JPH0727766A - Reagent-bonded polymer and its preparation - Google Patents
Reagent-bonded polymer and its preparationInfo
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- JPH0727766A JPH0727766A JP5153743A JP15374393A JPH0727766A JP H0727766 A JPH0727766 A JP H0727766A JP 5153743 A JP5153743 A JP 5153743A JP 15374393 A JP15374393 A JP 15374393A JP H0727766 A JPH0727766 A JP H0727766A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、液体試料中の少なくと
も１種の特定成分を測定するための試薬を結合したポリ
マーに関し、特に、カルボキシル基含有試薬や酵素活性
物質等、複数の成分に対応した種々の試薬が安定的に固
定化された試薬結合ポリマー、該ポリマー膜、該ポリマ
ー担持体および試薬結合ポリマー調製方法に関する。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a polymer bound with a reagent for measuring at least one specific component in a liquid sample, and particularly to a plurality of components such as a carboxyl group-containing reagent and enzyme active substance. The present invention relates to a reagent-bound polymer in which various reagents described above are stably immobilized, the polymer membrane, the polymer carrier, and a method for preparing a reagent-bound polymer.
【０００２】[0002]
【従来の技術】従来より、物理量を測定するための物理
センサーは工業プロセス、環境、医療等の分野において
広汎に用いられているが、化学物質の計測を対象とする
化学センサー、更に酵素等の反応特異性を利用し生体関
連物質等の計測を対象とするバイオセンサーは開発が遅
れている。これは特定の目的物質を選択的に識別するセ
ンサー素子の開発が容易でなかったことによる。しか
し、最近の技術の高度化、複雑化に伴い計測対象が著し
く増加し、これらを迅速かつ連続的に計測するバイオセ
ンサーの開発が特に臨床検査等の分野において強く要望
されている。2. Description of the Related Art Conventionally, a physical sensor for measuring a physical quantity has been widely used in the fields of industrial process, environment, medical treatment, etc., but a chemical sensor for measuring a chemical substance, an enzyme, etc. The development of biosensors that target the measurement of bio-related substances using reaction specificity has been delayed. This is because it was not easy to develop a sensor element that selectively identifies a specific target substance. However, the number of objects to be measured has remarkably increased with the recent advancement and complexity of technology, and there has been a strong demand for the development of biosensors for measuring these rapidly and continuously, especially in the fields of clinical examination and the like.
【０００３】生体液試料中の特定成分を生体内にて連続
計測する安全性の高いシステムの一つとしてガラス電極
や半導体等を利用した電気化学的方法があるが、この方
法は感度や応答速度の劣ること、外部からの電磁気的な
雑音による影響、あるいは装置自体の微小化の問題等、
技術的問題がある。近年、このような実情に鑑み電気化
学的方法等に代わり、機能性高分子膜による各種光学的
バイオセンサーが開発されるに至っている。例えば、ビ
ニルイミダゾールポリマーまたはコポリマーフィルムに
化学試薬を固定しこれを光ファイバーの先端に装着して
成るオプトロードを用いたバイオセンサー（特開平３−
６５６３９号公報）が知られているが、このものは、化
学試薬を担持するのに、ポリマー中のイミダゾール単位
上に存在する正の電荷を主に利用しているので、化学試
薬としてはスルホン酸官能基を有するものに有効である
ものの、他の試薬は安定に固定できない。又、該ポリマ
ーを光ファイバー上にグラフトするため光ファイバーの
端部を活性化処理する工程等も不可欠で製作が容易でな
く、又、使用後の交換に当ってはオプトロードごと交換
しなければなない。又、ペルオキシダーゼ及びグルコー
スオキシダーゼと特異的に結合させたカルボキシル基及
びアミノ基を有するポリアミド担体を用い、これにさら
にルミノールを固定し、ポリアミド担体を修飾すること
なくペルオキシターゼ及びグルコースオキシターゼを担
体上に担持できる複合体（特公平３−１１７５９号公
報）が知られているが、このものは特有のポリアミド担
体を用いかつ固定できる酵素もペルオキシターゼ及びグ
ルコースオキシターゼのみに制限され汎用性がなく、特
定用途の試験片として用いることができるが、精度等が
充分でないと推定され、又、この試験片は使い捨てで、
反応が可逆的でないためセンサーとして用いることは困
難である。There is an electrochemical method using a glass electrode, a semiconductor or the like as one of the highly safe systems for continuously measuring a specific component in a biological fluid sample in a living body. This method has a sensitivity and a response speed. Inferiority, the effect of external electromagnetic noise, or the problem of miniaturization of the device itself.
There is a technical problem. In recent years, in view of such circumstances, various optical biosensors using functional polymer films have been developed in place of electrochemical methods and the like. For example, a biosensor using an optrode, which is formed by fixing a chemical reagent on a vinylimidazole polymer or copolymer film and mounting it on the tip of an optical fiber (Japanese Patent Laid-Open No. 3-301).
65639 gazette) is known, but this one mainly utilizes the positive charge existing on the imidazole unit in the polymer to carry the chemical reagent, and therefore sulfonic acid is used as the chemical reagent. Although effective for those having a functional group, other reagents cannot be stably immobilized. In addition, since the polymer is grafted onto the optical fiber, the step of activating the end portion of the optical fiber is indispensable and the production is not easy, and the replacement after use must be replaced with the optrode. . Further, a polyamide carrier having a carboxyl group and an amino group specifically bound to peroxidase and glucose oxidase is used, and luminol is further fixed to this, so that peroxidase and glucose oxidase can be supported on the carrier without modifying the polyamide carrier. A complex (Japanese Patent Publication No. 3-11759) is known, but this one is a test piece for a specific purpose, which is not versatile because the enzyme that can be immobilized using a unique polyamide carrier is limited to only peroxidase and glucose oxidase. However, it is estimated that the accuracy is not sufficient, and this test piece is disposable.
It is difficult to use as a sensor because the reaction is not reversible.
【０００４】このような課題を解決するために、本願出
願人は既にハロゲン化アルキルスチレン誘導体とアクリ
ル酸類との共量合体を利用した試薬結合ポリマーを発明
した（特開平４−３３０２９８号公報）。このポリマー
はいろいろな形状に加工可能でセンサーとしての適用範
囲が広く、かつ固定できる試薬の種類も多く静電的結合
あるいは化学的結合で安定に結合できるという特徴を有
するが、具体的に対象となる試薬は、静電的結合を介し
て酸性指示薬や塩基性指示薬である色原体、化学的結合
を介してアミノ基含有試薬であり、その他の試薬の結合
例については開示がなく実質的にかかる２通りの結合の
みを対象とするものであった。また、化学的結合におい
ては、ポリマーの繰り返し単位に試薬を導入するために
好ましくはアミノ基含有スペーサーであるアンモニアあ
るいはジアミン類とカルボニル基含有スペーサーである
ジオキソ化合物とを反応させ得られる構造を一つのスペ
ーサーとして用い、該スペーサーのカルボニル基と試薬
のアミノ基を結合させていたので、アミノ基しか反応に
使えない場合、アミノ基を活性中心に持つ酵素は固定化
によって活性を失うことになり、また抗体分子の抗原結
合部位はタンパクのＮ末端（アミノ基）側であるから、
やはり固定化には不向きであるという問題点があり、更
にはスペーサーの導入に２段階の反応が必要であった。
また、静電的結合においては４級アンモニウム化合物が
スペーサーとして導入されているが、これに静電的に結
合できるものは酸塩基指示薬のみと考えられていたの
で、これ以外の試薬との結合性については未知であっ
た。即ち、上記ポリマー（共重合体）は種々の試薬を結
合させる担体として極めて優れており、結合できる試薬
が従来のものに比較すれば相当に多様であるが、結局、
結合できる試薬はアミノ基含有試薬と酸塩基指示薬の２
種類に限定されていた。In order to solve such a problem, the applicant of the present invention has already invented a reagent-bonded polymer utilizing a copolymerization of a halogenated alkylstyrene derivative and acrylic acid (Japanese Patent Laid-Open No. 4-330298). This polymer can be processed into various shapes, has a wide range of applications as a sensor, and has a large number of types of reagents that can be immobilized, and is characterized in that it can be stably bound by electrostatic bonding or chemical bonding. The reagent is a chromogen that is an acidic indicator or a basic indicator through an electrostatic bond, and an amino group-containing reagent through a chemical bond. It was intended only for these two types of binding. Further, in the chemical bond, in order to introduce a reagent into the repeating unit of the polymer, preferably a structure obtained by reacting ammonia or a diamine which is an amino group-containing spacer with a dioxo compound which is a carbonyl group-containing spacer is used. Since it was used as a spacer and the carbonyl group of the spacer was linked to the amino group of the reagent, if only the amino group can be used in the reaction, the enzyme having the amino group as the active center loses its activity by immobilization, and Since the antigen-binding site of the antibody molecule is on the N-terminal (amino group) side of the protein,
After all, there was a problem that it was not suitable for immobilization, and furthermore, a two-step reaction was required for introducing a spacer.
Also, in the electrostatic bond, a quaternary ammonium compound is introduced as a spacer, but it was considered that only an acid-base indicator could electrostatically bond to this, and therefore the bondability with other reagents Was unknown. That is, the above-mentioned polymer (copolymer) is extremely excellent as a carrier for binding various reagents, and the reagents capable of binding are considerably diverse as compared with the conventional ones.
Reagents that can be bound are amino group-containing reagents and acid-base indicators 2
It was limited to types.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来技
術の実情に鑑み、上述したハロゲン化アルキルスチレン
とアクリル酸類との共重合体を用い、特定のスペーサー
を導入することにより、化学的結合を介して試薬のアミ
ノ基以外の活性官能基を該共重合体に結合させ、また静
電的結合を介して酸塩基指示薬以外の試薬を該共重合体
に結合させることを目的とし、もってより広い範囲から
試薬を選択し該共重合体に安定的かつ簡便に結合させる
ことを目的とする。また、本発明の他の目的は、得られ
た試薬結合ポリマーを用いて成膜し又は担体に含浸させ
素子化することである。また、本発明の更に他の目的
は、上記化学的結合、静電的結合を行うための特定スペ
ーサーを共重合体に導入し試薬を定量的にかつ安定的に
結合させる方法を提供することである。SUMMARY OF THE INVENTION In view of the above-mentioned conventional circumstances, the present invention uses the above-mentioned copolymer of halogenated alkylstyrene and acrylic acid and introduces a specific spacer to chemically bond the compound. For the purpose of binding an active functional group other than the amino group of the reagent to the copolymer through the above, and also for binding a reagent other than the acid-base indicator to the copolymer through an electrostatic bond, The purpose is to select a reagent from a wide range and to stably and easily bind to the copolymer. Another object of the present invention is to form a film by using the obtained reagent-bonded polymer or impregnate a carrier to form an element. Still another object of the present invention is to provide a method for quantitatively and stably binding a reagent by introducing a specific spacer for performing the above chemical bond and electrostatic bond into a copolymer. is there.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】かかる目的を達成する本
発明は、下記一般式（Ｉ）で表される構造を有するハロ
ゲン化アルキルスチレンと下記一般式（II）で表される
アクリル酸類との共重合体を不溶性担体とし、この共重
合体の繰り返し単位中のＲ1に試薬を結合させてなる試
薬結合ポリマーにおいて、（ａ）Ａ−ＣＯＯＨ（Ａは主
要部分）で表されるカルボキシル基含有試薬が結合した
下記式（III）で表わされる試薬結合部、および／また
は（ｂ）酵素活性物質および免疫活性物質から選択され
た試薬が結合した下記式（IV）で表わされる試薬結合
部、または更に前記試薬結合部に加え（ｃ）酸塩基指示
薬が結合した下記式（IV）で表わされる試薬結合部、を
有することを特徴とする試薬結合ポリマーである。Means for Solving the Problems The present invention, which achieves the above object, comprises a halogenated alkylstyrene having a structure represented by the following general formula (I) and an acrylic acid represented by the following general formula (II). In a reagent-bound polymer obtained by binding a reagent to R 1 in the repeating unit of the copolymer using an insoluble carrier, (a) a carboxyl group represented by A-COOH (A is a main part) A reagent binding part represented by the following formula (III) to which a reagent is bound, and / or (b) a reagent binding part represented by the following formula (IV) to which a reagent selected from an enzyme active substance and an immunoactive substance is bound, or Further, in addition to the reagent binding part, (c) a reagent binding part represented by the following formula (IV) to which an acid-base indicator is bound, and a reagent binding polymer.
【０００７】[0007]
【化４】 [Chemical 4]
【０００８】[0008]
【化５】 （式中、Ｘはハロゲン、Ｒ1 はベンゼン環の任意の位置
をとり得る炭素数１〜４のアルキレン基、Ｒ2 及びＲ3
はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜４のアルキル基
を示す。） −Ｒ1−Ｓｐ−ＣＯ−Ａ （III） （式中、Ｒ1は一般式（Ｉ）と同じ意味、Ｓｐはアンモ
ニアまたはジアミン類からなるスペーサー構造を示
す。）[Chemical 5] (In the formula, X is a halogen, R 1 is an alkylene group having 1 to 4 carbon atoms which can take any position of the benzene ring, R 2 and R 3
Each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms. ) -R 1 -Sp-CO-A (III) (In the formula, R 1 has the same meaning as in formula (I), and Sp represents a spacer structure composed of ammonia or a diamine.)
【０００９】[0009]
【化６】 （式中、Ｒ1およびＸは一般式（Ｉ）と同じ意味、Ｒ4、
Ｒ5、Ｒ6はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜４のア
ルキル基、又は炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、
Ｂ±は正または負にチャージした試薬成分、…は静電的
結合を示す。） 上記の共重合体を担体として用い、スペーサーとしてア
ンモニアあるいはジアミン類を導入することにより、化
学的結合（酸アミド結合）によりカルボキシル基含有試
薬を結合させることができるので、簡単な構造でかつ安
定的にカルボキシル基を含有した酵素活性物質や免疫活
性物質等を結合させたポリマーを得ることができ、更
に、４級アンモニウム化合物を該共重合体に導入するこ
とにより静電的結合で酸塩基指示薬ばかりでなく酵素活
性物質や免疫活性物質も結合させることができるので、
複数種の試薬がポリマーに直接固定された機能性ポリマ
ーとすることができる。ここで、前出の特開平４−３３
０２９８号公報に開示された化学的結合による結合は試
薬のアミノ基を利用するものであり活性官能基としてア
ミノ基を有しない試薬の場合は対象とすることはできな
いが、酵素活性物質等の様にアミノ基とカルボキシル基
の両者を有しているものを試薬とする場合は、前出の結
合でも本発明の結合でもポリマーに結合できることにな
る。しかし、ポリマーに結合できても、酵素や抗体分子
等、アミノ基による結合で活性や安定性を損なうもので
は、実用上結合させる意義がない。発明のポリマーのス
ペーサーは、前出のものに比べて構造が簡単であるがス
ペーサーの機能自体には大きな違いがない上、アミノ基
による結合に不向きなものをカルボキシル基により結合
させることができるので、固定する物質の活性や安定性
を損なうことのない的確な結合様式を選定することがで
きる。また、同公報の静電的結合による試薬の結合で
は、酸塩基指示薬のみを対象としその他の試薬の結合可
能性については全く未知であったが、酵素活性物質や免
疫活性物質等も静電的結合によりポリマーに驚く程安定
的に結合させることができることが本発明において初め
て見出されたものである。従って、静電的結合により酵
素活性物質や免疫活性物質と共に酸塩基指示薬を結合さ
せることが可能となり、静電的結合のみでも機能性膜を
構成することができるようになる。[Chemical 6] (In the formula, R 1 and X have the same meanings as in the general formula (I), R 4 ,
R 5 and R 6 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or a hydroxyalkyl group having 1 to 4 carbon atoms,
B ± represents a reagent component charged positively or negatively, ... Represents electrostatic coupling. ) By using the above copolymer as a carrier and introducing ammonia or a diamine as a spacer, a carboxyl group-containing reagent can be bonded by a chemical bond (acid amide bond), so that the structure is simple and stable. A polymer to which an enzymatically active substance or an immunologically active substance containing a carboxyl group is bound can be obtained, and an acid-base indicator is electrostatically bound by introducing a quaternary ammonium compound into the copolymer. Not only can enzyme-active substances and immuno-active substances be bound,
It can be a functional polymer in which a plurality of types of reagents are directly immobilized on the polymer. Here, the above-mentioned JP-A-4-33.
The bond by the chemical bond disclosed in Japanese Patent Publication No. 0298 utilizes the amino group of the reagent and cannot be applied to a reagent having no amino group as an active functional group, but it cannot be used as an enzyme active substance or the like. When a reagent having both an amino group and a carboxyl group is used as the reagent, the above-mentioned bond or the bond of the present invention can be bonded to the polymer. However, even if it can be bound to a polymer, it is practically meaningless if it binds with an amino group such as an enzyme or an antibody molecule to impair the activity or stability. The polymer spacer of the invention has a simpler structure than the above-mentioned ones, but there is no significant difference in the function of the spacer itself, and since a spacer that is not suitable for binding with an amino group can be bound with a carboxyl group. It is possible to select an appropriate binding mode that does not impair the activity or stability of the substance to be immobilized. In addition, in the reagent coupling by electrostatic coupling in the same publication, the possibility of coupling other reagents with only acid-base indicators was completely unknown, but enzyme active substances, immunoactive substances, etc. are also electrostatically bound. It was discovered for the first time in the present invention that the bond allows surprisingly stable bonding to the polymer. Therefore, it becomes possible to bind the acid-base indicator together with the enzyme active substance and the immunologically active substance by electrostatic bonding, and the functional film can be constituted only by electrostatic bonding.
【００１０】また、共重合体が、一般式（Ｉ）で表わさ
れるモノマーと一般式（II）で表わされるモノマーとの
モル比が３：１〜１：３の範囲で得られたものである上
記試薬結合ポリマーによれば、親水性で試薬結合部位を
有するモノマーと疎水性で試薬結合部位を有しないモノ
マーとの割合が適当となるので、生体関連物質を測定す
るのに適した親水性、試薬の耐溶出性、ポリマーの加工
性等を得ることができる。Further, the copolymer is obtained in a molar ratio of the monomer represented by the general formula (I) to the monomer represented by the general formula (II) in the range of 3: 1 to 1: 3. According to the reagent-bonded polymer, since the ratio of the hydrophilic monomer having the reagent-binding site to the hydrophobic monomer having no reagent-binding site is appropriate, the hydrophilicity suitable for measuring a biological substance, The elution resistance of the reagent, the processability of the polymer, etc. can be obtained.
【００１１】また、カルボキシル基含有試薬が、酵素活
性物質および免疫活性物質から選ばれる上記試薬結合ポ
リマーによれば、これらには生体関連物質を測定する上
で極めて有用なものが含まれるので、バイオセンサーと
して広範な利用が可能となる。Further, according to the above-mentioned reagent-bonded polymer in which the carboxyl group-containing reagent is selected from enzyme active substances and immunological active substances, these include those extremely useful for measuring bio-related substances, It can be widely used as a sensor.
【００１２】また、上記試薬結合ポリマーを成膜してな
る試薬結合ポリマー膜、又は上記試薬結合ポリマーを液
体吸収性の別の担体に含浸させてなる試薬結合ポリマー
担持体によれば、該ポリマーの優れた加工性により、所
望により膜状や別担体に含浸させた形態とすることがで
きるので、種々の使用場面に対応できるセンサーを構成
することができる。Further, according to the reagent-bonded polymer film formed by forming the reagent-bonded polymer into a film, or the reagent-bonded polymer carrier obtained by impregnating the reagent-bonded polymer into another liquid-absorbent carrier, Due to its excellent processability, it can be formed into a film or a form in which it is impregnated into another carrier as desired, so that a sensor that can be used in various usage situations can be constructed.
【００１３】また、本発明は、上記の試薬結合ポリマー
を調製する方法であって、一般式（Ｉ）で表される構造
を有するハロゲン化アルキルスチレンと一般式（II）で
表されるアクリル酸類との共重合体を不溶性担体とし、
この共重合体の繰り返し単位中のＲ1に、（ａ）アンモ
ニアまたはジアミン類からなるスペーサーを結合させ末
端にアミノ基を導入し、次にＡ−ＣＯＯＨ（Ａは主要部
分）で表されるカルボキシル基含有試薬のカルボキシル
基と該アミノ基を結合させることにより式（III）で表
わされる試薬結合部を形成し、又は（ｂ）３級アミンを
結合させて４級化しこれをスペーサーとして、次に酵素
活性物質および免疫活性物質および／または酸塩基指示
薬から選択された試薬を付加することにより式（IV）で
表わされる試薬結合部を形成することを特徴とする試薬
結合ポリマー調製方法である。共重合体にアミノ基を導
入し酸アミド結合により試薬のカルボキシ基を結合させ
るので、試薬の結合を容易にかつ確実に行うことができ
る。酸アミド結合は、好ましくは、縮合試薬としてカル
ボジイミド試薬またはウッドワード試薬Ｋを用いて形成
されるものである。The present invention also relates to a method for preparing the above-mentioned reagent-bonded polymer, which comprises a halogenated alkylstyrene having a structure represented by the general formula (I) and an acrylic acid represented by the general formula (II). With a copolymer of as an insoluble carrier,
(A) A spacer composed of ammonia or a diamine is bonded to R 1 in the repeating unit of the copolymer to introduce an amino group at the terminal, and then a carboxyl group represented by A-COOH (A is a main part). A carboxyl group of the group-containing reagent is bound to the amino group to form a reagent binding part represented by the formula (III), or (b) a tertiary amine is bound to quaternize to form a spacer, A method for preparing a reagent-bound polymer, which comprises forming a reagent binding part represented by the formula (IV) by adding a reagent selected from an enzyme active substance and an immunoactive substance and / or an acid-base indicator. Since the amino group is introduced into the copolymer and the carboxy group of the reagent is bound by an acid amide bond, the reagent can be bound easily and reliably. The acid amide bond is preferably formed using a carbodiimide reagent or Woodward reagent K as a condensation reagent.
【００１４】また、スペーサー付担体ポリマーを有機溶
媒中に溶解し、これに試薬を添加し、溶媒中で該試薬を
スペーサーに結合させた後、成膜し又は別担体に含浸さ
せ試薬結合部を形成するか、またはスペーサー付担体ポ
リマーを成膜し又は別担体に含浸させた後、試薬含有溶
液中に浸漬することでスペーサーに該試薬を結合させ試
薬結合部を形成する請求項６記載の試薬結合ポリマー調
製方法によれば、多種類の試薬を定量的にかつ安定的に
膜または担体に担持させることができる。Further, a carrier polymer with a spacer is dissolved in an organic solvent, a reagent is added to this, the reagent is bound to the spacer in the solvent, and then a film is formed or impregnated into another carrier to form a reagent binding part. 7. The reagent according to claim 6, which is formed or after a carrier polymer with a spacer is formed into a film or impregnated into another carrier and then immersed in a reagent-containing solution to bind the reagent to the spacer to form a reagent binding part. According to the method for preparing a bound polymer, various kinds of reagents can be quantitatively and stably supported on a membrane or a carrier.
【００１５】以下、本発明を詳述する。The present invention will be described in detail below.
【００１６】本発明の試薬結合ポリマーは、所望の形状
に加工し得るポリマーに所望の試薬を直接固定化してい
るので、試薬と計測対象物質との反応速度が格段に速
く、迅速な計測を実現できる。又、本発明に係る担体ポ
リマーは加工性に極めて優れている。該ポリマーの構造
自体は公知であるが、種々の試薬を確実に固定し、目的
とするセンサー素子を設計の範囲内で安定的に作製でき
るということは従来技術からすれば予想し得ない驚くべ
きことである。更に、従来の技術は、ポリマー上に１種
の試薬のみ一定の条件下で固定できるにすぎなかった
が、本発明では複数の試薬を所定の量比で容易に固定で
き多機能性を実現できる。このような特徴を有する試薬
結合ポリマーは、オプトロード利用のバイオセンサー素
子あるいはより構造的に単純で簡易測定可能な試験片の
形態として好適である。更に、該特徴を有効に利用し、
試薬として適当なものを選定することで、他の用途にも
適用することは可能である。例えば、タンパク質の分
離、精製等に用いる免疫成分等の固定や、各種クロマト
グラフィー用の担体等である。In the reagent-bonded polymer of the present invention, a desired reagent is directly immobilized on a polymer that can be processed into a desired shape, so that the reaction rate between the reagent and the substance to be measured is remarkably high and quick measurement can be realized. it can. Further, the carrier polymer according to the present invention is extremely excellent in processability. Although the structure of the polymer itself is known, it is unexpected from the prior art that various kinds of reagents can be reliably immobilized and the target sensor element can be stably produced within the design range. That is. Further, according to the conventional technique, only one kind of reagent can be immobilized on a polymer under a certain condition, but in the present invention, a plurality of reagents can be easily immobilized at a predetermined amount ratio, and multi-functionality can be realized. . The reagent-bound polymer having such characteristics is suitable as a biosensor element using optrode or a test piece which is structurally simple and can be easily measured. Furthermore, by effectively utilizing the feature,
By selecting an appropriate reagent as a reagent, it can be applied to other uses. For example, it is a carrier for immobilization of immune components used for protein separation and purification, and a carrier for various chromatography.
【００１７】本発明に係る担体ポリマーは一般式（Ｉ）
で表わされるハロゲン化アルキルスチレンと一般式（I
I）で表わされるアクリル酸類との共重合体からなる。
ここにアクリル酸類とはメタクリル酸誘導体等も含む概
念である。式中Ｒ1 はパラ、メタ、オルトの各位置で結
合することができるが、好ましくはパラ位である。共重
合体を形成した後、試薬を固定する際に構造障害等によ
る影響が少ないからである。The carrier polymer according to the present invention has the general formula (I)
With a halogenated alkylstyrene represented by the general formula (I
It consists of a copolymer with acrylic acid represented by I).
Here, acrylic acid is a concept including methacrylic acid derivatives and the like. In the formula, R 1 can be bonded at each position of para, meta and ortho, but is preferably at the para position. This is because, when the reagent is fixed after the copolymer is formed, the influence of structural obstacles is small.
【００１８】ハロゲン化アルキルスチレンのＲ1 として
は、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラ
メチレン基、プロピレン基等の枝分れしていてもよい炭
素数１〜４のアルキレン基がよい。炭素数は比較的小さ
いものの方が重合反応の反応性が高く、又この部分が試
薬結合部位となるので炭素数は比較的小さいものの方が
反応の効率がよい。反応の容易性、実用性等の点からメ
チレン基が好ましい。Ｒ1 にはハロゲン原子Ｘが置換さ
れている。ＸとしてはＣｌ，Ｂｒ，Ｉ等がよい。反応性
が高いのはＣｌである。Ｒ1 上のハロゲン置換位置は特
に限定されない。又Ｒ1 上のハロゲン原子は１つが基本
であるが、Ｒ1 によっては複数のハロゲン原子が置換さ
れていてもよい。R 1 of the halogenated alkylstyrene is preferably an optionally branched alkylene group having 1 to 4 carbon atoms such as methylene group, ethylene group, trimethylene group, tetramethylene group and propylene group. A polymer having a relatively small number of carbons has a higher reactivity in the polymerization reaction, and this portion serves as a reagent binding site. Therefore, a polymer having a relatively small number of carbons has a higher reaction efficiency. A methylene group is preferable from the viewpoint of easiness of reaction and practicality. A halogen atom X is substituted on R 1 . As X, Cl, Br, I or the like is preferable. Cl is highly reactive. The halogen substitution position on R 1 is not particularly limited. Although one halogen atom on R 1 is basically used, a plurality of halogen atoms may be substituted depending on R 1 .
【００１９】ハロゲン化アルキルスチレンの代表例とし
ては、ｐ−クロロメチルスチレン、ｍ−クロロメチルス
チレン、ｏ−クロロメチルスチレン等を挙げることがで
きる。 アクリル酸類のＲ2 及びＲ3 は同一でも異なっ
ていてもよく、それぞれ独立に水素原子、又はエチル
基、メチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル
基、イソブチル基、sec −ブチル基、tert−ブチル基等
の炭素数１〜４のアルキル基がよい。ハロゲン化アルキ
ルスチレンとの共重合反応の容易さの点で、Ｒ2 は水素
原子、メチル基が好ましく、又、Ｒ3 も反応性に影響す
るのでメチル基が好ましく、従って適当なアクリル酸類
としてはアクリル酸エステルやメタクリル酸エステル等
を挙げることができる。メタクリル酸メチルを用いた共
重合体は一般に光線透過性が高く試薬担持ポリマー用の
モノマーとして好ましい。又、Ｒ2 ，Ｒ3 により共重合
反応における重合体の成長に相違を生じ、得られる共重
合体の組成が異なる場合がある。例えば、アクリル酸メ
チルとメタクリル酸メチルでは、重合温度が同じであれ
ば、メタクリル酸メチルを用いた方がハロゲン化アルキ
ルスチレンとの成長反応が同調しやすく、従って配合モ
ル比により組成を制御しやすい。Typical examples of the halogenated alkylstyrene include p-chloromethylstyrene, m-chloromethylstyrene, o-chloromethylstyrene and the like. R 2 and R 3 of the acrylic acid may be the same or different and each independently represents a hydrogen atom, or an ethyl group, a methyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, an isobutyl group, a sec-butyl group, a tert-butyl group. An alkyl group having 1 to 4 carbon atoms such as a group is preferable. From the viewpoint of ease of copolymerization reaction with halogenated alkylstyrene, R 2 is preferably a hydrogen atom or a methyl group, and R 3 is also preferably a methyl group because it affects the reactivity. Therefore, suitable acrylic acids are Acrylic acid ester, methacrylic acid ester, etc. can be mentioned. A copolymer using methyl methacrylate generally has high light transmittance and is preferable as a monomer for a reagent-supporting polymer. Further, R 2 and R 3 may cause a difference in the growth of the polymer in the copolymerization reaction, and the composition of the obtained copolymer may be different. For example, if the polymerization temperatures of methyl acrylate and methyl methacrylate are the same, it is easier to synchronize the growth reaction with halogenated alkylstyrene when methyl methacrylate is used, and thus it is easier to control the composition by the blending molar ratio. .
【００２０】本発明に用い得るアクリル酸類の代表例と
しては、アクリル酸、アクリル酸メチル、アクリル酸エ
チル、アクリル酸イソブチルなどのアクリル酸誘導体、
メタクリル酸、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチ
ル、メタクリル酸イソブチルなどのメタクリル酸誘導体
等を挙げることができる。Typical examples of acrylic acids that can be used in the present invention include acrylic acid, acrylic acid derivatives such as methyl acrylate, ethyl acrylate and isobutyl acrylate,
Methacrylic acid, methyl methacrylate, ethyl methacrylate, methacrylic acid derivatives such as isobutyl methacrylate and the like can be mentioned.
【００２１】共重合体としては、上記ハロゲン化アルキ
ルスチレン及びアクリル酸誘導体のそれぞれの１種以上
を含有することができる。多種類の混合系として共重合
体を形成してもよい。The copolymer may contain one or more of each of the above halogenated alkylstyrene and acrylic acid derivative. The copolymer may be formed as a mixed system of many kinds.
【００２２】重合反応におけるハロゲン化アルキルスチ
レンモノマーとアクリル酸類モノマーとのモル比は目的
とする試薬結合ポリマーの用途等により適宜設定すれば
よい。原則的には前者のモル比が増加すると、スペーサ
ーを導入したときにポリマーの親水化傾向が強くなり水
溶性成分との親和性が高くなり、生体関連物質等の測定
感度を向上させ得るが、測定時に溶出する可能性があ
り、臨床検査分野においては、安全性等が問題となるこ
とがある。又、試薬成分は前者のＲ1 の部位に結合され
るため、このモル比が増えればポリマー中の試薬濃度を
増加できるので、一般に好ましいが、前述のように溶出
の可能性があり、ポリマー組成にはアクリル酸類の存在
が不可欠である。しかし、アクリル酸類モノマーのモル
比が増加すると疎水化傾向が強くなり、被検体とのぬれ
性が低下し、測定感度が劣化する可能性がある。又、こ
のものは試薬結合部位を持たないので、このモル比が増
えれば試薬濃度が下がるので、測定感度は低下する。更
に、ハロゲン化アルキルスチレンモノマーモル比が増加
すると、特にスペーサーを用いて試薬を固定する場合
は、スペーサーの種類によっては増粘化を起しその後に
行う成膜化処理、試薬固定化処理等に支障をきたすこと
がある。従って、好ましくはハロゲン化アルキルスチレ
ンモノマーとアクリル酸類モノマーとのモル比は３：１
〜１：３である。更に好ましくは２：１〜１：２であ
る。仕込みのモル比がそのまま共重合体の組成とかなら
ずしも一致しないので、通常は各モノマーの反応性の幅
を考慮して、１：１のモル比で重合反応させるのは実用
的である。前述したように、例えばアクリル酸メチルは
メタクリル酸メチルよりも反応性が若干低く、同一条件
下でハロゲン化アルキルスチレンと共重合させれば、繰
り返し単位中に入り込む率が比較的低くなる。The molar ratio of the halogenated alkylstyrene monomer to the acrylic acid monomer in the polymerization reaction may be appropriately set depending on the intended use of the reagent-bound polymer. In principle, if the former molar ratio is increased, the hydrophilicity of the polymer becomes stronger when the spacer is introduced, the affinity with the water-soluble component becomes higher, and the measurement sensitivity of biologically relevant substances can be improved. Elution may occur during measurement, and safety may be a problem in the field of clinical testing. In addition, since the reagent component is bonded to the former R 1 site, increasing the molar ratio can increase the reagent concentration in the polymer, which is generally preferable. The presence of acrylic acids is essential for this. However, as the molar ratio of acrylic acid monomers increases, the tendency to become hydrophobic becomes stronger, the wettability with the analyte decreases, and the measurement sensitivity may deteriorate. Further, since this compound has no reagent binding site, the reagent concentration decreases as the molar ratio increases, and the measurement sensitivity decreases. Further, when the halogenated alkylstyrene monomer molar ratio increases, particularly when a reagent is fixed by using a spacer, depending on the type of the spacer, the viscosity may be increased and the film forming treatment or reagent fixing treatment to be performed thereafter may be performed. May cause problems. Therefore, the molar ratio of halogenated alkylstyrene monomer to acrylic acid monomer is preferably 3: 1.
~ 1: 3. More preferably, it is 2: 1 to 1: 2. Since the charged molar ratio does not always match the composition of the copolymer as it is, it is usually practical to carry out the polymerization reaction at a molar ratio of 1: 1 in consideration of the range of reactivity of each monomer. As described above, for example, methyl acrylate is slightly less reactive than methyl methacrylate, and when it is copolymerized with a halogenated alkylstyrene under the same conditions, the rate of penetration into the repeating unit becomes relatively low.
【００２３】各モノマーの共重合反応は、一般的な重合
体の製造方法で行うことが出来るが、重合開始剤として
は、過酸化物やアゾ化合物のような非イオン性型の物が
用いられ、特に、過酸化水素、ｔ−ブチルヒドロペルオ
キシド、アゾビスイソブチロニトリルが好ましい。反応
時の温度は２５〜１００℃で行われるが、好ましくは、
５０〜８０℃程度が用いられる。反応時間も特に制限は
ないが、一般的には３〜４８時間が適当である。反応は
通常、不活性雰囲気中で行う。The copolymerization reaction of each monomer can be carried out by a general method for producing a polymer, but as the polymerization initiator, a nonionic type such as a peroxide or an azo compound is used. Particularly preferred are hydrogen peroxide, t-butyl hydroperoxide and azobisisobutyronitrile. The reaction temperature is 25 to 100 ° C., preferably
A temperature of about 50 to 80 ° C is used. The reaction time is not particularly limited, but generally 3 to 48 hours is suitable. The reaction is usually performed in an inert atmosphere.
【００２４】得られた担体ポリマーは重合度にさほど影
響されず、試薬結合不溶性担体として機能する。次に、
Ｒ1 に必要により適当なスペーサーを用いて試薬を結合
させる。The carrier polymer obtained is not significantly affected by the degree of polymerization and functions as a reagent-bonded insoluble carrier. next,
A reagent is attached to R 1 using an appropriate spacer if necessary.
【００２５】本担体ポリマーに結合する試薬は、その結
合態様により２つに分類される。一方は、スペーサーと
して３級アミン類を用いて４級化したものに静電的に結
合するものであり、他方は、アミノ基を持つスペーサー
を介して化学的結合により結合するものである。前出の
特開平４−３３０２９８号公報では、静電的結合は専ら
酸塩基指示薬を対象とし、それ以外の試薬については全
く未知であったが、本発明者らは酵素活性物質や免疫活
性物質等も静電的結合により４級アンモニウム化合物に
結合し得ることを見出した。この結合は驚く程に強固で
安定しておりバイオセンサーとして充分なものであっ
た。化学的に結合するものはカルボキシル基含有試薬で
あり、酸アミド結合によりアミノ基末端を有するスペー
サーと結合する。試薬のアミノ基を利用し、カルボニル
基末端を有するスペーサーに結合する前出公報の結合で
は活性や安定性が損なわれる試薬でも、カルボキシル基
により的確に固定できる。たとえばアミノ基を活性中心
に持つ酵素、アミノ基側を抗原結合領域としている抗体
等、アミノ基を介する化学的結合に不向きな成分もカル
ボキシル基を利用して結合することが可能となる。また
本発明では反応の段階数が少ないため、固定化に要する
時間を短縮できる有利な効果がある。Reagents that bind to the carrier polymer are classified into two types depending on the binding mode. One is electrostatically bound to a quaternized one using tertiary amines as a spacer, and the other is chemically bound via a spacer having an amino group. In the above-mentioned Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-330298, the electrostatic bond is targeted only at the acid-base indicator, and the other reagents are completely unknown, but the present inventors have found that the enzyme active substance and the immunoactive substance are used. Have also been found to be capable of binding to quaternary ammonium compounds by electrostatic binding. This bond was surprisingly strong and stable enough for a biosensor. What is chemically bound is a carboxyl group-containing reagent, which binds to a spacer having an amino group terminal by an acid amide bond. Even a reagent whose activity and stability are impaired by the binding of the above-mentioned publication in which the amino group of the reagent is used to bind to a spacer having a carbonyl group terminal can be more accurately fixed to the carboxyl group. For example, a component not suitable for a chemical bond via an amino group, such as an enzyme having an amino group as an active center and an antibody having an amino group as an antigen-binding region, can be bonded using the carboxyl group. Further, in the present invention, since the number of reaction steps is small, there is an advantageous effect that the time required for immobilization can be shortened.
【００２６】共通の担体ポリマーを用いて異なる性質を
持つ試薬をそれぞれ固定できるという大きな利点は、そ
れぞれ別個に担体ポリマーに固定した後、それぞれのポ
リマーを容易に混合し一体化することを可能とする。担
体ポリマーが共通しているため均一に結合できるので、
試薬の固定後は混合操作においても解離しない。また、
スペーサー付き担体ポリマーを成膜加工又は別担体へ含
浸させ素子の形態にした後に、複数種の試薬溶液に順次
浸漬するだけでそれぞれの試薬をポリマーに安定に固定
できるという操作上の大きな利点がある。また、各成分
のポリマーへの結合性が同じレベルであれば各成分を単
一の操作で担体ポリマーに固定してもよい。このよう
に、色素と酵素、複数の色素と複数の酵素、複数の蛍光
塗料等、測定に必要な全ての試薬成分が均一に分散した
機能性膜を形成できるので、測定に際して他の成分を加
える必要がない。これは、センサーとして極めて有効な
特徴であり、従来技術ではけっして実現できなかったも
のである。The great advantage of being able to immobilize reagents having different properties to each other using a common carrier polymer makes it possible to easily mix and integrate the respective polymers after immobilizing them separately to the carrier polymer. . Since the carrier polymer is common, it can be bonded uniformly,
After fixing the reagent, it does not dissociate even in the mixing operation. Also,
There is a great operational advantage that each reagent can be stably immobilized on the polymer simply by sequentially dipping it into a plurality of types of reagent solutions after forming a device by forming a carrier polymer with spacers or impregnating another carrier into another device. . Further, each component may be fixed to the carrier polymer by a single operation as long as the binding property of each component to the polymer is at the same level. In this way, it is possible to form a functional film in which all reagent components necessary for measurement, such as dyes and enzymes, multiple dyes and multiple enzymes, and multiple fluorescent paints, are uniformly dispersed, so add other components during measurement. No need. This is an extremely effective feature as a sensor, which cannot be realized by the conventional technology.
【００２７】本発明では、上記化学的結合によるカルボ
キシル基含有試薬や静電的結合による酵素活性物質や免
疫活性物質の結合の加えて、かかる担体ポリマーと同一
ポリマーを用いる前出特開平４−３３０２９７８号公報
で教示されているアミノ基含有試薬をスペーサーを用い
て化学的に結合させたり、酸塩基指示薬を４級アンモニ
ウム化合物を用いて静電的に結合させることができ、多
機能性膜を形成することができる。In the present invention, the same polymer as the carrier polymer is used in addition to the binding of the carboxyl group-containing reagent by the chemical bond and the binding of the enzyme active substance or the immunoactive substance by the electrostatic bond as described above. The amino group-containing reagent taught in the publication can be chemically bound using a spacer, and the acid-base indicator can be electrostatically bound using a quaternary ammonium compound to form a multifunctional film. can do.
【００２８】次に、試薬の第１の結合態様である化学的
結合に基づく試薬の結合について説明する。用いること
のできる試薬はＡ−ＣＯＯＨ（Ａは主要成分）で示され
るカルボキシル基含有試薬である。即ち、カルボキシル
基を介してＲ1 に付加されたスペーサーと結合できるも
のであり、基本的にカルボキシル基を有する試薬であれ
ばいずれも結合でき、酵素活性物質や免疫活性物質、生
理活性物質、色原体、緩衝剤物質等が包含される。Next, the reagent binding based on the chemical bond which is the first binding mode of the reagent will be described. A reagent that can be used is a carboxyl group-containing reagent represented by A-COOH (A is a main component). That is, it can bind to a spacer added to R 1 via a carboxyl group, and basically any reagent having a carboxyl group can bind to it, and thus it can bind to an enzyme active substance, an immunologically active substance, a physiologically active substance, and a color. Included are drug substances, buffer substances and the like.
【００２９】具体的には酵素としてはグルコースオキシ
ダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダー
ゼ、アルカリフォスファターゼ等、免疫活性物質として
は、抗体やその断片、抗原、ハプテン類等が挙げられ
る。上記、試薬において、特開平４−３３０２９８号公
報に挙げたアミノ基含有試薬である酵素活性物質や免疫
活性物質等と共通するものは、即ちカルボキシル基とア
ミノ基の両者を有する試薬では、上記公報に記載された
技術又は本発明のいずれによってもポリマーに結合させ
ることができる。しかし、カルボキシル基を利用し結合
させる本発明では、スペーサーをポリマーに結合させる
反応段階数が少なく、またスペーサーであるアミノ基と
試薬のカルボキシル基が直接結合するので、固定化され
る試薬量の制御が簡単な他、固定化量も多くすることが
できる。また、アミノ基を含有せず、カルボキシル基を
含有する試薬、例えば脂肪酸、胆汁酸等においては、本
発明の方法によらなければ容易にかつ安定にポリマーに
結合させることができない。これらの試薬をＲ1 に結合
させたものは下記式（III）で表わされる。Specifically, examples of the enzyme include glucose oxidase, cholesterol oxidase, peroxidase, alkaline phosphatase and the like, and examples of the immunologically active substance include antibodies and fragments thereof, antigens and haptens. Among the above-mentioned reagents, those common to the amino group-containing reagents such as enzyme active substances and immunologically active substances described in JP-A-4-330298, that is, reagents having both a carboxyl group and an amino group, It can be attached to the polymer by any of the techniques described in 1. or the present invention. However, in the present invention in which a carboxyl group is used for binding, the number of reaction steps for binding the spacer to the polymer is small, and since the spacer amino group and the carboxyl group of the reagent are directly bound, the amount of immobilized reagent can be controlled. In addition to being simple, the amount of immobilization can be increased. In addition, reagents containing no amino group but carboxyl group, such as fatty acids and bile acids, cannot be easily and stably bound to the polymer by the method of the present invention. The one in which these reagents are bound to R 1 is represented by the following formula (III).
【００３０】 −Ｒ1 −Ｓｐ −ＣＯ−Ａ （III） （式中、Ｒ1 は一般式（Ｉ）と同じ意味、Ｓｐ はアン
モニアあるいはジアミン類からなるスペーサー構造を示
す。） 試薬Ａ−ＣＯＯＨはスペーサー構造を介し化学的結合で
担体ポリマーに結合する。このスペーサー構造はアンモ
ニア又はジアミン類からなり、これをＲ1に結合させる
ことで末端にアミノ基を有するスペーサー付き担体ポリ
マーとする。このアミノ基と試薬のカルボキシル基を結
合させて一種の酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を形成
し結果的に担体ポリマーに試薬を固定することができ
る。—R 1 —Sp —CO—A (III) (In the formula, R 1 has the same meaning as in formula (I), Sp represents a spacer structure composed of ammonia or diamines.) Reagent A-COOH is It is chemically bonded to the carrier polymer through the spacer structure. This spacer structure is composed of ammonia or a diamine, and is bound to R 1 to form a carrier polymer with a spacer having an amino group at the terminal. The amino group and the carboxyl group of the reagent are bonded to each other to form a kind of acid amide bond (-CO-NH-), and as a result, the reagent can be immobilized on the carrier polymer.
【００３１】この反応は、一般にぺプチド合成に使用さ
れているカルボジイミド試薬やウッドワード試薬Ｋ等の
ような縮合試薬を利用して、アミノ基とカルボキシル基
との間の結合を行うものである。具体的には、カルボジ
イミド試薬としては、ジシクロヘキシルカルポジイミ
ド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロビル）
カルボジイミド、１−シクロヘキシル−３−（２−モル
ホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスル
ホネ−ト等があり、ウッドワード試薬Ｋ（Ｎ−エチルー
Ｓ−フェニルイソオキサゾリウム−３’−スルホネー
ト）、あるいはＮ−エトキシカルボニル−２−エトキシ
−１，２−ジヒドロキノリン等が使用できる。 前出特
開平４−３３０２９８号公報では、第１段階として第一
のアミノ基含有スペーサーのアミノ基を利用してＲ1 に
該スペーサーを結合させ、次の第２段階で、該スペーサ
ーのアミノ基と別の第２のカルボニル基含有スペーサー
のカルボニル基を結合させ、このカルボニル基を利用し
て試薬のアミノ基を結合させ、結果的に担体ポリマーに
試薬を固定する方法を採用していたが、この方法ではス
ペーサーが２種類必要でありかつ構造が本発明によるス
ペーサーに比べ複雑なため、スペーサーの導入が本発明
のものに比較して容易でなく、また試薬固定化量も劣
る。This reaction utilizes a condensation reagent such as a carbodiimide reagent or Woodward reagent K, which is generally used for peptide synthesis, to bond the amino group and the carboxyl group. Specifically, as a carbodiimide reagent, dicyclohexylcarbodiimide, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)
There are carbodiimide, 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinoethyl) carbodiimide meth-p-toluene sulfonate, Woodward reagent K (N-ethyl-S-phenylisoxazolium-3'-sulfonate), Alternatively, N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline or the like can be used. In the above-mentioned JP-A-4-330298, in the first step, the amino group of the first amino group-containing spacer is used to bind the spacer to R 1 , and in the next second step, the amino group of the spacer is attached. And a second carbonyl group-containing spacer carbonyl group is bonded, and the amino group of the reagent is bonded using this carbonyl group, resulting in the method of fixing the reagent to the carrier polymer. In this method, two kinds of spacers are required and the structure is more complicated than that of the spacer according to the present invention, so introduction of the spacer is not easy as compared with that of the present invention, and the amount of immobilized reagent is also inferior.
【００３２】スペーサーとしては、アンモニアや、エチ
レンジアミン、テトラメチレンジアミン、ヘキサメチレ
ンジアミン等のジアミン類を用いることができる。As the spacer, ammonia and diamines such as ethylenediamine, tetramethylenediamine and hexamethylenediamine can be used.
【００３３】次に、試薬の第２の結合態様である静電的
結合のものについて説明する。静電的結合でポリマーに
結合させる試薬は、酵素活性物質および免疫活性物質お
よび／または酸塩基指示薬から選ばれる試薬である。特
開平４−３３０２９７８号公報では酸塩基指示薬のみし
か具体的に明示されていなかったが、酵素活性物質や免
疫活性物質も静電的結合により安定にポリマーに結合で
きることが本発明者らによって見出された。これにより
静電的結合のみで、即ち単一のポリマー担体を用いて酸
塩基指示薬と酵素活性物質等を共に結合させ機能性膜を
構成することが可能となる。Next, a description will be given of the second binding mode of reagents, that is, electrostatic binding. The reagent that is electrostatically bound to the polymer is a reagent selected from enzyme active substances and immunoactive substances and / or acid-base indicators. In JP-A-4-3302978, only the acid-base indicator was specifically specified, but the present inventors have found that enzymatically active substances and immunologically active substances can also be stably bound to the polymer by electrostatic binding. Was done. This makes it possible to form a functional membrane by electrostatic binding alone, that is, by binding a acid-base indicator and an enzyme active substance together using a single polymer carrier.
【００３４】ここで驚くべきことは、上記例で示された
静電的結合による試薬は共通の反応性官能基等を有する
わけではないにもかかわらず、これらをいずれも静電的
に担体ポリマー上に固定できることである。即ち、４級
アンモニウム化合物に配位しやすいような官能基を有し
ていれば、官能基の種類やそれが有する電荷の大きさ、
水可溶性か水難溶性か、更に変色域によらず担持でき
る。静電的結合により、即ち同一スペーサーで色原体と
酵素活性物質等を担持させることができるので、ポリマ
ーの合成、試薬の結合、成膜加工等が極めて容易とな
る。What is surprising here is that even though the reagents by electrostatic coupling shown in the above examples do not have a common reactive functional group or the like, they are both electrostatically carrier polymer. It can be fixed on top. That is, if it has a functional group capable of easily coordinating to a quaternary ammonium compound, the kind of the functional group and the magnitude of the charge that it has,
It can be supported regardless of whether it is water-soluble or water-insoluble. Since the chromogen and the enzyme active substance can be supported by the electrostatic bond, that is, with the same spacer, the synthesis of the polymer, the bonding of the reagent, the film forming process, etc. are extremely easy.
【００３５】静電的に結合できる酵素活性物質として
は、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリ
カーゼ等を挙げることができる。また、同じく免疫活性
物質としては、抗体やその断片、抗原、ハプテン類等を
挙げることができる。Examples of the enzyme active substance that can be electrostatically bound include glucose oxidase, peroxidase, uricase and the like. Similarly, examples of the immunologically active substance include antibodies, fragments thereof, antigens, haptens, and the like.
【００３６】かかる酵素活性物質の中で、カルボキシル
基を含有するものは前述した第１の結合態様である化学
的結合によってもポリマーに結合することができ、また
アミノ基を含有するものは前出特開平４−３３０２９７
８号公報に基づいてポリマーに結合することもできる
が、静電的結合の場合は、操作が簡単でその結合条件も
穏やかため、化学結合に比べて活性中心への影響が少な
く、比較的高い残存活性が得られるという利点がある。
担持を目的とする酵素活性物質の性質により、静電的結
合、化学的結合のいずれか適する方を選択でき、更に化
学的結合の場合は、カルボキシル基の結合かアミノ基の
結合かを選択できる。Among such enzymatically active substances, those containing a carboxyl group can be bound to the polymer by the chemical bond which is the first binding mode described above, and those containing an amino group are the same as those mentioned above. JP-A-4-330297
Although it can be bound to a polymer based on the publication No. 8, in the case of electrostatic binding, the operation is simple and the binding conditions are mild, so there is less influence on the active center compared to chemical binding, and it is relatively high. There is an advantage that residual activity can be obtained.
Depending on the nature of the enzyme active substance intended to be supported, electrostatic bond or chemical bond can be selected as appropriate, and in the case of chemical bond, carboxyl group bond or amino group bond can be selected. .
【００３７】酸塩基指示薬は特開平４−３３０２９７８
号公報に挙げたものを用いることができる。即ち、水素
イオン濃度の変化に伴い変色する試薬であり、本発明で
はその変色域にかかわらずに用いることができる。即
ち、酸性指示薬及び塩基性指示薬の両者を用い得る。The acid-base indicator is disclosed in JP-A-4-3302978.
The materials listed in the publication can be used. That is, it is a reagent that changes color with changes in hydrogen ion concentration, and can be used in the present invention regardless of the color change range. That is, both acidic and basic indicators can be used.
【００３８】フタレイン系指示薬、スルホンフタレイン
系指示薬、ベンゼン系指示薬、アゾ系指示薬、トリフェ
ニルメタン系指示薬、ニトロ系指示薬等を例示できる。
具体的には、チモールブルー、ブロムチモールブルー、
フェノールレッド、クレゾールレッド、フェノールフタ
レイン、クロロフェノールレッド、ブロムフェノールレ
ッド、ブロムクレゾールグリーン、３，４，６，８−テ
トラブロムフェノールスルホンフタレイン、メチルオレ
ンジ、メチルレッド等が挙げられる。Examples thereof include phthalein type indicators, sulfonephthalein type indicators, benzene type indicators, azo type indicators, triphenylmethane type indicators, nitro type indicators and the like.
Specifically, thymol blue, bromthymol blue,
Phenol red, cresol red, phenolphthalein, chlorophenol red, bromphenol red, bromcresol green, 3,4,6,8-tetrabromophenolsulfonephthalein, methyl orange, methyl red and the like can be mentioned.
【００３９】ここで、静電的に結合するとは、広く静電
的作用を利用してＲ1 に結合している４級アンモニウム
化合物と結合することをいい、単にイオン結合や 配位
結合による結合様式を意味しない。試薬結合部は一般に
次の式（IV）で示される。The term "electrostatic bond" as used herein means to bond with a quaternary ammonium compound bonded to R 1 by widely utilizing electrostatic action, and is simply a bond by an ionic bond or a coordinate bond. Does not mean style. The reagent binding part is generally represented by the following formula (IV).
【００４０】[0040]
【化７】 （式中、Ｒ1 及びＸは一般式（Ｉ）と同じ意味、Ｒ4 ，
Ｒ5 及びＲ6 はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜４
のアルキル基、又は炭素数１〜４のヒドロキシアルキル
基、Ｂ±は正又は負にチャージした試薬成分、…は静電
的結合を示す。） 式中Ｘは担体ポリマー由来のものである。４級アンモニ
ウム化合物の導入は例えば担体ポリマーをアセトン等に
溶解しこれに３級アミンを加え室温で１〜４８時間程度
反応させればよく、公知技術に基づいて実施できるもの
である。即ち、担体ポリマーを３級アミン等で処理する
と、３級アミンがＲ1 と反応して共有結合するとともに
４級化し４級アンモニウム化合物として導入される。こ
れが試薬結合のスペーサーとなる。スペーサー部分はカ
チオン性を示し、この構造は強塩基性陰イオン交換樹脂
と同じであり、実際に、４級アンモニウム化合物を導入
した担体ポリマーは陰イオン交換樹脂として機能し得
る。[Chemical 7] (In the formulae, R 1 and X have the same meanings as in formula (I), R 4 ,
R 5 and R 6 are each independently a hydrogen atom or a carbon number of 1 to 4
Represents a hydroxyalkyl group having 1 to 4 carbon atoms, B ± represents a positively or negatively charged reagent component, ... Represents an electrostatic bond. ) In the formula, X is derived from a carrier polymer. The quaternary ammonium compound may be introduced by, for example, dissolving a carrier polymer in acetone or the like, adding a tertiary amine thereto, and reacting the mixture at room temperature for about 1 to 48 hours, which can be carried out based on a known technique. That is, when the carrier polymer is treated with a tertiary amine or the like, the tertiary amine reacts with R 1 to covalently bond, quaternize, and is introduced as a quaternary ammonium compound. This serves as a spacer for reagent binding. The spacer portion exhibits cationicity, and its structure is the same as that of the strongly basic anion exchange resin. In fact, the carrier polymer having the quaternary ammonium compound introduced therein can function as the anion exchange resin.
【００４１】この方法の他にも、ハロゲン化アルキルス
チレンにまず４級アンモニウム化合物を導入し、これを
アクリル酸誘導体と共重合させてスペーサーを結合させ
た担体ポリマーを得ることもできる。In addition to this method, it is also possible to first introduce a quaternary ammonium compound into a halogenated alkylstyrene and copolymerize this with an acrylic acid derivative to obtain a carrier polymer having a spacer bonded thereto.
【００４２】前記式中、Ｒ4 ，Ｒ5 ，Ｒ6 はそれぞれ同
一又は異なるものであり、独立に、水素原子、メチル
基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル
基、イソブチル基、sec −ブチル基、tert−ブチル基等
の炭素数１〜４のアルキル基、またはヒドロキシメチル
基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒド
ロキシブチル基等の炭素数１〜４のヒドロキシアルキル
基を示す。実用的で好ましいものとしては、メチル基、
エチル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基
等、炭素数の比較的小さいものが反応性が高いのでよ
い。具体的には、トリメチルアミン、トリエチルアミ
ン、ｎ−プロピルジメチルアミン、メチルエチル−ｎ−
ブチルアミン、トリ−ｎ−ブチルアミン、ジメチルエタ
ノールアミン、ジエチルエタノールアミン等の３級アミ
ン類を用い得る。In the above formula, R 4 , R 5 and R 6 are the same or different and are independently hydrogen atom, methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, butyl group, isobutyl group, sec- It represents an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms such as butyl group and tert-butyl group, or a hydroxyalkyl group having 1 to 4 carbon atoms such as hydroxymethyl group, hydroxyethyl group, hydroxypropyl group and hydroxybutyl group. As a practical and preferable one, a methyl group,
Those having a relatively small number of carbon atoms such as an ethyl group, a hydroxymethyl group and a hydroxyethyl group are preferable because they have high reactivity. Specifically, trimethylamine, triethylamine, n-propyldimethylamine, methylethyl-n-
Tertiary amines such as butylamine, tri-n-butylamine, dimethylethanolamine and diethylethanolamine can be used.
【００４３】試薬をスペーサー付担体ポリマーに結合さ
せるには、（イ）スペーサー付担体ポリマーを有機溶媒
中に溶解し、これに試薬を添加し、溶媒中で試薬をスペ
ーサーに結合させた後、所定の形態に成形する方法、
（ロ）スペーサー付担体ポリマーを所定の形態に成形し
た後、試薬含有溶液中に浸漬することでスペーサーに試
薬を結合させる方法に大別できる。いずれも簡単な操作
で分析に必要な試薬を固定化できる利点を有するほか、
特別な雰囲気や高温条件を必要とせずに温和な条件のも
とで固定化できる。酵素、生理活性物質や色原体のよう
に、スペーサー付き担体ポリマーに固定する際、反応温
度を充分低くし、試薬自体が変質等の変化を受けないよ
うにする必要がある試薬を、例えば５℃前後の低温度で
も迅速に試薬を固定化でき、試薬の種類により適宜調整
することができる。分析に必要な試薬はスペーサーを介
して強固に結合しているため、測定時の溶出などは全く
見られない。複数の試薬をポリマー中に固定するには
（ｉ）それぞれの試薬を個別にポリマーに固定し、それ
らを合せて後、所定の形態に成形する方法、（ii）全試
薬の混合物を一度にポリマーに固定してから成膜する方
法、（iii）ポリマーを所定の形態に成形した後、それ
ぞれの試薬液に順次浸漬し固定化する方法がある。試薬
の量の制御、安定性という観点からは上記（ｉ）又は
（iii）が好ましい。これらの方法により、スペーサー
を適宜選定すれば化学的結合、静電的結合の別なくポリ
マーに取込むことができ、また同一スペーサーの付加し
たポリマー中にも複数の試薬を容易にかつ安定に結合さ
せることができるので、極めて多様な機能性素子を形成
することができる。In order to bind the reagent to the carrier polymer with a spacer, (a) the carrier polymer with a spacer is dissolved in an organic solvent, the reagent is added to this, and the reagent is bound to the spacer in the solvent, and then predetermined. A method of molding in the form of
(B) The method can be roughly classified into a method in which the carrier polymer with a spacer is molded into a predetermined shape and then immersed in a reagent-containing solution to bond the reagent to the spacer. All have the advantage of being able to immobilize the reagents required for analysis with simple operations.
It can be immobilized under mild conditions without the need for special atmosphere or high temperature conditions. Reagents such as enzymes, physiologically active substances and chromogens that require a sufficiently low reaction temperature when immobilized on a carrier polymer with a spacer so that the reagents themselves do not undergo alterations such as alteration, such as 5 The reagent can be rapidly immobilized even at a low temperature of around 0 ° C, and can be appropriately adjusted depending on the type of the reagent. Since the reagents necessary for the analysis are firmly bound via the spacer, no elution at the time of measurement is observed. To immobilize a plurality of reagents in a polymer, (i) immobilize each reagent individually on the polymer, combine them, and then mold into a predetermined form, (ii) mix a mixture of all reagents at once There is a method in which the polymer is fixed to the substrate and then a film is formed, and (iii) a polymer is molded into a predetermined form and then sequentially immersed in each reagent solution to be immobilized. From the viewpoint of controlling the amount of the reagent and stability, the above (i) or (iii) is preferable. According to these methods, if a spacer is appropriately selected, it can be incorporated into a polymer regardless of chemical bond or electrostatic bond, and a plurality of reagents can be easily and stably bound to a polymer to which the same spacer is added. Therefore, a great variety of functional elements can be formed.
【００４４】ポリマーの加工形態としてはそれ自体を膜
状に成形したものの他、液体吸収性の別の担体（第２の
担体）を用いこれに含浸させた形態とすることもでき
る。これは、試薬を固定化するポリマーが、試薬担持の
ための反応性の高い置換基を繰り返し単位中に有してい
ることの他、ポリマー自身の性質（反応性、相溶性、成
膜性、可塑性等）が優れているためである。即ち、試薬
を固定化した後にセンサーとして用いるためには、いろ
いろな形状に加工可能であることが適用範囲を広げるた
めに大事であるほか、固定化した試薬の溶出がなく、応
答速度が速く、反応が連続的に再現良く行われること等
も必要であるが、ポリマーの膜はそのような条件を十分
に満たしている。As the processing form of the polymer, it is possible to use not only the one formed into a film itself, but also a form in which another liquid-absorbent carrier (second carrier) is used for impregnation. This is because the polymer on which the reagent is immobilized has a highly reactive substituent in the repeating unit for supporting the reagent, and the properties of the polymer itself (reactivity, compatibility, film-forming property, It is because of excellent plasticity). That is, in order to use it as a sensor after immobilizing a reagent, it is important that it can be processed into various shapes in order to broaden the range of application, in addition, there is no elution of the immobilized reagent, and the response speed is fast, Although it is necessary that the reaction is continuously and reproducibly performed, the polymer film sufficiently satisfies such conditions.
【００４５】成膜法とその形態としては次のようなもの
が挙げられる。Examples of the film forming method and its form are as follows.
【００４６】液体試料中の特定成分を分析するために
は、上述したような固定化担体を分析に適する形状に加
工して使用しなければならない。この場合は一般にキャ
ストコーティングと呼ばれている方法で加工するのが望
ましい。キャストコーティングは、平滑な表面に湿潤塗
膜を接触させながら乾燥塗膜を形成させる方法であり、
紙に顔料分散系塗工剤を塗ったり、ビニル分散塗工剤、
ラッカーおよびラテックスをフィルム、織物、箔および
紙に塗工するときに良く用いられているコーティング方
法である。ここでは担体ポリマーとスペーサーをメタノ
ール等の有機溶媒中に溶解し室温で数時間程度反応させ
て結合した後、キャストコーティングで成膜し、そのあ
とから分析に必要な試薬成分を固定化する方法や、全て
の成分を混合したのちに同様に成膜する方法により分析
に適する膜を得ることができる。キャストコートする平
滑な物質としては、透明または不透明な支持体、例え
ば、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリカーボネー
ト、ポリスチレン等のフィルムが好ましく用いられるほ
か、テフロンのような非接着性物質も使用される。この
場合は、成膜して乾燥後に剥して使用することが可能で
ある。In order to analyze a specific component in a liquid sample, the immobilized carrier as described above must be processed into a shape suitable for analysis and used. In this case, it is desirable to process by a method generally called cast coating. Cast coating is a method of forming a dry coating film while bringing a wet coating film into contact with a smooth surface.
Apply pigment dispersion coating agent to paper, vinyl dispersion coating agent,
It is a coating method often used when applying lacquer and latex to films, fabrics, foils and papers. Here, a method in which a carrier polymer and a spacer are dissolved in an organic solvent such as methanol, reacted at room temperature for several hours to bond, and then film-formed by cast coating, and then the reagent components necessary for analysis are immobilized, A film suitable for analysis can be obtained by a method of forming a film in the same manner after mixing all the components. As the smooth substance to be cast-coated, a transparent or opaque support such as a film of polyvinyl chloride, polyester, polycarbonate, polystyrene or the like is preferably used, and a non-adhesive substance such as Teflon is also used. In this case, it is possible to use after peeling after forming a film.
【００４７】膜厚としては、５〜５００μｍ、通常は２
０〜５０μｍ程度のものがセンサーとして好適である。
キャストコーティングの他にも、ロールコーティング、
スプレーコーティング、ブレードコーティング等も同様
に採用できる。The film thickness is 5 to 500 μm, usually 2
A sensor having a thickness of about 0 to 50 μm is suitable for the sensor.
In addition to cast coating, roll coating,
Spray coating, blade coating, etc. can be similarly adopted.
【００４８】また、別の形態として、液体吸収性の第２
の担体に吸収せしめて使用することも可能であるが、第
２の担体としては、濾紙、ガラス繊維、メンブランフィ
ルター、織物、不織布、木材、スポンジ材のような多孔
質材料が好ましい。この場合も、担体ポリマーとスペー
サーを結合させた後に第２の担体に吸収させ、分析に必
要な試薬成分をあとから固定化する方法や、全ての成分
を混合したのちに吸収させる方法のどちらも使用するこ
とができる。この形態では被検体とのぬれ及び接触面積
を改良することができる。なお、成膜の際に公知技術に
基づき膜に可塑性、柔軟性を付与するため各種可塑剤を
添加することができる。可塑剤としては目的とする膜の
性状に応じてリン酸エステル、フタル酸エステル、脂肪
族一塩基酸エステル、脂肪族二塩基酸エステル、二価ア
ルコールエステル、オキシ酸エステル等を用い得る。As another form, a liquid-absorbent second
It is also possible to use it by absorbing it in a carrier of No. 3, but as the second carrier, a porous material such as a filter paper, a glass fiber, a membrane filter, a woven fabric, a non-woven fabric, a wood and a sponge material is preferable. In this case as well, both the method of binding the carrier polymer and the spacer to the second carrier and then immobilizing the reagent components necessary for the analysis later, and the method of adsorbing after mixing all the components are both available. Can be used. This form can improve the wetting and contact area with the subject. It should be noted that various plasticizers can be added in order to impart plasticity and flexibility to the film based on a known technique at the time of film formation. As the plasticizer, a phosphoric acid ester, a phthalic acid ester, an aliphatic monobasic acid ester, an aliphatic dibasic acid ester, a dihydric alcohol ester, an oxyacid ester or the like can be used depending on the properties of the target film.
【００４９】よって、本発明においては、膜状とするか
又は別担体へ含浸させるかの２つの形態を採ることがで
きるので、透過でも反射でもその目的とする分析形態に
応じた担体を選ぶことができ、さらに、その形状も自由
に変えることが可能なため様々な分析法に適用可能であ
る。得られた試薬結合ポリマー成型体は、試料中の特定
成分を分析するための試薬を強固に固定化し、通常の使
用条件で溶出などの問題を起こさない。また、複数の試
薬を同時に結合することも可能なため、測定に必要な成
分をすべて固定化した膜は、本膜を測定しようとする試
料中に置くだけで、他の成分を加えることなく測定する
ことができる。また、本膜は第２の吸収性担体に吸収さ
せて使うこともでき透明性を持っているので、呈色を読
み取る方法としては、透過、反射のいずれでも可能で応
用性が非常に広い。Therefore, in the present invention, it is possible to take two forms, that is, in the form of a film or by impregnating into another carrier. Therefore, in either transmission or reflection, a carrier suitable for the intended analysis form is selected. Moreover, the shape can be freely changed, so that it can be applied to various analytical methods. The obtained reagent-bonded polymer molded product firmly immobilizes a reagent for analyzing a specific component in a sample and does not cause problems such as elution under normal use conditions. In addition, since it is possible to bind multiple reagents at the same time, a membrane on which all the necessary components for measurement have been immobilized can be measured without adding other components by simply placing the membrane in the sample to be measured. can do. Further, since the present film can be used by being absorbed by the second absorptive carrier and has transparency, either transmission or reflection can be used as a method for reading the color, and the applicability is very wide.
【００５０】以上説明したように、本発明の試薬結合ポ
リマーは、成膜、含浸等加工も非常に容易でそれ自体が
試薬を固定しセンサー素子を構成できるので、試薬と被
検体との接触面積、接触程度が格段に高く、応答反応が
速く、正確であり、かつ、試薬の溶出がほとんどない。
又、酵素と色原体等複数の種類の試薬を一緒にポリマー
中に固定できるので、被検体中への発色剤等の添加は不
要となり、又、被検体中の計測成分は１種に限らず、複
数のものを測定できるよう、相当する試薬を担体ポリマ
ーに均一に一定量固定できるので、多機能性バイオセン
サー、特にオプトロード利用バイオセンサーに極めて有
用である。As described above, the reagent-bonded polymer of the present invention is very easy to process such as film formation and impregnation, and can itself form a sensor element by immobilizing a reagent. The contact degree is remarkably high, the response reaction is fast and accurate, and the reagent is hardly eluted.
In addition, multiple types of reagents such as enzymes and chromogens can be fixed together in the polymer, so there is no need to add a color-developing agent to the sample, and the number of measurement components in the sample is limited to one. First, since a corresponding reagent can be uniformly fixed to a carrier polymer in a fixed amount so that a plurality of substances can be measured, it is extremely useful for a multifunctional biosensor, particularly an optrode-utilizing biosensor.
【００５１】次に、本発明の試薬結合ポリマーを用いた
オプトロード利用のバイオセンサーの概略について説明
するが、該ポリマーの用途はこれに限られるものではな
く、より構造的に単純な簡易測定用の試薬片等にも広く
適用できる。Next, an outline of a biosensor using an optrode using the reagent-bonded polymer of the present invention will be described. However, the application of the polymer is not limited to this, and a simpler structure for simple measurement can be used. It can also be widely applied to the reagent pieces and the like.
【００５２】原理的には液体試料中の特定成分と接触し
て検知可能な信号を発生する試薬を結合し、膜状等に形
成した試薬結合ポリマー（センサー素子という）を、液
体試料中に存在する特定成分と接触させ、発生する信号
を光学的手段を用いて検知することで、特定成分の計測
を行うというものである。発生する信号としては、発
光、吸収波長、吸光度の変化等として現れるものであ
り、これを公知の光学的手段で計測すればよい。光学手
段としては吸収光強度、透過光強度、反射光強度等の変
化を検知できるものである。液体試料としては、尿、血
清、血漿、全血等、これまでバイオセンサー用試料に用
いられているものをそのまま利用することができる。又
光ファイバーを利用して信号を伝送すれば生体内の体液
を被検体とすることも可能であり、臨床検査分野におい
ては極めて有用である。In principle, a reagent-bonded polymer (referred to as a sensor element) formed in the form of a film by binding a reagent that generates a detectable signal upon contact with a specific component in the liquid sample is present in the liquid sample. The specific component is measured by bringing it into contact with the specific component and detecting the generated signal using an optical means. The generated signal appears as a change in emission, absorption wavelength, absorbance, etc., and this may be measured by a known optical means. The optical means is capable of detecting changes in the intensity of absorbed light, the intensity of transmitted light, the intensity of reflected light, and the like. As the liquid sample, urine, serum, plasma, whole blood and the like that have been used for biosensor samples can be used as they are. Further, if a signal is transmitted using an optical fiber, it is possible to use a body fluid in a living body as a subject, which is extremely useful in the clinical examination field.
【００５３】センサーとしては試薬結合ポリマー膜から
成るセンサー素子、発生する信号を伝達する手段、及び
信号の変化を吸収光強度、透過光強度、又は反射光強度
の変化としてとらえる光学的手段を少なくとも有する装
置によりセンサーを構成できる。即ち、センサー素子は
担体に試薬結合ポリマーが含浸されている形態であって
もよく、この場合は被検体を含浸担体に滴下し、被検体
中の特定成分量に応じて発色等が起こるのを反射光度計
等によって計測すればよい。又、光ファイバーを利用す
る形態としては、光ファイバーの先端部に直接センサー
素子膜を形成するか、あるいはセンサー素子膜を内部に
担持したセルを該先端部に装着すれば信号を外へ取り出
すことができる。センサー素子担持用セルを脱着可能と
すればセンサー素子部は、交換可能なヘッドとすること
ができ便利である。光ファイバーを利用した場合も透過
光、反射光のどちらの形式も採ることができる。光ファ
イバーの先端部にセンサー素子を装着した場合は一般に
反射光利用であり、光ファイバーの側面にセンサー素子
を装着した場合は一般に透過光利用である。The sensor has at least a sensor element composed of a reagent-bonded polymer film, a means for transmitting a generated signal, and an optical means for detecting a change in signal as a change in absorbed light intensity, transmitted light intensity, or reflected light intensity. The device can form a sensor. That is, the sensor element may be in a form in which the carrier is impregnated with the reagent-bound polymer, and in this case, the analyte is dropped on the impregnated carrier to prevent coloration or the like depending on the amount of the specific component in the analyte. It may be measured with a reflection photometer or the like. Further, as a mode of utilizing an optical fiber, a signal can be taken out by forming a sensor element film directly on the tip of the optical fiber or by mounting a cell carrying the sensor element film inside the tip. . If the sensor element-carrying cell is made removable, the sensor element portion can be a replaceable head, which is convenient. Even when an optical fiber is used, either transmitted light or reflected light can be used. When a sensor element is attached to the tip of the optical fiber, reflected light is generally used, and when a sensor element is attached to the side surface of the optical fiber, transmitted light is generally used.
【００５４】[0054]
実施例１ （担体ポリマーの合成）アルカリ水溶液で洗浄したのち
脱水し真空蒸留を行って精製されたメタクリル酸メチル
及びｐ−クロルメチルスチレンの各単量体を等モルづつ
トルエン中に加え、１％（重量比）のアゾビスイソブチ
ロニトリルを添加した。上記混合物を充分に窒素置換さ
れた反応容器内で、７０℃で１０時間重合させ、反応終
了後、大量のメタノール中に添加して、メタクリル酸メ
チル／ｐ−クロルメチルスチレン共重合体を得た。 （スペーサー導入１：静電的結合用）上記共重合体をア
セトンに溶解して１０％溶液とし、トリエチルアミンを
共重合体に対して３０％加えて室温下で２４時間反応さ
せた。反応終了後、析出物を濾別して適量のメタノール
に溶解し、この溶液を大量のアセトン中に添加して、強
塩基性イオン交換樹脂の性質を持つ下記式で示させるス
ペーサー付担体ポリマーを得た。Example 1 (Synthesis of carrier polymer) After washing with an aqueous alkali solution, dehydration and vacuum distillation, each monomer of methyl methacrylate and p-chloromethylstyrene, which had been purified, was added to toluene in an equimolar ratio to give 1%. (Weight ratio) azobisisobutyronitrile was added. The above mixture was polymerized at 70 ° C. for 10 hours in a reaction vessel sufficiently replaced with nitrogen, and after completion of the reaction, added to a large amount of methanol to obtain a methyl methacrylate / p-chloromethylstyrene copolymer. . (Introduction of Spacer 1: For Electrostatic Bonding) The above copolymer was dissolved in acetone to form a 10% solution, and 30% of triethylamine was added to the copolymer and reacted at room temperature for 24 hours. After the reaction was completed, the precipitate was separated by filtration and dissolved in an appropriate amount of methanol, and this solution was added to a large amount of acetone to obtain a carrier polymer with a spacer having the property of a strongly basic ion exchange resin represented by the following formula. .
【００５５】[0055]
【化８】 （スペーサー導入２：化学的結合用）上記共重合体を７
％の濃度になるようにアセトンに溶解し、これにアンモ
ニア水を２％加えて室温で８時問反応させ、その後大量
のメタノール中に添加して析出してきた下記式で示され
るアミノ基導入担体ポリマーを濾別した。[Chemical 8] (Spacer introduction 2: For chemical bonding) The above-mentioned copolymer 7
Amino group-introduced carrier represented by the following formula, which was dissolved in acetone to a concentration of 2%, 2% of ammonia water was added to the solution, reacted at room temperature for 8 hours, and then added to a large amount of methanol to precipitate. The polymer was filtered off.
【００５６】[0056]
【化９】 （グルコース測定センサーの作成）上記スペーサー導入
１で得られたポリマー０．５ｇを２０ｍｌのメタノール
に溶解し、更にスペーサー導入２で得られたポリマー
０．５ｇ、ブロムチモールブルー１０ｍｇ、アセトン３
０ｍｌを加えて溶解させた。この溶液をガラス繊維（Ｇ
Ａ１００（アドバンテック））に含浸し、８０℃で１５
分間乾燥させた。次いでグルコースオキシダーゼ（１０
０Ｕ／ｍｌ）、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホ
リノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホ
ネート（適量）を溶解した０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
６）に入れて４℃で２４時間反応させた。得られた酵素
及び色原体固定化ガラス繊維をよく洗浄し、未反応物を
取り除いた後、乾燥した。この操作により、スペーサー
導入１の担体ポリマーにｐＨ指示薬を静電的に結合し、
またスペーサー導入２の担体ポリマーに酵素（グルコー
スオキシダーゼ）のカルボキシル基を化学的に結合した
試薬結合ポリマーを得た。濃度の異なるグルコース溶液
１０μｌを該ガラス繊維に滴下して５分問反応させ、得
られた呈色をカラーアナライザーで反射光測光を行っ
た。結果は、図１のようにグルコース濃度に応じた反射
率変化を示し、グルコースを感度よく検出できた。 実施例２ （尿酸測定センサーの作製）上記スペーサー導入１で得
られたポリマー０．５ｇを２０ｍｌのメタノールに溶解
し、更にプロムチモールプルー１０ｍｇを加えて溶解し
て静電的に担体ポリマーに結合させた。この溶液をキャ
スト法によりポリエチレン上に厚さ２０μｍに成膜し、
ブロムチモールブルー固定化膜を得た。この固定化膜
を、ウリカーゼ７０ｍｇを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７）に溶解した溶液中に入れ、４℃で２４時間反応させ
て酵素を固定化した。この操作によりｐＨ指示薬ととも
に酵素（ウリカーゼ）を静電的に結合した試薬結合ポリ
マーを得た。[Chemical 9] (Preparation of glucose measuring sensor) 0.5 g of the polymer obtained in the above spacer introduction 1 was dissolved in 20 ml of methanol, and 0.5 g of the polymer obtained in the spacer introduction 2 further, bromthymol blue 10 mg, and acetone 3
0 ml was added and dissolved. This solution was mixed with glass fiber (G
A100 (Advantech) is impregnated at 80 ° C for 15
Allow to dry for minutes. Then glucose oxidase (10
0 U / ml), 0.1 M phosphate buffer (pH) in which 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinoethyl) carbodiimidimeto-p-toluenesulfonate (appropriate amount) was dissolved.
It was put in 6) and reacted at 4 ° C. for 24 hours. The obtained enzyme and chromogen-immobilized glass fiber were thoroughly washed, unreacted substances were removed, and then dried. By this operation, the pH indicator is electrostatically bound to the carrier polymer of the spacer introduction 1,
Further, a reagent-bonded polymer was obtained in which the carboxyl group of the enzyme (glucose oxidase) was chemically bonded to the carrier polymer of the spacer introduction 2. 10 μl of glucose solutions having different concentrations were dropped on the glass fiber and reacted for 5 minutes, and the resulting coloration was measured by reflected light with a color analyzer. As a result, as shown in FIG. 1, the reflectance was changed according to the glucose concentration, and glucose could be detected with high sensitivity. Example 2 (Preparation of Uric Acid Measuring Sensor) 0.5 g of the polymer obtained in the above-mentioned spacer introduction 1 was dissolved in 20 ml of methanol, and further 10 mg of promthymol pull was added and dissolved to electrostatically bind to the carrier polymer. It was This solution was cast on polyethylene to form a film with a thickness of 20 μm,
A bromthymol blue immobilized membrane was obtained. 70 mg of uricase and 50 mM phosphate buffer solution (pH
It was put in the solution dissolved in 7) and reacted at 4 ° C. for 24 hours to immobilize the enzyme. By this operation, a reagent-bound polymer in which an enzyme (uricase) was electrostatically bound together with a pH indicator was obtained.
【００５７】該膜を１５ｍｍφの大きさに裁断し、セン
サー素子とした。この素子を濃度の異なる尿酸溶液に浸
し、直ちに取り出して１０分問放置したところ、濃度に
比例した呈色変化が認められた。The film was cut into a size of 15 mmφ to obtain a sensor element. When this device was dipped in a uric acid solution having a different concentration, immediately taken out and allowed to stand for 10 minutes, a color change proportional to the concentration was observed.
【００５８】[0058]
【発明の効果】以上説明したように、ハロゲン化アルキ
ルスチレンとアクリル酸類との共重合体の繰り返し単位
中のＲ1に、スペーサーとしてアンモニアあるいはジア
ミン類を導入することにより、化学的結合（酸アミド結
合）によりカルボキシル基含有試薬を容易に結合させる
ことができるので、簡単な構造でかつ安定的にカルボキ
シル基を含有した酵素活性物質や免疫活性物質等を結合
させたポリマーを得ることができ、更に、４級アンモニ
ウム化合物を該共重合体に導入することにより静電的結
合で酸塩基指示薬ばかりでなく酵素活性物質や免疫活性
物質も結合させることができるので、複数種の試薬がポ
リマーに直接固定された多機能性ポリマーとすることが
できる。 また、該共重合体のモノマーのモル比を３：
１〜１：３の範囲とすることにより、親水性で試薬結合
部位を有するモノマーと疎水性で試薬結合部位を有しな
いモノマーとの割合が適当となるので、生体関連物質を
測定するのに適した親水性、試薬の耐溶出性、ポリマー
の加工性等を得ることができる。As described above, by introducing ammonia or a diamine as a spacer into R 1 in the repeating unit of the copolymer of a halogenated alkylstyrene and acrylic acid, a chemical bond (acid amide) can be obtained. Since it is possible to easily bind a carboxyl group-containing reagent by conjugation), it is possible to obtain a polymer having a simple structure and stably bound to a carboxyl group-containing enzymatically active substance or immunologically active substance. By introducing a quaternary ammonium compound into the copolymer, not only acid-base indicators but also enzyme-active substances and immuno-active substances can be bound by electrostatic binding, so multiple types of reagents can be directly immobilized on the polymer. Can be a polyfunctional polymer. Further, the molar ratio of the monomers of the copolymer is 3:
By setting the ratio in the range of 1 to 1: 3, the ratio of the hydrophilic monomer having a reagent binding site to the hydrophobic monomer having no reagent binding site becomes appropriate, which is suitable for measuring a biological substance. Moreover, hydrophilicity, elution resistance of reagents, processability of polymers, and the like can be obtained.
【００５９】また、カルボキシル基含有試薬を酵素活性
物質や免疫活性物質から選定することにより、生体関連
物質を測定する上で極めて有用なものを採用することが
できるので、バイオセンサーとして広範な利用が可能で
ある。Further, by selecting a carboxyl group-containing reagent from enzyme active substances and immunological active substances, it is possible to employ a very useful one for measuring biologically relevant substances, so that it can be widely used as a biosensor. It is possible.
【００６０】また、試薬結合ポリマー膜や試薬結合ポリ
マー担持体とすることにより、所望により膜状や別担体
に含浸させた形態とすることができるので、種々の使用
場面に対応できるセンサーを構成することができる。By using a reagent-bonded polymer film or a reagent-bonded polymer carrier, it is possible to form a film or a form in which it is impregnated into another carrier, so that a sensor that can be used in various situations is constructed. be able to.
【００６１】また、カルボキシ基含有試薬の結合におい
て、共重合体にアミノ基を導入し、好ましくはカルボジ
イミド試薬またはウッドワード試薬Ｋ等の縮合試薬を用
いて、酸アミド結合により試薬のカルボキシル基をスペ
ーサーのアミノ基と結合させるので、試薬の結合を容易
にかつ確実に行うことができる。In the binding of the carboxy group-containing reagent, an amino group is introduced into the copolymer, and a carbodiimide reagent or a condensation reagent such as Woodward reagent K is preferably used to bind the carboxyl group of the reagent to a spacer by an acid amide bond. Since it is bonded to the amino group of, the reagent can be bonded easily and surely.
【００６２】また、まず静電的結合用のスペーサー付き
ポリマーに酸塩基指示薬を付加し、続いて化学的結合用
のスペーサー付きポリマーと混合するか又は混合しない
で成膜し又は担体に含浸させ、次にカルボキシル基含有
試薬および／または酵素活性物質および免疫活性物質か
ら選ばれた試薬を結合させることにより、多種類の試薬
を定量的にかつ安定的に膜または担体に担持させること
ができる。Further, first, an acid-base indicator is added to a polymer with a spacer for electrostatic coupling, and subsequently a film is formed or impregnated into a carrier with or without mixing with a polymer with a spacer for chemical coupling. Next, a carboxyl group-containing reagent and / or a reagent selected from an enzyme active substance and an immunologically active substance is bound to allow various kinds of reagents to be quantitatively and stably supported on a membrane or a carrier.
【００６３】このように、本発明の試薬結合ポリマー
は、成膜、含浸等加工も非常に容易でそれ自体が試薬を
固定しセンサー素子を構成できるので、試薬と被検体と
の接触面積、接触程度が格段に高く、応答反応が速く、
正確であり、かつ、試薬の溶出がほとんどない。又、酵
素と色原体等複数の種類の試薬を一緒にポリマー中に固
定できるので、被検体中への発色剤等の添加は不要とな
る。又、被検体中の計測成分は１種に限らず、複数のも
のを測定できるよう、相当する試薬を担体ポリマーに均
一に一定量固定できるので、多機能性バイオセンサー、
特にオプトロード利用バイオセンサーに極めて有用であ
る。As described above, the reagent-bonded polymer of the present invention is very easy to process such as film formation and impregnation, and can itself form a sensor element by immobilizing a reagent. The degree is much higher, the response is faster,
It is accurate and there is almost no elution of reagents. Moreover, since a plurality of types of reagents such as an enzyme and a chromogen can be immobilized together in the polymer, it is not necessary to add a color former or the like to the subject. In addition, the number of measurement components in an analyte is not limited to one, but a fixed amount of a corresponding reagent can be fixed uniformly on a carrier polymer so that a plurality of substances can be measured.
In particular, it is extremely useful for biosensors using optrode.
【図１】実施例１で作製したグルコース測定センサーに
よる、各グルコース濃度における反射率変化と波長との
関係を示すグラフである。FIG. 1 is a graph showing a relationship between a reflectance change and a wavelength at each glucose concentration by the glucose measurement sensor manufactured in Example 1.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０８Ｇ 81/02 Ｃ１２Ｍ 1/00 Ｚ Ｇ０１Ｎ 27/327 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI Technical display area C08G 81/02 C12M 1/00 Z G01N 27/327
Claims (8)
るハロゲン化アルキルスチレンと下記一般式（II）で表
されるアクリル酸類との共重合体を不溶性担体とし、こ
の共重合体の繰り返し単位中のＲ1に試薬を結合させて
なる試薬結合ポリマーにおいて、（ａ）Ａ−ＣＯＯＨ
（Ａは主要部分）で表されるカルボキシル基含有試薬が
結合した下記式（III）で表わされる試薬結合部、およ
び／または（ｂ）酵素活性物質および免疫活性物質から
選択された試薬が結合した下記式（IV）で表わされる試
薬結合部、または更に前記試薬結合部に加え（ｃ）酸塩
基指示薬が結合した下記式（IV）で表わされる試薬結合
部、を有することを特徴とする試薬結合ポリマー。 【化１】 【化２】 （式中、Ｘはハロゲン、Ｒ1 はベンゼン環の任意の位置
をとり得る炭素数１〜４のアルキレン基、Ｒ2 及びＲ3
はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜４のアルキル基
を示す。） −Ｒ1−Ｓｐ−ＣＯ−Ａ （III） （式中、Ｒ1は一般式（Ｉ）と同じ意味、Ｓｐはアンモ
ニアまたはジアミン類からなるスペーサー構造を示
す。） 【化３】 （式中、Ｒ1およびＸは一般式（Ｉ）と同じ意味、Ｒ4、
Ｒ5、Ｒ6はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜４のア
ルキル基、又は炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、
Ｂ±は正または負にチャージした試薬成分、…は静電的
結合を示す。）1. A copolymer of a halogenated alkylstyrene having a structure represented by the following general formula (I) and an acrylic acid represented by the following general formula (II) is used as an insoluble carrier. In a reagent-bound polymer obtained by binding a reagent to R 1 in a repeating unit, (a) A-COOH
(A is a main part) A reagent binding part represented by the following formula (III), to which a carboxyl group-containing reagent is bound, and / or (b) a reagent selected from an enzyme active substance and an immunoactive substance A reagent bond having a reagent binding part represented by the following formula (IV), or (c) a reagent binding part represented by the following formula (IV) in which an acid-base indicator is bound in addition to the reagent binding part. polymer. [Chemical 1] [Chemical 2] (In the formula, X is a halogen, R 1 is an alkylene group having 1 to 4 carbon atoms which can take any position of the benzene ring, R 2 and R 3
Each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms. ) —R 1 —Sp—CO—A (III) (In the formula, R 1 has the same meaning as in formula (I), and Sp represents a spacer structure composed of ammonia or a diamine.) (In the formula, R 1 and X have the same meanings as in the general formula (I), R 4 ,
R 5 and R 6 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or a hydroxyalkyl group having 1 to 4 carbon atoms,
B ± represents a reagent component charged positively or negatively, ... Represents electrostatic coupling. )
モノマーと一般式（II）で表わされるモノマーとのモル
比が３：１〜１：３の範囲で得られたものである請求項
１記載の試薬結合ポリマー。2. The copolymer is obtained in a molar ratio of the monomer represented by the general formula (I) to the monomer represented by the general formula (II) in the range of 3: 1 to 1: 3. The reagent-bound polymer according to claim 1.
質および免疫活性物質から選ばれる請求項１記載の試薬
結合ポリマー。3. The reagent-bound polymer according to claim 1, wherein the carboxyl group-containing reagent is selected from an enzyme active substance and an immunoactive substance.
してなる試薬結合ポリマー膜。4. A reagent-bound polymer film obtained by forming a film of the reagent-bound polymer according to claim 1.
吸収性の別の担体に含浸させてなる試薬結合ポリマー担
持体。5. A reagent-bound polymer carrier obtained by impregnating the reagent-bound polymer according to claim 1 into another liquid-absorbent carrier.
する方法であって、一般式（Ｉ）で表される構造を有す
るハロゲン化アルキルスチレンと一般式（II）で表され
るアクリル酸類との共重合体を不溶性担体とし、この共
重合体の繰り返し単位中のＲ1に、（ａ）アンモニアま
たはジアミン類からなるスペーサーを結合させ末端にア
ミノ基を導入し、次にＡ−ＣＯＯＨ（Ａは主要部分）で
表されるカルボキシル基含有試薬のカルボキシル基と該
アミノ基を結合させることにより式（III）で表わされ
る試薬結合部を形成し、又は（ｂ）３級アミンを結合さ
せて４級化しこれをスペーサーとして、次に酵素活性物
質および免疫活性物質および／または酸塩基指示薬から
選択された試薬を付加することにより式（IV）で表わさ
れる試薬結合部を形成することを特徴とする試薬結合ポ
リマー調製方法。6. A method for preparing the reagent-bonded polymer according to claim 1, wherein the halogenated alkylstyrene having a structure represented by general formula (I) and acrylic acid represented by general formula (II) are used. The copolymer of (1) is used as an insoluble carrier, a spacer composed of (a) ammonia or a diamine is bonded to R 1 in the repeating unit of this copolymer to introduce an amino group at the terminal, and then A-COOH (A Is a main part) to form a reagent binding part represented by the formula (III) by binding the carboxyl group of the carboxyl group-containing reagent with the amino group, or (b) by binding a tertiary amine to 4 The reagent binding part represented by the formula (IV) is formed by categorizing and using this as a spacer, and then adding a reagent selected from an enzyme active substance, an immunoactive substance and / or an acid-base indicator. A method for preparing a reagent-bound polymer, comprising:
シル基の結合が、縮合試薬としてカルボジイミド試薬ま
たはウッドワード試薬Ｋを用いて形成される請求項６記
載の試薬結合ポリマー調製方法。7. The method for preparing a reagent-bonded polymer according to claim 6, wherein the bond between the amino group of the spacer and the carboxyl group of the reagent is formed by using a carbodiimide reagent or Woodward reagent K as a condensation reagent.
に溶解し、これに試薬を添加し、溶媒中で該試薬をスペ
ーサーに結合させた後、成膜し又は別担体に含浸させ試
薬結合部を形成するか、またはスペーサー付担体ポリマ
ーを成膜し又は別担体に含浸させた後、試薬含有溶液中
に浸漬することでスペーサーに該試薬を結合させ試薬結
合部を形成する請求項６記載の試薬結合ポリマー調製方
法。8. A carrier polymer with a spacer is dissolved in an organic solvent, a reagent is added to this, the reagent is bound to the spacer in the solvent, and then a film is formed or impregnated into another carrier to form a reagent binding part. 7. The reagent according to claim 6, which is formed or after a carrier polymer with a spacer is formed into a film or impregnated into another carrier and then immersed in a reagent-containing solution to bind the reagent to the spacer to form a reagent binding part. Method for preparing bound polymer.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5153743A JPH0727766A (en) | 1993-06-24 | 1993-06-24 | Reagent-bonded polymer and its preparation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5153743A JPH0727766A (en) | 1993-06-24 | 1993-06-24 | Reagent-bonded polymer and its preparation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0727766A true JPH0727766A (en) | 1995-01-31 |
Family
ID=15569144
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5153743A Pending JPH0727766A (en) | 1993-06-24 | 1993-06-24 | Reagent-bonded polymer and its preparation |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0727766A (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008506019A (en) * | 2004-07-08 | 2008-02-28 | レヴァ メディカル、 インコーポレイテッド | Side chain crystalline polymer for medical applications |
| US8703113B2 (en) | 2004-07-08 | 2014-04-22 | Reva Medical Inc. | Side-chain crystallizable polymers for medical applications |
| JP2014200749A (en) * | 2013-04-05 | 2014-10-27 | 和興フィルタテクノロジー株式会社 | Filter medium for air purification and production method of filter medium for air purification |
| JP2020502286A (en) * | 2016-12-22 | 2020-01-23 | デンツプライ デトレイ ゲー．エム．ベー．ハー． | Method for preparing a dental resin modified glass ionomer composition |
-
1993
- 1993-06-24 JP JP5153743A patent/JPH0727766A/en active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008506019A (en) * | 2004-07-08 | 2008-02-28 | レヴァ メディカル、 インコーポレイテッド | Side chain crystalline polymer for medical applications |
| US7939611B2 (en) | 2004-07-08 | 2011-05-10 | Reva Medical, Inc. | Side-chain crystallizable polymers for medical applications |
| US8124700B2 (en) | 2004-07-08 | 2012-02-28 | Reva Medical, Inc. | Side-chain crystallizable polymers for medical applications |
| US8133959B2 (en) | 2004-07-08 | 2012-03-13 | Reva Medical, Inc. | Side-chain crystallizable polymers for medical applications |
| US8703113B2 (en) | 2004-07-08 | 2014-04-22 | Reva Medical Inc. | Side-chain crystallizable polymers for medical applications |
| US9782523B2 (en) | 2004-07-08 | 2017-10-10 | Reva Medical, Inc. | Side-chain crystallizable polymers for medical applications |
| JP2014200749A (en) * | 2013-04-05 | 2014-10-27 | 和興フィルタテクノロジー株式会社 | Filter medium for air purification and production method of filter medium for air purification |
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