JPH05509232A

JPH05509232A - Expression vector containing the HIVnef gene to enhance replication efficiency

Info

Publication number: JPH05509232A
Application number: JP51423991A
Authority: JP
Inventors: ハゼルチン，ウイリアム・エイ; ターウイリガー，アーネスト; ランゴフ，エリク
Original assignee: デイナ・フアーバー・キヤンサー・インステイテユート
Priority date: 1990-06-20
Filing date: 1991-06-18
Publication date: 1993-12-22
Also published as: WO1991019817A1; EP0535161A4; CA2085880A1; EP0535161A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】複製効率を増強するためのＨｒ　Ｖ　ｎ　ｅ　ｆ遺伝子を本発明は、複製コンピテントＨｒＶ−１プロウィルス又はＨＩＶ−２プロウイルス、及び上記のプロウィルスの複製効率を増強する配列を含有するベクターに関する。ヒト免疫不全’フィル７、　（ＨＩ　Ｖ　−１，ＨＴＬＶ　−１１ｒ、ＬＡＶ又はＨＴＬＶ−■■■／ＬＡｖともいう）は後天性免疫不全症候群（Ａ　Ｉ　Ｄ　Ｓ）及び関連疾患の病因である［Ｂａｒｒｅ−３ｉｎｏｕｓｓｉ　ｅｔ　ａｌ、。５ｃｉｅｎｃｅ　２２０：８６８−８７１　（１９８３）；Ｇａ１ｌｏ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２２４：５００−５０３　（１９８４）；Ｌｅｖｙ　ｅｔ　ａｌ、。５ｃｉｅｎｃｅ　２２５＋８４０−８４２（１９８４）；Ｐｏｐｏｖｉｃ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２２４゜４９７−５００　（１９８４）；Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２２４：５０６−５０８（１９８４）；Ｓｉｅｇａｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎ、Ｅｎｇｌ。Ｊ、Ｍｅｄ、３０５：１４３９−１４４４（１９８１）コ。本疾患は長い無症候性期間とその後の免疫系及び中枢神経系の進行性変性を特徴とする。ウィルスの研究は、複製が高度に調節され、Ｔリンパ球のＣＤ４陽性ヘルパーサブセツトの潜伏性及び溶解性感染が組織培養中で生じることを示す［Ｚａｇｕｒｙｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ２３１：８５０−８５３（１９８６）］。感感染者におけるウィルスの発現も、免疫反応を回避させるように調節されると考えられる。ＨＩ　Ｖ−１の調節及びゲノム構成の分子研究は、それが多数の遺伝子をコードすることを示す［Ｒａｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。Ｎａｔｕｒｅ　３１３：２７７−２８４　（１９８５）；５ａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ　ｅｔ　ａｌ、。５ｃｉｅｎｃｅ　２２７：４８４−４９２　（１９８５）；Ｍｕｅｓｊｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３１３：４５０−４５７　（１９８５）；Ｗａｉｎ −Ｈｏｂｓｏｎｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　４０：９−１７　（１９８５）］。レトロウィルスは一般に、３つの亜科、即ち腫瘍ウィルス、スプマウイルス及びレンチウィルスに分類される。腫瘍ウィルスによる感染は一般に、悪性疾患を伴う。これらのウィルスは一般に、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子、並びに長末端反復（ＬＴＲ）配列を包含する約８，０００〜１０，０００ヌクレオチドの一重鎖プラス鎖ＲＮＡゲノムを含有する。腫瘍ウィルスは一般に腫瘍遺伝子を含有する。スプマウイルスは、組織培養の泡沫状細胞変性的変化を誘発するけれども、１ｎｖｉｖｏでは病原性ではないと一般的に考えられる。レンチウィルスによる感染は一般的に時間がかかり、長い潜伏期間後に慢性衰弱性疾咀を引き起こす。レンチウィルスは、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子の他に、調節機能を有する多数の付加的遺伝子を有する。ヒト免疫不全ウィルス（ＨＴＶ）は、同じくゆっくりしだ感染を引き起こし、共通の構造的特性を有するために、レンチウィルスと分類されてきた［Ｈａａ　ｅ、Ａ、Ｔ、Ｎａｔｕｒｅ３２２　：１３０−１３６　（１９８６）参照］。ＨＴＶ−１は、他のレトロウィルスとそれぞれｇａｇ。ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を共有する［Ｈａｓｅ　ｌ　ｔ　ｉｎｅ、Ｗ。Ａ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｃｑｕｅｒｅｄ　ＩｍｍｕｎｅＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、１：２１７−２４０　（１９８８）］。ＨＩＶ−１はまた、ウィルス複製を調節する別の遺伝子を有する。ＨＩＶ−１ゲノムは、ｖｉｆ。ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖＳｖｐｕ及びｎｅｆタンパク質をコードする［Ｈａｓｅｌｔｉｎｅ、Ｗ、Ａ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＡｃｑｕｅｒｅｄ　Ｉｍｍｕｎｅ　ＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙＳｙｎｄｒｏｍｅ、上記］。さらに、ＨｒＶの長末端反復（ＬＴＲｓ）は、組込み、転写及びポリアデニル化に重要なＣ１５−作用配列を含有する。別のｃｉｓ作用信号はいくつかの新規ＨｒＶ遺伝子生成物質によりＨＩＶ配列を調節させる［Ｈａｓｅｌｔｉｎｅ、Ｗ、Ａ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＡｃｑｕｅｒｅｄ　Ｉｍｍｕｎｅ　ＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙＳｙｎｄｒｏｍｅ、上記；５ｏｄｒｏｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、。Ｓｃ　ｉ　ｅｎｃｅ　２３１　：１５４９−１５５３　（１９８６）；Ａｒｙａ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２２９：６９−７３（１９８５）；５ｏｄｒｏｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、。５ｃｉｅｎｃｅ　２２７：１７１−１７３　（１９８５）；５ｏｄｒｏｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２１：４１２−４１７　（１９８６）；Ｆｅｉｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ。、Ｃｅ１ｌ　４６：８０７−８１７（１９８６）；Ｗｏｎｇ−３ｔａａｌ　ｅｔ　ａｌ、、ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ、ａｎｄＨｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　３：３３−３９（１９８７）　、これらの記載内容は参照により本明細書中に含めるものとする］。ＨＩＶ−２及びサル免疫不全ウィルス（Ｓ　Ｉ　Ｖ）からのヌクレオチド配列も、構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ。並びにｔａｔ、ｒｅｖ及びｎｅｆ：Ａ節配列を含有する［Ｇｕｙａｄｅｒ、Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ。３２６：６６２−６６９　（１９８７）；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ、Ｌ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ３２８　：　５４３−５４７　（１９８７）、　これらの記載内容は参照に依り本明細書中に含めるものとする］。霊長類免疫不全ウィルスＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２及びＳＩＶのｎｅｆ遺伝子は、これらのウィルスと他のレトロウィルスとを識別する。これらの霊長類免疫不全ウィルスに最も密接に関連したレトロウィルスであるビスナウィルス、ヤギ関節炎及び脳炎ウィルス（ＣＡＥＶ）並びにウマ感染性貧血ウィルス（Ｅ　Ｉ　ＡＶ）のような有蹄類レンチウィルスは、ｎｅｆ、即ちエンベロープ（ｅｎｖ）の３ ′付近で開始し、３°　ＬＴＲに延びる長開放読み取り枠を指定する領域を欠く。ＨＩＶ及びＳＩＶウィルスにより指定されるｎｅｆは、脂肪酸であるミリスチン酸のアミノ末端及び保存アミノ酸配列での付加による翻訳後修飾を含めた共通の特徴を有する。ＨＩＶ−１ｎｅｆ遺伝子によりコードされるタンパク質は一般に、２０６アミノ酸長であるが、しかし鎖によっていくつかの変動が生じる。さらに、ｎｅｆタンパク質に対する抗体は、感染個体及び感染サル中で見いだされる。これは、ｎｅｆが自然感染において重要な役割を演じることを示唆する。しかしながら、これは他のデータにより否定される。例えば、ｎｅｆタンパク質は、多数の複製コンピテントＨＩＶ−１単離体中で時期尚早に切頭される。ＨＩＶ−１の１１１８株に由来するプロウィルスを用いた初期の研究は、ｎｅｔタンパク質を発現するウィルスはｎｅｆを欠くウィルスよりもわずかに遅＜ＣＤ４＋Ｔ細胞培養中で複製することを明らかにした［Ｔｅ　ｒｗｉ　］　Ｉ　ｉ　ｇｅ　ｒ。Ｅ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６０バ５４−７６０（１９８６）、この記載内容は参照により本明細書中に含めるものとする］。この所見は、ＢＲＵ及びＮＹ５株由来の同−遺伝子対を含めたウィルスの他のいくつかの対を用いて確証された［Ｌｕｃｉｗ、Ｐ、、、ｅｔａｌ、、ＰＮＡＳ　８４：１４３４−１４３８　（１９８７）　；Ｎｉｅｄｅｒｍａｎ、Ｔ。Ｍ、、ｅ　ｔ　ａ　Ｉ、、ＰＮＡＳ　８６　：１１２８−１１３２（１９８９）　；Ａｈｍａｄ、Ｎ、、ｅｔ　ａｌ、。５ｃｉｅｎｃｅ　２４１＋１４８１−１４８５　（１９８８）　；及びＣｈｅｎｇ−Ｍｙｅｒ、Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２４６：１６２９−１６３２（１９８９）、これらの記載内容は参照により本明細書中に含めるものとする］。ｎｅｆ−ウィルスと比較した場合のｎｅｆ　の複製の５〜１０倍の差が、Ｔ細胞中でのこれらのウィルスの増殖に関して報告されている。ｎｅｆを構造的に発現するＣＤ４　Ｔ細胞系がＨＩＶ−１の多数の株の増殖を遅らせることも報告されている［Ｃｈｅｎｇ、ｅｔ　ａｔ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２４６．上記コ。しかしながら、ｎｅｆ　及びｎｅｆ−ウィルス間のこの差はいつも認められるわけてはない。いくつかの研究では、ｎｅｆ陽性ウィルスはｎｅｆ欠損ウィルスと同様に又はそれよりわずかに良好に複製した。多くの研究がヒト免疫不全ウィルス（特にＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）の理解に費やされてきたけれども、その生活環を十分に理解するには問題があった。これらのウィルスに感染した個体は一般に長い無症候期間を示し、この間、ウィルス力価は低く、Ｔ４＋リンパ球のレベルは正常であって、このような時期は一般に何年にも及ぶ。本ウィルスはさらに、はとんどの動物において感染を引き起こさない。チンパンジーは感染し得るが、しかしチンパンジー中のウィルスは感染の徴候を容易に示さず、非上記少量のタンパク質又はＲＮＡしか作らないので、それらを追跡するのは非常に難しい。したがって、病気の治療のための動物モデルを開発するために、複製コンピテントＨＩＶプロウィルス、及びそのプロウィルスを用いて広範囲の細胞及び広範囲の動物に感染を引き起こすのを容易にする配列に対応するヌクレオチドを含有するベクターを有するのは非常に有用である。とくに、感染を阻止する薬剤をスクリーニングし、ある種の細胞における感染を停止又は最小限にし得る薬剤を開発し得るために、広範囲の細胞でｉｎ　ＶｉｔｒＯ及びｉｎ　ｖｉｖ。でウィルスを追跡し得る系においてこのようなベクターの使用は有用である。ＨＩＶの病因の異なる側面を調べるための生育可能な動物モデルを開発するに際して、ウィルスをｉｌ　ｖｉｖｏで追跡し得る系におけるこのようなベクターの使用も有用である。ワクチン及び／又は抗体を開発するために、より強力且つ有効な免疫反応を誘発するために動物の免疫系に対してより可視的な標的を提供するより活動的なウィルスを有することも有用状々はここに、ウィルス複製及び感染性に必要なＩ−Ｔ　Ｉ　Ｖ遺伝子生成物質（ＨＩＶセグメント）を発現するための、ＥＬＩ株の全構造遺伝子以外のＨＩＶゲノムに対応する十分なスプマウイルスのヌクレオチドを包含し、さらにＨ［ＶのＥＬＩ株のｎｅｆ遺伝子に対応するヌクレオチドの一配列（ｎｅｆ遺伝子セグメント）を含有するベクターを開発した。好ましくは、このベクターのＨＩ　Ｖセグメントは、機能的ｖｐｕ遺伝子セグメント又は機能的ｖｐｒ遺伝子セグメントをも含有する。さらに好ましくは、このベクターのＨＩＶセグメントは機能的ｖｐｕ及び機能的ｖｐｒ遺伝子セグメントの両方を含有する。第二の態様において、我々はＥＬＩ遺伝子セグメントを包含するベクターを記載する。好ましくは、このベクターも異種遺伝子を含有する。本ベクターは広範囲の細胞系をトランスフェクトするためにｉｎ　ｖｉｖｏ及びｉｎ　ｖｉｔｒｏで用い得る。図面の簡単な説明図１は、Ｈ［Ｖゲノム及び調製された一連のベクターの略図である。図２は、ＨＸＢ　ＥＬＩ　１−ｆｓベクターの一部の略図である。図３は、ＨＸＢ　ＥＬＩ　２及びＨＸＢ　ＥＬＴ　２−ｆｓベクターの一部の略図である。図４は、ＨＩＶセグメント、機能的ｎｅｆ遺伝子、機能的ｖｐｕ遺伝子及び機能的ｖｐｒ遺伝子を含有するベクターの略図である。図５は、ＨＸＢ−ＢＨ８ベクターの一部の略図である。図６は、種々のベクターによる経時的末梢血リンパ球（Ｐ　Ｂ　Ｌ）中のｐ２４産生のグラフである。図７は、時間を追った種々のベクターによりトランスフェクトされた単核球／マクロファージ中のｐ２４産生のグラフである。図８は、時間を追った種々のベクターによりｌ・ランスフェクトされたＰＢＬ中のｐ２４産生のグラフである。本発明の詳細な説明我々はここに、ウィルス複製及び感染性に必要なＨＩＶ遺伝子生成物質（ＨＩＶセグメントと呼ぶ）を発現するためのＨＩＶゲノムに対応する十分なスプマウイルスのヌクレオチド及びウィルス複製を増強するためのＥ　Ｌ　１株のｎｅｆ遺伝子に対応するヌクレオチドの一配列（ＥＬＩ　ｎｅｆ遺伝子セグメントと呼ぶ）を含有するベクターを開発した。好ましくは、Ｉ］■ＶセグメントはＨＩＶ−１又ハＨＩ　Ｖ　−２ゲノムのヌクレオチドに対応する。さらに好ましくは、ＨＩ　ＶセグメントはＨＩＶ−１ゲノムのヌクレオチドに対応する。好ましくは、ＨＩ　Ｖセグメントは）ＩＩＶ−１の全ＥＬＩ株に対応しない。対応するという用語は、保存的付加、欠失及び置換が可能であることを意味する。ＥＬＩのｎｅｆ遺伝子は、ｅｎｖ読み取り枠の末端の直後にあって３°　ＬＴＲのＵ３領域の大半を経て延びる、８８２２位置に位置するその開始フトンを有する。この遺伝子は、約２５〜２７Ｋｂの見掛けの分子量を有するタンパク質をコードする。ｎｅｆ機能についてのほとんどの研究が、原型Ａｍｅｒｉｃａｎ　１１１８株［Ｇａｌ　ｌｏ、　Ｒ，Ｃ，、ｅｔａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ　２２４：５００　（１９８４）；Ｒａｔｎｅｒ、Ｌ、、ｅｔ　ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ　３１３：２７７　（１９８５）　）　コ　、　Ｆｒｅｎｃｈ　株　ＬＡＶ　ＢＲＵ［Ｂａｒｒｅ− ３ｉｎｏｕｓｓｉ、Ｆ、、ｅｔ　ａｌ。５ｃｉｅｎｃｅ　２２０：８６８（１９８３）；Ｖａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ、Ｓ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　４０：１９（１９８５）］　（これはｒｌｌＢと約９８％相同な配列を共有する）、又はＡｍｅｒｉｃａｎ　５Ｆ−２株［Ｌａｖｙ、Ｊ。Ａ、、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２２９：８４０（１９８４）；５ａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ、Ｒ，。ｅｔ　ａｌ、、５ｉｅｎｃｅ　２２７＋４８４　（１９８５）コ（これはＤＮＡレベルてＩＩＩＢ及びＢＲＵの両方と９０％以上相同である）に由来するクローンを用いた。これらはすべて、強力なＴ細胞刺激株である。これに対比して、ＬＡＶ　ＥＬＴは、Ｔ　Ｉ　ＩＢ、５Ｆ−２及びＢＲＵ株と対照的により分岐的なりローンの１つである。本クローンは公知の全ＨＴ　Ｖ調節機能に関して無傷である［Ｃｏｈｅｎ、Ｅ、、ｅｔ　ａｌ、。Ｎａｔｕｒｅ　３３４：５３２　（１９８８）；Ｃｏｈｅｎ、ＥＡ、、ｅｔａｌ、、Ｊ、ＡＩＤＳ、３＋１１　（１９９０）。Ａｌｉｚｏｎ９Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１１．４６：８３（１９８６）、これらの記載内容はけ参照により本明細書中に含めるものとする］。Ｚａｉｒｉａｎ単離物から得られたＬＡＶ　ＥＬＩ　Ｆｒｅｎｃｈクローンは、新鮮なＰＨＡ刺激Ｐ　ＢＭＣを用いて患者の末梢血リンパ球を共培養することにより２４歳の女性ＡＩＤＳ、１！者から、１９８３年に単離された。ＬＡＶ　ＥＬＩのｎｅｆ生成物質とｎｅｆについての我々の前研究［Ｔｅｒｗｉ　Ｉ　］　１ｇｅｒ、Ｅ、Ｆ、、ｅｔ　ａｌ、、ＪＶｉｒｏｌ、６０ニア５４　（１９８６）］で用いたＩＩＩＢ由米Ｈｘｏｒｆクローンのｎｅｆ生成物質との間にはアミノ酸配列（総数２０７のうち）において４７の差異が認められる。機能的ｎｅｆセグメントを含有する本発明のベクターの調製に際しては、多数の技術を用い得る。例えば、機能的ｎｅｆ遺伝子を含有するクローン、例えばＬＡＶ　ＥＬＴを用い得る。標準的技法により、例えば制限エンドヌクレアーゼの使用により、ＬＡＶ　ＥＬ＋プロウィルスクローンからこのセグメントを得ることができる。例えば、８５０６位置に原ＢａｍＨ［Ｖ部位が及び９６０７位置に５ａｃ１部位がある。このセグメントは全ｎｅｔ遺伝子を含有する。標準技法により、ＥＬＴｎｅｆ遺伝子セグメントにのみ対応し、他のＥＬＩ遺伝子セグメントのほとんどに対応しないようこのセグメントを切り取ることができる。例えば、Ｅｃｏ　Ｒ１を、ｎｅｆ開始コドンから３０塩基対だけ上流にある位１ｔ８７９２に挿入し得る。ｒＩＩＢ株よりもＥＬＩ株とより相同のｎｅｆ配列を含有する他の）ＴＴＶクローンの１つを用いることもできる。本明細書中で用いた場合、ＩＩＩＢ株よりもＥＬＩ株とより相同なｎｅｆ配列を基礎にしたこれらのヌクレオチド配列はウィルス複製を増強し、ＥＬＩ　ｎｅｆと等価であると考えられる。この特性は、本発明の開示を基礎にして当業者が容易に確定し得る。あるいは、機能的”ＥＬｒ　ｎｅｆセグメント”ヌクレオチドセグメントを化学的に合成し得る。本発明の開示を基礎にした当業者に公知の他の技術を用いてＥＬＩｎｅｆセグメントを調製してもよい。本ＥＬＦ　ｎｅｆセグメントは、好ましくは使用する他のＨＩＶ−１又はＨＩＶ −２株から得られるｎｅｆセグメントカ存在し得る位置におけるＨＩＶセグメントを含有する本明細書に記載のベクター中に挿入し得る。ｎｅｆ遺伝子を有するＨ　Ｉ　Ｖセグメントを用いる場合は、ｎｅｆ遺伝子を切り取り、ＥＬＩ　ｎｅｆセグメントを挿入し得る。ＨＩＶセグメントは、複製及び感染に必要な全ＨＴＶ遺伝子に対応する十分な数のヌクレオチドを含有する。好ましくは、このセグメントは、機能的ｖｐｕ遺伝子又は機能的ｖｐｒ遺伝子に対応するヌクレオチドをも含有する。さらに好ましくは、それは機能的ｖｐｕ及びｖｐｒ遺伝子の両方に対応するヌクレオチドを含有する。例えば、ＨＸＢ２プロウィルス中のｖｐｕ配列はｖｐｕに対する開始コドンを含有せず、したがって機能的ｖｐｕ遺伝子を発現しない。ＨＴＶセグメントがＨＸＢ２株に対応するヌクレオチドを有する場合は、開始コドンをｖｐｕ配列を有する枠のすぐ上流及び枠内に挿入し得る。あるいは、機能的ｖｐｕ遺伝子を含有するＤＮＡの配列を機能的ｖｐｕ遺伝子を含有しない配列に置換し得る。これは、ヌクレオチド配列中の種々の制限部位を利用して実施し得る。クローンＢＨ８、Ｂ　Ｈ１０、ＬＡＶＥＬ■等は、機能的ｖｐｕ遺伝子を生しるヌクレオチド配列を含有する。ＨＸＢ２株は未熟終止コドンを有し、機能的ｖｐｒタンパク質を発現しない。機能的であるとは考えられないこのようなりｐｒ遺伝子に対応するＨ［Ｖセグメントを用いる場合は、ＬＡＶ　ＢＲＵ、ＬＡＶ　ＥＬＴ等のような機能的ｖｐｒ遺伝子生成物質を発現する株からの機能的ｖｐｕ遺伝子を挿入し得る。前記のように、ベクターは、当業者に公知の種々の方法により合成し得る。調製し得る種々の異なるベクターを図１〜４に示す。ＥＬＴ　ｎｅｆ配列を含有する配列の異なる組み合わせを構築し、ＨＩＶ配列の３′端内に挿入し得るが、このような配列は複製コンピテントＨＸＢ２　（ＨＸＢｃ２とも呼ばれる）プロウィルスに対応するヌクレオチドを有する。適合性制限部位は、必要な標準技法により、例えば特定オリゴヌクレオチドの突然変異誘発により生成し得る。例えば、ＬＡＶ　ＥＬＩ内のＢ　ａ　ｍ　Ｈ１部位、並びにＬ　Ａ　Ｖ　Ｅ　Ｔ−Ｔ及びＨＸ　Ｂ　２両配列内の新規のＥｃｏ　Ｒ１部位。好ましくは、制限部位を“挿入”するために作られた各ヌクレオチド変化を用いる場合、変化は任意の遺伝子によりコードされる予定のアミノ酸配列を変えないか、又は最小度に保存的アミノ酸変化を引き起こす。構築物はシーケンシングにより確証し得る。ＨＸＢ−Ｅｌｌ　１は、位１１８５０６の原ＢａｍＨＴ部位と同様３°離れて、ｅｎｖ及びｒｅｖ遺伝子配列内の、ｎｅｆの上流の全ＨＸＢ２配列、並びにその位置と位１９６０７のＳａｃ１部位との開のＬＡＶＥＬＩ配列から成る。残りの３’　ＬＴＲ配列は、ＨＸＢ２に由来する。図１及び２を参照して頂きたい。ＨＸＢ−ＥＬ　ｒ−２においては、ＨＸ　Ｂ　２及びＬＡＶＥＬＩ配列間の５゛接合部は、ｎｅｆ開始コドンから３０塩基対（ｂ　ｐ）だけ上流の位置８７９２の新規のＥｃｏ　ＲＴ部位に対して下流に移される。図１及び３参照。ＨＸ　Ｂ　−Ｅ　Ｌ　ｒ　−２は、このＥｃｏ　Ｒ１部位と同じく３′離れたＨ　Ｘ　Ｂ　２配列のみを含有する。ＬＡＶＥＬＩ配列は、Ｉ− Ｉ　Ｘ　Ｂ　−Ｅ　Ｌ、　Ｉ　−２の場合と同様に、この位置３°から９６０７のＳａｃ　］部位まで延びる。これらのベクターは機能的ｖｐｒ又はｖｐｕ遺伝子を含有しない。しがしながら、機能的遺伝子は上記のように容易に付加し得る。例えば、位１１２００８のＡｐａ　１部位及び位ｆｆｉ！５８２０のＳａｌ　１部位間の配列に対応するこれらのベクター中の配列を切り取って、それを機能的ｖｐｒ読み取り枠を含有する、クローンＬＡＶ　ＢＲＵからの対応する配列と置換する。同様に、位ｉ１５８２　ＱのＳａｌ　１部位及び位ｆ１６３８２のｋｐｎ　１部位間の配列に対応するベクターからの配列を切り取って、機能的ｖｐｕ遺伝子を含有する、ＢＨＩＯからの対応するセグメントき置換し得る。上記のように、その他のストラテジー及びこのストラテジーの変法を、本発明の開示を基礎にして当業者は用い得る。ＥＬＩ　ｎｅｆ遺伝子を含有するプロウィルスプラスミド、及び上記のＨＴＶセグメントベクターは、制限酵素部位の使用によるといった公知の方法によりこの配列をプラスミド主鎖中に挿入することにより容易に作製し得る。本明細書中で用いる場合、十分数のヌクレオチドという用語は、特許請求された機能的能力が失われない限り、付加、欠失及び置換を可能にする。例えば、ウィルス複製に換算してｎｅｆ遺伝子の機能的能力を言及する場合には、その結果束じるウィルスの複製は同−遺伝子性ｎｅｆウィルスによるよりも多くなければならない。ベクターを用いて、標準的方法により望ましい細胞をトランスフェクトする。例えば、リン酸カルシウム同時沈殿法又はＤＥＡＥデキストラン法を用いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで細胞をトランスフェクトし得る。あるいは、このベクターを用いて、ｉｎ　ｖｉｖｏで生細胞をトランスフェクトし得る。このような方法は、当業者には公知である。本発明のｎｅｆ遺伝子セグメントの使用により、ＨＩ　Ｖ株、例えば末梢血単核球（ＰＢＭＣ）　、並びに精製−次ヒト単核球又は単核球様細胞系中で十分に複製しないＨＸＢ２株を得ることができるし、このような細胞系における感染性の増強が得られる。理論的に結びつけるつもりはないが、ＨＩＶゲノムの種々の遺伝子間の複雑な一連の相互作用が認められ、これらは本ウィルスを用いて観察されるより急性の作用のいくつかに関与し得ると思われる。例えば、ＨＩ　Ｖが感染個体における免疫反応をかわすことにより提案されたストラテジーのひとつは、大半の感染細胞内で、ウィルスが休眠状態にあるか又は非常に低レベルで複製する低レベル感染状態の確立によるものである。したがって、宿主ＤＮＡ中へのウィルスの取り込みを経てウィルスは安定感染を確立し得る。このような目的を達成するために、非常に“攻撃的”であるとは見えないように、原ウィルスを最初に注意深く調節する。本発明のｎｅｆ遺伝子セグメントを取り出して、それを他の株又はＨＩＶ −２ゲノムとともに挿入することにより、いくつかの相互作用を克服し得ると考えられる。したがって、ベクターにより構成されるブａウィルスはより攻前駆体はＰＢＭＣ中であまり複製しなかった。代償的突然変異が、ＨＸＢ２に対する前駆体の３’ ｅｎｖ配列中に生じ、ＰＢＭＣ中で十分に複製し得るウィルスを産生した。ＨＸＢ２ウィルスは、原ｎｅｆ突然変異並びに３’　ｅｎｖ配列における代償的突然変異を含有する。さらに、３’ｅｎｖ代償的突然変異は、ＢＩ３及びＢＨ１０ｎｅｆ遺伝子のような密接に関連したｎｅｔ配列の存在下で増殖に陰性の作用を及ぼす。この陰性相互作用は、ＥＬＩ　ｎｅｆ遺伝子のような分岐的ｎｅｆ配列には及ばない。その結果として、ｎｅｆの外側のＨＩＶの配列はｎｅｆ機能に影響を及ぼす。遺伝子性配列との相互作用に関してｎｅｆ対立遺伝子に差異が認められる。ＢＩ３及びＢＨＩＯｎｅｆは、ＨＸＢ２　３°　ｅｎｖ配列を伴う陰性調節遺伝子である。ＥＬＩ　ｎｅｆは、ＨＸＢ２又はＥＬＴ３’　ｅｎｖ配列を伴う陽性調節遺伝子である。ＥＬＩ　ｎｅｆは、−次単核球及びマクロファージの増殖のための必須遺伝子である。したがって、ＨＩＶ株が示す種々の向性を本発明のベクターは示さない。したがって、このようなベクターを用いて、本株が一般的になし得るより広い範囲の細胞を形質転換し得る。標準的技法を用いて、本ベクターを用いて動物の抗原反応を生じさせ、次いで生じた抗体を治療に用い得る。ｎｅｆの簡単なフレームシフト突然変異を含有するクローン化８１部位ＩＤ１ｅウイルスはｎｅｆ読み取り枠の復位に関してｉｎ　ｖｉｖｏで戻り復帰体に対する強い傾向を有するということが報告されている。しばしば提案されるように、単核球がｉｎ　ｖｉｖｏでのＨｒＶ感染の一次初期標的であるか及び／又は感染マクロファージが系内のウィルスの大型プールを保持するための重要な長期貯蔵所を構成する場合に、なぜ無傷ｎｅｆ機能に対する強力な選択圧がｉｎ　ｖｉｖｏに存在し、しかし必然的にｉｎ　ｖｉｔｒｏには存在しないかを、即ちＥＬＩ　ｎｅｆＪｌ伝子により示される同性を我々の発見は説明する。理論的に結びつけるつもりはないが、異なる種類のＣＤ４−陽性細胞に対する向性の大きな変化は事実、明瞭なウィルス調節現象である。このベクターを用いてｉｎ　ＶｉｔｒＯ又はｉｎ　ｖｉｖ。で細胞をトランスフェクトすると、薬剤をスクリーニングし、ウィルスの病原性を理解するための系を改良することができる。このベクターにより形質転換される細胞の範囲はＩＴＩＢ株のような他の実験呈味を用いた場合よりも広いため、一般的なものより広い範囲の感染細胞におけるウィルスの拡散に及ぼす薬剤の作用を調べることができる。例えば、それを−次細胞培養における試験に用いて、ＥＬＩｎｅｆが単核球中での抗レベルの複製を可能にする機序を確定し得る。このような情報は、特にウィルスの単核球向性株が、免疫学的損傷が明らかであるか否かとは関係なく、中枢神経系疾患の発症における重要な役割を演じることを示唆する証拠の点で、ＡＩＤＳの疾病進行の機序を理解ための極めて重要な関連性の１つである［Ｋｏｙａｎａｇｉ、Ｙ、、ｅｔ　ａｔ、。５ｃｉｅｎｃｅ　２３６：８１９　（１９８７）］。ある検定において、予定の化合物を細胞又は体液に添加し、その後それらの細胞を本発明のベクターでトランスフェクトしようと試み得る。多量のベクターを、このような細胞を形質転換するのに有効であることが予め確定された細胞に添加する。その後、その細胞の感染性のレベルを測定して、ウィルスの拡散を防止するに際しての化合物の有効性を確定する。あるいは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ又は１ｎｖｉｖｏで本発明のベクターを用いて先ず細胞をトランスフェクトし、その後予定の化合物を細胞に添加し、次いてウィルスの拡散を防止するに際しての化合物の有効性を確定する。観察したパラメーターとしては、シンシチウム形成、単一細胞殺害、Ｒ■Ａにより測定されるようなＨＩＶｐ２４コアタンパク質の上清のレベル、ＡＩＤＳ患者血清を用いた代謝的標識化ウィルスタンパク質の免疫沈降等が挙げられる。ベクターは、好ましくは一次単核球／′マクロファージを用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用する。ベクターは、ｉｎ　ｖｉｖｏで細胞を“感染”するために用いてもよい。概して、ＨＩＶの伝統的実験呈味は、伝統的動物モデル系中では、例えば幾人かの研究者達がＨＴＶ病原性のあ□　Ｃる観点に関して生育可能な動物モデル中で発症させようとしている５ＣＩＤ−ＨＵマウス系においては、非常に不十分に複製した。前記のように、本発明は典型的実験呈味よりも積極的に一次リンパ球中で複製し、５ＣＩＤ−ＨＵマウスの場合よりももっと有効に複製するに違いないプロウィルスクローンを生じる。他の好ましい動物モデルとしては、ヒト以外の哺乳類が挙げられる。このような哺乳類の好ましい例としては、ウサギ、マウス、らっと、ネコ及び霊長類が挙げられる。好ましい霊長類としては、チノパンツー及びサルが挙げられる。感染を確立するために動物に投与するのに必要な有効量のベクターは容易に確定し得る。例えば、０．１μｇ〜約Ｉ　ＱｍＨのベクター／体重１ｋｇである。投与は、筋肉内、腹腔内、静脈内又は皮下といったような非経口的投与を含めた任意の種々の経路が可能である。 “感染″（トランスフェクション）を確立するために必要な量及び条件が分かれば、予め選択した化合物の１ｎｖｉｖｏでの有効性を確立するためのモデル検定の開発が可能になる。標準的手段により、例えば注射によって動物に化合物を投与する。その後、感染を正常に確立し、感染が発症するか否かを、そして発症した場合には感染の程度を測定するために動物を観察するのに十分な量のベクターを投与する。あるいは、先ず動物における感染を確立するのに十分な量のベクターを投与し、次いで予め選択した化合物を投与する。その後、ベクターによる“感染”に及ぼす予選走化合物の作用を測定するために動物を観察する。別の態様では、ウィルス複製を増強するためのＨＩＶ−１のＥＬＩ株のｎｅｆ遺伝子に対応する十分数のヌクレオチド（ＥＬＩ　ｎｅｆ遺伝子セグメント）、プロモーター配列及びポリアデニル化配列は含有するがヌクレオチド配列をコードする全ＥＬＩは含有しないベクターを調製する。好ましくは、ベクターは、ＬＴＲ配列を含有し、さらに好ましくはＨＩＶＬＴＲ配列を含有する。プロモーターは、ＬＴＲであるか又は別のウィルスプロモーター、例えばＳＬ３プロモーターのような別個のプロモーターであり得る。このベクターは、好ましくは異種遺伝子を含有する。ある態様においては、異種遺伝子はマーカー遺伝子である。マーカー遺伝子は、当業界で十分公知であって、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ　Ｔ）遺伝子、又はヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のような成長ホルモンである。ベクターは、複製コンピテントＨＩＶプロウィルスを含有するベクターを用いて細胞中に、あるいは複製コンピテントＨｒ　Ｖ、例えばＨＸＢ２又はＨＸＢ−ＢＩ３によりトランスフェクトされる細胞系中に共トランスフェクトされ得る。これにより、ＥＬＩ　ｎｅｆセグメント及び他のウィルス遺伝子間の相互作用の分析がさらに可能になる。このベクターを用いるれば、このようなウィルスにトランスフェクトされる宿主の範囲も増大するに違いない。以下の実施例により本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明を理解するためのものであって、本発明を限定するものではない。ＨＸ　Ｂ　２　ハ、）（ＩＶ−１１１７）Ｉ　Ｉ　１８株由来の全長感染性プロウィルスであって［Ｆｉｓｈｅｒ、Ａ、Ｇ、、ｅｔ　ａｌ、。Ｎａｔｕｒｅ　３１６：２６２−２６５　（１９８５）］、各遺伝子における単一点突然変異の結果としてｎｅｆ、ｖｐｒ及びｖｐｕ遺伝子を欠く。ヌクレオチド８５０６にＢａｍＨ１部位が認められ、この位置を種々のプラスミドの調製に用いた（図１参照）。適合性制限部位−特にＬＡＶ　ＥＬＩ内のＢ　ａ　ｍ　Ｈｒ部位、並びにＬＡＶ　ＥＬＩ及びＩ−Ｉ　Ｘ　Ｂ　２両配列内の新規のＥｃ。Ｒｒ部位を、必要な場合は特定オリゴヌクレオチドの突然変異誘発により生成した。各々の場合、任意の遺伝子によりコードされる予定のアミノ酸配列を変えない変化を生じさせた。構築物はシーケンシングにより確証した。ＨＸＢ−ＥＬＩ　１は、位置８５０６の原Ｂ　ａ　ｍ　ＨＴ部位と同様３“離れて、ｅｎｖ及びｒｅｖ遺伝遺伝列配列内ｎｅｆの上流の全ＨＸＢ２配列、並びにその位置と位置９６０７のＳａｃ１部位との間のＬＡＶＥＬＩ配列から成る（図１及び２参照）。残りの３“　ＬＴＲ配列は、ＨＸ　Ｂ　２に由来する。ＨＸＢ−ＥＬＴ−２においては、ＨＸＢ２及びＬ　Ａ　Ｖ　Ｅ　Ｔ−１配列間の５″接合部は、ｎｅｆ開始コドンから３０塩基対（ｂ　ｐ）だけ上流の位ｆｆ１８７９２の新規のＥｃｏＲＩ部位に対して下流に移される。図１及び３参照。ＨＸＢ−ＥＬ　Ｉ−２は、このＥｃｏ　Ｒ１部位と同しく３′離れたＨＸＢ２配列のみを含有する。ＬＡＶ　ＥＬＩ配列は、ＨＸＢ−ＥＬ　Ｔ−２（Ｄ場合と同様に、この位置３゛から９６０７のＳａｃ　１部位まで延びる。ＥＬＦ配列による置換も、ｒｅｖの二次コードエクソン内、トランスメンブランタンパク質のカルボキシ末端をコードするｅｎｖ遺伝子のその部分、並びにｎｅｆと重複する３゜ＬＴＲのＵ３領域内に変化をもたらした［５ｏｄｒｏｓｋｉ。Ｊ、Ｇ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３７１：４１２（１９８６）］。したがって、フレームシフトを組換え体のｎｅｆ読み取り枠内に導入して、機能障害性ｎｅｆ−ＨＸＢ−ＥＬＴ　１−ｎｅｆを含有する二次同一遺伝子クローンを生成した。４塩基対フレームシフトを、位置８９２８の原Ｘｈｏ１部位を充填することによりＨＸＢ−ＥＬ　ｒ−１及び２のｎｅｆコード配列内に導入して、同一遺伝子ｎｅｆ欠損プロウィルスを生成した。それぞれ図２及び３を参照していただきたい。ＨＸＢ−ＢＩ３においては、原Ｘｈｏ１部位の３°末端は、ＢＨ８プロウィルス由来の配列を含有した。この株は、全ｎｅｆ開放読み取り枠を含有する１１１８株であって、元は十　季ＨＸＢ−ｏｒｆと呼ばれた（図５参照）ｏ　ｖｐｒ　、ｖｐｕＨＸＢ−ＢＩ３− Ｒプロウィルスは、ｖｐｒ−１ｖｐｕ−ＨＸ　Ｂ　−Ｂ　Ｈ８１，：由来した。位置２００８のＡｐａ　１部位と位置５８２０のＳａｌ　１部位との間のＨＸＢ −ＢＨ８のプロウィルス配列を、クローンＬＡＶ　ＢＲＵからの対応する配列と置換した。このセグメントは機能的ｖｐｒ読み取り枠を含む。次に、５８２０及び位置６３８２のｋｐｎ　１部位間のＨＸＢ−ＢＨ８配列を切り取って、密接に関連するＴＩＩＢクローンであるＢＨＩＯからの対応するセグメントで置換した。このセグメントは機能的ｖｐｕ遺伝子を含む。ＨＸＢ−ＥＬＩ　１において同一の置換を行なって、ＨＸＢ−ＥＬＩ　１−Ｒを生成した（図４参照）。ＨＸＢ−ＥＬＴ　１−Ｒ配列を、ＥｃｏＲ部位及びＰｖｕ　Ｉ　Ｔ部位間の公知のプラスミドｐＢＲ３２２中に挿入して、プラスミドＤＦＣＩ−ＨＴを生成した。これはｐＢＲ３２２主鎖を伴うＨＸＢ−Ｅｌ、、Ｉ　１−Ｒ配列を含有する。このプラスミドの標本は、ブダペスト条約下で、寄託番号６８３４３号としてＡｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）に寄託ＬｏｐａｔａＳｅｔ　ａｔ、、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ。１２：５７０７−５７１７　（１９８４）；Ｑｕｅｅｎ　ａｎｄＢａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｃｅ１ｌ　３３ニア４ｌ−７４８（１９８３）；５ｏｄｒｏｓｋｉ、Ｊ、、ｅｔ　ａｔ、。５ｃｉｅｎｃｅ　２３１：１５４９−１５５３（１９８６）に記載されているように、各プロウィルスプラスミド１０ｍｇを用いて０日目にＤＥＡＥ−デキストラン法により１０７個のＪｕｒｋａｔ細胞をトランスフェクトした。その後、培養を１２．５ｍｌのＲＰＭＩ＋１５％ウシ胎仔血清中ウシ保持し、毎日の全培地変化を生じさせた。各上清のアリコートを、後の検定のために各給餌時間に取っておいた。上清のＨＩＶ　ｐ２４コアタンパク質のレベルの他に、シンシチウム形成及び総細胞数に関して培養をモニタリングした。Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｖｉｏｌ。６０．７５４−７６０　（１９８６）に記載されて０るようζこ、各トランスフェクトＪｕｒｋａｔ培養のアリコートを代謝的Ｉこ標識化して、免疫沈降用に採集した。各試料の半分をＡＩＤＳ患者の血清を用いて免疫沈降させた。他の半分＋１、ｎｅｆタンパク質抗血清と反応させた。Ｌａ　ｅｍｍ　ｌ　ｉ、Ｕ、に、。Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−６８５　（１９７０）ｌ：記載されているように、免疫沈降及びポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した。健常血清陰性血液ドナーから得られた淡黄色被膜からのＦｉｃｏｌ１分離により、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。ＰＢＭＣ培養を、１０％ウシウシ血清及び抗体並びに２０％Ｐ　ＨＡ状態調節培地を含有するＲＰＭＩ−１６４０中の２４ｍｍ組織培養ウェル（Ｃｏ　ｓ　ｔ　ａ　ｒ、　ＭＡ）に４×１０６の密度で植付けた。４８時間培養後、ウィルスを各ウェルに添加した。Ｊ　ＩＪ　ｒ　ｋ　ａ　を細胞培養のトランスフェクションから滴定ウィルスストックを得た。ｐ２４　２０ｎｇと等価の感染上清を一次細胞の各ウェルに添加した。感染細胞培養を一夜インキユベートし、次いて成長培地を注意して各ウェルからデカントし、新鮮な培地に交換した。最終培地交換後、培養に給餌する前に３日毎にｐ２４検定用の試料を採集した。市販のＲ１Δキット（Ｄｕｐｏｎｔ、ＮＥＮ）を用いて、ｐ２４を測定した。次に、等量の細胞無含有ウィルスを用いて新鮮な活性化末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）なら精製−次ヒト単核球を上記と同一手段によって感染させた。上清中のｐ２４コア抗原を測定することにより、各ウィルスの複製を時間を追って検定した。単核球は、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配上での分別により、ＰＢＭＣから得た。汚染Ｔ細胞は、ノイラミニダーゼ処理ヒツジ赤血球を用いてロゼツト化することにより除去した低密度細胞からのものであった。単核球集団の純度は、単離単核球のサイドピンスピン細胞標本のイムノペルオキシダーゼ染色により立証した。Ｌ　ｅ　ｕ　３−Ｍで染色した細胞の９５％以上、及び〈５％がＬｅｕ　１８（ＣＤ２０）　、Ｌｅｕ　３　（ＣＤ４）又はＬｅｕ（ＣＤ８）ｌ：対して陽性であった。４×１０６個の単核球をＰ　８ＭＣ培養用に上記のように培養し、比較可能な増殖環境を保持した。ウィルスストックをＰＢＭＣに関して記載されているのと同様に用い、ｐ２４検定用試料を同時に収穫した。前記のように、ＨＸＢ−ＥＬＩ　１を生成するに際して３′ＬＡＶ　ＥＬＩ配列のｌ、ｌＫｂセグメントを挿入すると、ｒｅｖの二次コードエクソン内、トランスメンブランタンパク質のカルボキシ末端をコードするｅｎｖ遺伝子のその部分、並びにｎｅｆと重複する３’　ＬＴＲのＵ３領域内に変化が生じた。フレームシフトベクターＨＸＢ−ＥＬＦ　１−ｆｓを生成して、機能障害性ｎｅｆを含有する二次同一遺伝子クローンを生じた。次に、プロウィルス構築物のこの対を上記のようにＪｕｒｋａｔ細胞中にトランスフェクトし、ウィルス複製の動力学的所見を比較した。ＴＴＴＢ由来ｎｅｆ陽性（ＨＸ　Ｂ　−Ｂ　Ｈ８）及び陰性（ＨＸＢ２）ウィルスの対も、対照としてトランスフェクトした。上記のように、ＨＸＢ２はｎｅｆ内に点突然変異を含有し、その結果アミノ酸１２３の後の読み取り枠中に挿入されている未熟停止コドンを生しる。この切頭化ｎｅｆタンパク質は機能性でない。ＨＸＢ−Ｂ）Ｔ８（以前はＨｘ−ｏｒｆと呼ばれた）はこの突然変異を含有せず、全長ｎｅｆ生成物質を産生するＥＴｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ、Ｅ、Ｆ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ。Ｖｉ　ｒｏ　１．６０　：　７５４　（１９８６）］。上清ｐ２４のレベルの遅延は、初期トランスフェクト後にＨＸＢ　２を含有するものと比較した場合、ＨＸ　Ｂ　−Ｂ　Ｔ−Ｔ　８でトランスフェクトした培養に検出された。シンシチウム形成のパターンの顕著な差異も、明らかであった。トランスフェクト後のＨＸＢ−ＥＬＩ　１由来のウィルスの複製は、事実上ＨＸ　Ｂ２とは異ならなかった。別の実験ては、Ｔ−Ｔ　Ｘ　Ｂ　−Ｅ　Ｌ　Ｔ　１によってしめされるウィルス感染の動力学的所見は、ＩＴ　Ｘ　Ｂ　２の場合と同等であるか又はわずかに増強された。しかしながら、測定されたすべてのパラメーターにより、同−遺伝子性ｎｅｆ欠損組換え体プロウィルス（ＨＸＢ−ＥＬＴｌ−ｆｓ）由来のウィルスの複製は顕著に減衰した。ｎｅｆ陰性ウィルス培養中の上清ｐ２４レベルは、同−遺伝子性ｎｅｆ！Ｉｔ性ウィルス培養と比較して、この実験において１００分の１に減少した。ピーク細胞関連ウィルスタンパク質産生もこのウィルス培養中で劇的に減少したが、これは免疫沈降処理におけるかすかなウィルスバンドで示された。これらの測定値は、シンシチウム形成により評価したかあるいは経時的総細胞数の現象により評価したかに関係なく、感染細胞に及ぼすＨＸＢ−ＥＬ　Ｉ−ｎｅｆウィルスの細胞変性作用の劇的な減衰と平行した。同様の結果が反復実験から得られ、時折ｎｅｆ陽性及びｎｅｆ陰性ＨＸＢ−ＥＬ　Ｉ−１クロ一ン間の動力学の大きな差異さえ認められた。ｎｅｆ特異性ボリクａ−ナルウサギ血清を用いた代謝的標識化感染細胞溶解物は、ＨＸ　Ｂ　−Ｂ　Ｈ８又はＨＸＢ−Ｅｌｌ　１ウイルスに感染した細胞からの溶解物中の２７Ｋｂ　ｎｅｆタンパク質の存在を明示した。このバンドはＨＸＢ２又はＨＸＢ−ＥＬＩ　１−ｆｓでトランスフェクトされた細胞からの溶解物中には認められなかった。ＨＸ　Ｂ　−Ｂ　Ｈ８によるトランスフェクトは、機能的ｎｅｆ遺伝子のＨＸ　Ｂ　２プロウイルスへの導入によりｎｅｆ一対部分よりもＣＤ４　Ｔｍｍ上上ゆっくりと複製するウィルスが生したという初期の報告を確証した。ＬＡＶ　ＥＬＴ　ｎｅｆ遺伝子は、Ｊｕｒｋａｔ細胞中のウィルスの複製に及ぼす顕著な増強作用を示すと考えられた。この陽性作用は大きく、それとは逆に、ウィルスのＨＸＢ−ＢＨ８／ＨＸＢ２対に関連して観察されたｒｒｒＢ　ｎｅｆの陰性作用は小さかった。プロウィルスのＨＸＢ−ＥＬＦ　１対の別々に得られたクローンを用いた反復実験は、比較可能な結果を生し、ある構築物内の多少能れた部位での無作為二次変化が結果に関与するという可能性を排除した。われわれの実験計画における人工生成物質の生成野可能性を最小限にするために、別のプロウィルス構築物を上記と同様に調製した。動力学的試験も、トランスフェクト化安定Ｔ細胞系に対するものとして、細胞無含有ウィルスで試験した新たに培養した一次細胞にも及んた。ＨＸＢ−ＥＬＩ　２は、ＨＸＢ−ＥＬｒ　Ｌより小さなＬＡＶ　ＥＬＩ配列挿入を含有した（図１及び３参照）。８００塩基対挿入物の３゛末端は同しままであるが、しかし５°末端はｎｅｆ開始コドンに対する５°をちょうど３０塩基対だけ下流に移動する。ＨＸＢ−Ｅｌｌ　２及びＨＸＢ２間のｎｅｆタンパク質の予定アミノ酸配列中の４７の差異の他には、ＨＸＢ−ＥＬＩ　２の予定ｅｎｖ生成物質中の単一アミノ酸変化のみが認められる。位置８５４でのＨＸＢ２ｅｎｖ生成物質中のイソロイシン、即ちｇｐ４１のカルボキシ末端前の２残基たけがＨＸＢ−ＥＬＩ　２中のセリンに変換された。その他のいかなるコード枠にも変化は認められない。ＨＸＢ−ＥＬ［２プロウイルスの同一遺伝子ｎｅｆ欠損形態も、上記のようにｎｅｆ、ＨＸＢ−ＥＬＴ　２−ｆｓへのフレームンフトの挿入により生成した。　前記のように、ＨＸＢ２はｎｅｆ、ｖｐｕ　［Ｃｏｈｅｎ、Ｅ、Ａ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ。Ａｒｏｓ　３：１１　（１９９０）］及びｖｐｒ　［ＡＩ　１ｚｏｎ。Ｍ、　、　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｃｅ１ｌ　４６：８３　（１９８６）］遺伝子の他に、他の２つの調節遺伝子を欠いている。ＨＸＢ−ＢＩ３に由来するＨＸＢ− ＢＩ３−Ｒ（修復用）プロウィルスでは、無傷ｖｐｒ及びｖｐｕ枠は、他のＴＴＩＢクローン及び前記のＬＡＶ　ＥＬＩからの配列を用いた組換えにより修復した（図１参照）。したがって、ＨＸＢ−ＢＩ３−Ｒは）ＴＩＶ遺伝子のすべてに対して十分に機能的であると予測されるプロウィルスを表わす。ＨＸＢ−ＥＬＴ　１において同一の組換えを行なって、ＨＸＢ−ＥＬＩ　１−Ｒを生成した（図４参照）。したがって、ＨＸＢ−ＢＩ３−Ｒ及びＨＸＢ−ＥＬＴ　１−Ｒは同−遺伝子性であるが、但し、ＨＸＢ−ＥＬＩ　１−Ｒ中の１、ＩＫｂのＬＡ、Ｖ　ＥＬＩ配列＋！ＨＸＢ−ＢＨＩ　Ｃ１−Ｒ中の対応するＩＴＩＢ配列に取って代わる。ＴＩＩＢはＴ細胞系中では非常によく複製するが、しかしＰＢＭＣ中ではあまり複製せず、特に−次単核球又は単核球用細胞系中では弱い［Ｋｏｙａｎａｇｉ、Ｙ、ｅｔａｌ、。５ｃｉｅｎｃｅ、２３６：８１９　（１９８７）］。かろうじて検出可能なレベルのｐ２４抗原産生が、ＨＸＢ２ウィルスに感染したＰＢＭＣの上清内に観察された（図６参照）。同様に、ＨＸＢ−ＢＩ３及びＨＸ　Ｂ　−Ｂ　Ｈ８−Ｒウィルスも、ＨＸ　Ｂ　２上のＰＢＭＣ中で有意の活性増大を示さなかった（図６）。これら３つのいかなるウィルスによる検出可能な複製も、単核球マクロファージ培養中には観察されなかった（図７）。図６及び７はともに、ＨＸＢ−ＥＬＩ　１（ＥＬＴ−１ｎｅｆ　、中空丸）　、ＨＸＢ−ＥＬ　Ｉ　２　（ＥＬ　Ｔ−２ｎｅｆ　Ｈ中実矩形）、ＨＸＢ−ＢＩ３　（ＢＩ３　ｎｅｆ　。中空矩形）；ＨＸＢ−ＥＬＩ　１−ｆｓ（ＥＬＩ−１ｆｓｎｅｆ＋、中実丸）；ＨＸＢ−ＥＬＩ　２−ｆｓ　（ＥＬＩ　−２ｆｓ　ｎｅｆ−、中実三角）及びＨＸＢ２（ＨＸＢｃ２ｎｅｆ−、中空三角）でトランスフェクトされた細胞に関する時間を追ったｐ２４産生を示す。これに対比して、ＨＸＢ−ＥＬＩ　１及びＨＸＢ−ＥＬ　１２ウイルスはＰＢＭＣ内で強力な複製を示し、ｐ２４抗原産生の最大レベルは感染後１７及び２０日回心それぞれ約２６ｎｇ／ｍｌ及び約３３ｎｇ／ｍｌに達した。反復実験では、２つのウィルスの活性レベルの一貫した差異は認められなかった。ＨＸＢ−ＥＬＩ　１−Ｒウィルスは攻撃的でさえあって、ピークウィルス産生レベルはＨＸＢ−ＥＬＩ　１又はＥＬＩ　２より３〜５倍高くなった。これは、ＴＴＴＢ　ｎｅｆ配列を含有する任意のウィルスによって得られた最大ウィルス力価の５０倍以上であった。これに対比して、同一遺伝子ｎｅｆフレーシーフトＨＸＢ−ＥＬＩ　１−ｆｓ及びＨＸＢ−ＥＬＩ　２−ｆｓウィルスのいずれかに感染させた培養中では、上清ｐ２４レベルはわずかに検出限界内又はそれ以下であった。３つのｎｅｆ陽性ＨＸ　Ｂ　−Ｅ　Ｌ　１組換え体ウィルスはすべて、−次単核球培養内で非常に元気に複製した。例えば、典型的実験におけるＨＸＢ−ＥＬＩ　１は、感染後２０日回心単核球中で約３５　ｎ　ｇ／ｍ　ｌのピーク産生レベルに達した。ＨＸＢ−ＥＬＩ　１−Ｒはまた、他の２つのウィルスより数倍高い最大力価に達した。ｐ２４は、ＨＸＢ−ＥＬ　Ｉ−ｎ　ｅ　ｆ−欠損同一遺伝子ウィルスのいずれかで感染させた単核球の上清中には検出されなかった。例えば図８を参照すると、ＨＸＢ−ＥＬ　１１−Ｒは中空矩形て、ＨＸＢ−ＥＬ　Ｉは中空三角で、ＨＸ　Ｂ　２は中空丸で表されて、別の典型的実験の結果を示す。Ｊｕｒｋａｔ、ＰＢＭＣ及び単核球感染から得られた結果はすべて、ＬＡＶＥＬＩ配列を含有しないウィルスと比較して、ＬＡＶ　ＥＬＩ組換え体ウィルスの行動の劇的な変化を際立たせ、特にこの変化が無傷ＬＡＶＥＬ＋遺伝子の存在を要することを示す。ｎｅｔコード配列は無傷であったがＩＴＩＢが関与しなかったＨＸＩ３−ＢＩ３のようなウィルスは、この新規の表現型を示さなかった。この差異は、Ｊｕｒｋａｔ細胞中の同一遺伝子ｎｅｆ陽性及びｎｅｆ陰性ウィルスを比較した場合でさえ明白であって、この場合、ＩＩＩＢ　ｎｅｆはウィルス複製に小陰性作用を発揮し、一方ＬＡＶ　ＥＬＩ　ｎｅｆは大きな陽性作用を生じるのが認められる。しかしながら、最も驚くべきは、無傷ＬＡＶＥＬＩ　ｎｅｆ遺伝子の存在が組換え体ウィルスに単核球細胞に対する新規の向性を付与することであって、これもＰ　ＢＭＣにおける活発な複製のためのその能力に反映される。ＨＸＢ−ＥＬＩ　１−Ｒウィルスによる感染単核球中でのウィルス産生のレベルは、おそらく単核球向性のＨＴＶ株に関して報告されたものと同じ高さである［Ｋｏｙａｎａｇｉ、Ｙ、、ｅｔａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２３６：８１９　（１９８７）。Ｓｈｗａｒｔｚ、Ｓ、、ｅｔ　ａｌ、、ＰＮＡＳ、８６：７２００（１９８９）、Ｃｏｌｌｍａｎ、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、。Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１７０　：　５７１　（１９８９）］。おそらく、例えば、３’　ＬＴＲのＵ３領域内の付加的重複要素は、ＬＡＶ　ＥＬＩ組換え体の表現型変化に関与し得るがしかし、ＨＸＢ−ＥＬＴ　２はＨＸＢ −ＥＬＩ　１と同様に単核球中で複製すると考えられるため、ｅｎｖ及びｒｅｖ遺伝子中に存在するＨＸＢ２及びＨＸＢ−ＥＬＩ　１間の付加的配列差は表現型に関与するとは思えない。しかしながら、ｎｅｆ欠損ＬＡＶ　ＥＬＩウィルスの両方を用いて得られた陰性結果から、無傷ＬＡＶ　ＥＬＦ　ｎｅｆが表現型に不可欠であることは明瞭である。これに対比して、ｖｐｕ陽性、ｖｐｒ陽性ＨＸＢ −ＥＬＩ　１−Ｒウィルスによる一次細胞中のウィルス産生のレベルの約５倍の増強が、これらの機能を欠く親ＨＸＢ−ＥＬ　１１と比較した場合に認められる一方、ＨＸＢ−ＢＨ８におけるｖｐｕ及びｖｐｒの復帰は単核球中のこのウィルスによる複製に対する遮断を軽減するためにもＰＢＭＣ中での低レベルの感染を増強するためにも何もしなかった。以前に報告されているように、これらの因子の各々は、ウィルス複製を増強するために機能する［Ｃｏｈｅｎ、Ｅ、Ａ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ。ＡＩＤＳ、３　：　１１　（１９９０）、Ａｌ　１ｚｏｎ、Ｍ、、ｅｔａｌ、、Ｃｅ１ｌ、４６：８３　（１９８６）］。その他の読み取り枠中のコード化変化を、原ＨＸＢ−ＥＬＴ　１と比較してＨＸＢ−ＥＬＩ　１−Ｒに導入した一方で、Ｊｕｒｋａｔ細胞のウィルス感染中のｖｐｕ及びｖｐｒに関して我々が特性化した作用の大きさは、ＨＸＢ−ＥＬＴ　１−Ｒで感染させたＰＢＭＣ及び単核球培養の両方で観察されたウィルス力価の増強を説明するのに全く十分である。異なる型のＣＤ４陽性細胞に対する向性の大きな変動は、事実上明瞭な天然のウィルス調節現象であると考えられる。ｎｅｆがトランスのＨＩＶ　ＬＴＲからの発現を適度に下げ調節し得るという他の研究者の観察を、我々は首尾よく繰り返した。これは、ｎｅｆ発現ベクター又はｎｅｆ配列抽出物にフレームシフトを含有する同一遺伝子ベクターと一緒にＨＩＶＬＴＲ−ＣＡＴ構築物をＣＯ３−７細胞中に共トランスフェクションすることにより達成した。各プラスミドは、複製の５ｖ４０原を包含した。しかしながら、同様の結果は、ＨＸＢ２又はＬＡＶ　ＥＬＩからクローン化されたＨＴＶ　ＬＴＲ要素を用いて、ｎｅｆのどの株が発現中であるかには無関係に得られた。複製試験とともに、これは下げ調節作用が二次的現象であることを示唆する。前記の開示の利点により、本発明の概念から逸脱しない限り、本明細書に記載の実施例の多数の修正及び変更が可能であり、本発明は添付の請求の範囲の範囲及び精神によってのみ限定されるものであることは、当業者には明らかである。ｌ＼　／′＼ムＦＩＧ　＋特表千５−５０９２３２　（１４）Ｆ　Ｉ　Ｇ、６要　約複製コンピテントであるために必要なＨＴＶ遺伝子生成物質を発現するための十分数のヌクレオチドを含有し、さら：こＥＬＩ　ｎｅｆ遺伝子セグメントを含有するベクターを開示する。これらのベクターを用いて、検定系で使用するための広範囲の細胞及び宿主をトランスフェクトし得る。国際調査報告 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention provides an HrV nef gene for enhancing replication efficiency, which can be used in replication competent HrV-1 provirus or HIV-2 provirus, as well as in the above-mentioned proviruses. The present invention relates to a vector containing a sequence that enhances the replication efficiency of a virus. Human immunodeficiency’fil7, (HIV-1, HTLV-11r, LAV or HTLV-■■■/LAv) is the etiological agent of acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and related diseases [Barre-3inoussi et al. 5science 220:868-871 (1983); Gallo et al., 5science 224:500-503 (1984); Levy et al. 5science 225+840-842 (1984); Popovic et al, 5science 224°497-500 (1984); Sarn gadharanet al, 5science 224:506-508 (1 984); Siegal et al., N. Engl. J, Med, 305:1439-1444 (1981). The disease is characterized by a long asymptomatic period followed by progressive degeneration of the immune system and central nervous system. Viral studies show that replication is highly regulated and that latent and lytic infection of the CD4-positive helper subset of T lymphocytes occurs in tissue culture [Zaguryet al., 5science 231:850-853 (1986 )]. In infected people It is also believed that the expression of these viruses is regulated to evade immune responses. Molecular studies of the regulation and genome organization of HIV-1 have shown that it encodes a large number of genes. [Ratner et al. Nature 313:277-284 (1985); 5anchez-Pescador et al. 5science 227:484-492 (1985); Muesjng et al., Nature 313:450-457 (1985); Wain-Hobsonet al., Ce11 40:9-17 (1985)]. Retroviruses are generally classified into three subfamilies: oncoviruses, spumaviruses, and lentiviruses. Infections with tumor viruses are generally associated with malignant disease. cormorant. These viruses generally contain gag, pol and env genes, as well as long tails. One of approximately 8,000 to 10,000 nucleotides, including long terminal repeat (LTR) sequences. Contains the heavy positive strand RNA genome. Tumor viruses generally contain oncogenes. Although spumavirus induces foamy cytopathic changes in tissue culture, it is generally considered not to be pathogenic in vivo. Due to lentivirus Infection is generally slow and causes chronic debilitating disease after a long incubation period. Lentiviruses have regulatory functions in addition to gag, pol and env genes. It has a large number of additional genes. Human immunodeficiency virus (HTV) also causes a slow-growing infection and is common. They have been classified as lentiviruses because of their common structural properties [see Haae, A. T., Nature 322:130-136 (1986)]. HTV-1 and other retroviruses each have gag. They share the pol and env genes [Haseltine, W. A, Journal of Acquered Immune Deficiency Syndrome, 1:217-240 (1988)]. HIV-1 also has other genes that regulate viral replication. The HIV-1 genome is vi f. It encodes the vpr, tat, revSvpu and nef proteins [Hase ltine, W.A., Journal of Acquered Immune Deficiency Syndrome, supra]. Additionally, the long terminal repeats (LTRs) of HrV contain C15-acting sequences important for integration, transcription and polyadenylation. Another cis-acting signal regulates HIV sequences by several novel HrV gene products [Haseltine, W.A., Journal of Aqueried Immune Deficiency Syndrome, supra; 5 Odroski et al. Sci ence 231:1549-1553 (1986); Arya et al., 5science 229:69-73 (1985); 5odr oski et al. 5science 227:171-173 (1985); 5odroski et al., Nature 321:412-417 (1986); Feinberg et al. , Ce1l 46:807-817 (1986); Wong-3taal et al., AIDS Res, and Human Retroviruses 3:33-39 (1987), the contents of which are incorporated herein by reference. ] Nucleotide sequences from HIV-2 and simian immunodeficiency virus (SIV) also contain the structural genes gag, pol and env. and tat, rev and nef:A node sequences [Guyader, M., et al., Nature. 326:662-669 (1987); Chakrabarti, L., et al., Nature 328: 543-547 (1987), the contents of which are incorporated herein by reference]. The nef genes of the primate immunodeficiency viruses HIV-1, HIV-2, and SIV distinguish these viruses from other retroviruses. These primate immunodeficiency viruses are the most closely related retroviruses, visnaviruses, Ungulate lentiviruses, such as inflammatory and encephalitis virus (CAEV) and equine infectious anemia virus (EIAV), have a long opening that begins near the nef, 3′ of the envelope (env) and extends into the 3° LTR. Lacking an area to specify a reading frame. The nef specified by the HIV and SIV viruses have common features including post-translational modification by addition of the fatty acid myristic acid at the amino terminus and a conserved amino acid sequence. The protein encoded by the HIV-1nef gene is generally 206 amino acids long, but some variation occurs from chain to chain. Sara Additionally, antibodies against the nef protein are found in infected individuals and infected monkeys. This suggests that nef plays an important role in natural infection. deer However, this is contradicted by other data. For example, the nef protein is prematurely truncated in many replication-competent HIV-1 isolates. Early studies using proviruses derived from the 1118 strain of HIV-1 revealed that viruses expressing the net protein replicated in CD4+ T cell cultures slightly slower than viruses lacking nef [ T erwi ] I i ge r. E. et al., J. Virol, 60 bar 54-760 (1986), this article. The contents herein are incorporated by reference]. This finding was corroborated using several other pairs of viruses, including the isogene pair from strains BRU and NY5 [Luciw, P., et al., PNAS 84:1434-1438 (1987 ); Niederman, T. M., et al., PNAS 86:1128-1132 (1989); Ahmad, N., et al. 5science 241+1481-1485 (1988); and Cheng-Myer, C., et al., 5science 246:1629-1632 (1989), the contents of which are incorporated herein by reference. ]. A 5-10 fold difference in replication of nef compared to nef-viruses has been reported for the proliferation of these viruses in T cells. It has also been reported that a CD4 T cell line constitutively expressing nef slows the growth of many strains of HIV-1 [Cheng, et at, 5science 246. The above. but However, this difference between nef and nef-viruses is not always observed. In some studies, nef-positive viruses replicated as well or slightly better than nef-deficient viruses. Although much research has been devoted to understanding human immunodeficiency viruses (particularly HIV-1 and HIV-2), there have been problems in fully understanding their life cycles. this Individuals infected with these viruses generally exhibit long asymptomatic periods during which viral titers are low and T4+ lymphocyte levels are normal, and these periods generally extend over many years. Furthermore, the virus does not cause infection in most animals. Chimpanzees can be infected, but the virus in chimpanzees does not easily show signs of infection and only produces small amounts of non-infectious proteins or RNA, so They are very difficult to track down. Therefore, in order to develop animal models for the treatment of diseases, replication-competent HIV proviruses containing nucleotides corresponding to sequences that facilitate the use of the provirus to cause infection in a wide range of cells and animals. It is very useful to have a vector that does this. In particular, in vitro and in viv in a wide range of cells in order to be able to screen for agents that block infection and develop agents that can stop or minimize infection in certain types of cells. The use of such vectors is useful in systems where viruses can be tracked. In developing viable animal models to investigate different aspects of HIV pathogenesis. Also useful is the use of such vectors in systems where viruses can be tracked il vivo. To develop vaccines and/or antibodies, more active vaccines provide a more visible target to the animal's immune system to elicit a stronger and more effective immune response. It is also useful here to have a virus that corresponds to the entire HIV genome other than the structural genes of the ELI strain, in order to express the I-T IV gene products (HIV segments) required for viral replication and infectivity. A vector was developed that contains sufficient spumavirus nucleotides to carry out the virus and also contains a sequence of nucleotides (nef gene segment) corresponding to the nef gene of the ELI strain of H[V. Preferably, the HIV segment of the vector also contains a functional vpu or vpr gene segment. More preferably, the HIV segment of the vector contains both a functional vpu and a functional vpr gene segment. In a second embodiment, we describe vectors containing ELI gene segments. Preferably, this vector also contains a heterologous gene. This vector can be used in vivo and in vitro to transfect a wide variety of cell lines. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Figure 1 is a schematic representation of the H[V genome and the series of vectors prepared. FIG. 2 is a schematic diagram of a portion of the HXB ELI 1-fs vector. Figure 3 shows a schematic diagram of a portion of the HXB ELI 2 and HXB ELT 2-fs vectors. It is a diagram. FIG. 4 is a schematic diagram of a vector containing an HIV segment, a functional nef gene, a functional vpu gene, and a functional vpr gene. Figure 5 is a schematic diagram of a portion of the HXB-BH8 vector. FIG. 6 is a graph of p24 production in peripheral blood lymphocytes (PBL) over time by various vectors. Figure 7 shows mononuclear cells/macrocells transfected with various vectors over time. Figure 2 is a graph of p24 production in clophages. Figure 8 is a graph of p24 production in PBL transfected with various vectors over time. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION We have hereby provided that sufficient spomaviruses corresponding to the HIV genome to express the HIV gene products (referred to as HIV segments) required for viral replication and infectivity are provided. virus nucleotides and the nef residue of the E L 1 strain to enhance virus replication. A vector was developed containing a sequence of nucleotides corresponding to the gene (referred to as the ELI nef gene segment). Preferably, the I]V segment is a nucleus of the HIV-1 or HIV-2 genome. Corresponds to leotide. More preferably, the HIV segment is derived from the HIV-1 genome. corresponds to the nucleotide of the system. Preferably, the HIV segment does not correspond to all ELI strains of IIV-1. The term corresponding means that conservative additions, deletions and substitutions are possible. The ELI nef gene has its start futon located at position 8822, immediately following the end of the env open reading frame and extending through most of the U3 region of the 3° LTR. Ru. This gene encodes a protein with an apparent molecular weight of approximately 25-27 Kb. code. Most studies on nef function have been conducted on the prototypical American 1118 strain [Gallo, R.C., et al., 5science 224:500 (1 984); Ratner, L., et al., Nature 313:277 (1985)); French strain LAV BRU [Barre-3inoussi, F., et al. 5science 220:868 (1983); Vain-Hobson, S., et al., Ce1l 40:19 (1985)] (which shares approximately 98% sequence homology with rllB), or the American 5F-2 strain [ Lavy, J. A., et al., 5science 229:840 (1984); et al., 5ience 227+484 (1985) (which is more than 90% homologous at the DNA level to both IIIB and BRU). I used a button. All of these are potent T cell stimulators. In contrast, LAVELT is a more divergent strain in contrast to TIIIB, 5F-2 and BRU strains. This is one type of loan. This clone is intact with respect to all known HTV regulatory functions [Cohen, E., et al. Nature 334:532 (1988); Cohen, EA, et al., J. AIDS, 3+11 (1990). Alizon9M, et al, Ce11.46:83 (1986), this The contents of these publications are hereby incorporated by reference]. LAV ELI French clones obtained from Zairian isolates were A 24-year-old woman was diagnosed by co-culturing the patient's peripheral blood lymphocytes with GekiP BMC. Sexual AIDS, 1! It was isolated from a person in 1983. The nef producers of LAV ELI and the nef producers of the IIIB Yume Hxorf clone used in our previous study [Terwi Iger, E, F, et al., J Virol, 60 Near 54 (1986)] There are 47 differences in the amino acid sequence (out of a total of 207) between the two. A number of techniques can be used in preparing vectors of the invention containing a functional nef segment. For example, a clone containing a functional nef gene, such as LAV ELT, can be used. This segment can be obtained from the LAV EL + proviral clone by standard techniques, eg, by the use of restriction endonucleases. For example, there is an original BamH[V site at position 8506 and a 5ac1 site at position 9607. This segment contains the entire net gene. Using standard techniques, this segment can be excised to correspond only to the ELTnef gene segment and not to most other ELI gene segments. For example, Eco R1 can be inserted at position 1t8792, 30 base pairs upstream from the nef start codon. Other) TTV clones containing nef sequences that are more homologous to the ELI strain than to the rIIB strain. One of the steps can also be used. As used herein, these nucleotide sequences are based on the nef sequence, which is more homologous to strain ELI than strain IIIB. ELI nef enhances virus replication and is considered equivalent to ELI nef. This characteristic can be easily determined by a person skilled in the art based on the disclosure of the present invention. Alternatively, functional "ELr nef segment" nucleotide segments can be chemically synthesized. ELInef segments can be prepared using other techniques known to those skilled in the art based on the present disclosure. It may be manufactured. The ELF nef segment preferably comprises an HIV segment in a position where nef segments obtained from other HIV-1 or HIV-2 strains used may be present. can be inserted into the vectors described herein containing the vectors. If an HIV segment with the nef gene is used, the nef gene can be cut out and the ELI ne f segment inserted. The HIV segment contains a sufficient number of nucleotides to accommodate all HTV genes necessary for replication and infection. Preferably, this segment contains a functional vpu gene. It also contains nucleotides corresponding to a child or functional vpr gene. even more preferable In particular, it contains nucleotides corresponding to both functional vpu and vpr genes. have For example, the vpu sequence in the HXB2 provirus contains the start codon for vpu. and therefore do not express a functional vpu gene. If the HTV segment has nucleotides corresponding to the HX B2 strain, change the start codon to the vpu sequence. It can be inserted immediately upstream of and within the frame. Alternatively, containing a functional vpu gene The sequence of the DNA containing the vpu gene can be replaced with a sequence that does not contain a functional vpu gene. This can be accomplished by utilizing various restriction sites in the nucleotide sequence. Clones BH8, BH10, LAVEL, etc. contain nucleotide sequences that yield functional vpu genes. Strain HXB2 has a premature stop codon and does not express a functional vpr protein. machine The H[V segment corresponding to this pr gene is unlikely to be functional. If using a functional vpr legacy such as LAV BRU, LAV ELT, etc. A functional vpu gene from a strain expressing the gene product can be inserted. As mentioned above, vectors may be synthesized by a variety of methods known to those skilled in the art. A variety of different vectors that can be prepared are shown in Figures 1-4. Different combinations of sequences containing the ELT nef sequence can be constructed and inserted within the 3' end of the HIV sequence, such sequences having nucleotides corresponding to replication competent HXB2 (also called HX Bc2) proviruses. . Conformity system Restriction sites can be determined by any necessary standard techniques, e.g. mutagenesis of a particular oligonucleotide. It can be produced by For example, the B a m H1 site within LAV ELI, the alignment A novel Eco R1 site within both the LAVET-T and HXB2 sequences. Preferably, each nucleotide change made to "insert" a restriction site is used to If the change does not change the amino acid sequence intended to be encoded by any gene. or minimally conservative amino acid changes. Constructs can be verified by sequencing. HXB-Ell 1 contains the entire HXB 2 sequence upstream of nef within the env and rev gene sequences, as well as the original BamHT site at position 118506, 3° apart, and the open LAVELI between that position and the Sac1 site at position 19607. Distribution Consists of columns. The remaining 3' LTR sequences are derived from HXB2. See Figures 1 and 2. I would like you to look at it. In HXB-EL r-2, the 5' junction between the HX B 2 and LAVE LI sequences is 30 base pairs (bp) up from the nef start codon. The flow is moved downstream to a new Eco RT site at position 8792. See Figures 1 and 3. HX B -E L r -2 is the same as this Eco R1 site. It contains only two H X B sequences separated by 3'. The LAVELI sequence extends from this position 3° to the Sac] site at 9607, as in I-IXB-EL, I-2. These vectors contain functional vpr or vpu genes. Contains no children. However, functional genes can be easily added as described above. For example, Apa 1 site of position 112008 and position ffi! The sequences in these vectors corresponding to the sequences between the Sal 1 sites of 5820 are excised and replaced with the corresponding sequences from clone LAV BRU, which contains a functional vpr open reading frame. Similarly, 1 part of Sal at position i1582 Q and 1 part of kpn at position f16382 The sequence from the vector corresponding to the interposition sequence can be excised and replaced with the corresponding segment from BHIO containing a functional vpu gene. As mentioned above, Other strategies and variations of this strategy may be used by those skilled in the art based on the present disclosure. A proviral plasmid containing the ELI nef gene and the HTV cell described above. A vector can be easily constructed by inserting this sequence into the plasmid backbone by known methods, such as through the use of restriction enzyme sites. As used herein, the term sufficient number of nucleotides allows additions, deletions, and substitutions without loss of claimed functional ability. For example, When referring to the functional capacity of the nef gene in terms of viral replication, the resulting bundle of virus replication must be greater than that produced by the isogenic nef virus. No. The vector is used to transfect desired cells by standard methods. example For example, cells can be transfected in vitro using the calcium phosphate co-precipitation method or the DEAE-dextran method. Alternatively, this vector can be used to transfect living cells in vivo. Such methods are known to those skilled in the art. The use of the nef gene segments of the invention allows for fully replicating HIV strains, such as peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), as well as purified human mononuclear cells or mononuclear cell lines. It is possible to obtain HXB2 strains without production, and enhanced infectivity in such cell lines can be obtained. Although we do not intend to link them theoretically, we understand the complex interactions between various genes in the HIV genome. A series of interactions were observed, and these may be related to the more acute effects observed with this virus. It seems likely that some of these may be involved. For example, if HIV causes immunity in infected individuals, One of the strategies proposed to fend off the epidemic response is through the establishment of a low-level infection state in which the virus remains dormant or replicates at very low levels within most infected cells. Therefore, the incorporation of the virus into the host DNA Through this process, the virus can establish a stable infection. To accomplish this goal, the original virus is first carefully conditioned so that it does not appear too "aggressive." It is believed that some interactions may be overcome by taking the nef gene segment of the invention and inserting it with other strains or HIV-2 genomes. available. Therefore, the vector-constituted A virus was less likely to replicate in PBMCs than its progenitors. Compensatory mutations were made in the 3' env sequence of the precursor to HXB2, producing a virus that could replicate well in PBMC. The HX B2 virus contains the original nef mutation as well as compensatory mutations in the 3' env sequence. Furthermore, 3'env compensatory mutations exert negative effects on proliferation in the presence of closely related net sequences such as the BI3 and BH10nef genes. Boss. This negative interaction does not extend to divergent nef sequences such as the ELI nef gene. As a result, HIV sequences outside nef affect nef function. Legacy Differences are observed in nef alleles with respect to interaction with genetic sequences. BI3 and BHIOnef are negative regulatory genes with HXB2 3° env sequences. Ru. ELI nef is a positive regulatory gene with HXB2 or ELT3' env sequences. ELI nef is an essential gene for the proliferation of secondary monocytes and macrophages. Therefore, the vectors of the present invention exhibit the various tropisms exhibited by HIV strains. I don't. Therefore, using such a vector, we can demonstrate the general ability of this strain. can transform a wide range of cells. Using standard techniques, the vectors are used to generate an antigenic response in animals and then tested live. Different antibodies can be used therapeutically. Cloning site 81 ID1e containing a simple frameshift mutation of nef The virus was resistant to revertants in vivo for reinstatement of the nef open reading frame. It has been reported that there is a strong tendency to It is often proposed that monocytes are the primary initial target of HrV infection in vivo and/or that infected macrophages constitute an important long-term reservoir for maintaining a large pool of virus within the system. Our findings explain why strong selective pressure for intact nef function exists in vivo, but not necessarily in vitro, in the case of homology exhibited by the ELI nefJl gene. Although not intended to be theoretically linked, the large variation in tropism for different types of CD4-positive cells is in fact a distinct viral regulatory phenomenon. In VitrO or in viv using this vector. transfecting cells with a virus can improve systems for screening drugs and understanding virus pathogenesis. The range of cells transformed by this vector is wider than when using other experimental strains such as the ITIB strain, allowing us to predict the effect of the drug on virus spread in a wider range of infected cells than is typical. You can check it out. For example, it can be used in tests in secondary cell culture to determine the mechanism by which ELInef allows anti-level replication in mononuclear cells. Such information is especially In terms of evidence suggesting that mononucleotropic strains of M. russianus play an important role in the development of central nervous system disease, irrespective of whether immunological damage is evident or not, the disease of AI DS. It is one of the crucial links for understanding the mechanism of progression [Koya nagi, Y., et at. 5science 236:819 (1987)]. In some assays, one may add the compound of interest to cells or body fluids and then attempt to transfect those cells with the vectors of the invention. A large amount of vector is added to cells that have previously been determined to be effective in transforming such cells. The level of infectivity of those cells can then be measured to help prevent the spread of the virus. to determine the effectiveness of the compound as a compound. Alternatively, cells can be first transfected with the vectors of the invention in vitro or in vivo, and then the desired transfection The compound is added to the cells and the effectiveness of the compound in preventing the spread of the virus is then determined. Parameters observed included syncytium formation, single cell killing. supernatant levels of HIV p24 core protein as measured by RA, and immunoprecipitation of metabolically labeled viral proteins using AIDS patient serum. can be lost. The vector is preferably used in vitro using primary monocytes/macrophages. Vectors may be used to "infect" cells in vivo. In general, the traditional experimental manifestations of HIV in traditional animal model systems, for example, some researchers have attempted to develop in viable animal models regarding certain aspects of HTV pathogenicity. In the 5CID-HU mouse line, it replicated very poorly. As mentioned above, the present invention replicates more aggressively in primary lymphocytes than in typical laboratory experiments and is shown to be effective in the field in 5CID-HU mice. This results in proviral clones that must replicate more efficiently than hybrids. Other preferred animal models include non-human mammals. This kind of feeding Preferred examples of the species include rabbits, mice, rats, cats and primates. Ru. Preferred primates include chinopants and monkeys. The effective amount of vector required to be administered to an animal to establish infection can be readily determined. For example, 0.1 μg to about I QmH vector/kg body weight. throw Administration may include parenteral administration such as intramuscular, intraperitoneal, intravenous or subcutaneous. Various routes are possible. Knowing the amounts and conditions necessary to establish "infection" (transfection) allows the development of model assays to establish the in vivo efficacy of preselected compounds. Administer the compound to the animal by standard means, e.g. by injection. give Thereafter, administer enough vector to successfully establish infection and observe the animal to determine whether infection develops and, if so, the extent of infection. Ru. Alternatively, the vector is first administered in an amount sufficient to establish infection in the animal, followed by administration of the preselected compound. The animals are then observed to determine the effect of the pre-tactic compound on "infection" by the vector. In another embodiment, the nef gene of an ELI strain of HIV-1 to enhance viral replication. A sufficient number of nucleotides corresponding to the gene (ELI nef gene segment), A vector is prepared that contains the romator and polyadenylation sequences but not the entire ELI encoding nucleotide sequence. Preferably, the vector contains an LTR sequence, more preferably an HIV LTR sequence. The promoter can be an LTR or a separate promoter, such as another viral promoter, such as the SL3 promoter. This vector is preferably a heterologous Contains children. In certain embodiments, the heterologous gene is a marker gene. Mar Car genes are well known in the art and include, for example, chloramphenicol acetyl transferase (CAT) gene, or a growth hormone such as human growth hormone (hGH). The vector can be inserted into cells using a vector containing a replication competent HIV provirus, or a replication competent Hr V, e.g. For example, co-transfected into a cell line transfected with HXB2 or HXB-BI3. can be transfected. This allows ELI nef segments and other further enables analysis of interactions between rus genes. Use of this vector should also increase the range of hosts that can be transfected with such viruses. The invention is further illustrated by the following examples. These examples will help you understand the invention. The present invention is not limited to the present invention. (IV-1117) is a full-length infectious provirus derived from the II18 strain [Fisher, A.G., et al. Nature 316:262-265 (1985)], lacking the nef, vpr and vpu genes as a result of a single point mutation in each gene. Nucleochi A BamH1 site was found at code 8506, and this position was used for the preparation of various plasmids (see Figure 1). Compatible restriction sites - specifically the B am Hr site within LAV ELI and the novel Ec within both the LAV ELI and I-I X B 2 sequences. Rr sites are generated, if necessary, by mutagenesis of specific oligonucleotides. Ta. In each case, the intended amino acid sequence encoded by any gene is not changed. brought about significant changes. Constructs were verified by sequencing. HXB-ELI 1 contains the entire HXB2 sequence upstream of nef in the env and rev genetic sequences, as well as the original Bam HT site at position 8506, 3" apart, and between that position and the Sac1 site at position 9607. (see Figures 1 and 2). The remaining 3" LTR sequences are derived from HX B 2. In HXB-ELT-2, the 5'' junction between the HXB2 and LAVET-1 sequences is directed to a novel EcoRI site at position ff1 8792, 30 base pairs (bp) upstream from the nef start codon. See Figures 1 and 3. HXB-EL I-2 contains only the HXB2 sequence, which is also 3' away from this Eco R1 site. (As in case D, this extends from position 3' to the Sac 1 site at 9607.Replacements with ELF sequences also occur within the secondary coding exon of rev, that part of the env gene encoding the carboxy terminus of the transmembrane protein, and ne f [5odroski. J. G., et al., Nature 371:412 (1986)]. Therefore, a frameshift was introduced within the nef reading frame of the recombinant to generate a second identical genetic clone containing the dysfunctional nef-HXB-ELT1-nef. accomplished. A 4 base pair frameshift was introduced into the nef coding sequence of HXB-EL r-1 and 2 by filling in the original Xho1 site at position 8928 to generate an identical nef-deficient provirus. were referring to Figures 2 and 3 respectively. I want to eat it. In HXB-BI3, the 3° end of the original Xho1 site contained sequences from the BH8 provirus. This strain is the 1118 strain containing the entire nef open reading frame and was originally called HXB-orf (see Figure 5). HX B-B H81,: derived. The proviral sequence of HXB-BH8 between the Apa 1 site at position 2008 and the Sal 1 site at position 5820 was replaced with the corresponding sequence from clone LAV BRU. This segment contains a functional vpr reading frame. Next, we cut the HXB-BH8 sequence between the kpn 1 sites at positions 5820 and 6382. and the corresponding segment from BHIO, a closely related TIIB clone. Replaced with ment. This segment contains a functional vpu gene. Identical substitutions were made in HXB-ELI 1 to generate HXB-ELI 1-R (see Figure 4). The HXB-ELT 1-R sequence was inserted into the known plasmid pBR322 between the EcoR and Pvu IT sites to generate plasmid DFCI-HT. It contains the HXB-El, , I 1-R sequence with the pBR322 backbone. A specimen of this plasmid has been deposited with the American Type Culture Collection (ATCC) under the Budapest Treaty under deposit number 68343. 12:5707-5717 (1984); Queen and Baltimore re, Ce1l 33 Near 4l-748 (1983); 5odroski, J., et at. 5science 231:1549-1553 (1986). Sea urchins were treated with DEAE-dextrin on day 0 using 10 mg of each proviral plasmid. 107 Jurkat cells were transfected by run method. After that, cultivate The culture was maintained in 12.5 ml of RPMI + 15% fetal bovine serum, with daily total media changes occurring. An aliquot of each supernatant was set aside at each feeding time for later assays. In addition to supernatant HIV p24 core protein levels, cultures were monitored for syncytium formation and total cell number. Terwilliger, et al., J. Viol. 60.754-760 (1986). An aliquot of the cultured Jurkat culture was metabolically labeled and harvested for immunoprecipitation. collected. Half of each sample was immunoprecipitated with AIDS patient serum. The other half +1 was reacted with nef protein antiserum. La emm l i, U, to. Immunoprecipitation and polyacrylamide gel electrophoresis were performed as described: Nature 227:680-685 (1970). Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated by Ficol1 isolation from pale yellow capsules obtained from healthy seronegative blood donors. PBMC culture was performed using 10% bovine blood. Cells were cultured at a density of 4 x 10 cells in 24 mm tissue culture wells (Costar, MA) in RPMI-1640 containing supernatant and antibody and 20% PHA conditioned medium. It was planted at a certain degree. After 48 hours of culture, virus was added to each well. Titrated virus stocks were obtained from transfection of cell cultures with JIJrka. Infectious supernatant equivalent to 20 ng of p24 was added to each well of primary cells. infection details Incubate the cell culture overnight, then carefully decant the growth medium from each well. and replaced with fresh medium. Samples for p24 assay were collected every 3 days after the final medium change and before feeding the cultures. p24 was measured using a commercially available R1Δ kit (Dupont, NEN). Equal amounts of cell-free virus were then used to infect freshly activated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified human mononuclear cells by the same means described above. Replication of each virus was assayed over time by measuring p24 core antigen in the supernatant. Mononuclear cells were obtained from PBMC by fractionation on a Percoll gradient. Contaminated T-thin Cells are removed by rosetting using neuraminidase-treated sheep red blood cells. It was from low-density cells that had been removed. The purity of the mononuclear cell population is determined by immunoperoxidation of side-pin spin cell preparations of isolated mononuclear cells. Verified by Sidase staining. More than 95% of the cells stained with Leu3-M and <5% were positive for Leu18(CD20), Leu3(CD4) or Leu(CD8)l:. 4 x 106 mononuclear cells were cultured as described above for P8MC culture to maintain a comparable growth environment. Virus stocks were used as described for PBMC, with samples for p24 assay collected at the same time. I harvested it. As mentioned above, when generating HXB-ELI 1, inserting the l, lKb segments of the 3'LAV ELI sequence creates transducers within the secondary code exon of rev. Changes occurred in that portion of the env gene that encodes the carboxy terminus of the smembrane protein, as well as within the U3 region of the 3' LTR, which overlaps with nef. A frameshift vector HXB-ELF 1-fs was generated to generate a second identical gene clone containing a dysfunctional ne f. Next, we will discuss the proviral construct. were transfected into Jurkat cells as described above, and the kinetics of virus replication were compared. TTTB-derived nef positive (HX B -B H8) and negative (HXB2) viruses A pair of cells was also transfected as a control. As mentioned above, HXB2 contains a point mutation within nef that results in an insertion in the open reading frame after amino acid 123. Generates a premature stop codon. This truncated nef protein is non-functional. HXB-B) T8 (previously called Hx-orf) does not contain this mutation and produces a full-length nef product.ETerwilliger, E.F., et al., J. Viro 1.60: 754 (1986)]. A delay in the levels of supernatant p24 was detected in cultures transfected with HXB-BTT8 when compared to those containing HXB2 after initial transfection. Significant differences in the patterns of syncytium formation were also evident. Virus replication from HXB-ELI 1 after transfection was virtually no different from HX B2. In other experiments, the kinetics of viral infection exhibited by T-TXB-ELT1 were similar to or slightly enhanced with ITXB2. However, all parameters measured showed that the isogenic nef deficiency Replication of the virus derived from the damaged recombinant provirus (HXB-ELTl-fs) was not observed. It decreased significantly. Supernatant p24 levels in nef-negative virus cultures are similar to isogenic nef! It was reduced by a factor of 100 in this experiment compared to the It-mediated virus culture. Peak cell-associated viral protein production was also dramatically reduced during this virus culture. However, this was indicated by a faint virus band in the immunoprecipitation process. child These measurements demonstrate a dramatic attenuation of the cytopathic effects of the HXB-EL I-nef virus on infected cells, whether assessed by syncytium formation or by the phenomenon of total cell counts over time. parallel. Similar results were obtained from repeated experiments, and sometimes even large differences in kinetics between nef-positive and nef-negative HXB-EL I-1 clones were observed. Metabolically labeled infected cell lysates using nef-specific volemic rabbit serum demonstrated the presence of the 27Kb nef protein in lysates from cells infected with HXB-B H8 or HXB-Ell1 viruses. . This band was transferred with HXB2 or HXB-ELI 1-fs. It was not observed in lysates from isolated cells. Transfection with HXB-BH8 results in higher CD4 Tmm elevation than the nef pair by introducing a functional nef gene into the HXB2 provirus. This confirmed earlier reports of a virus that replicated slowly. The LAV ELT nef gene influences virus replication in Jurkat cells. It was thought that it exhibited a remarkable enhancing effect. This positive effect was large; in contrast, the negative effect of rrrB nef observed in association with the HXB-BH8/HXB2 pair of viruses was small. Replicate experiments using a pair of independently derived clones of the provirus HXB-ELF yielded comparable results, suggesting that random quadratic changes at more or less favorable sites within a given construct may have contributed to the results. The possibility of doing so has been ruled out. To minimize the potential for generation of artifacts in our experimental design, another proviral construct was prepared as described above. Kinetic studies were also performed on novel cell-free virus tests against transfected stable T cell lines. It also extended to primary cells that were cultured. HXB-ELI 2 contained a smaller LAV ELI sequence insertion than HXB-ELr L (see Figures 1 and 3). The 3' end of the 800 base pair insert remains the same, but the 5' end is at the nef start codon. 5° to exactly 30 base pairs downstream. Besides the 47 differences in the predicted amino acid sequence of the nef protein between HXB-Ell 2 and HXB2, only a single amino acid change is observed in the predicted env product of HXB-ELI 2. Isoleucine in the HXB2 env product at position 854, i.e., a component of gp41. Two residues before the carboxy terminus were converted to serine in HXB-ELI 2. So No changes are allowed to any other code frame. An isogenic nef-deleted form of the HXB-EL[2 provirus was also generated by insertion of a framenft into nef, HXB-ELT 2-fs, as described above. As previously described, HXB2 is compatible with nef, vpu [Cohen, E. A., et al., J. et al. Aros 3:11 (1990)] and vpr [AI 1zon. M, et al., Ce1l 46:83 (1986)] gene, it lacks two other regulatory genes. In the HXB-BI3-R (repair) provirus derived from HXB-BI3, the intact vpr and vpu frames were repaired by recombination with sequences from other TT IB clones and the LAV ELI described above. (See Figure 1). Therefore, HXB-BI3-R) represents a provirus predicted to be fully functional for all of the TIV genes. Identical recombination was performed in HXB-ELT 1 to generate HXB-ELI 1-R (see Figure 4). Therefore, HXB-BI3-R and HXB-ELT 1-R are isogenic, with the exception that 1 in HXB-ELI 1-R, LA of IKb, VELI sequence +! Replaces the corresponding ITIB sequence in HXB-BHI C1-R. TIIB replicates very well in T cell lines, but poorly in PBMCs, and particularly weakly in sub-monocytes or mononuclear cell lines [Koyanagi, Y. et al. 5science, 236:819 (1987)]. Barely detectable level p24 antigen production was observed in the supernatant of PBMC infected with HXB2 virus. (See Figure 6). Similarly, HXB-BI3 and HXB-B H8-R rus also showed no significant activity increase in PBMCs on HXB2 (Fig. 6). Detectable replication by any of these three viruses has been shown to occur in mononuclear cell macrophages. It was not observed during di-culture (Fig. 7). 6 and 7 both show HXB-ELI 1 (ELT-1nef, hollow circle), HXB-ELI 2 (EL T-2nef H solid rectangle), HXB-BI3 (BI3nef, hollow rectangle); HXB-ELI For cells transfected with 1-fs (ELI-1fsnef+, solid circles); HXB-ELI 2-fs (ELI-2fs nef-, solid triangles) and H XB2 (HXBc2nef-, hollow triangles). Figure 2 shows p24 production over time. In contrast, HXB-ELI 1 and HXB-EL 12 viruses exhibited strong replication within PBM C, with maximal levels of p24 antigen production occurring at 17 and 20 days post-infection at approximately 26 ng/ml and 33 ng, respectively. /ml was reached. Repeated experiments showed no consistent differences in the activity levels of the two viruses. The HXB-ELI 1-R virus is even aggressive, reaching peak virus production levels. Bell was 3-5 times higher than HXB-ELI 1 or ELI 2. This was more than 50 times the maximum viral titer obtained with any virus containing the TTTB nef sequence. In contrast, susceptibility to either the same gene nef fleift H XB-ELI 1-fs or HXB-ELI 2-fs viruses In infected cultures, supernatant p24 levels were just within or below the detection limit. It was. All three nef-positive HXB-E L1 recombinant viruses replicated very vigorously in secondary mononuclear cell cultures. For example, HXB-ELI 1 in a typical experiment produces peak production levels of approximately 35 ng/ml in converted mononuclear cells 20 days postinfection. Reached ru. HXB-ELI 1-R also reached maximum titers several times higher than the other two viruses. p24 was not detected in the supernatants of mononuclear cells infected with either of the HXB-EL I-ne f-deficient isogenic viruses. For example, referring to FIG. 8, HXB-EL 11-R is represented by a hollow rectangle, HXB-EL I by a hollow triangle, and HX B 2 by a hollow circle to illustrate the results of another exemplary experiment. The results obtained from Jurkat, PBMC and mononuclear cell infections all show that the line of LAV ELI recombinant viruses compared to viruses that do not contain LAVEL I sequences. This highlights a dramatic change in the dynamics, especially as this change requires the presence of an intact LAVEL+ gene. Show that. Viruses such as HXI3-BI3, in which the net coding sequence was intact but ITIB was not involved, did not exhibit this novel phenotype. This difference is due to the same gene nef-positive and nef-negative viruses in Jurkat cells. It is clear even when comparing the two cases that IIIB nef exerts a small negative effect on viral replication, while LAV ELI nef produces a large positive effect. It is permitted to do so. Most surprising, however, is that the presence of the intact LAVELI nef gene confers on the recombinant virus a novel tropism for mononuclear cells, which also reflects its ability for active replication in PBMCs. reflected in It will be done. The level of virus production in infected mononuclear cells by HXB-ELI 1-R virus is probably as high as that reported for mononucleotropic HTV strains [Koyanagi, Y., et al. 5science, 236:819 (1987). Shwartz, S., et al., PNAS, 86:7200 (1989), Collman, R., et al. J. Exp. Med, 170: 571 (1989)]. Perhaps additional redundant elements, e.g. within the U3 region of the 3' LTR, could be involved in the phenotypic changes of LAV E LI recombinants; Additional sequence differences between HXB2 and HXB-ELI1 present in the env and rev genes are unlikely to contribute to the phenotype. However, the negative results obtained with both nef-deficient LAV ELI viruses indicate that intact LAV ELF nef is phenotypically defective. It is clear that it is essential. In contrast, there was an approximately 5-fold enhancement in the level of virus production in primary cells by the vpu-positive, vpr-positive HXB-ELI 1-R virus when compared to the parent HXB-EL 11, which lacks these functions. On the other hand, the reversion of vpu and vpr in HXB-BH8 is associated with this virus in monocytes. Nothing was done to alleviate the block to replication by PBMCs or to enhance low-level infection in PBMCs. As previously reported, each of these factors functions to enhance viral replication [Cohen, E. A., et al., J. et al. AIDS, 3:11 (1990), Alzon, M., et al., Ce1l, 46:83 (1986)]. Coding changes in other open reading frames were introduced into HXB-ELI 1-R compared to the original HXB-ELT 1, while the effects we characterized on vpu and vpr during viral infection of Jurkat cells. The magnitude is quite sufficient to explain the enhancement of virus titers observed in both PBMC and mononuclear cell cultures infected with HXB-ELTI-R. The large variation in tropism for different types of CD4-positive cells is evidenced by the fact that there are virtually no distinct natural This is thought to be a virus regulation phenomenon. We successfully repeated the observation of other investigators that nef can moderately downregulate expression from the HIV LTR in trans. This can be used as a nef expression vector or co-transfected the HIV LTR-CAT construct into CO3-7 cells together with the same gene vector containing a frameshift in the nef sequence extract. This was achieved by Each plasmid contained 5v40 origins of replication. But long Similar results were obtained using HTV LTR elements cloned from HXB2 or LAV ELI, regardless of which strain of nef was being expressed. Together with replication studies, this suggests that the downregulation effect is a secondary phenomenon. In view of the benefit of the foregoing disclosure, numerous modifications and variations of the embodiments described herein are possible without departing from the inventive concept, and the invention lies within the scope of the appended claims. It will be clear to those skilled in the art that the invention is limited only by the spirit and spirit of the invention. l\ /'\mu FIG + Special Table of Contents 15-509232 (14) Vectors containing fractional nucleotides and further containing this ELI nef gene segment are disclosed. These vectors can be used to transfect a wide variety of cells and hosts for use in assay systems. international search report

Claims

[Claims]

1. below: (a) HIV gene products necessary for viral replication and infectivity, i.e., HIV segments; corresponding to the HIV genome to express the vector, but the virus from the ELI strain a sufficient number of nucleotides that do not correspond to all of the genes required for virus replication and infectivity; and (b) the nef gene of the ELI strain of HIV-1 to enhance viral replication. contains a sufficient number of nucleotides corresponding to the ELInef gene segment, i.e. vector.

2. Functional HIV for HIV segment to produce functional vpu protein The vector according to claim 1, containing a sufficient number of nucleotides corresponding to the vpu gene. -.

3. Functional HIV for HIV segment to produce functional vpr protein The vector according to claim 1, containing a sufficient number of nucleotides corresponding to the vpr gene. -.

4. Functional vpu for HIV segment to produce functional vpu protein The vector according to claim 3, containing a sufficient number of nucleotides corresponding to the gene.

5. HIV segments have sufficient numbers of nuclei to produce functional env proteins. Claim 1 which corresponds to leotide but not to the env nucleotide of the ELI strain. Vectors listed.

6. HIV segments have sufficient numbers of nuclei to produce functional gag protein. Claim 1 which corresponds to leotide but not to the gag nucleotide of the ELI strain. Vectors listed.

7. HIV segments have sufficient numbers of nuclei to produce functional pol protein. Claim 1 which corresponds to leotide but not to the pol nucleotide of the ELI strain. Vectors listed.

8. The vector according to claim 1, wherein the HIV genome is an HIV-2 genome.

9. Claim 1, wherein the HIV segment corresponds to a nucleotide of the HIV-1 genome. Vectors included.

10. HIV segments are functional gag, pol, env, rev, tat, v gag gene, pol gene, en for producing pu and vpr proteins Compatible with v gene, rev gene, tat gene, vpu gene and vpr gene 2. The vector according to claim 1, containing a sufficient number of nucleotides to

11. below: (a) against the nef gene of the ELI strain of HIV-1 to enhance virus replication; a sufficient number of nucleotides corresponding to the ELInef gene segment; (b) a promoter sequence; and (c) Polyadenylation sequence and contains all ELI-encoding nucleotide sequences. Vector that does not.

12. 12. Contains a sufficient number of nucleotides corresponding to the LTR sequence. vector.

13. 12. The vector according to claim 11, which also contains a heterologous gene.

14. In vivo tests for compounds effective against infection by the HIV virus 2. A method for determining the method of claim 1, comprising: (a) administering the vector of claim 1 to an animal; administered in sufficient quantity to cause infection; (b) add the intended compound to the animal; and (c) observe the animal and to determine the effect of the intended compound on infection A method consisting of steps.

15. 1. A method for testing the effectiveness of a compound against infection by the HIV virus, the method comprising: below: (a) adding a predetermined compound to a preselected animal; (b) the vector of claim 1; is administered to preselected animals in an amount determined to be sufficient to cause infection. And (c) Observe the effects of preselected compounds on infection by vectors in animals. confirm A method consisting of steps.

16. 15. The method according to claim 14, wherein the animal is a mammal other than a human.

17. 17. The method according to claim 16, wherein the mammal is a primate.

18. Mammals include rabbits, mice, rats, cats, chimpanzees, and monkeys. 17. The method according to claim 16, wherein the method is selected from the group consisting of:

19. 15. The method according to claim 14, wherein the animal is a chimpanzee.

20. 16. The method of claim 15, wherein the preselected animal is a non-human mammal.

21. 16. The method according to claim 15, wherein the mammal is a primate.

22. Mammals include rabbits, mice, rats, cats, chimpanzees, and monkeys 16. The method of claim 15, wherein the method is selected from the group.

23. 16. The method of claim 15, wherein the preselected animal is a chimpanzee.

24. A method for assaying compounds effective against the HIV virus, comprising: (a) transfecting and infecting a cell line with a sufficient amount of the vector according to claim 1; Obtain a culture; (b) adding the intended compound to the infected culture; and (c) screening the culture. to determine the effect of compounds on transfected cultures. A method consisting of steps.

25. 25. The method of claim 24, wherein the cell line is a primary mononuclear cell.

26. 1. A method for testing the effectiveness of a compound against infectivity by HIV virus, the method comprising: ,below: (a) adding a predetermined compound to a culture of cells; (b) transfecting a culture of cells; step ( a) attempting to transfect the culture of cells; and (c) transfecting the culture. Screen to determine if the culture is transfected and the extent of transfection with the vector in step (b). confirm A method consisting of steps.

27. 25. The method of claim 24, wherein the culture of cells is a culture of primary mononuclear cells.