチドを有してもよい。プローブは、精製制限消化産物中に存在するような天然ソースから取得できる。あるいは他の場合には、通常のヌクレオチドホスホラミジト（またはホスホネート）化学と、Applied Biosystems，Inc．（Foster City，CA）、DuPont（Wilmington，DE）またはMilligen（Bedford，MA）から入手可能な機器とを用いて所望のプローブを合成することが一般的に行なわれる。リガーゼによる連結に必要な、プローブの5′末端のホスホリル化は当業者に公知のようにキナーゼによってか、または化学合成（例えばClontech，Palo Alto，CAのPhosp hate-0n^TM）によって実現し得る。後述するように、プローブは第二のプローブへの連結点として、または重合伸長の開始点（例えばプライマー）として機能し得る。プライマーとして用いる場合、プローブは重合剤の存在下に伸長生成物の合成を可能にする十分な長さを有しなければならない。“重合”及び“伸長（exten-sion）”とは、当業者に良く知られているように鋳型を用いてプライマーにヌクレオシド三リン酸モノマーを１個ずつ付加することである。これに対して“延長（elongation）”とは、共有結合したより長いプローブが何等かの機構の下で得られるプロセスのことである。特に、延長には短い別のオリゴヌクレオチドを連結して“延長”生成物もしくは複合体を形成することが含まれる。延長は、本明細書に参考として含まれるヨーロッパ特許出願公開第439 182号から公知であるような、連結ステップ前の“修正（c orrec-tion）”（例えば伸長）ステップも包含する。プローブに関して用いた“修飾（modified）”及び“修正（corrected）”という語は、いずれも本明細書に参考として含まれる1991年1月9日付米国特許出願第07/634,771号（ヨーロッパ特許出願公開第439 182号として公開）及び1992年８月３日付米国特許出願第07/925,402号において特定された意味を有する。簡単に言えば、修飾したプローブとは、リガーゼに合致する基質でなくなったために同じ向きのパートナープローブに連結され得ないプローブである。リガーゼは基質として、1）近接または隣接プローブで2）5′-リン酸末端及び3）3′-ヒドロキシル末端を有するプローブを必要とする。リガーゼは、隣接を指示する鋳型にハイブリダイズした時上記必要条件を満たすプローブを著しく好む。プローブの修飾は通常、（隣接の必要条件を損なうべく）ギャップを残し、重複部を設けること；3′-ヒドロキシルをリン酸、リボヌクレオチド、もしくは他のブロッキング分子に変えること；または5′リン酸を変更し、もしくは5′-不適正塩基を挿入することによって行なう。通常の定義から逸脱しない他の“修飾”を行なうことも、本発明は企図している。先に挙げた米国特許出願第07/634,771号及び同第07/925,402号に詳細に述べてあるように、修飾を鋳型に依存した方法で“修正”することによって連結可能なプローブが得られる。しかし、この修正プロセスは実質的に、プローブを標的［または標的から製造したアンプリコン（amplicons)］にハイブリダイズする時にしか行なわれない。 “全４種のヌクレオシド三リン酸”という語が、DNAに関する場合はグアニン( G)、シトシン(C)、アデニン(A)及びチミン(T)を意味し、RNAに関する場合はグアニン(G)、シトシン(C)、アデニン(A)及びウラシル(U)を意味することも理解されるべきである。この語は上記塩基の類似体及び誘導体も包含する。従って、“全４種のヌクレオシド三リン酸のうちの３種以下”とは、４種のヌクレオシド三リン酸のうちの少なくとも１種を除外することである。〔方法段階〕本発明の増幅方法は通常、I）最初のハイブリッド形成及び逆転写、II）完全長DNAの少なくとも一方の鎖の分離及び形成、及びIII）完全長DNAの一方または両方の鎖の増幅の３段階で進行する。しかし、本発明の方法のこのような分説は確定的なことではなく、検討を容易にするためのものであり、本発明を限定しない。第１段階では、試料中に標的RNAが存在する場合該RNAに第一のプローブがハイブリダイズし、このプローブを、鋳型として前記RNAを用いる逆転写によって伸長させる。第一のプローブの伸長は逆転写酵素で実現しても、また所定条件下に DNAポリメラーゼで実現してもよい。本願出願人が試験したDNAポリメラーゼの場合、典型的には約0.5〜約30mMの濃度の二価カチオンを存在させなければならない。現在、既知のDNAポリメラーゼの逆転写活性発現にはマンガンが必要であると考えられており、その濃度は0.5〜約５mMが適当である。 cDNAを調製する上記最初の伸長は好ましくは、第一のプローブに約30個以下のヌクレオチドしか付加されないように制限する。伸長には、RNAのPCR増幅技術において通常そうであるように４種のヌクレオチド三リン酸を総て含み得るが、好ましくは全４種のヌクレオシド三リン酸のうちの３種以下しか含まず、なぜなら普通所定長のcDNAが望ましいからである。全４種のヌクレオシド三リン酸のうちの３種以下しか存在しないように試薬を制限すれば、除外したヌクレオシド三リン酸を伸長中のプライマーに付加することをRNA鋳型が指示する時伸長は終了する。このような事情から、除外した塩基の付加を要求する鋳型塩基を本明細書中では“終結塩基”と呼称する。第１段階でのcDNA伸長は通常ただ１回のラウンドで後の増幅の継続に十分であるが、第１段階を反復し、それによって各標的RNA分子からcDNAコピーを更に製造することが望ましい場合も有る。そのような反復は、十分な熱を適用して（またはストリンジェンシー条件を変更して）RNA：DNA二重体（duplex）を分離することを必要とする。その後、冷却して、伸長しなかった第一のプローブを標的RN A分子に再アニールし、もう一度第一のプローブを伸長させる。第１段階を反復するには、逆転写活性が比較的熱安定性であること、正確なストリンジェンシー条件を用い、それによってRNA：DNA二重体の分離を酵素活性の損失を伴わずに可能にすること、または酵素を各サイクル毎に再添加することが必要となる。国際特許出願公開第91/09944 号においてGelfand等は、熱活性な逆転写活性を有するポリメラーゼ酵素を報告している。第１段階は、普通加熱によるRNA：DNA二重体の分離によって完了する。約100℃に加熱すれば逆転写酵素も破壊できる。第２段階では、伸長させた第一のプローブを１種以上の他のプローブと組み合わせて、完全長DNAの少なくとも一方の鎖を合成する。“完全長”DNA鎖とは、典型的にはLCRによる後の増幅の継続に十分な長さを有するDNA鎖のことである。完全長DNAの長さは約40ヌクレオチドから100ヌクレオチドを上回るほどであり得、普通は40〜60ヌクレオチドである。完全長鎖は一方を合成すればよいが、好ましい方法では三つの付加的プローブを用い、両方の完全長鎖を合成する。これら４種のプローブと同じものを、後のLCR増幅段階でも用いる。最も単純な例では、完全長DNA鎖は伸長反応において４種のヌクレオシド三リン酸を総て用いて調製する。この場合は伸長は終結塩基により所定長に制限されることがなく、また第１段階と第２段階とは区別できない。本発明によれば、伸長は約30ヌクレオチドを越えない所定の長さに制限する。標的、プローブ設計、及び完全長DNAを可能にする補填基準次第では、完全長DNA を伸長のみを用いて調製することが、たとえ全４種のヌクレオシド三リン酸のうちの３種以下しか用いなくとも可能である。より一般的には完全長DNAは、延長複合体を形成するべく連結し得る付加的なプローブと、幾つかの機構によって実施し得る方法とを用いて調製する。いずれにせよ第二のプローブを、該プローブが伸長した第一のプローブにはハイブリダイズするが伸長していない第一のプローブにはハイブリダイズしないような条件下に用いる。特に、第二のプローブの 3′末端部は第一のプローブの伸長部の一部または全部と相補的である。この相補領域を本明細書中では“重複”領域と呼称するが、重複領域は第一のプローブにおいても第二のプローブにおいても、反応条件下に安定なハイブリッド複合体を実現する十分な長さを有しなければならない。厳密な長さはストリンジェンシー条件（特に温度）と、特定のプローブ構成とに依存する。例えば、25℃では約５〜15ヌクレオチドの重複で十分で、かつ好ましい。より高温ではより長い重複領域が必要となり、より低温ではより短い重複を用い得る。重複の長さは、後出の“プローブ設計”の段で詳細に検討する標的の拘束にも依存する。第一のプローブと第二のプローブとの安定な二重体を形成したら、いずれか一方（好ましくは両方）のプローブを、他方のプローブを鋳型として用いて完成し、それによって完全長DNAを合成する（これをその後増幅する）。用い得る幾つかの機構を次の表Ｉに要約する。繰り返しになるが、上記要約表中で言及した修飾及び修正はヨーロッパ特許出願公開第439 182号及び米国特許同時係属出願第07/925,402号において検討されているものと同様であり、ここで詳細に検討する必要は無い。好ましい４プローブ−二重ギャップ補填方式では、延長複合体の上方の鎖も下方の鎖もギャップ補填伸長及び連結によって調製する。二つのギャップの長さは好ましくは相違する。第一のプローブと第四のプローブとの間のギャップの長さは、伸長した第一のプローブと第二のプローブとが安定な二重体を構成し得るように約５〜15塩基とする。これに対して、第二のプローブと第三のプローブとの間にギャップが存在する場合その長さは典型的にははるかに小さく、例えば１塩基から約５〜10塩基であり、普通“非対称性の”ギャップとなる。第二のギャップは存在しない場合も有り、その時は第二のプローブと第三のプローブとは直接、即ち隣接して並び合う。そこで、延長複合体を構成するプローブ同士の間のギャップをギャップ比によって特徴付けることができる。第一の数は（下方の鎖の）第一のプローブと第四のプローブとの間のギャップの長さを特定し、第二の数は（上方の鎖の）第二のプローブと第三のプローブとの間のギャップの長さを特定する。即ち、本発明の具体例には、15：0または5：5、及び幾つかの中間の比、例えば10：2、12：3、8：0、8：1または9：3といったギャップ比を有するプローブ構成が非限定的に含まれる。このような方法は初め、完全長cDNAを調製するものとしては厄介であると考えられるかもしれないが、その真の有用性は増幅段階（第3段階）において認められ、この段階では先に完全長DNAを調製するのに用いたのと同じプローブ及びヌクレオチド試薬を完全長DNAの増幅に用いる。〔増幅段階〕第一のプローブと第二のプローブとの安定な二重体を形成したら、各プローブを他方のプローブ上で単に伸長させることによって増幅したDNAを得ることが可能となる。この方法はPCR反応に類似し、厳密なプローブ構成に依存する。しかし大抵の場合は、第一及び第二のプローブをその3′末端部が幾分重複し合うか、または実質的に垂直方向に並び合うように選択する。単純な伸長増幅にはポリメラーゼ、好ましくは熱安定性のDNAポリメラーゼを用いる。適当な熱安定性ポリメラーゼは、米国特許第4,8 89,818号及び同第5,079,352号並びに国際特許出願公開第91/09950号及び同第92/ 03556号を含めた幾つかの刊行物に開示されている。しかし、少なくとも一方の延長複合体は第三または第四のプローブの連結によって合成することが好ましい。その場合、増幅はLCR、またはヨーロッパ特許出願公開第439 182号に開示された修飾末端部LCRとほぼ同様に進行する。当然ながら、一方の鎖で伸長反応を生起させ、他方の鎖で（場合によっては修飾及び修正して）延長／連結反応を生起させるハイブリッド増幅法を用いることも可能であり、かつ本発明の範囲内である。ハイブリッド増幅は、付加的な試薬（例えばエンドヌクレアーゼIVやリボヌクレアーゼ）が必要な場合はさほど好ましくない。好ましい酵素連結ステップを可能にする条件及び試薬は通常当業者に公知であり、また“発明の背景”に挙げた引例に開示されている。本発明において有用な連結試薬にはE. coliリガーゼ、T4リガーゼ、及びヨーロッパ特許第320 308号に教示されたThermus thermophilusリガーゼ（例えばATCC 27634）などの原核生物リガーゼが含まれる。Thermus thermophilusリガーゼは、LCRの高温サイクル反復の間活性を維持する能力を有するので目下のところ好ましい。熱的に安定な他の適当リガーゼは、New England Biolabs，Inc．（Beverly，MA ）、Epicentre Technologies，Inc．（Madison，WI）及びMolecular Biology Re sources(Milwaukee，WI）から市販されている。熱安定性リガーゼを用いないと、サイクルを反復する度にリガーゼを再添加しなければならない。J．Biol．Che m．261 ，pp．10637-10647（1986）にRabin等によって報告されたDrosophiliaのD NAリガーゼを含む、真核生物リガーゼも有用である。連結完了後、融合プローブを標的から解離（例えば融解）させ、通常のLCRの場合のようにプロセスを幾サイクルか反復する。反復サイクル数は１から約100 まで様々とし得るが、目下のところ約15から約70が好ましい。〔プローブ設計〕本発明の目的に関して、標的RNAは、例えばゲノムRNA、mRNA、tRNA、hnRNA及びrRNA並びにこれらの任意の組み合わせを含めたウイルス、核または細胞質由来のRNAの中から選択した任意のRNAとし得る。本発明で用いるプローブは、増幅するべき各特定配列の異なる鎖と実質的に相補的であるように選択する。この文脈で“選択する”ということは、所望の特性を有する標的配列の位置を確認し、プローブを標的配列の一つ以上の適当断片の周囲に構築することを意味するものとする。本発明の必要条件を満たす特定の標的配列を探し、かつ同定する方法は当業者に公知であると理解するべきである。例えば、容易に入手可能なコンピュータソフトウェア（例えばMacVector、MacMo llyまたはGeneworks）で検索できる配列情報（例えばGENBANK、NBRF、EMBLまたはSwiss-Prot）が多くのデータベースに保有されている。データベース中のRNA 配列は便宜上、例えば実施例3に述べたようにDNA検索基準を用いて検索を行なうべく、その対応するDNA配列へと容易に変換することができる。また、いずれの生物の既知のゲノムにおいても、必要条件を満たす箇所は通常多数見出されることも認められよう。例えば、約9.4kbの長さを有するHCVゲノム［GENBANK Acc．N o．M58335（実施例１及び２並びに付表Ａ参照)］の検索は、本発明の実施に場合によっては適すると考え得る箇所の数が1486を越えることを明示する。プローブ１及び３は鋳型の配列を厳密に反映する（もしくは鋳型の配列と厳密に相補的である）必要は無いが、標的の配列とハイブリダイズするのに十分な相補性を有しなければならない。プローブ２はプローブ１の伸長部と相補的でなければならず、プローブ１に重複することすら可能であるが、ただしプローブ１の伸長前には実質的にプローブ１にハイブリダイズしない。プローブ２の5′末端側残部は全く任意の配列であり得、標的に特異的である必要は無い。プローブ4 を用いる場合、該プローブ４はプローブ２の5′末端側残部と相補的でありさえすればよい。第一または第二のプローブの延長複合体が形成されれば、プローブは、オリジナルの標的が存在したかどうかにかかわらず典型的には完璧な相補物である。完璧な相補性には、例えばDNA増幅段階において最初のcDNA伸長段階には存在しなかった終結塩基が創出されるという例外が存在し得る。終結塩基の創出は、例えばプローブ２を、プローブ１との重複領域に不適正塩基を含むように設計することによって実現し得る。オリジナルの鋳型は用意されているdNTPを要求したが、不適正な塩基はプール中に用意されていないdNTPを要求する。このことには、比較的長いcDNA伸長生成物を可能にする一方、増幅時のギャップ補填をより小さく制限する効果が有る。伸長したプローブ１とプローブ２との重複領域内に存在する不適正塩基が不安定化作用を有することは欠点となろう。本明細書の最後にプローブ設計のより詳細な例を示してあるが、ここで一典型例について述べる。この例は、潜在的な9：3非対称性ギャップLCR部位の一つのタイプの同定を説明するもので、上記部位は上方の鎖に1個の塩基(G)、続いてＴまたはＣである塩基９個の列、続いてＧまたはＡである塩基３個の列、続いて１個の塩基(T)を有する［即ち、配列RYYYYYYYYYRRRY（ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ）が検索される］。このような典型例は、C型肝炎ウイルスの5′非翻訳領域、ウイルスコア、マトリックス、エンベロープ及び非構造タンパク質RNA中に見出される配列によって明示される［Takamizawa，A．等，J．Virology 65，pp ．1105-1113（1991）；“CHUMR”と呼称］。プローブ２及び４は、これら二つのプローブ間に熱融解温度（Tm）を約50〜80 ℃とする十分な数の相補塩基が存在するように選択する。これは普通、15〜30塩基の相補性である。同様に、プローブ１及び３は典型的には、プローブ２及び４のものに近似するTmを有するように選択する。上述の例では、プローブ２及び４は19個の相補塩基を有し、プローブ１及び３は20個の相補塩基を有する。プローブ２は９個の塩基の連なり（5′-TCCTTTCTT-3′）を有し、この連なりはプローブ４とハイブリダイズしないが反応の増幅段階の間（プローブ２と３との連結後にDNAポリメラーゼにより）プローブ１にＧ及びＡを付加するための鋳型として機能する。プローブ１は３個の塩基の連なり（5′-TCC-3′）を有し、この連なりはプローブ３とハイブリダイズしないが反応の第２または第３段階の間（伸長させたプローブ１をプローブ４に連結し、または連結せずにDNAポリメラーゼにより）プローブ２にＧ及びＡを付加するための鋳型として機能する。加えて、最初に逆転写によってプローブ１を伸長させることにより、逆転写酵素にヌクレオシド三リン酸Ｃを与えない場合（即ち標的RNA鎖上の対応するＧが終結塩基として機能する場合）所定長に伸長した第一のプローブが得られることが指摘されるべきである。“所定長”とは、元のプローブ１に９個のＡ及びＧを付加した時の全体の長さのことである。上記９個の塩基から成る付加部分はプローブ１と２との、約25℃での二重体形成に十分な重複をもたらす。即ち、プローブ４を添加し、伸長させたプローブ１に連結することにより下方の鎖上で完全長 DNAを調製し得、またプローブ３を添加し、プローブ２を伸長させ、かつ伸長させたプローブ２をプローブ３に連結することにより上方の鎖上で完全長DNAを調製し得る。増幅段階では複数のプローブをほぼ等モル濃度で添加する。なぜならこれらのプローブは化学量論量で反応すると考えられるからである。各プローブは約0.5 ナノモル（nM）から約1000nMの濃度で存在させる。LCRのためには約１〜約100nM の濃度が好ましい。各反応のために用いるプローブの最適量は、実施しなければならないサイクルの数に応じても変化する。他のプローブ設計及び最適濃度は、当業者には容易に決定できる。プローブ設計は別の一面で、用いる特定の増幅法に係わる。延長プローブ複合体の形成にプローブの重合伸長しか要しない方法を用いる場合、プローブは二つしか必要でない。他方、第一または第二の延長プローブ複合体のいずれかの部分を連結によって形成する場合は一つまたは二つの付加的なプローブが必要となる。即ち本発明には、２プローブ方式、３プローブ方式及び４プローブ方式の三つの具体例が有る。３プローブ方式では、第一のプローブの延長生成物を伸長によって得、第二のプローブの延長複合体を、修正機構（例えば伸長）を伴うかまたは伴わない連結によって形成すれば、その方が簡単である。４プローブ方式では、二つの延長複合体のいずれも連結を必要とする。修正は、行なう方が好ましいが任意である。標的RNAを検出し得るプローブが同じ生物の対応する標的DNAも非常に良く検出し得、またこの逆もあり得ることは言及されるべきである。〔検出〕増幅後、増幅した配列を当業者に公知の幾つかの通常方法で検出し得る。本発明にとって必須な特定の検出機構は存在しない。特に好ましい機構では、少なくとも二つのプローブの有効な外側末端部（即ち延長プローブ複合体の両端に位置する末端部）、好ましくは四つのプローブ総ての外側末端部にフックを結合する。“フック”とは、特異的なリガンド−レセプター親和性を有する任意分子のことである。典型的には、複合体の一端側の末端部に位置する１個以上のフックは、固相上に結合した試薬（抗体またはアビジンなど）によって固定され得る抗原またはハプテンを含む。複合体の他端側の末端部に位置する１個以上のフックは、抗体−酵素結合体などの標識もしくは標識系によって識別され得る異なる抗原またはハプテンを含む。このようなアプローチを用いれば、増幅生成物を任意方式のサンドイッチイムノアッセイにおいて検出できる。フック結合後、検出可能な生成物へと酵素により変換される基質を添加する。多くの異なるハプテンが当業者に公知であり、実質的にいずれのハプテンも本発明と共に用い得る。実例となるようなハプテンには、多くの薬物［例えばジゴキシン、テオフィリン、フェンシクリジン（PCP）、サリチル酸塩等］、T3、ビオチン、フルオレセン（FITC）、ダンシル、2，4−ジニトロフェノール（DNP ）；ブロモウラシルなどの修飾ヌクレオチド、及びN−アセチル−7−ヨード−2 −フルオレニルアミノ（AIF）基の導入によって修飾した塩基；並びに他の多くのハプテンが含まれる。ここに述べたハプテンのうちの幾つかは、本願と同じ出願人による同時係属出願である、いずれも1991年12月17日付の米国特許出願第07 /808,508号（アダマンタン酢酸）及び同第07/808,839号（カルバゾール及びジベンゾフラン）；いずれも1992年３月27日付の米国特許出願第07/858,929号（アクリジン）及び同第07/858,820号（キノリン）；並びに1993年４月21日付、付、1993年３月26日付及び1993年３月26日付でそれそれ出願された、前記四つの出願それぞれの一部継続出願（本明細書中ではこれらをまとめて“ハプテン出願”と呼称）に開示されている。既に出願済みの上記各ハプテン出願の開示は総て、本明細書に参考として含まれる。プローブにハプテンを付加する多くの方法が文献中に認められる。Enzo Bioch emical（New York）及びClontech（Palo Alto）はいずれもプローブ標識技術を開示し、かつ商品化している。例えば、3′-Amine-ON CPG^TM（Clontech， Palo Alto，CA）を用いて3′オリゴ末端に第一級アミンを付加し得る。同様に、 Aminomodifier II（登録商標）（Clon-tech）を用いれば5′オリゴ末端に第一級アミンを付加し得る。アミンは、通常の活性化及び結合化学手段を用いて様々なハプテンと反応させることができる。加えて、同時係属出願である1990年12月11 日付の米国特許出願第625,566号及び1990年12月20日付の同第630,908号は、プローブをその5′及び3′末端それぞれにおいて標識する方法を教示している。これらの同時係属出願はいずれも本明細書に参考として含まれる。 1992年６月25日付の国際特許出願公開第92/10505号及び1992年７月９日付の同第92/11388号は、プローブをその5′及び3′末端部それぞれにおいて標識する方法を教示している。オリゴヌクレオチドを標識する一公知方法によれば、標識− ホスホラミジト試薬を製造し、これを用いてオリゴヌクレオチドに標識を、該オリゴヌクレオチドの合成の間に付加する。例えば、Thuong，N．T．等，Tet．Let ters29（46），pp．5905-5908（1988）や、Cohen，J．S．等の米国特許出願第07 /246,688号（NTIS ORDER No．PAT-APPL-7-246,688）（1989）を参照されたい。当然ながら、特異的プローブ捕捉及び／または検出など、他の検出機構も本発明において有用である。本発明の方法をRNAの増幅が望まれる様々な情況で用い得ることは、当業者には認められる。以下の実施例は単に本発明を解説するためのものであり、添付した請求の範囲を限定しない。プローブは概して慣行通り5′から3′の方向で左から右へ書いたが、標的として（または標的上で整列したものとして）示す場合は一方の鎖（または二つのプローブ）を逆向きにしてある。実施例以下の各実施例において、DNAリガーゼはThermus ther-mophilusから精製した熱安定性リガーゼであり、かかるThermus種に由来する熱安定性ポリメラーゼはM olecular Biology Resources（MBR），Milwaukee，WIから入手する。ポリメラーゼの量は、全部で10ナノモルのヌクレオチドを酸不溶性物質に70℃において30分で含有させるのに必要な酵素量を１単位とする旨（例えばMBRにより）定義された単位で表わす。リガーゼ酵素の単位は（本出願人の社内規格）、１mgの95％精製Thermus thermophilus DNAリガーゼは約１×10⁸単位の比活性を有すると定義した。この定義は厳密には標準化されておらず、20％ほど変動し得るが、最適化は日常的従業者の技術の範囲内である。実施例１ 9：3プローブ設計を用いてのC型肝炎ウイルス（HCV）の検出標的配列としてHCVの標的RNAを検出するべく、次のプローブセットを設計した。下線を付した塩基は、後段にみるように終結塩基となる。380B型DNAシンセサイザー（App-lied Biosystems，Inc.，Foster City，CA）を用いてプローブを合成し、その各末端部を、市販（Clontech，Palo Alto，CA）のビオチン及びフルオレセンホスホラミジト試薬を用いてビオチン（bio）及びフルオレセン（f1）で標識した。標的RNAは、DNA依存性RNAポリメラーゼと、HCVの5′非翻訳領域（“HCV5′UTR ”）の断片とその上流に位置する細菌プロモ-ターを含む、HindIIIで直線状としたDNAプラスミドとを用いて調製した約350塩基のRNA転写物とした。標的RNAの検出は、二つのステップを有する反応を生起させることによって行なった。第一のステップは、dATP及びdGTPのみの存在下に第一のプローブを伸長させて９塩基の付着端3′-AGGAAAGAAを生じさせる逆転写ステップであった。逆転写は次の条件下に進行させた。 42℃で１時間インキュベートすることによって反応を開始させ、第一のプローブを伸長させた。次に、試料を５分間煮沸して逆転写酵素を不活性化し、RNA：D NAハイブリッドを変性させた。上記の反応混合物20μlに、次の混合物を180μl添加した。伸長させた第一のプローブを、第二及び第三のプローブにハイブリダイズした。下記の条件下にGAP LCRを用いて、第二及び第三のプローブをDNAポリメラーゼによって伸長させ、かつ連結した。同様に、第二のプローブとのハイブリッド形成時に第四のプローブと、伸長させた第一のプローブとを連結した。次の複合体を得たが、下方の配列中にみられる（総てｇまたはａの）ヌクレオチドは伸長ステップに由来するものであり、また下線を付した塩基は終結塩基である。ギャップLCR伸長は、85℃で90秒間、続いて25℃で30分間インキュベートすることにより実現した。増幅操作では、85℃で85秒間のインキュベーションと、続く56℃で60秒間のインキュベーションとから成るサイクルを45回実施した。増幅後、二重に標識したLCR増幅生成物を、Abbott IMx（登録商標）系上で行なうサンドイッチイムノアッセイを介して2試料ずつ検出し、次の表IVに示す結果を得た。IMxでの検出法は文献に記載されている。実施例２ 6：2プローブ設計を用いてのC型肝炎ウイルス（HCV）の検出標的配列としてHCVの標的RNAを検出するべく、次のプローブセットを設計した。下線を付した塩基は、後段にみるように終結塩基となる。実施例１に述べたようにしてプローブを合成し、かつ標識した。標的RNAは実施例１と同じにした。標的RNAの検出は、上記実施例１に述べたような、二つのステップを有する反応を生起させることによって行なった。第一のステップは、dCTP及びdTTPのみの存在下に第一のプローブを伸長させて6塩基の付着端5′-TTCCTCを生じさせる逆転写ステップであった。逆転写は、dGTP及びdA TPをdCTP及びdTTPに置き換えた以外は実施例１で第一のステップとして説明したように進行させた。42℃で15分間インキュベートすることによって反応を開始させた。次に、試料を99℃で5分間インキュベートして逆転写酵素を不活性化し、R NA：DNAハイブリッドを変性させた。その後、試料を５℃で５分間インキュベートした。下記の条件下にギャップLCRを用いて、第二のプローブをDNAポリメラーゼによって伸長させて第三のプローブに連結した。同様に、第二のプローブとのハイブリッド形成時に第四のプローブと、伸長させた第一のプローブとを連結した。第一のステップの反応生成物20μlに、次の混合物を80μl 添加した。次の複合体を得たが、下方の配列中にみられる（総てｃまたはｔの）ヌクレオチドは伸長ステップに由来するものであり、また下線を付した塩基は終結塩基である。ギャップLCR伸長は、85℃で60秒間、続いて25℃で30分間インキュベートすることにより実現した。増幅操作では、 85℃で30秒間のインキュベーションと、続く64℃で30秒間のインキュベーションとから成るサイクルを47回実施した。増幅後、ハプテンで二重に標識したLCR増幅生成物を、Abbott IMx（登録商標）系上で行なうサンドイッチイムノアッセイを介して３回ずつ検出し、次のような結果を得た。即ち、10⁴個のHCV標的分子はいずれの標的からも区別できなかった。ハイブッド形成を達成するのに100％の相同性が不可欠でないことは、当業者には十分に理解される。厳密な条件次第では、比較的低いストリンジェンシー条件下であっても60％のような低い相同性でハイブッド形成の達成に十分であり得る。LCR及びPCRのように昇温下に反復する操作では75〜100％、好ましくは少なくとも80％の相同性が必要である。即ち、20マープローブなら標的と、多くとも４ヌクレオチドしか相違し得ない。当然ながら、プローブ中の不適正塩基の位置はきわめて重要であり得る。不適正塩基が伸長部または連結部の接合点に位置することは、そのような不適正塩基がプローブの外側末端部に位置する同数の不適正塩基よりも、仮に許されるとしてもはるかに不利な作用を有する。実施例３他のプローブ設計と適合するHCV標的領域の位置確認本発明は、既知であるいずれの標的RNAに対しても有用である。RNA（例えばmR NAまたはrRNA）をコードすることが知られている任意のDNA領域、または既知である任意のRNA 配列に関して、本発明の必要条件を満たす標的領域を配列中に探索し得る。当然ながら、RNA配列をその対応するDNA配列にまず変換することが望ましい場合も有る。一般化した探索方法は、表VIIIに掲げた基準を満たす領域を探すことであり、その際表VIII中に用いた記号は次のような意味を有する。ｈ及びｋの整数を選択して探索を行なう。ただ１個のヌクレオシド三リン酸での補填を可能にするような標的領域はあまり見出せないことが予測され得る。そのような領域は、たとえ存在しても融解温度の抑制、または二次構造の抑制に起因して良好に機能しない恐れが有る。これに対して、ギャップの補填に３種の異なるヌクレオシド三リン酸を用いる場合はより多数の箇所を見出すことが期待できるかもしれない。有効な箇所の数と、各反応毎に添加する試薬の量を制限したい欲求との均衡を図るには、２種のヌクレオチドで補填できる領域を探すことが合理的であると考えられる。添付の付表Ａに、HCVのCHUMR配列中に存在する上記のような２塩基補填箇所を、当業者に理解される通常の一覧表を用いて示す。実施例４ 10：1プローブ設計を用いてのラビットβ−グロビンmRNAの検出実施例１及び２の操作及び条件に従い、ラビットβ-グロビンmRNAを検出するアッセイを行なう。mRNA配列及び番号付けシステムはGENBANK，ver．69 Acc．No ．J00659によって公開されたものとし、選択したプローブは532〜584の領域にハイブリダイズする。次のプローブを実施例１に述べたように合成及び標識した。終結塩基に下線を付す。この例ではプローブは、第一のプローブと第四のプローブとの間に10塩基のギャップが存在し、第二のプローブと第三のプローブとの間に1塩基のギャップが存在するように設計した。四つのプローブは標的（配列番号32）上に次のように並び合い、ギャップはＣ及びＡのみで補填される。プローブの外側末端の標識は先の実施例の場合同様、別々のハプテンのビオチン及びフルオレセンで行ない、また増幅生成物の検出も先の実施例の場合と同様に、Abbott IMx（登録商標）系において行なう。ラビットβ-グロビンmRNAでは上記以外にも、次の表IXに示した二つの潜在的非対称性ギャップLCR箇所が同定されていることが指摘される。これらの例では上方の鎖中にはギャップが存在しないことに留意されたい。当然ながら、先に検討したように、ギャップがより短い場合やギャップの補填に３種のヌクレオチドを用いる場合まで含むように探索範囲を拡張すれば、ゲノム中に更に幾つかの箇所が見出されると考えられる。実施例５ 11：4プローブ設計を用いてのHIV RNAの検出次のプローブを実施例１に述べたように合成した。示したプローブ末端部は当業者に公知のハプテンーホスホラミジトを用いて、記号“crb”（カルバゾール誘導体を意味する）及び“adam”（アダマンタン誘導体を意味する）で示したリポーターハプテンで標識した（先の“検出”の章参照）。これらのプローブはHIV-1のGAG領域の1773〜1826位に特異的であり、HIV SF2CG GenBankのリリース71、アクセス番号KO2007から選択した。HIV標的RNAは、HCVDNAの挿入の代わりにHIV DNAの挿入を用いて実施例１でのように調製し、かつEcoR Iで直線状とした約675塩基のRNA転写物とした。プローブは下記のように標的（配列番号33）上に、補填にＡ、Ｔ及びＣしか必要でないように並び合う。下線を付したヌクレオチドで下方の配列中のものは、二次構造を軽減するべく意図的に導入した不適正なヌクレオチドであり、上方の配列中のものは終結塩基である。 HIV標的は５ng/μlのE. coli 16s23sリボソームRNAで稀釈し、また稀釈剤のE. coli 16s23sリボソームRNAのみのものを負性対照として用いた。 HIV RNAの検出は段階的に行なった。第一のステップでは、dATP、dCTP及びdTT Pのみを用意して標的及びプローブ１からcDNAを合成し、長さを11塩基に制限した伸長部を生じさせた。このことはプローブ２に対する付着端をもたらす。cDNAは次の混合物中で、99℃で１秒間、62℃で15分間、及び４℃で２分間のインキュベーション条件下に調製した。第二のステップでは、伸長させたプローブ１を鋳型RNAから分離してその付着端をプローブ２とハイブリダイズすること、及び伸長させたプローブ１にプローブ４を、プローブ２を鋳型として用いて連結することにより完全長DNA生成物を調製した。実際のところ第二のステップと同時に実施する第三のステップでは、ヨーロッパ特許出願公開第439 182号に開示されたギャップLCR（GLCR）を行なった。この方法は、第一のステップで生成させた付着端を具えたプローブ１を利用する。伸長させたプローブ１には今やプローブ２と３との両方をハイブリダイズし得る。プローブ２も dATP、dCTP及びdTTPのみの存在下に伸長させてプローブ３に連結し、それによって後のGLCR増幅サイクルのための第一の標的DNA鎖を調製する。同様に、後のサイクルにおいてプローブ４と伸長させたプローブ１とを、プローブ２とのハイブリッド形成下に連結して増幅のための第二の標的DNA鎖を調製し得る。上記の反応混合物20μlに、次の混合物を180μl添加した。200μlの反応混合物に、97℃で１秒間、55℃で１秒間、及び62℃で50秒間のインキュベーションサイクルを40回実施した。増幅後、ハプテンで二重に標識したLCR増幅生成物を、Abbott IMx（登録商標）系上で行なうサンドイッチイムノアッセイを介して３回検出し、次のような結果を得た。この結果は、HIV標的RNAの検出感度が分子10³個以上であり、10²個以上の場合もあり得ることを示している。実施例６ 9：3プローブ設計を用いてのHIV RNAの検出次のプローブを実施例１に述べたように合成した。示したプローブ末端部は実施例５でのようにハプテン−ホスホラミジトを用いて、記号“crb”（カルバゾール誘導体を意味する）及び“adam”（アダマンタン誘導体を意味する）で示したリポーターハプテンで標識した。これらのプローブはHIV-1のNEF領域の8905〜8956位に特異的であり、HIV SF2C G GenBankのリリース71、アクセス番号K02007から選択した。HIV標的は、HIVに感染したH9IIIB細胞に由来するCsC1精製全細胞RNAとした。プローブは下記のように標的（配列番号34）上に、補填にＧ、Ｔ及びＣしか必要でないように並び合う。下線を付したヌクレオチドで下方の配列中のものは、二次構造を軽減するべく意図的に導入した不適正なヌクレオチドであり、上方の配列中のものは終結塩基である。 HIV標的は５ng/μlのE. coli 16s23sリボソームRNAで稀釈し、また稀釈剤のE. coli 16s23sリボソームRNAのみのものを負性対照として用いた。 HIV RNAの検出は実施例５に述べたようにして段階的に行ない、ただしその際伸長ステップのためのdATPはdGTPに代え、また第二のプローブに対する付着端として得られる伸長部の長さは９塩基に制限した。増幅後、ハプテンで二重に標識したLCR増幅生成物を、Abbott IMx（登録商標）系上で行なうサンドイッチイムノアッセイを介して多数回検出し、次のような結果を得た。この結果は、標的RNAの検出感度が分子約10³個であることを示している。実施例７ 10：5プローブ設計を用いてのHIV RNAの検出次のプローブを実施例１に述べたように合成した。示したプローブ末端部は実施例５でのようにハプテン−ホスホラミジトを用いて、記号“crb”（カルバゾール誘導体を意味する）及び“adam”（アダマンタン誘導体を意味する）で示したリポーターハプテンで標識した。これらのプローブはHI-1のpol領域の3549〜3603位に特異的であり、HIV SF2CG GenBankのリリース71、アクセス番号K02007から選択した。HIV標的RNAは実施例６に述べたCsCl精製全細胞RNA調製物とした。プローブは下記のように標的（配列番号35）上に、補填にdATP、dGTP及びdTTPしか必要でないように並び合う。下線を付したヌクレオチドは終結塩基である。伸長段階及び増幅段階を実施例５に述べたように実施し、ただしその際各プローブは１反応当たり１×10¹²個ずつ用い、また補填には（10μMの）dATP、dTTP 及びdGTPを用いた。増幅後、ハプテンで二重に標識したLCR増幅生成物を、Abbot t IMx（登録商標）系上で行なうサンドイッチイムノアッセイを介して多数回検出し、次のような結果を得た。実施例８ 11：2プローブ設計を用いてのＣ型肝炎ウイルス（HCV）の検出次のプローブを実施例１に述べたように合成した。示したプローブ末端部はそれぞれ、市販（Clontech，Palo Alto，CA）のビオチン及びフルオレセンホスホラミジト試薬を用いてビオチン（bio）及びフルオレセン（fl）で標識した。これらのプローブは、GenBankのリリース71、アクセス番号M58335に見出されるHPCHUMR配列の246〜302位に位置する5′UTRに特異的である。HCV標的RNAは実施例１で用いたものとした。プローブは下記のように標的（配列番号36）上に、補填にＡ、Ｃ及びＧしか必要でないように並び合う。終結塩基に下線を付す。 HCV標的は２ng／μlのE. coli 16s23sリボソームRNAで稀釈し、また稀釈剤のE . coli 16s23sリボソームRNAのみのものを負性対照として用いた。 HCV RNAの検出は段階的に行なった。第一のステップでは、dATP、dCTP及びdGT Pのみを用意して標的RNA及びプローブ１からcDNAを合成し、長さを11塩基に制限した伸長部を生じさせた。このことはプローブ２に対する付着端をもたらす。cD NAは次の混合物中で、99℃で１秒間、62℃で15分間、及び４℃で２分間のインキュベーション条件下に調製した。第二のステップでは、伸長させたプローブ１を鋳型RNAから分離してその付着端をプローブ２とハイブリダイズすること、及び伸長させたプローブ１にプローブ４を、プローブ２を鋳型として用いて連結することにより完全長DNA生成物を調製した。実際のところ第二のステップと同時に実施する第三のステップでは、ヨーロッパ特許出願公開第439 182号に開示されたギャップLCR（GLCR）を行なった。この方法は、第一のステップで生成させた付着端を具えたプローブ１を利用する。伸長させたプローブ１には今やプローブ２と３との両方をハイブリダイズし得る。プローブ２もdATP、dCTP及びdTTPのみの存在下に伸長させてプローブ３に連結し、それによって後のGLCR増幅サイクルのための第一の標的DNA鎖を調製する。同様に、後のサイクルにおいてプローブ４と伸長させたプローブ１とを、プローブ２とのハイブリッド形成下に連結して増幅のための第二の標的DNA鎖を調製し得る。次の反応混合物に、97℃で１秒間、55℃で１秒間、及び62℃で50秒間のインキュベーションサイクルを40回実施した。上記の反応混合物20μlに、次の混合物を180μl添加した。200μlの反応混合物に、97℃で１秒間、55℃で１秒間、及び62℃で50秒間のインキュベーションサイクルを40回実施した。増幅後、ハプテンで二重に標識したLCR増幅生成物を、Abbott IMx（登録商標）系上で行なうサンドイッチイムノアッセイを介して３回検出し、次のような結果を得た。この結果は、HCV標的RNAの検出感度が分子約10²個であることを示している。これまでの実施例は本発明を解説するためのもので、限定するためのものではない。本発明は、添付した請求の範囲によって規定される。付表Ｂ【配列表】配列番号：１配列の長さ：23 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 CCAGGCATTG AGCGGGTTGA TCC 配列番号：２配列の長さ：28 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 AATTGCCACG ACGACCGGGT CCTTTCTT 配列番号：３配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 TCAACCCGCT CAATGCCTGG 配列番号：４配列の長さ：19 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 CCCGGTCGTC GTGGCAATT 配列番号：５配列の長さ：24 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 ACCGTTTCTG CGTGAAGACA GTAG 配列番号：６配列の長さ：27 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 CACCATAGAT CACTCCCCTG TGAGGAA 配列番号：７配列の長さ：22 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 ACTGTCTTCA CGCAGAAACG GT 配列番号：８配列の長さ：21 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 ACAGGGGAGT GATCTATGGT G 配列番号：９配列の長さ：22 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 ACCAGCAGCC TGCCCAGGGC CT 配列番号：10 配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 GCAAGGTGAA TGTGGAAGAA GTTGGTGGTG 配列番号：11 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 GGCCCTGGGC AGGCTGCTGG 配列番号：12 配列の長さ：21 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 TTCTTCCACA TTCACCTTGC C 配列番号：13 配列の長さ：24 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 CTAGTGTAGC TGCTGGTCCC AATG 配列番号：14 配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 CGAACCCAGA TTGTAAGACT ATTTTAAAAG 配列番号：15 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 GGGACCAGCA GCTACACTAG 配列番号：16 配列の長さ：19 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖卜ポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 GTCTTACAAT CTGGGTTCG 配列番号：17 配列の長さ：24 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 GTATTGCTAC TTGTGATTGC TCCA 配列番号：18 配列の長さ：28 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 GAGCAGTATC TGGAGACCTG GAAAAACA 配列番号：19 配列の長さ：21 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 AGCAATCACA AGTAGCAATA C 配列番号：20 配列の長さ：19 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 AGGTCTCCAG ATACTGCTC 配列番号：21 配列の長さ：25 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 AGATTTTTAA ATGGCTCTTG ATAAA 配列番号：22 配列の長さ：29 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 GCAGGGGCAA GGCCAATGGA CATATCAAA 配列番号：23 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 CAAGAGCCAT TTAAAAATCT 配列番号：24 配列の長さ：19 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 CCATTGGCCT TGCCCCTGC 配列番号：25 配列の長さ：23 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 TCGCAAGCAC CCTATCAGGC AGT 配列番号：26 配列の長さ：33 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 CGAGTAGTGT TGGGTTGCGA AAGGCCTTGT GGT 配列番号：27 配列の長さ：22 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 TGCCTGATAG GGTGCTTGCG AG 配列番号：28 配列の長さ：23 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 TTTCGCAACC CAACACTACT CGG 配列番号：29 配列の長さ：53 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：RNA 配列 GGAAUUGCCA GGACGACCGG GUCCUUUCUU GGAUCAACCC GCUCAAUGCC UGG 配列番号：30 配列の長さ：51 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 AATTGCCACG ACGACCGGGT CCTTTCTTGG ATCAACCCGC TCAATGCCTG G 配列番号：31 配列の長さ：51 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 CACCATAGAT CACTCCCCTG TGAGGAACTA CTGTCTTCAC GCAGAAACGG T 配列番号：32 配列の長さ：53 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：RNA 配列 GGCAAGGUGA AUGUGGAAGA AGUUGGUGGU GAGGCCCUGG GCAGGCUGCU GGU 配列番号：33 配列の長さ：54 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：RNA 配列 CGAACCCAGA UUGUAAGACU AUUUUAAAAG CAUUGGGACC AGCAGCUACA CUAG 配列番号：34 配列の長さ：52 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：RNA 配列 GAGCAGUAUC UGGAGACCUG GAAAAACAUG GAGCAAUCAC AAGUAGCAAU AC 配列番号：35 配列の長さ：54 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：RNA 配列 GCAGGGGCAA GGCCAAUGGA CAUAUCAAAU UUAUCAAGAG CCAUUUAAAA AUCU 配列番号：36 配列の長さ：57 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：RNA 配列 CGAGUAGUGU UGGGUUGCGA AAGGCCUUGU GGUACUGCCU GAUAGGGUGC UUGCGAG

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９３年１２月３日【補正内容】請求の範囲１．生物学的試料中に存在する既知の標的RNA配列を増幅する方法であって、（ａ）試料中のRNAをハイブリッド形成条件下に第一のオリゴヌクレオチドプローブで処理し、この第一のプローブは特定のハイブリッド形成条件下に既知の標的RNAの第一の断片にハイブリダイズ可能であり、（ｂ）前記第一のプローブの3′末端を標的RNAの逆転写によって伸長させ、それによって5′末端部に前記第一のプローブを有し、伸長した3′末端部にはハイブリッド形成条件下に標的RNAの第二の断片と相補的であるヌクレオチド配列を有するcDNA断片を調製し、その際前記逆転写は約30個以下のヌクレオチドの付加に制限し、（ｃ）伸長させた第一のプローブを標的RNAから解離させ、（ｄ）伸長させた第一のプローブに第二のオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズし、この第二のプローブの3′末端部は第一のプローブの伸長したcDNA 断片に、特定のハイブリッド形成条件下にハイブリダイズ可能であるが、第一のプローブを伸長させなかった場合は実質的に第一のプローブにハイブリダイズできず、（ｅ）（ｉ）第二のプローブの3′末端に第三のオリゴヌクレオチドプローブを共有結合で連結することによって、ただし第二または第三のプローブを修飾してある場合は前記連結前に当該プローブを修正して、第二のプローブの延長複合体を形成すること、及び（ii）第一のプローブの3′末端に共有結合し、第二のプローブと相補的な第四のオリゴヌクレオチド断片を調製することによって第一のプローブの延長複合体を形成することの少なくとも一方を行ない、（ｆ）第二のプローブの延長複合体及び第一のプローブの延長複合体の少なくとも一方を増幅することを含む方法。２．第一のプローブの延長複合体を、伸長させた第一のプローブの3′末端にヌクレオチド三リン酸を重合させることによって形成することを特徴とする請求項１に記載の方法。３．第一のプローブの延長複合体を、伸長させた第一のプローブの3′末端に第四のオリゴヌクレオチドプローブを共有結合で連結することによって形成することを特徴とする請求項１に記載の方法。４．第一のプローブをその3′末端部へのヌクレオチド三リン酸の重合によって伸長させ、第一のプローブの延長複合体を、伸長させた第一のプローブの3′末端に第四のオリゴヌクレオチドプローブの5′末端を共有結合で連結することによって形成することを特徴とする請求項３に記載の方法。（ｉ）第二または第三のプローブを修飾してある場合は当該プローブを修正してから第二のプローブの3′末端に共有結合で連結するという条件で、第一のプローブの少なくとも一部と相補的な第三のオリゴヌクレオチドプローブから成る延長複合体、及び（ii）第一のプローブの3′末端に共有結合させた、第二のプローブの少なくとも一部と相補的な延長オリゴヌクレオチド複合体の両方を形成する反復サイクルを少なくとも一つ含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。 16．増幅ステップで用いる第一、第二及び第三のオリゴヌクレオチドプローブを、ステップ(e)で延長プローブ複合体の形成に用いるものと同じにすることを特徴とする請求項15に記載の方法。 17．前記第四のオリゴヌクレオチド断片を、連結前に伸長させてあることを条件とする第一のプローブの3′末端に第四のオリゴヌクレオチドプローブを共有結合で連結することによって調製し、それによって増幅ステップをLCRのバリエーションとすることを特徴とする請求項15に記載の方法。 18．延長オリゴヌクレオチド複合体を第一のプローブの伸長のみによって形成し、それによって増幅ステップを、延長によって一方の延長複合体を得、重合伸長によって他方の延長複合体を得るハイブリッド増幅反応とすることを特徴とする請求項15に記載の方法。 19．生物学的試料中に存在する既知の標的RNA配列を増幅する方法であって、（ａ）試料中のRNAを特定のハイブリッド形成条件下に第一のオリゴヌクレオチドプローブで処理し、この第一のプローブは前記ハイブリッド形成条件下に既知の標的RNAの第一の断片にハイブリダイズ可能であり、（ｂ）前記プローブの3′末端を標的RNAの逆転写によって伸長させ、それによって5′末端部に前記第一のプローブを有し、伸長した3′末端部には標的RNAの第二の断片と相補的なヌクレオチド配列を有するcDNA断片を調製し、その際第一のプローブのcDNA伸長部を標的RNAの選択した断片と相補的な、全４種のヌクレオシド三リン酸のうちの３種以下の組み合わせとすることにより該伸長部の長さを所定長に制限し、（ｃ）伸長させた第一のプローブを標的RNAから解離させ、（ｄ）伸長させた第一のプローブに第二のオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズし、この第二のプローブの3′末端部は第一のプローブの伸長したcDNA 断片にハイブリッド形成条件下にハイブリダイズ可能であるが、第一のプロ一ブを伸長させなかった場合は実質的に第一のプローブにハイブリダイズできず、（ｅ）第一のプローブと相補的な第三のオリゴヌクレオチドプローブを第二のプローブの3′末端に連結し、ただし連結前に第二のプローブを伸長させた場合は伸長させた第二のプローブの3′末端に第三のプローブを連結し、それによって第二のプローブの伸長複合体を形成し、（ｆ）第二のプローブと相補的な第四のオリゴヌクレオチドプローブを第一のプローブの3′末端に連結し、ただし連結前に第一のプローブを伸長させた場合は伸長させた第一のプローブの3′末端に第四のプローブを連結し、それによって第一のプローブの伸長複合体を形成し、（ｇ）第二のプローブの伸長複合体及び第一のプローブの伸長複合体の少なくとも一方を、反応体として第一、第二、第三及び第四のプローブを用いるリガーゼ連鎖反応によって増幅し、ただし反応体プローブを修飾してある場合は連結前に修正することを含む方法。 20．試料中に存在する既知の標的RNA配列から所定長のcDNAを調製する方法であって、（ａ）RNAを特定のハイブリッド形成条件下に、該ハイブリッド形成条件下に標的RNAの第一の断片にハイブリダイズ可能な第一のオリゴヌクレオチドプローブで処理するステップ、及び（ｂ）前記プローブの3′末端を、全４種のヌクレオシド三リン酸のうちの３種以下しか含まない条件下でのRNAの逆転写によって伸長させ、それによって所定長のcDNA断片を得、その際前記伸長は鋳型RNAが存在しないヌクレオシド三リン酸を要求する所定長実現時点に終了するステップを含む方法。 21．伸長させた第一のcDNAプローブを標的RNAから解離させること、及びこのcDN Aプローブを検出することも含むことを特徴とする請求項20に記載の方法。 22．前記cDNAを検出前に増幅することも含むことを特徴とする請求項21に記載の方法。 23．生物学的試料中に存在する標的核酸を検出する診断キットであって、（ａ）標的の一部と相補的な第一のオリゴヌクレオチドプローブと、（ｂ）第一のプローブの3′位に位置する標的領域と相補的なヌクレオシド三リン酸を供給し、第一のプローブをプライマーとして用いて標的RNAを逆転写し、及び／または第一のプローブを標的DNA上で伸長させる伸長試薬と、（ｃ）第一のオリゴヌクレオチドプローブを逆転写によって伸長させた場合にのみ、この第一のプローブにハイブリッド形成条件下に実質的にハイブリダイズ可能な第二のオリゴヌクレオチドプローブと、（ｄ）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者サスタチエク，ジヨアン・シーアメリカ合衆国、ウイスコンシン・53126、フランクスビル、ハイウエイ・エイチ・ 3525、アパートメント・６

Claims

【特許請求の範囲】１．生物学的試料中に存在する既知の標的RNA配列を増幅する方法であって、（ａ）試料中のRNAをハイブリッド形成条件下に第一のオリゴヌクレオチドプローブで処理し、この第一のプローブは前記ハイブリッド形成条件下に既知の標的RNAの第一の断片にハイブリダイズ可能であり、（ｂ）前記第一のプローブの3′末端を標的RNAの逆転写によって伸長させ、それによって5′末端部に前記第一のプローブを有し、伸長した3′末端部にはハイブリッド形成条件下に標的RNAの第二の断片と相補的であるヌクレオチド配列を有するｃDNA断片を調製し、その際前記逆転写は約30個以下のヌクレオチドの付加に制限し、（ｃ）伸長させた第一のプローブを標的RNAから解離させ、（ｄ）伸長させた第一のプローブに第二のオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズし、この第二のプローブの3′末端部は第一のプローブの伸長したcDN A断片にハイブリダイズ可能であるが、第一のプローブを伸長させなかった場合は実質的に第一のプローブにハイブリダイズできず、（ｅ）（ｉ）第二のプローブの3′末端に第三のオリゴヌクレオチドプローブを共有結合で連結することによって、ただし第二または第三のプローブを修飾してある場合は前記連結前に当該プローブを修正して、第二のプローブの延長複合体を形成すること、及び（ii）第一のプローブの3′末端に共有結合し、第二のプローブと相補的な第四のオリゴヌクレオチド断片を調製することによって第一のプローブの延長複合体を形成することの少なくとも一方を行ない、（ｆ）第二のプローブの延長複合体及び第一のプローブの延長複合体の少なくとも一方を増幅することを含む方法。２．第一のプローブの延長複合体を、伸長させた第一のプローブの3′末端にヌクレオチド三リン酸を重合させることによって形成することを特徴とする請求項１に記載の方法。３．第一のプローブの延長複合体を、伸長させた第一のプローブの3′末端に第四のオリゴヌクレオチドプローブを共有結合で連結することによって形成することを特徴とする請求項１に記載の方法。４．第一のプローブをその3′末端部へのヌクレオチド三リン酸の重合によって伸長させ、第一のプローブの延長複合体を、伸長させた第一のプローブの3′末端に第四のオリゴヌクレオチドプローブの5′末端を共有結合で連結することによって形成することを特徴とする請求項3に記載の方法。５．第一のプローブを約５〜約15個のヌクレオチドの重合によって伸長させることを特徴とする請求項４に記載の方法。６．第二のプローブの延長複合体を、第二のプローブの3′末端に直接第三のオリゴヌクレオチドプローブの5′末端部を共有結合で連結することによって形成することを特徴とする請求項１に記載の方法。７．第二のプローブを、該プローブの3′末端部にヌクレオチド三リン酸を付加する重合伸長によって修正し、第二のプローブの延長複合体を、伸長させた第二のプローブの3′末端に第三のオリゴヌクレオチドプローブの5′末端を共有結合で連結することによって形成することを特徴とする請求項１に記載の方法。８．第二のプローブを１〜５個のヌクレオチドの重合によって伸長させることを特徴とする請求項7に記載の方法。９．第二のプローブをその3′末端部に存在するブロッキング部分の開裂によって修正し、第二のプローブの延長複合体を、修正した第二のプローブの3′末端に第三のオリゴヌクレオチドプローブの5′末端を共有結合で連結することによって形成することを特徴とする請求項１に記載の方法。 10．逆転写が逆転写酵素もしくはDNAポリメラーゼの使用を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。 11．第一のプローブのcDNA伸長部を標的RNAの選択した断片と相補的な、全4種のヌクレオシド三リン酸のうちの３種以下の組み合わせとすることにより該伸長部の長さを所定長に制限することを特徴とする請求項1に記載の方法。 12．cDNA伸長部の長さを、該伸長部が標的RNAと相補的な塩基を十分な数で含み、その結果第二のプローブと第一のプローブとが反応条件下に安定なハイブリッド複合体を構成するように決定することを特徴とする請求項11に記載の方法。 13．第一のプローブからのcDNA伸長部の長さが約５〜約15塩基であることを特徴とする請求項11に記載の方法。 14．標的RNA配列をゲノムRNA、mRNA、tRNA、rRNA、核RNA、細胞質RNA、全RNA及びウイルスRNA並びにこれらの任意の組み合わせの中から選択することを特徴とする請求項１に記載の方法。 15．増幅ステップが（ｉ）第二または第三のプローブを修飾してある場合は当該プローブを修正してから第二のプローブの3′末端に共有結合で連結するという条件で、第一のプローブの少なくとも一部と相補的な第三のオリゴヌクレオチドプローブから成る延長複合体、及び（ii）第一のプローブの3′末端に共有結合させた、第二のプローブの少なくとも一部と相補的な延長オリゴヌクレオチド複合体の両方を形成する反復サイクルを少なくとも一つ含むことを特徴とする請求項1 に記載の方法。 16．増幅ステップで用いる第一、第二及び第三のオリゴヌクレオチドプローブを、ステップ(e)で延長プローブ複合体の形成に用いるものと同じにすることを特徴とする請求項15に記載の方法。 17．前記第四のオリゴヌクレオチド断片を、連結前に伸長させてあることを条件とする第一のプローブの3′末端に第四のオリゴヌクレオチドプローブを共有結合で連結することによって調製し、それによって増幅ステップをLCRのバリエーションとすることを特徴とする請求項15に記載の方法。 18. 延長オリゴヌクレオチド複合体を第一のプローブの伸長のみによって形成し、それによって増幅ステップを、延長によって一方の延長複合体を得、重合伸長によって他方の延長複合体を得るハイブリッド増幅反応とすることを特徴とする請求項15に記載の方法。 19．生物学的試料中に存在する既知の標的RNA配列を増幅する方法であって、（ａ）試料中のRNAをハイブリッド形成条件下に第一のオリゴヌクレオチドプローブで処理し、この第一のプローブは前記ハイブリッド形成条件下に既知の標的RNAの第一の断片にハイブリダイズ可能であり、（ｂ）前記プローブの3′末端を標的RNAの逆転写によって伸長させ、それによって5′末端部に前記第一のプローブを有し、伸長した3′末端部には標的RNAの第二の断片と相補的なヌクレオチド配列を有するcDNA断片を調製し、その際第一のプローブのcDNA伸長部を標的RNAの選択した断片と相補的な、全４種のヌクレオシド三リン酸のうちの３種以下の組み合わせとすることにより該伸長部の長さを所定長に制限し、（ｃ）伸長させた第一のプローブを標的RNAから解離させ、（ｄ）伸長させた第一のプローブに第二のオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズし、この第二のプローブの3′末端部は第一のプローブの伸長したcDN A断片にハイブリッド形成条件下にハイブリダイズ可能であるが、第一のプローブを伸長させなかった場合は実質的に第一のプローブにハイブリダイズできず、（ｅ）第一のプローブと相補的な第三のオリゴヌクレオチドプローブを第二のプローブの3′末端に連結し、ただし連結前に第二のプローブを伸長させた場合は伸長させた第二のプローブの3′末端に第三のプローブを連結し、それによって第二のプローブの伸長複合体を形成し、（ｆ）第二のプローブと相補的な第四のオリゴヌクレオチドプローブを第一のプローブの3′末端に連結し、ただし連結前に第一のプローブを伸長させた場合は伸長させた第一のプローブの3′末端に第四のプローブを連結し、それによって第一のプローブの伸長複合体を形成し、（ｇ）第二のプローブの伸長複合体及び第一のプローブの伸長複合体の少なくとも一方を、反応体として第一、第二、第三及び第四のプローブを用いるリガーゼ連鎖反応によって増幅し、ただし反応体プローブを修飾してある場合は連結前に修正することを含む方法。 20．試料中に存在する既知の標的RNA配列から所定長のcDNAを調製する方法であって、（ａ） RNAをハイブリッド形成条件下に、該ハイブリッド形成条件下に標的RNA の第一の断片にハイブリダイズ可能な第一のオリゴヌクレオチドプローブで処理するステップ、及び（ｂ）前記プローブの3′末端を、全４種のヌクレオシド三リン酸のうちの３種以下しか含まない条件下でのRNAの逆転写によって伸長させ、それによって所定長のcDNA断片を得、その際前記伸長は鋳型RNAが存在しないヌクレオシド三リン酸を要求する所定長実現時点に終了するステップを含む方法。 21．伸長させた第一のcDNAプローブを標的RNAから解離させること、及びこのcDN Aプローブを検出することも含むことを特徴とする請求項20に記載の方法。 22．前記cDNAを検出前に増幅することも含むことを特徴とする請求項21に記載の方法。 23．生物学的試料中に存在する標的核酸を検出する診断キットであって、（ａ）標的の一部と相補的な第一のオリゴヌクレオチドプローブと、（ｂ）第一のプローブの3′位に位置する標的領域と相補的なヌクレオシド三リン酸を供給し、第一のプローブをプライマーとして用いて標的RNAを逆転写し、及び／または第一のプローブを標的DNA上で伸長させる伸長試薬と、（ｃ）第一のオリゴヌクレオチドプローブを逆転写によって伸長させた場合にのみ、第一のプローブにハイブリッド形成条件下に実質的にハイブリダイズ可能な第二のオリゴヌクレオチドプローブと、（ｄ）（ｉ）第二のプローブの3′末端に連結可能でかつ第一のプローブの一部と相補的である5′末端を有する、第一のプローブの一部と相補的な第三のオリゴヌクレオチドプローブで、第二または第三のプローブを連結前に修正した場合は修正後の形態で第二のプローブを第三のプローブに連結し、それによって第二のプローブの延長複合体を形成することができる第三のオリゴヌクレオチドプローブ、及び（ii）第二のプローブの一部と相補的な第四のオリゴヌクレオチドプローブで、第一のプローブを伸長させた場合に第一のプローブの3′末端に共有結合で連結し、それによって第一のプローブの延長複合体を形成することができる第四のオリゴヌクレオチドプローブの少なくとも一方と、（ｅ）第二のプローブの延長複合体、第一のプローブの延長複合体、またはこれらの複合体の両方の形成に用いるアセンブリング試薬とを組み合わせて含むキット。 24．伸長試薬が逆転写酵素もしくはDNAはポリメラーゼを含むことを特徴とする請求項23に記載のキット。 25．アセンブリング試薬がリガーゼ、及び場合によってはDNAポリメラーゼを含むことを特徴とする請求項23に記載のキット。 26．ステップ(d)において第三のオリゴヌクレオチドプローブを含むことを特徴とする請求項23に記載のキット。 27．ステップ(d)において第四のオリゴヌクレオチドプローブを含むことを特徴とする請求項23に記載のキット。 28．ステップ(d)において第四のオリゴヌクレオチドプローブも含むことを特徴とする請求項26に記載のキット。 29．HCVの検出に用いられ、第一のプローブは約15〜約30ヌクレオチドの長さを有し、かつオリゴヌクレオチド 5′−CCAGGCATTGAGCGGGTTGATCC−3′（配列番号１）と少なくとも80％相同であり、第二のプローブは約15〜約40ヌクレオチドの長さを有し、かつオリゴヌクレオチド 5′−AATTGCCACGACGACCGGGTCCTTTCTT−3′（配列番号２）と少なくとも80％相同であることを特徴とする請求項23に記載のキット。 30．HCVの検出に用いられ、第一のプローブは約15〜約30ヌクレオチドの長さを有し、かつオリゴヌクレオチド 5′ACCGTTTCTGCGTGAAGACAGTAG−3′（配列番号５）と少なくとも80％相同であり、第二のプローブは約15〜約40ヌクレオチドの長さを有し、かつオリゴヌクレオチド 5′−CACCATAGATCACTCCCCTGTGAGGAA−3′（配列番号６）と少なくとも80％相同であることを特徴とする請求項23に記載のキット。 31．HCVの検出に用いられ、第一のプローブは約15〜約30ヌクレオチドの長さを有し、かつオリゴヌクレオチド 5′−TCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT−3′（配列番号25）と少なくとも80％相同であり、第二のプローブは約15〜約40ヌクレオチドの長さを有し、かつオリゴヌクレオチド 5′−CGAGTAGTGTTGGGTTGCGAAAGGCCTTGTGGT−3′（配列番号26）と少なくとも80％相同であることを特徴とする請求項23に記載のキット。 32．HIVの検出に用いられ、第一のプローブは約15〜約30ヌクレオチドの長さを有し、かつオリゴヌクレオチド 5′−CTAGTGTAGCTGCTGGTCCCAATG−3′（配列番号13）と少なくとも80％相同であり、第二のプローブは約15〜約40ヌクレオチドの長さを有し、かつオリゴヌクレオチド 5′−CGAACCCAGATTGTAAGACTATTTTAAAAG−3′（配列番号14）と少なくとも80％相同であることを特徴とする請求項23に記載のキット。 33．HIVの検出に用いられ、第一のプローブは約15〜約30ヌクレオチドの長さを有し、かつオリゴヌクレオチド 5′−GTATTGCTACTTGTGATTGCTCCA−3′（配列番号17）と少なくとも80％相同であり、第二のプローブは約15〜約40ヌクレオチドの長さを有し、かつオリゴヌクレオチド 5′−GAGCAGTATCTGGAGACCTGGAAAAACA−3′（配列番号18）と少なくとも80％相同であることを特徴とする請求項23に記載のキット。 34．HIVの検出に用いられ、第一のプローブは約15〜約30ヌクレオチドの長さを有し、かつオリゴヌクレオチド 5′−AGATTTTTAAATGGCTCTTGATAAA−3′（配列番号21）と少なくとも80％相同であり、第二のプローブは約15〜約40ヌクレオチドの長さを有し、かつオリゴヌクレオチド 5′−GCAGGGGCAAGGCCAATGGACATATCAAA−3′（配列番号22）と少なくとも80％相同であることを特徴とする請求項23に記載のキット。