JPH0710226B2 - Protoplast stirring device, cell fusion device and flow cytometer device including the same - Google Patents
Protoplast stirring device, cell fusion device and flow cytometer device including the sameInfo
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- JPH0710226B2 JPH0710226B2 JP2284775A JP28477590A JPH0710226B2 JP H0710226 B2 JPH0710226 B2 JP H0710226B2 JP 2284775 A JP2284775 A JP 2284775A JP 28477590 A JP28477590 A JP 28477590A JP H0710226 B2 JPH0710226 B2 JP H0710226B2
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、プロトプラストを液内に均一に分散させるた
めの装置並びに該装置を含む細胞融合装置及びフローサ
イトメーター装置に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a device for uniformly dispersing protoplasts in a liquid, a cell fusion device and a flow cytometer device including the device.
［従来の技術］ 従来、細胞の攪拌には振盪（回転式又は往復式）が簡便
な方法として用いられていた。しかし扱う容器の形状
（フラスコ、試験管等）によっては均一な攪拌が困難で
あり、また、強い攪拌はプロトプラストのように細胞壁
を持たない細胞には細胞破壊のおそれがあるのであまり
向かない方法であった。[Prior Art] Conventionally, shaking (rotating or reciprocating) has been used as a simple method for stirring cells. However, uniform agitation is difficult depending on the shape of the container to be handled (flask, test tube, etc.), and strong agitation is not suitable for cells that do not have a cell wall such as protoplasts because cell destruction may occur. there were.
また、植物プロトプラスト等の細胞懸濁液を調製し、細
胞融合等に供する場合、プロトプラストを崩壊させない
ように穏やかに攪拌し、処理を行なう必要がある。特
に、連続して細胞を処理しようとする場合には、時間経
過と共に生じるプロトプラストの沈降を防ぎながら、常
に一定した細胞密度で細胞を融合チャンバーに送ること
が融合効率上重要である。しかしながら、従来の方法で
は、このように常に一定の細胞密度に細胞を懸濁するこ
とは困難であった。Further, when a cell suspension such as a plant protoplast is prepared and subjected to cell fusion or the like, it is necessary to stir gently to prevent the protoplast from being destroyed. In particular, when cells are to be treated continuously, it is important for the fusion efficiency to send the cells to the fusion chamber at a constant cell density while preventing the protoplasts from sedimenting with the passage of time. However, in the conventional method, it was difficult to always suspend cells at a constant cell density.
［発明が解決しようとする問題点］ 従って、本発明の目的は、プロトプラストを液中で均
一、かつ、ほぼ一定の細胞密度に分散、維持することが
できるプロトプラスト攪拌装置を提供することである。[Problems to be Solved by the Invention] Therefore, an object of the present invention is to provide a protoplast agitator capable of dispersing and maintaining protoplasts in a liquid at a uniform and almost constant cell density.
［問題点を解決するための手段］ 本願発明者らは、鋭意研究の結果、空気又は窒素ガス等
の圧力を利用し、特殊なノズルの先端からプロトプラス
ト懸濁液を吸引し、これを吐出するという操作を繰返す
ことにより、プロトプラストを液中で均一に分散するこ
とができ、しかもプロトプラストへの障害もない有効な
攪拌効果が得られることを見出し、さらに、このような
攪拌を自動的及び連続的に行なう装置を作製することに
成功し、本発明を完成した。[Means for Solving Problems] As a result of earnest research, the inventors of the present application have utilized a pressure of air or nitrogen gas to suck the protoplast suspension from the tip of a special nozzle and discharge it. By repeating the above operation, it was found that the protoplasts can be uniformly dispersed in the liquid, and an effective stirring effect without obstructing the protoplasts can be obtained. Furthermore, such stirring is automatically and continuously performed. The present invention has been completed by succeeding in producing a device for performing the above.
すなわち、本発明は、プロトプラスト懸濁液を収容する
ための容器と、該容器に収容される前記プロトプラスト
懸濁液中に少なくともその先端が浸漬される、空気を吸
引することなく前記プロトプラスト懸濁液の吸引及び吐
出を行なうためのノズルと、該ノズルに接続され、該ノ
ズルから吸引された前記プロトプラスト懸濁液を一時的
に保存するためのチューブと、前記ノズルを介して前記
プロトプラスト懸濁液の吸引及び吐出を行なうための手
段を有するプロトプラスト攪拌装置を提供する。That is, the present invention is a container for containing a protoplast suspension, and at least its tip is immersed in the protoplast suspension contained in the container, the protoplast suspension without sucking air. For suctioning and discharging, a tube connected to the nozzle for temporarily storing the protoplast suspension sucked from the nozzle, and a tube for storing the protoplast suspension through the nozzle. Provided is a protoplast stirrer having means for performing suction and discharge.
さらに、本発明は、電気的刺激により連続してプロトプ
ラスト融合を行なう装置と、該装置の細胞懸濁液吸入口
に接続された上記本発明のプロトプラスト攪拌装置とを
有する細胞融合装置を提供する。Furthermore, the present invention provides a cell fusion device having a device for continuously performing protoplast fusion by electrical stimulation and the above-described protoplast agitation device of the present invention connected to a cell suspension suction port of the device.
さらにまた、本発明は、フローサイトメーターと、該フ
ローサイトメーターのプロトプラスト懸濁液吸入口に接
続された上記本発明のプロトプラスト攪拌装置とを有す
るフローサイトメーター装置を提供する。Furthermore, the present invention provides a flow cytometer device having a flow cytometer and the protoplast stirring device of the present invention connected to the protoplast suspension inlet of the flow cytometer.
［発明の具体的説明］ 以下、上記ノズルを介して前記プロトプラスト懸濁液の
吸引及び吐出を行なうための手段が、前記ノズル、前記
チューブ及び前記容器内空間を連通する流路系と、該流
路系に接続され、前記プロトプラスト懸濁液を送液する
ための圧力源としての加圧ポンプと、該加圧ポンプによ
り加圧され、前記流路系の少なくとも一部を流通する加
圧媒体としてのガスと、前記流路系に設けられ、前記加
圧ポンプによって加圧される流路を変更するための複数
のバルブを有するものである、本発明の好ましい一態様
の一実施例を図面に基づき詳細に説明する。[Detailed Description of the Invention] Hereinafter, a means for performing suction and discharge of the protoplast suspension through the nozzle includes a flow path system that communicates the nozzle, the tube, and the internal space of the container, A pressure pump connected to a channel system and serving as a pressure source for feeding the protoplast suspension, and a pressure medium pressurized by the pressure pump and flowing through at least a part of the channel system. Gas and a plurality of valves provided in the flow channel system for changing the flow channel pressurized by the pressure pump. One embodiment of a preferred embodiment of the present invention is shown in the drawings. Based on this, a detailed description will be given.
第１図に示すように、本発明のプロトプラスト攪拌装置
は、懸濁プロトプラストを保持するための試験管３に空
気を吸引することなくプロトプラスト懸濁液21を吸引及
び吐出するためのノズル１と、該ノズルを試験管に設置
するための保持体であって、前記試験管の気密な蓋とし
ても機能する保持体４、さらに吸引したプロトプラスト
懸濁液を一時的に保持するためのチューブ２から構成さ
れる。さらに、該攪拌装置は懸濁液の吸引、吐出のため
の圧力源として空気や窒素等のガス圧力を利用するた
め、例えば加圧ポンプ15や圧力を調整するためのレギュ
レーター16とその導入、排出のためのバルブ５、10及び
懸濁プロトプラストを流路13から該装置外に送り出すべ
く途中の流路に設置された流路切替のためのバルブ６、
７、８から成る。また、必要に応じて、該装置の流路系
を洗浄するための洗浄液ボトルと流路切り替えバルブ９
を設置する。これらのバルブ類は全て制御回路14で開閉
をコントロールされる。As shown in FIG. 1, the protoplast agitator of the present invention comprises a nozzle 1 for sucking and discharging a protoplast suspension 21 without sucking air into a test tube 3 for holding suspended protoplasts. A holder for installing the nozzle in a test tube, which also functions as an airtight lid for the test tube, and a tube 2 for temporarily holding the aspirated protoplast suspension. To be done. Further, since the stirring device uses gas pressure such as air and nitrogen as a pressure source for sucking and discharging the suspension, for example, a pressurizing pump 15 and a regulator 16 for adjusting the pressure and its introduction and discharge. Valves 5 and 10 for controlling the flow path and a valve 6 for switching the flow path, which is installed in the flow path on the way to send the suspension protoplast from the flow path 13 to the outside of the apparatus,
It consists of 7 and 8. Further, if necessary, a cleaning liquid bottle for cleaning the flow channel system of the apparatus and a flow channel switching valve 9
Set up. The opening and closing of all of these valves is controlled by the control circuit 14.
本装置を使用する際には、加圧ポンプ15からのガス圧を
レギュレーター16で適当な圧力に調節する。通常、圧力
は0.05〜1.0kgf/cm2が適当であり、約0.5kgf/cm2程度が
好ましい。圧力媒体としては空気や窒素ガス等を使用す
ることが可能であり、窒素ガスが特に好ましい。また、
必要に応じて無菌化のためのフィルター17の設置も可能
である。When using this device, the gas pressure from the pressurizing pump 15 is adjusted to an appropriate pressure by the regulator 16. Usually, the pressure is suitably 0.05~1.0kgf / cm 2, about 0.5 kgf / cm 2 is preferred. Air or nitrogen gas can be used as the pressure medium, and nitrogen gas is particularly preferable. Also,
A filter 17 for sterilization can be installed if necessary.
操作にあたっては、先ず最初に第２図に示すように、プ
ロトプラスト懸濁液21の入った試験管３にバルブ５を開
いて加圧する。In operation, first, as shown in FIG. 2, the valve 5 is opened and pressurized in the test tube 3 containing the protoplast suspension 21.
次に、懸濁液の攪拌の際には、第３図に示す如くバルブ
６を開きノズル１の先端部から空気を吸引することなく
懸濁液21を吸引し、チューブ２内に一時的に保持してバ
ルブ６を閉じる。Next, at the time of stirring the suspension, as shown in FIG. 3, the valve 6 is opened to suck the suspension 21 from the tip of the nozzle 1 without sucking air, and the suspension 2 is temporarily sucked into the tube 2. Hold and close valve 6.
それからバルブ10、７、６を開き、チューブ２内に保持
されていた懸濁液をノズル１の先端から試験管内に吐出
する。Then, the valves 10, 7 and 6 are opened, and the suspension liquid retained in the tube 2 is discharged from the tip of the nozzle 1 into the test tube.
この操作を１回ないし数回、連続的又は断続的に行なう
ことにより試験管３内のプロトプラスト懸濁液21を攪拌
する。ここで、チューブ内に吸引する懸濁液の量は、懸
濁液の一部又は全量でも良く、好ましくは懸濁液全体の
約半分程度である。This operation is carried out once or several times continuously or intermittently to stir the protoplast suspension 21 in the test tube 3. Here, the amount of the suspension sucked into the tube may be a part or the whole amount of the suspension, and is preferably about half of the total suspension.
ノズル１によるプロトプラスト攪拌の様子が第４図に模
式的に示されている。第４図に示されるように、プロト
プラスト懸濁液21中のプロトプラスト22は、ノズルによ
る吸引及び吐出を繰返すことによりプロトプラスト22が
均一に分散される。このような攪拌を連続的又は断続的
に攪拌することによりプロトプラスト懸濁液を均一のプ
ロトプラスト濃度に維持することが可能である。The state of stirring the protoplasts by the nozzle 1 is schematically shown in FIG. As shown in FIG. 4, the protoplasts 22 in the protoplast suspension 21 are uniformly dispersed by repeating suction and discharge by the nozzles. By stirring such stirring continuously or intermittently, it is possible to maintain the protoplast suspension at a uniform protoplast concentration.
このようにして攪拌されたプロトプラスト細胞液は、流
路13を通して装置の外に送液される。後述のように、例
えば、連続式に電気的な刺激によってプロトプラストを
融合するための装置やフローサイトメーター等の装置と
組合わせることが適当である。The protoplast cell liquid thus stirred is sent to the outside of the device through the flow path 13. As will be described later, for example, it is appropriate to combine with a device for fusing protoplasts by continuous electrical stimulation and a device such as a flow cytometer.
使用の際、流路系の無菌化にはエタノール等を用いるこ
とができる。また、流路系の洗浄には、洗浄液ボトル11
の洗浄液、例えば滅菌水や滅菌したバッファー、培養液
等が利用できる。具体的には、第５図に示す如くバルブ
６、７、９及び20を開き、洗浄液をチューブ２及びノズ
ル１に導入する。次に第６図に示す如くバルブ10、７、
６を開き試験管３内にガスを送りバブリングする。最終
的に第７図に示す如くバルブ５及び８を開き試験管３内
の洗浄液を廃液ボトル12へ排出する。At the time of use, ethanol or the like can be used to sterilize the flow path system. In addition, the cleaning liquid bottle 11
The washing solution of, for example, sterilized water, sterilized buffer, culture solution and the like can be used. Specifically, as shown in FIG. 5, the valves 6, 7, 9 and 20 are opened to introduce the cleaning liquid into the tube 2 and the nozzle 1. Next, as shown in FIG. 6, valves 10, 7,
6 is opened and gas is sent into the test tube 3 for bubbling. Finally, as shown in FIG. 7, the valves 5 and 8 are opened and the cleaning liquid in the test tube 3 is discharged to the waste liquid bottle 12.
上記した本発明のプロトプラスト攪拌装置は、好ましく
は、電気的刺激により連続して細胞融合を行なう装置又
はフローサイトメーターのプロトプラスト懸濁液吸入口
に接続され、プロトプラスト融合装置又はフローサイト
メーター装置を構成することができる。本発明のプロト
プラスト攪拌装置が接続されるプロトプラスト融合を行
なう装置及びフローサイトメーターはこの分野において
周知である。本発明のプロトプラスト撹拌装置を接続し
た細胞融合装置及びフローサイトメーターにおいては、
常に均一の細胞密度の懸濁液が供給されるので、連続的
な細胞融合やセルソーティングを効率良く行なうことが
できる。The above-described protoplast agitation apparatus of the present invention is preferably connected to a protoplast suspension suction port of an apparatus or a flow cytometer that continuously performs cell fusion by electrical stimulation, and constitutes a protoplast fusion apparatus or a flow cytometer apparatus. can do. Devices and flow cytometers for performing protoplast fusion to which the protoplast stirrer of the present invention is connected are well known in the art. In the cell fusion device and flow cytometer to which the protoplast agitation device of the present invention is connected,
Since a suspension having a uniform cell density is always supplied, continuous cell fusion and cell sorting can be efficiently performed.
実施例１ 上記したプロトプラスト攪拌装置の流路13側に、電気的
に連続して細胞融合を行なう装置（日本分光社製CET-20
0型）をフローチャンバーと共に接続した。該細胞融合
装置は、半連続的にプロトプラスト懸濁液に電気刺激を
与え細胞を融合させる仕組になっている。すなわち、白
金パネル電極を備えたフロー型のチャンバー内にプロト
プラスト懸濁液を取り込み、電気パルス７を印加した
後、チャンバー内のプロトプラスト処理液を排出すると
同時に新しいプロトプラスト懸濁液を取り込む操作を繰
返すことにより、連続的にプロトプラストを融合させる
ための装置である。通常、該細胞融合装置には、サンプ
ルボトル中のプロトプラスト懸濁液をペリスタルポンプ
により送液しているが、処理時間が経過するにつれて次
第に懸濁液中のプロトプラストが沈降してしまい、プロ
トプラスト密度が均一な状態で送液できなくなることが
あった。Example 1 An apparatus for electrically and continuously fusing cells on the flow path 13 side of the above-described protoplast stirrer (CET-20 manufactured by JASCO Corporation)
Type 0) was connected with the flow chamber. The cell fusion device is designed to semi-continuously apply electrical stimulation to the protoplast suspension to fuse the cells. That is, the operation of taking in the protoplast suspension in a flow type chamber equipped with a platinum panel electrode, applying the electric pulse 7, and then discharging the protoplast treatment liquid in the chamber and taking in a new protoplast suspension at the same time are repeated. Is a device for continuously fusing protoplasts. Usually, in the cell fusion device, the protoplast suspension in the sample bottle is sent by a peristaltic pump, but the protoplasts in the suspension gradually settle down as the treatment time elapses, and the protoplast density is increased. In some cases, the solution could not be delivered in a uniform state.
そこで該攪拌装置を接続してプロトプラスト懸濁液のサ
ンプリングを行なったところ、プロトプラストが崩壊す
ることなく、効果的な攪拌が得られた。すなわち、フロ
ーチャンバー内へ送液する直前に１回ないしは数回の吸
引、吐出操作を繰返し行なうことにより、均一なプロト
プラスト懸濁液を送液できることがわかった。Therefore, when the protoplast suspension was sampled by connecting the stirrer, effective stirring was obtained without the protoplasts collapsing. That is, it was found that a uniform protoplast suspension can be sent by repeating suction and discharge operations once or several times immediately before sending the solution into the flow chamber.
実施例２ 上記したプロトプラスト攪拌装置の流路13側に、フロー
サイトメーターのサンプル導入管を接続した。フローサ
イトメーター（コールター社製、EPICS-752J型）のサン
プルボトルは、沈降を防ぐための回転振盪装置が備え付
けられているタイプであるが、植物細胞のプロトプラス
トをサンプルとする場合には、効果的な攪拌が得られ
ず、サンプルボトル内で細胞が沈降してしまう様子が肉
眼でも確認できる。Example 2 A sample introduction tube of a flow cytometer was connected to the flow path 13 side of the above protoplast stirrer. The flow cytometer (Coulter, EPICS-752J) sample bottle is a type equipped with a rotary shaker to prevent sedimentation, but it is effective when using plant cell protoplasts as a sample. It is possible to visually confirm that the cells are settled in the sample bottle without sufficient stirring.
そこで、該攪拌装置をフローサイトメーターのサンプル
導入管に接続してプロトプラスト懸濁液の連続送液を行
なった。攪拌は１回ないし数回、断続的に行ないながら
連続的にフローセルに送液した。フローセルからシース
液と共に流出される細胞数を検出器でカウントしたとこ
ろ、単位時間当りに流出されるプロトプラスト数は、常
に一定の値を示した。Therefore, the stirrer was connected to a sample introduction pipe of a flow cytometer to continuously feed the protoplast suspension. The solution was continuously fed to the flow cell while being stirred once or several times intermittently. When the number of cells flowing out from the flow cell together with the sheath liquid was counted by a detector, the number of protoplasts flowing out per unit time always showed a constant value.
［発明の効果］ 本発明によれば、懸濁プロトプラスト液を保持する試験
管等の容器を振盪することなく、液内のプロトプラスト
が効果的に攪拌される。また、加圧ポンプ等の圧力を適
当に調節することにより、壊れ易いプロトプラストの攪
拌にも有効である。従って、プロトプラストを材料にし
て行なう実験の前処理としての利用にも有効である。さ
らに、攪拌効果は容器の形態にほとんど左右されず、振
盪を行なう場合に必要なスペースも考慮しなくてすむた
め、小型化された機械装置、例えば細胞融合装置等の一
部として組み込めば理想的な攪拌効果を発揮できる。[Effect of the Invention] According to the present invention, protoplasts in a liquid are effectively stirred without shaking a container such as a test tube holding a suspension protoplast liquid. Further, by appropriately adjusting the pressure of a pressurizing pump or the like, it is also effective for stirring fragile protoplasts. Therefore, it is also effective for use as a pretreatment for an experiment using protoplasts as a material. Furthermore, the stirring effect is almost independent of the form of the container, and it does not need to consider the space required for shaking, so it is ideal to incorporate it as a part of a miniaturized mechanical device such as a cell fusion device. It can exert a good stirring effect.
第１図は本発明のプロトプラスト攪拌装置の一実施例を
示す模式図、 第２図及び第３図は第１図に示すプロトプラスト攪拌装
置の使用状態を説明するための部分図、 第４図は本発明のプロトプラスト攪拌装置におけるノズ
ルによるプロトプラスト懸濁液の攪拌の様子を示す模式
部分拡大図、 第５図ないし第７図は第１図に示すプロトプラスト攪拌
装置のさらなる使用状態を説明するための部分図であ
る。 １……ノズル、２……チューブ、３……試験管、４……
保持体、５、６、７、８、９、10……バルブ、11……洗
浄液ボトル、12……廃液ボトル、13……排出流路、14…
…制御回路、15……加圧ポンプ、16……レギュレータ
ー、17……滅菌フィルター、18……マニホールド、19…
…圧力メーター、20……バルブ、21……プロトプラスト
懸濁液、22……プロトプラストFIG. 1 is a schematic view showing an embodiment of the protoplast agitator of the present invention, FIGS. 2 and 3 are partial views for explaining the usage state of the protoplast agitator shown in FIG. 1, and FIG. FIG. 5 to FIG. 7 are schematic partial enlarged views showing a state of stirring a protoplast suspension by a nozzle in the protoplast stirring device of the present invention, and FIGS. 5 to 7 are parts for explaining a further use state of the protoplast stirring device shown in FIG. It is a figure. 1 ... Nozzle, 2 ... Tube, 3 ... Test tube, 4 ...
Holder, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ... Valve, 11 ... Washing liquid bottle, 12 ... Waste liquid bottle, 13 ... Discharge passage, 14 ...
… Control circuit, 15… Pressurizing pump, 16… Regulator, 17… Sterilization filter, 18… Manifold, 19…
… Pressure meter, 20 …… Valve, 21 …… Protoplast suspension, 22 …… Protoplast
Claims (3)
器と、該容器に収容される前記プロトプラスト懸濁液中
に少なくともその先端が浸漬される、空気を吸引するこ
となく前記プロトプラスト懸濁液の吸引及び吐出を行な
うためのノズルと、該ノズルに接続され、該ノズルから
吸引された前記プロトプラスト懸濁液を一時的に保存す
るためのチューブと、前記ノズルを介して前記プロトプ
ラスト懸濁液の吸引及び吐出を行なうための手段を有す
るプロトプラスト攪拌装置。1. A container for containing a protoplast suspension, and at least a tip thereof is immersed in the protoplast suspension contained in the container, wherein the protoplast suspension is prepared without sucking air. A nozzle for performing suction and discharge, a tube connected to the nozzle for temporarily storing the protoplast suspension sucked from the nozzle, and suction of the protoplast suspension through the nozzle And a protoplast stirrer having means for delivering.
う装置と、該装置のプロトプラスト懸濁液吸入口に接続
された請求項１に記載されたプロトプラスト攪拌装置と
を有する細胞融合装置。2. A cell fusion device comprising a device for continuously performing cell fusion by electrical stimulation and the protoplast agitation device according to claim 1, which is connected to a protoplast suspension suction port of the device.
メーターのプロトプラスト懸濁液吸入口に接続された請
求項１に記載されたプロトプラスト攪拌装置とを有する
フローサイトメーター装置。3. A flow cytometer device having a flow cytometer and the protoplast agitator according to claim 1, which is connected to a protoplast suspension suction port of the flow cytometer.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16196590 | 1990-06-20 | ||
| JP2-161965 | 1990-06-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04126066A JPH04126066A (en) | 1992-04-27 |
| JPH0710226B2 true JPH0710226B2 (en) | 1995-02-08 |
Family
ID=15745441
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2284775A Expired - Lifetime JPH0710226B2 (en) | 1990-06-20 | 1990-10-23 | Protoplast stirring device, cell fusion device and flow cytometer device including the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0710226B2 (en) |
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-
1990
- 1990-10-23 JP JP2284775A patent/JPH0710226B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
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|---|---|
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