JPH02501258A - Ｃａ１２５抗原の単離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＣＡ１２５は、漿液性、子宮内膜性、透明細胞および未分化組織構造のすべての 非ムチン卵巣上皮腫瘍の８０％以上で発現する腫瘍関連抗原である（　Ｂａ５ｔ 。

：９８〜１０４．１９８３）。ＣＡ１２５と反応するネズミモノクローナル抗体 ＯＣ１’２５は、樹立されたヒト漿液性嚢腫癌細胞系、ｏｖＣＡ４３３を使用し て発生された（　Ｂａ５ｔ、Ｒ，Ｃ，、Ｊｒ、ら：前出）。卵巣癌患者ノ血−清 中でのこの決定基の定量は、０Ｃ１２５を用いたイムノラジオメトリック・アッ セイの開発によって可能となっている（　Ｋｌｕｇ、Ｔ、Ｌ、ら：　Ｃａｎｃｅ ｒ　Ｒｅｓ、　４４　：１０４８〜１０５！１．１９８４）。ＣＡ１２５抗原決 印刷中）および中心気道と正常肺組織（Ｎｏｕｖｒｅｎ、Ｅ、Ｊ。

ら：　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４３　：　８６６〜８７６．１９８６＞にも見 出されることが報告されている。さらに、ＣＡ１２５活性はヒト精漿中にも存在 が認められる。

ＣＡ１２５決定基はムチン様高分子量糖タンパク複合体に関連すると報告されて いた（たとえば、Ｈａｎｉｓｃｈ。

：　２８１　Ｓ〜２８１９，１９８４：およびＢａ５ｔ、Ｒ，Ｃ。

Ｊｒ、ら：　ＣａｎｃｅｒＢｕｌｌ、　３７　：８ｏ〜ｓ　１　、１９８５参照 ）。しかしながら、ＣＡ１２５はその単離方法がわかっていなかったので、化学 的組成の分析結果も誤本発明は、抗原ＣＡ１２５の単離方法、その単離抗原のプ レバレージョンおよびその単離抗原の使用に関する。

ＣＡ１２５抗原は、この抗原を生育培地中に排出する卵巣癌細胞（たとえばヒト 漿液性嚢腫癌細胞系０ＶＣＡ４３３）の組織培養培地から、２０　Ｄ　ｋＤａ種 として高純度に単離できる。本明細書に記載した操作によって単離されるＣＡ１ ２５種は、電気泳動分析およびイムノプロッティング分析によって確認した場合 、非ムチン性卵巣癌患者の血清中に見出されるＣＡ１２５種と同一である。

本発明の方法によれば、ヒト卵巣癌細胞の培養液から、細胞を含まない上清を得 る。第１工程では、酸処理（たとえば過クロル酸、６Ｍ）でタンパク質を沈殿さ せ、沈殿したタンパク質を除去する。ついで、ＣＡ１２５活性を含有する酸可溶 性分画を中和する。

酸可溶性分画中のＣＡ１２５活性は高分子量複合体（１，０００，０００Ｄａ） に結合している。次の工程では、分子サイズ排除クロマトグラフィーが用いられ 、この高分子量ＣＡ１２５種が低分子量成分から分離される。

たとえば、酸可溶性分画をＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ４　Ｂ　−ＣＬデルのカラム に適用することができる。Ｓ　ｅ　ｐ　ｈａτｏｓｅＴＭ４Ｂ−ＣＬは約６０， ０００〜２，０００．０００　Ｄａの分子を保持する。ＣＡ１２５種合体はとの カラムから、空隙容量中に溶出される。

分子サイズ排除クロマトグラフィーで単離された高分子量ＣＡ１２５複合体の分 裂には、カオトロピック剤（たとえば尿素、６Ｍ）が使用される。カオトロピッ ク剤は、５ｅｐｈａｒｏｓｅ′ｒＭ４　Ｂ　−ＣＬカラムからのＣＡ１２５含有 分画に添加される。ついでＣＡ１２５は、第二の分子サイズ排除クロマトグラフ ィ一工程によって分離される。このカラムは２００　ｋＤａ　ＣＡ　１２５種を 保持するように選択される（たとえばＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ６Ｂ樹脂）。クロ マトグラフィーは、カオトロピック剤と、分裂したＣＡ１２５を安定化するため の界面活性剤（たとえばＳＤＳ　）を含む溶出緩衝液を用いて実施される。ＣＡ １２５活性を含有する（ｏｃ１２５抗体との反応性で確認）保持分画をカラムか ら溶出させて集める。収集した分画からカオトロピック剤を、たとえば透析によ って除去する。

単離操作の最終工程では、ＯＣｌ　２５抗体を用いてＣＡＩ　２５を免疫精製す る。この目的には、免疫活性０Ｃ１２５を樹脂材料（たとえば５ｅｐｈａｒｏｓ ｅ　４　Ｂ　）に結合させたイムノアフィニティーカラムを使用する。

この操作によって単離されたＣＡ１２５抗原は、分子量約２Ｑ　Ｑ　ｋＤａで、 浮遊密度は約１．５６１／ｍｌである。抗原は炭水化物２４チ（重量）を含む。

抗体結合（ＯＣｌ　２５）活性は、熱およびプロテアーゼに不安定であるが、エ キソグリコシダーゼおよび過ヨウ素酸には非感受性で、０Ｃ１２５の連結決定基 はタンパク性であると考えられる。

単離ＣＡ１２５抗原はＣＡ１２５と反応するポリクローナルまたはモノクローナ ル抗体の作成に使用できる。００１２５に対する抗体は卵巣癌の診断および／ま たは治療に、たとえば腫瘍造影、受動免疫療法、および免疫毒素療法に使用でき る。さらに、単離ＣＡ１２５抗原は、患者の血清、血漿または他の生物学的液体 中の抗−〇Ａ１２５抗体の検出に使用できる（たとえば固相ＲＩＡまたはＥＬＩ ＳＡによって）。患者に抗−ＣＡＩ　２５抗体が存在することは、卵巣癌の存在 または再発を指示する。

第１図は、０ＶＣＡ４３３組織培養上清（０−０）お！びヒト血清（◇−＜１） から単離されたＣＡＩ　２５抗原の、５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂカラム クロマトグラフィーにおける溶出像である。

第２図は、ヒト血清（０−９）、０ＶＣＡ４３３組織培養上清（◆−◆）および ヒト乳汁（ローロ）から単離されたＣＡ１２５抗原の、５ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｃ Ｌ　−４Ｂカラムクロマトグラフィー後における密度勾配超遠心を示す。

第３図は、ヒト乳汁／４Ｂ（２００単位／レーン）（レ−：／１）、ｏｖｃＡ４ ５３継代６９／４Ｂ（３００単位／レーン）（レーン３）、ヒト卵巣癌患者血清 ／４Ｂ（１００〜２００単位／レーン）（レージ４〜７）および陰性対照血清／ ４Ｂ　（２３単位／レーン）（レーン８）から単離されたＣＡ１２５抗原のＳＤ Ｓ　−ＰＡＧＥを示す。

第４図は、ｏｖｃＡ４３３から単離され、ついでイムノプロッティングに付した ＣＡＩ　２５抗原の慣用のＳＤＳ：　ＰＡ（）Ｅ（５〜１２チ勾配）を示す。

第５Ａ図は、０ＶＣＡ４３３から単離されたＣＡ１２５抗原の５ｅｐｈｒｏｓｅ 　ＣＬ　−６Ｂ溶出像を示す。溶出は、６Ｍ尿素中４５℃で３０分間処理したの ち５ＤＳ−尿素−トリス緩衝液中で実施した。分画のＣＡ　１．２５活性は固相 ＲＩＡで検定された。第５Ｂ図は、５ｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ　−６Ｂデル濾過カ ラムクロマトグラフイーの関連分画のＳＤＳ　：　ＰＡＧＥ　（６チ）を示す。

第６図は、０ＶＣＡ　４３３から単離されたＣＡ１２５の、５ｅｐｈａｒｏｓｅ 　ＣＬ　−４Ｂカラム上部分精製（ｏ　−ｏ　）および固定化０Ｃ１２５−プロ ティンＡ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂカラム上イムノアフイニテイークロ マトグラフイー精製（０−０）後の密度勾配超遠心を示す。

発明の詳細な説明 ＣＡ１２５の精製操作は、以下に示すように、一般に４工程を要する。この操作 は、卵巣癌細胞を生育させた組織培養培地からＣＡ１２５を単離するのに応用で きる。細胞はもちろん、抗原を発現し、生育培地中に抗原を排出（放出）する卵 巣癌細胞でなければならない。この操作は、生物学的液体たとえば血清または腹 水から抗原を単離するためにも使用できる。しかしながら、これらの体液中に見 出される抗原量はきわめて微かで、抗原の精製源としては一般に実用的ではない 。

好ましい卵巣癌細胞系は、Ｂａ５ｔ、Ｒ，Ｊ、Ｊｒ、ら（前出）によって報告さ れた０ＶＣＡ４り３細胞系である。使用できる他の細胞系には、卵巣腫瘍細胞系 ＮＩＨ：○ＶＣＡＲ−３（ＡＴＣＣ’ＨＴＢ１６１　）、Ｓ　Ｋ　−ＯＶ　−３ （ＡＴＣＣ”ＨＴＢ　７７　）、ＣＡＯＶ　−３（ＡＴＣＣ’　ＨＴＢ　７５　 ）　オ！びＣＡＯＶ　−４（ＡＴＣＣ”　ＨＴＢ　７６　）がある。慣用の一組 織培地中で生育させると、これらの細胞系は培地中にＣＡ１２５抗原を放出する 。放出された抗原はついで、培地から４工程操作によって単離できる。

１、酸沈殿 細胞を含まない上清を酸沈殿に付す。好ましい酸は最終濃度０．６Ｍの過クロル 酸である。沈殿したタンパク質を除去し、ＣＡ１２５活性を含む酸可溶性分画を 中和する（たとえばＫＯＨで）。酸可溶性分画をついで蒸留水に対して透析し、 濃縮する（たとえば最初の上清容量の２０倍）。

２、分子サイズ排除クロマトグラフィー酸可溶性分１を分子サイズ排除クロマト グラフィーに付し、高分子量ＣＡ１２５複合体を低分子量成分から分離する。好 ましい樹脂は（５０ｋＤ〜２，０００　ｋＤの範囲の分子を保持する５ｅｐｈａ ｒｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂ樹脂である。ＣＡ１２５抗原はこのカラムから間隙容量 中に溶出される。抗原はリン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ　）中に適用し、溶出でき る。

ＣＡ１２５活性を含有する分画をカオトロピック剤で処理する。カオトロピック 剤は高分子量ＣＡ１２５複合体を分裂する。尿素が好ましいが、グアニジン塩酸 塩も使用できる。尿素処理に続いて、２００ｋＤａの範囲の分子を保持する樹脂 でクロマトグラフィーを行う。好ましい樹脂は５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−７ ５Ｂである。

５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−６Ｂ上でのりＯ？トゲラフイーは、カオトロピッ ク剤（たとえば６Ｍ尿素）および界面活性剤（たとえば１％ＳＤＳ　）を含有す る緩衝液を用いて行われる。溶出分画はＣＡ１２５ＲＩＡによってＣＡ１２５活 性をモニタリングすることができる。

４．アフィニティー精製 ＣＡ１２５抗原はイムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。

ＱＣ１２５を固相（たとえばプロティンＡ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−４ Ｂ樹脂）に結合させ、前のゲル濾過工程からの抗原含有分画を上記樹脂に、抗原 が固相に特異的に結合する条件下に通過させる。ついで抗原を適当な溶出液たと えばジエチルアミンによって溶出する。好ましいイムノアフィニティーカラムは 、以下に述べる５ｃｈｎｅｉｄｅｒらの方法にほぼ従って調製される。すなわち 、０Ｃ１２５は、０Ｃ１２５抗体の活性を妨害しないカップリング剤、たとえば ジメチルピメリミデートを介してプロティンＡ−８ｅｐｈａｒｏｓｅに共有結合 させる。結合した抗原はジエチルアミンによって溶出する。

好ましい態様では、ＣＡ１２５抗原は、以下に記載する操作を用いて、０ＶＣＡ ４３３細胞培養上清から精製清を集密的単層培養体から収集する。上滑を１０倍 に濃縮し、過りロル酸０．６モル溶液とする。沈殿したタンパク質を除去する。

酸可溶性分画を中和し、ついで蒸留水に対して透析する。ＣＡＩ　２５反応性は 可溶性分画に認められ（９５％）、一方タンパク質の８０チは除去される。

精製工程２．過クロル酸可溶性分画を濃縮し、リン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ　） で平衡化したＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ４Ｂ−ＣＬの３．２　Ｘ　８５αカラムを 用いたゲル濾過クロマトグラフィーによって分画する。各分画についてＣＡ１２ ５活性およびＡ２８０を測定する。大部分のＣＡ１２５活性は間隙容量（ｖＯ） と、その後の小ピークに溶出される。この溶出像は高分子量成分（＞１，０００ ｋＤａ　）と小成分（２００〜４００　ｋＤａ　）の存在を示している。Ｖｏ分 画は初期の反応性の約８５チを含有する。

精製工程３．　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂ　−ＣＬカラムからのＶｏ分画を尿 素濃度が６Ｍになるようにして、０．１％ＳＤＳ。

６Ｍ尿素、５０　ｍＭ　）リス塩酸塩ＰＨ８，０で平衡化した５ｅｐｈａｒｏｓ ａ　ｔ５　Ｂ　−ＣＬの１．２×９５ｃＩｒＬカラムに適用する。分画を集ＣＡ １２５反応性を検定する。ＣＡ１２５活性は２つのピークに溶出する。すなわち ピーク１：間隙容量における微かな高分子量成分（＞１．０００ｋＤａ　）　、 およびピーク２：主要な、低分子量成分（２００〜４００ｋＤａ　）である。

−クロマトグラフィーによってさらに精製する。アフィニティーカラムはＯＣＩ 　２５抗体をプロティンＡ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂ　−ＣＬに共有結合に よってカップリングさせることにより、Ｓｃｈ口ｅｉａ−ｇｒらの方法に従って 調製する。まだ６Ｍ尿素、０．１％ＳＤＳ中にあるプールしたピーク２をイムノ アフィニティーカラムに６回通す。

洗浄後、抗原を５０ｍＭジエチルアミン（ＤＰＡ）　ｐＨ１１，５で溶出する。

溶出液を中和緩衝液中に捕集して直ちに中和し、ついで蒸留水に対して透析する 。

この精製の各工程におけるＣＡ１２５の抗原活性はウェスタンプロットを用いて 評価した。精製工程１（ＰＣＡ抽出）からの大部分の反応性はきわめて高い分子 量（＞　１，０００ｋＤａ　）を有し、低分子量領域（＜１，０００ｋＤａ）に は反応性はほとんどまたは全く認められない。精製工程６からのピーク２の分析 では、大部分の反応性が２００〜４００　ｋＤａの範囲にあることを示している 。これは１　＋０００　ｋＤａ抗原が小さな成分に解離したことを示唆する。最 後に精製工程４でイムノアフィニティーカラムから溶出した抗原は２００〜４０ ０　ｋＤａの成分を有し、１，０００　ｋＤａの反応性は検出されない。

工程５および４以後に認められる２００〜４００ｋＤａ成分が＞　１，０００　 ｋＤａの物質の解離によって形成されたものであることを明らかにするために、 ＰＣＡ抽出物について６Ｍ尿素処理を行い、または行わないで、ウェスタンプロ ットを実施した。非処理ＰＣＡ抽出物は１．０００　ｋＤａの主成分と２００〜 ４００　ｋＤａの微小成分を有する。６Ｍ尿素で処理後には（４５°Ｃ１３０分 間）、大部分の反応性は２００〜４００　ｋＤａ領域に見出された。

本発明の単離操作では、出発した上清物質に対して５．９００倍の精製を達成す ることができる（出発物質対最終物質の活性を単位／ダタンパク質で測定）。こ の操作で単離されたＣＡＩ　２５抗原種は以下の特性を有する。

分子量は約２００ｋＤａである。２４チの炭水化物から構成される。炭水化物の 組成は、ジアール酸、フコース、マンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチル−グ ルコサミンおよびＮ−アセチルガラクトサミン、３．６／　０．４　／　５．０ 　／　６．６　／　５．８　／　２．２の比である。

ＯＣＩ　２５決定基の領域はタンパク性であると考えられる（以下の例証参照） 。

単離されたＣＡ１２５の免疫反応性２００　ｋＤａ種は抗−〇Ａ１２５抗体を作 成するだめの免疫原プレバレージョンとして使用することができる。たとえば、 モノクローナル抗−〇Ａ１２５抗体はＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの標準方 法で生成させることができる。マウスを単離ＣＡ１２５で免疫感作する。牌臓細 胞を収穫し、骨髄腫細胞と融合する。生成したノ・イブリドーマは単離ＣＡＩ　 ２５抗原との反応性に基づき、抗−ＣＡＩ　２５抗体の生成について選択できる 。

ＣＡ１２５に対する抗体は卵巣癌の診断および治療に有用である。たとえば、抗 体は、生物学的液体中のＣＡ１２５の存在の、ＲＩＡおよびＥＬＩＳＡによる診 断試験に使用できる。このような抗体は卵巣癌細胞の同定のだめの腫瘍同定に際 し免疫組織学的技術として使用できる。この抗体はまた、卵巣癌のｉｎ　ｖｉｖ ｏ造影に、卵巣癌の免疫学的治療たとえば受動免疫療法または免疫毒素療法にも 使用できる。

単離ＣＡ１２５は血中の抗ＣＡ１２５抗体を検出するためのイムノアブソーベン トの提供に使用することもできる。ＣＡ１２５抗体の存在は患者に卵巣癌の指標 を提供するものである。

本発明をさらに以下の実施例によって例示する。

実施例 材料および方法 材料 プリステーンで抗原刺激したＢＡＬＢ　／　ｃマウス中で生育させ九ノ・イブリ ドーマが産生ずるネズミモノクローナル抗体ＯＣ１２５（Ｂａ５ｔ、Ｒ，Ｃ，ら ：　Ｊ、Ｃ１１ｎ。

（Ｋａｂａｗａｔ、Ｓ、Ｅ、ら；　Ａｍ、、Ｔ　、Ｃ１１ｎ、Ｐａｔｈｏｌ、　 ７９　：　９８〜１０４．１９８３）。血清サンプルは、進行した上は分娩７力 月後の健康な女性から得た。エキソグリコシダーゼおよびプロテアーゼは、Ｃａ ｌｂｉｏｃｈｅｍ　、ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓ　、ＣＡ　（プロナーゼ）、および Ｓｉｇｍａ　、Ｓｔ　、Ｌｏｕｉｓ。

ＭＯ（キモトリプシン、トリプシン、コンドロイチナーゼＡＢＣ、α−およびβ −ガラクトシダーゼ、α−フコシダーゼ、ヘキサミニダーゼ、ならびにニューラ ミニダーゼ）から購入した。モノクローナル抗体国特許第４，３４９．５２８号 ）はＺｅｎｏｎ　５ｔｅｐｌｅＷＳｋｉ博士、Ｗｉｓｔａｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ ｅ、Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＦＡから恵与された。ポリクローナル抗−Ｃ■ 抗体はＡｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｏｒｔｈ　Ｃｈｉｃａｇ ｏ、ＩＬから入手した。５ｅｐｈａ−ｒｏｓｅＣＬ−４ＢおよびＣＬ−６Ｂ、な らびにプロティ：ｙ　Ａ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂは、Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ。

Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ　、ＮＪから購入した。電気泳動試薬はＢｉｏ−Ｒａｄ、 Ｒｏｃｋｖｉｌｌｄ　Ｃｅｎｔｒｅ、ＮＹから購入した。Ｓｅａ−ＫｅｍＬＥア ガロースはＦＭＣＣ０ｒｐ−、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥから購入した。サカナゼ ラチンはＮｏｒｔｈｌａｎｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｉｎｃ、、ＮｅｗＢｒｕｎｓ ｖｒｉｃｋ、ＮＪから入手した。他の試薬はすべて最高の純度の市販品とした。

固相ラジオイムノアッセイ ＣＡ１２５活性（Ｋｌｕｇ、Ｔ、Ｌ、ら：　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４４゜： １０４８〜１０５３．１９８４）およびＣＡ１９−９活性（Ｒｉｔｔｓ　、Ｒ， Ｅ、ら：　Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　３３　：　３３９〜４４５．１９８４） の測定には、同時「サンドインチ」イムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ 　）を使用した。ＣＡＣＡｌ２５ＩＲにおいては、（１２３１〕−□０１２５（ １００μＡ、Ｉ　Ｘｌ　０５ｃｐｍ）をポリスチレン−固定化ｏｃ１２５および サンプル（１００μｔ）とインキュベートした（２０時間、２６°Ｃ）。ビーズ を洗浄しく６回）、ガンマカウンターでカウントした。アッセイキットはＣｅｎ ｔｏｃｏｒ、Ｍａｌｖｅｒｎ、　Ｐ　Ａで製造されだ０平板アツセイは９６ウエ ル・ポリ塩化ビニル・マイクロタイター板（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　）を用いて実施 した。

０ＶＣＡ　４５５　／　ＰＣＡ　／　４　Ｂ　（ｒ　０ＶＣＡ　４３３組織培養 上清からのＣＡ　１．２５の単離」の項参照）分画を用いてウェルを被覆した１ ００μｚ、ｓｏｏ単位／ウェル）。

平板に抗原を結合させたのち（１８時間、４°Ｃ）、ウェルを５％（Ｗ／Ｖ　） ウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ　）と１時間インキュベー トした。インキュベーション終了後、ウェルの液を除き、ＰＢＳで２回洗浄した 。次に（１２５Ｉ）−０Ｃ１２５（２０μｔ１２　Ｘ　１０’　ｃｐｍ　）を固 定化抗原とインキュベートした（４時間、２３℃）。ついでウェルをＰＢＳで６ 回洗浄し、切断し、ガンマカウンター中でカウントした。

ＣＡＣＡｌ２５ＩＲは多価抗原のみを検出するので、１価および多価抗原の両者 を定量するために阻止アッセイを開発した。阻止アッセイは、（：　１２５１　 ］−〇Ｃｌ２５（２０μｔ、２Ｘ１０’ｃｐｍ）を、放射標識０Ｃ１２５の平板 への結合を阻止できる各種抗原プレバレージョンと同時にインキュベートした（ ５０μｔ、　４時間、２３６Ｃ）以外は上述の平版アッセイと同様に実施した。

ウェルを６回洗浄し切断し、ガンマカウンター中でカウントした。平板アッセイ および阻止アッセイの両者に用いられる放射性ヨード化０Ｃ１２５はＣｅｎｔｏ ｃｏｒ　ＲＩＡキットから得た。

ＳＤＳ　：ポリアクリルアミドデル電気泳動Ｌａｅｍｍｌｉの方法（Ｌａｅｍｍ ｌｉ、Ｕ、に、　：　Ｎａｔｕｒｅ　２７７　：６８０〜６８５．１９７０）に ほぼ従って慣用のＳＤＳ：　ＰＡＧＥを実施した。サンプル緩衝液にはスルフヒ ドリル還元剤またはＳＤＳを加えず、加熱しなかった。これらの条件でないとＣ Ａ１２５抗原が不活化されたからである。ＣＡ１２５抗原は通常の３％Ｃ１）ポ リアクリルアミドゲルを浸透しなかったので、一部の実験では、サンプル成分の 分離にポリアクリルアミド−アガロース混成ゲルが必要であった。

通常、混成デルは２．５％ポリアクリルアミドと１．０チアガロースから製造さ れた。この溶液を６５°Ｃに加熱し、この時点で過硫酸アンモニウムを添加した 。予熱した溶液をついで、予め３７℃に平衡化したデル装置に直ちに注ぎ、次に 全装置をアガロースが固化するまで４°Ｃに冷却した。室温で２．５％ポリアク リルアミド−１，０％アガロースの積重デルを上張りしたのち、サンプル（３０ ０単位／レーン）をスルフヒドリル還元剤またはＳＤＳを含まず、加熱していな い１０Ｍ尿素サンプル緩衝液中に適用した。電気泳動け４°Ｃで実施した。混成 ゲルの製造および試行に用いられるすべての緩衝液もＬａｅｍｍｌｉの記載（前 出参照）に従った。

イムノブロッティング 電気泳動後、タンパク質を電気泳動によりニトロセルロースに遷移しく　Ｔｏｗ ｂｉｎら：　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

７６：４５５０〜４３５４．１９Ｔ９）、放射標識ｏｃ１２５でイムノブロッテ ィングを行い、オートラジオグラフィーに付した。各イムノプロットには少なく とも１つの陰性抗原対照レーンを含有させた。電気泳動による遷移は１００ｍＡ で一夜実施しだ。イムノブロッティングはニトロセルロースを、サカナゼラチン 緩衝液（１チサカナゼラチン、５ＱｍＭクエン酸塩、ｐＨ６，０，０，０５チＮ Ｐ−４０）中放射性ヨード化０−０１２５　（２Ｍ、２　Ｘｌ　０’　ｃｐｍ） で６時間被覆して行った。ついでニトロセルローシシートを、ＣｒｏｎｅｘＱｕ ａｎｔａ　■フルオールスクリーン（ＤｕＰｏｎｔ　）を用いてＸ−線フイルム に一８０チで１８時間曝露してオートラジオグラフィーを行った。

ヒト血清およびヒト乳汁の分画 全血清を１時間１［させ、ついで遠心分離した（３，０００Ｘ、９．１０分）。

上清の一部（２が）をＰＢＳで平衡化した１、２　Ｘ　４７ｃｍ　５ｅｐｈａｒ ｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂカラム上で分画した（ヒト血清／４Ｂ）。ＣＡ１２５ＲＩ Ａで確認したＣＡ１２５活性含有分画（１ｍｊ）をプールして濃縮した。ヒト乳 汁は１０°Ｃで遠心分離して（３，ＯＯＯＸｇ、１時間）脱脂した。上清は血清 について上述したようにカラムクロマトグラフィーによってさらに精製した（ヒ ト乳汁／４Ｂ）。

ｏｖｃＡ４３３ヒト卵巣癌細胞を、’ｌｒｎＭグルタミン、１蜆ピルベート、１ ％非必須アミノ酸および１０チ熱不活化ウシ胎仔血清を補充したイーグルの最小 必須培地中で生育させた。Ｔ−１５０フラスコ（（：ｏｓｔａｒ　）に１×１０ ６個の細胞を播種した。細胞が集密状態に達するまで生育を続けさせ、この時点 で培地を取出した。

新鮮な培地を添加し、５〜７日間間隔で計１０〜１２週間採集した。０ＶＣＡ４ ３３細胞は、Ｇｏ生育期に最大量のＣＡ１２５抗原を産生ずるものと考えられた 。これらの条件下に産生ずるＣＡＩ　２５抗原の濃度は約１．０［］０単位／ゴ であった。プールした細胞上清を１０．０００Ｘ、９で遠心分離し、５ａｒｔｏ ｒｉｕｓ　Ｏ−２ミクロン孔径連続フィルターカプセルを通して濾過し、Ａｍ１ ｃｏｎ　Ｄ　Ｃ−２中空繊維装置および分子量カットオフ１００　ｋＤａのフィ ルターカートリッジ（ＨＰｌｏｏ−２Ｃ１Ｏ”）を用いて最初の容量の１０分の １に濃縮した。濃縮物は一２０℃に凍結保存した。この条件で、ＣＡＩ　２５活 性は少なくとも１２力月安定であった。

０ＶＣＡ４３３組織培養上清からのＣＡ１２５の単離ＯＶＣ’Ａ　４３３組織培 養上清の１０倍ＩＩＩ縮物を保存したのち、まず過クロル酸（ＰＣＡ、最終濃度 ０．６Ｍ）沈殿に付した（　Ｋｒｕｐｅｙ、Ｊ−ら：　Ｊｌｘｐ、Ｍｅｄ、　１ ２８　：　３８７〜３８８．１９６８）。ＣＡ１２５活性はＰＣＡ可溶性分画に 残存し、完全に保存された。酸可溶性分画を水酸化カリウム（１，２Ｍ）で中和 し、蒸留水に対して透析しく２４時間、４°Ｃ）、最初の上清容量の２０倍に濃 縮した。このサンプルは○ＶＣＡ　４３３　／　ＰＣＡと呼ぶ。

０ＶＣＡ　４３５　／　ＰＣＡサンプル（３５１ｆＬｔ）をＰＢＳに平衡化した ５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂカラム（５，２Ｘ　７０ｃｍ）に適用した。

ＣＡ１２５ＲＩＡで確認してＣＡＩ　２５活性を含有する分画（７＋／）をプー ルし、濃縮した。この分画を０ＶＣＡ　４３３／ＰＣＡ／　４　Ｂと呼び、とく に指示のない限シ全実験に使用する。

次の分画化は０ＶＣＡ　４３３　／　ＰＣＡ　／　４　Ｂ分画の尿素処理Ｃ６Ｍ 、５０分、４５°Ｃ）、ついでトリス−尿素−８ＤＳ　（５０ｍＭ　トリス、６ Ｍ尿素、０．１％　ＳＤＳ　、　ｐＨ８，０）中に平衡化した５ｅｐｈａｒｏｓ ｅ　ＣＬ　−６Ｂカラム上クロマトグラフィーとした。最終分画化は０Ｃ１２５ −ゾロティ：ｙ　Ａ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂカラム上イムノアフ ィニティークロマトグラフィーによって行った。モノクローナル抗体０Ｃ１２５ を、５ｃｈｎｅｉｄｅｒらの方法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５７　：　１ ０７６６〜．１０７６９　。

１９８２）にほぼ従って、プロティン−Ａ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂカ ラムに共有結合させ、洗浄し、カップリングさせた。わずかな改変は、トリス− 塩酸塩の代わシにクエン酸緩衝液（０，０５Ｍ、　ｐＨ６，０）、デオキシ”　 −／’酸（ＤＤＣ）の代わりにタウロデオキシコール酸（ＴＤＣ）を用いて点で ある。０．１　％　ＳＤＳおよび６Ｍ尿素中５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂ カラムからのＣＡ１２５反応性低分子量分画をアフィニティーカラムに反復（３ 回）通過させると、ＣＡ１２５活性の８０％以上が結合した。ＣＡ１２５抗原の カラムからの溶出はジエチルアミ７　（ＤＥＡ　）　（５０ｍＭ％　ｐＨ１１， ３）を用いて行った。このアフィニティーで精製した抗原を以下０ＶＣＡ４３３ ／４　Ｂ／ＤＥＡと呼ぶ。

密度勾配超遠心 ヒト血清、ヒト乳汁または○ｖｃＡ４３３組織培養上清のいずれかから単離した ＣＡ１２５抗原の、５ｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂ上クロマトグラフイー後超遠 心はＰＢＳ中塩化セシウム同密度勾配（ＰＢＳ　３．４１４ｍｊ中Ｃ５ＣＬ２． ２７６．９を溶解）によって実施した。β−ガラクトシダーゼの浮遊密度を標準 として測定した。分画（０，２１ｍ）についてβ−ガラクトシダーゼ活性を、Ｍ ｉ　１１　ｅｒの方法（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 Ｇｅｎｅｔｉｃｓ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　＆ｒｂｏｒ。

ＮＹ、１９７２）による平衡状態で検定した。勾配は、した（　３３＋０００ｒ ｐｍｓ　６８時間、１０°Ｃ）。分画Ｃ０，２ｍ１）を集め、上述のＣＡ１２Ｓ ＲｒＡを用いて活性を検定した。各分画の密度は既知容量の秤量によって測定し た。

化学的処理 ＣＡ１２５抗原の過ヨード酸酸化は、酢酸緩衝液（ｐ）Ｉ　４．５．５０　ｍＭ １４°Ｃ）中０．−０．１．　１．０．１０．０および１００餌過ヨード酸によ り、５ｔａｈｌら（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、７３　：　４０４５〜４０４９　、１９７６）に 従い、暗所で実施した。還元とアルキル化は別に記載されている方法によった（ 　Ｇｌａｚｅｒ、Ａ、Ｎ、ら：　Ｃｈｅｍｉ−ｃａｌ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏ ｎｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｔ、Ｓ、ＷｏｒｋおよびＥ。

ｖｉｅｒ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、　１９７５参照）。還元は、グアニ ジン塩酸塩（６Ｍ）の存在下または非存在下にＤＴＴ　（１０ｍＭ、５０　ｍＭ 　）リス、ｐＨ８−１，４時間、４５°Ｃ）によって実施した。アルキル化は、 サンプルを室温に冷却したのち、ヨード酢酸（２０ｍＭ、５０分）によって行っ た。サンプルは蒸留水に対して直ちに透析した（４°Ｃ１１８時間）。

ｐＨ４，５，４８時間、６７°Ｃ）中で実施した。エキソグリコシダーゼの単位 数は、適当な時間枠内にオリヒ糖残基の完全な消化が確実に行われるように選択 した。

エキソグリコシダーゼ消化はすべて、適当な基質が薄層クロマトグラフィーで検 出して完全に加水分解されたことを示す条件下に実施した。処理後のＣＡ１２５ 活性は前述のように、ＣＡ１２５ＲＩＡおよび平板アッセイの両者で検定した。

各種プロテアーゼによる消化はトリス−塩酸塩緩衝液（０，２Ｍ、　ｐＨ８，０ ，１０ｍＭ塩化カルシウム）中で実施した。プロテアーゼとしてトリジシン、キ モトリプシンおよびゾロナーゼ（２％ｗ／ｖ、ｓｏμｔ）を抗原含有ウェルに加 え、インキュベートした（４８時陣３７℃）。プロテアーゼ消化は、薄層クロマ トグラフィーで検出してアルブミンの加水分解が起こる条件下に行った。サンプ ルは前述のように、ＣＡ１２５ＲＩＡおよび平板アッセイの両者で、ＣＡ１２５ 活性を検定○ｖＣＡ４３３／４Ｂ／ＤＥＡのサンプルを０．１％７−１−／−ル 含有６Ｎ塩酸に溶解し、真空下に密封し、１１０℃で２４時間加水分解した。ア ミノ酸はフェニルインチオシアネー）　（ＰＩＴＣ）で誘導体とし、誘導ＰＴＣ −１０４，１９８４）の溶出条件を用いてＨＰＬＣで定量した。

炭水化物組成 アミノ酸定量に付したと同じロットのｏｖｃＡ４３３／４Ｂ／ＤＥＡのサンプル をＹａｎｇとＨａｋｏｍｏｒｉ　（Ｊ　、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２４６：１１９２〜１２００．１９７１）によって報告されている炭 水化物組成分析に付した。サンプルはアセトＩＪシスに付したのち、加水分解、 還元した。生成した糖アルコールを無水酢酸でペルー〇−アセチル化した。ジア ール酸の定量はトリメチルシリル誘導体（ＴＭＳ　）として実施した（　Ｌａ１ ｎｅ、Ｒ９Ａ、ら：Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ−２８：　１５９〜１６７　、１ ９７２　）。

糖アルコールアセテートおよびＴＭＳ−メチルグリコシドはいずれもＨｅｗｌｅ ｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ　５７９０ガスクロマトグラフによって分離し、Ｈｅｗｌ ｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ　５７９０質量選択検出器（ＭＳＤ　）によって同定し た。

０ＶＣＡ　４３３およびヒト卵巣癌患者血清から過りロル酸沈殿によって単離し た抗原は最初、５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−４Ｂカラムの間隙容量に溶出する（ 第１図）。さらに、はるかに分子量が小さいことを示すＣＡ１２５活性の小ピー クが遅れてカラムから溶出する。これらのＣＡ１２５活性のピークは分子量１． ０００１ＣＤａ以上おＣＡ１２５抗原溶出パターンも０ＶＣＡ　４３３およびヒ ト癌患者血清についてみられたパターンと類似する。

○ＶＣＡ　４５３細胞上清、卵巣癌患者血清およびヒト乳汁から単離された抗原 の物理的性状を比較するためへそれぞれに一つき浮遊密度を測定した（第２図） 。０ＶＣＡ４６６から単離した抗原を５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂカラム に通したのち（０ＶＣＡ　４３３／　４　Ｂ　）、抗原の平均浮遊密度は約１． ４２Ｆ／１ｍであるのに対し、患者血清７４Ｂおよび乳汁／４Ｂの場合の浮遊密 度はそれぞれ１．４６および１−３２９／ｍｔである。標準として、α−ガラク トシダーゼについて浮遊密度を測定したところ１−３２　ｇ／ｍ！であった。こ れは報告された値１．３１６９　／ｍｌ　（Ｃｏ５ｔｉｎｉ、Ｎ、Ｖ、ら：　Ｊ 、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ’、　２５４　：１１２４２〜１１２４６．１９７９）と よく一致する。

第６図は、０ＶＣＡ　４３３　／　４　Ｂ％　ヒト乳汁／４Ｂおよび卵巣癌血清 ／４Ｂからの免疫反応種の、混成２．５％ポリアクリルアミド／１．０％アガロ ースｒゲルの電気泳動移動度を比較したものである。サンプルを、ＤＴＴまたは ＳＤＳを含まず、加熱していない１０Ｍ尿素サンプル緩衝液中に適用した。各原 料からの、イムノプロッティングしたＯＣＩ　２５反応性抗原は、類似の電気泳 動像を有する２００〜１　＋　０００　ｋＤａの間の高分子量複合体として存在 する。ＣＡ１２５抗原複合体の多種の集合状態を示唆するこのデータは、第１１ 図に示した５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂ溶出像とよく合致する。両実験と も、抗原が１，０００ｋＤａ以上の高分子量種としておよび約２００〜６００　 ｋＤａの低分子量種として存在することを示している。

０ＶＣＡ　４３３　／ＰＣＡ／４　Ｂ分画を、イムツブ０７テイングについで６ 〜１２チポリアクリルアミド勾配ゲルを用いてＳＤＳ　：　ＰＡＧＥ電気泳動に 付すと、放射性ヨード化モノクローナル抗体０Ｃ１２５と反応性のレーンは１， ０００　ｋＤａ分子量以上のバンドと約４００　ｋＤａの低分子量バンドを与え る。使用したサンプル緩衝液は１０チグリセロール、０．０８Ｍトリス、ｐＨ６ ，８およびブロモフェノールブルーを含有した。隣接レーンは、シアリル化うク ）−Ｎ−フコペンタツース■炭水化物決定基を認識する放射性ヨード化モノクロ ーナル抗体１９−９で覆うと、高分子量バンドのみが認められる。

放射性抗−〇ＥＡをかぶせたレーンには免疫反応性は認められない。さらに、モ ノクローナル抗体１９−９をオーバーレイとして用いたウェスタンプロットでは 、ＱＣ１２５アフイニテイー精製ＣＡ１２５抗原（ＯＶＣＡ４３３　／　４　Ｂ 　／　ＤＥＡ　）分画は全くバンドを生じない。

また、ＣＡ　１９−９　ＲＩＡで測定した場合、ＣＡｉ　９−９活性は存在しな い（データは示していない）。この結果は、抗原性決定基ＣＡ１２５およびＣＡ １９−９は同じ高分子量糖タンパク質複合体上に存在するが、ＣＡ１２５および ＣＡ１９−９決定基は同じ糖タンパク質分子上には存在しないことを明瞭に示し ている。

５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂカラムクｏ’ｖトゲラフイーおよびＳＤＳ　 ：　ＰＡＧＥ分析の結果は、低分子量物質は多分、高分子量種に由来したもので あることを示唆する。高分子量物質を、イオン性（ＳＤＳ　）および非イオン性 （ＮＰ−４０）界明活性剤の両者で分解する試みは徒労に終った。しかしながら 、０ＶＣＡ　４５３／　ＰＣＡの５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂカラムの間 隙容量を集め濃縮し６Ｍ尿素により４５°Ｃで６０分間処理し、ついで０．１％ ＳＤＳおよび６Ｍ尿素中５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−６Ｂ上カラムクロマトグ ラフィーに付すと、第５図に示すように２つのピークを生じる。この工程後には 、大部分（８０％）のＣＡ１２５活性は約２００　ｋＤａとはるかに低い分子量 のピークに伴って見出される。これは、５ｅｐｈａ−ｒｏｓｅ　ＣＬ　−６Ｂカ ラムクロマトグラフイーからの分画の電気泳動およびイムノプロッティングによ って確認される（第５図）。一部の抗原は依然として高分子量結合型に保持され る。

５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂカラムク０マドグラフィー、ついで６Ｍ尿素 および熱処理、続いて６Ｍ尿素およびＱ、ｉ％ＳＤＳの存在下における５ｅｐｈ ａｒｏｓｅ　ＣＬ　−６Ｂ上カラムクロマトグラフィーにより（第５図）、０Ｖ ＣＡ４６３上清からのＣＡ１２５抗原は１，４００倍に精製される（データは示 していない）。このプレバレージョンは、タンパク質１μｇあたり１１７単位の ＣＡ１２５比活性を有する。比活性は、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ　ＣＡ１２５ＲＩＡキ ツトを用いてＣＡ１２５活性を測定し、これと同一ロットの精製ＣＡ１２５抗原 についてアミノ酸分析を行いタ；バク質量を定量することによってめられる。抗 原の最終分画化は、固定化ＯＣ１２５−プロティンＡ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　 ＣＬ　−４Ｂカラム上イムノアフィニティーによって実施する。カラムからジエ チルアミン（ＤＥＡ　）によって溶出される抗原の比活性は３１７単位ＣＡ１２ ５／μｇタンパク質である。

５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂカラムおよび０Ｃ１２５イムノアフイニテイ ーカラムから溶出された抗原サンプルを密度勾配超遠心に付した。この操作から 、２種の抗原プレバレージョンでは、平均浮遊密度は異なることがわかる（第６ 図）。さらに高純度に精製されたＤＥＡ溶出物は約１−５６ｇ／ｍｌの浮遊密度 を有するが、Ｏ’ＶＣＡ４３５／４Ｂの場合の浮遊密度は約１．４２ｇ／＋７で ある。これは、純度の低い抗原はどグリコジル化程度の高いタンパク質に結合し ていて、浮遊密度像は多分散性を示すと同時に、平均浮遊密度は高くなることを 示ｏｖＣＡ４３５／４Ｂ／ＤＥＡの炭水化物組成の予備的試験では、ジアール酸 、フコース、マンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＮ− アセチルガラクトサミンがそれぞれ６．６：、０．４０　：　３．０　：６．６ 　：　５．８　：　２．２の比で存在することが明らかにされている（データは 示していない）。このデータは、Ｎ−および〇−結合オリゴ糖の両者が存在する ことを示している。さらに、この免疫精製ＣＡ１２５抗原は重量で２４％の炭水 化物を含むことが見出され、これは、その浮遊密度１．５６９／ｍｌから計算さ れる値とよく一致する。したがって、ＣＡ１２５抗原は典型的なムチンではなく 、脂質は含まれていたとしても有意な量でＣＡ１２５決定基の性質は、多くの化 学的および物理的処置ならびに抗原の徹底的エキソグリコシダーゼおよびプロテ アーゼ消化を用いて検討した。０ＶＣＡ４３３／４Ｂおよびヒト乳汁／　４　Ｂ から単離されたＣＡ１２５免疫反応性抗原の過ヨウ素酸酸化（第１ｔａは、ＣＡ １９−９炭水化物決定基、ジアール化ラクト−Ｎ−フルコペンタノース■の活性 が完全に破壊されるヨウ素酸濃度および反応時間でも、活性に影響を与えない。

事実、ＣＡ１９−９活性を破壊する最小過ヨウ素酸濃度では、ＣＡ１２５活性に は増加さえ認められる。きわめて高い過ヨウ素酸濃度（１００ｍＭ）またはきわ めて長い反応時間（２４時間）でのみＣＡ１２５活性の有意な低下が認められる が、これは抗原のタンパク質骨格の非特異的な酸化によるものと思われる。

第１表 各種濃度、反応時間の過ヨウ素酸酸化のＣＡ１２５活性に対する影響 濃度（ｍＭ）　時間（ｈ） ＯＶＣＡ　０　１００　９９　１０２　１０２４３３／　０．１　１００　１１ ０　１１５　９２ＰＣへ／　１．０　１００　１３４　１４４　１２１４Ｂ　： ｆｆ０−０　１００　１５１　１３５　１１９１００．０　１００　７２　４８ 　４０ヒ上乳汁／　０　１００　１０１　１０３　９８４Ｂ　Ｏ，１１００１０ ３９５９７ １，０１００１０７１１０８４ １０・０　１００　１１１　６９　５０１００．０　１００　７　５　５ 陽性対　０　１００　１００　９７　９９照１−９−９　０．１　１００　１（ Ｓ　１１　５ｃＧｐ　１−０　１００　１０　５　５大部分のタンパク質の変性 を生じる化学的および物理的処理、すなわち６Ｍグアニジン塩酸塩中での還元お よびアルキル化、８Ｍ尿素および煮沸はすべてＣＡ１２５の免疫反応性を低下さ せる（第■表）。しかしながら、還元単独はＣＡＩ　２５の免疫反応性に影響し ないようである。すなわち、グアニジン塩酸塩の存在下における還元またはアル キル化で認められた活性低下は、主として抗原に対するグアニジン塩酸塩の作用 によるものである。また、陰イオン界面活性剤ＳＤＳも、非イオン界面活性剤Ｎ Ｐ−４０もＣＡ１２５の免疫反応性には影響しない。

第■表 グアニジン塩酸塩　ＮＤ　２０　４９ （６Ｍ、４５１４時間） 還元（Ｉ　ＱｍＭＤＴＴｌ　ＮＤ　７３　９８４時間、４５°Ｃ） グアニジン塩酸塩中還元　ＮＤ　４０　２０アルキル化（２０ｍＭヨー　ＮＤ　 ５１８２ド酢酸、３０分、２０℃） グアニジン塩酸塩中アル　ＮＤ　４０　２９キル化 還元およびアルキル化　ＮＤ　５３　５１グアニジン塩酸塩中　５　１２　５〜 ７還元およびアルキル化 尿素（８Ｍ、２４時間、４°Ｏ）　１００　１００　１００尿素（８Ｍ、２４時 間、４５℃）　１５　１０　０加Ｍ（１００℃、２Ｃ１ｌ　ＯＯ［１ ｓｐｓ（２％）　１００　ＮＤ　ｌ０ＯＮＦ−４０（１０％）　、　１００　Ｎ Ｄ　Ｉ００エキソグリコシダーゼ処理を種々の組合せでＣＡ１２５抗原に対して 実施した（第■表）。固相ｒｍではα−ガラクトシダーゼおよび／またはβ−が ラクトシダーゼ処理によりわずかにＣＡ１２５免疫反応性が低下することを示し ている。一方、平板アッセイでは免疫反応性の低下は認められない。実際、大部 分のエキングリコシダーゼ処理後、固定化抗原の放射標識０Ｃ１２５抗体を結合 させる能力は増加する。この結果は過ヨウ素酸酸化で得られた結果と一致し、末 端炭水化物残基の除去によってＣＡ１２５決定基への０Ｃ１２５の接近が実際に 増大したものと考えられる。

最後に、プロナーゼ、トリプシンまたはキモトリプシンによる徹底的プロテアー ゼ消化は、ＩＲＭＡで測定しても平板アッセイで測定しても、抗原活性を完全に 消失させる。

第■表 ０ＶＣＡ４３３から単離されたＣＡ１２５抗原活性に対する酵素消化の影響 ０．、ッ／”　１）：”／／−（？Ｑｉ　°”１２５５鯨４儂）ニューラミニダ ーゼ（Ｎ）　９６　１２５Ｎ十α−フコシダーゼ（Ｆ）　１０６　１２８Ｎ十Ｆ 十β−ガラクトシダーゼ（βＧ）　９６　１２９Ｎ十Ｆ＋７Ｇ＋へ＃；／？ｊ二 ／−−ｔ’　１０９　１２３α−ガラクトシダーゼ　９４　１１７ α＋β−ガラクトシダーゼ　８８　１１６フンドロイチナーゼＡＢＣ９３９４ 徹底的グロテアーゼ処理　Ｉ　’ＥＷＡ　平板アッセイ考察 ネズミモノクローナル抗体０Ｃ１２５は、ヒト卵巣癌関連抗原決定基（ＣＡ１２ ５）を認識する。本発明者らは、卵巣癌細胞系０ＶＣＡ　４３３、ヒト血清およ び乳汁から糖タンパク質複合体を単離した。これらはすべてＣＡ１２５決定基活 性を発現する。さらに、本発明者らは、Ｂｒｕｉｊｎら（前出）の観察に反して 、精漿中にもＣＡ１２５活性を確認した。０ＶＣＡ４３３細胞上清から単離され た高分子量複合体の化学的処理およびクロマトグラフィーによ’）　２００　ｋ Ｄａの免疫反応種が生じた。しかしながら、抗原決定基を発現する実際のタンパ ク質はさらに低分子量である可能性もある。さらに、もつと分子量の低い免疫反 応種の単離を試みたが現在までのところ無効なことが明らかにされている。また 、本明細書に記載した単離体系では、完全均一かつ純粋な種は得られない。

数種の原料から単離されたＣＡ１２５決定基を発現する抗原は、平均浮遊密度１ ．３６〜１．４６１１　／Ｉｌｌの高分子量糖タンパク質複合体として存在する 。しかも、これらの平均密度は、６種の原料から単離された各抗原がわずかなが ら異なるタンパク質および炭水化物損たけそれ以上の炭水化物からなり、大部分 は〇−結結合オリゴマ、Ｎ−結合鎖をほとんどまたは全く含まない高分子量糖タ ンパク質と定義すると、ＣＡ１２５抗原は典型的なムチンではない。この結論は 、ＣＡ１２５の炭水化物組成が２４チであること、高含量のマンノースが存在す ること、大部分がＮ一連結オリゴ糖であること、およびＣＡ１２５抗原の浮遊密 度が低いことに基づくものである。非グリコジル化タンパク質の平均浮遊密度は １．２５〜１．３５　ｆ！／ｎｔであるが、一方、ムチンの平均浮遊密度は約１ ．５０．！ｉ’／ｍ／である。この所見は、モノクローナル抗体によって認識さ れる他の上皮性腫瘍関連抗原、たとえば１９−９　（Ｍａｇｎａｎｔ。

Ｊ　、Ｌ、ら：　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５７　：　１４３６５〜１４３６ ９゜１９８２　）　、　Ｂ　７２．５　（Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｖ、Ｇ、ら：　Ｃａ ｎｃｅｒと、曇：８５０〜８５７．１９８６）、ＤＵ−ＰＡＮ　−’ｌ　（Ｌａ ｎ、Ｍ、Ｓ、ら：　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４５　：　５５０〜３１０．１９ ８５）およびＦ　３６　／　２２　（Ｃｒｏｇｈａｎ。

よって高分子量ムチン様糖タンパク質として分類されてきた抗原について報告さ れている所見とは相反している。

０ＶＣＡ４３３の上清から単離された高分子量抗原複合体はモノクローナル抗体 １９−９　（Ｍａ、ｇｎａｎｉら二前出）と反応性を示し、ＣＡ１９−９決定基 はこの複合体上に存在することを示唆している。しかしながら、本発明者らは、 電気泳動およびイムノブロッティングによって、０Ｃ１２５イムノアフイニテイ ー精製ＣＡ１２５抗原がモノクローナル抗体１９−９と反応性を示さなかったこ とから、ＣＡ１９−９とＣＡＩ　２５の両決定基は同一の糖タンパク質上にはな いことを明瞭に示した。この観察は、ＣＡ１９−９およびＣＡ１２５両活性をヒ ト乳汁から単離したＨａｎ　ｉ　ｓ　ｃ　ｈら（前出）の示唆とは相反している 。

モノクローナル抗体０Ｃ１２５によって認識される抗原決定基の性質をさらＫよ く理解するために、ＣＡ１２５抗原の化学的および物理的処理を行った。ＣＡ１ ２５の過ヨウ素酸化では、過ヨウ素酸の濃度が高いときまたは反応時間が長いと きにのみ、免応反性が低下した。実際、ＣＡ１９−９決定基の免疫反応性が完全 に消失する濃度および反応時間でも、抗原の活性は明らかに増加した。高濃度の 過ヨク素酸によるＣＡ１２５活性の消失は、多分、タンパク質骨格の非特異的な 酸化によって生じたものと思われる。ＣＡＩ　２５抗原の精製時、尿素および熱 処理後に、初めの活性の８２チの消失を認めた。この活性の見掛は上の低下は、 抗原複合体の結合度の低い型への分解または抗原の部分変性による可能性が最も 高かった。ＣＡ１２５ＲＩＡはＣＡ１２５抗原価、すなわち抗原分子あたりの０ Ｃ１２５結合部位の数に敏感であるから１．結合度の低い状態は単位価の低下を 招くことが考えられる。

ＣＡ１２５決定基は炭水化物性であると示唆したＨａｎｉｓｃｈら（前出）の観 察は、２つの特性、すなわち、その過ヨウ素酸酸化に対する感受性（濃度１ＱＱ ｍＭ。

反応時間１８時間）とＮ−アセチルニューラミン酸が選択的に切断される条件下 で−３，３，１００°Ｃ）でのその活性の消失に基づくものであった。彼らの結 果はまた、ニューラミダーゼ処理のみでは、ムチン結合ジアール酸の約９７チが 切断したにもかかわらず、免疫活性の低下はわずかにすぎないことを示していた 。本発明者らの結果は、炭水化物を酸化するのに十分な過ヨウ素濃度がＣＡ１２ ５活性に影響しないことを明瞭に示している。しだがって、ｐＨ３，３，１００ ℃でＣＡ１２５の抗原活性が破壊されることは驚くべきことではない。さらに、 グアニジン塩酸塩の存在下の還元およびアルキル化で９５％以上の活性が失われ た。最後に、エキソグリコシダーゼ処理では実際にＣＡＩ　２５活性の□増加が 生じたのに対し、徹底的プロテアーゼ消化では抗原活性は完全に消失した。これ らのデータは、ＣＡＩ　２５決定基が本来タンパク性であるか、または少なくと も、立体配置依存性エピトープに炭水化物が結合したタンパク質であることを強 く示唆するものである。これは各種起源たとえばヒト血清、０ＶＣＡ４３３、お よびヒト乳汁から単離された抗原の類似性も説明する。ペゾチド決定基は炭水化 物決定基よりもはるかに高度な保存が期待される。すなわち、タンパク質配列は 単一の独特のタンパク質に関連することが考えやすいが、炭水化物構造は数種の 異なるタンパク質上に存在できる。これらの結果は、モノクローナル抗体Ｂ　７ ２−３によって認識される腫瘍関連糖タンパク質エピトープ（ＴＡＧ　−７２） の性質が立体配置依存性ＴＡＧ−７２決定基の形成部分として、炭水化物に加え てタンパク質を指示すると思われたことから、全く独特なものではないと考えら れる。

均等 本技術分野の熟練者であれば、以上述べた本発明の特定の態様に対する多くの均 等な態様に想到し、また単なる定常的実験によってそれを確認できよう。このよ うな均等な態様は以下の請求の範囲に包含することを意図するものである。

分画杏号 密度　（ｇ／ｍ１） １．２　１．２８　＋、３６　１．４４　＋、５２　１．６密度　（ｇ／ｍｌ） 補正書の翻訳文提出書　（特許法第１８４船躊罎）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）分子量約２００ｋＤａの抗原ＣＡ１２５の単離された免疫種。 （２）以下の特性を有する抗原ＯＡ１２５の単離された免疫種： ａ．分子量約２００ｋＤａ ｂ．浮遊密度約１．３６ｇ／ｍｅ ｃ．炭水化物組成約２４％（重量） ｄ．炭水化物組成、ジアール酸、フコース、マンノース、ガラクトース、Ｎ−ア セチルーグルコサミン、およびＮ−アセチルガラクトサミン、比率約５．６／０ ．４／３．０／６．６／５．８／２．２ｅ．抗体０ｃ１２５との反応性。 （３）以下の工程： ａ．ＣＡ１２５を培地中に排出する細胞の培養液から細胞培養培地を得る工程、 ｂ．培地を酸沈殿に付して酸可溶性および酸不溶性分画を与える工程 ｃ．酸可溶性分画を回収し、中和する工程、ｄ．酸可溶性分画中のＣＡ１２５種 を分子排除クロマトグラフィーによつて、分画の低分子量成分から分離してＣＡ １２５種を回収する工程、ｅ．回収されたＣＡ１２５種をカオトロピック剤で処 理して高分子量ＣＡ１２５種を分解する工程、ｆ．カオトロピック剤の存在下、 分子排除クロマトグラフィーにより、低分子量ｃＡ１２５種を分離する工程、 ｇ．ＣＡ１２５種を含有する溶出分画を回収する工程、 ｈ．ＯＡ１２５に結合する抗体を樹脂にカツプりングしてなるイムノアドソーベ ントを、イムノアドソーべントによるＯＡ１２５の選択的吸着が可能な条件下に ＣＡ１２５種と接触させる工程、およびｉ．イムノアドソーベントからＣＡ１２ ５を回収する工程 からなる抗原ＣＡ１２５の単離方法。 （４）ＣＡ１２５抗原を排出する細胞は卵巣癌細胞である請求の範囲第５項に記 載の方法。 （５）酸沈殿は過クロル酸によつて実施する請求の範囲第４項に記載の方法。 （６）工程ｄ．の分子サイズ排除クロマトグラフィーはＳｅｐｈａτｏｓｅ４Ｂ −ＣＬ樹脂上て実施する請求の範囲第５項に記載の方法。 （７）カオトロピック剤は尿素またはグアニジン塩酸塩てある請求の範囲第６項 に記載の方法。 （８）工程ｆ．の分子サイズ排除クロマトグラフィーはＳｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ 樹脂上で実施する請求の範囲第７項に記載の方法。 （９）カオトロピック剤は、分子サイズ排除クロマトグラフィー後に、透析によ つてＣＡ１２５種から分離する請求の範囲第８項に記載の方法。 （１０）以下の工程 ａ．卵巣癌細胞の培養液の細胞を含まない上清を得る工程、 ｂ．上清を酸性にしてタンパク質を沈殿させる工程、 ｃ．上清の酸可溶性分画から沈殿したタンパク質を分離する工程、 ｄ．可溶性分画を中和する工程 ｅ．高分子量（１０００ｋＤａ）ＯＡ１２５を、低分子量ＣＡ１２５種および可 溶性分画中の他の成分から、分子サイズ排除クロマトグラフィーによつて分離す る工程、 ｆ．高分子量ＣＡ１２５種の尿素で処理して高分子量種を分解する工程、 ｇ．２００ｋＤ■の範囲の分子を保持する樹脂上、尿素の存在下の分子排除クロ マトグラフィーによりｃＡ１２５種を分離する工程、および ｈ．ＣＡ１２５種を免疫精製する工程、からなるＣＡ１２５の単離方法。 （１２）卵巣癌細胞はＯＶＣＡ４３３、ＮＩＨ■ＯＶＣＡＲ−３、ＳＫ−ＯＶ− ３、ＣＡＯＶ−３およびＣＡＯＶ−４からなる群より選ばれる請求の範囲第１１ 項に記載の方法。 （１３）細胞はＯＶＣＡ４３３てある請求の範囲第１１項に記載の方法。 （１４）上清は過クロル酸で酸化する請求の範囲第１１項に記載の方法。 （１５）工程ｅの分子サイズ排除クロマトグラフィーはｓｅｐｈａτｏｓｅ４Ｂ −ＣＬ樹脂上で行う請求の範囲第１１項に記載の方法。 （１６）尿素は約６モル濃度とする請求の範囲第１１項に記載の方法。 （１７）工程ｇの分子サイズ排除クロマトグラフィーはｓｅｐｈａｒｏｓｅＢ樹 脂上で行う請求の範囲第１１項に記載の方法。 （１８）以下の工程： ａ．ＣＡ１２５を培養培地中に排出する卵巣癌細胞の培養液の細胞を含まない上 清を得る工程、ｂ．上清を過クロル酸で酸性にしてタンパク質を沈殿させる工程 、 ｃ．沈殿したタンパク質を除去し、酸可溶性分画を中和する工程、 ｄ．中和した酸可溶性分画をＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂ樹脂上分子サイズ排 除クロマトグラフイーに付し、このカラムからＣＡ１２５活性含有分画（間隙容 量）を回収する工程、 ｅ．ＣＡ１２５活性を含有する分画を約６Ｍの尿素で処理する工程、 ｆ．尿素処理分画を、尿素６ＭおよびＳＤＳ約１％に調節した緩衝液中Ｓｅｐｈ ａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂ上分子サイズ排除クロマトグラフィーに付し、ＣＡ１２５ 活性を含む溶出分画を回収する工程、 ｇ．回収した分画から尿素を除去する工程、ｈ．ての分画を、プロテインＡ−Ｓ ｅｐｈａｒｏｓｅにジメチルピメリミデートを介してＯＣ１２５をカツプリング させたイムノアフイニテイーカラムに適用する工程、 １．イムノアフイニテイーカラムからＣＡ１２５をジエチルアミンで溶出する工 程、 からなる分子量約２００ｋＤａのＣＡ１２５種の単離方法。 （９）ＣＡ１２５抗原の単離免疫反応性種からなるＣＡ１２５と反応性の抗体の 特異的吸着のためのイムノアドソーベント。 （２０）生理的に許容されるビヒクル中に単離ＣＡ１２５抗原を含有するＣＡ１ ２５抗原に対して動物を免疫感作するための免疫原組成物。 （２０）単離ＣＡ１２５抗原は分子量約２００ｋＤａのＣＡ１２５の免疫反応性 種である請求の範囲第２０項に記載の免疫原組成物。 （２２）ＣＡ１２５に対する抗体の製造のための、請求の範囲第２０項に記載の 免疫原の使用。