JPH01500432A - Compositions and methods for immunizing against viral agents of AIDS and ARC - Google Patents

Compositions and methods for immunizing against viral agents of AIDS and ARC

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JPH01500432A
JPH01500432A JP62504599A JP50459987A JPH01500432A JP H01500432 A JPH01500432 A JP H01500432A JP 62504599 A JP62504599 A JP 62504599A JP 50459987 A JP50459987 A JP 50459987A JP H01500432 A JPH01500432 A JP H01500432A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 AIDSおよびARCのウィルス原因物質に対して免疫化するための組成物およ び方法 本発明は次のNIH認可:A I −22307−01、A I −23619 −01およびA l−23472−01のうち1つ以上のもとて政府の援助を得 て行われた。政府はこの発明に対して一定の権利を有する。[Detailed description of the invention] Compositions and compositions for immunizing against viral agents of AIDS and ARC How to This invention is subject to the following NIH approvals: AI-22307-01, AI-23619 -01 and A1-23472-01 with government assistance. It was done. The government has certain rights to this invention.

これは「合成ペプチド、ならびにAIDSおよびARCの診断・予防接種へのそ の使用」と題する1985年10月24日付の米国特許出願第790830号、 および「ポリアミド樹脂、ならびに免疫診断用試薬の調製方法」と題する198 6年4月30日付の米国特許出願第858216号の一部継続出願である。This is “synthetic peptides and their use in diagnosis and vaccination of AIDS and ARC.” U.S. Patent Application No. 790,830, dated October 24, 1985, entitled and 198 entitled “Polyamide resin and method for preparing immunodiagnostic reagents.” This is a continuation-in-part of U.S. Patent Application No. 858,216, filed April 30, 2006.

九哩へ11 本発明は後天性免疫不全症候群(AIDS)およびAIDS関連症(A RC) に対する予防接種用組成物ならびに予防接種方法に関する。特に、本発明はAI DSおよびARCのウィルス原因物質に対する免疫接種方法、ならびにAIDS およびARCの診断検定において使用することができるポリアミド樹脂−合成ペ プチド複合体に関する。Nine miles to 11 The present invention relates to acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and AIDS-related diseases (ARC). The present invention relates to a vaccination composition and a vaccination method for. In particular, the present invention Immunization methods against viral causative agents of DS and ARC, and AIDS and polyamide resin-synthetic polymers that can be used in ARC diagnostic assays. Concerning the putido complex.

AIDSは同性愛の男性の間に起こる日和見5染の報告をもたらした重症の免疫 不全症として初めに発見された〔ゴツトリーブ(Gottlieb、M 、S  、)ら、305N 、Engl、J 、Med、1425−1431(1981 );マシュ−(Masur、H、)ら、305N 、Engl、J 、Med、 1431−1438(1981)を参照されたい〕。“後天性免疫不全症候群( AIDS>”と呼ばれるこの新しいヒト疾病の発生率は急速に増加し特表昭64 −500432 (2) つつある、性的伝達が主な伝幡方法であると考えられるが、多くの場合にこの疾 病は輸血によって伝幡されることが報告された〔ゴツトリーブらの上記文献を参 照〕。この疾病の原因物質はヒト向T細胞性つィルス■型(HTLV−1)、リ ンパ節症関連ウィルス(LAV)(バレーシノッシ−(B arre −S 1 noussi 。AIDS is a severe immune system that has led to reports of opportunistic infections occurring among homosexual men. It was first discovered as a deficiency disorder [Gottlieb, M, S. ) et al., 305N, Engl, J., Med, 1425-1431 (1981 ); Masur, H., et al., 305N, Engl., J., Med. 1431-1438 (1981)]. “Acquired immunodeficiency syndrome ( The incidence of this new human disease, called AIDS, was rapidly increasing and -500432 (2) sexual transmission is thought to be the main method of transmission; It has been reported that the disease is transmitted through blood transfusions [see the above-mentioned article by Gottlieb et al. Light]. The causative agent of this disease is human T cell tropic virus type II (HTLV-1). Lymph node disease-associated virus (LAV) (Barre-S1 noussi.

F、)ら、2205cience 868−871 (1983)) 、または AIDS関連レトロウィルス(ARV)といろいろに呼ばれるヒトレ1〜ロウイ ルスであることが判明した。F.) et al., 2205 science 868-871 (1983)), or Hitore 1-lowi, variously referred to as AIDS-related retroviruses (ARV) It turned out to be Luz.

血清疫学的研究により、大部分のAIDSまたはARC患者の血清からHTLV −I[特異的抗体が同定された。AIDS患者および血友病者から得られた血清 中の抗体により認識される主な抗原は外被糖タンパク質に関係がある。さらに、 ヒト向T細胞性ウィルス、HTLV−1およびHTLV−I[の最も免疫原性の あるタンパク質は細胞表面で発現される糖タンパク質である〔チェノ(Chen 、 I 、S 、)ら、305 N ature(ロンドン)502(1983 )を参照されたい〕。Seroepidemiological studies have shown that HTLV was detected in the serum of most patients with AIDS or ARC. -I [Specific antibody identified. Serum obtained from AIDS patients and hemophiliacs The main antigen recognized by the antibodies in the protein is related to the coat glycoprotein. moreover, The most immunogenic of the human T cell-tropic viruses, HTLV-1 and HTLV-I Some proteins are glycoproteins expressed on the cell surface [Chen , I, S, ) et al., 305 Nature (London) 502 (1983 )].

HTLV−1[1の外被(env)遺伝子産物はポリタンパク質前駆物質として 合成され、その後感染細胞内でグリコジル化される。The envelope (env) gene product of HTLV-1 [1 is used as a polyprotein precursor. It is synthesized and then glycosylated within infected cells.

推定分子量160kdのそのグリコジル化ポリタンパク質(gp160)はアミ ン末端サブユニットgp12Qとカルボキシルトランスメンブランサブユニット gp41にプロセッシングされる。gp41サブユニットは精製ウィルス調製物 に含まれる主なポリペプチドの1つである。Its glycosylated polyprotein (gp160) with an estimated molecular weight of 160 kd is an amino acid. gp12Q and carboxyl transmembrane subunit Processed by gp41. gp41 subunit purified virus preparation It is one of the main polypeptides contained in

AIDSおよびARC患者からの抗体はウィルス中和活性を示す、しかしながら 、感染は中和抗体の発生以前にそれらの患者において起こると思われ、r!!5 染に先立つ中和抗体の誘導が防御免疫をもたらすかどうか未知であるレトロウィ ルスについての一般的見解は、中和抗体の誘導に関与する高原決定基またはエピ トープが糖タンパク質外被と関連するということである〔ホールデン(Hold en、H、T 、)およびタニャマ(T 、Taniyama)、150J 、 Exp、Med、1367(1979);フライヤー(F 1yer、 D 、 C、>ら、305 N ature(ロンドン>815(1983)を参照され たい〕。本発明まで、その関連はAIDSFI連ウィルスに対して確立されてい なかった。以下で説明するように、今やgp41、gp120およびgpis。Antibodies from AIDS and ARC patients exhibit virus-neutralizing activity, however , infection appears to occur in those patients before the development of neutralizing antibodies, r! ! 5 It is unknown whether induction of neutralizing antibodies prior to infection confers protective immunity. The general view is that the plateau determinants or epitopes involved in the induction of neutralizing antibodies are The tope is associated with the glycoprotein envelope [Holden et al. en, H, T,) and Taniyama (T, Taniyama), 150J, Exp, Med, 1367 (1979); Flyer (F 1yer, D, See C. et al., 305 Nature (London > 815 (1983)). sea bream〕. Until the present invention, no association has been established for the AIDSFI family of viruses. There wasn't. As explained below, now gp41, gp120 and gpis.

外被糖タンパク質はウィルスにさらされた個体において最も免疫原性のあるエピ トープであることが証明された。The coat glycoprotein is the most immunogenic epitope in individuals exposed to the virus. It proved to be taupe.

本発明は、防御ウィルス中和抗体の誘導に関与する決定的エピトープが2種類の ウィルス外被糖タンパク質サブユニット、gp120およびgp41と関連する という仮説を前提としている。また、本発明は固相樹脂(この樹脂上で免疫原性 サブユニットのポリペプチド部分が合成される)に結合されたとき、AIDSお よびARCの完全な原因物質に対して免疫応答を誘発するような、それらの免疫 原性サブユニットのポリペプチド部分の使用に基づいている。これらのポリペプ チドサブユニットは都合よく固相樹脂上で合成される。固相ペプチド合成はタン パク質およびペプチド(本明細書ではこれらと集合的に“ブロチド”と呼ぶ)の 構造ならびに作用機構を明らかにするための価値ある手法である。大部分のこの ような合成法は、ブロチドがその合成中に(通常はリンカ−分子を介して)固定 される固相として、架橋ポリスチレン系樹脂と使用している。その合成は、保護 アミノ酸を固相に付加し、そのアミノ酸の保護基を選択的に除去しく脱保護し) 、そして別の適当に保護したアミノ酸を付加することから成る反復サイクルによ って達成される〔参考としてメリーフィールド(Merrifield、R,B  、)、“固相ペプチド合成′°、32 Adv、 Enzymo1ogy22 1(1969)を参照されたい〕。The present invention shows that there are two types of critical epitopes involved in the induction of protective virus-neutralizing antibodies. Associated with viral coat glycoprotein subunits, gp120 and gp41 It is based on the hypothesis that In addition, the present invention provides a solid-phase resin (on this resin, immunogenic When the polypeptide portion of the subunit is synthesized), AIDS and and their immunization to elicit an immune response against the full causative agent of ARC. It is based on the use of the polypeptide portion of the subunit. These polypeps Tide subunits are conveniently synthesized on solid phase resins. Solid phase peptide synthesis proteins and peptides (collectively referred to herein as “brotides”). This is a valuable method for elucidating the structure and mechanism of action. Most of this Such synthetic methods require that the brotide is immobilized (usually via a linker molecule) during its synthesis. A cross-linked polystyrene resin is used as the solid phase. Its synthesis protects Amino acids are added to a solid phase, and the protecting groups of the amino acids are selectively removed (deprotected). , and by an iterative cycle consisting of adding another suitably protected amino acid. [Merrifield, R.B. ), “Solid-phase peptide synthesis’°, 32 Adv, Enzymo1ogy22 1 (1969)].

架橋ポリスチレン系樹脂は固相ブロチド合成における支持体として最も一般的に 使用されるが、反応剤を可溶化するのに必要な極性有機媒体に対して、それらの 比較的疎水性の性質はブロチド鎖合成において問題となる。この種の媒体は次第 に増成されつつあるブロチドを自由に溶媒和させつるが、ポリスチレンマトリッ クスを十分に膨潤させない、ポリマー格子内での試薬類の拡散減少および立体障 害がカップリングサイクル中の効率低下の原因となり、反復基準で最終収量とか なり低下させる。Cross-linked polystyrene resins are the most commonly used supports in solid-phase brotide synthesis. used, but their resistance to the polar organic media necessary to solubilize the reactants The relatively hydrophobic nature poses problems in brotide chain synthesis. This kind of medium depends on The brotides that are being grown in the polystyrene matrices are free to solvate. Reduced diffusion and steric hindrance of reagents within the polymer lattice, resulting in insufficient swelling of the polymer This can cause loss of efficiency during the coupling cycle and reduce the final yield on an iterative basis. decrease.

合成の初期段階において、樹脂対ブロチドの質量比が高く且つ支持体の物理的性 質が優位である場合は、この効率低下が特に急激である。In the early stages of synthesis, the resin to brotide mass ratio is high and the physical properties of the support are This drop in efficiency is particularly sharp when quality is dominant.

これらの欠点は、性質が高度に極性であり且つペプチド合成に必要な溶媒が自由 に浸透する架橋ポリジメチルアクリルアミド系支持体の開発へ導いた。アサ−ト ン(A therton 、 E 、 )、クライブ(D 、L 、J 、C1 ive)およびシェパード(R、C、S heppard)、“ポリペプチド合 成用のポリアミド支持体”、97 J 、 A 5ier、 Chem 。These disadvantages are that they are highly polar in nature and that the solvents required for peptide synthesis are free. This led to the development of a cross-linked polydimethylacrylamide-based support that penetrates into water. assert Atherton, E, Clive (D, L, J, C1) ive) and Sheppard (R, C, S heppard), “Polypeptide Synthesis. 97 J, A5ier, Chem.

S oc 、6584(1975) ニア−シャディー (A rshady  、 R,、)、アサ−トン(E 、 A therton) 、ゲイト(M、J 、Ga1t)、リー(K、Lee)およびシェパード(R、C、S heppa rd)、°′固相ヘフチド/オリゴヌクレオチド合成用の容易に製造される極性 支持体”、1979J、C,S。S oc, 6584 (1975) A rshady , R, ), Atherton (E, Atherton), Gate (M, J , Galt), Lee (K, Lee) and Sheppard (R, C, S heppa) rd), °′ Easily prepared polar heftide/oligonucleotide synthesis for solid phase heftide/oligonucleotide synthesis "Support", 1979J, C,S.

Chem、Co+am、425(1979)を参照されたい。このポリアミド樹 脂(例えばアミノメチル誘導体)は適当なリンカ−分子(C末端残基を支持体に 連結させる)の選択によって、別の保護戦略を組み入れた合成計画に適応させる ことができる。しかしながら、この樹脂上で合成されたペプチドは合成の完了後 に樹脂から分離して精製しなければならず、両方とも時間のかかる工程であって ブロチドの最終収量を減少させる。See Chem, Co+am, 425 (1979). This polyamide tree Fats (e.g. aminomethyl derivatives) can be used with a suitable linker molecule (with the C-terminal residue as a support). Adapt to a synthetic strategy that incorporates alternative protection strategies by choosing be able to. However, peptides synthesized on this resin are It must be separated from the resin and purified, both of which are time-consuming processes. Reduces the final yield of brotides.

本発明組成物および方法の意義ある利点は、プロチドが合成のために使用した樹 脂から分離・精製することなく、実験動物に免疫応答を誘発するために使用し得 るという点にある。このように合成された樹脂−ブロチド複合体は多くの検定用 途において使用できる。ある種のポリアミド樹脂−ペプチド複合体特に免疫原と してBp160外被糖タンパク質のgp120およびgp41サブユニット部分 を含む複合体は本発明においてとりわけ興味深い物質である。A significant advantage of the compositions and methods of the present invention is that the protide is It can be used to induce an immune response in laboratory animals without being separated or purified from fat. The point is that Resin-brotide complexes synthesized in this way are used for many assays. It can be used on the way. certain polyamide resin-peptide complexes, especially with immunogens. The gp120 and gp41 subunit portions of the Bp160 coat glycoprotein are of particular interest in the present invention.

ウィルスコード化タンパク質に含まれる配列に類似した合成ペプチドは、このよ うなタンパク質に関係した天然の抗原決定基を同定するのに有用であることが以 前に証明されている。いくつかの研究所は種々のB型肝炎抗原(HBsAg)合 成ペプチドの抗原活性についの研究を報告した。ドリースマン(Drees…& n。Synthetic peptides with sequences similar to those contained in virus-encoded proteins are The following findings are useful for identifying natural antigenic determinants associated with such proteins. has been proven before. Several laboratories have tested various hepatitis B antigen (HBsAg) compounds. reported a study on the antigenic activity of the synthetic peptide. Dreesman (Drees…& n.

G、R,)ら、295Nature158(1982) ;ラーナー(Lern er、R、A、)ら、78Proc、Natl、Acad、Sci、U 5A3 403(1981)ニブリンス(Prince、A、M 、)ら、79 Pro c、Natl、Acad、Sci、U SA 579(1982)を参照された い。この種のペプチドを使用することによるHBsAgに対する抗体応答の誘導 は比較的弱いことが分かつたが、免疫接種前にキャリアータンパク質へペプチド を結合すせることにより増強することができた。ラーナーらの上記文献;サンナ x (S anchez 、 Y 、)ら、18 I ntervirolog y 209 (1982)を参照されたい。さらに、タバコモザイクウィルス〔 アンプラー(Anderer、F 、A 、)およびジュランバーガー(Sch lumberger、H。G, R, et al., 295 Nature 158 (1982); Lern er, R, A,) et al., 78Proc, Natl, Acad, Sci, U 5A3 403 (1981) Prince, A. M. et al., 79 Pro. c, Natl, Acad, Sci, U SA 579 (1982). stomach. Induction of antibody responses against HBsAg by using peptides of this type Although the peptide was found to be relatively weak, it It was possible to strengthen this by combining the two. The above literature by Lerner et al.; Sanna x (S anchez, Y,) et al., 18 I intervirolog y 209 (1982). In addition, tobacco mosaic virus [ Anderer (Anderer, F, A,) and Juranberger (Sch lumberger, H.

D、)、97B iochiw+、B 1ophys、Aeta 503−50 9(1965);アンプラーおよびジュランバーガー、115B 1ochis +、 B 1ophys、Acta222−224(1966)ニア イアニー (F earney、 F 、 J 、)、ルング(Leung、C。D,), 97B iochiw+, B1ophys, Aeta 503-50 9 (1965); Ampler and Juranberger, 115B 1ochis +, B 1ophys, Acta222-224 (1966) Near Iani (F Earnney, F, J,), Leung, C.

Y、)、ヤング(J 、D 、Young)およびベンジャミン(E、Benj amini)、243B iochim、B 1ophys、Acta509− 514(1971)を参照〕、口蹄疫ウィルス〔ビトル(Bittle、J、L 、)ら、298 Nature30−33(1982) ;パフ(Pfaff、 E、)ら、IEMBOJ、869−874(1982)を参照〕、およびポリオ ウィルス〔エミニ(Emini、E 、A 、>、ジャムソン(B 、A 、  J ameson)およびライマー(E 、Wi+*mer)、304Natu re 699−703(1983)を参照〕のカプシドタンパク質部分のアミノ 酸配列に相当する合成ペプチドは、完全なウィルス粒子に関連した中和エピトー プを決定するために使用された。Y, ), Young (J, D, Young) and Benj, E. amini), 243B iochim, B1ophys, Acta509- 514 (1971)], foot-and-mouth disease virus [Bittle, J.L. ) et al., 298 Nature 30-33 (1982); Pfaff, E., et al., IEMBOJ, 869-874 (1982)], and polio Virus [Emini, E, A, >, Jamson (B, A, J Ameson) and Reimer (E, Wi++mer), 304 Natu RE 699-703 (1983)] Synthetic peptides corresponding to the acid sequences can be used to detect neutralizing epitopes associated with intact virus particles. was used to determine the

これらの免疫原の一次配列分析に基づく免疫原作AIDSおよびARCタンパク 質の抗原決定基の推察は正確でないので、手探り法による推定上のエピトープの 同定は骨の折れる作業である0合成ペプチドと共にAIDSおよびARCのウィ ルス原因物質に固有の抗原配列の記述を包含し、且つ合成ペプチドの精製および そのペプチドのキャリアータンパク質への結合を必要としない組成物および方法 は非常に有利であるだろう。Immunogenic AIDS and ARC proteins based on primary sequence analysis of these immunogens Since inference of quality antigenic determinants is not accurate, it is difficult to identify putative epitopes by searching. The identification of AIDS and ARC viruses along with synthetic peptides is a painstaking task. including the description of antigenic sequences specific to virus-causing agents, and the purification and purification of synthetic peptides. Compositions and methods that do not require conjugation of the peptide to a carrier protein would be very advantageous.

光朋mヶ 従って、本発明の目的は、AIDSおよびARCのウィルス原因物質に対して免 疫応答を誘発しうるポリアミド樹脂と合成ペプチドから成る組成物を提供するこ とであり、その合成ペプチドはHTLV−[1、ARVまタハLAV)gp12 0まり?j:gp41外被糖タンパク質のアミノ酸配列の一部に相同な配列を有 し且つその配列中に親木領域を含むアミノ酸鎖から成るものである。Mitsuho Mga Therefore, the object of the present invention is to provide immunity against the viral causative agents of AIDS and ARC. To provide a composition comprising a polyamide resin and a synthetic peptide that can induce an epidemic response. The synthetic peptide is HTLV-[1, ARV or LAV) gp12 0 mari? j: has a sequence homologous to part of the amino acid sequence of gp41 coat glycoprotein It consists of an amino acid chain that contains a parent tree region in its sequence.

この目的を達成するために、まず初めにこのような応答を誘発しうる多数の合成 ペプチド候補物質を同定することが必要であった。それ故に、HTLV−III の最も免疫原性のあるタンパク質(すなわち8p120およびgp41)のアミ ノ酸配列を決定し、そしてこれらのタンパク質および完全なウィルス粒子に対す る抗体の結合部位が最も存在しそうなこれらのタンパク質のアミノ酸配列部分の 構造コンホメーションを同定し、その後その結合部位を含むアミノ酸配列部分と 同じであるか又は十分に相同である配列および構造をもつ免疫原性合成ペプチド を合成することも本発明の目的である。To achieve this goal, we first developed a number of synthetic compounds that could induce such a response. It was necessary to identify peptide candidates. Therefore, HTLV-III The amino acids of the most immunogenic proteins (i.e. 8p120 and gp41) determined the amino acid sequences and determined the amino acid sequences for these proteins and the complete virus particle. The amino acid sequences of these proteins where binding sites for antibodies are most likely to exist are determined. Identify the structural conformation and then identify the portion of the amino acid sequence that contains the binding site. Immunogenic synthetic peptides with identical or sufficiently homologous sequences and structures It is also an object of the present invention to synthesize

本発明の別の目的はポリアミド樹脂およびその製法を提供することであり、これ らの合成ペプチドは固相合成法によりその樹脂上で合成されて、実験動物に注射 したとき、AIDSおよびARCのウィルス原因物質に対して免疫応答をtea する複合体く実験動物に注射する前に樹脂から合成ペプチドを分離する必要がな い〉を生ずる。Another object of the present invention is to provide a polyamide resin and a method for producing the same. Their synthetic peptides were synthesized on the resin by solid-phase synthesis and injected into experimental animals. When this happens, the immune response to the viral causative agent of AIDS and ARC is teat. It is not necessary to separate the synthetic peptide from the resin before injecting it into experimental animals. 〉

本発明の他の目的は、ポリアミド樹脂−ペプチド複合体念特異的結合対のリガン ドに結合させ(ここで、その結合対はリガンドとそのリガンドに対して特異的親 和性を有する抗リガンドから成り、そしてその合成へブチドはHTLV−I[1 、ARVまたはLAVのgp120または8p41外被糖タンパク質の一部に相 同な配列を有するアミノ酸鎖から成る);その複合体を動物からの血清と接触さ せ、それによりその血清中に存在するAIDSまたはARCのウィルス原因物質 に対するすべての抗体をその複合体に結合させ;その後結合抗体を特異的結合対 の抗リガンドと接触させる;ことから成るAIDSまたはARCにかかつている 疑いのある個体においてAIDSまたはARCのウィルス原因物質に対する抗体 を検出する検定法を提供することである。Another object of the present invention is to use a polyamide resin-peptide complex as a ligand for specific binding pairs. (where the binding pair is a ligand and a parent specific for the ligand). HTLV-I [1 , a portion of the gp120 or 8p41 coat glycoprotein of ARV or LAV. consisting of amino acid chains with the same sequence); the complex is brought into contact with serum from an animal. and thereby eliminate the viral causative agent of AIDS or ARC present in the serum. bind all antibodies to the complex; then bind the bound antibodies to the specific binding partner. contact with an anti-ligand; Antibodies against the viral causative agent of AIDS or ARC in suspected individuals The object of the present invention is to provide an assay method for detecting.

本発明の他の目的は、ポリアミド樹脂上でHTLV−III、ARVまたはLA Vのgp120またはgp41外被糖タンパク質の一部に相同な配列を有し且つ その配列中に親木領域を含むアミノ酸鎖から成るペプチドを合成し、そして免疫 原として有効な量のポリアミド樹脂−ペプチド複合体を実験動物に投与すること から成る、AIDSまたはARCのウィルス原因物質に対して実験動物を免疫化 する方法を提供することである。Another object of the invention is to prepare HTLV-III, ARV or LA on polyamide resin. It has a sequence homologous to a part of gp120 or gp41 coat glycoprotein of V, and A peptide consisting of an amino acid chain containing the parent tree region in its sequence is synthesized, and Administering an effective amount of the polyamide resin-peptide complex to experimental animals. immunization of laboratory animals against the viral causative agent of AIDS or ARC, consisting of The goal is to provide a method to do so.

l匡α11欠反肌 第1図は二次構造についてのチュー・ファスマン(Chou−F asIIla n)の推定案を利用するコンピュータプログラムにより生じたHTLV−Ill 、LAVおよびARVのgp120およびgp41env糖タンパク質の1p1 60糖タンパク質前駆体のアミノ酸配列に対する各アミノ酸残基の親水性平均値 のプロットの描写である。α11-deficient skin Figure 1 shows Chou-F asIIla's research on secondary structure. HTLV-Ill generated by a computer program that utilizes the estimation plan of n) , gp120 and gp41env glycoproteins 1p1 of LAV and ARV Average hydrophilicity value of each amino acid residue for the amino acid sequence of 60 glycoprotein precursors This is a depiction of the plot.

第2図は第1図のプロットのアミノ酸配列セグメントの実際のコンピュータプロ ットである。Figure 2 shows an actual computer program of the amino acid sequence segment of the plot in Figure 1. It is a cut.

第3図ハHT L V −[[、LAVおよびA RV (7) gp160前 駆体の二次構造との差を示す第1図のプロットのアミノ酸配列の二次構造を示す 模式図である。Figure 3 HT L V - [[, LAV and A RV (7) Before gp160 The secondary structure of the amino acid sequence is shown in the plot of Figure 1 showing the difference from the secondary structure of the precursor. It is a schematic diagram.

第4図は酵素結合免疫吸着検定法によってペプチド6のウサギ抗体による結合を 示すgp120ペプチド503−532 (表Hのペプチド6)で免疫化したウ サギからの抗血清の逆希釈に対する光学密度のグラフである。第4A図はペプチ ド6の結合を示し、第4B図は対照ペプチド(実施例15参照)の結合を示す。Figure 4 shows the binding of peptide 6 by rabbit antibody using enzyme-linked immunosorbent assay. Horses immunized with the indicated gp120 peptide 503-532 (peptide 6 in Table H). FIG. 2 is a graph of optical density versus back dilution of antiserum from Heron. Figure 4A is pepti Figure 4B shows binding of control peptide (see Example 15).

ウサギ1に由来する抗ペプチド抗血清からのデータは(・)で示し、そしてウサ ギ2に由来する抗ペプチド抗血清からのデータは(○)で示す、各ウサギに由来 する前免疫血清からのデータはそれぞれ(ム)および(△)で示す。Data from anti-peptide antiserum derived from rabbit 1 are shown in (·) and from rabbit 1. Data from anti-peptide antiserum derived from G. 2 are indicated by (○) and derived from each rabbit. Data from pre-immune sera are shown as (mu) and (△), respectively.

第5図は逆転写酵素(RT)活性(コH−TTPの取り込み;実施例16g照) を検定することにより測定したA3.OIM3胞株におけるHTLV−I[1ウ イルスの増殖を示す。第5A図は10伺希釈、第5B図は10−2希釈、第5C 図は10−3希釈、そして第5D図は10−4希釈でのウィルス複製を示す。Figure 5 shows reverse transcriptase (RT) activity (co-H-TTP uptake; see Example 16g) A3. measured by testing. HTLV-I [1 u. Indicates virus proliferation. Figure 5A is a 10 dilution, Figure 5B is a 10-2 dilution, and Figure 5C is a 10-2 dilution. The figure shows virus replication at a 10-3 dilution and Figure 5D shows virus replication at a 10-4 dilution.

九胛へ1且r九肌 上述したように、本発明はAIDSおよびARCのウィルス原因物質の最も免疫 原性のあるエピトープが外被糖タンパク質のgptzoおよびgp41サブユニ ットであるという仮説に一部基づいている。以下で説明するように、この仮説の 正当性は今や説明された0次に、gp120およびgp41サブユニットのアミ ノ酸配列を決定し、そして抗体結合部位が最も存在しそうなこれらの外被糖タン パク質サブユニットの部分を選択することが必要であった。この選択はgp12 0およびgp41サブユニットの構造のコンピュータモデリングを用いて達成さ れた。1 to 9 skins As mentioned above, the present invention is directed to the most immunogenic of the viral causative agents of AIDS and ARC. The gptzo and gp41 subunits of the coat glycoprotein are It is based in part on the hypothesis that As explained below, this hypothesis The validity is now explained by the amino acids of the gp120 and gp41 subunits. determine the amino acid sequences and identify those coated glycoproteins where antibody binding sites are most likely to exist. It was necessary to select parts of protein subunits. This selection is gp12 achieved using computer modeling of the structure of the 0 and gp41 subunits. It was.

ひとたび最も存在しそうな抗体結合部位が同定されると、ポリアミド樹脂上でア ミノ酸鎖を合成して、それぞれの部位のアミノ酸配列を複製した。ポリスチレン 系樹脂へ合成ペプチドをカップリングする一般的方法はベンジルエステル誘導体 を介して行われ、樹脂からのペプチドの分離は通常酸または塩基開裂により達成 される。ベンジルエステルはいくつがのこのような開裂方法を受けやすいが、固 相合成法に特有な多数の脱保護、中和およびカップリング反応の間中安定である 。ヒドラジンもまたブロチドを樹脂から分離するために使用され〔ゲスラー(K essler、W、)およびイセリン(B 、 I 5elin)、49 He 1v、Chim。Once the most likely antibody binding site has been identified, the binding sites on the polyamide resin are A amino acid chain was synthesized and the amino acid sequence at each site was duplicated. polystyrene A common method for coupling synthetic peptides to system resins is benzyl ester derivatives. Separation of the peptide from the resin is usually achieved by acid or base cleavage. be done. Although benzyl esters are susceptible to several such cleavage methods, Stable through the numerous deprotection, neutralization, and coupling reactions characteristic of phase synthesis methods . Hydrazine was also used to separate the brotide from the resin [Gessler (K Essler, W.) and Iselin (B, I5elin), 49 He 1v, Chim.

A cta1330(1966)を参照〕、また各種のアンモニア分解〔マニン グ(Manning、M 、>、90 J 、 A m、c hem、 S o c、1348(1968)を参照〕および他の方法も同様に使用された。しがし ながら、これらの方法はペプチドの分解を回避するために、続いて合成副生物( アミノ酸、短いペプチド、樹脂の分解産物、そして往々にして保護基が不完全に 除去されたペプチドを含む)からペプチドを精製するために適当な工程を行う必 要がある。精製は直接結晶化により達成されることもあるが、夾雑ペプチドが目 的産物とほぼ同じ大きさおよび組成である合成においては、より選択的な手法を 採用しなければならない。分離・精製法のいかんにがかわらず、これらの必要条 件はその合成に時間のかかる工程を付加し、しばしば合成ペプチドの総収量を低 下させる。本発明のポリアミド樹脂および方法はこのような分離・精製を全く必 要とせず、それにより合成にかかる時間を短縮させ、しかもペプチドの収量を高 める。A [see cta 1330 (1966)], and various ammonia decomposition [manin Manning, M, >, 90 J, A m, c hem, S o 1348 (1968)] and other methods were used as well. Shigashi However, these methods avoid degradation of the peptide and subsequently produce synthetic by-products ( amino acids, short peptides, resin degradation products, and often incompletely protected groups. Appropriate steps must be taken to purify the peptides (including the removed peptides). There is a point. Purification is sometimes achieved by direct crystallization, but contaminating peptides are For syntheses of similar size and composition to the desired product, a more selective approach is recommended. must be adopted. Regardless of the separation and purification method, these requirements must be met. peptides add time-consuming steps to their synthesis and often reduce the total yield of synthetic peptides. Let it go down. The polyamide resin and method of the present invention do not require such separation and purification at all. This reduces the synthesis time and increases the yield of peptides. Melt.

本発明のポリアミド樹脂−ペプチド複合体のポリアミド樹脂は、ジアミノアルカ ン(好ましくは分子の両端にアルケノイル基をもつジアミノアルカン、例えばN 、N′−ビスーアルゲノイルージアミノアルカン)を用いて水溶液中で市販のジ メチルアクリルアミド羊量体を架橋することにより製造される。目下の好適な実 施態様では、架橋剤はハルバーン(Halpern)およびスバロー(Spar row)の方法に従って製造されたN、N’−ビスアクリロイル−1,3−ジア ミノプロパンまたはN、N’−ビスアクリロイル−1,3−ジアミノブタンのい ずれかである(J。The polyamide resin of the polyamide resin-peptide complex of the present invention is a diaminoalkaline N , N'-bis-argenoyl-diaminoalkane) in an aqueous solution. Produced by crosslinking methylacrylamide amniotes. current suitable fruit In embodiments, the crosslinking agent is Halpern and Spar N,N'-bisacryloyl-1,3-dia produced according to the method of Minopropane or N,N'-bisacryloyl-1,3-diaminobutane Either way (J.

A、ハルパーンおよびJ、T、スパロー、′改良されたN、N’ −ビスアクリ ロイルジアミノアルカン合成法“’、10SyntheticComm、569 (1980) ;その全容は参照によりここに引用される〕。A, Halpern and J, T, Sparrow, 'Improved N,N'-bisacrylic Loyldiaminoalkane synthesis method “’, 10SyntheticComm, 569 (1980); the entire text of which is hereby incorporated by reference].

プロパン類a、体の使用は、それがエチル類似体の使用により得られたポリマー よりも大きい細孔寸法および改良された膨潤性な示すポリマーをもたらすので好 適である。しかしながら、本発明の利益を受ける当業者は、前記文献に掲載され た他のジアミノアルカン類、N、N′−ビスアクリロイル−1,2−ジアミノエ タンおよびN、N′−ビスアクリロイル−1,6−ジアミツヘキサンも本発明樹 脂の製造に使用できることを理解するであろう。The use of propanes a, the polymer it is obtained by the use of ethyl analogues is preferred because it results in polymers with larger pore sizes and improved swellability. suitable. However, a person skilled in the art who has the benefit of the present invention will appreciate the information published in said document. and other diaminoalkanes, N,N'-bisacryloyl-1,2-diaminoethyl Tan and N,N'-bisacryloyl-1,6-diamithexane are also included in the present invention. It will be appreciated that it can be used in the production of fat.

架橋樹脂には官能性単量体が含まれる。゛′官能性単量体パなる用語は合成ペプ チドのC末端アミノ酸を樹脂に固定するために使用されるアルケニルアミン類を 意味する。メチルスルホニルエチルオキシカルボニル(M S C>基で保護さ れた場合〔テツサー (T esser 、 G 、 I 、 )およびバルバ ートーギールス(1,C,Ba1vert−G eers)、“メチルスルホニ ルエチルオキシカルボニル基、多方面で使用しうる新しいアミノ保護基”)、7 1 nt、J 、PepticleP rotein Res、295(197 5)を参照〕、その官能性単量体はMSCアルケニルアミンと呼ばれる。これら の官能性単量体は市販の塩化物誘導体とアルケニルアミンとの反応により製造さ れ、そしてMSC保護基はその後塩基により除去される。しかしながら、M3C 基は必要でない。ポリアミド樹脂は過剰のアリルアミンと単に添加し、その後濾 過または他の方法によって得られた微細粒子を分離することにより製造すること ができる。添加する官能性単量体の量は樹脂1g当たり約0.1ミリモル〜約0 .5ミリモル、好ましくは約0.2ミリモル〜約0.4ミリモルの範囲の樹脂置 換をもたらすように選ばれる。開始剤は過硫酸塩やリボフラビンのような当業者 に知られたいずれの開始剤であってもよく、好ましくは過vfL酸アンモニウム である。The crosslinked resin includes a functional monomer. The term "functional monomer" refers to synthetic peptides. alkenylamines used to fix the C-terminal amino acid of Tido to the resin. means. Methylsulfonylethyloxycarbonyl (MSC> group protected) [Tesser, G, I,) and Barba] -Togiers (1, C, Ba1vert-G eers), “Methylsulfony ethyloxycarbonyl group, a new amino protecting group that can be used in many ways”), 7 1 nt, J, Pepticle P rotein Res, 295 (197 5)], the functional monomers are called MSC alkenylamines. these The functional monomer is prepared by the reaction of a commercially available chloride derivative with an alkenylamine. and the MSC protecting group is then removed with base. However, M3C No base is required. Polyamide resin is simply added with excess allylamine and then filtered. manufactured by separating fine particles obtained by filtration or other methods Can be done. The amount of functional monomer added ranges from about 0.1 mmol to about 0 per gram of resin. .. 5 mmol, preferably in the range of about 0.2 mmol to about 0.4 mmol. chosen to bring about change. Initiators can be selected from those skilled in the art such as persulfate or riboflavin. may be any initiator known in the art, preferably ammonium pervfL It is.

上記の物質は水溶液中で混和されるので、それらは集合的に“水相”と呼ばれる 。本発明のポリアミド樹脂−合成ペプチド複合体のポリアミド樹脂製造における 次の工程は水相と有機相を合わせることである。“有機相”なる用語は、水相と 合わせて攪拌したときに懸濁体(その懸濁体から樹脂が得られる)を生じる有機 溶媒を意味する。目下の好適な実施態様において、その有機相はヘキサンと四塩 化炭素の混合物から成る。Since the above substances are mixed in an aqueous solution, they are collectively referred to as the “aqueous phase”. . In the polyamide resin production of the polyamide resin-synthetic peptide complex of the present invention The next step is to combine the aqueous and organic phases. The term “organic phase” refers to the aqueous phase. organic substances that, when stirred together, form a suspension (from which a resin is obtained) means solvent. In the presently preferred embodiment, the organic phase is hexane and a tetrasalt. It consists of a mixture of carbonized carbon.

均一な大きさのビーズ登形成させるために攪拌中に乳化剤が添加される。乳化剤 は当業者に知られたいずれの界面活性剤であってもよく、目下の好適な実施態様 ではソルビタンセスキオレエート、ソルビタンモノラウレート、またはソルビタ ンモツプカッエートのいずれかでありうる。界面活性剤の添加量はほぼ均一な大 きさの球形樹脂を得るように調節される。界面活性剤の量が減少すると、より大 きい無定形物質を多量に含むエマルジョンが生じ、これは次第に増成されつつあ る内部のアミノ酸鎖の減少をもたらすであろう、界面活性剤の量が増加すると、 微細物質の量が多くなり、この微細物質は有意量の樹脂の損失なしに取り出すこ とが困難である。これらの微細粒子はペプチド合成機の反応容器、ならびに付随 の管路やバルブを詰まらせることにもなる。An emulsifier is added during stirring to form beads of uniform size. emulsifier may be any surfactant known to those skilled in the art, and in the presently preferred embodiment Sorbitan sesquioleate, sorbitan monolaurate, or sorbitan It can be any of the following: The amount of surfactant added is approximately uniform. Adjustments are made to obtain fine spherical resin. As the amount of surfactant decreases, the An emulsion containing a large amount of amorphous material is formed, which is gradually increasing in size. Increasing the amount of surfactant will result in a reduction of the internal amino acid chains The amount of fine material is large and this fine material cannot be removed without loss of significant amounts of resin. It is difficult to These fine particles are present in the reaction vessel of the peptide synthesizer, as well as in the accompanying It can also clog pipes and valves.

その後、懸濁体中の単量体の重合と促進して本発明のポリアミド樹脂ビーズの形 成をうながすために、促進剤が添加される。Thereafter, the monomers in suspension are polymerized and promoted to form the polyamide resin beads of the present invention. Accelerators are added to promote growth.

多くの促進剤が当業者の知るところであるが、ポリアミド樹脂の製造では、N、 N、N’ 、N′−テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)を用いた場合 に特別の成功をおさめた。得られたビーズはその後濾過して洗浄し、(もしも存 在するならば)M3C基を塩基で除去し、そしてビーズを乾燥させる。ビーズは 比較的均一な大きさを確保するためにメツシュ篩を通してえり分けることができ る。本発明方法を使用する全収率は出発単量体から約87〜94%の範囲であっ た。Although many accelerators are known to those skilled in the art, in the production of polyamide resins N, When using N, N', N'-tetramethylethylenediamine (TEMED) achieved particular success. The resulting beads are then filtered and washed (if any). The M3C group (if present) is removed with base and the beads are dried. The beads are Can be screened through a mesh sieve to ensure relatively uniform size. Ru. The overall yield using the method of the invention ranges from about 87-94% from the starting monomer. Ta.

得られたアミノメチル、架橋ポリジメチルアクリルアミド樹脂は、合成ペプチド と結合したとき、水溶液中でペプチドの最大露出を与え、そして樹脂−ポリマー 主鎖はペプチドを立体配置的に制限しない、ペプチドの露出は、高度に水和され たときその乾燥床体積の数倍にまで膨潤するポリアミド樹脂の能力の結果である 。The resulting aminomethyl, cross-linked polydimethylacrylamide resin is a synthetic peptide gives maximum exposure of the peptide in aqueous solution and resin-polymer The backbone does not sterically restrict the peptide; exposure of the peptide is highly hydrated. This is a result of the polyamide resin's ability to swell to several times its dry bed volume when .

合成ペプチドは活性化剤によって樹脂に結合されたリンカ−へカップリングすこ とによりビーズ上で合成される。“リンカ−”なる用語は合成ペプチドの第1の アミノ酸のカルボキシル基を樹脂へ結合させる結合基を意味する。目下の好適な 実施態様において、このリンカ−はオキシアルキル安、セ、香酸(OBA)であ り、これにアミノ酸残基がカップリングしてペプチド鎖の第1のアミノ酸となる 。OBAリンカ−がC末端アミノ酸をポリアミド樹脂へ結合させるために使用さ れるので、樹脂からの合成ペプチドの有意な損失なしにペプチドから側鎖保護基 を除くために、無ホフッ化水素を使用することができる。以下の実施例において 、選ばれたアミノ酸はt−ブチルオキシカルボニル(t−BOC)保護基で保護 されたグリシンであるが、当業者はそのアミノ酸がいずれのアミノ酸であっても よく、とりわけ合成しようとするペプチドの第1アミノ酸であり得、また他の保 護基が同様に使用できることを理解するであろう、グリシン残基はペプチドと樹 脂−ポリマー主頌との間のもう1つのスペーサー基として役立つ。The synthetic peptide is coupled to a linker attached to the resin by an activator. Synthesized on beads by The term "linker" refers to the first linker of a synthetic peptide. A bonding group that bonds the carboxyl group of an amino acid to a resin. current preferred In embodiments, the linker is an oxyalkyl ammonium, acetate, aromatic acid (OBA). An amino acid residue is coupled to this to become the first amino acid of the peptide chain. . An OBA linker is used to attach the C-terminal amino acid to the polyamide resin. side chain protecting groups from the peptide without significant loss of synthetic peptide from the resin. Fluoride-free hydrogen fluoride can be used to remove. In the following examples , the selected amino acids were protected with t-butyloxycarbonyl (t-BOC) protecting group. However, those skilled in the art will understand whether the amino acid is any amino acid. It can often be the first amino acid of the peptide to be synthesized, and may also be the first amino acid of the peptide to be synthesized. It will be appreciated that protecting groups can be used as well, glycine residues are It serves as another spacer group between the lipid-polymer main body.

目下の好適なリンカ−であるBOC−グリシル−4−(オキシメチル)安息香酸 はミッチェルらの方法の変法を用いて製造された〔ミッチェル(Mitchel l、A、R,)、ゲント(S、B、H。BOC-glycyl-4-(oxymethyl)benzoic acid, a presently preferred linker was prepared using a modification of the method of Mitchell et al. l, A, R,), Ghent (S, B, H.

Kent)、エンゲルハード(M 、E nBe1hard)およびメリーフィ ールド(R,B、Merrifield)、“固相ペプチド合成の改良された支 持体、t−ブチルオキシカルボニルアミノアシル−4−(オキシメチル)フェニ ルアセトアミドメチル−樹脂への新しい合成経路”、43 J 、Org、Cb c論、2845(1978);その全容は参照によりここに引用される〕。ミッ チェルらの方法の重要な変更は、溶媒としてジメチルホルムアミドを使用するの をやめたことである。Kent), Engelhard (M, EnBe1hard) and Maryfi Merrifield, R.B., “Improved Support for Solid-Phase Peptide Synthesis.” carrier, t-butyloxycarbonylaminoacyl-4-(oxymethyl)phenylene "A new synthetic route to ruacetamidomethyl-resin", 43 J, Org, Cb C, 2845 (1978); the entirety of which is hereby incorporated by reference]. Mi An important modification of the method of Chell et al. is the use of dimethylformamide as a solvent. I stopped doing that.

この溶媒は蒸発させるのが困難であり、その結果たとえ蒸発が温度を上げること により早められたとしても、この方法はまだ時間がかかる。上記のように製造さ れたポリアミド樹脂にリンカ−を結合させるべく使用される活性化剤はジイソプ ロピルカルボジイミドおよび4−ジメチルアミノピリジンであるが、当業者はジ シクロへキシルカルボジイミドや4−メチルピロリジノピリジンのような他の活 性化剤もこの目的のために同様に使用できることを理解するであろう。This solvent is difficult to evaporate and as a result even if evaporation raises the temperature Even if speeded up, this method still takes time. Manufactured as above The activator used to attach the linker to the prepared polyamide resin is diisopropylene. lopylcarbodiimide and 4-dimethylaminopyridine, but those skilled in the art Other active agents such as cyclohexylcarbodiimide and 4-methylpyrrolidinopyridine It will be appreciated that sexing agents can be used for this purpose as well.

ポリアミド樹脂上でペプチドを合成した後、本発明のポリアミド樹脂−ブロチド 複合体は多くの目的のために、例えば実験動物においてA、 I D Sまたは ARCのウィルス原因物質に対する免疫原応答を誘発させるために、HTLV− IIi、ARVまたはL A、 Vに対する抗体の存在についてin vitr o検定するために、あるいはAIDSまたはARCのウィルス原因物質上の抗原 決定基をマツピングするために使用される。例えばin vitro検定はビー ズ状ポリアミド樹脂−合成ペプチド複合体をモーターおよび乳棒ですりつぶし、 そのすりつぶした複合体を中性pH緩衡液を用いてマイクロタイターテストプレ ー1・のような固相上に吸着させることにより行われる。A、 I D Sまた はARCのウィルス原因物質に対する抗体を含む疑いのある血清または他の体液 をその後吸着複合体とインキュベーションし、未結合抗体を洗浄して除き、そし て結合抗体を酵素結合免疫吸着検定、ビオチン−アビジン増幅検定または当分野 で知られるような他の検定法により検出する。After synthesizing the peptide on the polyamide resin, the polyamide resin-brotide of the present invention The complex can be used for many purposes, e.g. in experimental animals as A, IDS or To elicit an immunogenic response against the viral causative agent of ARC, HTLV- IIi, in vitro for the presence of antibodies against ARV or LA, V o to assay or antigens on the viral causative agent of AIDS or ARC. Used for mapping determinants. For example, in vitro assays Grind the polyamide resin-synthetic peptide complex with a motor and pestle, The ground complex was prepared in a microtiter test plate using a neutral pH buffer. This is done by adsorption onto a solid phase such as -1. A, I D S again serum or other body fluids suspected of containing antibodies to the viral causative agent of ARC. is then incubated with the adsorbed complex, washed to remove unbound antibody, and The bound antibodies can be analyzed using enzyme-linked immunosorbent assays, biotin-avidin amplification assays, or those skilled in the art. detection by other assays such as those known in the art.

ポリアミド樹脂−合成ペプチド複合体はまた、ペプチドの合成中にときどきポリ アミド樹脂の一部を取り出し、そのペプチドを脱保護し、そして段階的方法でそ れぞれの取り出した部分を試験してそのペプチドがAIDSおよびARCのウィ ルス原因物質に特異的な抗体と結合する合成中のその時点を決定することにより 、AIDSまたはARCのウィルス原因物質上の抗原決定基をマツピングするた めに使用される。この方法は他の合成方法において必要とされる分離・精製工程 を排除したことにより可能になった。複合体はまた、すりつぶしてマイクロタイ ターテストプレートのような担体に吸着させることによりその抗体結合能力につ いて試験され、上記のように検定される。Polyamide resin-synthetic peptide conjugates are also sometimes used during peptide synthesis. Take a portion of the amide resin, deprotect the peptide, and process it in a stepwise manner. Each removed portion was tested to determine if the peptide was a virus for AIDS and ARC. By determining that point during synthesis that binds to antibodies specific to the virus-causing agent. , to map antigenic determinants on the viral causative agent of AIDS or ARC. used for This method requires separation and purification steps that are required in other synthetic methods. This was made possible by eliminating the . The complex can also be ground and microtied. The antibody binding ability can be determined by adsorbing it onto a carrier such as a test plate. and certified as described above.

樹脂からのペプチドの分離およびペプチドの精製はこのような検定法にとって必 要でない。Separation of the peptide from the resin and purification of the peptide are essential for such assays. Not necessary.

ポリアミド樹脂−ブロチド複合体はまたA、 I D SまたはARCのウィル ス原因物質に対する免疫原として有用である。この複合体はアジュバントを用い て又は用いないで実験動物を免疫化するために直接使用される。“実験動物”な る用語は、本明細書で使用する場合、免疫応答の可能なすべての動物を意味する 。The polyamide resin-brotide composite can also be used as a compound for A, IDS or ARC. useful as an immunogen against cancer-causing agents. This complex is prepared using an adjuvant. used directly to immunize laboratory animals with or without. “Experimental animal” As used herein, the term refers to any animal capable of an immune response. .

第一に興味のある実験動物は哺乳類であるが、免疫原応答は本発明方法を用いて 鳥類のような他の実験動物にも誘発しうる。Although the experimental animals of primary interest are mammals, immunogenic responses can be determined using the method of the present invention. It can also be induced in other laboratory animals such as birds.

例えば、AIDSおよびARCのウィルス原因物質に対して特異的な免疫応答は 、放射線免疫沈降法により測定したとき、HTLV−IIIウィルスの外被タン パク質に対応するアミノ酸配列を有する合成ペプチドとポリアミド樹脂とから成 る複合体を使用して、ウサギを免疫化することにより誘発された。For example, the specific immune response to the viral agents of AIDS and ARC is , the envelope protein of HTLV-III virus as measured by radioimmunoprecipitation. Made of synthetic peptide with an amino acid sequence corresponding to protein and polyamide resin. was induced by immunizing rabbits using the conjugate.

その後、AIDSウィルスと結合するウサギ抗体を誘導するこれらの合成ペプチ ドはヒト抗HTLV−1抗体と結合するそれらの能力について試験され、またウ サギ抗HTLV−I[1抗体はそれらが組織培養物中の怒染ウィルスを中和でき るか否かを調べるために試験された。ひとたびこれらの判定基準を満たす最も免 疫原性のある合成ペプチドが同定されると、それらはワクチンとして、またはA IDSおよびARC患者ならびにAIDSおよびARCのウィルス原因物質にさ らされた個体を識別するための診断検定において使用される。These synthetic peptides then induce rabbit antibodies that bind to the AIDS virus. The antibodies were tested for their ability to bind human anti-HTLV-1 antibodies and Heron anti-HTLV-I [1 antibodies showed that they were able to neutralize the virus in tissue culture. It was tested to find out whether Once the most exempt Once epidemiogenic synthetic peptides have been identified, they can be used as vaccines or IDS and ARC patients and viral agents of AIDS and ARC. used in diagnostic assays to identify affected individuals.

811120およびgp41サブユニットのアミノ酸配列は、HT L V−■ のヌクレオチド配列に基づく推論、ならびに3〔H〕ロイシン、3JS)シスチ ンおよび3〔H〕バリンで標識したタンパク質のエドマン分解によるNH2末端 配列の分析によるこれらの配列の証明により決定された。The amino acid sequences of 811120 and gp41 subunit are HTLV-■ Inferences based on the nucleotide sequence of 3[H]leucine, 3JS)cysti NH2-terminus by Edman degradation of 3[H]valine- and 3[H]valine-labeled proteins These sequences were determined by verification of sequence analysis.

gp120およびgp41外被糖タンパク質(ならびにそれらの前駆体gp16 0)の免疫原性の証明は、AIDSおよびARC患者由来の血清試料をスクリー ニングして、)19/HTLV−III細胞株を使用する間接細胞膜免疫蛍光法 (MIF>および35[:Slシスチン標識H9/HTLV−I[1細胞を使用 する放射線免疫沈降法/ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気 泳動(RI P/5DS−PAGE)によりHTLV−1に対する抗体を含む血 清を同定することによって得られな。代表的な抗体陽性血清はまたヒラマメレク チンのカラムを通して濃縮したH9/HTLV−III細胞の糖タンパク質調製 物に対して試験した。gp120 and gp41 coat glycoproteins (and their precursor gp16 The immunogenicity of 0) was demonstrated by screening serum samples from AIDS and ARC patients. ) Indirect cell membrane immunofluorescence using the 19/HTLV-III cell line (MIF> and 35[: Sl cystine-labeled H9/HTLV-I[1 cells were used. Radiation immunoprecipitation method/sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrolysis Blood containing antibodies against HTLV-1 by electrophoresis (RI P/5DS-PAGE) It cannot be obtained by identifying the supernatant. A typical antibody-positive serum is also Hiramamelek. Glycoprotein preparation of H9/HTLV-III cells concentrated through a column of Chin Tested on objects.

これらの結果により、抗体陽性血清はgp120とgp160を認識する抗体を 含む比率が最も高く、他のエピトープに対する抗体を含む試料はすべてgp12 0と、pl、60を認識する抗体を含むことが判明した。These results show that antibody-positive serum contains antibodies that recognize gp120 and gp160. All samples containing antibodies against other epitopes had the highest proportion of gp12 It was found that it contains antibodies that recognize 0, pl, and 60.

gp120. gp41およびgp160外被糖タンパク質上の最も免疫原作の ある部位の選択は、ホップ(1−(opp、T、P 、>およびウッド(K。gp120. The most immunogenic proteins on the gp41 and gp160 coat glycoproteins Certain site selections include hops (1-(opp, T, P, >) and wood (K.

R、W oods )、78Proc、Nat′l ^ead、sci、U 5 A3824−3828(1981)に記載される親水性指数に基づくコンピュー タプログラムを変更して、HTLV−II、LAVおよびARVからのHTLV −II[外被gp160糖タンパク質と関連した親水領域の位置を推定すること により達成したにれらの糖タンパク質のアミノ酸配列はまたチュー・ファスマン の推定案〔チュー(Chou、P。R, W oods), 78Proc, Nat'l ^ead, sci, U 5 A3824-3828 (1981) HTLV from HTLV-II, LAV and ARV -II [Estimating the location of hydrophilic regions associated with the coat gp160 glycoprotein The amino acid sequence of these glycoproteins was also achieved by Chu Fassman. Estimated proposal [Chou, P.

Y、)およびファスマン(E、D、Fasman)、f3B iochemis try2Z2(1974)を参照〕を使用して二次構造について分析した。ピー ク親木領域は推定した二次構造と比較し、そして糖タンパク質の表面に最も露出 されそうな親木領域を同定した。これらの領域はさらに、ウィルス外被タンパク 質を使用する以前の研究が、推定されたβターン二次構造をもつ表面に露出しな 親水領域はウィルス上の免疫原作のある表面領域な表すと報告したので、βター ンの存在についても調べた〔ドリースマン(Dreesman。Y,) and Fasman (E, D, Fasman), f3B iochemis try2Z2 (1974)] was used to analyze the secondary structure. P The parent tree region is compared with the predicted secondary structure and most exposed on the surface of the glycoprotein. The parent tree area that is likely to be damaged was identified. These regions also contain viral coat proteins. Previous studies using the Since we reported that the hydrophilic region represents the surface region of the virus where the immunogen is located, We also researched the existence of the Dreesman (Dreesman).

G、R,)ら、295N ature(ロンドン)158−160(1982)  (B型肝炎表面抗原):ホップおよびウッドの上記文献(B型肝炎表面抗原) ;ヘンダーソン(Henderson 、 L 、 E 、 )ら、258J  、B iol、chem、8400−8406(1981)(ラウチャーネズミ 白血病ウィルス);ジンジャース(G ingeras、T 、R、)ら、25 7 J 、 B iol 、Che@、13475−13491(1,983) (アデノウィルススパイクタンパク質):ワトソン(Watson。G, R, et al., 295Nature (London) 158-160 (1982) (Hepatitis B surface antigen): Hopf and Wood's above-mentioned literature (hepatitis B surface antigen) ; Henderson, L., E., et al., 258J. , Biol, chem, 8400-8406 (1981) (Raucher rat leukemia virus); Gingeras, T., R., et al., 25 7 J, B iol, Che@, 13475-13491 (1,983) (Adenovirus spike protein): Watson.

R,J、)ら、218Science 381−384(1982)(単純性庖 疹ウィルス外被タンパク質D)を参照されたい〕。R, J.) et al., 218 Science 381-384 (1982) (Simplicity (See Viral Coat Protein D)].

HT L V−[1、LAVおよびARV由来のgp160糖タンパク質のアミ ノ酸配列およびその配列中の免疫原性のありそうな領域が同定されたので、次の 工程は糖タンパク質のその領域と同じアミノ酸配列(またはそのエピトープと結 合する抗体によって同じ方法で処理されるように十分類似した配列)をもつポリ ペプチドを合成することであった。合成は上記の固相法を用いて行った。全部で 10種類の合成ペプチドを合成し、各合成ペプチドは予測される免疫原作につい ての上記の試験に基づいて選択した。これらの合成ペプチドのそれぞれのアミノ 酸配列を表Hに示す。HTLV-[1, amino acid of gp160 glycoprotein derived from LAV and ARV Now that the amino acid sequence and likely immunogenic regions within the sequence have been identified, the next step is to The process involves identifying the same amino acid sequence (or binding to its epitope) as that region of the glycoprotein. Polymers with sufficiently similar sequences to be processed in the same way by matching antibodies The goal was to synthesize peptides. The synthesis was performed using the solid phase method described above. In all Ten types of synthetic peptides were synthesized, and each synthetic peptide was The selection was made based on the above-mentioned tests. The respective amino acids of these synthetic peptides The acid sequences are shown in Table H.

その後、10種類の合成ペプチドはポリアミド樹脂−合成ペプチド複合体をウサ ギに注射することにより、ウサギに免疫応答を誘発すべく使用された。ウサギに はまた樹脂(この上でペプチドが合成される)から分離した後でキャリアーへ結 合させた合成ペプチドも注射した。ウサギ血清の抗体力価は、ウシ血清アルブミ ン(BSA)に結合させたペプチドと結合する抗体の能力により試験した。これ らの結果は、ウサギ抗ペプチドのペプチド−BSAへの結合の阻害を測定する阻 害検定な行うことにより確認した。After that, 10 types of synthetic peptides were transferred to rabbits using polyamide resin-synthetic peptide complexes. It was used to induce an immune response in rabbits by injecting it into rabbits. to the rabbit may also be conjugated to a carrier after separation from the resin (on which the peptide is synthesized). The combined synthetic peptide was also injected. Antibody titers in rabbit serum are compared with bovine serum albumin. The antibody was tested for its ability to bind to a peptide conjugated to BSA (BSA). this Their results demonstrate that inhibition of rabbit anti-peptide binding to peptide-BSA is This was confirmed by conducting a harm test.

次いで、ウサギ抗ペプチド抗体はHTLV−I[[と関連した天然タンパク質を 認識するそれらの能力について調べた 35(S )−シスチンで標識したHT LV−I[[5染T細胞株企免疫沈降法のために使用して、抗ペプチド血清が放 射性標1HTLV−III天然タンパク質と結合するか否かを調べた。5DS− PAGEによるオートラジオグラフィーは、ウサギ抗ペプチド抗体がHTLV− ■の6p160前駆体外被糖タンパク質に相当する単一のタンパク質を特異的に 沈澱させることを明らかにした。前駆体gp160産物は切断されると、主要な Ep120外被糖タンパク質とgp41トランスメンブラン糖タンパク質を生ず る。gp41外被サブユニットは前駆体gp160糖タンパク質のアミン末端基 ど同程度に:15(S)−シスチンで放射性標識されず、免疫沈降によって検出 されなかった。しかしながら、” [S )−メチオニンを標識として使用した 場合は、結合が免疫沈降により検出され、その結果はウェスターントランスファ ー法(Western transfermethod)を用いて確認した。Rabbit anti-peptide antibodies were then used to detect natural proteins associated with HTLV-I. Their ability to recognize HT labeled with 35(S)-cystine was investigated. LV-I [[5 stained T cell line was used for immunoprecipitation and anti-peptide serum was released. It was investigated whether radioactive target 1 binds to HTLV-III natural protein. 5DS- Autoradiography by PAGE showed that the rabbit anti-peptide antibody was ■Specifically detects a single protein corresponding to the 6p160 precursor coat glycoprotein. It was revealed that it precipitates. When the precursor gp160 product is cleaved, the major Generates Ep120 coat glycoprotein and gp41 transmembrane glycoprotein Ru. The gp41 coat subunit is the amine terminal group of the precursor gp160 glycoprotein. To the same extent: not radiolabeled with 15(S)-cystine and detected by immunoprecipitation It wasn't done. However, “[S])-methionine was used as a label. If binding is detected by immunoprecipitation, the results are This was confirmed using the Western transfer method.

このようにして生成した抗ペプチド抗体はその後それらがAIDSまたはARC のウィルス原因物置を中和できるか否かと調べるために試験した。この試験は多 くの方法で行うことができる。1つの方法では、ポリアミド樹脂−ペプチド複合 体をモーターと乳棒ですりつぶし、緩衝食塩水中で樹脂の懸濁体を作る。そのペ プチドエマルジョンをマイクロタイタープレートの固相に吸着させ、その後非特 異的部位を10%正常ヤギ血清で遮断する。ウサギ抗体のペプチドへの結合は、 ウサギIgGに対するビオチン−ヤギ抗体およびアビジン結合西洋ワサビペルオ キシダーゼを使用して検出する。ペルオキシダーゼ活性は基質として1.2′− アジノージ(3・−エチル−ベンズチアゾリン−スルホン酸)およびH20□を 用いて測定する。B型肝炎表面抗原配列に相当する樹脂結合ペプチドは対照とし て役立つ、ウサギ抗ペプチドの結合はプレート読取機を用いて410nmでスペ クトル光度測定により定量化する。The anti-peptide antibodies generated in this way are then used to identify whether they are AIDS or ARC. The test was conducted to see if it could neutralize the virus causing the virus. This test This can be done in many ways. In one method, a polyamide resin-peptide conjugate The bodies are ground with a motor and pestle to create a suspension of resin in buffered saline. That page The emulsion was adsorbed onto the solid phase of a microtiter plate and then non-specifically Block the heterologous site with 10% normal goat serum. Binding of rabbit antibody to peptide is Biotin-goat antibody against rabbit IgG and avidin-conjugated horseradish periodine Detect using oxidase. Peroxidase activity is activated by 1.2'- Azinodi (3-ethyl-benzthiazoline-sulfonic acid) and H20□ Measure using A resin-bound peptide corresponding to the hepatitis B surface antigen sequence served as a control. Binding of the rabbit anti-peptide was detected using a plate reader at 410 nm. quantified by vector photometry.

第2の方法では、精製ウィルスおよびウサギ抗ペプチド抗体を感染したTヘルパ ー細胞株と共にインキュベーションし、次いで溶解細胞をウェスターントランス ファーおよび免疫沈降法でウィルスの存在について調べることにより、抗ペプチ ド抗体の中和能力を試験した。第3の方法では、逆転写酵素(RT)活性の低下 を測定することにより、ポリアミド樹脂−合成ペプチド複合体に対するウサギ抗 体の中和能力を評価した。これらの結果は放射線免疫沈降により証明した。In the second method, purified virus and rabbit anti-peptide antibodies were used in infected T helper cells. – incubate with the cell line and then transfer the lysed cells to Western Trans Anti-peptides were tested for the presence of viruses by immunoprecipitation and immunoprecipitation. The neutralizing ability of these antibodies was tested. A third method involves reducing reverse transcriptase (RT) activity. By measuring the rabbit anti-polyamide resin-synthetic peptide complex, The body's neutralizing ability was evaluated. These results were verified by radioimmunoprecipitation.

その後、最も免疫原性のある合成ペプチドはAIDSおよびARCの診断検定に おいて、またはワクチンとして使用される。The most immunogenic synthetic peptides were then used in diagnostic assays for AIDS and ARC. used as a vaccine or as a vaccine.

診断検定で使用する場合、好適な方法はAIDSおよび/またはARCのウィル ス原因物質に対する抗体の検出を包含する。When used in diagnostic assays, the preferred method is detection of antibodies against the disease-causing agent.

この検定は、例えば、ポリスチレンビーズのカラムやマイクロウェルテストプレ ートのような不活性マトリックスに、AIDSまたはARCのウィルス原因物質 の1つのエピトープと関連したアミノ酸配列を含む合成ペプチドまたはキャリア ータンパク質(すなわちウシ血清アルブミン)に結合させた合成ペプチドを塗布 することにより行われる。別の方法としては、不活性マトリックスに数種のエピ トープのアミノ酸配列を含む多数の異なる合成ペプチド(°゛カクテル゛°を塗 布する。また、別の方法として、ポリアミド樹脂−合成ペプチド複合体をモータ ーと乳棒ですりつぶして、上述したように固相へ吸着させることもできる。This assay can be performed using, for example, a column of polystyrene beads or a microwell test plate. the viral agent of AIDS or ARC in an inert matrix such as a synthetic peptide or carrier containing an amino acid sequence related to one epitope of – Applying a synthetic peptide conjugated to a protein (i.e. bovine serum albumin) It is done by doing. Alternatively, an inert matrix with several epitaxial A large number of different synthetic peptides containing topic amino acid sequences (°゛cocktail゛°) to clothe Another method is to use a polyamide resin-synthetic peptide complex as a motor. It can also be ground with a pestle and adsorbed onto a solid phase as described above.

疑いのある患者から採取した生物学的液体の試料は、所定の抗体を免疫捕獲する ために、合成ペプチドを塗布したマトリックスとインキュベーションする。未捕 獲試料から分離したマトリックスはその後、もしも存在するならば、測定可能な 多数のヒト抗体を結合するのに十分な量の所定の抗体くもしも体液がヒト患者か ら採取されるならば、抗ヒト抗体が所定の抗体であるだろう)の種(spec  1es)に対して導かれたビオチン標識抗体とインキュベーションする0次いで 未捕獲ビオチン標識抗体およびマトリックスから分離した生成マトリックスは、 もしも存在するならば、測定可能な多数の抗体を結合するに足る量の標識アビジ ン(好ましくは、アルカリ性ホスファターゼのような酵素で標識したアビジン) とインキュベーションする。生成マトリックスは未捕獲アビジンから分離し、標 識はその酵素に特異的な基質を添加することにより検出し、かつ/また好ましく は定量化し、それにより試料中のAIDSウィルスに対する抗体の存在を間接的 に測定する。抗体はまた直接酵素で標識することができ、その場合はマトリック スを酵素反応性基質とインキュベーションし、その後基質の変化(例えば、色の 変化または蛍光の発生)を検出する。標識が抗体、酵素、またはビオチン−アビ ジンで標識された酵素であるかどうかにかかわりなく、抗原と抗体または酵素と 基質により形成される結合対は特異的結合対の“リガント”および“抗リガント ”と呼ばれるであろう。A sample of biological fluid taken from a suspected patient is immunocaptured with predetermined antibodies. For this purpose, incubate with a matrix coated with synthetic peptides. Uncaptured The matrix separated from the harvested sample is then measurable, if present. If the body fluids of a given antibody are present in sufficient quantities to bind large numbers of human antibodies, anti-human antibodies would be the antibodies of interest). 1es) and then incubated with a biotinylated antibody directed against The product matrix separated from the uncaptured biotinylated antibody and matrix was If present, enough labeled avidity binds a measurable number of antibodies. (preferably avidin labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase) Incubate with. The product matrix is separated from uncaptured avidin and The enzyme is preferably detected by adding a substrate specific for the enzyme and/or quantifies and thereby indirectly determines the presence of antibodies against the AIDS virus in a sample. Measure to. Antibodies can also be directly enzyme-labeled, in which case the matrix The substrate is incubated with an enzyme-reactive substrate, followed by a change in the substrate (e.g., color change). change or occurrence of fluorescence). If the label is an antibody, enzyme, or biotin-avi antigens and antibodies or enzymes, whether or not the enzymes are labeled with enzymes. The binding pair formed by the substrate is the “ligand” and “antiligand” of the specific binding pair. ” will be called.

診断検定はまた所定の抗体よりもむしろ抗原の検出のために行われる。抗原テス トを実施するためには、固相マトリックスにAIDSのウィルス原因物質に対す る抗体、すなわち、本発明ペプチドのような合成ペプチドまたはポリアミド樹脂 −合成ペプチド複合体く好ましくは数種のペプチド)で免疫化することにより作 られた抗体を塗布する。次いで、AIDSウィルスに8染した疑いのある患者か ら採取した生物学的液体の試料をマトリックスに加え、続いてビオチン標識抗体 (この抗体は上記のようにして作られたAIDSウィルスに結合する抗体である )を加える。その後アビジン標識酵素を加え、その酵素に特異的な基質を加えて 、色の変化または蛍光の発生を検出する。これらの検定はまた阻害検定としても 行われ、その場合は結合抗原にA、 I D Sウィルスに対するビオチン標識 抗体な加える代わりに、ビオチン−合成ペプチドまたはビオチン−ポリアミド樹 脂−合成ペプチド複合体を加える。Diagnostic assays are also performed for the detection of antigens rather than specific antibodies. antigen test In order to carry out this test, the solid phase matrix must be coated with anti-AIDS viral agents. antibodies, i.e. synthetic peptides such as the peptides of the present invention or polyamide resins. - produced by immunization with a synthetic peptide conjugate (preferably several peptides) Apply the applied antibody. Next, patients suspected of having been infected with the AIDS virus. A sample of biological fluid taken from a sample is added to the matrix, followed by biotinylated antibody. (This antibody is an antibody that binds to the AIDS virus produced as described above. ) is added. Then add an avidin-labeled enzyme and add a substrate specific to that enzyme. , detecting a change in color or the occurrence of fluorescence. These assays can also be used as inhibition assays. In that case, the bound antigen is labeled with biotin for A, IDS virus. Instead of adding antibodies, biotin-synthetic peptides or biotin-polyamide trees can be added. Add lipid-synthetic peptide complex.

本発明のポリアミド樹脂−合成ペプチド複合体をAIDSのウィルス原因物質に 対するワクチンとして使用するために、本発明の教示に従ってポリアミド樹脂− 合成ペプチド複合体として作られた1種または数種の合成ペプチド約100〜1 000μgをアジュバントと一緒に個体に投与した。また、合成のために使用し た樹脂からペプチドを分離した後でキャリアーに結合させた合成ペプチドも投与 した。適当なキャリアーにはトキソイド成分、注射しようとする動物に対して外 来性の数種の大型タンパク質含有′PfJ質のいずれが1つ、アジュバント活性 を示し且つキャリアーとしてふるまう数種の小型ペプチド調製物のいずれが、ま たはリポソームが含まれる。トキソイド成分は破傷風トキソイドまたはジフテリ アトキソイドでありうる。“注射しようとする動物に対して外来性の大型タンパ ク質含有物質゛なる表現は、キーホール・リンベット(Keyhole lim pet)ヘモシアニン(KLH)またはBSAのような物質を意味する。アジュ バント活性が証明され、またキャリアーとしても作用する小型ペプチド調製物に はムラミルジペプチド、ムラブチジン、およびポリアミノ酸(例えばポリ−L− グルタミン酸またはポリーL−リジン)が含まれる。約10〜100分子の合成 ペプチドが慢−マレイミドベンジル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル( MBS)〔リウ(L iu、 F 、T 、>ら、18 B 1oche@1s try 690 (1979) ;グリーン(G reen 、 N 、 )ら 、28 Ce1l 477(1982)を参照〕、グルタルアルデヒド、カルボ ジイミド、無水コハク酸またはN−スクシンイミジル−3−〔2−ピリジルジチ オシー10ビオネートのようなヘテロ三官能性架橋剤を使用して、1分子のキャ リアーへ結合される。The polyamide resin-synthetic peptide complex of the present invention is used as the virus-causing substance of AIDS According to the teachings of the present invention, polyamide resin- About 100 to 1 synthetic peptide or synthetic peptides made as a synthetic peptide complex 000 μg was administered to individuals together with adjuvant. Also used for synthesis Synthetic peptides that are conjugated to carriers after separation of the peptides from the resin are also administered. did. A suitable carrier contains the toxoid component and is compatible with the animal to be injected. Any one of several naturally occurring large protein-containing 'PfJ substances' has adjuvant activity. Any of several small peptide preparations that exhibit or liposomes. Toxoid component is tetanus toxoid or diphtheria It can be an atoxoid. “Large proteins foreign to the animal to be injected.” The expression ``keyhole limbet'' refers to (pet) hemocyanin (KLH) or substances such as BSA. Aju small peptide preparations with proven bunt activity and also act as carriers. are muramyl dipeptides, murabtidine, and polyamino acids (e.g. poly-L- glutamic acid or poly-L-lysine). Synthesis of about 10-100 molecules The peptide is chronic-maleimidobenzyl-N-hydroxysuccinimide ester ( MBS) [Liu, F, T, > et al., 18 B 1oche@1s try 690 (1979); Green (Green, N,) et al. , 28 Ce1l 477 (1982)], glutaraldehyde, carbo diimide, succinic anhydride or N-succinimidyl-3-[2-pyridyldith] Using a heterotrifunctional crosslinker such as Ocy-10 bionate, one molecule of carrier can be Connected to the rear.

適当なアジュバントにはみょうばん(水酸化アルミニウム)および当業者に知ら れた他のアジュバントが含まれる。ポリアミド樹脂−ペプチド複合体およびキャ リアー−合成ペプチド複合体は両方とも蒸留水、リン酸緩衝食塩水、クエン酸緩 衝液または中性pHH街液(すなわち約pH6〜8の緩衝液〉のような薬剤学的 に許容される希釈剤と共に投与される。Suitable adjuvants include alum (aluminum hydroxide) and those known to those skilled in the art. Contains other adjuvants. Polyamide resin-peptide complex and carrier Both rear-synthetic peptide complexes were prepared in distilled water, phosphate buffered saline, and citrate. Pharmaceutical solutions such as buffer solutions or neutral pHH solutions (i.e. buffers of about pH 6-8) Administered with an acceptable diluent.

本発明のポリアミド樹脂−合成ペプチド複合体はまたAIDSおよび/またはA  RCに対する推定上のワクチン候補物質をスクリーニングするために使用され る。このようなスクリー二ングは不活性マトリックスに上記のようなポリアミド 樹脂−合成ペプチド複合体のすりつぶしたビーズを塗布することにより最良に実 施される。その後、ワクチン候補物質はl8G−ウサギ抗ペプチドービオチン抗 体の1 :1000希釈物のようなペプチドに対する抗体くビオチンを含まなく てもよい)とインキュベーションする。ビオチン標識抗体を使用する場合は、ア ビジン−酵素複合体を加え(ビオチンを使用しない場合はビオチン標識ヤギ抗ウ サギIgGのようなビオチン標識抗種抗体を加え、その後アビジンー酵素を加え る)、その後基質を加えてその反応分検出する。The polyamide resin-synthetic peptide complex of the present invention also Used to screen putative vaccine candidates against RC Ru. Such screening involves the use of polyamides such as those described above in an inert matrix. This is best achieved by applying ground beads of resin-synthetic peptide complex. administered. After that, the vaccine candidate substance was 18G-rabbit anti-peptide-biotin anti- Antibodies against peptides, such as a 1:1000 dilution of the body, do not contain biotin. Incubate with When using biotinylated antibodies, Add biotin-enzyme complex (if biotin is not used, add biotin-labeled goat anti-wine). Add biotin-labeled anti-species antibody such as heron IgG, then add avidin-enzyme. ), then add the substrate and detect the reaction.

本発明のポリアミド樹脂−合成ペプチド複合体はまたAIDSまたはA R,C 患者からのウィルス単離物を血清型で分類するために使用される。血清型による 分類はワクチン候補物質のスクリーニングについて上述した方法と同じ方法で実 施される。The polyamide resin-synthetic peptide complex of the present invention can also be used for AIDS or A.R.C. Used to serotype virus isolates from patients. By serotype Classification is performed in the same manner as described above for screening vaccine candidates. administered.

なぜならば、両方の場合とも、抗ペプチド抗体は完全なAIDSウィルス原因物 質と結合しなければならないからである。しかしながら、ウィルス単MfMの血 清型による分類の場合には、単離物の一部が順次多数の結合抗ペプチド抗体(そ れぞれの抗体は異なるポリアミド樹脂−合成ペプチド複合体に対して特異的であ り、別々の不活性マトリックスに結合されている)に添加される。Because in both cases, the anti-peptide antibodies are completely isolated from the AIDS virus causative agent. This is because it must be combined with quality. However, virus single MfM blood In the case of type-based classification, a portion of the isolate is sequentially labeled with a large number of bound anti-peptide antibodies (such as Each antibody is specific for a different polyamide resin-synthetic peptide complex. (added to a separate inert matrix).

本発明は以下の非限定的実施例を参照することにより更によく理解されるであろ う。The invention will be better understood by reference to the following non-limiting examples. cormorant.

例1.HTLV−I[1!’43JIIの 持および 射 標う付け2種のHT LV−]11産生細胞系、H−9およびMOLT−3を、20%ウシ胎仔血清、 2mMグルタミン、非必須アミノ酸および0.1%N a HCO3を補充した R P M I−1,640(維持培地)で増殖させた。細胞を維持培地からシ スチンおよびグルコース欠乏培地に移し、1時間後に35〔S〕−シスチン(1 50μCi/*Il)および’ (H)−グルコサミン(20μC1/ml、2 4時間〉を添加することにより細胞培養物を標識付けした。細胞を低速遠心分離 (1,000xy、10分間)により組織培養上層液から分離した。Example 1. HTLV-I[1! 2 types of HT with '43JII holding and shooting markings LV-]11 producing cell lines, H-9 and MOLT-3, 20% fetal bovine serum, Supplemented with 2mM glutamine, non-essential amino acids and 0.1% N a HCO3 It was grown in R P M I-1,640 (maintenance medium). Remove cells from maintenance medium. After 1 hour, 35[S]-cystine (1 50μCi/*Il) and '(H)-glucosamine (20μCi/ml, 2 Cell cultures were labeled by adding >4 hours. Low speed centrifugation of cells (1,000xy, 10 minutes) from the tissue culture supernatant.

例2、HT L V−1の 120および 41サブユニツトの免且」は1ヶ証 朋− 1983〜1984年にエイズおよびARCの危険度が高い地域の診療所および 同地域の各病院に訪れた被験者から採取した血清試料を、エセックスら、320 、サイエンス859(1983)の記載に従い1−19 / HT L V’  −III細胞細胞層いて間接細胞膜免疫蛍光検査法(MIF)によりHTLV− I[1に対する抗体をスクリーニングした。要約するとこの方法は下記の工程を 伴う、上記例1に記載した培地から細胞を分離し、1xLO’〜2X10’個の 細胞をリン酸塩緩衝化食塩液(PBS)で2回洗浄し、これらをあらかじめ遠心 分離した血清の1:4希釈液40μkに37℃で30分間入れておく。各調製液 を次いでPBSにより2回洗浄し、カッベル社(ペンシルベニア州コツクランビ レ)のヒト免疫グロブリン(IgA+ I 6G + I gM )に対するヤ ギ抗血清のフルオレセイン結合F(ab′)2断片の1:20希釈液40/iR と反応させた。各試料を再び37℃で30分間インキュベー1〜し、PBSで2 回洗浄し、蛍光顕微鏡により検査した。少なくとも50%(または40%、指示 した場合)の細胞が特異的蛍光を示した場合、その血清試料は陽性と判定された 。各試料をコード化し、二重盲検法により読取り、陽性および陰性のヒト血清試 料を標準として含めた。このスクリーニングの結果を表1に六オ 表 ■ 下記に対し陽性の エイズ 50 48(96) 49(98)A R,C5043(86) 46 (92)健康な男性同性愛者 73 34(47) 36(49)健康な研究室 職員 2700 1 )ITLV−I[[膜抗原(HTLV−III−MA)のアッセイ。Example 2, 120 and 41 subunit exemption of HT L V-1 is one certificate. Friend In 1983-1984, clinics and clinics in high-risk areas for AIDS and ARC Serum samples collected from subjects visiting hospitals in the region were collected by Essex et al. 1-19 / HT L V' according to the description in Science 859 (1983) HTLV-III cells by indirect membrane immunofluorescence (MIF) Antibodies against I[1 were screened. In summary, this method involves the following steps: The cells were separated from the medium described in Example 1 above, with 1 x LO' to 2 x 10' cells. Wash cells twice with phosphate-buffered saline (PBS) and pre-centrifuge them. Place in 40 μk of a 1:4 dilution of the separated serum for 30 minutes at 37°C. Each preparation solution The samples were then washed twice with PBS and washed with a (e) against human immunoglobulin (IgA + I6G + IgM) 1:20 dilution of fluorescein-conjugated F(ab')2 fragment of antiserum 40/iR I reacted. Each sample was again incubated at 37°C for 30 minutes and then incubated with PBS for 2 to 30 minutes. Washed twice and examined by fluorescence microscopy. At least 50% (or 40%, as indicated) The serum sample was determined to be positive if the cells in . Each sample was coded and read in a double-blind manner for positive and negative human serum samples. included as standard. The results of this screening are shown in Table 1. Table ■ Positive for: AIDS 50 48 (96) 49 (98) A R, C5043 (86) 46 (92) Healthy male homosexual 73 34 (47) 36 (49) Healthy laboratory Staff 2700 1) Assay for ITLV-I [[Membrane Antigen (HTLV-III-MA).

エセックスら、220サイエンス859(1983)に記載のM I Fにより 実施。According to the MIF described in Essex et al., 220 Science 859 (1983) implementation.

2HT L V−lのεp120エンベロープ糖タンパク質のアッセイ。Assay of εp120 envelope glycoprotein of 2HT L V-1.

エセックスら、220サイエンス859(1983)に記載のFこIPSDS− PAGEに 同じ190人から得た試料すべてにつき、ff5(S)シスチン標識H9/HT LV−I[rおよび未恐染H9細胞と用いた放射標識免疫沈澱法(radioi mIIIunoprecipitation)およびドデシル硫酸ナトリウム− ポリアクリルアミドゲル電気泳動(RIP/5DS−PAGE)による試験も行 った。要約するとこの方法は下記による。標識された細胞をRIPAi衝液(0 ,15M −NaCIf’、0.05M)リス−HCL pH7,2,1%トラ イトン(Triton)X −100,1%デオキシコール酸、および0.1% 5DS)で破壊したのち細胞を100,0OOXyで1時間遠心分離した。細胞 溶解物上層液をタンパク質入−セファロースCL−4B(タンパクiAビーズ) に結合した標準陰性対照血清10μ!で1回澄明化したのち、各部分をヒト被験 血清10μlと反応させた。免疫反応性11Thを試料緩衝に!c(0,1Mク レラ7ト試藁、2%SDS、0.08Mト1.Jス−H(J、pH6,8,10 %グリセリン、および0.2%ブロム7 x /−ルブルー)中で100℃にお いて2分間煮沸することにより溶離した。3,5%堆積ゲルを含む12.5%溶 解用アクリルアミドゲル中で試料を分析した(レムリ、227ネイチヤー(ロン ドン)68゜(1970)の不連続緩衝系による)、表面標識付けはラクトペル オキシダーゼ触媒作用による放射性ヨウ素化法により行われた。F IPSDS- as described in Essex et al., 220 Science 859 (1983) to PAGE For all samples obtained from the same 190 individuals, ff5(S)cystine-labeled H9/HT Radiolabeled immunoprecipitation using LV-I[r and unstained H9 cells. mIIIunoprecipitation) and sodium dodecyl sulfate- We also conducted tests using polyacrylamide gel electrophoresis (RIP/5DS-PAGE). It was. In summary, the method is as follows. The labeled cells were soaked in RIPAi buffer (0 , 15M -NaCIf', 0.05M) Lis-HCL pH 7, 2, 1% Tora Triton X - 100, 1% deoxycholic acid, and 0.1% After disruption with 5DS), the cells were centrifuged at 100,0 OOXy for 1 hour. cell Add protein to the upper layer of the lysate - Sepharose CL-4B (Protein iA beads) Standard negative control serum bound to 10μ! After clarification once, each part was tested on humans. It was reacted with 10 μl of serum. Use immunoreactive 11Th as sample buffer! c (0,1M Ku Lera 7 straw, 2% SDS, 0.08M 1. Jsu-H (J, pH 6, 8, 10 % glycerin, and 0.2% bromine (7x/- Le Blue) at 100°C. Elution was performed by boiling for 2 minutes. 12.5% solution containing 3.5% deposited gel Samples were analyzed in a resolving acrylamide gel (Laemmle, 227 Nature (London)). 68° (1970) discontinuous buffer system), surface labeling was done using Lactopel. It was carried out by an oxidase-catalyzed radioiodination method.

その結果を表■に示す。The results are shown in Table ■.

代表的な抗体陽性血清については、レンズマメ(lentil)レクチンカラム を用いて濃縮したH 91 HT L V−III 細胞の糖タンパク質調製物 においても試験を行った。HTLV−Iff糖タンパク質をレンズマメレクチン ・セファロース4Bと共に4時間インキュベートし、次いで0.2Mメチルマン ノシドで溶離した。For typical antibody-positive sera, use a lentil lectin column. Glycoprotein preparation of H91HTL V-III cells concentrated using Tests were also conducted at HTLV-Iff glycoprotein as lentil lectin - Incubate with Sepharose 4B for 4 hours, then 0.2M Methylman eluted with Noside.

得られたタンパク質を次いでHTLV−III標準血清で免疫沈澱させ、タンパ ク質入−セファロースに結合した沈澱を0.1%SDSおよび0.15Mクエン 酸ナトリウム(pH5,5)の存在下で2分間煮沸することにより抗体から解オ させた0次いで等量を37℃でエンドグリコシダーゼH0,25μsの存在下ま たは不在下に3時間インキュベートした。5容量の冷95%エタノールの添加に より反応を停止し、タンパク質ご一夜−20”Cで沈澱させた0次いで試料を1 2000Xyで15分間遠心分離し、タンパク質を電気泳動試料緩衝液で再構成 し、3分間煮沸し、電気泳動した。抗体陽性のエイズ患者4人より得た試料から 約120kD、160kDおよび41kDのタンパク質が沈澱した。同様な結果 が抗体陽性のARC患者2人、および抗体陽性の健康な男性同性愛者2人につい ても得られた。抗体陰性の健康な男性同性愛者がら得た血清または健康と思われ る研究室職員から得た血清には関連する大きさのタンパク質は検出されながった 。試験したヒト血清試料はいずれもHTLV−[[ウィルス上の他のエピトープ に対する抗体を含まず、また少なくともgp120およびgp160に対する容 易に検出できる抗体も含まなかった。The resulting protein was then immunoprecipitated with HTLV-III standard serum to Quarantine - Sepharose-bound precipitate was dissolved in 0.1% SDS and 0.15M citric acid. Antibodies are deoxidized by boiling for 2 minutes in the presence of sodium hydroxide (pH 5.5). Equal amounts were incubated at 37°C in the presence of endoglycosidase H0, for 25 μs. or for 3 hours in the absence. Addition of 5 volumes of cold 95% ethanol Stop the reaction and precipitate the protein overnight at -20"C. Centrifuge at 2000Xy for 15 minutes and reconstitute proteins with electrophoresis sample buffer. The mixture was boiled for 3 minutes and subjected to electrophoresis. From samples obtained from four antibody-positive AIDS patients Proteins of approximately 120 kD, 160 kD and 41 kD were precipitated. similar results in two antibody-positive ARC patients and two antibody-positive healthy homosexual men. I got it though. Serum obtained from a healthy male homosexual who is antibody negative or who appears to be healthy. No proteins of relevant size were detected in serum obtained from laboratory personnel. . None of the human serum samples tested showed HTLV-[[other epitopes on the virus]. and contains no antibodies against at least gp120 and gp160. It also contained no easily detectable antibodies.

表 ■ 残基No、341−304−728−735−846−503−733−55−  650−465−370畢752752川湛l畢咀憔 ser thr leu asp ala val gly ala hisu glyarg arB pro argile ala pro thr se rvglyala pro ile pro arg”pro asp thr  Ieu asn×Iys”asn pro glukhis thr arc  thr ile”ser’trp asn arg Hly ile Iys  pro leu glu asnasn asn gly ile pron ala argqphe glu asn2asn thr pro FIlu  argIys gly ser ser gluthr hrB asp g lu argargile ala gln 5erIeu Iys argg lu ile arg Hlu ser asn gluglu ile gl ukgly gln val glu ala gln phe配列i1e a rg gly glu gly gln gly’ Iystglu arga spdile ile arc Ieu arg gly 市1ys pr。Table ■ Residue No., 341-304-728-735-846-503-733-55- 650-465-370 752752 Riverside ser thr leu asp ala val gly ala hisu glyarg arB pro argile ala pro thr se rvglyala pro ile pro arg"pro asp thr  Ieu asn×Iys”asn pro glukhis thr arc  thr ile”ser’trp asn arg Hly Ile Iys pro leu glu asnasn asn gly ile pron ala argqphe glu asn2asn thr pro FIlu argIys gly ser ser glutenhr hrB asp g lu argargile ala gln 5erIeu Iys argg lu ile arg Hlu ser asn glu glu ile gl ukgly gln val glu ala gln phe array i1e a rg gly glu gly gln gly’ Iystglu arga spdile ile arc Ieu arg gly city 1ys pr.

seregln’ glu asp glu glu Hlu tt$f−as n glyleu gly gILI asp arg asp thr gl n 5IIFargpro gly argala arg gtu glu  aspg!u gly gly ser vat arg’val Ieu m etgln arg glu gly ser his leu argphe  ila arg 1leOile asn glu aspgly phe  asp gly arg val leu asnasn thr asp 1 eupval ala arglys ile arg phe thr 5e rthr ser leu his giuile gly ala 1eu i1efphe cys phe l eu a gln ARV中 h ala LAV中 c glu ARV中 d val ARV中 LAV中ではalae lys ARV中 f vat ARV中 g asn ARV中 h tyr ARV中 i ARVにはなし j his ARV中 k asp ARV中 + HTLV−I[[ではaspの可能性ありm leu ARV中 n his ARV中 o ARVではileとのglyの間にvalありp met ARV中 q HTLV−[[ではHluの可能性ありr HTLV−[[、ARVおよび LAVにおいてこのペプチドの実際の配列はargとargの間にaspを含む s cys HTLV−I[[中 t arg ARV中 u tyr ARV中 v thr ARV中 w leu ARV中 xL^■では次の3残基がなし;ARVではasnの代わりにthry asn  ARV中 z asp ARV中 aa Hly l−^■中 bb vat ARV中 例3.12041および 160エンベロープ タンパク 上の免交鳳11へ肚 仮 3種のウィルス分離体HTLV−I[[、LAVおよびARVから得たgp16 0前駆糖タンパク質のアミノ酸配列の推定を、ティー・ビー・ホップおよびゲー ・アール・ウッヅ(20モレ・イムノロ(Mol 、 I m5unol 、) 483−489(1983))が達成したパラメーターおよび親水値を用いたコ ンピュータープログラムにより行った。コンピュータープログラムはアップルベ ーシック(RASIC)で書込まれた。プログラムは、チョウーファスマンの予 測法(ピー・ワイ・チョウおよびイー・ディー・ファスマン、13バイオケミス トリー222(1974) )と調和する形式でディスク中にアミノ酸配列を記 録しうるように作成された。親水性プログラムはへキサペプチドの長さ全体にわ たる親水基平均値を計算し、これにより推定の精度を高める。AsxまたはGl x、すなわち酸性アミノ酸残基のアミド型には親水値が無いめで、これらのコー ドは計算を行う前に削除しなければならない、3種のエイズウィルス糖タンパク 質に関して残基当たりの親水基平均をアミノ酸配列数に対してプロットしたもの を第1図に示す、第1図は実際には特性が明らかにされたエイズ/ARCのウィ ルス性原因物質3種について得た親水性プロットのコンピューターグラフィック 出力の描き出したチャートである。最高ピーク(fiも親水性)は3種の配列す べてについて同様な領域に示され、最高親水指数は)(TLV−■、LAVおよ びARVにつきそれぞれ残基739,744および738において生じた。第2 の最高親水領域はビーク1のアミノ末端側にあたるアミノ酸残基653−659 付近に中心をもつ。第3の最高親水領域はビーク1に近接し、3種の環タンパク 質それぞれにつきアミノ酸残基733−739付近に中心をもつ。seregln’ glu asp glu glu Hlu tt$f-as n glyleu gly gILI asp arg asp thr gl n5IIFargpro gly argala arg gtu glu aspg! u gly gly ser vat arg’val Ieu m etgln arg glu gly ser his leu argphe ila arg 1leOile asn glu aspgly phe asp gly arg val leu asnasn thr asp 1 eupval ala arglys ile arg phe thr 5e rthr ser leu his giuile gly ala 1eu i1efphe cys phe l eu a gln ARV中 h ala LAV c glu ARV medium d val in ARV alae lys in LAV f vat ARV g asn in ARV h tyr ARV in progress i None for ARV j His ARV in progress k asp ARV medium + HTLV-I [[There is a possibility of asp m leu ARV in n his ARV o In ARV, there is val between gly and ile pmet in ARV q HTLV-[[, there is a possibility of Hlu r HTLV-[[, ARV and The actual sequence of this peptide in LAV includes asp between arg and arg. s cys HTLV-I t arg ARV in progress u tyr in ARV v thr ARV in progress w leu ARV in progress xL^■ does not have the following three residues; ARV has three asn instead of asn During ARV z asp ARV medium aa Hly l-^■ Medium bb vat ARV Example 3. 12041 and 160 envelope proteins tentative gp16 from three virus isolates HTLV-I[[, LAV and ARV The deduced amino acid sequence of the 0 precursor glycoprotein was ・R Woods (Mol, Im5unol,) 483-489 (1983)) using parameters and hydrophilicity values. This was done using a computer program. The computer program is Apple -Written in RASIC. The program is based on Chow-Fasman's plan. Measurement method (P. Wai Chou and E. D. Fassman, 13 Biochemistry Amino acid sequences are recorded on the disk in a format consistent with It was created so that it could be recorded. The hydrophilicity program extends throughout the length of the hexapeptide. Calculate the average value of the hydrophilic groups, thereby increasing the accuracy of the estimation. Asx or Gl x, that is, the amide form of acidic amino acid residues, has no hydrophilic value, so these codes The three AIDS virus glycoproteins must be removed before doing the calculation. Regarding the quality, the average hydrophilic group per residue is plotted against the number of amino acid sequences. Figure 1 shows the AIDS/ARC virus whose characteristics have been clarified. Computer graphics of hydrophilicity plots obtained for three types of russe-causing substances This is a chart depicting the output. The highest peak (fi is also hydrophilic) has three types of sequences. The highest hydrophilic index is shown in a similar area for all and ARV at residues 739, 744 and 738, respectively. Second The highest hydrophilic region is amino acid residues 653-659 on the amino terminal side of beak 1. Centered nearby. The third highest hydrophilic region is close to beak 1 and contains three ring proteins. Each protein is centered around amino acid residues 733-739.

HTLV−1[[配列の一セグメントの実際のコンピュータープログラム出力を 第2図に示す。HTLV−1[[配列全体は長いため、−セグメントのみを示し た。プロリン残基はグラフに“P”として示される。この配列内の連続した2個 または3個の芳香族アミノ酸は“0”として表わされる。ある配列内に芳香族ア ミノ酸が存在することは、高度の水素結合の潜在性をもつ領域があることを示す 。水素結合はタンパク質の全体的確認に影響を与える可能性がある。これらのデ ータはこれらの領域が環タンパク質の表面に露出している可能性を示す。HTLV-1[[Actual computer program output of one segment of the sequence Shown in Figure 2. HTLV-1[[Because the entire sequence is long, only the - segment is shown. Ta. Proline residues are shown as "P" on the graph. Two consecutive items in this array or three aromatic amino acids are represented as "0". aromatic atom in an array The presence of amino acids indicates that there are regions with a high degree of hydrogen bonding potential. . Hydrogen bonding can affect the overall identity of the protein. These de The data indicate that these regions may be exposed on the surface of the ring protein.

HTLV−11[環タンパク質の推定二次構造(チョウーファスマンの推定構造 により決定)を第3図に示す、この推定二次構造において)ITLV−111、 LAVおよびA−R,V間の主な相違は四角で囲った領域に示される。これらの 領域はHTLV−I[1、LAVおよびARV<、mつきそれぞれ残基127− 150,127−155、および126−148が含まれる。ここでは残基の相 同性はわずか約40%であり、このためβ回転のポテンシャルが変化する。さら に有意の相違がARVの領域319−330および398−408.LA、Vの 323−333および401−415、ならびにHTLV−I[1の313!− 328および396−411に認められた。親水性を二次構造と対比すると、ピ ーク1はこの領域内に4個の潜在的β回転部を含むことが示され、アミノ酸73 9−744付近に中心をもつ領域が潜在的な抗原決定因子としての第1候補とな る。親水ビーク2も推定β回転部と含み、この領域がエンベロープの環タンパク 質の表面に露出していることを示唆する。HTLV-11 [Predicted secondary structure of ring protein (Chow-Fasman's predicted structure In this putative secondary structure (determined by ) shown in Figure 3) ITLV-111, The main differences between LAV and A-R,V are shown in the boxed area. these The regions are HTLV-I[1, LAV and ARV<, residues 127-1 with m, respectively. 150, 127-155, and 126-148. Here, the phase of the residue is Only about 40% are homogeneous, which changes the β-rotation potential. Sara There were significant differences in ARV regions 319-330 and 398-408. LA, V's 323-333 and 401-415, and 313 of HTLV-I[1! − 328 and 396-411. Contrasting hydrophilicity with secondary structure Mark 1 was shown to contain four potential β-turns within this region, starting at amino acid 73. The region centered around 9-744 is the first candidate as a potential antigenic determinant. Ru. Hydrophilic peak 2 also contains a putative β-rotation region, and this region is the ring protein of the envelope. Suggests that the quality is exposed on the surface.

例4,554デ1漏引zuL底。Example 4,554 de 1 leakage zuL bottom.

表■に“ペプチド4”ヘディングとして示したアミノ酸配列をもつ合成へブチド (これはエイズおよびARCのウィルス性原因物質のgp120糖タンパク質の 残基番号735−752に相当する)をバイオサーチ・サムn (B 1ose arch Samll )ペプチド合成装置で固相法により合成した(アール・ ビー・メリフィールド、327ドバ、エンザイモロ、(Adv、Enzymol 、>221(1969))。ジシクロへキシルカルボジイミドを触媒量の4−N 、N−ジメチルアミノピリジンと共に用いてポリスチレンに結合させたブチルオ キシカルボニル−8−4−メチルベンジル−し−シスチンを合成の固相支持体と して用いた。4個のアミノ基はt−ブチルオキシカルボニル(t−BOC)によ り保護され、側鎖保護基は下記のものであった。セリンの水酸基についてはベン ジルエーテル、チロシンのフェノール性水酸基についてはジクロルベンジルエー テル、グルタミン酸およびアスパラギン酸のカルボキシル基についてはそれぞれ γ−およびβ−ベンジルエステルを用いた。A synthetic hebutide with the amino acid sequence shown in Table ■ under the heading “Peptide 4” (This is due to gp120 glycoprotein, the viral causative agent of AIDS and ARC. corresponding to residue numbers 735-752) by biosearch sum n (B1ose Synthesized using a solid phase method using a peptide synthesizer (Arch Samll) Bea Merrifield, 327 Doba, Enzymol, (Adv, Enzymol , >221 (1969)). dicyclohexylcarbodiimide in a catalytic amount of 4-N , butylene bound to polystyrene using N-dimethylaminopyridine. Oxycarbonyl-8-4-methylbenzyl-cystine was used as a solid support for the synthesis. It was used as The four amino groups are replaced by t-butyloxycarbonyl (t-BOC). The side chain protecting group was as follows. Regarding the hydroxyl group of serine, ben Dichlorobenzyl ether and dichlorobenzyl ether for the phenolic hydroxyl group of tyrosine. for the carboxyl groups of tel, glutamic acid and aspartic acid, respectively. γ- and β-benzyl esters were used.

トリフルオル酢酸(CHZCjh中40%)を用いてt−BOCを除去し、得ら れた塩をN、N−ジイソプロピルエチルアミン(CH2C12中10%)で中和 した。ジイソプロピルカルボジイミドを用いてt−BOCアミノ酸を結合させた 。この合成の個々の工程はジェイ・ティー・スバロー、41ジェイ、オルガ、ゲ ミ、(J、Org。The t-BOC was removed using trifluoroacetic acid (40% in CHZCjh) and the obtained The resulting salt was neutralized with N,N-diisopropylethylamine (10% in CH2C12). did. t-BOC amino acids were attached using diisopropylcarbodiimide . The individual steps of this synthesis were described by J.T. Sbarrow, 41 J. Olga, Ge. Mi, (J, Org.

Chem、)1350(1976)に発表されており、その全体をここに参考と して引用する。Chem, ) 1350 (1976), the entirety of which is hereby incorporated by reference. and quote.

保護基を除去し、0℃でアニソール10%およびエタンジチオール1%を含有す る無水フッ化水素をスキャベンジャ−として用いて樹脂からペプチドを解離した 。フッ化水素試薬を真空下に0℃で除去し、次いでペプチドを沈澱させ、無水エ ーテルで洗浄した。トリフルオル酢酸を用いて樹脂からペプチドを抽出したのち 、溶剤215℃で蒸発させ、ペプチドを再びエーテルで沈澱させた。遠心分離し たのちエーテルをデカントし、6M・グアニジンHCりを含む5%酢酸にベレッ トを溶解した。The protecting groups were removed and the solution containing 10% anisole and 1% ethanedithiol was prepared at 0°C. The peptide was dissociated from the resin using anhydrous hydrogen fluoride as a scavenger. . The hydrogen fluoride reagent was removed under vacuum at 0°C, then the peptide was precipitated and washed with anhydrous ether. Washed with water. After extracting the peptides from the resin using trifluoroacetic acid , the solvent was evaporated at 215° C. and the peptide was again precipitated with ether. centrifuge Afterwards, the ether was decanted and dissolved in 5% acetic acid containing 6M guanidine HC. The mixture was dissolved.

5%酢酸中て平衡化したバイオゲル(B 1oGel)P 2カラムで上記溶液 を脱塩し、ペプチド含有画分をプールし、凍結乾燥した0次いでペプチドのカル ボキシル末端にシスティン残基を付加して、ペプチドをキャリアータンパク質に 結合させるための官能性−3H基を施した。システィンの後にグリシン残基を付 加して、上記の結合システィン残基とgp160に相当するアミノ酸配列との間 にスペーサーアミノ酸を施しな。+2SJで放射性標識するためにチロシン残基 をアミノ末端に付加して、ペプチド−キャリアータンパク質結合効率を測定し、 かつ278n論における吸光により精製中のペプチドを確認した。The above solution was applied to a Biogel (B1oGel) P2 column equilibrated in 5% acetic acid. The peptide-containing fractions were desalted and the peptide-containing fractions were pooled and lyophilized. Adding a cysteine residue to the boxyl terminus converts the peptide into a carrier protein. A functional -3H group was provided for attachment. Adding a glycine residue after cysteine In addition, between the above bonded cysteine residue and the amino acid sequence corresponding to gp160 Do not apply spacer amino acid to. Tyrosine residue for radiolabeling with +2SJ was added to the amino terminus to measure the peptide-carrier protein binding efficiency, The peptide being purified was also confirmed by absorbance at 278 nm.

バイオゲルP2カラム上で酢酸中において脱塩し、凍結乾燥したのち、ペプチド は予期したアミノ酸分析結果を備え(表■参照)、C1,−逆相HPLCにおい て0.05%トリフルオル酢酸および2−プロパツールの直線濃度勾配により単 一ピーク(92%)として溶出した。After desalting in acetic acid on a Biogel P2 column and lyophilization, the peptide had the expected amino acid analysis results (see Table ■) and A linear concentration gradient of 0.05% trifluoroacetic acid and 2-propanol was used. It eluted as one peak (92%).

例5.ポリアミド樹脂上におけるペプチド6の合成表■のペプチド6ヘデイング として示した配列をもつ合成ペプチド(これはエイズおよびARCのウィルス性 原因物質のgp120糖タンパク質の残基番号503−532の配列に相当する )を下記に従ってポリアミド上で合成した。この明細書全体において用いた番号 はHTLV−1[[のアミノ酸残基に付された番号から採用した。これはエル・ ラトナーら、“エイズウィルスHTLV−■の全ヌクレオチド配列”313ネイ チャー277−284(1985)に示されてものであり、その全体をここに参 考として引用する。ポリアミド−ペプチド6結合体の配列は下記のとおりであっ た。Example 5. Synthesis of Peptide 6 on Polyamide Resin Heading of Peptide 6 in Table ■ A synthetic peptide with the sequence shown as Corresponds to the sequence of residue numbers 503-532 of the causative substance gp120 glycoprotein ) was synthesized on polyamide as follows. Numbers used throughout this specification was adopted from the numbers assigned to the amino acid residues of HTLV-1 [[. This is Elle Ratner et al., “Complete nucleotide sequence of AIDS virus HTLV-■” 313 277-284 (1985), the entire text of which is hereby incorporated by reference. I quote it as a consideration. The sequence of the polyamide-peptide 6 conjugate is as follows. Ta.

H2N−VAL−ALA−PR○−THR−LYS−ALA−LYS−ARG− ARG−VAL−VAL−GLN−ARG−GLU−LYS−ARG−ALA− VAL−GLY−I LE−GLY−ALA−LEU−PHE−LEU−GLY −PHE−LEU−GLY−A、官能性モノマーの調製 2−メチルスルホニルエチルオキシカルボニルクロリド(MSCクロリド>(K +にラボズ、 I CN)5g(26,8ミリモル)をアセトニトリル15社に 溶解し、再蒸留アリルアミン(コダック)2.1zi!(28ミリモル)および 再蒸留ジイソプロピルエチルアミン(D I E A )4.!3yl(28ミ リモル)の溶液(アセトニトリル2(hl中)2.1ffi!に攪拌下に20分 間にわたって滴加した。(DIEA、(アルドリッヒ)はニンヒドリン上で還流 し、再蒸留した。)溶液をさらに2時間撹拌し、溶剤を蒸発させた。残渣を酢酸 エチル250y1に入れ、1〜2時間放置した。大部分のDIEA塩酸塩が針状 晶として沈澱した。濾過および蒸発させたのち、@製物質を最少量のクロロホル ムに溶解し、同−溶剤中において充填したシリカゲルG−60カラム(60y> に装填した。クロロホルムで溶離して、純粋なMSC−アリルアミンを得た(T LC上のRF−164(溶剤= CHCl :l : CHz OH19: 1  ))。H2N-VAL-ALA-PR○-THR-LYS-ALA-LYS-ARG- ARG-VAL-VAL-GLN-ARG-GLU-LYS-ARG-ALA- VAL-GLY-I LE-GLY-ALA-LEU-PHE-LEU-GLY -PHE-LEU-GLY-A, preparation of functional monomer 2-Methylsulfonylethyloxycarbonyl chloride (MSC chloride>(K + Laboz, ICN) 5g (26.8 mmol) to 15 acetonitrile companies Dissolve and redistilled allylamine (Kodak) 2.1zi! (28 mmol) and Redistilled diisopropylethylamine (DIEA)4. ! 3yl (28mm) 2.1ffi! in acetonitrile (in HL) for 20 minutes under stirring. It was added dropwise over a period of time. (DIEA, (Aldrich) refluxed over ninhydrin and redistilled. ) The solution was stirred for a further 2 hours and the solvent was evaporated. Residue in acetic acid The mixture was placed in ethyl 250y1 and left for 1 to 2 hours. Most of DIEA hydrochloride is acicular It precipitated as crystals. After filtration and evaporation, the @ material is treated with a minimum amount of chloroform. A silica gel G-60 column (60y> loaded into. Elution with chloroform gave pure MSC-allylamine (T RF-164 on LC (solvent = CHCl: l: CHz OH19: 1  )).

残りのDIEA塩はこの条件下でカラムに吸着された。場合によりTLCにおい て溶剤前端付近に移行した物質がMSC−アリルアミンカラム画分に混入した。The remaining DIEA salt was adsorbed onto the column under this condition. Occasionally TLC smell The substance that migrated to the vicinity of the front end of the solvent was mixed into the MSC-allylamine column fraction.

この物質はMSC−アリルアミンを一20℃で塩化メチレン−ヘキサンから結晶 化することにより除かれた。収量は4.8g(86%、MSCクロリドから)で あった。This material is MSC-allylamine crystallized from methylene chloride-hexane at -20°C. It was removed by changing the Yield: 4.8 g (86%, from MSC chloride) there were.

B、架橋剤の調製 架橋剤であるN、N’−ビスアクリリル−1,3−ジアミノプロパンはへルベル ンおよびスパロー(前掲)に示それた方法に従って調製された。以下に要約する 。ジアミノプロパン(アルドリッヒ)をアセトニトリルに溶解し、塩化アクリリ ル−アセI・ニトリル溶液に4℃で滴加し、室温にまで昇温させ、攪拌した。ジ アミノプロパンジ塩酸塩を枦別し、温アセトニトリルで洗浄し、P液を合わせて 真空中で濃縮した。N、N′−ビスアクリリル−1,3−ジアミノプロパンが4 ℃、−夜で晶出し、得られた板状晶を濾過し、真空中で乾燥させた。B. Preparation of crosslinking agent The crosslinking agent N,N'-bisacrylyl-1,3-diaminopropane is It was prepared according to the method described by John and Sparrow (supra). summarized below . Dissolve diaminopropane (Aldrich) in acetonitrile and add acrylic chloride. The mixture was added dropwise to the leu-aceI nitrile solution at 4°C, heated to room temperature, and stirred. Ji Separate the aminopropane dihydrochloride, wash with warm acetonitrile, and combine with P solution. Concentrated in vacuo. N,N'-bisacrylyl-1,3-diaminopropane is 4 C., overnight, the platelets obtained were filtered and dried in vacuo.

C,ポリアミド樹脂の調製 窒素導入管および機械駆動式ガラス攪拌機を備えたガラス製の21容円筒状、段 付き重合容器にヘキサン490m1および四塩化炭素290zlを添加した。溶 液を窒素で15分間パージして酸素を除去した。この溶液に例5.Bの記載に従 って調製したN、N’−ビスアクリリル−1,3−ジアミノプロパン(2,9, ,15,9ミリモル)を含む水溶液を添加し、N、N−ジメチルアクリルアミド (ポリサイエンシズ)18.2zl(175ミリモル)と混合した。例5.Aの 記載に従って製造したMSCアリルアミン10y(48ミリモル)および水12 0m1を添加し、溶液を濾過し、脱泡したのち有機相に添加した。400〜45 0RPMで攪拌しながら、得られた混合物の密度を調整し、均質な懸濁液を得た 。過硫酸アンモニウム(バイオラド)(H205d中o、sy>、およびセスキ オレイン酸ソルビタンまたはモノラウリン酸ソルビタン(シグマ)1111を添 加した。C. Preparation of polyamide resin Glass 21 volume cylindrical, trayed with nitrogen inlet tube and mechanically driven glass stirrer 490 ml of hexane and 290 zl of carbon tetrachloride were added to a polymerization vessel equipped with a reactor. melt The solution was purged with nitrogen for 15 minutes to remove oxygen. Example 5. According to the description of B. N,N'-bisacrylyl-1,3-diaminopropane (2,9, , 15,9 mmol) and N,N-dimethylacrylamide. (Polysciences) 18.2 zl (175 mmol). Example 5. A's MSC allylamine 10y (48 mmol) and water 12 prepared as described 0 ml was added and the solution was filtered, defoamed and added to the organic phase. 400-45 While stirring at 0 RPM, the density of the resulting mixture was adjusted to obtain a homogeneous suspension. . Ammonium persulfate (Bio-Rad) (H205d in o, sy>, and sesqui Added sorbitan oleate or sorbitan monolaurate (Sigma) 1111 added.

次いでH202x l中のN、N、N” 、N′−テトラメチルエチレンジアミ ン(TEMED)(バイオラド)3zfの溶液(pH6,5〜7.5、濃HCI )を懸濁液に添加した。懸濁したエマルジョンを窒素雰囲気下に2時間攪拌した 。次いで得られたビーズ状材料を沢過し、順次水(11)、メタノール(1り、 ジオキサン:メタノール=2N・NaOH混合Th<1.4:5:1.21、A i S C類の除去のため)、水(21)、I N −HCI<21>、水(2 t’)、次いでメ9/−ル(2f>で洗浄した。樹脂をメタノールに懸濁し、デ カントする(3回)ことによって調整した。塩化メチレン(ベーカー、HPLC 用)中で膨潤させたのち、樹脂をヘキサン中で収縮させ、真空中で乾燥させた。Next, N, N, N'', N'-tetramethylethylene diamide in H202xl TEMED (Bio-Rad) 3zf solution (pH 6.5-7.5, concentrated HCI ) was added to the suspension. The suspended emulsion was stirred for 2 hours under nitrogen atmosphere. . Next, the obtained bead-like material was filtered, and water (11), methanol (1, Dioxane:methanol=2N NaOH mixture Th<1.4:5:1.21, A iS for removal of C), water (21), IN-HCI<21>, water (2 t') and then washed with methanol (2f>).The resin was suspended in methanol and washed with Adjusted by canting (3 times). Methylene chloride (Baker, HPLC After swelling in dioxins, the resin was shrunk in hexane and dried in vacuo.

樹脂を80メツシユ(180ミクロン)の篩で篩別することにより大型の非晶質 材料を除去した。By sieving the resin with an 80 mesh (180 micron) sieve, it becomes a large amorphous material. Material removed.

ジイソプロピルカルボジイミドを活性剤として、4−ジメチルアミノピリジン( 酢酸エチルから再結晶)を触媒として用いて、樹脂100jyにBOC−アラニ ンを結合させることにより、官能化の程度を調べた。アミノ酸分析はロットに応 じて0.15〜0.3ミリモル/2(樹脂)の置換を示し、アリルアミンの添加 量に応じて約0.1〜約0.5ミリモル/2(樹脂〉の樹脂が調製された。負荷 された樹脂はビクリルスルホン酸により検出可能な染色を示さず、未反応の遊離 アミンが存在しないことを示していた。これらのビーズは塩化メチレン中で膨潤 させるとそれらの乾燥床容量の約2.5倍を占めた。ジメチルホルムアミドまた は水溶液中で膨潤させると、ビーズはそれらの乾燥床容量のそれぞれ約4および 6倍を占めた。Using diisopropylcarbodiimide as an activator, 4-dimethylaminopyridine ( BOC-alani was added to 100jy of resin using 100jy of resin (recrystallized from ethyl acetate) as a catalyst. The degree of functionalization was investigated by attaching ions. Amino acid analysis is lot-specific. The addition of allylamine Depending on the amount, about 0.1 to about 0.5 mmol/2 (resin) of resin was prepared. The treated resin showed no detectable staining with vicrylsulfonic acid, indicating that unreacted free This indicated the absence of amines. These beads swell in methylene chloride This occupied about 2.5 times their drying bed capacity. Dimethylformamide also When swollen in an aqueous solution, the beads have a dry bed capacity of about 4 and 4, respectively. It accounted for 6 times more.

D、リンカ−の調製 リンカ−であるBOC−グリシル−4−(オキシメチル)安息香酸はミッチェル らの方法(前掲)の変法により調製された。要約すると、4−(ブロムメチル) 安、!、香醋酸フェニルアシルエステル下記により調製しな。再蒸留ジイソプロ ピルアミン10.3zlおよびブロムアセトフェノン12.059(60,6ミ リモル)を酢酸エチル450社に溶解した。4−(ブロムメチル)安思香酸13 .89g(60,6ミリモル)を7等分して3時間にわたって、40〜50℃で 攪拌された溶液に添加した。攪拌を室温でさらにら2時間続けた。沈澱したEt iN・HBrな沢去し、酢酸エチル溶液を各5011の10%クエン酸、飽和塩 化ナトリウム、飽和炭酸水素ナトリウムおよび飽和塩化ナトリウム水溶液で4回 洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下での回転蒸発によ り溶剤を除去した。残渣をCH2Cl2−石油エーテル(1:3v/v)から結 晶化して4−(ブロムメチル)安息香酸フェニルアシルエステルを得た。D. Preparation of linker The linker, BOC-glycyl-4-(oxymethyl)benzoic acid, is a Mitchell It was prepared by a modification of the method of et al. (supra). In summary, 4-(bromomethyl) Cheap! , fragrant phenylacyl ester prepared as follows. redistilled diisopro pyramine 10.3zl and bromoacetophenone 12.059 (60.6ml) (remol) was dissolved in ethyl acetate 450. 4-(bromomethyl)benzikoic acid 13 .. 89 g (60.6 mmol) was divided into 7 equal parts and heated at 40-50°C for 3 hours. Added to stirred solution. Stirring was continued for an additional 2 hours at room temperature. Precipitated Et Remove the iN HBr solution and add each 5011 10% citric acid, saturated salt to the ethyl acetate solution. 4 times with sodium chloride, saturated sodium bicarbonate and saturated sodium chloride aqueous solution Washed. The organic phase was dried over anhydrous magnesium sulfate and evaporated by rotary evaporation under reduced pressure. The solvent was removed. The residue was purified from CH2Cl2-petroleum ether (1:3 v/v). Crystallization gave 4-(bromomethyl)benzoic acid phenyl acyl ester.

4−(ブロムメチル)安息香酸フェニルアシルエステルを下記によりBOC−グ リシル−4−(オキシメチル)安息香酸に変換した。BOC−L−グリシン(2 5ミリモル、4.38g)をメタノール1511に溶解し、水酸化テトラメチル アンモニウム(メタノール中25%)を中性になるまで滴下した。溶剤を真空中 でクロロホルムと共沸除去し、この塩をアセトニトリル150M1に溶解した。4-(bromomethyl)benzoic acid phenylacyl ester was converted to BOC-glue as follows. It was converted to lysyl-4-(oxymethyl)benzoic acid. BOC-L-glycine (2 5 mmol, 4.38 g) in methanol 1511, tetramethyl hydroxide Ammonium (25% in methanol) was added dropwise until neutral. Solvent in vacuum and the salt was dissolved in 150M1 acetonitrile.

この溶液に攪拌下に、上記により調製した4−(ブロムメチル)安息香酸フェナ シルエステル5.8g(17,5ミリモル)を添加した。−夜混合したのち、沈 澱した臭化テトラメチルアンモニウムを濾過し、溶剤を蒸発させた。残渣を酢酸 エチル400m1に溶解し、溶液を瀘通した。次いで有機相を順次、10%クエ ン酸水溶液(3x75z1)、0.5M炭酸水素ナトリウム:0.5M炭酸カリ ウム(2:1)、pH9,5(8x 75.vf)、次いで水(3X 75y1 )で洗浄した。この溶液を乾燥させ(MgSOJ、溶剤を真空中で除去した。残 渣を85%酢酸200z1に溶解し、これに酸洗浄した亜鉛末231?を添加し た。TLCによりフェナシルエステルがもはや認められなくなるまで混合物を攪 拌した(4〜5時間)、亜鉛を濾過し、酢酸50d’で洗浄し、溶液を合わせて 凍結乾燥した。残渣を水100m1:酢酸エチル30(hlに懸濁し、pHを1 .5に調整した(濃HC1>。水増を2回目の酢酸エチル(200v1)で抽出 し、抽出液を合わせて水洗した(100ii’) 、乾ti(MfISO4)お よび蒸発ののち、BOC−グリシル−4−(オキシメチル)安息香酸を塩化メチ レン:ヘキサンから一10°で再結晶することにより精製した。To this solution, under stirring, was added 4-(bromomethyl)benzoic acid phenyl prepared as described above. 5.8 g (17.5 mmol) of syl ester were added. - After mixing at night, The precipitated tetramethylammonium bromide was filtered and the solvent was evaporated. Residue in acetic acid Dissolved in 400 ml of ethyl and filtered the solution. The organic phase was then sequentially treated with 10% quenchant. Aqueous acid solution (3x75z1), 0.5M sodium bicarbonate: 0.5M potassium carbonate (2:1), pH 9.5 (8x 75.vf), then water (3x 75y1) ). The solution was dried (MgSOJ, the solvent was removed in vacuo. The residue was dissolved in 85% acetic acid 200z1 and acid washed with zinc powder 231? add Ta. Stir the mixture until no more phenacyl ester is visible by TLC. Stir (4-5 hours), filter the zinc, wash with 50 d' of acetic acid, and combine the solutions. Lyophilized. The residue was suspended in 100 ml of water: 30 ml of ethyl acetate, and the pH was adjusted to 1. .. Adjusted to 5 (concentrated HC1) The extracts were combined and washed with water (100ii'), dried ti (MfISO4) and After evaporation and evaporation, BOC-glycyl-4-(oxymethyl)benzoic acid is converted into methyl chloride. Ren: Purified by recrystallization from hexane at -10°.

収量は4−51?(14,5ミリモル、83%、フェナシルエステルから)であ った。The yield is 4-51? (14.5 mmol, 83%, from phenacyl ester) It was.

E、ポリアミド樹脂へのリンカ−の結合例5.Dの記載に従って調製したBOC −グリシル−4−(オキシメチル)安息香酸と例5.Cの記載に従って調製した アミンメチルポリアミド樹脂(1、h>を、バイオサーチ・サム■自動ペプチド 合成装置により、ジシクロへキシルカルボジイミドおよびジメチルアミノピリジ ンを活性剤として用いて、1:1塩化メチレン:ジメチルホルムアミド溶液中で 結合させた。塩化メチレン(ベーカー、HPLC用)およびジメチルホルムアミ ド(ベーカー、フォトレックス(Photrex)用)は共にそれ以上精製せず に使用した。フッ化水素で処理したのち、50agのグリシル−樹脂は0.15 ミリモル/gを含むことがアミノ酸分析により認められた。アミノ酸分析は以下 のいずれかにより行われた。E. Example 5 of linker binding to polyamide resin. BOC prepared as described in D. -Glycyl-4-(oxymethyl)benzoic acid and Example 5. Prepared as described in C. Amine methylpolyamide resin (1, h>), Biosearch Sam ■ Automatic peptide The synthesizer produces dicyclohexylcarbodiimide and dimethylaminopyridi in a 1:1 methylene chloride:dimethylformamide solution using Combined. Methylene chloride (Baker, HPLC grade) and dimethylformamide (for Baker and Photorex) without further purification. used for. After treatment with hydrogen fluoride, 50 ag of glycyl-resin is 0.15 It was found by amino acid analysis that it contained mmol/g. Amino acid analysis is below carried out by any of the following.

(1)樹脂結合ペプチドを2時間加水分解する(12N −HC1:プロピオン 酸、1:1.135℃)か、もしくは24時間加水分解したのち(6N−HCl 、110℃)、ペックマン119型アミノ酸分析器による。または(2)2時間 加水分解したのち(12N −HCI:プロピオンfl、1 :1.0.05% フェノールを含む、135℃)、ベックマン7300型アミノ酸分析器による。(1) Hydrolyze the resin-bound peptide for 2 hours (12N-HC1: propion acid, 1:1.135°C) or after 24 hours of hydrolysis (6N-HCl , 110°C) using a Peckman Model 119 amino acid analyzer. or (2) 2 hours After hydrolysis (12N-HCI: propion fl, 1:1.0.05% (containing phenol, 135°C) using a Beckman Model 7300 Amino Acid Analyzer.

アミノ酸分析の結果を表■に示す。 ペプチド1,2.7および10は上記樹脂 上で同じ様式により合成され、対応するポリアミド樹脂−ペプチド結合体を得た 。The results of amino acid analysis are shown in Table ■. Peptides 1, 2.7 and 10 are the above resins The corresponding polyamide resin-peptide conjugate was synthesized in the same manner as above to obtain the corresponding polyamide resin-peptide conjugate. .

例6−10 のベブ ドのム 前記例4に記載の方法を用いて表■に挙げたペプチド3,5゜8および9を合成 した。これらはそれぞれ表中のアミノ酸配列に対応する。Example 6-10 Synthesize peptides 3, 5° 8 and 9 listed in Table ■ using the method described in Example 4 above. did. Each of these corresponds to the amino acid sequence in the table.

例11. ヤリアーへの4 ペプチドの七ム合成ペプチド4(表■参照)をシス ティン残基の−SH基を介して、キーボール・リンピット(keyhole I i+apet、カサガイ)ヘモシアニン(KLH)(家兎の免疫処置用)および ウシ血清アルブミン(BSA)(抗ペプチド活性のアッセイ用)のアミン基に、 ヘテロニ官能性架橋剤M−マレイミドベンジル−N−ヒドロキシスクシンイミド エステル(MBS)を用いて結合させた。この方法の詳細はエフ・ティー・リュ ーら、18バイオケミストリー690(1979)およびエフ・グリーンら、2 8セル477(1982)に示される。これら両者の全体とここに参考として引 用する。Example 11. Peptide 4 to Yaria Synthetic peptide 4 (see table ■) Through the -SH group of the tin residue, keyhole limpit (keyhole I) i+apet, limpet) hemocyanin (KLH) (for rabbit immunization) and On the amine group of bovine serum albumin (BSA) (for assaying anti-peptide activity), Heteronifunctional crosslinker M-maleimidobenzyl-N-hydroxysuccinimide Coupling was done using ester (MBS). Details of this method can be found in F.T. et al., 18 Biochemistry 690 (1979) and F. Green et al., 2 8 Cell 477 (1982). Both of these are cited in their entirety and here as a reference. use

表 ■ 残基 HF処理前 HF処理後 Thr 、75(1)” 、85(1)G lu/G In 2.30(2)  2.15(2)Pro N 、D 、b(1) 1.07(1)G ly 4. 85<5) 5.35(5)A Ia 4.70(5) 5.19(5)Val  3.60(4) 3.59(4)11e O,94(1) 1.04(1)L eu 2.70(3) 3.12(3)P he 2.00(2) 2.00( 2)L ys 2.73(3) 4.10(3)A rg 4.00(4) 3 .90(4)μモル/g 71 50 a 数値は加水分解中の破壊について補正されていない。かっこ内の数値は個々 の配列に対する各アミノ酸の理論収量を表わす。Table ■ Residue Before HF treatment After HF treatment Thr, 75(1)”, 85(1)G lu/G In 2.30(2) 2.15 (2) Pro N, D, b (1) 1.07 (1) G ly 4. 85<5) 5.35 (5) A Ia 4.70 (5) 5.19 (5) Val 3.60 (4) 3.59 (4) 11e O, 94 (1) 1.04 (1) L eu 2.70 (3) 3.12 (3) P he 2.00 (2) 2.00 ( 2) L ys 2.73 (3) 4.10 (3) A rg 4.00 (4) 3 .. 90 (4) μmol/g 71 50 a Values are not corrected for destruction during hydrolysis. Numbers in parentheses are individual represents the theoretical yield of each amino acid for the sequence.

b 測定されながった。b. Not measured.

以下に要約する。10mMリン酸ナトリウム(pH7,2)中のKLHまたはB SAlzyをそれぞれジメチルホルムアミド中のM B S4xgおよび800 μgと共に25℃で30分間インキュベートした。50mMリン酸ナトリウム緩 衝液(pH6,0)中で平衡化したセファデックスPD−10カラムにより未反 応のMBSおよび溶剤を除去した。KLHまたはBSAに対し100モル過剰の ペプチド4を約500 、000c p#lの125 (: 工)標識ペプチド 4と共に反応混合物に添加し、25°Cでさらに3時間インキュベートした。タ ンパク質キャリアーに結合しなかったペプチドを反復透析により除去した。It is summarized below. KLH or B in 10mM sodium phosphate (pH 7,2) M B S4xg and 800% SAlzy in dimethylformamide, respectively. ug for 30 minutes at 25°C. 50mM sodium phosphate A Sephadex PD-10 column equilibrated in a buffer solution (pH 6.0) was used to remove the unreacted The corresponding MBS and solvent were removed. 100 molar excess over KLH or BSA Approximately 500,000cp#l of peptide 4 was 125(: engineering) labeled peptide 4 to the reaction mixture and incubated for an additional 3 hours at 25°C. Ta Peptides that did not bind to the protein carrier were removed by repeated dialysis.

K L l−1およびBSAに付随する125〔■〕ペプチドの量により結合効 率が判定され、KLHおよびBSAにつきそれぞれ約62%および56%であっ た。The binding efficiency is determined by the amount of 125[■] peptide associated with KLl-1 and BSA. The rates were determined to be approximately 62% and 56% for KLH and BSA, respectively. Ta.

キャリア−ペプチド4結合体の配列は下記のとおりであった。The sequence of the carrier-peptide 4 conjugate was as follows.

GLY−I LE−GLtJ−GLU−GLU−GLY−GLY−GLU−AR G−ASP−ARG−ASP−H り!lI OOH ペプチド3,5.8および9(表■参照)も同様な様式でキャリアーに結合して いた。GLY-I LE-GLtJ-GLU-GLU-GLY-GLY-GLU-AR G-ASP-ARG-ASP-H the law of nature! lI OOH Peptides 3, 5.8 and 9 (see Table ■) were also attached to the carrier in a similar manner. there was.

例12.來兎圀並見玉逸−咬】U(応luN導:ペプチドーキャリアーフロイン ドの不完全アジュバント中に乳化したペプチド4−KLH複合体(上記に従って 調製)100μ2/回を用いて2匹の家兎をそれぞれ免疫処理した。家兎に2週 間毎に1回の筋肉的注射を施しく合計3回の注射)、各免疫処理後に血清を採取 した。Example 12.䆆兎圀Namimitamayitsu-Kite] U Peptide 4-KLH complex emulsified in incomplete adjuvant (as described above) Preparation) Two domestic rabbits were each immunized using 100μ2/time. 2 weeks for rabbit one intramuscular injection at each interval for a total of three injections), and serum was collected after each immunization. did.

固相ラジオイムノアッセイ法を採用して、家兎抗ペプチド抗血清を滴定した。以 下に要約する。BSAに結合したペプチド4(例11の記載に従って調製)20 0ni+をポリビニル製ミクロタイタープレートのウェルに吸着させ、4℃で一 夜インキユベートした。10%正常ヤギ血清(Nats>を添加して非特異的部 位をブロックしたのち、10%NGtS中に希釈した家兎抗ペプチド抗血清を添 加し、37℃で2時間インキュベートした。抗血清は各免疫処理の14日後に得 られた。ミクロタイターのウェルをツイーン20リン酸塩緩衝化食塩液(T−P BS)で洗浄し、+25[)ヤギ抗家兎カンマグロブリン(50μ!中に約50 0,0OOcpJを添加した。37℃で1時間インキュベートしたのち、ウェル をT−PBSで洗浄して過剰の放射能を除き、ガンマ線計数管で計数した。容量 はすべて50μ!であり、表■に示す抗ベブチド力価は終末点力価希釈度(免疫 処理家兎血清よりも高いep−を与えた抗血清の最大希釈度)の逆数として表わ される。終末点力価は5倍希釈液に基づくものであり、三重反復値の平均を示す 。A solid-phase radioimmunoassay method was adopted to titrate the rabbit anti-peptide antiserum. Below Summarized below. Peptide 4 conjugated to BSA (prepared as described in Example 11) 20 Adsorb 0ni+ into the wells of a polyvinyl microtiter plate and incubate at 4°C. Incubated at night. Add 10% normal goat serum (Nats) to remove non-specific portions. After blocking the site, add rabbit anti-peptide antiserum diluted in 10% NGtS. and incubated at 37°C for 2 hours. Antisera were obtained 14 days after each immunization. It was done. Fill microtiter wells with Tween 20 phosphate buffered saline (T-P). Wash with +25[) goat anti-rabbit comma globulin (50μ! 0.0OOcpJ was added. After incubating for 1 hour at 37°C, the wells The cells were washed with T-PBS to remove excess radioactivity and counted in a gamma counter. capacity are all 50μ! The antibebutide titers shown in Table ■ are based on the endpoint titer dilution (immunization expressed as the reciprocal of the maximum dilution of the antiserum that gave a higher ep- than the treated rabbit serum. be done. Endpoint titers are based on 5-fold dilutions and represent the average of triplicate values. .

免疫処理前 10 21 三次 31.250 免疫処理前 1〇 一次 1250 二次 6250 22 三次 156.250 表■に示した結果は、2匹の家兎がペプチド−KLHの1回注射後に検出可能な 抗ペプチド反応を生じたことを示す(ペプチド−BSAにより測定)。免疫処理 前に各家兎から得た匍清はペプチドを有意に結合しなかった(10以下の力価) 。抗ベブチド力価はペプチド注射それぞれののちに上昇し、3回目の注射ののち には31.250〜156,250に及んだ。Before immunization treatment 10 21 Tertiary 31.250 Before immunization treatment 10 Primary 1250 Secondary 6250 22 Tertiary 156.250 The results shown in Table ■ show that two rabbits were detectable after a single injection of peptide-KLH. Indicates that an anti-peptide response occurred (measured by peptide-BSA). Immunization The samples previously obtained from each rabbit did not bind the peptide significantly (titer below 10). . Antibebutide titers increased after each peptide injection and after the third injection. It ranged from 31,250 to 156,250.

抗体反応の特異性は、抗ペプチド血清がBSAに結合した対照ペプチドを結合し 得ないことによって示された。さらにHTLV−@ペプチド728−745 ( ペプチド3ンは、ペプチド−BSAへの家兎抗ペプチドの結合を完全に抑PI、 た(100%)。2匹の家兎はK L )(に対しても高い抗体価を生じたが、 家兎抗KLHはペプチド−BSAを結合しなかった。The specificity of the antibody response is determined by the fact that the anti-peptide serum binds the control peptide bound to BSA. demonstrated by not getting it. Furthermore, HTLV-@peptide 728-745 ( Peptide 3in completely inhibited the binding of rabbit anti-peptide to peptide-BSA, (100%). Two domestic rabbits also developed high antibody titers against KL) ( Rabbit anti-KLH did not bind peptide-BSA.

M 13. 社止る 、の;導:ポリアミド L人 ベブ ド Δ 2匹の家兎をそれぞれフロイントの完全アジュバント中のポリアミド樹脂−ベブ チドロ結合体(ペプチド6.200μ9/回)で免疫処理した。家兎に2週間毎 に1回の筋肉的注射を施したく合計3回の注射)。後続の注射は1か刃間隔で施 し、4回目の注射の30日後に血清を得た。対照の抗ペプチド抗血清は、KLH に結合したサルウィルス40腫瘍抗原ペプチド(例11においてKLHへのペプ チド4の結合について記載した方法による)または肝炎B表面抗原樹脂結合ペプ チド(例5の方法により調製)を用いて免疫処理した家兎において産生された。M13. Company stop, Lead: Polyamide L person Bev de Δ Two rabbits were each treated with polyamide resin-Bev in complete Freund's adjuvant. Immunization was performed with Tidro conjugate (peptide 6.200 μ9/time). For rabbits every 2 weeks (1 intramuscular injection for a total of 3 injections). Subsequent injections should be administered at one or more blade intervals. and serum was obtained 30 days after the fourth injection. The control anti-peptide antiserum was KLH simian virus 40 tumor antigen peptide (in Example 11, peptide to KLH) (by the method described for the binding of hepatitis B surface antigen resin) or hepatitis B surface antigen resin-conjugated peptide. was produced in rabbits immunized with Tide (prepared according to the method of Example 5).

例14.家 −ペプチド 体によるHTLV−Jタン伐乙」@籾−:ベプ ドー キャリアー ペプチド4に対する家兎抗体がHTLV−I[[に付随する天然タンパク質を認 識する能力を下記により試験した。MOLT−3、すなわちHTLV−II[f fi染T細胞系を” [:S:]−シスチアで標識し、前記の例2に記載した免 疫沈澱法に使用して、抗ペプチド血清が放射性標識付きHT L V −III 天然タンパクH,6結合するか否かを調べた。キャリアー−ペプチド4結合体( 例11の記載に従って調製)で免疫処理した家兎から得た家兎抗ペプチド抗体は 、5DS−PAGEのオートラジオグラフにより示されるように約160,00 0ダルトンの単一タンパク質を沈澱させた。このタンパク質はHTLV−1の前 駆物質であるエンベロープ糖タンパク質gp160である。免疫処理前の家兎血 清を免疫沈澱実験に用いた場合は、HT L V −1[[タンパク質に対する 反応性は証明されなかった。上記家兎抗ペプチドは、エイズ患者から得たヒト抗 血清を免疫沈澱法に用いた場合にHIS(s)−シスチン標識付きM OL T  −3m胞により検出された8p120エンベロープサブユニツトを認識しなか った。gp41エンベロープサブユニットは” CS )−シスチンによりgρ 120ど同程度には放射性標識されず、免疫沈澱法により検出するのは困難であ る。Example 14. House - HTLV by peptide body - J Tan Setsu Otsu” @Momo -: Bepudo carrier Rabbit antibodies against peptide 4 recognized the natural protein associated with HTLV-I. The ability to recognize was tested as follows. MOLT-3, i.e. HTLV-II[f fi-stained T cell lines were labeled with "[:S:]-cystia" and immunolabeled as described in Example 2 above. The anti-peptide serum was used in the epidemiological precipitation method to obtain radiolabeled HTLV-III. It was investigated whether or not it binds to natural protein H,6. Carrier-peptide 4 conjugate ( Rabbit anti-peptide antibodies obtained from rabbits immunized with (prepared as described in Example 11) , approximately 160,00 as shown by 5DS-PAGE autoradiograph. A single protein of 0 daltons was precipitated. This protein is located before HTLV-1. The precursor substance is envelope glycoprotein gp160. Rabbit blood before immunization When the supernatant was used for immunoprecipitation experiments, HTLV-1 [[for protein No reactivity was demonstrated. The above rabbit anti-peptide is a human anti-peptide obtained from AIDS patients. When serum is used for immunoprecipitation, HIS(s)-cystine labeled MOLT -Failure to recognize 8p120 envelope subunit detected by 3m cells It was. The gp41 envelope subunit is converted to gρ by “CS)-cystine. 120 is not radiolabeled to the same extent and is difficult to detect by immunoprecipitation. Ru.

比較的高い水準の比放射能の8p41を調製することの困難さは以下により回避 された。HTLV−II[怒染M OI−T −3細胞を、1s(S)−メチオ ニンおよびHIS(S)−シスチン双方の添加により二重標識した。次いでこれ らの二重シスチン−メチオニン標識付き細胞溶解物中に存在する糖タンパク質集 団を、前記の例2の記載に従ってアフィニティクロマトグラフィーにより濃縮し た。前記の例2に記載した放射性免疫沈澱実験により分析したところ、家兎抗ペ プチド血清がこれらの糖タンパク質濃縮画分と反応した場合にはgp160およ びgp41糖タンパク質の双方が観察された。The difficulty of preparing 8p41 with relatively high levels of specific activity is avoided by It was done. HTLV-II [anger-stained M OI-T-3 cells were stained with 1s(S)-methio Double labeling was achieved by addition of both nin and HIS(S)-cystine. Then this A collection of glycoproteins present in double cystine-methionine labeled cell lysates of The complex was concentrated by affinity chromatography as described in Example 2 above. Ta. As analyzed by the radioimmunoprecipitation experiment described in Example 2 above, When the putido serum reacted with these glycoprotein-enriched fractions, gp160 and Both gp41 and gp41 glycoproteins were observed.

HTLVタンパク質についてのウェスターン転写法により、家兎抗ペプチドが実 際に8p41を認識したことが証明された。この方法は感染H9細胞(バイオラ ド・ラボラトリーズ、カリフォルニア州すッチモンド)′iたはMOLT−3細 胞溶解物の原液をHTLV−IIIタンパク源として用いる。このアッセイ法で は5xlO’個の怒染細胞を1%ツヴイッタージェント(Zwittergen t)3−14(カルビオヘムーベーリング)溶液lzf中で5分間可溶化し、1 000Xyで10分間遠心分離する。得られた上層液を等容量の破壊用緩衝液1 kM)リス−HCJ、pH6,8、グリセリンおよび0.01%ブロムフェノー ルブルー)と混合し、3分間煮沸する。Rabbit anti-peptides were produced using the Western transcription method for HTLV proteins. It was proven that the virus recognized 8p41. This method uses infected H9 cells (biolabeled Laboratories, Suchmond, California) or MOLT-3 Thin A stock solution of cell lysate is used as the HTLV-III protein source. With this assay method 5×lO’ cells were injected with 1% Zwittergen. t) Solubilize for 5 minutes in 3-14 (Calbiohemubering) solution lzf, Centrifuge at 000Xy for 10 minutes. The obtained upper layer solution was added with an equal volume of disruption buffer 1 kM) Lis-HCJ, pH 6,8, glycerin and 0.01% bromophenol Le Bleu) and boil for 3 minutes.

破壊細胞溶解物8μ!を隣接する数列において4−25%アクリルアミド直線濃 度勾配ゲル(1,5x 17X 14CJF)中で24時間、50 v 、/ゲ ルの定電圧下に電気泳動する。電気泳動により分離した濃度勾配ゲルを次いで1 aIIIρの定電流において90分間、10”Cで、タウビンら76ブロシ、ナ ショナル、アカデ、サイ、(Proc、Natl、A、cad。Destroyed cell lysate 8μ! 4-25% acrylamide linear concentration in adjacent rows. 24 hours in a gradient gel (1,5x 17x 14CJF) at 50v/ge. electrophoresis under constant voltage. The electrophoretically separated concentration gradient gel was then separated by 1 At 10"C for 90 minutes at a constant current of aIIIρ, Taubin et al. National, Akade, Sai, (Proc, Natl, A, cad.

Sci、)4350(1979)に記載の緩衝系を用いてニトロセルロースシー )・に転写する。この文献全体をここに参考として引用する。Sci., ) 4350 (1979). )・Transfer to. This document is incorporated herein by reference in its entirety.

あらかじめ着色した分子量マーカー(BRL)をも電気泳動し、ニトロセルロー スに転写して、転写HTLV−■ペプチドの分子量を推定するための標準として 用いた。A pre-colored molecular weight marker (BRL) was also electrophoresed, and nitrocellulose as a standard for estimating the molecular weight of the transcribed HTLV-■ peptide. Using.

転写終了後、o、oot%III/vメチオレートおよび0.0001Xy /  vアンチフオーム(Antifoam)A(シグマ)を含有するPBS中で再 水和した5%w/v脱脂粉乳1.OOw 1と共にニトロセルロースシートを室 温で30分間インキヱベートした。ペプチド4で免疫処理した家兎から得た血清 の系列希釈液を次いでニトロセルロースシートと共に37°Cで1時間インキュ ベートした0次いでニトロセルロースシートをツイーン20リン酸塩緩衝化食塩 液(T−P B S )1.0Oy1で洗浄した0次いでビオチニル化ヤギ抗ヒ トIgG(5μg/y/)を、家兎抗ペプチド抗体の結合を調べるためにニトロ セルロースシートと共に37℃で1時間インキュベートした。ニトロセルロース シートを再びT−PBSで洗浄し、次いでアビジン標識付きホースラディツシュ ペルオキシダーゼ(AシーHRP)1.ug/y1を添加し、室温ニ20分装置 イタ、T−PBSで再び洗浄したのち、ペルオキシダーゼ色原体二基質溶液(P BS中0.2xg/rt1)O−シアニスジン+ 30%H2021μm/ w l>100zfを、膜上に沈澱が認められるまで上記ニトロセルロース膜に添加 した(10〜15分間)、ペルオキシダーゼ触媒反応はニトロセルロースシート を水中の2%SDS中で洗浄することにより停止した。このウェスターン転写ア ッセイ法の対照には、正常ヒト血清の使用、ならびに抗血清と感染および非感染 細胞溶解物との反応性の並行比較が含まれる。 gp41タンパク質との結合お よびgp120サブユニットとの結合が認められた。After completion of transcription, o, oot%III/v methiolate and 0.0001Xy/ Re-incubate in PBS containing Antifoam A (Sigma). Hydrated 5% w/v skim milk powder1. Place the nitrocellulose sheet together with OOw 1. Incubate for 30 minutes at warm temperature. Serum obtained from rabbits immunized with peptide 4 Serial dilutions were then incubated with nitrocellulose sheets for 1 hour at 37°C. The nitrocellulose sheet was then treated with Tween 20 phosphate buffered saline. Washed with 1.0 Oy1 of solution (T-PBS) To examine the binding of rabbit anti-peptide antibodies, rabbit IgG (5 μg/y/) was added to the It was incubated with the cellulose sheet for 1 hour at 37°C. nitrocellulose The sheets were washed again with T-PBS and then washed with avidin-labeled horseradish. Peroxidase (AC-HRP) 1. Add ug/y1 and incubate at room temperature for 20 minutes. After washing again with T-PBS, peroxidase chromogen bisubstrate solution (PBS) 0.2xg/rt1) O-cyanisdine + 30% H2021μm/w in BS Add l>100zf to the nitrocellulose membrane until a precipitate is observed on the membrane. (10-15 minutes), the peroxidase-catalyzed reaction was carried out on a nitrocellulose sheet. was stopped by washing in 2% SDS in water. This western transcription a Control assays included the use of normal human serum, as well as antiserum and infected and uninfected samples. A parallel comparison of reactivity with cell lysates is included. Binding with gp41 protein and binding to gp120 subunit was observed.

例15.ウィルス性7、 ・ に る家 r によるポリアミド −ム ペプチ ド結ム のMljエイズおよびARCのウィルス性原因物質に対するヒト抗体の 検出のために酵素結合イムノソルベントアッセイ法(ELISA)を採用した。Example 15. Viral 7, Polyamide-mu pepti by house r development of human antibodies against the viral causative agent of AIDS and ARC Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was employed for detection.

例5の記載に従って調製したポリアミド樹脂−ベブチドロ結合体を乳鉢と乳棒で 破砕し、ホウ酸塩緩衝化食塩液(B B S )(pH8,0)中の破砕結合体 懸濁液を調製した。ペプチド6約10μg(アミノ酸組成により計算された重量 に基づく)を含有するこのエマルジョン100μpを、ダイナチック・イムノロ ン(D ynatech I mmunolon) IIミクロタイタープレー トの固相にB B S (pH8,0)中で4℃において8時間吸収させた。非 特異性部位をツイーン20リン酸塩緩衝化食塩液(T−PBS)中の10%正常 ヤギ血清(NGtS)でブロックし、次いで’IPBsで洗浄した。The polyamide resin-bebutydro conjugate prepared as described in Example 5 was prepared in a mortar and pestle. Crushed and crushed conjugate in borate buffered saline (BS) (pH 8,0) A suspension was prepared. Approximately 10 μg of peptide 6 (weight calculated based on amino acid composition) 100 μp of this emulsion containing (Dynatech I mmunolon) II Microtiter Play The solid phase was absorbed in BBS (pH 8,0) at 4° C. for 8 hours. Non The specificity site was isolated to 10% normal in Tween 20 phosphate buffered saline (T-PBS). Blocked with goat serum (NGtS) and then washed with 'IPBs.

10%NGtS中に希釈した家兎血清を次いでペプチド6コーチングしたプレー トに添加し、37℃で1時間インキュベートしたのち、T−PBSで洗浄した0 次いでベクターラボラトリーズ(カリフォルニア州バーリンゲーム)の家兎Ig Gに対するビオチン−ヤギ抗体を家兎血清と共に37℃で1時間インキュベート した。次いで各ウェルを洗浄し、ホースラディツシュペルオキシダーゼに結合し たアビジン(Av−HRP)を添加し、室温に20分聞装いた。次いで各ウェル をT−PBSで洗浄して非結合A v −HRPを除去し、1.2′−アジノー ジ(3−エチル−ベンゾチアゾリン−スルホン酸)〈シグマ・ケミカル社)の1 mM溶液および0.03%H2O2(基質として)を用いてペルオキシダーゼ活 性を測定した0反応を5%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウムにより停止したの ち、ダイナチックプレート読取装置を用いて410nmにおいて分光光度法によ り定量した。各試薬の最適希釈度は滴定により選ばれた。基質を除いて、特異的 結合を測定するための試薬はすべて10%NGtS中に希釈された0例13に記 載した樹脂結合肝炎8表面抗原を対照として用いた。結果を第4図に示す。ここ でポリアミド樹脂−ベブチドロ結合体についての結果はグラフAに示され、ポリ アミド樹脂−肝炎Bペプチド結合体についての結果はグラフBに示される。家兎 抗ペプチド抗血清は家兎no、1[・)、家兎no、2(○)から得られた。試 験はすべて三重試験法により行われ、ブラケットは数値の範囲を表わす。Rabbit serum diluted in 10% NGtS was then added to the peptide 6-coated plate. After incubating for 1 hour at 37°C, the cells were washed with T-PBS. Next, domestic rabbit Ig from Vector Laboratories (Burlingame, CA) Biotin-goat antibody against G was incubated with rabbit serum for 1 hour at 37°C. did. Each well was then washed and bound to horseradish peroxidase. Avidin (Av-HRP) was added and incubated at room temperature for 20 minutes. Then each well was washed with T-PBS to remove unbound Av-HRP, and 1,2′-azino Di(3-ethyl-benzothiazoline-sulfonic acid) (Sigma Chemical Company) 1 Peroxidase activity using mM solution and 0.03% H2O2 (as substrate) The reaction in which the properties were measured was stopped with 5% (w/v) sodium dodecyl sulfate. spectrophotometrically at 410 nm using a dynamic plate reader. was quantified. The optimal dilution of each reagent was selected by titration. Specific, except for the substrate All reagents for measuring binding were diluted in 10% NGtS as described in Example 13. Resin-bound hepatitis 8 surface antigen was used as a control. The results are shown in Figure 4. here The results for the polyamide resin-bebutydro conjugate are shown in graph A, and Results for the amide resin-Hepatitis B peptide conjugate are shown in Graph B. domestic rabbit Anti-peptide antiserum was obtained from rabbit no. 1 [·) and rabbit no. 2 (○). trial All experiments were performed using the triple test method, and brackets indicate numerical ranges.

例16.ポリアミド樹脂−ベブチドロ結合体に対する抗体によるエイズおよびA RCのウィルス 原 の 和A、HTLV−I[1の複製 家兎抗ポリアミド樹脂−ベブチドロ抗血清がインビトロでHTLV−IIの怒染 性を中和する能力を調べる前に、恣受性ヒトT@胞系におけるHTLV−1複製 の速度を調べる必要があった。HTLV−11ウイルス原液の各種希釈液を正常 ヒト血清および免疫処理筒家兎血清と共に、抗ペプチド試薬によるウィルスの中 和を調べるのに用いたと同様な方法でインキュベートした。血清と共に1時間イ ンキュベートしたのち、ティー・フォークスら(1985、ブロシ、ナショナル 、アカデ、サイ、U S A (P roe。Example 16. AIDS and A by antibodies against polyamide resin-bebutydro conjugate RC virus original Japanese A, HTLV-I [1 replication Rabbit anti-polyamide resin-bebutydro antiserum inhibits HTLV-II staining in vitro. Before examining the ability to neutralize sex, we investigated HTLV-1 replication in the human T cell system. I needed to check the speed of Various dilutions of HTLV-11 virus stock solution were tested successfully. In addition to human serum and immunized rabbit serum, anti-peptide reagents were used to remove viruses. The cells were incubated in the same manner as used to examine the sum. 1 hour with serum After incubation, T. Fawkes et al. (1985, Brosi, National , Akade, Sai, U.S.A. (Proe.

Nat’ l Acad、Sci、USA)4539−4543(1985)) に示された方法に従って維持された感受性A3.01細胞培養物にHTLV−I IIウィルス希釈液を添加した(上記文献の全体をここに参考として引用する) 。HTLV−Itlを感染させた培養物を15日間維持し、培養物からの上層液 5.8.10.12および15日1に採取した。Nat'l Acad, Sci, USA) 4539-4543 (1985)) HTLV-I in susceptible A3.01 cell cultures maintained according to the method described in II virus dilution (the above document is hereby incorporated by reference in its entirety). . Cultures infected with HTLV-Itl were maintained for 15 days, and the supernatant fluid from the cultures was Harvested on 5.8.10.12 and 15th day 1.

HT L V−I[1複製は培養上層液中に逆転写酵素(RT)活性が存在する ことにより評価された。HT L V-I [1 replication is due to the presence of reverse transcriptase (RT) activity in the culture supernatant It was evaluated by

逆転写酵素活性を測定する方法は他に詳述されている(エフ・バレシノーシら、 220サイエンス868−871 (1983)。以下に要約する。A3.01 5染培養物から得た各上層液15μpを、ウィルス希釈用緩衝液(0,05M) リス−HCJ、 p)(7,8,0,1M −NaC1,0,15wg/w1ジ チオトレイトール(DTT>、0.1%トライトンX−100)50μeを入れ たウェル数96のミクロタイタープレートに添加した。50μ!の反応混合物( 1Mトリス−1−I C&、3M−KCl、0.1.5MHCj!2.10%ト ライトン、ポリA、オリゴDTおよび3H−チミジン−トリリン酸塩(’H−T TP)を添加し、37℃で1時間インキュベートした。インキュベーションのの ち、混合物50μ!をニトロセルロース濾紙上に滴下した。この沢紙を順次、( 1)5%トリクロル酢Fi(TCA)および5%ビロリン酸ナトリウム;(2) 5%TCA、および(3)50%エタノールを入れた各ビーカー内で洗浄した。Methods for measuring reverse transcriptase activity have been described in detail elsewhere (F. Valesinosi et al. 220 Science 868-871 (1983). It is summarized below. A3.01 15μp of each supernatant obtained from the 5-stained culture was added to virus dilution buffer (0.05M). Squirrel-HCJ, p) (7,8,0,1M-NaCl1,0,15wg/w1 di Add 50 μe of thiothreitol (DTT>, 0.1% Triton X-100) The cells were added to a microtiter plate with 96 wells. 50μ! reaction mixture ( 1M Tris-1-I C&, 3M-KCl, 0.1.5MHCj! 2.10% Ryton, PolyA, Oligo DT and 3H-thymidine-triphosphate ('H-T TP) was added and incubated at 37°C for 1 hour. of incubation Hey, the mixture is 50μ! was dropped onto nitrocellulose filter paper. These many papers are sequentially ( 1) 5% trichloracetic acid Fi (TCA) and 5% sodium birophosphate; (2) Each beaker was washed with 5% TCA, and (3) 50% ethanol.

濾紙を自動シンチレーション計数管で計数し、3H−TTPのcp−を測定した 。The filter paper was counted with an automatic scintillation counter and the cp- of 3H-TTP was measured. .

HTLV−IIIウィルス原液の各種希釈液を調製するために、正常ヒト血清1 種および免疫処理面家兎血清4種を56℃で1時間加熱不活化し、0,2μ鶴の フィルターにより濾過滅菌した。1:5希釈液150JiNt!−HTI−V− I[1分離体(N Y −5)10− ’ 、10−2 。To prepare various dilutions of HTLV-III virus stock solution, normal human serum 1 Seeds and four types of immunized rabbit serum were heat-inactivated at 56°C for 1 hour, and 0.2μ crane It was sterilized by filtration using a filter. 1:5 dilution 150JiNt! -HTI-V- I [1 isolated body (N Y -5) 10-', 10-2.

10−’、10−’および10−S希釈液等容量と共に37°Cて1時間インキ ュベートした。NY−5分離体はヒトT細胞系A3.01において測定して、1 0−5単位の感染力価をもつ。インキュベーションののち、抗体処理ウィルス混 合物を10’個のA3.01細胞に添加した。Ink for 1 hour at 37°C with equal volumes of 10-', 10-' and 10-S diluents. It was incubated. The NY-5 isolate was measured in the human T cell line A3.01 to It has an infectious titer of 0-5 units. After incubation, antibody-treated virus mixture The compound was added to 10' A3.01 cells.

この混合物を37℃で1μ3/11のポリブレン(POLYBRENE)(カル ビオヘミ)の存在下に2時間インキュベートした。この恣染A、3.01細胞を 10%加熱不活化ウシつ仔血漬含有RP M1培地1112で洗浄および再懸濁 し、ウェル数24のミクロタイタープレートに分散させた。消費された培地上層 液500μeを8染後5.8.10.12および15日1に取出し、逆転写酵素 活性を測定するまで一135℃で凍結した。上層液を取出したのち各培養物にR PMI+ウシ胎仔血清500p1と補給した。各培養は二重実験法により行われ た。RT活性は取込まれた3H−T′「Pのカウント/分により測定された。This mixture was heated to 37°C using 1μ3/11 POLYBRENE (cal). biohemi) for 2 hours. This arbitrary dye A, 3.01 cells Wash and resuspend in RP M1 medium 1112 containing 10% heat-inactivated calf blood. and dispersed in a microtiter plate with 24 wells. Top layer of spent medium 500 μe of the solution was taken out on 5.8.10.12 and 15th day after 8 staining, and reverse transcriptase was added. The cells were frozen at -135°C until activity was determined. After removing the supernatant liquid, add R to each culture. Supplemented with PMI + fetal bovine serum 500p1. Each culture was performed in duplicate Ta. RT activity was measured by counts/min of 3H-T''P incorporated.

ELISA法およびウェスターンプロット法により陽性を示したヒトエイズ血清 のプールは、ドクター・トーマス・フォークス氏から入手したく免疫調節研究所 、NIAID、マリーランド州ベテスダ)。ヒト血清および家兎抗ペプチド抗血 清は前記に従って処理された。それぞれの場合、その家兎の免疫処理筒血清がH T L V−■感染性(各家兎の抗ペプチド調製物と比較したI’(T活性(c pm)により判定)の中和を示さない陰性対照として用いられた。免疫処理筒血 清および家兎抗ペプチド抗血清を前記に従ってNY−5分離体の10−1.10 −2.10−コ、10−’および10−5希釈液と共にインキュベ−1〜した。Human AIDS serum that tested positive by ELISA and Western blot methods The pool is available from Dr. Thomas Foulkes at the Immunomodulatory Research Institute. , NIAID, Bethesda, Maryland). Human serum and rabbit anti-peptide anti-blood The supernatant was processed as described above. In each case, the immunized serum of the rabbit was T L V-■ Infectivity (I' (T activity (c It was used as a negative control, showing no neutralization of the phthalate (determined by pm). Immunized tube blood 10-1.10 of the NY-5 isolate as described above. -2. Incubated with 10-co, 10-' and 10-5 dilutions.

各培養は二重実験法により行われた。感染A、3.01細胞から5.8.10. 12および15日目に上層液を取出し、−135℃で凍結し、RT活性につきア ッセイした。RT活性の抑制率(%)は次式により定められた。Each culture was performed in duplicate. Infection A, 5.8.10 from 3.01 cells. On days 12 and 15, the supernatant was removed, frozen at -135°C, and assayed for RT activity. I said yes. The inhibition rate (%) of RT activity was determined by the following formula.

cpm、抗ペプチド抗血清培養物のRTアッセイ1−−−−X100 eplm、免疫処理筒血清培養物のRTアッセイ抑制率を計算する前に200〜 750cpmのバックグラウンドカウント数を各測定値から差引いた。cpm, RT assay of anti-peptide antiserum cultures 1---X100 eplm, 200 to 200 before calculating the RT assay inhibition rate of immunotreated tube serum cultures. A background count of 750 cpm was subtracted from each measurement.

HTLV−II[の4種の希釈液(A、10−’;BJO−2;C,10−’; D。Four dilutions of HTLV-II [A, 10-'; BJO-2; C, 10-'; D.

1O−4)ノ反応速度(8染t& 5 、8.10.12オよび15日目のR′ F活性に基づく)を第5図に示す。曲線上の各点は二重実験法により行った5回 の異なる測定に基づく3H−TTP取込みの平均cpmを表わす。範囲を示すバ ーは平均値の標準誤差を意味する。1O-4) reaction rate (8 dye t & 5, 8.10.12 o and R' on the 15th day (based on F activity) is shown in FIG. Each point on the curve is 5 times performed using the double experimental method. represents the average cpm of 3H-TTP uptake based on different measurements of . A bar indicating the range - means standard error of the mean.

10−Iおよび10″2に希釈されたH T L V−IIIの有意の複製は感 染f!10日目ま7起こらなかった。12日目にはこれらのウィルスし活発な複 製を示し、15日目までにはRT活性が低下し、これらのHTLV−III希釈 液が感受性標的細胞に対して細胞溶解活性をもつことを示した。HTLV−Iの 10−3希釈液の複製は12および15日目に観察されたが、ウィルスの10− 4希釈液は15日目までですらほとんどまたは全(複製を示さなかった。200 epm以下を示した12の測定値くすべてのウィルス希釈液につき5および8日 目、10−3および10− ’希釈液につき10日目、ならびに10−4希釈液 につき12および15日目)のうち11が平均値ep1mよりも大きいかまたは それに等しい平均値の標準偏差および標準誤差を示したという事実に基づいて、 2000cpm以上の3H−取込みの読みをHTLV−I[1複製の指示として 選んだ。Significant replication of HTL V-III diluted to 10-I and 10″2 Dye f! It didn't happen on the 10th day. By the 12th day, these viruses are actively replicating. By day 15, RT activity decreased, and these HTLV-III dilutions The fluid was shown to have cytolytic activity against sensitive target cells. HTLV-I Replication of the 10-3 dilution was observed on days 12 and 15, whereas the 10-3 dilution of the virus 4 dilutions showed little or no replication even by day 15.200 5 and 8 days for all virus dilutions with 12 measurements showing below epm. Day 10 for 10-3 and 10-' dilutions, and 10-4 dilutions 11 of 12 and 15 days) are greater than the mean value ep1m or Based on the fact that we have shown the standard deviation and standard error of the mean equal to 3H-incorporation readings of 2000 cpm or more were measured using HTLV-I [1 as an indication for replication. I chose.

平均値の標準偏差および標準誤差がそれらの希釈液における平均値cp輸と等し いかまたはそれを越えるという所見は、個々のeplm値がきわめて変動性であ ること、および低いRT活性が特異的中和または単にRTアッセイのランダム変 動のいずれに起因するかを判断するのが困難であることを示していた。圧倒的に 多量の感染性ピリオンが存在する場合、抗体はウィルスを効果的に中和し得ない 可能性がある。HTLV−1[1ウイルス原液の速度論的研究および性質に基づ いて、ヒトおよび家兎抗ペプチド抗血清によるHTLV−I[[の感染性の中和 は、HTLV−■の10−1および10−2希釈液についてはto、tzおよび 15日目、10弓希釈液については12および15日目であろうと判定された。The standard deviation and standard error of the mean are equal to the mean cp transfer in those dilutions. The finding that individual eplm values are highly variable and that low RT activity is due to specific neutralization or simply random variation of the RT assay. This indicated that it was difficult to determine which of the following actions was attributable to the problem. overwhelmingly Antibodies cannot effectively neutralize the virus when large numbers of infectious pilions are present there is a possibility. Based on kinetic studies and properties of HTLV-1 [1 virus stock] Neutralization of infectivity of HTLV-I by human and rabbit anti-peptide antisera are to, tz and for 10-1 and 10-2 dilutions of HTLV-■. Day 15 was determined to be day 12 and day 15 for the 10-bow dilution.

B、 ペプチド 血゛の中和 表Vに示す結果により表わされるように、家兎n011から得たポリアミド樹脂 −ペプチドロ結合体に対する抗血清は、エイズ患者からプールしたヒト血清に匹 敵して、ウィルスの10−1および10−2双方の希釈液において10日目にH TLV−Illの複製を効果的に低下させた。このペプチドに対するno、2の 家兎の血清はHTLV−I[1の複製を低下させることができず、RTアッセイ 全体において対照抗血清として用いられた。この家兎は同様の免疫原を受け、検 出可能な抗ペプチド反応を示したにもかかわらず、この抗血清には抗HT L  V−■活性は放射性標識免疫沈澱法により検出されなかった。HTLV−Ill を中和した抗血清はgp120およびgp160エンベロープ糖タンパク質を双 方とも検出しな。家兎no、1抗血清はヒトエイズ血清と比較して、12および 15日目にはHTLV−IIIを中和する効力がより低いことが認められた。R T活性の低下率は12日目までにウィルスの10−1および10−2希釈液につ いて90%以上(10日目)からそれぞれ23および45%に低下した。ウイJ レスが@薄であるほど12日目におけるRT活性の低下は大きく、抗血清の中和 能はウィルスの量に依存することが示された。B. Peptide blood neutralization Polyamide resin obtained from domestic rabbit n011, as shown by the results shown in Table V. - Antisera against peptidoloconjugates are comparable to pooled human sera from AIDS patients. In contrast, H on day 10 in both 10-1 and 10-2 dilutions of virus. Effectively reduced TLV-Ill replication. no, 2 for this peptide Rabbit serum failed to reduce HTLV-I[1 replication and RT assay It was used as a control antiserum throughout. This rabbit received a similar immunogen and was tested. Despite showing a possible anti-peptide reaction, this antiserum contained anti-HTL. No V-■ activity was detected by radiolabeled immunoprecipitation. HTLV-Ill The antiserum neutralized both gp120 and gp160 envelope glycoproteins. Don't detect either one. Rabbit no. 1 antiserum has 12 and 1 antisera compared with human AIDS serum. Lower efficacy in neutralizing HTLV-III was observed on day 15. R The rate of decline in T activity decreased by day 12 for 10-1 and 10-2 dilutions of virus. and decreased from over 90% (on day 10) to 23 and 45%, respectively. Ui J The weaker the response, the greater the decrease in RT activity on the 12th day, and the neutralization of antiserum. The efficacy was shown to be dependent on the amount of virus.

ポリアミド樹脂−ベブチドロ結合体に対する家兎抗血清は双方とも10日目に1 0−2ウイルス希釈液を中和した。しかしいずれもヒトエイズ患者から得た血清 または家兎抗ポリアミド樹脂−ベブチドロ結合体と比較した場合、より高濃度の ウィルス(10−’ )を中和するに当たりさほど有効でなかった。家兎n03 3は10−3ウイルス希釈液を12および15日目の双方において効果的に中和 した(95%以上)。家兎no、4から15日目に得た抗血清については、RT 活性の低下は得られなかった。これは家兎n013は家兎no、 4ど比較して HTLV−11[に対しより高い抗体価を示したという事実に反映されるであろ う、15日目にはいずれの抗血清についても高濃度のウィルスに対してRT活性 低下は認められなかった。これは培養物中に8染性ウイルスが存在し、抗血清が この時点ではウィルスの複製を抑制するのに有効でなかったことを示す、ヒトエ イズ患者および家兎no、3から得た抗血清は双方とも、15日目にウィルスの 10−3希釈液についてRT活性を抑制した。対照家兎抗血清(KLHに結合し た非HTLV−■エンベロープ糖タンパク質、および肝炎8表面抗原など、対照 の樹脂結合ペプチド調製物に対して産生されたもの)は、インビトロ中和試験に 用いたと同様な希釈度において、有意のRT活性抑制を示さなかった(25%以 下)。Both rabbit antisera against the polyamide resin-bebutydro conjugate showed 1 on day 10. 0-2 virus dilution was neutralized. However, both serum samples were obtained from human AIDS patients. or a higher concentration of rabbit anti-polyamide resin-bebutydro conjugate. It was not very effective in neutralizing the virus (10-'). Rabbit n03 3 effectively neutralized the 10-3 virus dilution on both days 12 and 15. (more than 95%). For antisera obtained from rabbit no. 4 to 15 days, RT No decrease in activity was observed. This is a comparison of rabbit n013 and rabbit no.4. This may be reflected in the fact that they showed higher antibody titers against HTLV-11. On day 15, all antiserum showed RT activity against high concentration of virus. No decrease was observed. This is due to the presence of 8-infectious virus in the culture and the presence of antiserum. In humans, this indicates that the virus was not effective at inhibiting viral replication at this time. Both antisera obtained from a patient with I.D. and rabbit no. RT activity was suppressed for the 10-3 dilution. Control rabbit antiserum (binds to KLH) Controls such as non-HTLV-■ envelope glycoprotein and hepatitis 8 surface antigen (produced against resin-bound peptide preparations) were tested for in vitro neutralization. At similar dilutions used, no significant inhibition of RT activity was observed (more than 25%). under).

表 ■ ヒト 家 兎 RT活性低下率 (10日目) 10−’ 98% 96% 0% 0% 0%10−” 97% 94% 0%  90% 97%1O−3nd nd nd nd ndRT活性低下率 (1 2日目) 10−’ 91% 23% 0% 0% 0%10−297% 45% 0%  67% 67%10弓 100% 70% 0% 100% nd′LRT活性 低下率 (15日7) 10伺 0% 0% 0% 0% 0%10−20% 0% 0% 0% 0% 90% 24% 0% 95% 0% a その培養物における3H取込みのcpIII数が2000c−以下であRT ゛・・は′I されtかった 例17.エイズまたはARCの衿 のためのアッセイ: 体の検出不溶性支持体 マトリックスを前記例5の記載に従って調製したポリアミド樹脂−合成ペプチド 結合体各5μgにより、ホウ酸塩緩衝化食塩液(B B S )(pH8,0> 中で4℃において8時間コーチングする(あるいはマトリックスを37℃で1時 間コーチングすることもできる)。結合体を10%正常ヤギ血清(NGtS)で 20分間ブロックし、ツイーン20リン酸塩緩衝化食塩液(T−PBS)で3回 洗浄する。エイズおよび/またはARCのウィルス性原因物質に対する抗体を含 有する疑いのある血清試料を添加し、37℃で1時間インキュベートする。支持 体マトリックスをT−PBSで3回洗浄し、ビオチン標識付きヤギ抗ヒトエ8( 10%NGtS中、5胃g/wlの1コ1000、ベクター・ラボズ、カリフォ ルニア州バーリンゲーム)を添加する。マトリックスをT−PBSで3回洗浄し 、’5H/ylアビジンーホースラディツシュベルオキシダーゼの1 :200 0を添加し、室温で20分間インキュベートする。マトリックスeT−PBSで 3回洗浄し、基質、すなわち2,2′−アジノジー(3−エチルベンゾチアゾリ ンスルホン酸)(ABTS)のジアンモニウム塩を820□と共に添加する。酵 素反応を10%SDSで停止し、例15の記載に従って光学濃度を410nmに おいて読取る。Table ■ human rabbit RT activity reduction rate (10th day) 10-' 98% 96% 0% 0% 0%10-'' 97% 94% 0% 90% 97% 1O-3nd nd nd nd ndRT activity reduction rate (1 2nd day) 10-’ 91% 23% 0% 0% 0% 10-297% 45% 0% 67% 67% 10 bow 100% 70% 0% 100% nd'LRT activity Decrease rate (15th 7th) 10 inquiries 0% 0% 0% 0% 0% 10-20% 0% 0% 0% 0% 90% 24% 0% 95% 0% a If the cpIII number of 3H incorporation in the culture is below 2000 c- ゛...was 'I Example 17. Assay for AIDS or ARC collar: Body detection insoluble support Polyamide resin-synthetic peptide matrix prepared as described in Example 5 above. 5 μg of each conjugate was added to borate buffered saline (BBS) (pH 8.0> coat for 8 hours at 4°C (or coat the matrix for 1 hour at 37°C). coaching is also available). Conjugates were prepared in 10% normal goat serum (NGtS). Block for 20 min and 3 times with Tween 20 phosphate buffered saline (T-PBS). Wash. Contains antibodies against the viral causative agents of AIDS and/or ARC. Add the suspected serum sample and incubate for 1 hour at 37°C. support The body matrix was washed three times with T-PBS and biotin-labeled goat anti-Humanoid 8 ( 1 part 1000 of 5 stomach g/wl in 10% NGtS, Vector Labs, Califor Burlingame, Lunia). Wash the matrix 3 times with T-PBS ,'5H/yl avidin-horseradish oxidase 1:200 0 and incubate for 20 minutes at room temperature. Matrix eT-PBS Wash three times and remove the substrate, i.e. 2,2'-azinodi(3-ethylbenzothiazoli). Add the diammonium salt of sulfonic acid (ABTS) along with 820□. fermentation The elementary reaction was stopped with 10% SDS and the optical density was adjusted to 410 nm as described in Example 15. and read it.

例18.エイズまたはARCの衿 のためのアッセイ:2、のエイズ抗原の存在 を検出するために、例5の記載に従って調製したポリアミド樹脂−ペプチド結合 体1種または2種以上により実験動物を免疫処理することによって産生された抗 体で固相マトリックスをコーチングし、前記に従って抗体をブロックし、洗浄す る。次いで、エイズまたはARCウィルス性原因物質物質有する疑いのある生物 学的流体試料を添加し、洗浄する。Example 18. Assay for AIDS or ARC collar: 2. Presence of AIDS antigen A polyamide resin-peptide bond prepared as described in Example 5 for the detection of Antibiotics produced by immunizing experimental animals with one or more Coat the solid phase matrix with the body, block the antibody and wash as described above. Ru. Next, organisms suspected of having AIDS or ARC viral causative agents Add biological fluid sample and wash.

アッセイは直接結合アッセイ法として、または抑制アッセイ法として行うことが できる。直接結合アッセイを行う場合、前記に従って産生されたエイズおよび7 才たはARCに対するビオチン標識付き抗体を添加し、洗浄する。次いでアビジ ン標識付き酵素を前記に従って添加し、洗浄し、前記により基質を添加する。反 応を停止し、光学濃度を読取る。Assays can be performed as direct binding assays or as inhibition assays. can. When performing direct binding assays, AIDS and 7 produced as described above A biotin-labeled antibody against ARC or ARC is added and washed. Then Abhiji The labeled enzyme is added as described above, washed, and the substrate is added as described above. anti Stop the reaction and read the optical density.

抑制アッセイ法として行う場合、ビオチン標識付き抗体をエイズウィルスに添加 する代わりに、ビオチン標識付きペプチドを添加し、不溶性支持体マトリックス を洗浄する。次いでアビジン標識付き酵素を添加し、洗浄する。基質を添加し、 反応を停止し、光学濃度を読取る。ヒトまたはチンパンジーエイズ含有血清から 得たIgGをワットマンDE−52アニオン交換カラム上でのイオン交換クロマ トグラフィーにより精製する。家兎抗ペプチドから得たIgGをタンパク質A− セファロース4Bカラム(ファルマシア)により精製する。ビオチン−N−ヒド ロキシスクシンアミドエステル(ベーリンガー・マンハイム)を用いてIgGを ビオチニル化する。When performed as an inhibition assay, biotin-labeled antibodies are added to the AIDS virus. Instead, add biotin-labeled peptide and insoluble support matrix. Wash. Next, an avidin-labeled enzyme is added and washed. Add substrate; Stop the reaction and read the optical density. From human or chimpanzee AIDS-containing serum The obtained IgG was subjected to ion exchange chromatography on a Whatman DE-52 anion exchange column. Purify by chromatography. IgG obtained from rabbit anti-peptide was used as protein A- Purify by Sepharose 4B column (Pharmacia). Biotin-N-hydro IgG using roxysuccinamide ester (Boehringer Mannheim) Biotinylate.

例19.エイズおよびARCに・ る預」実験動物にエイズおよびARCのウィ ルス性原因物質に対する予防接種を行うために、前記例5の記載に従って合成ペ プチド】−9をポリアミド樹脂上で合成する。ポリアミド樹脂−合成ペプチド結 合体、または数種の結合体の混き物を、アジュバントとしてのみょうばん中10 0〜1000μgの合成ペプチドの巨丸剤として動物に注入する。筋肉内または 皮下に沼週に、ウィルスに対する測定可能な反応が検出されるまで、別個に3回 注入する。他の間隔、たとえば0,1および6が月を合成ペプチドの注入のため に採用してもよい。Example 19. AIDS and ARC care in experimental animals In order to vaccinate against the viral causative agent, synthetic antibiotics were prepared as described in Example 5 above. [Petide]-9 is synthesized on polyamide resin. Polyamide resin-synthetic peptide bond 10 in alum as an adjuvant, or a mixture of several conjugates. Animals are injected as a bolus of 0-1000 μg of synthetic peptide. intramuscular or subcutaneously on three separate occasions per week until a measurable response to the virus is detected. inject. Other intervals, e.g. 0, 1 and 6 months, for injection of synthetic peptides may be adopted.

例20.想 エイズワク ンのスクリーニング本発明の合成ペプチドは潜在的な エイズワクチン候補が被験動物において免疫原反応を誘導する効力についてスク リーニングするためにも使用できる。ポリアミド樹脂−合成ペプチド結合体1種 または2種辺上を、前記例15の記載に従って不溶性マトリックスにコーチング する。次いでワクチン候補を上記ペプチドに対する抗体(ビオチン標識したもの 、またはしないもの)と共にインキュベートする。ビオチン標識されている場合 、アビジン酵素を添加する。標識されていない場合、ビオチン抗動物種抗体、た とえばビオチンヤギ抗家兎IgGを添加し、光学濃度を読取って、ワクチン候補 がペプチドの結合をブロックする効力を判定する。Example 20. Screening for AIDS vaccines The synthetic peptides of the present invention have potential Screening for the efficacy of AIDS vaccine candidates in inducing immunogenic responses in test animals. It can also be used for leaning. One type of polyamide resin-synthetic peptide conjugate or coated on an insoluble matrix as described in Example 15 above. do. Next, the vaccine candidate is treated with an antibody (biotin-labeled) against the above peptide. , or without). If biotinylated , add avidin enzyme. If unlabeled, biotin anti-species antibody, For example, add biotin goat anti-rabbit IgG, read the optical density, and determine the vaccine candidate. determine the efficacy of blocking peptide binding.

以上の例は例示のために提示したものであり、限定のためのものではない。これ らの方法の変更は当業者に自明で・あり、以下の請求の範囲に記載される本発明 の精神および範囲から逸脱することなくこの種の変更をいずれもなしうると思わ れる。The above examples are presented for purposes of illustration and not limitation. this Modifications to these methods will be obvious to those skilled in the art and may be incorporated into the invention as set forth in the claims below. We believe that any changes of this kind can be made without departing from the spirit and scope of the It will be done.

浄書(内容に亡zなし) AA# AAコ−r HJ1缶 H−F−ihr−7vp AA POS、 + h 8親水性プロv1・ v−1(17,2 LAV 1−ITLV−Hl ”■−2浄@(内容に亡ゴなしア 坑=厖か噂釈番の隻蚊 手続補正書 昭和63年6月を日 1、事件の表示 PCT/US 87101733 2、発明の名称 AIDSおよびA)ぢウィルス原因物質に対して免疫化するための組成物および 方法3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 名 称 サウスウエスト・ファウンデーション・フォー・バイオメディカル・リ サーチ 電話(270)−6641〜6 5、補正の対象 浄書した明細書及び請求の範囲の翻訳文6、補正の内容 手続補正書Engraving (no discrepancies in content) AA# AA Co-r HJ1 can H-F-ihr-7vp AA POS, + h 8 Hydrophilic Pro v1・ v-1(17,2 LAV 1-ITLV-Hl ”■-2 Jyo@(Contents are missing) A pit = a gully or a rumor-monger. Procedural amendment Date: June 1986 1.Display of the incident PCT/US 87101733 2. Name of the invention Compositions for immunizing against AIDS and A) virus causative agents and Method 3: Person making the correction Relationship to the incident: Patent applicant address Name: Southwest Foundation for Biomedical Research search Phone (270)-6641~6 5. Subject of correction Translation of the written specification and claims 6, contents of amendments Procedural amendment

Claims (14)

【特許請求の範囲】[Claims] 1.HTLV−III、ARVまたはLAVの8p120またはgp41外被糖 タンパク質のアミノ酸配列の一部に相同な配列を有し且つその中に親水領域を含 むアミノ酸鎖から成る合成ペプチドおよびポリアミド樹脂から成る、AIDSお よびARCのウイルス原因物質に対して免疫応答を誘発しうる組成物。1. 8p120 or gp41 coat sugar of HTLV-III, ARV or LAV It has a sequence homologous to a part of the amino acid sequence of a protein and contains a hydrophilic region. AIDS and synthetic peptides consisting of amino acid chains and polyamide resins. and a composition capable of inducing an immune response against a viral causative agent of ARC. 2.前記アミノ酸鎖はβターンを含む、請求の範囲第1項記載の組成物。2. 2. The composition of claim 1, wherein the amino acid chain includes a β turn. 3.前記ポリアミド樹脂は架橋されたポリジメチルアクリルアミド樹脂である、 請求の範囲第1項記載の組成物。3. the polyamide resin is a crosslinked polydimethylacrylamide resin; A composition according to claim 1. 4.前記アミノ酸鎖はリンカーを介して前記ポリアミド樹脂に結合される、請求 の範囲第1項記載の組成物。4. Claim: the amino acid chain is attached to the polyamide resin via a linker. The composition according to item 1. 5.前記リンカーはオキシアルキル安息香酸誘導体である、請求の範囲第4項記 載の組成物。5. Claim 4, wherein the linker is an oxyalkylbenzoic acid derivative. composition. 6.HTLV−III、ARVまたはLAVのgp120またはgp41外被糖 タンパク質の一部に相同な配列を有し且つその中に親水領域を含むアミノ酸鎖か ら成るペプチドをポリアミド樹脂上で合成し、そして免疫原として有効な量のポ リアミド樹脂−ペプチド複合体を実験動物に投与することから成る、AIDSお よびARCのウイルス原因物質に対して実験動物を免疫化する方法。6. gp120 or gp41 coat sugar of HTLV-III, ARV or LAV An amino acid chain that has a sequence homologous to a part of a protein and contains a hydrophilic region within it. A peptide consisting of AIDS and anti-inflammatory drug therapy, which consists of administering a lyamide resin-peptide complex to laboratory animals. and a method of immunizing laboratory animals against the viral causative agent of ARC. 7.前記ポリアミド樹脂−ペプチド複合体は薬剤学的に許容される希釈剤と共に 前記動物に投与される、請求の範囲第6項記載の方法。7. The polyamide resin-peptide complex is combined with a pharmaceutically acceptable diluent. 7. The method of claim 6, wherein the method is administered to the animal. 8.前記希釈剤はさらにアジュバントを含む、請求の範囲第7項記載の方法。8. 8. The method of claim 7, wherein the diluent further comprises an adjuvant. 9.前記希釈剤は蒸留水または中佐pH緩衝液である、請求の範囲第7項記載の 方法。9. Claim 7, wherein the diluent is distilled water or a pH buffer solution. Method. 10.ポリアミド樹脂−合成ペプチド複合体を特異的結合対のリガンドに結合さ せ、その際前記結合対は前記リガンドと該リガンドに対して特異的親和性を有す る抗リガンドから成り、そして前記合成ペプチドはHTLV−III、ARVま たはしAVのgp120またはgp41外被糖タンパク質の一部に相同な配列を 有するアミノ酸鎖から成り; 前記複合体を動物からの血清と接触させ、それにより前記血清中のAIDSまた はARCのウイルス原因物質に対する抗体も前記複合体に結合させ;そして その後結合した抗体を前記特異的結合対の抗リガンドと接触させる; ことから成るAIDSおよびARCのウイルス原因物質に対する抗体の検出方法 。10. A polyamide resin-synthetic peptide complex is attached to a specific binding pair of ligands. wherein said binding pair has a specific affinity for said ligand. and the synthetic peptide consists of an anti-ligand such as HTLV-III, ARV or A sequence homologous to part of the gp120 or gp41 coat glycoprotein of Tahashi AV Consists of an amino acid chain with; The complex is contacted with serum from an animal, thereby eliminating AIDS or AIDS in the serum. also binds to the complex an antibody against the viral causative agent of ARC; and then contacting the bound antibody with the anti-ligand of said specific binding pair; A method for detecting antibodies against viral causative agents of AIDS and ARC, comprising: . 11.前記リガンドは酵素であり、そして前記抗リガンドは該酵素に特異的な基 質である、請求の範囲第10項記載の方法。11. The ligand is an enzyme, and the antiligand is a group specific to the enzyme. 11. The method of claim 10, wherein the method is: 12.前記酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼであり、そして前記基質は過酸化 水素である、請求の範囲第11項記載の方法。12. The enzyme is horseradish peroxidase and the substrate is peroxidase. 12. The method of claim 11, wherein the hydrogen is hydrogen. 13.前記リガンドは抗体であり、そして前記抗リガンドは該抗体に特異的な抗 原である、請求の範囲第10項記載の方法。13. The ligand is an antibody, and the anti-ligand is an anti-ligand specific for the antibody. 11. The method according to claim 10, wherein the method is an original. 14.前記リガンドは抗原であり、そして抗リガンドは該抗原に特異的な抗体で ある、請求の範囲第10項記載の方法。14. The ligand is an antigen, and the antiligand is an antibody specific for the antigen. 11. The method of claim 10.
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