JPH07504897A

JPH07504897A - ネコ感染性腹膜炎ワクチンおよび調製方法

Info

Publication number: JPH07504897A
Application number: JP5514305A
Authority: JP
Inventors: オルセン，リチャード・ジー
Original assignee: パーヘリオン　コーポレーション
Priority date: 1992-02-18
Filing date: 1993-02-18
Publication date: 1995-06-01
Also published as: EP0627936A4; CA2128698A1; EP0627936A1; US5460815A; WO1993015762A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ネコ感染性腹膜炎（Ｆｅｌｉｎｅ　１ｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｐｅｒｉｔｏｎｉｔｉｓ　、　Ｆ　Ｉ　Ｐ）は、飼われている、および野生のネコ科動物に不意に発生する散発性の疾患である。ＦＩＰは、主として飼われているネコの疾患であるが、ライオン、ピューマ、ヒョウ、チーターおよびジャガーにおいて診断例がある。ＦＩＰに罹ったことのある小型の野生のネコには、オオヤマネコおよびカラカル、サンドキャット（ｓａｎｄ　ｃａｔ）並びにバラスキャット（ｐａｌｌａｓ　ｃａｔ）が含まれる。飼われているネコでは、この疾患は主として若い動物に発生するが、全ての年齢のネコが罹患性である。発病率のピークは６〜１２月齢に生ずる。５〜１３年齢に発病率の低下が認められ、その後にネコでは１４〜１５年齢て発病率は増加する。有意な性別による傾向はない。

ＦＩＰは純粋種のネコにおいてより頻繁に発生するが、これは恐らくこれらのネコは、より普通にネコの飼育所または多数のネコの家族集団の中で飼育されるためである。この疾患は世界中に分布している。

ＦＴＰは、ある種のコロナウィルスにより引起こされる。コロナウィルスは、多形性でエンベロープを有する粒子であり、平均して直径は＋００ｎｍで、−水路のＲＮＡを含む。ベブロマーと呼ばれる特徴的な花びら形の突起がウィルス表面から突出している。多くの動物の種において、コロナウィルスは比較的制限された器官親和性を有し、呼吸および／または胃腸系に感染する。経口感染の後、ウィルスは、十二指腸、空腸および回腸内の絨毛の成熟した尖端円柱上皮に対して親和性を存する。

ネコに感染するコロナウィルスは、ＦＩＰを引起こすもの（ＦＩＰＶｓ）と、無症状乃至重篤な腸炎を誘発するもの（ネコ腸炎コロナウィルス、またはＦＥＣＶｓ）とに分類されている。ＰＩＦ’Ｖｓは、胃腸管から逃れて別個の組織内の複製部位に拡散するその能力の点でＦＥＣＶｓとは異なる。ＦＩＰＶｓおよびＦＥＣＶｓは、単一のコロナウィルスの種類の病原性の変種を代表し得る。また、ＦＩＰＶｓは、ＦＥＣＶ株の変異体として周期的に発生し得る。

ＦＩＰＶ、ブタの伝達性胃腸炎ウィルス（ＴＧＥＶ）　、イヌのコロナウィルス（ＣＣＶ）　、および２２９Ｅ群のヒト呼吸管コロナウィルスは、コロナウィルス科の群内の密接に関連するウィルスの抗原性クラスターを含む。ＦＩＰＶ、ＴＧＥＶおよびＣＣｖの主要な構造ポリペプチドは抗原的に非常に類似しているため、これらの３つのウィルスは個々のウィルス種というより寧ろ、宿主範囲変異体として考えられる場合もある。

ネコ感染性腹膜炎という名称は、疾患の主たる形態、内蔵漿膜および網の炎症性の状況に言及したものである。報告されたＦＩＰの第２の形態は、腎臓、腸間膜リンパ節、肝臓、膵臓、中枢神経系（ＣＮＳ）およびを椎、並びに目のブドウ膜管のような実質組織器官の肉芽腫による関与を特徴とする。ＦＩＰの肉芽腫形態は、体腔内への炎症性の滲出がないため、「乾燥」または［非滲出性」と呼ばれている。事例の約４分の３の場合を占める古典的なＦＩＰは、「湿式」または「滲出性」と呼ばれている。ＦＩＰの第３の形態は、滲出性および非滲出性の変種の両者の特徴を組合せたものである。

滲出性ＦＴＰの臨床経過は、１〜６週間または場合によりそれ以上継続する。

疾患の発病は、慢性的で変動する発熱の出現によって先導される。発熱に伴って、通常は体重、活力および食欲の進行性の減退がある。最後にはネコはショックに至り、死亡する。滲出性ＦＩＰのネコの９０％以上に腹膜炎が見られ、事例の約４０９６に胸膜炎が見られる。目やＣＮＳのような他の器官の関与は、滲出性疾患のネコの１０９６のみに臨床的に明らかであるが、幾分高い割合のものが、これらおよび他の非漿膜部位における臨床的に隠れた病変を有し得る。

非滲出性Ｆ［’のネコは、通常は１−１２週またはそれ以上病気の状態である。

滲出性形態の場合と同様に、慢性的で変動する発熱が疾患に伴う。やはり一般的な体の状況および食欲の進行性の減退がある。ただしこれらの特徴に加えて、特定の器官系に帰し得る徴候がある。非滲出性ＦＩＰのネコの５０％に腹膜腔の病変か認められ、１０９６に胸膜腔の病変が認められる。非滲出性ＦＩＰは、視覚系またはＣＮＳが関与する高い発病率がある点て滲出性形態とは異なる。非滲出性ＦＴＰのネコの約３分のｌがＣＮＳに帰し得る徴候を示し、同程度の数か臨床的に明らかな視覚疾患を育する。

ＦＥＰＶが体に侵入する正確な経路は知られていない。ＦＩＰＶは熱に不安定なウィルスであり、室温で２４〜４８時間以内に不活性化される。自然界でＦＩＰのネコがＦＩＰＶの唯一の起源である可能性は低い。同様に、宿主外でのＦＩＰＶの安定性が短いとすると、汚染された媒介物が感染の起源である可能性も低い。大半の場合、ウィルスの伝達は恐らく糞を介して、更に一般性は低いが、無症候性のキャリヤの尿または目鼻の分泌物を介して起こる。疾患の散発性で無作為の発生を説明するために、キャリヤのネコはウィルスを間欠的または非常に低いレベルで放出するものとし得る。

ＦＩＰＶに無症候的に感染した雌ネコは、子宮内で、または新生児の期間にその子孫を感染させ得る。子宮内で感染した子ネコは病気で生れるか、または疾患の徴候を示さない場合もある。ただし、無症候性の感染した子ネコの中には、その免疫応答性が損なわれるに至った場合に、後になってＦＩＰが発現するものもあり得る。

ネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）との同時感染が、ＦＩＰＶに感染したネコで報告されている。ＦｅＬＶ感染がＦＩＰＶの発病率を強化する機構は特に知られていないが、文献に報告された制御された観察により、ＦｅＬＶ感染は確立され。

たＦＩＰＶ免疫性を何らかの方法で妨害するという推定が導かれている。この妨害の機構は、ネコを介入性または日和見性の感染に晒す、持続的なＦｅＬＶ感染に関連して説明された、幾つかの一般化された免疫抑制効果を伴うと推定されている。

経口または気管内注入によりＦＩＰＶに露呈された特定の病原体を含有しない（Ｓ　Ｐ　Ｆ）子ネコは、血清学的には幾つかの様式で反応する。幾つかの子ネコは長期間の露呈の後も感染の徴候を何ら発現せず、抗体陰性のままである。感染していても病気の徴候を発現しない子ネコは、プラトー状の抗体応答を示す一方、ＦＴＰを発現する子ネコは、進行性の抗体力価の上昇を示す。感染した子ネコの両者の群において、ウィルス中和抗体の存在は、免疫蛍光抗体（ＩＦＡ）力価と相関する傾向がある。しかしながら、場合により、感染したネコはウィルス中和抗体のみを発現することがあり、ＩＦＡ力価は無視してよいものとなろう。ＦｌＰＶと非ＦＴＰ誘発性コロナウィルス（ＦＥＣＶ）との間の抗原的な類似性、および自然界におけるＦＥＣＶ感染の遍在性のために、血清学的応答を説明するには困難が生ずる。自由にぶらつくネコの約２５％がＦＥＣＶに既に感染しているか感染したままであり、ネコの飼育所および多数のネコの家族集団において特に優勢な感染を保持している。ＦＥＣＶによる感染の結果、現在ではＦＩＰＶ、ＣＣＶまたはＴＧＥＶによる感染により誘発されるものと血清学的に区別し得ないコロナウィルス抗体が生産される。

ＦＥＣＶ感染の結果として形成される抗体は、ＦＩＰＶの毒性株による後の攻撃からネコを保護しない。実際、この抗体は後の攻撃に対してネコを感受性にするものであり、毒性のＦＩＰＶにより誘発される疾患過程を促進する。

ブタのＴＧＥＶによりネコを免疫化してＦＩＰに対する保護を与えようとする最初の試みは不成功であることが示されたが、ＦＩＰＶによる子ブタの免疫化は、ＴＧＥＶに対する抗体生産を惹起することが知られている。今日に至るまで、殺したＦＩＰＶによる免疫化も全く不成功であることが示されている。自己由来の殺したワクチンから誘導される免疫性は、毒性の生きたウィルスによる攻撃に対して殆ど常にネコをより罹患性にするものであり、結果として起こる疾患は、通常はより重篤で電撃的に発症する。域別させたＦＩＰＶによるワクチン処理も、市販されているこの種の製品がないことから証明されるように、不成功であることが示されている。これに関しては、ゲルバーら、「温度感受性ＦＩＰＶワクチンの鼻腔内接種によるネコ感染性腹膜炎に対する保護Ｊ　、Ｖａｃｃ　ｉｎｅ、第８巻、第５３６〜５４２頁（１９９０年１２月）、並びに米国特許第４．２９３゜６５３号、第４．３０３．６４４号および第４．５７１，３８６号が参照される。

ゲルバーらは、ノルデン・ラボラトリイズ（Ｎｏｒｄｅｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）のネコ腎臓（ＮＬＦＫ）細胞系統（ノルデン・ラボラトリイズ、リンコルン、ネブラスカＵＳＡ）による組織培養に適合した毒性株（ＤＦ２−ＦＩＰＶ）から誘導したネコ感染性腹膜炎ウィルスワクチンを開示した。このウィルスは、ＮＬＦＫ細胞上での９９継代の継代により域別された。最後の継代は、紫外線照射に露呈することにより温度感受性とされた。その後温度感受性ＦＩＰＶは、更に８継代ＮＬＦＫ細胞上で増殖され、凍結乾燥された。この方法は、持続的に感染した細胞系統を含むものではない。ＮＬＦＫ細胞は、それぞれの継代の後毎にウィルスにより感染されている。本発明は、生きた域別したウィルスでもなく、殺したウィルスワクチンでもない。これは、ＦＩＰＶにより持続的（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｌｙ）に感染させた培養細胞の上澄に存在する免疫原に基くものである。ネコ感染性腹膜炎ウィルスの増殖のための組織培養による種々の方法が報告されているが（米国特許第４゜１９５．１３０号、第４．２９３．６５３号および第４．３０３．６４４号）、持続的に感染した細胞系統を開示するものはない。

ＦＩＰのネコについての予後は、現在ではウィルス感染を停止させる有効な処置がないため貧弱である。幾つかの処置処方により、注意深く選択された患者において短い期間での軽減は可能である。緩和療法のための最良の患者は、ＦｅＬＶに感染しておらず、良好な身体的状況にあり、良好な食欲を維持し、かつ重篤な貧血または神経病の徴候を有さないようなＦＩＰのネコである。残念ながら、疾患の過程における十分な初期にこれらの評価基準に合致するものどして提示されるＦＩＰのネコは殆どおらず、大半の罹患したネコはｌ−１６週以内に死亡するに至る。

ＦＴＰに関する更なる情報源には、オルセンら、「ウィルス疾患の比較病原学ｊ第２巻、第１１５〜＋３６頁、ＣＲＣブレス社、ポカ・ラドン、フロリダ（＋９８５）およびこれに引用された参考文献、並びに「ノルデン・ニュース」、１９８９年秋、第１５〜１９頁、リンコルン、ネブラス力が含まれるが、これらの開示を明示的にここに援用するものとする。

発明の開示本発明の１つの目的は、ネコ感染性腹膜炎ウィルス（ＦＩＰＶ）により生ずる疾患の予防のためのワクチンを提供することにある。この種のワクチンは、ＦＩＰＶにより持続的に感染された、試験管内で生産した細胞から誘導されるＦＩＰウィルス前駆体免疫原を含む。本発明のワクチンを形成するウィルス免疫原の製造に好適なのは、クラントール（Ｃｒａｎｄａｌｌ）ネコ腎臓（ＣＲＦＫ）細胞系統である。

よって、この発明の第２の観点は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）　、ロックビル、メリーランドに１９９２年９月２３日に寄託し、受託番号ＣＲＬ１１１３７を与えられたＦＩＰ感染クラントールネコ腎臓細胞系統を含む。

この発明の第３の観点は、ＦＴＰウィルス前駆体免疫原の製造方法に関し、これは血清を含有する生育培地中でＦＩＰ持続的感染細胞を試験管内培養し、その後前記細胞から放出されるＦＩＰウィルス前駆体免疫原を蓄積するのに適切な条件下および時間の間、前記培養細胞を血清を含有しない培地に移して維持し、その後ウィルス前駆体免疫原を含有する上澄から細胞を分離することを含む。その後、少量で存在し得る全ゆる生きたウィルスを不活性化する薬剤を用いて、ＦＩＰウィルス前駆体免疫原を含有する上澄を処理し、薬学的に許容し得るアジュバントと配合してここに開示するＦＩＰワクチンの形成を図る。

図面の簡単な説明図１は、非還元および還元条件下におけるＦＩＰＶ免疫原のウェスタンプロットの写真である。

図２は、非還元および還元条件下におけるプロットしていないＦＩＰＶ免疫原の銀染色の写真である。

発明を実施するための最良の形態本発明のワクチンは、ＦＩＰＶに随伴する疾患に対してネコを有効に保護する。

更に、接種したネコは、この疾患のキャリヤとして作用しない。この保護は、ワクチンが生きたウィルスを含有しないことと併せて、発明のワクチンによりもたらされる高度に育意義な利益を強調するものである。このワクチンは生きたウィルスも死んだウィルスも必要とせず、寧ろウィルスに感染した細胞の産物（すなわちウィルス前駆体免疫原）であるため、非常に有効であるのみならず、その上に実質的にリスクのないものである。

発明のＦＩＰワクチンは、その効力を害することなく、他のネコの疾患に対して有効なワクチンと組合せることができる。本ワクチンと組合せることのできる他のワクチンには、例えば、ネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）、ネコ肉腫ウィルス（ＦｅＳＶ）、ネコ汎白血球減少症ウィルス（ＦＰＶ）、ネコカリチウイルス（ＦＣＶ）およびネコヘルペスウィルスＩ　（ＦＨＶ−１）（ネコのウィルス性鼻腔気管炎を引起こす）に対するワクチンが含まれる。

持続的に感染した細胞から誘導されるウィルス前駆体免疫原は、ＦＴＰに随伴する蛋白質または蛋白質前駆体（すなわち、会合していないウィルス蛋白質）である。ウィルス前駆体免疫原を補集する方法については、第１の工程で、ＦＩＰＶに持続的に感染し得るが、ＦＩＰＶが非細胞毒性である細胞系統の選択か必要である。更に、ウィルス前駆体免疫原を回収するために細胞系統を犠牲にしないことが望ましい。よって、選択する細胞系統は、ＦＩＰに持続的に感染し得るのみならず、ウィルス前駆体免疫原の回収に順応し、その後に生育および回収の後続する過程のために、方法についてリサイクルを行うことのできるものともすべきである。

ウシ胎児血清のような適切な量の動物血清を添加した従来の血清を含有しない生育培地を含む、培養のための血清を含有する生育培地に、感染した細胞を最初に入れる。適切な血清を含有しない培地には、マツコイの５８培地およびＲＰＭ１＋６４０培地（ギブコ、グランド・アイランド、Ｎ、　Ｙ、　）並びに同様の従来の培地か含まれる。この種の血清を含存しない培地に対し、適切な量の血清および抗生物質を従来の様式で添加する。時に応じて追加的な血清を必要に応じて添加し、好ましくは細胞が使用した培地の容量において飽和密度に達するまで、細胞を培養する。当業界で周知の従来の生育条件を維持する。

この方法の次の工程は、その後続する工程の際には血清を使用または添加しない以外は、培養工程で使用したのと望ましくは実質的に同一の組成の血清を含有しない培地に、培養した持続的感染細胞を移すことを含む。血清を含有しない培地に一旦細胞を入れたならば、これらは明らかに正常な生育サイクルを停止し、実質的に全てのウィルス生産が阻止される。血清を含有しない培地中で細胞が受ける厳しいストレスの結果、多量のウィルス前駆体免疫原（および恐ら（付加的な細胞物質）か、実質的な量で細胞から放出される。本発明のワクチンに必須なのは、殺したウィルスまたは域別させた生きたウィルスではな（、この材料である。

その後、ウィルス前駆体免疫原を含有する血清を含有しない培地を含む上澄は、例えば遠心分離を含む従来の分離技術によって、持続的感染細胞から分離する。

その後分離した細胞系統は、血清を含存する生育培地を用い、この方法の培養工程にリサイクルすることかできる。回収した感染細胞系統から分離したＦＩＰウィルス前駆体免疫原の決定は、ドツトプロット分析により便利に行うことができる。

ＦＩＰウィルス前駆体免疫原は、保存のために凍結乾燥するか、または直ちにワクチンに変換することができる。選択する技術が凍結乾燥の場合、ウィルス前駆体免疫原粉末をこの種のの形態で保存することができ、または好適な場合は、再懸濁して非常に低い温度（例えば−６７，８°〜−１２６，７°Ｃ）で保存することができる。

ＦＩＰウィルス前駆体免疫原を本発明のワクチンに変換するためには、上澄中の低い力価の生きたウィルスを、例えばβ−プロピオラクトン、ホルマリン、グルタルアルデヒド、二成分エチレンアミンまたは熱を用いる処理により最初に不活性化しなければならない。その後不活性化した混合物を、好ましくは最小有効量に希釈し、薬学的に許容し得るアジュバントと配合する。従来のアジュバントには、完全または不完全フロインドアジュバント、水酸化アルミニウム、タイル（Ｑｕｉｌ）Ａ、ＥＭＡ、ＤＤＡ、ＴＤＭ−スクリーン、レシチン、ミョウバン、サポニン、および当業界で周知のこの種の他のアジュバント、並びにこれらの混合物が含まれる。

調製したか、または他のネコのワクチンもしくは接種物と組合せたワクチンを使用し、ＦＩＰＶに随伴する疾患の予防のために、飼われている、および野生の両者のネコ科動物に接種することができる。従来の投与の経路、例えば非経口接種（皮下および筋肉内ワクチン接種を含む）または経口投与により、投薬量当りのウィルス前駆体免疫原単位をネコに投与する。非経口投与が、投与の好適な経路である。

このワクチンを用いて子ネコおよび成体ネコの両者をワクチン接種することができ、これにより感染からの十分な保護を受けるものである。接種のための子ネコの好適な最小齢は、大半の他のワクチンと同様に約８週であり、この時には子ネコは離乳しており、母性抗体は消失している。よって、ワクチン接種のための示唆される時間範囲は、６〜１２週齢の期間を包含する。

以下の実施例は、本発明を実施する様式を説明するものであるが、限定するものとして解釈すべきではない。明示的に示さない限り、この場合の全ての単位はメートル法によるものとし、ここに引用する全ての参考文献は明示的に援用するクラントールネコ腎臓（ＣｒＦＫ）細胞系統に、１　：　ｔｏｏに希釈したネコ感染性原膜炎ウィルス（ＡＴＣＣ−ＶＲ−８６７、ダールバーグ（Ｄａｈｌｂｅｒｇ）株）を感染させ、３７°Ｃて１時間インキュベートした。細胞病理学的効果（ＣＰ　Ｅ）が最大となるまで細胞を３７°Ｃてインキュベートした。

イーグルの塩類を含存し、ＩＯ％熱失活ウシ胎児血清、抗生物質混合物および２ｍＭグルタミンを補填したイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）を含む新鮮な生育培地（ＧＭ）をフラスコに添加し、３７°Ｃで培養した。３日毎に培養物を検査し、細胞生育の小さい高部を観察した。細胞が集密状態に達するまで新鮮なＧＭを添加した。その後０．０２５９６のトリプシンの添加により培養物を維持し、フラスコから細胞を離脱させ解離させて単細胞とし、他のフラスコへと継代した。

カバーガラス上でも細胞を生育させ、ＦＴＰモノクローナル抗体を一次試薬として用いる間接的免疫蛍光抗体（ＩＩＦＡ）技術を使用してウィルス生産について検査した。細胞系統をそれぞれの継代においてウィルス生産についてモニターし、５継代毎に保存のために凍結した。

１１ＦＡは次の手順に従って行った・ ■、ガラスペトリ皿中て蒸気滅菌によりカバーガラスを滅菌した。

２、ＣｒＦＫ−Ｆ　ＩＰ細胞をＧＭ中でカバーガラスに添加し、集密状態になるまで（通常は４８時間）インキュベートした。

３　培地をデカントし、ダルベツコのカルシウム・マグネシウムを含有しないリン酸緩衝生理食塩水（ＣＭＦ−ＰＢＳ）を用いて洗浄した。

４、−２０°Ｃのアセトンで皿を満たし、フリーザー中で１０分間固定した。アセトンを除去し、細胞を風乾し、直ちに使用するか、または［乾燥状態」て−２０°Ｃて保存した。

５、カバーガラスを、１　：　１０００に希釈したＦＩＰモノクローナル抗体の液で浸し、湿潤雰囲気中にて３７℃で３０分間インキュベートした。

６、ＣＭＦ−ＰＢＳを用いて３回（洗浄１回当り５分間）細胞を洗浄し、乾燥し、二次試薬を添加した。

７．１：４０に希釈した、フルオレセインイソチオシアネー）　（ＦＩＴＣ）と接合させたウサギ抗マウスＴｇＧで二次試薬を構成した。

８、二次試薬をインキュベートし、工程５および６に記載したように洗浄を行った。

９、最後の洗浄の後、カバーガラスを蒸留水に浸し、風乾し、グリシン：ＣＭＦ −ＰＢＳのｌ＝１混合物中でガラスの顕微鏡用スライド上に細胞側を下にして据付けた。

１０、適切な励起体およびバリヤーフィルターを備えた紫外線エビ蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）顕微鏡を用いて細胞を検査した。

Ｉｌ、顆粒状の澄んだ黄緑色の細胞質の蛍光により陽性の細胞を同定した。

１２、非感染ＣｒＦＫ細胞を対照として利用した。

実施例２ワクチンの製造のため、ウィルス試験した細胞をＧＭ中にて大きいプラスチックのＴフラスコ（７５または２５０ｍ１）に移し、集密状態まで３７°Ｃでインキュベートした。血清を含有しないＧＭにより培地を取替え、３７°Ｃで７２時間インキュベートした。２４および４８時間で試験のためにサンプルを取出した。

７２時間で培地を補集し、遠心分離して細胞残渣を除去した。ポリエチレングリコール１０００　（アクアシトＩＩＩ、カルビオケム、う・ジョラ、カリホルニア）を用いて４°Ｃて透析することにより、清澄化した上澄をｌ０Ｘ（１０倍）に濃縮した。ドツトプロット分析により、ＦＩＰ抗原についてＩＯＸ濃縮上澄を試験し、８５°Ｃで凍結した。

ドツトプロット分析は次のように行った：１．１×および１０×のワクチン調製物を試験した。

２．２０マイクロリツトルのサンプルをニトロセルロース紙（細孔寸法４５マイクロメーター）の細片にピペットで移し、風乾した。次のサンプルを使用した。

＊２４時間＊４８時間＊７２時間（ｌ×）＊７２時間（ＩＯＸ）＊血清を含有しないＭＥＭのみ＊７２時間インキュベートした非感染ＣｒＦＫ細胞由来の血清を含有しないＭＥＭ＊ＦＩＰウィルス（１：５０希釈）３．５ｇ／８０ｍＩＰＢＳ：２０ｍ１ツイーン２０（ジグ７−ケミカル、セントルイス、Ｍｏ、　）で５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて３７℃で１時間細片をインキュベートした。

４．１＋２００希釈のＦＩＰモノクローナル抗体溶液中で３７℃で１時間細片をインキュベートした。

５．５％ＢＳＡ−ツイーン２０洗浄液中にて軌道旋回台上で３回（１回の洗浄当り１０分）細片を洗浄した。

６、二次試薬、アルカリ性ホスファターゼと接合したブドウ球菌プロティンＡ（ｌ・５００に希釈）と共に細片をインキュベートした。１ｍＭＢＣＩＰ濃縮物、ＩｍＭＮＢＴ濃縮物、および１０ｍ１）リス緩衝液（キルケガード・アンド・ベリー・ラプス社、ガイサースバーグ、Ｍｄ）を含むＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質中に細片を入れ、通常は５〜１０分間、所望の強度に色を発色させた。

７、細片を蒸留水に浸すことにより反応を停止した。

８、細片を風乾し、テープで封止した。

９、陰性および陽性対照と比較するに際し、暗い青色／黒色の染色につき細片を可視化した。

混合物中に存在する生きたウィルスまたは域別した生きたウィルスの不活性化は、蒸留脱イオン水中にて１　：　１００の希釈でβ−プロピオラクトンを新たに調製し、Ｉ　：１２００の終濃度でウィルス懸濁物にこれを添加し、その後３７ °Ｃで２時間インキュベートすることにより行った。不活性化したサンプルを罹患性のＣｒＦＫ細胞上細胞値検定することにより、感染性のウィルスについて不活性化したワクチンを試験した。感染した細胞および適切な対照の毎日の観察によってウィルス性の細胞病理が銘記されない場合は、結果は陰性であるとした。

実施例３ＦＩＰＶ持続的感染ＣｒＦＫ細胞のウェスタンプロットによる特徴付け：ラエミリの系（ラエミリ・ニー：バクテリオファージＴ４の頭部の会合の際の構造蛋白質の開裂、Ｎａｔｕｒｅ、２２７：６８０−６８１．１９７０）を改変したものを使用し、ＦＩＰＶ免疫原のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。５ＤＳ−ＰＡＧＥは、３．５９６スタツキングゲルおよび１０％ランニングゲルを使用し、一定電流で還元または非還元条件下で行った。トウビンらの方法（トウビン・エッチ、スタイヒリン・ティおよびゴートン・ティ：ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロースシートへの蛋白質の電気泳動による転写：手順と幾つかの応用、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、７６：４３５０−４３５５．１９７９）により、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルからイモピロン（Ｉｎｗｎｏｂｉｌｏｎ　）　−Ｐ　（ミリボア）転写膜への蛋白質の電気泳動による転写を行った。ＦＩＰＶのダールバーグ株を一次抗体として用いて攻撃したネコ由来のポリクローナル血清を使用してプロットを免疫染色した。

二次抗体は、アルカリ性ホスファターゼと接合したウサギ抗ネコ免疫グロブリンとした。

図１は、左から右に、非還元および還元条件下におけるＦＩＰＶ免疫原のウェスタンプロットの写真であり、最初のレーンは分子量マーカーの対照、レーン２はパーへりオン（Ｐａｒｈｅｌｉｏｎ　）ウィルス免疫原（１０−１４−９２）− ポリエチレングリコール沈殿させたもの、レーン３はパーへりオンウィルス免疫原（１０−２６−９２）−ポリエチレングリコール沈殿させたもの、レーン４はパーへりオンウィルス免疫原（ＣＲＦＩＰ　２７Ｋ）−沈殿させていないもの、レーン５は毒性ＦＩＰＶ単離物（ＦｉＰＶ５）、およびレーン６はＣｒＦＫ細胞の対照である。

ウィルス特異的蛋白質バンドＳ　（２００ｋＤａ）、Ｎ（４６ｋＤａ）およびＭ（２８ｋＤａ）が、毒性ＦＩＰＶ単離物についてレーン５において見られる。更なるバンド（７０ｋＤａおよび９７ｋＤａ）がこのレーンでは明らかであるが、これらはパーへりオンＦＩＰＶ免疫プロットについてレーン２．３および４では明らかではない。ウィルス特異的バンド（１８０〜１９０ｋＤａ）がパーへりオンＦＩＰＶ免疫原について明らかであるが、毒性ウィルス（レーン５）の免疫プロットでは検出し得ない。これらは、ＦＴＰＶ持続的感染細胞系統には存在するが、毒性ＦＩＰＶ５のウィルス液には存在しない、Ｓ蛋白質の開裂生成物であろう。

比較の目的のため、非還元および還元条件下におけるプロットしていないＦＩＰＶ免疫原の銀染色を図２に示す。左から右に、最初のレーンは分子量マーカーの対照、レーン２はパーへりオンウィルス免疫原（１０−１４−９２）−ポリエチレングリコール沈殿させたもの、レーン３はパーへりオンウィルス免疫原（ｌＯ −２６−９２）−ポリエチレングリコール沈殿させたもの、レーン４はパーへりオンウィルス免疫原（ＣＲＦＩＰ２７Ｋ）−沈殿させていないもの、レーン５は毒性ＦＩＰＶ単離物（ＦＩＰＶ５）、およびレーン６はＣｒ　Ｆ　Ｋ細胞の対照である。ゲルのこの半分の部分は非還元条件下で流し、一方同一のサンプルを、図の右側に示すように還元条件下で流した。

実施例４次の手順に従い、免疫化および蛋白質の研究のために１２匹のＳＰＦネコを使用した：＊群Ａ：４匹のネコ、ワクチン（１，０ｍ１）の経口投与、＊群Ｂ：４匹のネコ、ＩＯＸワクチン濃縮物とセピック（Ｓｅｐｐｉｃ）　ｌ５Ａ５０アジユバント（モナチド、パリ、フランス）とのｌ：１混合物を含むワクチン（１，０ｍ１）の皮下投与、＊群Ｃ：４匹のネコ、対照として免疫化していないもの。

３回投与の処方および血清サンプリング手順を行った：＊０週：２週間ネコを条件付けする、＊２週：１．Ｏｍｌの血清のためにネコを予備採血する、＊３週：１．Ｏｍｌの血清のためにネコを予備採血し、最初のワクチン投与量を投与する、＊４週二本コを供試採血し、２回目のワクチン投与量を投与する、＊５週：ネコを供試採血し、３回目のワクチン投与量を投与する、＊６週、ネコを供試採血し、最初のウィルスによる攻撃を投与する、＊１４週：ネコを供試採血し、２回目のウィルスによる攻撃を投与する、＊１６週：ネコを採血し、検死する。

臨床経過および組織病理学的所見の大要を以下の表に記載する：Ａ　ＧＵ３　養成不振、発熱、痩せ、衰弱、２３ｄｐＣ＊　７９Ａ　ＧＦＡ　なし、健康　生存Ａ　ＧＪＩ　なし、健康　生存Ａ　ＧＵ４　なし、健康　生存Ｂ　ＧＡ２　なし、健康　生存Ｂ　ＧＢａ　なし、健康　生存Ｂ　ＧＪ２　［麻酔死］　ＸＸＸＢ　ＧＭＩ　なし、健康　生存Ｃ０Ｍ２　食欲不振、１１ｄｐＣ＋　１７ＣＧＮ６　食欲不振、１８ｄｐｃ＋　３６ＣＧＲ５食欲不振　５３ＣＧＰ５　食欲不振、ｇｄｐｃ　＋　、回復（１３ｄｐｃ　、　）、　生存２回目の攻撃を受容せず ″″ｄｐｃ＝攻撃後の日数（ｄａｙｓ　ｐｏｓｔ　ｃｈａｌｌｅｎｇｅ　）　（ｌおよび２）表２０Ｍ２　１７ｄｐｃ　、滲出性腹膜炎、全ての内蔵器官の多重病巣壊死組繊細胞性炎症、絨毛萎縮（回腸）、赤血球形成不全、骨髄過形成ＧＮ６　３６ｄｐｃ　、滲出性腹膜炎、全ての内蔵器官、脳および目の多重病巣化膿性肉芽腫症炎症、赤血球形成不全、骨髄過形成ＧＲ５１７ｄｐｃ　、滲出性腹膜炎、全ての内蔵器官、脳および目の多重病巣経壁性肉芽腫症回腸炎、赤血球形成不全、骨髄過形成ＦＩＰの臨床徴候について動物を毎日観察した。前記したデータから明らかなように、最初の攻撃の後、ワクチン接種していない対照群の４匹のネコの内３匹かＦＩＰの臨床徴候を示した。これらの３匹のネコを安楽死させた（全て瀕死の状況で、２匹は最初の攻撃の後、３匹目は２回目の攻撃の後であった）。ワクチン接種したネコの内、群Ａの４匹のネコの内３匹、および群Ｂの全てのネコ（麻酔により倒れたネコＧＪ２を除く）は、研究の間中ずっと健康のままだった。

群Ｃの対照のネコでは、ＦＩＰに典型的な病変が種々の器官で認められた。安楽死させた３匹のネコの全ては、滲出性腹膜炎、および肝臓、腎臓および肺での多重病巣壊死性乃至肉芽腫性炎症を有していた。ネコＧＭ２は過怠性組繊細胞性応答を存し、一方ネコＧＮ６およびＧＲ５は、主として化膿性肉芽腫性応答、より典Ｙ的には特発性ＦＩＰを示した。加えて、化膿性肉芽腫性病変が、より長期化した疾患の２匹のネコの脳および目に存在したが、急性で死亡した動物には存在しなかった。３匹のネコの全ての腸は、小腸および結腸の両者において、壊死性残渣、白血球および粘液による腸線の穏和乃至重篤な拡張を示した。２匹のネコでは、重篤な絨毛萎縮が回腸において明らかであり、経壁性肉芽腫性腸炎が３匹目のネコに存在していた。

よって、ＦＩＰＶをネコに接種すると、重篤な特発性疾患の病原性の特徴が正確に反復され、感染したネコは典型的な化膿性肉芽腫性応答を発病する。加えて、このＦＩＰ株は、他の種におけるコロナウィルス性腸炎に非類似ではないが、特発性ＦＴＰには随伴しない腸の病変を含む。

よって、前記したデータは、発明のワクチンが、高度に毒性のＦＩＰＶへの多重露呈に対する保護を与えることを示す。はぼ１００％存効であることに加えて、発明のワクチンは、感染性のウィルス粒子の放出の危険がなく、毒性株に戻る可能性がなく、ワクチンを他の不活性化したワクチンと容易に混合することができる点で、従来の改変した生きたワクチンによるアプローチに対して顕著な利点を存する。

ＦＩＰＶの全ての公知の株により持続的に感染された細胞によって生産される免疫原は、ウィルスの同種および異種の株に対する保護を与えるよう、ネコにおける適切な免疫応答を刺激することもできる。保護性とするためには、免疫原は、ネコの免疫系と接触するに至る全ゆるＦＩＰＶを中和しかつ除去する、十分な粘膜および細胞媒介免疫性を刺激するものとすべきである。

ＦＩＰＶの公知の株には次のものが含まれる：ＦＩ　ＰＶ−ＵＣＤＩ　：　ペダーセン、エヌシー、ボイμ、ジエイエフ、フロイド、ケー：組織培養で増殖したネコ感染性腹膜炎ウィルスを利用する子ネコにおける感染の研究、Ａｍ、Ｊ、Ｖｅｔ、Ｒｅｓ、４２：３６３−３６７．１９８１Ｆ　ＴＰＶ−ＴＮ４０６　ペダーセン、エヌシー、ブラック、ジェイダブリュ：弱毒性の生きたウィルスまたは準致死量の毒性ウィルスを使用する、ネコ感染性腹膜炎に対するネコの免疫化の試み、Ａｍ、　Ｊ、　Ｖｅ　ｔ、　Ｒｅｓ、４４：２２９−２３４．１９８３ＦＩＰＶ−７９−１１４６ベダーセン、エヌシー、エバーマン、ジェイエフ、マカイマン、エージエイ、オツド、アールエルニネココロナウイルス単離物７９− １１４６および７９−１６８３の病原性の研究、Ａｍ、Ｊ、　Ｖｅｔ、Ｒｅｓ、４５：２５８０−２５８５．１９８ＦＴＰＶ−Ｎｏｒ　１５　エバーマン、ジェイエフ、バウムガートナー、エル、オツドら：ネコ感染性腹膜炎ウィルス単離物の特徴、Ｖｅｔ、Ｐａｔｈｏｌ、１８：２５６−２６５．１９８１ＦＩＰＶ−ＵＣＤ４　ペダーセン、エフシー：ネコ感染性腹膜炎ウィルスの３つの新しい株：ＦＩＰＶ−ＵＣＤ２、ＦＩＰＶ−ＵＣＤ３およびＦ　ＩＰＶ−ＵＣＤ４を用いる実験的研究、Ｔｈｅ　Ｃｏｍｐ、Ｃｏｎｔ、Ｅｄｕｃ、７：１００１−１０１１Ｓ　１９８５ネココロナウイルス（腸内性）ＡＴＣＣＶＲ−９８９、株ＷＳＵ−７９−１６８（３）（ＦＩＰＮＯＲ１５株と交差反応する）ネコ感染性腹膜炎（ネココロナウィルス）ＡＴＣＣＶＲ−８６７ダ一ルバーグ株ネコ感染性腹膜炎、ＡＴＣＣＶＲ−９９０、株ＷＳＵ７９−１１４６ネコ感染性腹膜炎、ＡＴＣＣＶＲ−２００４、株ＤＦ２ネコ感染性腹膜炎、ＡＴＣＣＶＲ− ２００９、株ＮＷ−１２種類の実験、生体内および試験管内試験を使用してこの種のワクチンを試験することができる。

試験管内試験のためには、ネコにワクチンをワクチン接種しく２１日間の間隔で２回）、同種のＦＩＰＶ株を用いて少なくとも２回攻撃させるべきである。ネコは、２回目のワクチン接種の後１４４回目攻撃ウィルスに露呈し、臨床症候、体温、血液の状況（白血球計数、赤血球充填容積および特異形ｔ！りおよび攻撃露呈による死亡について、約５６日間の攻撃後の期間の間モニターすべきである。

攻撃後約５６８目に、生残ったワクチン接種体および対照、更に処理を受けていない（ｎａｉｖｅ　）対照に２回目の攻撃を行い、最初の攻撃の後で記載したように、最初の攻撃露呈後１１２日間モニターすべきである。２回目の生体内試験は前記したように行うべきであるが、攻撃ウィルスとして異種ＦＩＰＶ株を使用するものとする。ＦＩＰＶワクチンについて効力があると考えられるためには、同種および異種の攻撃ウィルス株に対して、ワクチン接種体における少なくとも７０％の保護率が与えられるべきである。試験管内試験のためには、ワクチン接種したネコ由来の血清を使用し、異なるＦＩＰＶ株の抗原性関係を決定することができる。ネコ血清の２倍希釈物をミクロ力価検定プレート中で調製する。異なるＦＩＰＶ株を希釈して約１００７ＣＩＤｓ。を含有するものとし、希釈した血清の穴に等しい容量を添加するものとする。プレートを３７°Ｃで１週間インキュベートし、その後ウィルス細胞病原性効果（ＣＰＥ）を検査する。それぞれのＦＩＰＶ株についての血清力価は、ＣＰＥを阻害する血清の最高の希釈として決定する。それぞれのＦＩＰＶ株についての血清力価を比較すると類似している筈であり、ネコの血清が全ての異種ＦＩＰＶ株を等しく中和し得ることを示すものとする。これは、ワクチン免疫原は全てのＦＩＰＶ株に対して共通であり、全てのＦＩＰＶ株に対してワクチン接種したネコを保護し得ることを示し得るものである。

実施例５ＣｒＦＫ　（クラントールネコ腎臓）細胞系統（ｐ１８１）を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から凍結した状態で受取った。細胞を含有するアンプルを３７°Ｃの水浴中で迅速に解凍し、７５平方センチのフラスコに直ちに移した（エージの塩（Ｅａｒｌｅ’　ｓ　５ａｌｔｓ　）を含む２０ｍ１のイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ−Ｅ）で、１０％熱失活（５６°Ｃ）ウシ胎児血清、２ｍＭのし一グルタミン、１％ピルビン酸ナトリウム、および５０μｇ／ｍｌ硫酸ゲンタマイシンを補填したもの（ＣＭ））。湿潤した５％Ｃ０２９５％空気のインキュベーター内で集密状態まで、３７°Ｃて細胞をインキュベートした。

０．２５％トリプシン溶液を用いて細胞を分離することにより、ｌ：３の分割比率て約３〜４日毎に細胞を継代した。ＣＭを注ぎ出し、３．０ｍｌのトリプシンを添加したＭＥＭ−Ｅで単層表面を洗浄し、単層を揺り動かして細胞表面を液で浸した。ピペットにより約０．５ｍｌを残してトリプシンを除去した。数分後、細胞は寄集められ始め、細胞表面から分離した。その後細胞を予備加温（３７° Ｃ）シたＣＭに再懸濁し、細胞単層を激しく濯ぎ、細胞か細胞の基部マトリックスから開放されるまで、フラスコの内側に対してピペットで上下させた。懸濁した細胞を３つの別のフラスコに等しく分割し、３７°Ｃでインキュベートした。

この手順を繰返し、１８９継代目に、元は感染性腹膜炎のネコの肝臓から単離され、ＡＴＣＣから受取った（ＡＴＣＣＶＲ−８６７）ネコ感染性腹膜炎（ＦＬＰ）のダールバーグ株の凍結アンプルを迅速に解凍し、氷水に浸漬した。アンプルの内容物を冷却（４°Ｃ）シたＭＥＭ−Ｅ中で１：ｌＯＯに希釈し、１．Ｏｍｌの希釈したウィルスをＣｒＦＫの３つのフラスコのそれぞれに添加し、３７℃でインキュベートし、位相差照明に設定した倒立顕微鏡を用いて２００×の倍率で毎日観察した。

感染後（ｐｏｓｔ−ｉ口ｆｅｃｔｉｏｎ、　ｐ、ｉ、）　５日で多核細胞の形成が認められ、上澄をフラスコから除去し、プールし、１．Ｏｍｌの両分で凍結し、力価検定するまで一８５°Ｃで保存した。幾つかのフラスコをトリプシン処理し、細胞を計数し、細胞保存剤として１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を補填した冷却したＣＭに再懸濁し、凍結するまで１度／分の温度の制御した凍結の速度で凍結し、その時点で保存のために細胞を液体窒素に浸漬した。持続的に感染した細胞を含有する他のフラスコはＣＭで満たし、更に３７°Ｃでインキュベートし、非感染細胞と同様に継代した。

免疫蛍光抗体検定（ＩＦＡ）および免疫プロット検定（ＩＢ）により持続性をモニターした。ウィルスまたはウィルス抗原生産について細胞系統をモニターするのにＩＦＡを使用する一方、上澄中に放出されたウィルスまたはウィルス蛋白質を検出するのにＴＢを用いた。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両者を用いた。二次抗体は、フルオレセインイソチオシアネートと接合させた抗一種ＩＧＧとした。適切なバリヤーおよび励起体フィルターを用いてエビ蛍光顕微鏡技術を使用し、ニコンの蛍光顕微鏡を用いて、メタノ−固定し染色した細胞を検査した。持続的感染細胞は、特異的な細胞質性の澄んだ黄緑色の蛍光を放射するものとして決定した。

生育培地条件およびインキュベート時間を変化させることにより、通常の生育条件を使用した場合より大量に、持続的感染細胞からウィルス蛋白質か後に放出されることを認めた。このことはワクチン製造の基本となった。集密状態の細胞培養物を、ウシ胎児血清を含有しないＭＥＭ−Ｈに入替え、３７℃で７２時間インキュベートした。インキュベート期間の終りに際し、上澄をプールし、ボエチレングリコール６０００　（ＰＥ０６０００）に対する透析によりＩＯＸに濃縮した。最初は改変したラエメリの免疫プロット技術により、濃縮した上澄をウィルス抗原について試験し、その後陽性および陰性の試験上澄を洗剤で処理してウィルスおよび非ウィルス蛋白質を可溶化し、ドデシル硫酸ナトリウムを用いたポリアクリルアミドスラブゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中に調製した穴に装填した。

バーネットにより記載されたように、材料を電気泳動してニトロセルロース膜上に転写プロットした。分離した蛋白質を、ポリクローナル抗ＦＩＰＶ血清またはモノクローナル抗体（ウィルス蛋白質に特異的）と反応させた。ＦＩＰＶに対して特異的に結合した免疫グロブリンは、ヤギ抗一種（ネコまたはマウス）免疫グロブリン−ビオチン−アビジンアルカリ性ホスファターゼ接合体との順次の反応により視覚化し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴホスファターゼの市販基質系中で発現させた。

ウェスタンプロット検定は、分離したウィルス蛋白質を検出するものである。

コロナウィルスの構造蛋白質は、次の分子量を存する６つの構造蛋白質よりなるものとして現在同定されている：記号　ＭＷ３　１８０．０００（スパイク糖蛋白質）Ｓｌ　９０．０００　（Ｎ末端Ｓ開裂生成物）３２　９０．０００　（Ｃ末端Ｓ開裂生成物）ＨＥ　６５．０００（ヘマグルチニン−エステラーゼ糖蛋白質）Ｍ　２Ｏ−３０ＫＤ（一体化膜蛋白質）Ｎ　５Ｏ−６０ＫＤ（ヌクレオカプシド蛋白質）図１は、ワクチン産物は、公知のウィルス産物の内の２つ、３０．０ＯＯＫＤのＭＷを有するもの（Ｍ蛋白質）および５０〜６０．０００ＭＷのもの（Ｎ蛋白質）を与えるものであることを示す。ＭおよびＮ蛋白質の間のＭＷを有するなお未同定の第３の蛋白質も、これらの実験条件下で生産される。ＦＩＰＶの１１４６およびダールバーグ株の両者を用いて類似するパターンが認められた。

膜融合に関与すると共に重要な抗原性部位を担持する大きいスパイク糖蛋白質（Ｓ、ＳｌおよびＳ２）は、コロナウィルス棟内て並びに種間て長さおよび組成か驚く程変動する。よって、これらの蛋白質は、ＦＩＰＶ株による同種または異種の攻撃に対して保護する良好なワクチンを与え得ない。ベネマら（ベネマ、エッチ、デグルート、アール、ハーバ−、ディ、バージネック、エムおよびスノクーン、ジエイ、ネコ感染性腹膜炎ウィルスの膜およびヌクレオカプシド蛋白質の一次構造および子ネコにおける組換えワクチニアウィルスの免疫原性、ＶｉｒｏｌｏｇＶ１８１　：３２７−３３５　（１９９１））は、ＦＩＰＶの融合性スパイク蛋白質をワクチニアウィルスのゲノムに組換え、子ネコを免疫化した。このワクチンは低い力価の中和抗体を顕現させたが、毒性ウィルスにより攻撃された場合は、ワクチニアのベクター株で免疫化した子ネコより早く死亡を招いた。

一体化した構成員の糖蛋白質（Ｍ）は、内部疎水性配列を使用して膜内での移行を指向させることが示されている。全てのコロナウィルスが、ヌクレオカプシド（Ｎ）と相互作用する膜（Ｍ）蛋白質を含有する。これはウィルス粒子の会合に関与し、感染した細胞からのウィルスの出芽の部位を決定する役割を果たす。

よって、現存する公知の株、公になっていない大学や会社の研究室の所存株、およびなお発見されるべきＦＩＰＶの株から調製したＦＩＰＶサブユニ・ノドワクチンは、前記した手順て調製したワクチンを用いた場合、保護性の免疫性を顕現させると推定して妥当てあろう。

本手順に従ってＦＩＰＶの前記した株のいずれかから調製したワクチンは、ＦＩＰＶの同種または異種株由来の、後の制御された毒性ウィルスの攻撃に対して免疫化した子ネコを保護するのに効力を有し得る。ＦＩＰＶワクチン接種したネコの約８０９６か、所定の攻撃に対して保護され得る。野生の状況下におけるウィルスによる負荷は攻撃投与より小さい可能性が非常に大きいため、免疫化された子ネコは、実験室条件下より大きい保護率を有し得る。

実施例６以下の実験は、本発明のワクチンが、ＤＦ−２株ネコ感染性腹膜炎ウィルスによる多重の攻撃に対してネコを保護することを示した。

次の手順に従った：１０匹のネコワクチン接種１２１日ワクチン接種１１４日ＤＦ２による攻１！＋１０匹のワクチン接種体、５匹の対照攻撃後１〜２１日：温度、臨床観察攻撃後１４．２８．４２およヒ５６　日：ＷＢＣ，ｐｃｖ、特異形態１５６日攻撃生存体（ワクチン接種体＋対照）５匹の処理を受けていない対照攻撃後５７〜７８：温度、臨床観察攻撃後７０．８４．９８および１１２日：ＷＢＣ，ＰＣＶ、特異形態攻撃後１１２日で終了動物品種／資質　バーラン・スプラーグ・ダウレイ（Ｈａｒｌａｎ　Ｓｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙ　）ネコ数：４０齢／性別・　９〜１４週齢起源：　バーラン・スブラーグ・ダウレイ実験の設計群＝　ＩＯワクチン接種体５対照鍵となる操作口：　試験旧　処理０　採血／ワクチン接種２Ｉ　採血／ワクチン接種３５　採血／攻撃２０匹のワクチン接種体、５匹の対照３５−３６　臨床症状の観察／記録ＷＢＣ％ｐｖｃ、特異形態採血／攻撃生存体５匹の対照９１−１１２　臨床症状の観察／記録ＷＢＣ，ＰＶＣ，特異形態１４７　終了測定したバラメーター二臨床症状、ＷＢＣ，ＰＶＣ，特異形態試験材料ワクチン：　ＫＶネコ感染性腹膜炎ウィルスワクチン接種経路：　皮下投与：　２回（それぞれ１ｍ１）間隔＝　２１日サンプル：　血液サンプル処理：　血清を補集保存：　≦−２０°Ｃ配送：　シャトル攻撃：　毒性攻撃ウィルス、ＤＦ−２株攻撃方法：　ａ、１．　０ｍｌ、経口抑制剤：　ケタミンＨＣＩ　（５ｍｇ／ｌｂ）結果を以下の表に示す。表３は、ワクチン接種の前に、試験群のそれぞれのネコは、陰性のウィルス血清中和力価を有していたことを示し、ネコ感染性腹膜炎ウィルスまたはネコ腸炎コロナウィルスのいずれかの株に以前に露呈されたものはなかったことを意味する。２回目のワクチン接種の後であるがウィルスによる攻撃の前に、１０匹の試験対象の全ては種々の程度のウィルスに対する抗体を生産していた。抗体力価は非常に低（、これは望ましい。ワクチン処理に対する高い抗体応答は、ネコがウィルスに対する更なる露呈に感受性となったことを示すことがよく知られている。抗体力価が高かったならば（すなわち１０２４または２０４Ｂ）、これはＦＩＰＶ攻撃後の早々の死亡の高い可能性を示すものであり得た。有効なＦＩＰＶワクチンは、抗体に媒介される機構ではなく、細胞に媒介される免疫機構により作動すると見られる。したがって、表３のｌｌｌ３および４は、陽性の結果（すなわち低い抗体力価）を予備的に示すものである。

ネコ感染性腹膜炎ウィルスワクチン免疫原性試験投与１１０　ＮＥＧ　４　１２８１１２　ＮＥＧ　６４　１２８＋１４　ＮＥＧ　ＮＥＧ　１２８１１８　ＮＥＧ　１６　２５６１２６　ＮＥＧ　ＮＥＧ　２１３２　ＮＥｏ　８　１２８１４１　ＮＥＧ　＜２　４１６３　ＮＥＧ　８　１６１７３　ＮＥｏ　２　１２８１７５　ＮＥＧ　ＮＥＧ　８＊完全なウィルス中和を生起した血清の最高の希釈として表したウィルス血清中和力価。

表４は、１０匹の対象の内８匹が最初の攻撃で生残った、すなわち８０％の保護を示す。８匹の生存体の内、７匹が２回目の攻撃で生残った（すなわち８７゜５％の保護）。

ネコ感染性腹膜炎ウィルスワクチン免疫原性試験投与カルバボールアジュバントＤＦ−２攻撃−皮下（最初の攻撃）１７３　＋　２１＊２２回目攻撃露呈後の死亡を示す。

表５ネコ感染性腹膜炎ウィルスワクチン免疫原性試験投与カルバボールアジュバントＤＦ−２攻撃−皮下（最初の攻撃）１１６　＋　２２１２９　（＋）　１８８＊２回目の攻撃露呈後の死亡を示す。

表５は元の対照群に関係するものであり、最初の攻撃の後に５匹のワクチン接種していないネコの内３匹が死亡したことを示す。２匹の生存体の内、１匹はＤＦ −２ＦＩＰＶによる２回目の攻撃の１８日後に死亡した。処理を受けていない５匹の対照の内３匹は、２回目の攻撃実験で使用したウィルスに対する露呈の結果死亡した。このデータは、本発明のワクチンが、ネコ感染性腹膜炎ウィルスの毒性単離物による多重攻撃に対する有意義な保護を与えることを示す。

ｑ）フロントベージの続き（５１）Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号、庁内整理番号Ｃｌ２Ｐ　２１１００　Ａ　９２８２−４Ｂ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１００Ｃ１２Ｒ１：９１）Ｉ

Claims

【特許請求の範囲】

１．試験管内で培養したＦＩＰ持続的感染細胞から誘導したＦＩＰ免疫原。
２．細胞が、クランドールネコ腎臓細胞で構成される請求項１記載のＦＩＰ免疫原。
３．血清を含有しない生育培地から回収した請求項１記載のＦＩＰ免疫原。
４．前記ＦＩＰ持続的感染細胞が、血清を含有する生育培地中で培養された後に、前記血清を含有しない生育培地に移されたものである請求項３記載のＦＩＰ免疫原。
５．前記細胞が、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１１１３７で指定される細胞系統に由来するものである請求項２記載のＦＩＰ免疫原。
６．ネコ感染性腹膜炎ウイルスワクチンの製造方法であって、ＦＩＰＶに持続的に感染した細胞を血清を含有する生育培地中で培養し、前記持続的感染細胞を血清を含有しない生育培地に移し、前記持続的感染細胞を分離して上澄を回収し、上澄中の生きたウイルスを不活性化することを含む、ネコ感染性腹膜炎ウイルスワクチンの製造方法。
７．前記培養細胞が、クランドールネコ腎臓細胞で構成される請求項６記載の方法。
８．前記培養細胞が、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１１１３７で指定される細胞系統に由来するものである請求項７記載の方法。
９．前記上澄を凍結乾燥し、この結果得られる粉末を回収する請求項６記載の方法。
１０．薬学的に許容し得るアジュバントを用いて前記ワクチンを希釈する請求項６記載の方法。
１１．ＦＩＰ罹患性哺乳動物の免疫化のためのワクチン組成物であって、予めウイルス不活性化処理に供せられ、薬学的に許容し得るアジュバントと配合した、試験管内で培養したＦＩＰ持続的感染細胞から誘導した、免疫化に有効な量の上澄を含むワクチン組成物。
１２．前記細胞が、クランドールネコ腎臓細胞で構成される請求項１１記載のＦＩＰワクチン。
１３．前記持続的感染細胞が、血清を含有しない生育培地中で培養される請求項１１記載のＦＩＰワクチン。
１４．前記ＦＩＰ持続的感染細胞が、血清を含有する生育培地中で培養された後に、前記血清を含有しない生育培地に移されたものである請求項１３記載のＦＩＰワクチン。
１５．前記細胞が、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１１１３７で指定される細胞系統に由来するものである請求項１２記載のＦＩＰワクチン。
１６．請求項１１記載のワクチンを前記哺乳動物に非経口的に接種することを含む、ＦＩＰ罹患性哺乳動物を免疫化する方法。
１７．前記哺乳動物がネコである請求項１６記載の方法。
１８．前記哺乳動物が、接種の際に約６〜１２週齢である請求項１６記載の方法。
１９．請求項１５記載のワクチンを前記哺乳動物に接種する請求項１６記載の方法。
２０．前記薬学的に許容し得るアジュバントが、完全または不完全フロインドアジュバント、水酸化アルミニウム、タイルＡ、ＥＭＡ、ＤＤＡ、ＴＤＭ−スクワレン、レシチン、ミョウバン、サポニン、およびこれらの混合物よりなる群から選択される請求項１６記載の方法。
２１．ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１１１３７で指定されるＦＩＰＶにより持続的に感染されたクランドール賢臓細胞系統。