JP7406291B1 - Plant extracellular vesicles, their preparation methods and uses - Google Patents
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Abstract
【課題】植物細胞外小胞を単離するための新たな原料を提供すること、及びその原料から植物細胞外小胞を調製する方法を提供すること。【解決手段】植物が気体中に放出した細胞外小胞を単離する。一態様において、植物の蒸散物から、該植物の細胞外小胞を単離する。植物の蒸散物には、細胞外小胞が豊富に含まれる一方、植物細胞体由来の成分がほとんど混入していないため、簡便な操作で、高純度の植物細胞外小胞を回収することが可能である。【選択図】なしThe present invention provides a new raw material for isolating plant extracellular vesicles, and a method for preparing plant extracellular vesicles from the raw material. SOLUTION: Extracellular vesicles released into the gas by plants are isolated. In one embodiment, extracellular vesicles of the plant are isolated from the plant's transpiration. Although plant transpiration contains abundant extracellular vesicles, it contains almost no components derived from plant cell bodies, making it possible to collect highly pure plant extracellular vesicles with simple operations. It is possible. [Selection diagram] None
Description
本発明は、植物細胞外小胞、その調製方法及び用途に関する。 The present invention relates to plant extracellular vesicles, their preparation methods and uses.
細胞外小胞は細胞から分泌される脂質二重膜からなる小胞である。1980年代ごろから，さまざまな細胞が小胞を分泌することが観察されており、これらの小胞は、大きさや細胞の期限等により、エクソソーム、エクトソーム、マイクロベシクル、シェディングベシクル、オンコソーム、プロスタソームなど、さまざまな名称で呼ばれてきた。International Society for Extracellular Vesicles（ISEV）では、これら細胞から分泌される小胞の総称として細胞外小胞（extracellular vesicle）の使用を推奨している。 Extracellular vesicles are vesicles secreted from cells and composed of a lipid bilayer membrane. Since the 1980s, it has been observed that various cells secrete vesicles, and these vesicles can be classified into exosomes, ectosomes, microvesicles, shedding vesicles, oncosomes, and prostasomes, depending on their size and cell age. It has been called by various names. The International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) recommends the use of extracellular vesicles as a general term for vesicles secreted from these cells.
1990年代にはエクソソームは機能をもつ小胞であることが判明していたものの、長いあいだ、エクソソームは細胞にとり不要なものを詰めて外に捨てるためのゴミ袋だと考えられてきた。しかし，2007年、エクソソームはmiRNAおよびmRNAを含み，それらは細胞のあいだを輸送されることが明らかにされた（非特許文献1)。さらに、3つの研究グループにより同時に、エクソソームに含まれるmiRNAが細胞の間を輸送され、輸送された先の細胞において機能することが明らかにされた（非特許文献2～4)。同じころには、血液に存在するmiRNAを疾患の診断法に利用するという論文が発表されており、これ以降、エクソソームに関する研究が飛躍的に発展した。 Although it was discovered in the 1990s that exosomes are functional vesicles, for a long time they were thought to be garbage bags for cells to fill with things they don't need and throw them away. However, in 2007, it was revealed that exosomes contain miRNA and mRNA, which are transported between cells (Non-Patent Document 1). Furthermore, three research groups simultaneously revealed that miRNAs contained in exosomes are transported between cells and function in the cells to which they are transported (Non-patent Documents 2 to 4). Around the same time, a paper was published on the use of miRNA present in the blood as a diagnostic method for diseases, and since then, research on exosomes has made rapid progress.
植物についても細胞外小胞が存在することは知られているが、動物由来の細胞外小胞に対して、論文の数が限定的であり、機能解析も進んでいない。植物の細胞外小胞の報告は1960年代からあるが、植物細胞がエクソソームを分泌するのが報告されたのは2007年である（非特許文献5）。近年では、様々な食用のフルーツや野菜から細胞外小胞が単離され、様々な疾患に対する治療や、薬物送達媒体への転用への応用が研究されている。しかしながら、フルーツや野菜には、細胞外小胞以外の成分が大量に含まれていて、大量の不純物から細胞外小胞を精製しなければならないため、不純物の混入が少なく、精製を簡便に行うことが可能な、植物細胞外小胞の原料が望まれる。植物の細胞外小胞も、動物の細胞外小胞と同様に、様々なタンパク質や核酸（DNA, mRNA, miRNA, non-coding RNA）を含み、細胞間コミュニケーションを媒介していると考えられているが、その詳細なメカニズムの解析はこれからである。 Although it is known that extracellular vesicles exist in plants, the number of papers regarding extracellular vesicles derived from animals is limited, and functional analysis has not progressed. Although there have been reports of extracellular vesicles in plants since the 1960s, it was not until 2007 that plant cells secreted exosomes (Non-Patent Document 5). In recent years, extracellular vesicles have been isolated from various edible fruits and vegetables, and their applications in the treatment of various diseases and as drug delivery vehicles are being investigated. However, fruits and vegetables contain large amounts of components other than extracellular vesicles, and extracellular vesicles must be purified from a large amount of impurities. A raw material for plant extracellular vesicles that can be used is desired. Plant extracellular vesicles, like animal extracellular vesicles, contain various proteins and nucleic acids (DNA, mRNA, miRNA, non-coding RNA) and are thought to mediate intercellular communication. However, the detailed mechanism has yet to be analyzed.
一方、森林浴は、身体によいとされており、諸外国では森林浴セラピーや自然療法として、森林浴が実際に医療の現場で実用化されている。森林浴には、ストレスホルモン減少、副交感神経活動の活発化、交感神経活動の抑制、血圧や脈拍の低下、免疫力向上等の効果が期待されている。森林浴が人体にもたらす有益な効果は、フィトンチッドと呼ばれる樹木が作り出して放出している物質によるものであると考えられている。フィトンチッドは、テルペンと呼ばれる有機化合物で構成されている。フィトンチッドは体をリフレッシュするだけではなく抗菌、防虫、消臭などの様々な効果を有することが報告されている。しかしながら、樹木が放出する他の物質については、ほとんど報告がない。 On the other hand, forest bathing is said to be good for the body, and in many countries, forest bathing is actually put into practical use in medical settings as a form of forest bathing therapy or natural therapy. Forest bathing is expected to have effects such as reducing stress hormones, increasing parasympathetic nerve activity, suppressing sympathetic nerve activity, lowering blood pressure and pulse rate, and improving immunity. The beneficial effects that forest bathing has on the human body are thought to be due to substances produced and released by trees called phytoncides. Phytoncides are composed of organic compounds called terpenes. It has been reported that phytoncides not only refresh the body but also have various effects such as antibacterial, insect repellent, and deodorizing effects. However, there are few reports on other substances emitted by trees.
本発明は、植物細胞外小胞を単離するための新たな原料を提供すること、及びその原料から植物細胞外小胞を調製する方法、及びその細胞外小胞の用途を提供することを目的とする。 The present invention aims to provide a new raw material for isolating plant extracellular vesicles, a method for preparing plant extracellular vesicles from the raw material, and a use of the extracellular vesicle. purpose.
本発明者らは上記課題を解決するべく鋭意検討したところ、驚くべきことに、植物が気体中に細胞外小胞を放出していることを見出した。植物の蒸散物には、細胞外小胞が豊富に含まれる一方、植物細胞体由来の成分の混入が少ないため、植物の蒸散物から、簡便な操作で、高純度の細胞外小胞を回収することができた。植物が生息する地域の環境水からも植物細胞外小胞を回収することができた。回収した細胞外小胞から多様なmiRNAが同定された。これらの知見から、植物細胞外小胞が森林浴においてヒトが浴びる主要な成分の一つであることが示唆された。本発明者らは、これらの知見に基づき、更に検討を進め、本発明を完成した。 The present inventors conducted extensive studies to solve the above problems, and surprisingly discovered that plants release extracellular vesicles into the gas. Although plant transpiration contains abundant extracellular vesicles, there is little contamination with components derived from plant cell bodies, so highly pure extracellular vesicles can be recovered from plant transpiration with a simple operation. We were able to. Plant extracellular vesicles could also be recovered from environmental water in areas where plants live. Various miRNAs were identified from the collected extracellular vesicles. These findings suggest that plant extracellular vesicles are one of the main components that humans are exposed to during forest bathing. Based on these findings, the present inventors conducted further studies and completed the present invention.
即ち、本発明は以下に関する。
［1］植物が気体中に放出した単離された植物細胞外小胞。
［2］miRNAを含有する、［1］の植物細胞外小胞。
［3］全RNAに対する長さ200塩基以下のRNAの重量比百分率で定義される細胞外小胞の純度が70wt%以上である、［1］又は［2］の植物細胞外小胞。
［4］植物の蒸散物から単離されたものである、［1］～［3］のいずれかの植物細胞外小胞。
［5］植物が生息する地域の環境水から単離されたものである、［1］～［3］のいずれかの植物細胞外小胞。
［6］植物が気体中に放出した細胞外小胞を単離することを含む、植物細胞外小胞の調製方法。
［7］植物の蒸散物から該植物の細胞外小胞を単離することを含む、［6］の調製方法。
［8］植物の蒸散物を遠心分離、カラムクロマトグラフィー、又は限外濾過に付し、植物細胞外小胞を含む画分を回収することを含む、［7］の調製方法。
［9］回収した画分が植物細胞外小胞を含むことを確認することを含む、［8］の調製方法。
［10］植物が生息する地域の環境水から該植物が気体中に放出した細胞外小胞を単離することを含む、［6］の調製方法。
［11］［1］～［5］のいずれかの植物細胞外小胞を含む組成物。
［12］凍結乾燥組成物である、［11］の組成物。
［13］植物細胞外小胞を含む、森林浴の疑似体験用組成物。
［14］香料を更に含む、［13］の組成物。
［15］香料がテルペン又は植物精油である、［14］の組成物。
［16］植物細胞外小胞を散布することを含む、森林浴の疑似体験方法。
［17］香料を散布することを更に含む、［16］の方法。
［18］香料がテルペン又は植物精油である、［17］の方法。
［19］空気1m3あたり107個以上の植物細胞外小胞を散布する、［16］～［18］のいずれかの方法。
That is, the present invention relates to the following.
[1] Isolated plant extracellular vesicles released into the gas by plants.
[2] The plant extracellular vesicle of [1] containing miRNA.
[3] The plant extracellular vesicle according to [1] or [2], wherein the purity of the extracellular vesicle, defined as the weight ratio of RNA with a length of 200 bases or less to total RNA, is 70 wt% or more.
[4] The plant extracellular vesicle according to any one of [1] to [3], which is isolated from plant transpiration.
[5] The plant extracellular vesicle according to any one of [1] to [3], which is isolated from the environmental water of the region where the plant inhabits.
[6] A method for preparing plant extracellular vesicles, the method comprising isolating extracellular vesicles released by the plant into a gas.
[7] The preparation method of [6], which comprises isolating extracellular vesicles of the plant from the plant's transpiration.
[8] The method for preparing [7], which comprises subjecting plant transpiration to centrifugation, column chromatography, or ultrafiltration and collecting a fraction containing plant extracellular vesicles.
[9] The preparation method of [8], which includes confirming that the collected fraction contains plant extracellular vesicles.
[10] The preparation method of [6], which comprises isolating extracellular vesicles released into the gas by the plant from the environmental water of the area where the plant inhabits.
[11] A composition comprising the plant extracellular vesicle according to any one of [1] to [5].
[12] The composition of [11], which is a lyophilized composition.
[13] A composition for a simulated forest bathing experience containing plant extracellular vesicles.
[14] The composition of [13], further comprising a fragrance.
[15] The composition of [14], wherein the fragrance is a terpene or a plant essential oil.
[16] A method to simulate forest bathing, including spraying plant extracellular vesicles.
[17] The method of [16], further comprising spraying a fragrance.
[18] The method of [17], wherein the fragrance is a terpene or a plant essential oil.
[19] Any method of [16] to [18], in which 10 7 or more plant extracellular vesicles are sprayed per 1 m 3 of air.
本発明により、植物が気体中に放出した単離された植物細胞外小胞が提供される。本発明により、植物が生息する周囲の空気環境中から植物細胞外小胞を調製することが可能となる。特に植物の蒸散物には、細胞外小胞が豊富に含まれる一方、植物細胞体由来の成分がほとんど混入していないため、植物の蒸散物から、簡便な操作で、高純度の細胞外小胞を回収することが可能である。植物が気体中に細胞外小胞を放出することは、これまでに知られておらず、植物が生息する周囲の空気や、植物蒸散物は、植物細胞外小胞の新たな原料となり得る。植物が気体中に放出する細胞外小胞には多様なmiRNAが含まれていることから、植物が気体中に細胞外小胞を放出し、その細胞外小胞を介して周囲の生物とコニュニケーションしている可能性があり、気体中に浮遊する細胞外小胞を介した生物間のコミュニケーションという、新たな学術領域が切り開かれる。更なる局面において、湧水などの植物が生息する地域の環境水からも該植物が気体中に放出した細胞外小胞を単離することが可能となる。更に、本発明により植物細胞外小胞を用いた森林浴の疑似体験方法が提供される。植物細胞外小胞は森林浴においてヒトが浴びる主要な成分の一つであることから、植物細胞外小胞を散布することにより、よりリアルな森林浴の疑似体験を行うことができる。 The present invention provides isolated plant extracellular vesicles released into the gas by plants. The present invention makes it possible to prepare plant extracellular vesicles from the air environment surrounding plants. In particular, while plant transpiration contains abundant extracellular vesicles, it contains almost no components derived from plant cell bodies. It is possible to collect the cells. It has not been previously known that plants release extracellular vesicles into the air, and the air surrounding plants and plant transpiration may serve as new raw materials for plant extracellular vesicles. The extracellular vesicles that plants release into the gas contain a variety of miRNAs, so it is possible that plants release extracellular vesicles into the gas and communicate with surrounding organisms through these extracellular vesicles. This opens up a new academic field of communication between organisms via extracellular vesicles suspended in gas. In a further aspect, it becomes possible to isolate extracellular vesicles released into the gas by plants from environmental water such as spring water in areas where plants inhabit. Furthermore, the present invention provides a method for simulating forest bathing using plant extracellular vesicles. Since plant extracellular vesicles are one of the main components that humans are exposed to during forest bathing, by spraying plant extracellular vesicles it is possible to have a more realistic simulated experience of forest bathing.
１．植物が気体中に放出した単離された植物細胞外小胞
本発明は、植物が気体中に放出した単離された植物細胞外小胞（以下、「本発明の細胞外小胞」という。）を提供するものである。従来、植物の細胞外小胞は、果実、葉、茎、根等の中で細胞から分泌されて、植物体内における細胞間コミュニケーションを媒介することが知られていたが、本発明者は、驚くべきことに、植物が細胞外小胞を気体中に放出し、その放出された細胞外小胞を介して外界の他の生物とコミュニケーションしている可能性を見出した。
1. Isolated plant extracellular vesicles released into gas by plants The present invention relates to isolated plant extracellular vesicles released into gas by plants (hereinafter referred to as "extracellular vesicles of the present invention"). ). Conventionally, it was known that plant extracellular vesicles are secreted from cells in fruits, leaves, stems, roots, etc., and mediate intercellular communication within the plant body, but the present inventors were surprised to find that The researchers found that plants may release extracellular vesicles into the gas and communicate with other organisms in the outside world through the released extracellular vesicles.
本明細書において、用語「細胞外小胞」とは、細胞から放出される核を持たない（複製できない）脂質二重膜で囲まれた粒子をいう。細胞外小胞は、産生機構の違いから、エクソソーム、マイクロベシクル、及びアポトーシス小体に分類されている。エクソソームは、エンドサイトーシス過程で形成されるエンドソーム膜由来の小胞であり、そのサイズは一般的には直径30～150 nm程度である。マイクロベシクルは、細胞膜が外側へ出芽して、細胞外へと分泌された小胞であり、そのサイズは、一般的には直径100～1000 nm程度である。アポトーシス小体は、アポトーシスを起こした細胞において、マイクロベシクルと同様に、細胞膜が外側へ出芽して、細胞外へと分泌された小胞であり、そのサイズは、一般的には直径50～5000 nm程度である。本明細書において、細胞外小胞は、細胞から放出される核を持たない（複製できない）脂質二重膜で囲まれた粒子であれば、エクソソーム、マイクロベシクル、及びアポトーシス小体に特に限定されない。 As used herein, the term "extracellular vesicle" refers to a particle without a nucleus (incapable of replication) surrounded by a lipid bilayer membrane and released from a cell. Extracellular vesicles are classified into exosomes, microvesicles, and apoptotic bodies based on different production mechanisms. Exosomes are vesicles derived from endosomal membranes that are formed during the endocytic process, and their size is generally about 30 to 150 nm in diameter. Microvesicles are vesicles that are secreted from the cell membrane by budding outward, and their size is generally about 100 to 1000 nm in diameter. Apoptotic bodies are vesicles that are secreted from the cell membrane by budding outward from the cell membrane, similar to microvesicles, in cells that have undergone apoptosis, and their size is generally 50 to 5000 mm in diameter. It is about nm. In this specification, extracellular vesicles are not particularly limited to exosomes, microvesicles, and apoptotic bodies, as long as they are particles that are released from cells and are surrounded by a lipid bilayer membrane and do not have a nucleus (cannot replicate). .
本発明の細胞外小胞の由来となる植物の種類は、特に限定されないが、好ましくは、陸上に生息し、気体中に細胞外小胞を放出する陸生植物である。陸生植物としては、コケ植物、シダ植物、種子植物（裸子植物、被子植物）等を挙げることができる。 The type of plant from which the extracellular vesicles of the present invention are derived is not particularly limited, but preferably is a terrestrial plant that lives on land and releases extracellular vesicles into gas. Examples of terrestrial plants include mosses, ferns, and seed plants (gynosperms and angiosperms).
本発明の細胞外小胞は単離されている。「単離」とは、天然に存在する状態から、目的とする成分以外の成分を除去する操作が施されていることを意味する。本発明の細胞外小胞は、植物が気体中に放出する植物細胞外小胞以外の成分（植物細胞やその断片、花粉、テルペン等）から実質的に分離されており、天然に存在する場合よりも多い量に濃縮されている。 The extracellular vesicles of the invention have been isolated. "Isolation" means that an operation is performed to remove components other than the target component from the naturally existing state. The extracellular vesicles of the present invention are substantially separated from components other than plant extracellular vesicles released into the gas by plants (plant cells and fragments thereof, pollen, terpenes, etc.), and are present in nature. It is concentrated in a larger amount.
本発明の細胞外小胞はmicroRNA（miRNA）を含有し得る。miRNAは、一般的には、21～25塩基（nt）長の1本鎖RNA分子として定義される。miRNAは、真核生物において内在性のRNAサイレンシング機構を担う代表的な短鎖ノンコーディングRNAであり、遺伝子の転写後発現調節に関与し得る。miRNAを含有する本発明の細胞外小胞は、そのmiRNAにより外界の生物の遺伝子発現に影響を与え得る。 Extracellular vesicles of the invention may contain microRNAs (miRNAs). miRNAs are generally defined as single-stranded RNA molecules 21-25 bases (nt) in length. miRNA is a typical short non-coding RNA that plays a role in the endogenous RNA silencing mechanism in eukaryotes, and can be involved in post-transcriptional expression regulation of genes. The extracellular vesicles of the present invention containing miRNA can affect gene expression in organisms in the outside world through the miRNA.
本発明の細胞外小胞は、植物が気体中に放出した植物細胞外小胞を単離することにより得ることが出来る。本発明は、植物が気体中に放出した植物細胞外小胞を単離することを含む、植物細胞外小胞の調製方法（以下「本発明の調製方法」という。）をも提供する。 The extracellular vesicles of the present invention can be obtained by isolating plant extracellular vesicles released into the gas by plants. The present invention also provides a method for preparing plant extracellular vesicles (hereinafter referred to as "preparation method of the present invention") comprising isolating plant extracellular vesicles released into a gas by a plant.
植物細胞外小胞を単離する原料は、植物が気体中に放出した細胞外小胞を含んでいれば、特に限定されないが、好ましくは、植物細胞外小胞を含む植物の蒸散物である。蒸散とは、植物の地上部から大気中へ水蒸気が放出される現象であり、蒸散物とは、その放出される水蒸気及びその含有成分をいう。蒸散物は、気体中に浮遊する形態（例、水蒸気）であってもよいし、植物が大気中へ放出した水蒸気が結露した液体の形態（蒸散液）であってもよい。理論には拘束されないが、植物は、蒸散作用により、細胞外小胞を含む水蒸気を大気中へ放出することにより、気体中へ細胞外小胞を放出する。 The raw material for isolating plant extracellular vesicles is not particularly limited as long as it contains extracellular vesicles released into the gas by the plant, but is preferably a plant transpiration containing plant extracellular vesicles. . Transpiration is a phenomenon in which water vapor is released from the above-ground parts of plants into the atmosphere, and transpiration refers to the released water vapor and its components. The transpiration may be in the form of floating in a gas (eg, water vapor), or may be in the form of a liquid (transpiration liquid) in which water vapor released into the atmosphere by plants is condensed. Without being bound by theory, plants release extracellular vesicles into the gas by releasing water vapor containing the extracellular vesicles into the atmosphere through transpiration.
一態様において、植物が大気中へ放出した水蒸気が結露した液体の形態の蒸散物（蒸散液）を回収する。例えば、細胞外小胞を放出する植物の全部又は一部を略密閉空間に閉じ込めて、内部の湿度を上昇させるか、温度を低下させることにより、水蒸気の結露を促し、植物細胞外小胞を含む蒸散液を回収する。具体的には、細胞外小胞を放出する植物の全部又は一部をビニール袋等で覆うか、該植物を略密閉の建物や温室の内部で栽培すればよい。蒸散は、葉、茎、花、果実等において行われるので、これらの蒸散が行われる植物の部分の少なくとも1つが含まれるように、植物の全部又は一部を略密閉空間に閉じ込め、蒸散液を回収する。一般的には、蒸散は、葉の裏側に集中して起こるので、好ましくは、葉が含まれるように、植物の全部又は一部を略密閉空間に閉じ込める。 In one embodiment, a liquid form of transpiration (transpiration liquid) in which water vapor released into the atmosphere by a plant is condensed is collected. For example, by confining all or part of a plant that releases extracellular vesicles in a nearly closed space and increasing the internal humidity or lowering the temperature, condensation of water vapor is promoted and the plant extracellular vesicles are released. Collect the transpiration liquid containing the Specifically, all or part of a plant that releases extracellular vesicles may be covered with a plastic bag or the like, or the plant may be cultivated inside a substantially closed building or greenhouse. Since transpiration occurs in leaves, stems, flowers, fruits, etc., all or part of the plant is confined in a nearly closed space so that at least one of the parts of the plant where transpiration occurs is contained, and the transpiration fluid is collected. to recover. Generally, transpiration occurs concentrated on the underside of the leaves, so preferably all or part of the plant is confined in a substantially closed space to include the leaves.
別の態様において、気体中に浮遊する水蒸気の形態の蒸散物を回収する。具体的には、細胞外小胞を放出する植物が生育する環境中の気体（例、空気）から水蒸気の形態の蒸散物を回収する。例えば、森林や草原に生息する植物（樹木、下草、苔等）が気体中に放出した細胞外小胞を回収する場合、該植物が生息する森林や草原の空気から水蒸気の形態の蒸散物を回収する。また、畑や庭で栽培した植物（野菜、香草、果樹、庭木、草花、観葉植物等）が気体中に放出した細胞外小胞を回収する場合、該植物を栽培している畑や庭の空気から水蒸気の形態の蒸散物を回収する。建物や温室の内部で栽培した植物が気体中に放出した細胞外小胞を回収する場合、該建物や温室の内部の気体（例、空気）から水蒸気の形態の蒸散物を回収する。 In another embodiment, transpiration in the form of water vapor suspended in the gas is recovered. Specifically, transpiration in the form of water vapor is collected from a gas (eg, air) in the environment in which plants that release extracellular vesicles grow. For example, when collecting extracellular vesicles released into the air by plants living in forests and grasslands (trees, undergrowth, moss, etc.), transpiration in the form of water vapor is collected from the air of the forests and grasslands where the plants live. to recover. In addition, when collecting extracellular vesicles released into the gas by plants grown in fields or gardens (vegetables, aromatic herbs, fruit trees, garden trees, flowers, ornamental plants, etc.), Recovers transpiration in the form of water vapor from the air. When collecting extracellular vesicles released into the gas by plants grown inside a building or greenhouse, transpiration in the form of water vapor is collected from the gas (eg, air) inside the building or greenhouse.
植物が気体中に放出した細胞外小胞を含む水蒸気の形態の蒸散物を該気体から回収する方法としては、気体中に浮遊する微粒子を回収する方法を広く用いることができる。一般的に、気体中に浮遊する微粒子は、重力、慣性力、遠心力、拡散、静電気力などの一つ又は複数を組み合わせて利用することにより、気体から分離し、回収することができる。例えば、静電気により微粒子を回収する静電式電気集塵機、ろ過により微粒子を分離回収するフィルター式集塵機、旋回気流・遠心力により微粒子を回収するサイクロン式集塵機、気体中に含まれる微粒子を攪拌した液体（例、水）に吸着させて回収する湿式集塵機（スクラバー）等の集塵機を用いて、気体中に浮遊する細胞外小胞を含む水蒸気の形態の蒸散物を回収することができる。 As a method for recovering transpiration products in the form of water vapor containing extracellular vesicles released into the gas by plants, a method for recovering fine particles suspended in the gas can be widely used. Generally, fine particles suspended in gas can be separated from the gas and recovered by using one or a combination of gravity, inertial force, centrifugal force, diffusion, electrostatic force, and the like. For example, an electrostatic electric precipitator that collects fine particles using static electricity, a filter type dust collector that separates and collects fine particles through filtration, a cyclone type dust collector that collects fine particles using swirling airflow and centrifugal force, and a liquid that stirs fine particles contained in gas ( For example, transpiration in the form of water vapor containing extracellular vesicles floating in the gas can be collected using a dust collector such as a wet dust collector (scrubber) that collects the dust by adsorbing it to water.
必要に応じて、植物細胞外小胞を含む蒸散物を水性溶媒で希釈し、植物細胞外小胞の分散液を得てもよい。本明細書においては、蒸散物を水性溶媒で希釈して得た植物細胞外小胞の分散液も、植物細胞外小胞を含む蒸散物に包含される。蒸散物を水性溶媒で希釈することにより、その後の精製、濃縮、定量、機能解析等の操作が容易となり得る。水性溶媒としては、水、生理食塩水、生理的な緩衝水溶液（例、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液、Tris緩衝液）、細胞培養用の培養液等を挙げることができるが、これらに限定されない。水性溶媒のpHは特に限定されないが、好ましくは5～9、より好ましくは6～8である。水性溶媒には、細胞外小胞体やその含有成分（タンパク質、RNA等）の分解を抑制するため、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤（例、RNase阻害剤）等を添加してもよい。 If necessary, the transpiration material containing plant extracellular vesicles may be diluted with an aqueous solvent to obtain a dispersion of plant extracellular vesicles. In this specification, a dispersion of plant extracellular vesicles obtained by diluting a transpiration with an aqueous solvent is also included in the transpiration containing plant extracellular vesicles. By diluting the transpiration product with an aqueous solvent, subsequent operations such as purification, concentration, quantification, and functional analysis can be facilitated. Examples of the aqueous solvent include water, physiological saline, physiological buffer aqueous solution (e.g., phosphate buffer, borate buffer, glycine buffer, Tris buffer), culture medium for cell culture, etc. However, it is not limited to these. The pH of the aqueous solvent is not particularly limited, but is preferably 5 to 9, more preferably 6 to 8. A protease inhibitor, a nuclease inhibitor (eg, RNase inhibitor), etc. may be added to the aqueous solvent in order to suppress the decomposition of the extracellular endoplasmic reticulum and its contained components (proteins, RNA, etc.).
蒸散物中の植物細胞外小胞の純度を高くするため、蒸散物から不純物を除去するための前処理に付してもよい。前処理としては、遠心分離、フィルターろ過等を挙げることができるが、これらに限定されない。例えば、植物細胞外小胞を含む蒸散物を、植物細胞外小胞より大きな不純物は沈降するが、植物細胞外小胞は沈降しない相対遠心加速度（例、10,000 x g以下、好ましくは300～2,500 x g）にて遠心分離することにより、不純物を沈降させ、植物細胞外小胞を含む上清を回収することにより、不純物が除去された、より純度の高い植物細胞外小胞を含む蒸散物を得ることができる。また、植物細胞外小胞を含む蒸散物を、植物細胞外小胞より大きな不純物は通過しないが、植物細胞外小胞は通過する孔径（例、0.1 μm以上、好ましくは0.2～0.8μm）のフィルターでろ過することにより、不純物が除去された、より純度の高い植物細胞外小胞を含む蒸散物を得ることができる。複数種類の前処理を組み合わせて行ってもよく、例えば、遠心分離とフィルターろ過を組み合わせて行うこともできる。 In order to increase the purity of plant extracellular vesicles in the transpire, the transpire may be subjected to pretreatment to remove impurities. Pretreatment may include, but is not limited to, centrifugation, filter filtration, and the like. For example, transpiration containing plant extracellular vesicles can be treated at relative centrifugal accelerations (e.g., 10,000 x g or less, preferably 300 to 2,500 x g) that cause impurities larger than plant extracellular vesicles to settle, but not plant extracellular vesicles. ) to precipitate impurities and collect the supernatant containing plant extracellular vesicles to obtain a transpiration product containing higher purity plant extracellular vesicles from which impurities have been removed. be able to. In addition, impurities larger than plant extracellular vesicles do not pass through transpiration containing plant extracellular vesicles; By filtering, it is possible to obtain a transpire containing plant extracellular vesicles with higher purity from which impurities have been removed. A combination of multiple types of pretreatment may be performed, for example, a combination of centrifugation and filter filtration may be performed.
そして、植物細胞外小胞を含む植物の蒸散物から植物細胞外小胞を更に精製してもよい。植物細胞外小胞を精製する方法としては、当該技術分野において周知の細胞外小胞の精製方法を用いることができる。例えば、植物の蒸散物を、遠心分離、カラムクロマトグラフィー、又は限外濾過に付し、植物細胞外小胞を含む画分を回収する。遠心分離を利用して植物細胞外小胞を単離する方法としては、ペレットダウン法、スクロースクッション法、密度勾配遠心法、水和性ポリマー法等を挙げることができるが、これらに限定されない。ペレットダウン法においては、植物細胞外小胞の分散液を、植物細胞外小胞が沈降するのに十分な相対遠心加速度（例、80,000 x g以上、好ましくは、100,000～200,000 x g）で超遠心することにより、植物細胞外小胞を沈降させ、上清を除去する。植物細胞外小胞のチューブへの吸着を抑制するため、タンパク質低吸着性のチューブを超遠心の際に用いてもよい。スクロースクッション法においては、超遠心時に植物細胞外小胞の沈降を阻止するのに十分な濃度（例、10 %(W/V)以上、好ましくは20～40 %(W/V)）のスクロース水溶液を超遠心チューブの底にアプライし、その上境界面を崩さないように植物細胞外小胞の分散液を重層し、ペレットダウン法と同程度の相対遠心加速度（例、80,000 x g以上、好ましくは、100,000～200,000 x g）で超遠心し、植物細胞外小胞をスクロース水溶液層へ濃縮し、上清を除去することにより、植物細胞外小胞が濃縮された分散液を得ることができる。スクロース水溶液としてTris/スクロース/D2O溶液を用いてもよい。密度勾配遠心法においては、スクロースやイオジキサノール等の密度媒体の水溶液で、遠心管中に上部から下部へと密度が大きくなる密度勾配を作っておき、その密度勾配液の上に植物細胞外小胞の分散液を重層し、ペレットダウン法と同程度の相対遠心加速度（例、80,000 x g以上、好ましくは、100,000～200,000 x g）で超遠心し、植物細胞外小胞を含む画分を回収する。水和性ポリマー法においては、植物細胞外小胞の分散液にポリエチレングリコール（PEG）等の水和性ポリマーを加えて、遠心分離に付し、水和性ポリマーに吸着した植物細胞外小胞を沈降させて、上清を除去する。 Then, the plant extracellular vesicles may be further purified from the plant transpiration containing the plant extracellular vesicles. As a method for purifying plant extracellular vesicles, methods for purifying extracellular vesicles well known in the art can be used. For example, plant transpiration is subjected to centrifugation, column chromatography, or ultrafiltration, and a fraction containing plant extracellular vesicles is collected. Methods for isolating plant extracellular vesicles using centrifugation include, but are not limited to, the pellet down method, sucrose cushion method, density gradient centrifugation method, and hydratable polymer method. In the pellet-down method, a dispersion of plant extracellular vesicles is ultracentrifuged at a relative centrifugal acceleration sufficient to sediment the plant extracellular vesicles (e.g., 80,000 xg or higher, preferably 100,000 to 200,000 xg). By this, the plant extracellular vesicles are sedimented and the supernatant is removed. In order to suppress adsorption of plant extracellular vesicles to the tube, a tube with low protein adsorption may be used during ultracentrifugation. In the sucrose cushion method, sucrose is used at a sufficient concentration (e.g., 10% (W/V) or more, preferably 20 to 40% (W/V)) to prevent sedimentation of plant extracellular vesicles during ultracentrifugation. Apply the aqueous solution to the bottom of an ultracentrifuge tube, overlay the dispersion of plant extracellular vesicles on top of it without disrupting the interface, and apply a relative centrifugal acceleration similar to that of the pellet down method (e.g., 80,000 xg or higher, preferably By performing ultracentrifugation at 100,000 to 200,000 xg) to concentrate the plant extracellular vesicles into the sucrose aqueous solution layer and removing the supernatant, a dispersion containing concentrated plant extracellular vesicles can be obtained. A Tris/sucrose/D 2 O solution may be used as the sucrose aqueous solution. In density gradient centrifugation, a density gradient in which the density increases from the top to the bottom is created in a centrifuge tube using an aqueous solution of a density medium such as sucrose or iodixanol, and plant extracellular vesicles are placed on top of the density gradient solution. A dispersion of the above is superimposed and ultracentrifuged at a relative centrifugal acceleration similar to that of the pellet down method (e.g., 80,000 xg or higher, preferably 100,000 to 200,000 xg) to collect a fraction containing plant extracellular vesicles. In the hydratable polymer method, a hydratable polymer such as polyethylene glycol (PEG) is added to a dispersion of plant extracellular vesicles, and the plant extracellular vesicles adsorbed to the hydratable polymer are centrifuged. sediment and remove the supernatant.
カラムクロマトグラフィーを利用して植物細胞外小胞を単離する方法としては、サイズ排除クロマトグラフィーカラム又はサイズクロマトグラフィーを用いて、粒子サイズによるふるいをかけて細胞外小胞を分画する方法（分子ふるいクロマトグラフィー法）、細胞外小胞が含有する分子に対してアフィニティを有する分子（例、抗体）を用いたアフィニティ精製等を挙げることができる。限外濾過を利用して植物細胞外小胞を単離する方法としては、限外濾過フィルターを使って高分子の植物細胞外小胞をフィルター上に留まらせて、小さなタンパク質を落とすことで、植物細胞外小胞を濃縮する方法を挙げることができる。市販のキットを用いてもよく、また、複数の精製方法を組み合わせて行ってもよい。 Methods for isolating plant extracellular vesicles using column chromatography include a method in which extracellular vesicles are fractionated by sieving based on particle size using a size exclusion chromatography column or size chromatography ( Examples include molecular sieve chromatography (molecular sieve chromatography), affinity purification using molecules (eg, antibodies) that have an affinity for molecules contained in extracellular vesicles, and the like. A method for isolating plant extracellular vesicles using ultrafiltration is to use an ultrafiltration filter to allow the polymeric plant extracellular vesicles to remain on the filter and remove small proteins. Mention may be made of methods for concentrating plant extracellular vesicles. A commercially available kit may be used, or a combination of multiple purification methods may be used.
また、得られた画分中に、植物細胞外小胞が含まれることを確認してもよい。例えば、得られた画分に含まれる微粒子の数や大きさ（直径）を測定して、植物細胞外小胞が含まれていることを確認してもよい。細胞外小胞の大きさは、一般的には直径30～5000 nm程度（エクソソームは直径30～150 nm程度、マイクロベシクルは直径100～1000 nm程度、アポトーシス小体は直径50～5000 nm程度）である。細胞外小胞の直径は、電子顕微鏡、電気抵抗ナノパルス法、ナノトラッキング解析（NTA）等の方法により測定することができる。電気抵抗ナノパルス法を用いた測定装置としては、qNano（Izon Science社）等を挙げることが出来る。NTAを用いた解析装置としては、NanoSight（Malvern Panalytical社）、Zeta View（DKSH社）等を挙げることができる。 It may also be confirmed that the obtained fraction contains plant extracellular vesicles. For example, the number and size (diameter) of fine particles contained in the obtained fraction may be measured to confirm that plant extracellular vesicles are contained. The size of extracellular vesicles is generally about 30 to 5000 nm in diameter (exosomes are about 30 to 150 nm in diameter, microvesicles are about 100 to 1000 nm in diameter, and apoptotic bodies are about 50 to 5000 nm in diameter). It is. The diameter of extracellular vesicles can be measured by methods such as electron microscopy, electrical resistance nanopulse method, and nanotracking analysis (NTA). Examples of measurement devices using the electrical resistance nanopulse method include qNano (Izon Science). Examples of analysis devices using NTA include NanoSight (Malvern Panalytical) and Zeta View (DKSH).
単離した植物細胞外小胞の純度を評価してもよい。例えば、評価対象の画分からRNAを精製して、バイオアナライザーによりそのサイズを分析し、細胞由来RNAの混入量を測定してもよい。植物が気体中に放出する植物細胞外小胞は小分子RNA（miRNA等）を豊富に含むが、リボソームRNAは殆ど含まない。一方、細胞由来のRNAにはサイズの大きいリボソームRNAが豊富に含まれる。従って、評価対象の画分からRNAを精製し、そのRNAに含まれる小分子RNAの割合を測定することにより、細胞外小胞の純度を評価することができる。小分子RNAの割合が高いことは、不純物である細胞由来のRNAの混入が少ないことを意味する。一態様において、本発明の細胞外小胞は、全RNAに対する長さ200塩基以下のRNAの重量比百分率で定義される細胞外小胞の純度が30wt%以上（好ましくは、40wt%以上、50wt%以上、60wt%以上、70wt%以上、80wt%以上、85wt%以上、90wt%以上、95wt%以上、96%以上、97％以上、98％以上、又は99％以上）である。全RNAに対する長さ200塩基以下のRNAの重量比百分率は、評価対象のRNAサンプルをバイオアナライザー（Agilent 2100）で解析したときに得られるクロマトグラムのピーク面積比で求めることができる。本発明の調製方法において、回収した画分に含まれる植物細胞外小胞の純度（全RNAに対する長さ200塩基以下のRNAの重量比百分率）が30wt%以上（好ましくは、40wt%以上、50wt%以上、60wt%以上、70wt%以上、80wt%以上、85wt%以上、90wt%以上、95wt%以上、96%以上、97％以上、98％以上、又は99％以上）であることを確認してもよい。 The purity of isolated plant extracellular vesicles may be assessed. For example, RNA may be purified from the fraction to be evaluated, and its size may be analyzed using a bioanalyzer to measure the amount of contaminating cell-derived RNA. Plant extracellular vesicles released into the air by plants contain abundant small RNA molecules (such as miRNA), but contain almost no ribosomal RNA. On the other hand, cell-derived RNA is rich in large-sized ribosomal RNA. Therefore, the purity of extracellular vesicles can be evaluated by purifying RNA from the fraction to be evaluated and measuring the proportion of small RNA contained in the RNA. A high proportion of small RNA means that there is less contamination with cell-derived RNA, which is an impurity. In one aspect, the extracellular vesicles of the present invention have a purity of 30 wt% or more (preferably 40 wt% or more, 50 wt% % or more, 60wt% or more, 70wt% or more, 80wt% or more, 85wt% or more, 90wt% or more, 95wt% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more). The weight percentage of RNA with a length of 200 bases or less to total RNA can be determined by the peak area ratio of the chromatogram obtained when the RNA sample to be evaluated is analyzed with a bioanalyzer (Agilent 2100). In the preparation method of the present invention, the purity of plant extracellular vesicles contained in the collected fraction (weight ratio of RNA with a length of 200 bases or less to total RNA) is 30 wt% or more (preferably 40 wt% or more, 50 wt% or more). % or more, 60wt% or more, 70wt% or more, 80wt% or more, 85wt% or more, 90wt% or more, 95wt% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more). You can.
本明細書においては、植物の蒸散物から植物細胞外小胞を単離する態様を中心に、本発明の調製方法を説明したが、本発明の調製方法は、これに限定されず、植物の蒸散物以外から、植物が気体中に放出した細胞外小胞を単離する方法をも包含する。例えば、植物がエアロゾルの形態で気体中に放出した細胞外小胞を該気体から単離してもよい。該態様においては、細胞外小胞を含むエアロゾルを放出する植物が生育する環境中の気体（例、空気）から該エアロゾルを上述の集塵機等で回収し、水性溶媒に分散することにより、植物細胞外小胞の分散液を得て、該分散液を、上述の蒸散物の場合と同様に、遠心分離、カラムクロマトグラフィー、又は限外濾過に付し、植物細胞外小胞を含む画分を回収してもよい。 In this specification, the preparation method of the present invention has been explained focusing on the aspect of isolating plant extracellular vesicles from plant transpiration, but the preparation method of the present invention is not limited to this, and the preparation method of the present invention is not limited to this. It also includes methods for isolating extracellular vesicles released into the gas by plants from sources other than transpiration. For example, extracellular vesicles released into a gas by a plant in the form of an aerosol may be isolated from the gas. In this embodiment, the aerosol containing extracellular vesicles is collected from the gas (e.g., air) in the environment in which the plant grows, using the above-mentioned dust collector, etc., and dispersed in an aqueous solvent to collect the aerosol from the plant cells. A dispersion of plant extracellular vesicles is obtained, and the dispersion is subjected to centrifugation, column chromatography, or ultrafiltration in the same manner as in the case of the transpired product described above to obtain a fraction containing plant extracellular vesicles. May be collected.
更なる局面において、植物が生息する地域の環境水から該植物が気体中に放出した細胞外小胞を単離してもよい。植物が生息する地域（例えば森林）の環境水には、該植物が気体中に放出した細胞外小胞を含む蒸散物が含まれるので、該環境水から該植物が気体中に放出した細胞外小胞を単離することが可能となる。該環境水には、植物以外（微生物等）に由来する細胞外小胞が含まれていても良い。環境水としては、湧水、河川水、湖沼水、海水等を挙げることができるが、これらに限定されない。該環境水を、上述の蒸散物の場合と同様に、遠心分離、カラムクロマトグラフィー、又は限外濾過に付し、植物細胞外小胞を含む画分を回収することができる。 In a further aspect, extracellular vesicles released into the gas by the plant may be isolated from the environmental waters of the area where the plant lives. Environmental water in areas where plants inhabit (for example, forests) contains transpiration products containing extracellular vesicles released by the plants into the gas. It becomes possible to isolate the vesicles. The environmental water may contain extracellular vesicles derived from sources other than plants (microorganisms, etc.). Examples of environmental water include spring water, river water, lake water, seawater, etc., but are not limited to these. The environmental water can be subjected to centrifugation, column chromatography, or ultrafiltration to collect a fraction containing plant extracellular vesicles, as in the case of the above-mentioned transpiration.
本発明の細胞外小胞を乾燥して、乾燥粉末の形態で提供してもよい。本発明の細胞外小胞を乾燥する方法としては、凍結乾燥、真空乾燥、減圧乾燥等を挙げることができるが、これらに限定されない。乾燥粉末（例、凍結乾燥粉末、真空乾燥粉末、減圧乾燥粉末）の形態の本発明の細胞外小胞は、安定性に優れていて、長期間の保存が可能であり得る。 The extracellular vesicles of the invention may be dried and provided in the form of a dry powder. Methods for drying the extracellular vesicles of the present invention include, but are not limited to, freeze drying, vacuum drying, reduced pressure drying, and the like. The extracellular vesicles of the present invention in the form of dry powders (eg, freeze-dried powders, vacuum-dried powders, vacuum-dried powders) have excellent stability and may be stored for long periods of time.
本発明の細胞外小胞は、薬物送達担体、化粧品原料、食品添加物等として有用である。 The extracellular vesicles of the present invention are useful as drug delivery carriers, cosmetic raw materials, food additives, and the like.
２．植物が気体中に放出した単離された植物細胞外小胞を含む組成物、及びその用途
また、本発明は、上記本発明の細胞外小胞を含む組成物（以下、「本発明の組成物」という。）を提供する。本発明の組成物は、本発明の細胞外小胞に加えて、生理的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤を更に含んでいてもよい。担体、賦形剤または希釈剤としては、水、オイル、ワックス、脂肪酸、脂肪酸アルコール、脂肪酸エステル、界面活性剤、吸湿剤（humectant）、増粘剤、抗酸化剤、粘度安定化剤、キレート剤、緩衝剤、低級アルコールなどが含まれるが、これらに制限されるわけではない。本発明の組成物は、該組成物の重量を基準として、例えば0.00001～99wt%の植物が気体中に放出した細胞外小胞を含有する。
2. Compositions containing isolated plant extracellular vesicles released into gas by plants, and uses thereof The present invention also provides compositions containing the above-mentioned extracellular vesicles of the present invention (hereinafter referred to as "compositions of the present invention"). (referred to as "thing"). In addition to the extracellular vesicles of the invention, the compositions of the invention may further contain physiologically acceptable carriers, excipients or diluents. Carriers, excipients or diluents include water, oils, waxes, fatty acids, fatty alcohols, fatty acid esters, surfactants, humectants, thickeners, antioxidants, viscosity stabilizers, chelating agents. , buffering agents, lower alcohols, etc., but are not limited to these. The compositions of the invention contain, for example, from 0.00001 to 99 wt%, based on the weight of the composition, of plant-released extracellular vesicles into the gas.
一態様において、本発明の組成物は、凍結乾燥組成物（以下、「本発明の凍結乾燥組成物」という。）である。本発明の凍結乾燥組成物は、上記本発明の細胞外小胞の水性溶媒中の分散液を凍結乾燥することにより調製することができる。本発明の凍結乾燥組成物は、ケーキ状組成物であり得る。本発明の凍結乾燥組成物は、安定化剤を含んでいてもよい。安定化剤としては、糖類（グルコース、スクロース、トレハロース、マンニトール、マルトース、ラクトース、セロビオース等）、グリシン、ポリビニルピロリドン、アルブミン等を挙げることができるが、これらに限定されない。本発明の凍結乾燥組成物は、緩衝剤を含んでいてもよい。緩衝剤としては、リン酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、グリシン・塩酸緩衝剤等挙げることができるがこれらに限定されない。本発明の凍結乾燥組成物を水で再構成することにより、本発明の細胞外小胞の水性溶媒中の分散液を得ることができる。 In one embodiment, the composition of the present invention is a lyophilized composition (hereinafter referred to as "lyophilized composition of the present invention"). The lyophilized composition of the present invention can be prepared by lyophilizing a dispersion of the extracellular vesicle of the present invention in an aqueous solvent. The lyophilized composition of the present invention can be a cake-like composition. The lyophilized composition of the invention may also contain a stabilizer. Stabilizers include, but are not limited to, sugars (glucose, sucrose, trehalose, mannitol, maltose, lactose, cellobiose, etc.), glycine, polyvinylpyrrolidone, albumin, and the like. The lyophilized composition of the invention may also contain a buffer. Buffers include, but are not limited to, phosphate buffers, carbonate buffers, citrate buffers, acetate buffers, glycine/hydrochloric acid buffers, and the like. By reconstituting the lyophilized composition of the invention with water, a dispersion of the extracellular vesicles of the invention in an aqueous solvent can be obtained.
一態様において、本発明の組成物は、芳香組成物として有用である。本発明の芳香組成物は、本発明の細胞外小胞に加えて、香料を含有する。香料は、好ましくはテルペン又は植物精油である。本発明の芳香組成物は、香料と、植物が気体中に放出した細胞外小胞を含有し、これをヒトのいる空間やヒトの皮膚へ噴霧すると、そのヒトは香料と植物が気体中に放出した細胞外小胞の両方を同時に曝露されることになるので、森林浴を行ったときにより近い、優れたリラックス効果やストレス緩和効果が期待できる。 In one aspect, the compositions of the invention are useful as fragrance compositions. The fragrance composition of the invention contains a fragrance in addition to the extracellular vesicles of the invention. The fragrance is preferably a terpene or a vegetable essential oil. The aroma composition of the present invention contains a fragrance and extracellular vesicles released into the gas by plants, and when this is sprayed onto a space where a person is present or on the human skin, the person will be able to absorb the fragrance and the plant into the gas. Since you will be exposed to both of the released extracellular vesicles at the same time, you can expect excellent relaxing and stress-reducing effects similar to those of forest bathing.
テルペンは、典型的には植物精油中に見出される化合物である。好ましいテルペンとしては、α-ピネン、β-ピネン、カンフェン、テルピノレン、テルピネン、サビネン、リモネン、D-リモネン、ミルセン、オシメン、p-シメン、及びα-フェランドレンが挙げられるが、これらに限定されない。 Terpenes are compounds typically found in plant essential oils. Preferred terpenes include, but are not limited to, α-pinene, β-pinene, camphene, terpinolene, terpinene, sabinene, limonene, D-limonene, myrcene, ocimene, p-cymene, and α-phellandrene.
植物精油は、主に、植物の葉、果皮及び枝などの植物の一部から抽出することによって得られるテルペンの混合物である。植物精油としては、ヒノキ油、マツ油、トウヒ油、モミ油、バルサムモミ油、ヒバ油、ティーツリー油、シダーウッド油等の針葉樹油、オレンジ油、レモン油、マンダリン油、ベルガモット油、グレープフルーツ油、ライム油等の柑橘油、ハッカ油、ペパーミント油、タイム油、バジル油、カシア油、クローブ油、シトロネラ油、シナモン油、ゼラニウム油、ピメント油、フェンネル油、ベニーローヤル油、ベルガモット油、ラベンダー油、ルー油、レモングラス油、ジャスミン油、ゲラニオール油、カンファー油、セージ油、ザクロ油、ローズ油、テレピン油、ショウブ油、ラベンダー油、ベイ油等を挙げることができるが、これらに限定されない。 Plant essential oils are primarily mixtures of terpenes obtained by extraction from plant parts such as leaves, pericarp, and branches. Plant essential oils include coniferous oils such as cypress oil, pine oil, spruce oil, fir oil, balsam fir oil, cypress oil, tea tree oil, and cedarwood oil, orange oil, lemon oil, mandarin oil, bergamot oil, grapefruit oil, and lime oil. Citrus oils such as peppermint oil, peppermint oil, thyme oil, basil oil, cassia oil, clove oil, citronella oil, cinnamon oil, geranium oil, pimento oil, fennel oil, benny royal oil, bergamot oil, lavender oil, roux Examples include, but are not limited to, lemongrass oil, jasmine oil, geraniol oil, camphor oil, sage oil, pomegranate oil, rose oil, turpentine oil, calamus oil, lavender oil, bay oil, and the like.
香料の含有量は、芳香組成物の重量を基準として、例えば0.01～15wt%である。 The content of the fragrance is, for example, 0.01 to 15 wt% based on the weight of the fragrance composition.
一態様として、本発明の芳香組成物は、特定の種類の植物から抽出した植物精油と、同じ種類の植物が気体中に放出した細胞外小胞との組み合わせを含む。一例として、ヒノキ油と、ヒノキが気体中に放出した細胞外小胞との組み合わせ、針葉樹油と、針葉樹が生えた森林で気体中から採集した当該針葉樹が気体中に放出した細胞外小胞との組み合わせを挙げることが出来る。 In one embodiment, the fragrance composition of the present invention comprises a combination of a plant essential oil extracted from a particular type of plant and extracellular vesicles released into the gas by the same type of plant. As an example, a combination of cypress oil and extracellular vesicles released into the gas by the cypress, and a combination of coniferous oil and extracellular vesicles released into the gas by the coniferous tree collected from the gas in a forest where conifers grew. There are several combinations of.
組成物中で細胞外小胞を安定に分散させるため、本発明の芳香組成物は溶媒として水を含有することが好ましい。一態様において、本発明の芳香組成物は、溶媒として水及び有機溶媒を含む。 In order to stably disperse extracellular vesicles in the composition, the aromatic composition of the present invention preferably contains water as a solvent. In one embodiment, the fragrance composition of the present invention comprises water and an organic solvent as solvents.
本発明の芳香組成物が溶媒として水を含有する場合、該組成物に含まれる植物細胞外小胞の濃度は、例えば、104個／ml以上、好ましくは、105個／ml以上、106個／ml以上、107個／ml以上、108個／ml以上、109個／ml以上、1010個／ml以上、1011個／ml以上、1012個／ml以上である。該組成物に含まれる植物細胞外小胞の濃度の上限値は、理論的には特に制限はないが、例えば、1015個／ml以下、1014個／ml以下、1013個／ml以下である。後述の実施例において示すように、植物の蒸散水には、1mLあたり106～108オーダーの粒子数の細胞外小胞が含まれる。一態様において、本発明の芳香組成物には、植物の蒸散水と同等の濃度（例えば、106個／ml以上、109個／ml以下）の植物細胞外小胞が含まれる。別の態様において、本発明の芳香組成物には、植物の蒸散水を超える濃度（例えば、109個／ml超）の植物細胞外小胞が含まれる。 When the aroma composition of the present invention contains water as a solvent, the concentration of plant extracellular vesicles contained in the composition is, for example, 10 4 or more/ml, preferably 10 5 or more/ml, 10 6 pieces/ml or more, 10 7 pieces/ml or more, 10 8 pieces/ml or more, 10 9 pieces/ml or more, 10 10 pieces/ml or more, 10 11 pieces/ml or more, 10 12 pieces/ml or more. The upper limit of the concentration of plant extracellular vesicles contained in the composition is theoretically not particularly limited, but is, for example, 10 15 or less/ml, 10 14 or less/ml, 10 13 or less/ml It is. As shown in the Examples below, plant transpiration water contains extracellular vesicles with a particle number on the order of 10 6 to 10 8 per mL. In one embodiment, the aroma composition of the present invention contains plant extracellular vesicles at a concentration equivalent to that of plant transpiration water (for example, 10 6 or more and 10 9 or less vesicles/ml). In another embodiment, the aroma compositions of the invention include a concentration of plant extracellular vesicles (eg, greater than 10 9 cells/ml) in excess of the plant's transpiring water.
気化を促すため、本発明の芳香組成物は有機溶媒を含んでいてもよい。有機溶媒としては、ベンジルアルコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルエーテル、LPG等を挙げることができるが、これらに限定されない。これらは単独で用いても、2種以上を併用してもよい。 To facilitate vaporization, the aromatic composition of the present invention may contain an organic solvent. Examples of the organic solvent include, but are not limited to, benzyl alcohol, propylene glycol, dipropylene glycol, isopropyl myristate, ethanol, isopropyl alcohol, dimethyl ether, LPG, and the like. These may be used alone or in combination of two or more.
本発明の芳香組成物は、細胞外小胞や香料を分散、溶解させるために、界面活性剤を含んでいてもよい。界面活性剤としては、非イオン系界面活性剤、陽イオン系界面活性剤、陰イオン系界面活性剤、両性界面活性剤を用いることができる。 The aroma composition of the present invention may contain a surfactant in order to disperse and dissolve extracellular vesicles and fragrances. As the surfactant, nonionic surfactants, cationic surfactants, anionic surfactants, and amphoteric surfactants can be used.
本発明の芳香組成物は、その効果を損なわない範囲で、その他の成分を含んでいてもよい。その他の成分としては、増粘剤、色素、紫外線吸収剤、酸化防止剤、酸・アルカリ等のpH調整成分、消泡剤、乳化剤等が挙げられる。 The aroma composition of the present invention may contain other components as long as the effects thereof are not impaired. Other components include thickeners, pigments, ultraviolet absorbers, antioxidants, pH adjusting components such as acids and alkalis, antifoaming agents, emulsifiers, and the like.
一態様において、本発明の芳香組成物は無菌である。植物細胞外小胞を含む組成物を、植物細胞外小胞より大きな細菌は通過しないが、植物細胞外小胞は通過する孔径（例、0.2～0.8μm）のフィルターでろ過することにより、無菌の本発明の芳香組成物を得ることができる。 In one embodiment, the fragrance composition of the present invention is sterile. A composition containing plant extracellular vesicles can be sterilized by filtering it through a filter with a pore size (e.g., 0.2 to 0.8 μm) that does not allow bacteria larger than plant extracellular vesicles to pass through, but allows plant extracellular vesicles to pass through. The fragrance composition of the present invention can be obtained.
本発明の芳香組成物は、噴霧装置に収容することによりスプレー製剤とすることができる。噴霧装置としては、本発明の芳香組成物を充填でき、噴霧を可能とし、スプレー剤として機能するものであれば特に限定されないが、例えば、ポンプ式噴霧器、トリガー式噴霧器、エアロゾル式噴霧器等を挙げることができる。 The fragrance composition of the present invention can be made into a spray formulation by being placed in a spray device. The spraying device is not particularly limited as long as it can be filled with the aroma composition of the present invention, enables spraying, and functions as a spray agent, but examples include pump-type sprayers, trigger-type sprayers, aerosol-type sprayers, etc. be able to.
上記スプレー製剤を用いて、本発明の芳香組成物を室内や、ヒトの皮膚へ噴霧すると、そのヒトは香料と植物が気体中に放出した細胞外小胞の両方を同時に曝露されることになるので、森林浴を行ったときにより近い、優れたリラックス効果やストレス緩和効果が期待できる。 When the aroma composition of the present invention is sprayed indoors or onto the skin of a person using the above spray formulation, the person will be simultaneously exposed to both the fragrance and the extracellular vesicles released into the gas by the plants. Therefore, you can expect excellent relaxing and stress-relieving effects that are similar to those of forest bathing.
３．森林浴の疑似体験方法、及びそれに使用する組成物
更なる局面において、本発明は、森林浴の疑似体験における植物細胞外小胞の使用を提供する。本発明者らが見出したように、植物細胞外小胞は森林浴においてヒトが浴びる主要な成分の一つであることから、ヒトがいる空間に人工的に植物細胞外小胞を散布することにより、森林以外の場所において、森林浴の疑似体験を提供することができる。すなわち、本発明は、植物細胞外小胞を散布することを含む、森林浴の疑似体験方法（以下、「本発明の森林浴の疑似体験方法」という。）を提供する。
3. Method for simulating forest bathing and compositions used therein In a further aspect, the present invention provides the use of plant extracellular vesicles in a simulating forest bathing experience. As the present inventors discovered, plant extracellular vesicles are one of the main components that humans bathe in during forest bathing, so by artificially spraying plant extracellular vesicles in the space where humans are , it is possible to provide a simulated experience of forest bathing in a place other than a forest. That is, the present invention provides a method for simulating forest bathing (hereinafter referred to as "method for simulating forest bathing of the present invention"), which includes dispersing plant extracellular vesicles.
本発明の森林浴の疑似体験方法において使用する細胞外小胞の由来となる植物の種類は、特に限定されないが、好ましくは、陸生植物である。陸生植物としては、コケ植物、シダ植物、種子植物（裸子植物、被子植物）等を挙げることができる。よりリアルな森林浴の疑似体験を達成する観点から、森林を構成する植物由来の細胞外小胞を用いることが好ましい。森林を構成する植物としては、針葉樹（スギ、ヒノキ、カラマツ、ヒバ、アスナロ、モミ等）、広葉樹（ブナ、クリ、ケヤキ、シラカバ、キリ、クス等）等を挙げることができるが、これらに限定されない。 The type of plant from which the extracellular vesicles used in the forest bathing simulation method of the present invention is derived is not particularly limited, but is preferably a terrestrial plant. Examples of terrestrial plants include mosses, ferns, and seed plants (gynosperms and angiosperms). From the viewpoint of achieving a more realistic simulated experience of forest bathing, it is preferable to use extracellular vesicles derived from plants constituting forests. The plants that make up the forest include coniferous trees (cedar, cypress, larch, hiba, asunaro, fir, etc.) and broad-leaved trees (beech, chestnut, zelkova, birch, thorn, camphor, etc.), but are limited to these. Not done.
一態様において、本発明の森林浴の疑似体験方法において使用する植物細胞外小胞は、上述の本発明の細胞外小胞（植物が気体中に放出した単離された植物細胞外小胞）であり得る。別の態様において、本発明の森林浴の疑似体験方法において使用する植物細胞外小胞は、植物の体の一部（葉、茎、花、果実、根等）から抽出・単離された植物細胞外小胞であり得る。植物の体の一部からの植物細胞外小胞の抽出・単離は、自体公知の方法により実施することができる。例えば、植物の体の一部を適切な水性緩衝液中で粉砕し、得られた植物細胞外小胞を含むホモジネートを、植物細胞外小胞以外の不純物を除去するための前処理に付す。前処理としては、遠心分離、フィルターろ過等を挙げることができるが、これらに限定されない。例えば、植物細胞外小胞を含むホモジネートを、植物細胞外小胞より大きな不純物は沈降するが、植物細胞外小胞は沈降しない相対遠心加速度（例、10,000 x g以下、好ましくは300～2,500 x g）にて遠心分離することにより、不純物を沈降させ、植物細胞外小胞を含む上清を回収することにより、不純物が除去された、より純度の高い植物細胞外小胞を含むホモジネートを得ることができる。また、植物細胞外小胞を含むホモジネートを、植物細胞外小胞より大きな不純物は通過しないが、植物細胞外小胞は通過する孔径（例、0.1 μm以上、好ましくは0.2～0.8μm）のフィルターでろ過することにより、不純物が除去された、より純度の高い植物細胞外小胞を含むホモジネートを得ることができる。複数種類の前処理を組み合わせて行ってもよく、例えば、遠心分離とフィルターろ過を組み合わせて行うこともできる。 In one embodiment, the plant extracellular vesicles used in the method for simulating forest bathing of the present invention are the above-mentioned extracellular vesicles of the present invention (isolated plant extracellular vesicles released into the gas by plants). could be. In another embodiment, the plant extracellular vesicles used in the method for simulating forest bathing of the present invention are plant cells extracted and isolated from parts of the plant body (leaves, stems, flowers, fruits, roots, etc.). May be external vesicles. Extraction and isolation of plant extracellular vesicles from parts of the plant body can be carried out by methods known per se. For example, a plant body part is ground in a suitable aqueous buffer, and the resulting homogenate containing plant extracellular vesicles is subjected to pretreatment to remove impurities other than the plant extracellular vesicles. Pretreatment may include, but is not limited to, centrifugation, filter filtration, and the like. For example, a homogenate containing plant extracellular vesicles can be prepared at a relative centrifugal acceleration (e.g., 10,000 x g or less, preferably 300 to 2,500 x g) that causes impurities larger than the plant extracellular vesicles to settle, but not the plant extracellular vesicles. By centrifuging the plant at a temperature of 100 mL to precipitate impurities and collecting the supernatant containing plant extracellular vesicles, it is possible to obtain a homogenate containing higher purity plant extracellular vesicles from which impurities have been removed. can. In addition, the homogenate containing plant extracellular vesicles can be filtered through a filter with a pore size (e.g., 0.1 μm or more, preferably 0.2 to 0.8 μm) that does not allow impurities larger than the plant extracellular vesicles to pass through, but allows the plant extracellular vesicles to pass through. By filtration, a homogenate containing higher purity plant extracellular vesicles from which impurities have been removed can be obtained. A combination of multiple types of pretreatment may be performed, for example, a combination of centrifugation and filter filtration may be performed.
前処理をした植物細胞外小胞を含むホモジネートから植物細胞外小胞を更に精製してもよい。植物細胞外小胞を精製する方法としては、当該技術分野において周知の細胞外小胞の精製技術を用いることができる。例えば、植物細胞外小胞を含むホモジネートを、遠心分離、カラムクロマトグラフィー、又は限外濾過に付し、植物細胞外小胞を含む画分を回収する。遠心分離を利用して植物細胞外小胞を単離する方法としては、ペレットダウン法、スクロースクッション法、密度勾配遠心法、水和性ポリマー法等を挙げることができるが、これらに限定されない。カラムクロマトグラフィーを利用して植物細胞外小胞を単離する方法としては、サイズ排除クロマトグラフィーカラム又はサイズクロマトグラフィーを用いて、粒子サイズによるふるいをかけて細胞外小胞を分画する方法（分子ふるいクロマトグラフィー法）、細胞外小胞が含有する分子に対してアフィニティを有する分子（例、抗体）を用いたアフィニティ精製等を挙げることができる。市販のキットを用いてもよく、また、複数の精製方法を組み合わせて行ってもよい。 Plant extracellular vesicles may be further purified from a homogenate containing pretreated plant extracellular vesicles. As a method for purifying plant extracellular vesicles, techniques for purifying extracellular vesicles well known in the art can be used. For example, a homogenate containing plant extracellular vesicles is subjected to centrifugation, column chromatography, or ultrafiltration, and a fraction containing plant extracellular vesicles is collected. Methods for isolating plant extracellular vesicles using centrifugation include, but are not limited to, the pellet down method, sucrose cushion method, density gradient centrifugation method, and hydratable polymer method. Methods for isolating plant extracellular vesicles using column chromatography include a method in which extracellular vesicles are fractionated by sieving based on particle size using a size exclusion chromatography column or size chromatography ( Examples include molecular sieve chromatography (molecular sieve chromatography), affinity purification using molecules (eg, antibodies) that have an affinity for molecules contained in extracellular vesicles, and the like. A commercially available kit may be used, or a combination of multiple purification methods may be used.
一態様において、本発明の森林浴の疑似体験方法において使用する植物細胞外小胞は、針葉樹又は広葉樹の葉から抽出・単離した細胞外小胞であり得る。 In one embodiment, the plant extracellular vesicles used in the method for simulating forest bathing of the present invention may be extracellular vesicles extracted and isolated from leaves of coniferous or broadleaf trees.
本発明の森林浴の疑似体験方法において使用する植物細胞外小胞は、好ましくは単離されている。単離された植物細胞外小胞の純度は、全RNAに対する長さ200塩基以下のRNAの重量比百分率で定義される細胞外小胞の純度として、30wt%以上（好ましくは、40wt%以上、50wt%以上、60wt%以上、70wt%以上、80wt%以上、85wt%以上、90wt%以上、95wt%以上、96%以上、97％以上、98％以上、又は99％以上）である。全RNAに対する長さ200塩基以下のRNAの重量比百分率は、評価対象のRNAサンプルをバイオアナライザー（Agilent 2100）で解析したときに得られるクロマトグラムのピーク面積比で求めることができる。 The plant extracellular vesicles used in the method for simulating forest bathing of the present invention are preferably isolated. The purity of isolated plant extracellular vesicles is defined as the weight ratio of RNA with a length of 200 bases or less to total RNA, and is 30 wt% or more (preferably 40 wt% or more, 50wt% or more, 60wt% or more, 70wt% or more, 80wt% or more, 85wt% or more, 90wt% or more, 95wt% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more). The weight percentage of RNA with a length of 200 bases or less to total RNA can be determined by the peak area ratio of the chromatogram obtained when the RNA sample to be evaluated is analyzed with a bioanalyzer (Agilent 2100).
植物細胞外小胞に加えて、香料を更に散布してもよい。香料は、好ましくはテルペン又は植物精油である。テルペン及び植物精油の例としては、上記「植物が気体中に放出した単離された植物細胞外小胞を含む組成物、及びその用途」の項において記載したものを挙げることができる。オキシデンタロール、オキシドール、α-, β-, γ-オイデスモール、ミルセン、α-テルピネオール、サクサンボルニル、ツヨプセン、セドロール、エレメナール、カフェイン、クリプトメリジオール、クリプトメリオール、ショウノウ、シネオール等の樹木の香り成分を香料として用いることもまた好ましい。 In addition to the plant extracellular vesicles, perfumes may also be applied. The fragrance is preferably a terpene or a vegetable essential oil. Examples of terpenes and plant essential oils include those described above in the section "Compositions comprising isolated plant extracellular vesicles released into gas by plants and uses thereof". Tree scent components such as oxidentalol, oxidol, α-, β-, γ-eudesmol, myrcene, α-terpineol, saxanbornyl, thjopsene, cedrol, elemenal, caffeine, cryptomeridiol, cryptomeriol, camphor, cineole, etc. It is also preferred to use it as a fragrance.
植物細胞外小胞の散布は、植物細胞外小胞を含む液体組成物を散布することにより実施することが出来る。本発明は、植物細胞外小胞を含む森林浴の疑似体験用液体組成物（以下、「本発明の森林浴の疑似体験用液体組成物」という。）をも提供する。本発明の森林浴の疑似体験用液体組成物は、植物細胞外小胞の水性溶媒中の懸濁液であり得る。水性溶媒としては、水、生理食塩水、各種緩衝液（リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液）等が例示される。該懸濁液中の植物細胞外小胞の含有量は、通常104個／ml以上、好ましくは、105個／ml以上、106個／ml以上、107個／ml以上、108個／ml以上、109個／ml以上、1010個／ml以上、1011個／ml以上、又は1012個／ml以上である。該懸濁液中の植物細胞外小胞の含有量の上限値は、理論的には特に制限はないが、通常、1015個／ml以下、1014個／ml以下、1013個／ml以下である。以下である。後述の実施例において示すように、植物の蒸散水には、1mLあたり106～108オーダーの粒子数の細胞外小胞が含まれる。一態様において、本発明の森林浴の疑似体験用液体組成物には、植物の蒸散水と同等の濃度（例えば、106個／ml以上、109個／ml以下）の植物細胞外小胞が含まれる。別の態様において、本発明の森林浴の疑似体験用液体組成物には、植物の蒸散水を超える濃度（例えば、109個／ml超）の植物細胞外小胞が含まれる。 Spraying of plant extracellular vesicles can be carried out by spraying a liquid composition containing plant extracellular vesicles. The present invention also provides a liquid composition for a simulated forest bathing experience containing plant extracellular vesicles (hereinafter referred to as "liquid composition for a simulated forest bathing experience of the present invention"). The liquid composition for simulated forest bathing experience of the present invention may be a suspension of plant extracellular vesicles in an aqueous solvent. Examples of the aqueous solvent include water, physiological saline, and various buffers (phosphate buffer, Tris-HCl buffer, borate buffer, glycine buffer), and the like. The content of plant extracellular vesicles in the suspension is usually 10 4 or more/ml, preferably 10 5 or more, 10 6 or more, 10 7 or more/ml, or 10 8 or more . 10 9 pieces/ml or more, 10 10 pieces/ml or more, 10 11 pieces/ml or more, or 10 12 pieces /ml or more. The upper limit of the content of plant extracellular vesicles in the suspension is theoretically not particularly limited, but is usually 10 15 cells/ml or less, 10 14 cells/ml or less, 10 13 cells/ml or less. It is as follows. It is as follows. As shown in the Examples below, plant transpiration water contains extracellular vesicles with a particle number on the order of 10 6 to 10 8 per mL. In one embodiment, the liquid composition for a simulated forest bathing experience of the present invention contains plant extracellular vesicles at a concentration equivalent to that of plant transpiration water (for example, 10 6 or more and 10 9 or less vesicles/ml). included. In another embodiment, the liquid composition for simulated forest bathing experience of the present invention includes a concentration of plant extracellular vesicles (eg, greater than 10 9 cells/ml) in excess of plant transpiration water.
本発明の森林浴の疑似体験用液体組成物は、香料を更に含んでいてもよい。香料は、好ましくはテルペン又は植物精油である。テルペン及び植物精油の例としては、上記「植物が気体中に放出した単離された植物細胞外小胞を含む組成物、及びその用途」の項において記載したものを挙げることができる。オキシデンタロール、オキシドール、α-, β-, γ-オイデスモール、ミルセン、α-テルピネオール、サクサンボルニル、ツヨプセン、セドロール、エレメナール、カフェイン、クリプトメリジオール、クリプトメリオール、ショウノウ、シネオール等の樹木の香り成分を香料として用いることもまた好ましい。香料の含有量は、本発明の森林浴の疑似体験用液体組成物の重量を基準として、例えば0.001～15wt%、好ましくは0.01～15wt%である。 The liquid composition for simulated forest bathing experience of the present invention may further contain a fragrance. The fragrance is preferably a terpene or a vegetable essential oil. Examples of terpenes and plant essential oils include those described above in the section "Compositions comprising isolated plant extracellular vesicles released into gas by plants and uses thereof". Tree scent components such as oxidentalol, oxidol, α-, β-, γ-eudesmol, myrcene, α-terpineol, saxanbornyl, thjopsene, cedrol, elemenal, caffeine, cryptomeridiol, cryptomeriol, camphor, cineole, etc. It is also preferred to use it as a fragrance. The content of the fragrance is, for example, 0.001 to 15 wt%, preferably 0.01 to 15 wt%, based on the weight of the liquid composition for simulated forest bathing experience of the present invention.
一態様として、本発明の森林浴の疑似体験用液体組成物は、特定の種類の植物から抽出した植物精油と、同じ種類の植物の細胞外小胞との組み合わせを含む。一例として、ヒノキ油と、ヒノキ細胞外小胞との組み合わせ、針葉樹油と、針葉樹細胞外小胞との組み合わせを挙げることが出来る。 In one embodiment, the liquid composition for simulated forest bathing experience of the present invention includes a combination of plant essential oil extracted from a specific type of plant and extracellular vesicles from the same type of plant. Examples include a combination of cypress oil and cypress extracellular vesicles, and a combination of coniferous oil and coniferous extracellular vesicles.
気化を促すため、本発明の森林浴の疑似体験用液体組成物は有機溶媒を含んでいてもよい。有機溶媒としては、ベンジルアルコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルエーテル、LPG等を挙げることができるが、これらに限定されない。これらは単独で用いても、2種以上を併用してもよい。 In order to promote vaporization, the liquid composition for simulated forest bathing experience of the present invention may contain an organic solvent. Examples of the organic solvent include, but are not limited to, benzyl alcohol, propylene glycol, dipropylene glycol, isopropyl myristate, ethanol, isopropyl alcohol, dimethyl ether, LPG, and the like. These may be used alone or in combination of two or more.
本発明の森林浴の疑似体験用液体組成物は、植物細胞外小胞や香料を分散、溶解させるために、界面活性剤を含んでいてもよい。界面活性剤としては、非イオン系界面活性剤、陽イオン系界面活性剤、陰イオン系界面活性剤、両性界面活性剤を用いることができる。 The liquid composition for simulated forest bathing experience of the present invention may contain a surfactant in order to disperse and dissolve plant extracellular vesicles and fragrances. As the surfactant, nonionic surfactants, cationic surfactants, anionic surfactants, and amphoteric surfactants can be used.
本発明の森林浴の疑似体験用液体組成物は、その効果を損なわない範囲で、その他の成分を含んでいてもよい。その他の成分としては、増粘剤、色素、紫外線吸収剤、酸化防止剤、酸・アルカリ等のpH調整成分、消泡剤、乳化剤等が挙げられる。 The liquid composition for simulated forest bathing experience of the present invention may contain other components as long as the effects are not impaired. Other components include thickeners, pigments, ultraviolet absorbers, antioxidants, pH adjusting components such as acids and alkalis, antifoaming agents, emulsifiers, and the like.
一態様において、本発明の森林浴の疑似体験用液体組成物は無菌である。植物細胞外小胞の懸濁液を、植物細胞外小胞より大きな細菌は通過しないが、植物細胞外小胞は通過する孔径（例、0.2～0.8μm）のフィルターでろ過することにより、無菌の森林浴の疑似体験用液体組成物を得ることができる。 In one embodiment, the liquid composition for simulated forest bathing experience of the present invention is sterile. The suspension of plant extracellular vesicles is filtered through a filter with a pore size (e.g., 0.2 to 0.8 μm) that does not allow bacteria larger than the plant extracellular vesicles to pass through, but allows the plant extracellular vesicles to pass through. A liquid composition for a simulated forest bathing experience can be obtained.
本発明の森林浴の疑似体験用液体組成物は、噴霧装置に収容することによりスプレー製剤とすることができる。噴霧装置としては、本発明の森林浴の疑似体験用液体組成物を充填でき、噴霧を可能とし、スプレー剤として機能するものであれば特に限定されないが、例えば、ポンプ式噴霧器、トリガー式噴霧器、エアロゾル式噴霧器等を挙げることができる。 The liquid composition for simulated forest bathing experience of the present invention can be made into a spray formulation by being placed in a spray device. The spraying device is not particularly limited as long as it can be filled with the liquid composition for a simulated forest bathing experience of the present invention, enables spraying, and functions as a spray agent, but includes, for example, a pump-type sprayer, a trigger-type sprayer, and an aerosol. Examples include a type sprayer and the like.
上記スプレー製剤等を用いて、本発明の森林浴の疑似体験用液体組成物を室内や、ヒトの皮膚等へ噴霧することにより、森林浴を疑似体験することができる。 By spraying the liquid composition for simulating forest bathing of the present invention indoors or onto human skin using the above-mentioned spray formulation, it is possible to simulate forest bathing.
本発明の森林浴の疑似体験用液体組成物を室内等の空間に噴霧する際に、噴霧する植物細胞外小胞の個数や濃度は特に制限されないが、空気1m3あたりに含まれる植物細胞外小胞の数が、通常、107個以上、好ましくは108個以上、109個以上、又は1010個以上となるように、植物細胞外小胞を噴霧する。噴霧する植物細胞外小胞の粒子数の上限値は、理論的には特に制限はないが、通常、空気1m3あたりに含まれる植物細胞外小胞の数が、1015個／ml以下、1014個／ml以下、又は1013個／ml以下となるように植物細胞外小胞を噴霧する。後述の実施例において示すように、森林環境においては、空気１ｍ3あたり108～109オーダーの粒子数の植物細胞外小胞が含まれることが期待される。そこで、一態様において、空気１ｍ3あたりに、森林環境と同程度の粒子数（例、108個以上、1010個以下）の植物細胞外小胞が含まれるように、本発明の森林浴の疑似体験用液体組成物を噴霧する。別の態様において、空気１ｍ3あたりに、森林環境を超える粒子数（例、1010個超）の植物細胞外小胞が含まれるように、本発明の森林浴の疑似体験用液体組成物を噴霧する。 When spraying the liquid composition for a simulated forest bathing experience of the present invention into a space such as an indoor space, there are no particular restrictions on the number or concentration of plant extracellular vesicles to be sprayed. Plant extracellular vesicles are sprayed so that the number of vesicles is usually 10 7 or more, preferably 10 8 or more, 10 9 or more, or 10 10 or more. The upper limit for the number of plant extracellular vesicle particles to be sprayed is theoretically not particularly limited, but usually, the number of plant extracellular vesicles contained in 1 m3 of air is 10 to 15 particles/ml or less, Spray plant extracellular vesicles at a concentration of 10 14 vesicles/ml or less, or 10 13 vesicles/ml or less. As shown in the examples below, in a forest environment, it is expected that 1 m 3 of air contains plant extracellular vesicles in a particle number on the order of 10 8 to 10 9 . Therefore, in one embodiment, the forest bathing method of the present invention is designed so that the number of plant extracellular vesicles per m 3 of air is the same as in the forest environment (e.g., 10 8 or more, 10 10 or less). Spray a liquid composition for a simulated experience. In another embodiment, the liquid composition for simulated forest bathing experience of the present invention is sprayed so that the number of plant extracellular vesicles per m 3 of air is greater than that of a forest environment (e.g., greater than 10 ). do.
刊行物、特許文献等を含む、本明細書に引用されたすべての参考文献は、引用により、それらが個々に具体的に参考として援用されかつその内容全体が具体的に記載されているのと同程度まで、本明細書に援用される。 All references cited herein, including publications, patent documents, etc., are incorporated by reference into the specification, as if each individual reference were specifically incorporated by reference and as if the entire contents were specifically described. It is incorporated herein by reference to the same extent.
以下に、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be explained in more detail with reference to Examples below, but the present invention is not limited thereto.
［実施例１］植物蒸散液からの細胞外小胞の抽出及びmiRNAの解析
［方法］
（1）植物蒸散液の回収
シルバープリペット(Ligustrum sinense)、クヌギ(Quercus acutissima)、カラカシ(Quercus glauca)及びツツジ(Rhododendron ferrugineum)の枝先にビニール袋をかぶせ、袋口を閉じ、3～7時間程度放置した（図1～3）。ビニール袋の裏表面に結露した水分（蒸散液）を回収した。
[Example 1] Extraction of extracellular vesicles from plant transpiration fluid and analysis of miRNA [Method]
(1) Collection of plant transpiration liquid Place a plastic bag over the tip of a branch of Ligustrum sinense, Quercus acutissima, Quercus glauca, and Rhododendron ferrugineum, close the bag opening, and collect 3 to 7 days. It was left for about an hour (Figures 1 to 3). The moisture that had condensed on the back surface of the plastic bag (transpiration liquid) was collected.
（2）植物蒸散液からの細胞外小胞の抽出
1.2mLの蒸散液を20℃、10,000 x gで10分間遠心分離に付した。1mLの上清を新しい2mLチューブに移し、1mLのTotal Exosome Isolation Reagent(from urine) (Thermo Fisher社製)を加えた。溶液が均一になるまで、チューブを反転またはボルテックスしてよく混合し、混合液を室温で1時間インキュベートした。混合液を4℃、10,000 x gで1時間遠心分離した。ピペットで上清を吸引することにより、ペレットを乱さずに上清を除去した。細胞外小胞をチューブの底のペレットとして回収した。
(2) Extraction of extracellular vesicles from plant transpiration fluid
1.2 mL of the evaporated liquid was centrifuged at 20°C and 10,000 xg for 10 minutes. 1 mL of supernatant was transferred to a new 2 mL tube, and 1 mL of Total Exosome Isolation Reagent (from urine) (manufactured by Thermo Fisher) was added. The tube was mixed well by inverting or vortexing until the solution was homogeneous, and the mixture was incubated at room temperature for 1 h. The mixture was centrifuged at 10,000 xg for 1 hour at 4°C. The supernatant was removed without disturbing the pellet by aspirating the supernatant with a pipette. Extracellular vesicles were collected as a pellet at the bottom of the tube.
（3）細胞外小胞からのmiRNAの抽出
ペレット化した細胞外小胞を指で軽く叩きルーズにした。細胞外小胞に700 μlのQIAzol Lysis Reagentを添加し、ボルテックス又はピペットで混和し、室温（15～25℃）で5分間静置した。ホモジネート溶液に140 μlのクロロホルムを添加し、15 秒間激しく振り、得られた混合液を室温（15～25℃）で2～3分間静置した。混合液を、4℃、12,000 x g で15 分間遠心分離し、遠心で分離された一番上の水層350 μlを新しい2 mlチューブに移した。水層に1.5倍容量の100％エタノール525 μlを添加し、ピペットで完全に混和した。2 ml コレクションチューブにセットしたRNeasy Microスピンカラム（Qiagen社製）に最大700 μl のサンプル（形成した沈殿物を含む）をピペットでアプライし、室温（15～25℃）、8,000 x g以上で15秒間遠心した。コレクションチューブに溜まったろ液は棄てた。残ったサンプルを同じRNeasy Microスピンカラムにアプライし、miRNAを1つのカラムにまとめた。700 μlのBuffer RWTをRNeasy Microスピンカラムに添加し、8,000 x g以上で15 秒間遠心してカラムを洗浄した。500 μlのBuffer RPEをRNeasy Microスピンカラムに添加し、8,000 x g（10,000 rpm）以上で15 秒間遠心してカラムを洗浄した。RNeasy Microスピンカラムに500 μlのBuffer RPEを再度添加し、RNeasy Microスピンカラム・メンブレンを乾燥するため、8,000 x g以上で2分間遠心した。RNeasy Micro スピンカラムを新しい2 mlチューブに移し、最高スピードで1分間マイクロ遠心機で遠心した。RNeasy Micro スピンカラムを新しい1.5 ml のチューブに移し、20～50 μlのRNase フリー水を直接RNeasy Micro スピンカラム・メンブレンにアプライし、8,000 x g以上で1 分間遠心し、RNAを溶出することにより、miRNA含有溶液を得た。
(3) Extraction of miRNA from extracellular vesicles The pelleted extracellular vesicles were lightly tapped with a finger to loosen them. 700 μl of QIAzol Lysis Reagent was added to the extracellular vesicles, mixed by vortexing or pipetting, and left at room temperature (15-25°C) for 5 minutes. 140 μl of chloroform was added to the homogenate solution, shaken vigorously for 15 seconds, and the resulting mixture was allowed to stand at room temperature (15-25°C) for 2-3 minutes. The mixture was centrifuged at 4°C and 12,000 xg for 15 minutes, and 350 μl of the centrifuged top aqueous layer was transferred to a new 2 ml tube. 525 μl of 1.5 times the volume of 100% ethanol was added to the aqueous layer and mixed completely with a pipette. Pipette up to 700 μl of the sample (including any precipitate formed) onto an RNeasy Micro spin column (Qiagen) set in a 2 ml collection tube, and incubate for 15 seconds at room temperature (15-25°C) at 8,000 x g or higher. Centrifuged. The filtrate collected in the collection tube was discarded. The remaining sample was applied to the same RNeasy Micro spin column to combine miRNAs into one column. 700 μl of Buffer RWT was added to the RNeasy Micro spin column and the column was washed by centrifugation at 8,000 x g or higher for 15 seconds. 500 μl of Buffer RPE was added to the RNeasy Micro spin column and the column was washed by centrifugation at 8,000 x g (10,000 rpm) for 15 seconds. 500 μl of Buffer RPE was added to the RNeasy Micro spin column again and centrifuged at 8,000 x g or higher for 2 minutes to dry the RNeasy Micro spin column membrane. The RNeasy Micro spin column was transferred to a new 2 ml tube and spun in a microcentrifuge for 1 minute at maximum speed. Transfer the RNeasy Micro spin column to a new 1.5 ml tube, apply 20-50 μl of RNase-free water directly to the RNeasy Micro spin column membrane, and elute the RNA by centrifuging at >8,000 x g for 1 min. A containing solution was obtained.
（4）RNAの品質チェック
バイオアナライザー（Agilent 2100、Agilent Technologies社製）を用いて、（3）で得られたmiRNA含有溶液の品質を評価した。サンプル調製は、Agilent RNA 6000ピコキット（Agilent Technologies社製）を用いた。標準サンプルとして、25、200、500、1000、2000、4000、6000 nts相当のRNAを含むラダーを用いた。
(4) RNA quality check The quality of the miRNA-containing solution obtained in (3) was evaluated using a bioanalyzer (Agilent 2100, manufactured by Agilent Technologies). For sample preparation, Agilent RNA 6000 Pico Kit (manufactured by Agilent Technologies) was used. A ladder containing RNA equivalent to 25, 200, 500, 1000, 2000, 4000, and 6000 nts was used as a standard sample.
（5）miRNA配列解析
QIAseq miRNA UDI Library Kit（QIAGEN）を用いて、（3）で得られたmiRNA含有溶液からNGSライブラリーを構築し、NGSによる配列解析に付した。
PNRD(http://structuralbiology.cau.edu.cn/PNRD/)およびPMIREN(https://www.pmiren.com/)のデータベースサイトからリファレンスデータ(FASTAファイル)をダウンロードした。データベースにLigustrum sinense、Quercus acutissima、Quercus glauca、Rhododendron ferrugineumのデータはないため、判明している全植物種のmiRNAのリファレンスデータを用いた。各FASTAファイルをmiRNA解析用プログラム(ezcount、https://gitlab.com/BioAlgo/miR-pipe)に適したデータファイルへ変換した。植物種のmiRNAセットごとにezcountによるアライメントおよびカウントを実施した。
(5) miRNA sequence analysis
Using the QIAseq miRNA UDI Library Kit (QIAGEN), an NGS library was constructed from the miRNA-containing solution obtained in (3) and subjected to sequence analysis by NGS.
Reference data (FASTA files) were downloaded from the database sites of PNRD (http://structuralbiology.cau.edu.cn/PNRD/) and PMIREN (https://www.pmiren.com/). Since there is no data on Ligustrum sinense, Quercus acutissima, Quercus glauca, and Rhododendron ferrugineum in the database, we used miRNA reference data for all known plant species. Each FASTA file was converted into a data file suitable for a miRNA analysis program (ezcount, https://gitlab.com/BioAlgo/miR-pipe). Alignment and counting using ezcount was performed for each miRNA set of plant species.
［結果］
（1）植物蒸散液の回収
シルバープリペット、カラカシ及びツツジから、以下の表の条件で蒸散液を回収した。
[result]
(1) Collection of plant transpiration liquids Transpiration liquids were collected from Silver Pripet, Japanese oak, and azalea under the conditions shown in the table below.
シルバープリペット、カラカシ及びツツジから、それぞれ1000 μl、910 μl、及び880μlの蒸散液を回収した。回収した蒸散液を植物種ごとにまとめ、Total Exosome Isolation Reagent(from urine) (Thermo Fisher社製)を用いて、細胞外小胞を回収し、更に回収した細胞外小胞からRNeasy Microスピンカラムを用いてRNAを抽出した。 1000 μl, 910 μl, and 880 μl of transpiration liquid were collected from Silver Prepet, Karakaashi, and Azalea, respectively. The collected transpiration liquid was collected by plant species, and extracellular vesicles were collected using Total Exosome Isolation Reagent (from urine) (manufactured by Thermo Fisher). RNA was extracted using
（2）回収したRNAのサイズ及び品質チェック（１）
植物蒸散液から回収した細胞外小胞から抽出したRNA溶液をバイオアナライザーで解析し、その品質を評価した。代表的な結果を図4に示す。また、参考として植物細胞から回収したRNA溶液をバイオアナライザーで解析した結果を図5に示す。検出時間 22 sec (25 nts) 付近のピークは、内部標準サンプルに由来するものである。回収したRNAは、小分子のRNA領域（約200nt以下）に高いピークを示した。リボソームRNA（18S、28S）等の高分子領域のRNAの混入はほとんど認められず、大部分が小分子のRNA（miRNA）であった。
(2) Size and quality check of recovered RNA (1)
An RNA solution extracted from extracellular vesicles collected from plant transpiration fluid was analyzed using a bioanalyzer to evaluate its quality. Representative results are shown in Figure 4. Additionally, as a reference, Figure 5 shows the results of analyzing an RNA solution collected from plant cells using a bioanalyzer. The peak around the detection time of 22 sec (25 nts) is derived from the internal standard sample. The recovered RNA showed a high peak in the small RNA region (approximately 200 nt or less). Contamination with high-molecular region RNA such as ribosomal RNA (18S, 28S) was hardly observed, and the majority was small-molecule RNA (miRNA).
（3）回収したRNAのサイズ及び品質チェック（２）
シルバープリペット、カラカシ及びツツジの蒸散液から回収した細胞外小胞から抽出したRNA溶液をバイオアナライザーで解析し、その品質を評価した。内部標準サンプルを用いて、RNAのサイズを評価した。結果を図6～9に示す。回収したRNAは、小分子のRNA領域（約200nt以下）に高いピークを示した。リボソームRNA（18S、28S）等の高分子領域のRNAの混入はほとんど認められず、大部分が小分子のRNA（miRNA）であった。
(3) Size and quality check of recovered RNA (2)
RNA solutions extracted from extracellular vesicles collected from the transpiration fluids of Silver Prepet, Karakasa and Azalea were analyzed using a bioanalyzer to evaluate their quality. RNA size was assessed using an internal standard sample. The results are shown in Figures 6-9. The recovered RNA showed a high peak in the small RNA region (approximately 200 nt or less). Contamination with high-molecular region RNA such as ribosomal RNA (18S, 28S) was hardly observed, and the majority was small-molecule RNA (miRNA).
（4）miRNAの配列解析
植物蒸散液から回収したmiRNAからNGSライブラリーを構築し、NGSによる配列解析に付した。結果を以下の表に示す。
(4) Sequence analysis of miRNA An NGS library was constructed from miRNA recovered from plant transpiration fluid and subjected to sequence analysis by NGS. The results are shown in the table below.
表2及び3は、miRNA配列がリファレンスデータと一致したクローンの数をリファレンス配列の由来する植物種ごとにまとめたものであり、表2はPNRDのリファレンスデータ、表3はPMIRENのリファレンスデータとの比較結果を示す。表4は、代表例として、PNRDに登録されたコトカケヤナギ(Populus euphratica)のmiRNA配列と一致したクローンの数をmiRNAの種類ごとにまとめたものである。 Tables 2 and 3 summarize the number of clones whose miRNA sequences matched the reference data by plant species from which the reference sequences were derived. Table 2 shows the comparison with the PNRD reference data, and Table 3 shows the comparison with the PMIREN reference data. Comparison results are shown. As a representative example, Table 4 summarizes the number of clones that matched the miRNA sequence of Populus euphratica registered in the PNRD for each type of miRNA.
シルバープリペット、カラカシ、ツツジの蒸散液から回収したRNAをNGS解析したところ、多様なmiRNAが検出された。その配列を解析したところ、PNRD及びPMIRENに登録された種々の植物miRNAの配列と一致したことから、植物miRNAが回収できたことが示唆された。 NGS analysis of RNA collected from the transpiration fluid of Silver Pripet, Japanese Calanthe, and Azalea detected a variety of miRNAs. When the sequence was analyzed, it matched the sequences of various plant miRNAs registered in PNRD and PMIREN, suggesting that plant miRNAs had been recovered.
植物蒸散液から、細胞由来RNA（リボソーマルRNA）の混入なしに小分子RNAが抽出できたこと、及びその小分子RNAが植物miRNAであることが同定できたことから、植物蒸散液中に、その植物が気体中に放出した細胞外小胞が含まれることが示唆された。 We were able to extract small RNA from plant transpiration without contaminating cell-derived RNA (ribosomal RNA), and identified that the small RNA was plant miRNA. It was suggested that the gas contains extracellular vesicles released by plants into the gas.
［実施例２］ 蒸散液中の植物細胞外小胞のナノサイトによる解析
［方法］
１．植物蒸散液からの細胞外小胞の抽出
実施例１の方法に準じ、以下の植物蒸散液から、細胞外小胞を抽出した。
サンプル１：シルバープリペット蒸散液１７ｍＬ
サンプル２：シラカシ蒸散液３．６４ｍＬ
サンプル３：ツツジ蒸散液０．６２ｍＬ
サンプル５：ウバメガシ蒸散液２ｍＬ
[Example 2] Analysis of plant extracellular vesicles in transpiration liquid using nanosites [Method]
1. Extraction of extracellular vesicles from plant transpirations According to the method of Example 1, extracellular vesicles were extracted from the following plant transpirations.
Sample 1: Silver Prepet distilled liquid 17mL
Sample 2: Shirakashi transpiration liquid 3.64mL
Sample 3: Azalea transpiration liquid 0.62mL
Sample 5: Ubamegashi transpiration liquid 2mL
２．環境水からの植物細胞外小胞の抽出
南魚沼市妙音寺境内の湧水である「雷電様の水」から、以下の方法で植物細胞外小胞を抽出した。
環境水１６～１７ｍLを限外濾過チューブAmicon Ultra-15 （カットオフ：100kDa）に入れ、４℃、５０００ｇにて１０分間遠心し、２５０μＬ以下に濃縮した（１回目濃縮）。環境水約１６ｍＬを限外濾過チューブに追加し、４℃、５０００ｇにて８分間遠心し、２５０μＬ以下に濃縮した（２回目濃縮）。環境水約１６ｍＬを限外濾過チューブに追加し、４℃、５０００ｇにて５分間遠心し、２５０～５００μＬに濃縮した（３回目濃縮）。更に、環境水約１６ｍＬを限外濾過チューブに追加し、４℃、５０００ｇにて１０分間遠心し、２５０～５００μＬに濃縮し（４回目濃縮）、得られた濃縮液をサンプル６としてナノサイト解析に付した。
2. Extraction of plant extracellular vesicles from environmental water Plant extracellular vesicles were extracted from ``Raiden-like water'', a spring water within the precincts of Myoonji Temple, Minamiuonuma City, by the following method.
16 to 17 mL of environmental water was placed in an ultrafiltration tube Amicon Ultra-15 (cutoff: 100 kDa), centrifuged at 5000 g at 4°C for 10 minutes, and concentrated to 250 μL or less (first concentration). Approximately 16 mL of environmental water was added to the ultrafiltration tube, centrifuged at 5000 g at 4° C. for 8 minutes, and concentrated to 250 μL or less (second concentration). Approximately 16 mL of environmental water was added to the ultrafiltration tube, centrifuged at 5000 g at 4° C. for 5 minutes, and concentrated to 250 to 500 μL (third concentration). Furthermore, approximately 16 mL of environmental water was added to the ultrafiltration tube, centrifuged at 5,000 g at 4°C for 10 minutes, and concentrated to 250 to 500 μL (fourth concentration). The resulting concentrated liquid was used as sample 6 for nanosite analysis. It was attached to.
３．ナノサイト解析
上記１及び２で得られた各サンプルをナノサイトで解析し、サンプルに含まれる植物細胞外小胞の粒子径、及び粒子濃度を測定した。
3. Nanosite Analysis Each sample obtained in 1 and 2 above was analyzed using a nanosite, and the particle diameter and particle concentration of plant extracellular vesicles contained in the sample were measured.
図10～14に粒子径の測定結果を示す。植物種により、蒸散液中に含まれる細胞外小胞の粒子径が異なっていた。シルバープリペットでは、223nm付近に単一のピークが認められた（図10）。シラカシでは、66nm付近のメジャーなピークに加えて、53nmと282nm付近にマイナーなピークが認められた（図11）。ツツジでは、103nm、205nm及び557nm付近にピークが認められた（図12）。ウバメガシでは、210nm付近のメジャーなピークに加えて、42nm、94nm、271nm及び408nm付近にマイナーなピークが認められた（図13）。湧水では、202nm付近のメジャーなピークに加えて65nm付近にマイナーなピークが認められた（図14）。 Figures 10 to 14 show the measurement results of particle diameter. The particle size of extracellular vesicles contained in the transpiration fluid differed depending on the plant species. For Silver Prepet, a single peak was observed around 223 nm (Figure 10). For white oak, in addition to a major peak around 66 nm, minor peaks were observed around 53 nm and 282 nm (Figure 11). In Azalea, peaks were observed around 103 nm, 205 nm, and 557 nm (Figure 12). In Ubamegashi, in addition to a major peak around 210 nm, minor peaks were observed around 42 nm, 94 nm, 271 nm, and 408 nm (Figure 13). For spring water, in addition to a major peak around 202 nm, a minor peak around 65 nm was observed (Figure 14).
ナノサイトにおける粒子数の測定結果に基づき、各サンプルの原液中の細胞外小胞濃度を算出した。結果を表5に示す。 Based on the measurement results of the number of particles in the nanosites, the concentration of extracellular vesicles in the stock solution of each sample was calculated. The results are shown in Table 5.
更に、森林環境として25℃における飽和水蒸気量（23g/m3）あたりの細胞外小胞濃度を算出した。また、体積100m3（広さ50m2、高さ2mの部屋に相当）に含まれる細胞外小胞数を算出した。結果を表6に示す。 Furthermore, the extracellular vesicle concentration per saturated water vapor amount (23 g/m 3 ) at 25°C in a forest environment was calculated. In addition, the number of extracellular vesicles contained in a volume of 100 m 3 (equivalent to a room with a width of 50 m 2 and a height of 2 m) was calculated. The results are shown in Table 6.
上記測定結果から、植物の蒸散水には、1mLあたり106～108オーダーの粒子数の細胞外小胞が含まれることが示唆された。また、森林環境中の湧水にも、105オーダーの粒子数の細胞外小胞が含まれることが示唆された。すなわち、森林環境中の湧水には、植物蒸散水の1/100程度の植物細胞外小胞が含まれていることが示唆された。これらの植物の蒸散水で、空気1m3を25℃における飽和水蒸気量で充たすと、空気1m3あたり108～109オーダーの粒子数の細胞外小胞が含まれることになる。すなわち、森林浴においては、空気１ｍ3あたり108～109オーダーの粒子数の植物細胞外小胞が期待される。また、体積100m3の部屋を森林環境と同等数の植物細胞外小胞で満たすためには、1010～1011オーダーの粒子数の植物細胞外小胞を用意することが期待され、1012の粒子数の植物細胞外小胞があれば十分と考えられる。1011個の植物細胞外小胞は、およそ、10倍濃縮した蒸散水10mL、及び1000倍濃縮した湧水10mLに相当する。 The above measurement results suggested that plant transpiration water contains extracellular vesicles with a particle number on the order of 10 6 to 10 8 per mL. It was also suggested that spring water in forest environments contains extracellular vesicles with particles on the order of 10 5 . In other words, it was suggested that spring water in forest environments contains about 1/100 of plant extracellular vesicles compared to plant transpiration water. If 1 m 3 of air is filled with saturated water vapor at 25°C using the water transpired by these plants, each 1 m 3 of air will contain extracellular vesicles on the order of 10 8 to 10 9 particles. That is, in forest bathing, the number of plant extracellular vesicles is expected to be on the order of 10 8 to 10 9 particles per 1 m 3 of air. In addition, in order to fill a room with a volume of 100 m 3 with the same number of plant extracellular vesicles as in a forest environment, it is expected that the number of plant extracellular vesicles on the order of 10 10 to 10 11 must be prepared, and 10 12 It is considered that a particle number of plant extracellular vesicles is sufficient. 10 11 plant extracellular vesicles corresponds approximately to 10 mL of 10-fold concentrated transpiration water and 10 mL of 1000-fold concentrated spring water.
本発明により、植物が気体中に放出した単離された細胞外小胞が提供される。本発明により、植物が生息する周囲の空気環境中から細胞外小胞を調製することが可能となる。特に植物の蒸散物には、細胞外小胞が豊富に含まれる一方、植物細胞体由来の成分がほとんど混入していないため、植物の蒸散物から、簡便な操作で、高純度の細胞外小胞を回収することが可能である。植物が気体中に細胞外小胞を放出することは、これまでに知られておらず、植物が生息する周囲の空気や、植物蒸散物は、植物細胞外小胞の新たな原料となり得る。 The present invention provides isolated extracellular vesicles released into the gas by plants. The present invention makes it possible to prepare extracellular vesicles from the air environment surrounding plants. In particular, while plant transpiration contains abundant extracellular vesicles, it contains almost no components derived from plant cell bodies. It is possible to collect the cells. It has not been previously known that plants release extracellular vesicles into the air, and the air surrounding plants and plant transpiration may serve as new raw materials for plant extracellular vesicles.
本出願は日本で出願された特願2023-075298（出願日：2023年4月28日）を
基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
This application is based on Japanese Patent Application No. 2023-075298 (filing date: April 28, 2023), the contents of which are fully incorporated herein.
Claims (5)
2. The preparation method according to claim 1 , comprising isolating extracellular vesicles released into the gas by the plants from the environmental water of the area where the plants live.
Applications Claiming Priority (2)
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