JP7402491B2 - Exosome isolation methods, exosome isolation kits, and exosome removal methods - Google Patents
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Description
本発明は、エクソソームの単離方法、エクソソームの単離キット、およびエクソソームの除去方法に関する。 The present invention relates to an exosome isolation method, an exosome isolation kit, and an exosome removal method.
エクソソームは、細胞から分泌される直径５０～１５０ｎｍ程度の、脂質二重膜に覆われている細胞外小胞である。エクソソームの内部には、タンパク質、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（以下、「ｍｉＲＮＡ」という。）等、分泌元の細胞固有の情報が高度に保存されていることから、がん等の各種疾患および生命現象の新たなバイオマーカーとして注目されている。 Exosomes are extracellular vesicles that are secreted from cells and have a diameter of about 50 to 150 nm and are covered with a lipid bilayer membrane. Inside exosomes, information unique to the secreting cell, such as proteins, mRNA, and microRNA (hereinafter referred to as "miRNA"), is highly preserved. It is attracting attention as a new biomarker.
また近年、間葉系幹細胞由来のエクソソームが、抗炎症作用および複合的な免疫制御作用を持つことが明らかとなり、エクソソームそのものを治療薬として利用する研究が活発に行なわれている。そのため、エクソソームを損傷の少ない状態（インタクトな状態）で単離する技術の重要性が高まってきている。エクソソームによる治療および診断の世界的な市場規模は、２０２３年には１億８千万米ドルに達するとの予測もあり、エクソソームの研究は最も成長が期待される研究分野のひとつに挙げられている。 Furthermore, in recent years, it has become clear that exosomes derived from mesenchymal stem cells have anti-inflammatory and complex immunoregulatory effects, and research is actively being conducted to utilize exosomes themselves as therapeutic agents. Therefore, techniques for isolating exosomes in a less damaged state (intact state) are becoming increasingly important. The global market size for exosome-based treatments and diagnostics is predicted to reach 180 million US dollars by 2023, and exosome research is considered one of the research fields with the highest growth expectations. .
エクソソームの単離方法としては、超遠心機を用いた超遠心分離法が一般的に利用されている。しかしながら、この超遠心分離法は、大スケール化（大量精製）および多検体化に対応することが難しい。さらには、強い遠心力によってエクソソームが損傷を受ける等の問題点も指摘されている。これからのエクソソーム研究およびエクソソームによる治療の普及には、より再現性が高く、大量かつ多検体に対応できる単離方法の開発が求められている。 As a method for isolating exosomes, ultracentrifugation using an ultracentrifuge is generally used. However, this ultracentrifugation method is difficult to cope with large-scale (large-scale purification) and multi-analyte use. Furthermore, problems such as exosomes being damaged by strong centrifugal force have also been pointed out. For future exosome research and the spread of exosome-based treatments, there is a need for the development of isolation methods that are more reproducible and can handle large quantities and multiple samples.
例えば、特許文献１には、互いに近接した４つ以上のリジンを含むペプチドを利用することで、損傷の極めて少ない、インタクトな状態でのエクソソームの単離方法が開示されている。 For example, Patent Document 1 discloses a method for isolating exosomes in an intact state with extremely little damage by using a peptide containing four or more lysines in close proximity to each other.
しかしながら、エクソソームは均一なものではなく、分化した細胞の種類および状態によって多様に変化することが知られている。例えば、ＣＤ９およびＣＤ６３はいずれもエクソソームのマーカーとして知られているが、エクソソームでの、ＣＤ９の発現量とＣＤ６３の発現量との相関はあまり高くないと考えられている。すなわち、比較的ＣＤ９の発現量が多いエクソソーム（ＣＤ９陽性エクソソーム）と、比較的ＣＤ６３の発現量が多いエクソソーム（ＣＤ６３陽性エクソソーム）とが存在する。ＣＤ６３陽性エクソソームは、腫瘍化した細胞から多く分泌されることが知られている（参考文献：Ricklefs FL et al. J Extracell Vesicles. 2019;8(1);1588555）。したがって、特にがん診断分野においては、ＣＤ６３陽性エクソソームを効率よく単離できることが求められる。また、今後、例えばエクソソームそのものを治療薬として利用する場合には、多様な種類のエクソソームを単離できる方法が必要となる。しかしながら、特許文献１に記載のエクソソームの単離方法では、単離できるエクソソームの種類については不明である。 However, it is known that exosomes are not uniform and vary widely depending on the type and state of differentiated cells. For example, both CD9 and CD63 are known as markers of exosomes, but it is thought that the correlation between the expression levels of CD9 and CD63 in exosomes is not very high. That is, there are exosomes that express a relatively high amount of CD9 (CD9-positive exosomes) and exosomes that express a relatively high amount of CD63 (CD63-positive exosomes). It is known that CD63-positive exosomes are secreted in large quantities from tumorigenic cells (Reference: Ricklefs FL et al. J Extracell Vesicles. 2019;8(1);1588555). Therefore, especially in the field of cancer diagnosis, it is required to be able to efficiently isolate CD63-positive exosomes. Furthermore, in the future, for example, if exosomes themselves are to be used as therapeutic agents, methods that can isolate various types of exosomes will be needed. However, with the exosome isolation method described in Patent Document 1, the types of exosomes that can be isolated are unknown.
本発明者らが鋭意検討した結果、特許文献１に記載のエクソソームの単離方法（互いに近接した４つ以上のリジンを含むペプチドを用いた方法）は、ＣＤ９陽性エクソソームがＣＤ６３陽性エクソソームよりも優先的に単離できることが分かった（後述の比較例２参照）。本発明の目的は、簡便に、かつインタクトな状態で（またはインタクトに近い状態で）多様な種類のエクソソーム、特にＣＤ６３陽性エクソソームを単離する方法およびエクソソームの単離キットを提供することにある。また、本発明の他の目的は、エクソソームを含む試料から簡便に多様な種類のエクソソームを除去できる、エクソソームの除去方法を提供することにある。 As a result of intensive studies by the present inventors, the method for isolating exosomes described in Patent Document 1 (method using a peptide containing four or more lysines in close proximity to each other) gives priority to CD9-positive exosomes over CD63-positive exosomes. (See Comparative Example 2 below). An object of the present invention is to provide a method and an exosome isolation kit for easily isolating various types of exosomes, particularly CD63-positive exosomes, in an intact state (or in a near-intact state). Another object of the present invention is to provide an exosome removal method that can easily remove various types of exosomes from a sample containing exosomes.
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、リン脂質との親和性が高いアルギニンを含むペプチドが、多様なエクソソームと結合することができ、特にＣＤ６３陽性エクソソームと優先的に結合できることを見出した。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors found that a peptide containing arginine, which has a high affinity for phospholipids, can bind to a variety of exosomes, and in particular binds preferentially to CD63-positive exosomes. I found out what I can do.
すなわち、本発明の一実施形態は、以下のような構成である。
〔１〕エクソソームを含む試料からエクソソームを単離する、エクソソームの単離方法であって、前記試料と、互いに近接した４つ以上のアルギニンを含むペプチドと、前記ペプチドを担持可能な担体とを接触させるか、または、前記試料と、前記担体に担持された前記ペプチドとを接触させることによって、前記エクソソームと前記担体に担持された前記ペプチドとが結合してなる複合体を形成させる複合体形成工程、および、前記複合体形成工程によって得られた前記複合体と、金属陽イオンを含む解離バッファーとを接触させて、前記複合体から前記エクソソームを解離させる解離工程を含むことを特徴とする、エクソソームの単離方法。
〔２〕前記ペプチドに含まれるアルギニンは連続していることを特徴とする、〔１〕に記載のエクソソームの単離方法。
〔３〕前記ペプチドに含まれるアルギニンは、８つ以上であることを特徴とする、〔１〕または〔２〕に記載のエクソソームの単離方法。
〔４〕前記エクソソームは、ＣＤ６３陽性エクソソームの含有量が、ＣＤ９陽性エクソソームの含有量の１０％以上であることを特徴とする、〔１〕から〔３〕何れか１つに記載のエクソソームの単離方法。
〔５〕前記試料は、生体由来であり、前記エクソソーム以外の夾雑物を含んでいることを特徴とする、〔１〕から〔４〕の何れか１つに記載のエクソソームの単離方法。
〔６〕前記担体は、磁性ビーズであることを特徴とする、〔１〕から〔５〕の何れか１つに記載のエクソソームの単離方法。
〔７〕〔１〕から〔６〕の何れか１つに記載のエクソソームの単離方法を行なうためのエクソソームの単離キットであって、前記ペプチド、前記担体および前記解離バッファーを含むことを特徴とする、エクソソームの単離キット。
〔８〕エクソソームを含む試料からエクソソームを除去する、エクソソームの除去方法であって、前記試料と、互いに近接した４つ以上のアルギニンを含むペプチドと、前記ペプチドを担持可能な担体とを接触させるか、または、前記試料と、前記担体に担持された前記ペプチドとを接触させることによって、前記エクソソームと前記担体に担持された前記ペプチドとが結合してなる複合体を形成させる複合体形成工程、および、前記複合体形成工程によって得られた前記複合体を担持する前記担体と、前記試料とを分離して、前記試料から前記エクソソームの少なくとも一部が除去された分離液を得る分離工程を含むことを特徴とする、エクソソームの除去方法。
That is, one embodiment of the present invention has the following configuration.
[1] A method for isolating exosomes, which involves isolating exosomes from a sample containing exosomes, the method comprising contacting the sample, a peptide containing four or more arginines in close proximity to each other, and a carrier capable of supporting the peptide. or a complex forming step of forming a complex in which the exosome and the peptide supported on the carrier are combined by bringing the sample and the peptide supported on the carrier into contact with each other. , and a dissociation step of dissociating the exosome from the complex by contacting the complex obtained by the complex formation step with a dissociation buffer containing a metal cation. isolation method.
[2] The method for isolating exosomes according to [1], wherein the arginines contained in the peptide are continuous.
[3] The method for isolating exosomes according to [1] or [2], wherein the peptide contains eight or more arginines.
[4] The exosome is a single exosome according to any one of [1] to [3], wherein the content of CD63-positive exosomes is 10% or more of the content of CD9-positive exosomes. How to leave.
[5] The method for isolating exosomes according to any one of [1] to [4], wherein the sample is derived from a living body and contains impurities other than the exosomes.
[6] The method for isolating exosomes according to any one of [1] to [5], wherein the carrier is a magnetic bead.
[7] An exosome isolation kit for carrying out the exosome isolation method according to any one of [1] to [6], comprising the peptide, the carrier, and the dissociation buffer. An exosome isolation kit.
[8] A method for removing exosomes from a sample containing exosomes, the method comprising: contacting the sample with a peptide containing four or more arginines in close proximity to each other and a carrier capable of supporting the peptide; or, a complex forming step of forming a complex in which the exosome and the peptide supported on the carrier are combined by contacting the sample with the peptide supported on the carrier, and , a separation step of separating the carrier carrying the complex obtained in the complex formation step and the sample to obtain a separated liquid from which at least a portion of the exosomes have been removed from the sample. A method for removing exosomes, characterized by:
本発明の一実施形態によれば、簡便に、かつインタクトな状態で（またはインタクトに近い状態で）、多様な種類のエクソソームを単離することが可能となるという効果を奏する。 According to one embodiment of the present invention, it is possible to easily isolate various types of exosomes in an intact state (or in a near-intact state).
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能である。本発明はまた、異なる実施形態および実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態および実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。なお、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上（Ａを含みかつＡより大きい）Ｂ以下（Ｂを含みかつＢより小さい）」を意図する。 An embodiment of the present invention will be described below, but the present invention is not limited thereto. The present invention is not limited to each configuration described below, and various changes can be made within the scope of the claims. The present invention also includes embodiments and examples obtained by appropriately combining technical means disclosed in different embodiments and examples. Note that all academic literature and patent literature described in this specification are incorporated as references in this specification. In addition, unless otherwise specified in this specification, the numerical range "A to B" is intended to be "above A (including A and greater than A) and less than or equal to B (including B and less than B)."
本明細書中では、用語「ペプチド」は、「ポリペプチド」と交換可能に使用され、ペプチド結合によってアミノ酸２個以上が結合した化合物を意味する。本明細書中では、アミノ酸の表記は、適宜ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記または３文字表記を使用する。 As used herein, the term "peptide" is used interchangeably with "polypeptide" and refers to a compound in which two or more amino acids are linked by a peptide bond. In this specification, the one-letter or three-letter notation defined by IUPAC and IUB is used as appropriate for the notation of amino acids.
〔１．エクソソームの単離方法〕
本発明の一実施形態に係るエクソソームの単離方法（以下、適宜「本発明の単離方法」という。）は、エクソソームを含む試料からエクソソームを単離する、エクソソームの単離方法であって、
前記試料と、互いに近接した４つ以上のアルギニンを含むペプチドと、前記ペプチドを担持可能な担体とを接触させるか、または、前記試料と、前記担体に担持された前記ペプチドとを接触させることによって、前記エクソソームと前記担体に担持された前記ペプチドとが結合してなる複合体を形成させる複合体形成工程、および、
前記複合体形成工程によって得られた前記複合体と、金属陽イオンを含む解離バッファーとを接触させて、前記複合体から前記エクソソームを解離させる解離工程を含んでいる。
[1. Exosome isolation method]
A method for isolating exosomes according to an embodiment of the present invention (hereinafter referred to as "isolation method of the present invention") is a method for isolating exosomes from a sample containing exosomes, comprising:
By bringing the sample into contact with a peptide containing four or more arginines close to each other and a carrier capable of supporting the peptide, or by contacting the sample with the peptide supported on the carrier. , a complex forming step in which the exosome and the peptide supported on the carrier form a complex, and
The method includes a dissociation step of bringing the complex obtained by the complex formation step into contact with a dissociation buffer containing a metal cation to dissociate the exosome from the complex.
本発明の一実施形態に係るエクソソームの単離方法は、前記構成とすることから、後記（１）～（３）の効果を奏する。
（１）超遠心機等を使用する必要がないため、短時間に、かつ、簡便に、エクソソームを単離できる。
（２）４つ以上のアルギニンを含むペプチドが、比較的ＣＤ６３の発現量が多いエクソソーム（ＣＤ６３陽性エクソソーム）を含む多様なエクソソームの膜に結合することを利用しているため、広くエクソソームを捕捉し、単離することができる。
（３）膜構造に影響を及ぼすような界面活性剤等を含む解離バッファーではなく、エクソソームの膜構造および膜に存在するタンパク質の構造に影響が無い（または少ない）金属陽イオンを含む解離バッファーを用いたマイルドな（温和な）条件で、複合体からエクソソームを解離させている。そのため、エクソソームを傷つけることなく（言い換えれば、インタクトな状態、またはインタクトに近い状態で）、複合体からエクソソームを単離することができる。
Since the method for isolating exosomes according to one embodiment of the present invention has the above configuration, it achieves the effects (1) to (3) below.
(1) Since there is no need to use an ultracentrifuge or the like, exosomes can be isolated easily and in a short time.
(2) It utilizes the fact that a peptide containing four or more arginines binds to the membranes of various exosomes, including exosomes with a relatively high expression level of CD63 (CD63-positive exosomes), so it can capture a wide range of exosomes. , can be isolated.
(3) Use a dissociation buffer that contains metal cations that do not (or have little) effect on the membrane structure of exosomes and the structure of proteins present in the membrane, rather than a dissociation buffer that contains surfactants that may affect the membrane structure. The mild conditions used were used to dissociate exosomes from the complex. Therefore, exosomes can be isolated from the complex without damaging the exosomes (in other words, in an intact state or a near-intact state).
インタクトな状態（またはインタクトに近い状態）のエクソソームを単離することによって、例えば、（１）エクソソームの生理作用等の機能解析、および（２）バイオマーカー（エクソソーム由来のタンパク質、ｍｉＲＮＡ等の核酸）等に利用することが可能である。 By isolating intact (or near-intact) exosomes, it is possible to perform, for example, (1) functional analysis of exosome physiological effects, and (2) biomarkers (exosome-derived proteins, nucleic acids such as miRNA). It is possible to use it for etc.
また、エクソソームはがん、アルツハイマー病、心筋梗塞、脳梗塞、および感染症等、幅広い疾患の治療への応用が期待されている。そのため、インタクトな状態（またはインタクトに近い状態）のエクソソームを単離することによって、単離したエクソソームそのものを、（３）治療薬、および（４）ドラッグデリバリーシステムの運搬体、として利用できる。特に、前記（３）治療薬としてのエクソソームの利用には、（Ａ）再生医療への補助的な利用、（Ｂ）免疫制御を目的とした利用、および（Ｃ）ワクチンとしての利用等が考えられている（参考文献：実験医学、２０１６年、３４巻、ｐ１３９０-１３９６：エクソソームが築く次世代医療）。 In addition, exosomes are expected to be applied to the treatment of a wide range of diseases, including cancer, Alzheimer's disease, myocardial infarction, cerebral infarction, and infectious diseases. Therefore, by isolating intact (or nearly intact) exosomes, the isolated exosomes themselves can be used as (3) therapeutic agents and (4) carriers for drug delivery systems. In particular, the use of exosomes as a therapeutic drug in (3) above includes (A) supplementary use in regenerative medicine, (B) use for the purpose of immune control, and (C) use as a vaccine. (Reference: Experimental Medicine, 2016, Vol. 34, p1390-1396: Next-generation medicine built by exosomes).
前記（Ａ）～（Ｃ）について具体例を挙げて説明する。間葉系幹細胞（mesenchymal stem/stromal cell；ＭＳＣ）由来のエクソソームは、最も研究されているエクソソームである。ＭＳＣ由来のエクソソームは、細胞分裂の促進作用、抗アポトーシス作用、および抗炎症作用を持つことが知られている。これにより、損傷組織の周囲の組織の２次的な損傷を低減することが可能であり、損傷組織の回復を促進することができる。そのため、皮膚および肝臓の再生、並びに心筋梗塞からの回復等の多くの疾患への応用が期待されている（（Ａ）再生医療への補助的な利用）。また、ＭＳＣ由来のエクソソームには、複合的な免疫制御作用があり、自己免疫疾患の治療、および臓器移植後の免疫制御への応用が期待されている（（Ｂ）免疫制御を目的とした利用）。 The above (A) to (C) will be explained by giving specific examples. Exosomes derived from mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) are the most studied exosomes. MSC-derived exosomes are known to have cell division-promoting effects, anti-apoptotic effects, and anti-inflammatory effects. Thereby, it is possible to reduce secondary damage to tissues surrounding the damaged tissue, and it is possible to promote recovery of the damaged tissue. Therefore, it is expected to be applied to many diseases such as skin and liver regeneration and recovery from myocardial infarction ((A) auxiliary use in regenerative medicine). In addition, MSC-derived exosomes have complex immunoregulatory effects, and are expected to be applied to the treatment of autoimmune diseases and immune regulation after organ transplantation ((B) Use for immune regulation) ).
また、抗原提示細胞にがん抗原ペプチドを反応させた後に回収した、抗原提示細胞から分泌されたエクソソームには、抗原ペプチドが提示されており、ＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化する作用がある。また、がん細胞由来のエクソソームを直接抗原として使用することによって、当該エクソソームをワクチンとして利用することも考えられている（（Ｃ）ワクチンとしての利用）。 In addition, exosomes secreted from antigen-presenting cells, which are collected after reacting antigen-presenting cells with cancer antigen peptides, present antigenic peptides and have the effect of activating CD4-positive and CD8-positive T cells. be. Furthermore, it is also considered to use exosomes derived from cancer cells as vaccines by directly using them as antigens ((C) Use as vaccines).
特に、本発明の単離方法により効率的に単離できるＣＤ６３陽性エクソソームは、腫瘍化した細胞から多く分泌されることが知られている。本発明の単離方法は、比較的ＣＤ９の発現量が多いエクソソーム（ＣＤ９陽性エクソソーム）およびＣＤ６３陽性エクソソーム等を含む、多様な種類のエクソソームを網羅的に単離できる。したがって、本発明の単離方法により単離されたエクソソームによれば、前記（１）エクソソームの生理作用等の機能解析について、より網羅的かつ漏れの少ない解析が実現できる。特にがん分野においては、前記（１）エクソソームの生理作用等の機能解析によるがん病態の解明等への効果的な利用が期待できる。 In particular, it is known that CD63-positive exosomes, which can be efficiently isolated by the isolation method of the present invention, are secreted in large quantities from tumorous cells. The isolation method of the present invention can comprehensively isolate various types of exosomes, including exosomes with a relatively high expression level of CD9 (CD9-positive exosomes), CD63-positive exosomes, and the like. Therefore, according to the exosomes isolated by the isolation method of the present invention, more comprehensive and less omitted analysis can be realized in the above-mentioned (1) functional analysis such as the physiological effects of exosomes. Particularly in the field of cancer, effective use can be expected in (1) elucidation of cancer pathology through functional analysis of the physiological effects of exosomes.
また、本発明の単離方法により単離されたエクソソームは、前記（２）バイオマーカーとして利用することで、がん診断ツールとしての効果的な利用が期待できる。さらに、前記（３）治療薬、および前記（４）ドラッグデリバリーシステムの運搬体としての利用についても、より多様な種類のエクソソームを単離できることにより、応用可能な範囲が広がることが期待できる。 In addition, by using the exosomes isolated by the isolation method of the present invention as the above-mentioned (2) biomarker, it can be expected to be effectively used as a cancer diagnostic tool. Furthermore, with regard to the use of (3) therapeutic drugs and (4) drug delivery systems as carriers, it is expected that the range of possible applications will expand as more diverse types of exosomes can be isolated.
以下では、本発明の一実施形態に係るエクソソームの単離方法に用いられる材料についてまずは説明し、続いて、エクソソームの単離方法の各工程について説明する。 Below, the materials used in the exosome isolation method according to one embodiment of the present invention will be explained first, and then each step of the exosome isolation method will be explained.
〔１－１．材料〕
（試料）
本発明の単離方法において、「エクソソームを含む試料」（本明細書中では、単に「試料」とも称する。）とはエクソソームを含む混合物であれば、その他の構成は特に限定されず、例えば、エクソソームを含む生物学的試料が挙げられる。
[1-1. material〕
(sample)
In the isolation method of the present invention, the "sample containing exosomes" (herein also simply referred to as "sample") is not particularly limited in other configurations as long as it is a mixture containing exosomes, for example, Examples include biological samples containing exosomes.
本明細書中では、「生物学的試料」とは、生物の体内から採取された検体を意味する。生物学的試料としては、例えば、血液、血漿、血清、唾液、尿、涙液、汗、母乳、羊水、脳脊髄液（髄液）、骨髄液、胸水、腹水、関節液、眼房水、硝子体液等が含まれるがこれらに限定されない。生物学的試料の選択は、目的に応じて、当業者により適宜設定され得る。例えば、採取の容易さの観点からは、血液、血漿、血清、唾液、尿等が好ましく用いられる。 As used herein, "biological sample" means a specimen collected from the body of an organism. Biological samples include, for example, blood, plasma, serum, saliva, urine, lacrimal fluid, sweat, breast milk, amniotic fluid, cerebrospinal fluid (cerebrospinal fluid), bone marrow fluid, pleural fluid, ascites fluid, synovial fluid, aqueous humor, These include, but are not limited to, vitreous humor and the like. The selection of biological samples can be appropriately determined by those skilled in the art depending on the purpose. For example, from the viewpoint of ease of collection, blood, plasma, serum, saliva, urine, etc. are preferably used.
本発明の一実施形態では、生物学的試料の由来は、エクソソームを保有する生物種由来であれば別段限定されない。生物学的試料の由来となる生物種としては、例えば哺乳類が好ましい。哺乳類の例としては、マウス（Mus musculus）、ウシ（Bos Taurus）、ヒト（Homo sapiens）等が挙げられる。 In one embodiment of the present invention, the origin of the biological sample is not particularly limited as long as it is derived from a biological species that possesses exosomes. The biological species from which the biological sample is derived is preferably, for example, a mammal. Examples of mammals include mice (Mus musculus), cows (Bos Taurus), humans (Homo sapiens), and the like.
（ペプチド）
本発明の単離方法において利用するペプチド（以下、適宜「本発明のペプチド」という。）は、互いに近接した４つ以上のアルギニンを含むペプチドであって、試料中のエクソソームと結合することができる。特に、このようなペプチドであればＣＤ６３陽性エクソソームと好適に結合することができる。
(peptide)
The peptides used in the isolation method of the present invention (hereinafter referred to as "peptides of the present invention") are peptides containing four or more arginines in close proximity to each other, and are capable of binding to exosomes in a sample. . In particular, such a peptide can suitably bind to CD63-positive exosomes.
本発明のペプチドの説明における「互いに近接した」とは、本発明のペプチドを構成するアルギニン同士が互いに隣接している（言い換えれば、連続している）か、または互いのアルギニンの間に、１～５個（より好ましくは１～３個、さらに好ましくは１個）のアルギニン以外のアミノ酸を含んでいることを意味する。 In the description of the peptide of the present invention, "close to each other" means that the arginines constituting the peptide of the present invention are adjacent to each other (in other words, they are continuous), or that there is one arginine between each other. This means that it contains ~5 (more preferably 1 to 3, still more preferably 1) amino acids other than arginine.
本発明の発明者らは、本発明のペプチドが、互いに近接した４つ以上のアルギニンを含むことによって、本発明のペプチドはＣＤ６３陽性エクソソームを含む多様なエクソソームと結合できることを見出した。また、本発明の発明者らは、上述の特許文献１に記載のエクソソームの単離方法では、ＣＤ９陽性エクソソームが、ＣＤ６３陽性エクソソームよりも優先的に単離されることを見出した（後述の比較例２参照）。すなわち、互いに近接した４つ以上のアルギニンを含むペプチドは、互いに近接した４つ以上のリジンを含むペプチドよりも、ＣＤ６３陽性エクソソームとの結合親和性が高い。これは、本発明の発明者らによる鋭意研究により見出された知見である。したがって、本発明の単離方法によれば、ＣＤ６３陽性エクソソームを容易に単離できる。 The inventors of the present invention found that the peptide of the present invention contains four or more arginines close to each other, so that the peptide of the present invention can bind to various exosomes including CD63-positive exosomes. In addition, the inventors of the present invention found that in the method for isolating exosomes described in Patent Document 1, CD9-positive exosomes are isolated preferentially over CD63-positive exosomes (see Comparative Example below). (see 2). That is, a peptide containing four or more arginines close to each other has a higher binding affinity to CD63-positive exosomes than a peptide containing four or more lysines close to each other. This is a finding discovered through intensive research by the inventors of the present invention. Therefore, according to the isolation method of the present invention, CD63-positive exosomes can be easily isolated.
本発明のペプチドと結合するエクソソームは、ＣＤ６３陽性エクソソームの含有量が、ＣＤ９陽性エクソソームの含有量の１０％以上であり、より好ましくはＣＤ９陽性エクソソームの含有量の１５％以上であり、より好ましくはＣＤ９陽性エクソソームの含有量の２０％以上であり、より好ましくはＣＤ９陽性エクソソームの含有量２５％以上であり、より好ましくはＣＤ９陽性エクソソームの含有量の３０％以上であり、より好ましくはＣＤ９陽性エクソソームの含有量の３５％以上であり、より好ましくはＣＤ９陽性エクソソームの含有量の４０％以上であり、より好ましくはＣＤ９陽性エクソソームの含有量の４５％以上であり、より好ましくはＣＤ９陽性エクソソームの含有量５０％以上であり、より好ましくはＣＤ９陽性エクソソームの含有量の５５％以上であり、より好ましくはＣＤ９陽性エクソソームの含有量の６０％以上である。 In the exosomes that bind to the peptide of the present invention, the content of CD63-positive exosomes is 10% or more of the content of CD9-positive exosomes, more preferably 15% or more of the content of CD9-positive exosomes, and more preferably The content of CD9-positive exosomes is 20% or more, more preferably the content of CD9-positive exosomes is 25% or more, more preferably 30% or more of the content of CD9-positive exosomes, and more preferably CD9-positive exosomes. 35% or more of the content of CD9-positive exosomes, more preferably 40% or more of the content of CD9-positive exosomes, more preferably 45% or more of the content of CD9-positive exosomes, and more preferably content of CD9-positive exosomes. The amount is 50% or more, more preferably 55% or more of the content of CD9-positive exosomes, and more preferably 60% or more of the content of CD9-positive exosomes.
本発明のペプチドは、互いに近接した４つ以上のアルギニンを含んでいればエクソソームを単離できる程度の結合強度を持ってエクソソームに結合することができるが、さらに互いに近接した５つ以上のアルギニンを含むことが好ましく、互いに近接した６つ以上のアルギニンを含むことがより好ましく、互いに近接した７つ以上のアルギニンを含むことがさらに好ましく、互いに近接した８つ以上のアルギニンを含むことが特に好ましい。本発明のペプチドが前記構成を有することによって、当該ペプチドは、エクソソームとより結合しやすくなるという利点を有する。 The peptide of the present invention can bind to exosomes with a binding strength sufficient to isolate exosomes if it contains four or more arginines that are close to each other, but it can also bind to exosomes with a binding strength that is sufficient to isolate exosomes if it contains four or more arginines that are close to each other. Preferably, it contains six or more arginines, more preferably six or more arginines, even more preferably seven or more arginines, and particularly preferably eight or more arginines. When the peptide of the present invention has the above-mentioned structure, the peptide has the advantage that it more easily binds to exosomes.
本発明のペプチドは、互いに近接した４つ以上のアルギニンを含む限り、その他の構成は特に限定されず、アルギニンのみからなるペプチドであってもよく、またアルギニン以外のアミノ酸を含むペプチドであってもよい。さらには、本発明のペプチドは糖鎖またはイソプレノイド基等のペプチド以外の構造をさらに含む複合ペプチドであってもよい。本発明のペプチドに含まれるアミノ酸は修飾されていてもよい。また本発明のペプチドに含まれるアミノ酸はＬ型であっても、Ｄ型であってもよい。 The peptide of the present invention is not particularly limited in other configurations as long as it contains four or more arginines close to each other, and may be a peptide consisting only of arginine or a peptide containing an amino acid other than arginine. good. Furthermore, the peptide of the present invention may be a complex peptide that further contains a structure other than the peptide, such as a sugar chain or an isoprenoid group. Amino acids contained in the peptides of the present invention may be modified. Furthermore, the amino acids contained in the peptide of the present invention may be of L type or D type.
本発明のペプチドは、当該分野において公知の任意の手法に従って容易に作製され得、例えば、ペプチドの発現ベクターが導入された形質転換体によって発現されても、化学合成されてもよい。すなわち、本発明のペプチドをコードするヌクレオチドもまた、本発明の範囲内である。化学合成法としては、固相法または液相法を挙げることができる。固相法において、例えば、市販の各種ペプチド合成装置（Model MultiPep RS (Intavis AG) 等）を利用することができる。また市販されているポリアルギニンを本発明のペプチドとして利用可能である。市販されているポリアルギニンは、特に限定されるものではないが、ポリ－Ｌ－アルギニン（分子量５０００～１５０００、シグマアルドリッチ社製）等が挙げられる。 The peptide of the present invention can be easily produced according to any method known in the art, for example, it can be expressed by a transformant into which a peptide expression vector has been introduced, or it can be chemically synthesized. Thus, nucleotides encoding the peptides of the invention are also within the scope of the invention. As the chemical synthesis method, a solid phase method or a liquid phase method can be mentioned. In the solid phase method, for example, various commercially available peptide synthesizers (Model MultiPep RS (Intavis AG), etc.) can be used. Furthermore, commercially available polyarginine can be used as the peptide of the present invention. Commercially available polyarginine is not particularly limited, but examples include poly-L-arginine (molecular weight 5,000 to 15,000, manufactured by Sigma-Aldrich).
本発明のペプチドは、最小で４つのアルギニンからなり得るため、本発明のペプチドの分子量の下限は６４２．７８［＝（１７４．２１×４）－（１８．０２×３）］であるといえる。本発明のペプチドの分子量の上限は特に限定されるものではないが、溶解性および粘度等の操作性の観点からは３０００００程度が上限であるといえる。 Since the peptide of the present invention can consist of at least four arginines, it can be said that the lower limit of the molecular weight of the peptide of the present invention is 642.78 [=(174.21×4)−(18.02×3)]. . Although the upper limit of the molecular weight of the peptide of the present invention is not particularly limited, it can be said that about 300,000 is the upper limit from the viewpoint of operability such as solubility and viscosity.
本発明のペプチドは、単一の分子量を有するペプチドからなるものであっても、それぞれ異なった分子量を有するペプチドの混合物からなるものであってもよい。 The peptide of the present invention may be composed of a peptide having a single molecular weight, or may be composed of a mixture of peptides having different molecular weights.
（担体）
本発明の単離方法において利用する担体（以下適宜「本発明の担体」という。）は、本発明のペプチドを担持可能な担体を意味する。本発明の担体は、エクソソームに結合した本発明のペプチドと結合しエクソソーム－本発明のペプチド－本発明の担体の順で結合した複合体を形成し得る。
(carrier)
The carrier used in the isolation method of the present invention (hereinafter appropriately referred to as "the carrier of the present invention") means a carrier capable of supporting the peptide of the present invention. The carrier of the present invention can bind to the peptide of the present invention bound to exosomes to form a complex in which the exosomes, the peptide of the present invention, and the carrier of the present invention are bound in this order.
本発明の単離方法では、担体を用いることによって、エクソソームを含む複合体を効率的かつ簡便に単離することが可能となる。 In the isolation method of the present invention, by using a carrier, it becomes possible to efficiently and easily isolate a complex containing exosomes.
担体は、本発明のペプチドを直接的または間接的に担持（保持）できる構造物であれば、その他の構成は特に限定されない。本発明の担体としては、担体に結合する本発明のペプチドの機能を弱めない支持体であることが好ましく、例えば、ガラス、ナイロンメンブレン、半導体ウェハー、ラテックス粒子、セルロース粒子、マイクロビーズ、シリカビーズ、磁性ビーズ等が挙げられる。本発明の担体としては、エクソソームを含む複合体の回収およびエクソソームの単離を容易に行なうことができるという点で、特に磁性ビーズであることが好ましい。磁性ビーズはタンパク質、ＤＮＡ、細胞等の分離精製において広く使用されており、当業者であれば十分に理解し得る担体である。 The structure of the carrier is not particularly limited as long as it is a structure that can directly or indirectly support (retain) the peptide of the present invention. The carrier of the present invention is preferably a support that does not weaken the function of the peptide of the present invention bound to the carrier, such as glass, nylon membrane, semiconductor wafer, latex particles, cellulose particles, microbeads, silica beads, Examples include magnetic beads. As the carrier of the present invention, magnetic beads are particularly preferable because they allow easy collection of complexes containing exosomes and isolation of exosomes. Magnetic beads are widely used in the separation and purification of proteins, DNA, cells, etc., and are carriers that can be fully understood by those skilled in the art.
（本発明のペプチドと本発明の担体との結合方法）
上述したように、本発明のペプチドと本発明の担体とは結合することによって、本発明のペプチドを本発明の担体が担持することが可能である。
(Method for binding the peptide of the present invention and the carrier of the present invention)
As described above, the peptide of the present invention can be supported by the carrier of the present invention by binding the peptide of the present invention to the carrier of the present invention.
本発明の一実施形態においてペプチドと担体との結合方法は、別段限定されず、適宜、周知の方法を用いることができる。また、ペプチドと担体との結合は直接的であっても間接的であってもよい。例えば、ビオチンを結合させた本発明のペプチドと、ストレプトアビジンを結合させた本発明の担体とを用い、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を介して、ペプチドと担体との間接的な結合を形成することが可能である。ストレプトアビジンは４量体を形成しているので、１つの「担体に結合したストレプトアビジン」に対して４つの「ペプチドに結合したビオチン」が結合することができる。つまり本発明の担体がストレプトアビジンを１つ有している場合、本発明の担体１つに対して本発明のペプチドが４つ結合していることになる。それゆえ、本発明の担体は４つの本発明のペプチドを介して１つ以上のエクソソームに結合することができる。そのため、本発明の担体とエクソソームとの結合力が極めて高くなるか、または、本発明の担体は複数のエクソソームと結合できる。よって、上述の結合方法を用いることにより、極めて高収率にてエクソソームを単離することができる。 In one embodiment of the present invention, the method of binding the peptide to the carrier is not particularly limited, and well-known methods can be used as appropriate. Further, the binding between the peptide and the carrier may be direct or indirect. For example, by using the peptide of the present invention bound to biotin and the carrier of the present invention bound to streptavidin, an indirect bond between the peptide and the carrier is formed through the binding of biotin and streptavidin. Is possible. Since streptavidin forms a tetramer, four "peptide-bound biotins" can bind to one "carrier-bound streptavidin." In other words, when the carrier of the present invention has one streptavidin, four peptides of the present invention are bound to one carrier of the present invention. Therefore, the carrier of the invention can bind to one or more exosomes via the four peptides of the invention. Therefore, the binding strength between the carrier of the present invention and exosomes becomes extremely high, or the carrier of the present invention can bind to multiple exosomes. Therefore, by using the above-described binding method, exosomes can be isolated in extremely high yield.
ペプチドにビオチンを結合する方法、言い換えればビオチンが結合したペプチド（本明細書中では、適宜「ビオチン標識ペプチド」ともいう。）を作製する方法は特に限定されない。例えば、ビオチンとペプチドとを直接結合させてもよく、間接的に結合させてもよい。ペプチドの構造およびそれに基づく機能をできるだけ正常に維持するという観点からは、ビオチンとペプチドとを間接的に結合させることが好ましい。ビオチンとペプチドとを間接的に結合させる場合には、例えば、本発明のペプチドに任意のリンカーを連結した後に、ペプチドと連結したリンカーに対してビオチンを結合させればよい。ペプチドの構造およびそれに基づく機能をできるだけ正常に維持するという観点からは、ペプチドはそのアミノ末端（Ｎ末端）および／またはカルボキシ末端（Ｃ末端）に、ビオチンと結合するためのリンカーを有することが好ましい。 The method of binding biotin to a peptide, in other words, the method of producing a peptide to which biotin is bound (herein, also referred to as a "biotin-labeled peptide" as appropriate) is not particularly limited. For example, biotin and a peptide may be bound directly or indirectly. From the viewpoint of maintaining the structure of the peptide and the functions based on it as normally as possible, it is preferable to bind biotin and the peptide indirectly. In the case of indirectly binding biotin and a peptide, for example, after connecting an arbitrary linker to the peptide of the present invention, biotin can be bonded to the linker connected to the peptide. From the viewpoint of maintaining the structure of the peptide and its functions as normally as possible, the peptide preferably has a linker for binding to biotin at its amino terminus (N-terminus) and/or carboxy terminus (C-terminus). .
リンカーは、ポリペプチドからなるリンカー（本明細書中では、「ペプチドリンカー」ともいう。）であってもよいし、ビオチンとペプチドとを連結することが可能な周知の架橋剤またはスペーサーアームであってもよい。 The linker may be a linker made of a polypeptide (herein also referred to as a "peptide linker"), or a well-known crosslinking agent or spacer arm capable of linking biotin and a peptide. It's okay.
ペプチドリンカーの場合、リンカーの長さおよびそれを構成するアミノ酸の種類は、当業者により適宜設定され得る。ペプチドリンカーの長さは、別段限定されるものではなく、通常、１～２０個、好ましくは、１～１０個（例えば、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、１個）のアミノ酸からなるリンカーが使用される。また、ペプチドリンカーに用いられるアミノ酸の種類も、別段限定されるものではないが、例えば、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）等が使用され得る。とりわけ、ＧＧＳ、ＧＧＧＳ（配列番号１）、ＧＧＧＧＳ（配列番号２）等のペプチドリンカー、および、これらが複数回繰り返されたペプチドリンカー（例えば、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号４）等）が好ましく用いられる。 In the case of a peptide linker, the length of the linker and the types of amino acids constituting it can be determined as appropriate by those skilled in the art. The length of the peptide linker is not particularly limited, and is usually 1 to 20, preferably 1 to 10 (for example, 10, 9, 8, 7, 6, 5, Linkers consisting of 4, 3, 2, 1) amino acids are used. Furthermore, the type of amino acid used in the peptide linker is not particularly limited, but for example, glycine (G), serine (S), threonine (T), etc. may be used. In particular, peptide linkers such as GGS, GGGS (SEQ ID NO: 1), GGGGS (SEQ ID NO: 2), and peptide linkers in which these are repeated multiple times (e.g., GGGSGGGS (SEQ ID NO: 3), GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 4), etc. ) is preferably used.
ビオチンとペプチドとを連結することが可能な周知の架橋剤としては、例えば、Ｎ－スクシンイミジルアミド、Ｎ－マレインイミド、イソチオシアネート、ブロモアセトアミド等が挙げられるがこれらに限定されない。 Well-known crosslinking agents capable of linking biotin and peptides include, but are not limited to, N-succinimidylamide, N-maleimide, isothiocyanate, bromoacetamide, and the like.
スペーサーアームとしては、周知のものであれば別段限定されないが、例えば、炭素鎖を含むスペーサーアームが用いられ、より好ましくは、炭素数６個の炭素鎖を有するhexanonateが用いられる。 The spacer arm is not particularly limited as long as it is well known, but for example, a spacer arm containing a carbon chain is used, and more preferably hexanonate having a carbon chain of 6 carbon atoms is used.
担体と結合したストレプトアビジンを作製する方法は特に限定されない。例えば、担体とストレプトアビジンとを直接結合させてもよく、間接的に結合させてもよい。適宜、公知の手法に従って、担体と結合したストレプトアビジンを作製すればよい。なお、ストレプトアビジンを結合させた磁性ビーズは市販されており、例えばDynabeads（登録商標、
サーモフィッシャーサイエンティフィック社）等が知られている。
The method for producing streptavidin bound to a carrier is not particularly limited. For example, the carrier and streptavidin may be bound directly or indirectly. Streptavidin bound to a carrier may be produced appropriately according to known techniques. Magnetic beads bound with streptavidin are commercially available, such as Dynabeads (registered trademark).
Thermo Fisher Scientific, Inc.) etc. are known.
担体と結合するペプチドの種類は、一種類であってもよいし、複数種類の組み合わせであってもよい。複数種類のペプチドが組み合わせて用いられる場合、その組み合わせは別段限定されない。 The type of peptide that binds to the carrier may be one type or a combination of multiple types. When multiple types of peptides are used in combination, the combination is not particularly limited.
（解離バッファー）
本発明の単離方法では、後述する解離工程において、複合体と金属陽イオンを含む解離バッファー（以下、適宜「本発明の解離バッファー」という。）とを接触させることによって、複合体からエクソソームを解離させ、エクソソームを単離する。本発明の解離バッファーは膜構造に影響を及ぼすような界面活性剤および／またはタンパク質変性剤等を含むことなく、マイルドな（温和な）条件でエクソソームを複合体から解離させることができるため、エクソソームをインタクトな状態（インタクトに近い状態）で単離することができる。このようなマイルドな解離バッファーで、本発明のペプチドとエクソソームとの結合を解離させることができるということを見出したのは本発明者らが初めてである。
(dissociation buffer)
In the isolation method of the present invention, exosomes are separated from the complex by bringing the complex into contact with a dissociation buffer containing metal cations (hereinafter referred to as "the dissociation buffer of the present invention") in the dissociation step described below. Dissociate and isolate exosomes. The dissociation buffer of the present invention does not contain surfactants and/or protein denaturants that affect membrane structure, and can dissociate exosomes from complexes under mild conditions. can be isolated in an intact state (nearly intact state). The present inventors are the first to discover that the binding between the peptide of the present invention and exosomes can be dissociated using such a mild dissociation buffer.
本発明の解離バッファーに含まれる金属陽イオンとしては、特に限定されず、例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン、リチウムイオン、銀イオン、および銅(I)イオン等の１価の金属陽イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、亜鉛イオン、ニッケルイオン、バリウムイオン、銅(II)イオン、鉄(II)イオン、スズ(II)イオン、コバルト(II)イオン、および鉛(II)イオン等の２価の金属陽イオン、ならびにアルミニウムイオン、および鉄(III)イオン等の３価の金属陽イオン、等が挙げられる。本発明の解離バッファーに含まれる金属陽イオンとしては、これら金属陽イオンの中でも、水溶性が高いことから、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、およびニッケルイオンが好ましい。さらに、複合体からエクソソームを十分に解離させることができることから、本発明の解離バッファーは、上述した金属陽イオンの中でもナトリウムイオン、カリウムイオン、もしくはマグネシウムイオンを、単独でまたは組み合わせて含むことが好ましい。 The metal cations contained in the dissociation buffer of the present invention are not particularly limited, and include, for example, monovalent metal cations such as sodium ions, potassium ions, lithium ions, silver ions, and copper (I) ions, and magnesium ions. , divalent metal cations such as calcium ions, zinc ions, nickel ions, barium ions, copper(II) ions, iron(II) ions, tin(II) ions, cobalt(II) ions, and lead(II) ions. ions, and trivalent metal cations such as aluminum ions and iron (III) ions. Among these metal cations, sodium ions, potassium ions, magnesium ions, zinc ions, and nickel ions are preferred as the metal cations contained in the dissociation buffer of the present invention, since they have high water solubility. Furthermore, since exosomes can be sufficiently dissociated from the complex, the dissociation buffer of the present invention preferably contains sodium ions, potassium ions, or magnesium ions among the above-mentioned metal cations, either alone or in combination. .
本発明の単離方法の目的は、簡便に、かつインタクトな状態で（またはインタクトに近い状態で）エクソソームを単離することである。よって、本発明の単離方法において「インタクトな状態で（またはインタクトに近い状態で）エクソソームを単離する」とは、エクソソームを傷つけることなく（ほぼ傷つけることなく）、試料中のエクソソームを、試料中のエクソソーム以外の物質（例えばタンパク質等）から分離し、単離することを意味する。言い換えれば、本発明の単離方法において「インタクトな状態で（またはインタクトに近い状態で）エクソソームを単離する」とは、エクソソームの膜構造（具体的には脂質二重膜構造）を保った状態（ほぼ保った状態）で、および、膜に存在するタンパク質の構造を保った状態（ほぼ保った状態）で、試料中のエクソソームを、試料中のエクソソーム以外の物質と分離し、単離することを意味する。 The purpose of the isolation method of the present invention is to easily isolate exosomes in an intact state (or in a near-intact state). Therefore, in the isolation method of the present invention, "isolating exosomes in an intact state (or in a near-intact state)" means to isolate exosomes in a sample without damaging them (almost without damaging them). It means separating and isolating substances other than exosomes (e.g. proteins, etc.) inside. In other words, in the isolation method of the present invention, "isolating exosomes in an intact state (or in a near-intact state)" means that the membrane structure (specifically, the lipid bilayer membrane structure) of the exosomes is maintained. Exosomes in the sample are separated from substances other than exosomes in the sample and isolated while the structure of the protein present in the membrane is maintained (almost preserved). It means that.
解離バッファーは、エクソソームの膜構造および膜に存在するタンパク質の構造に影響を与えない範囲において、金属陽イオン以外の物質を含んでいてもよい。 The dissociation buffer may contain substances other than metal cations as long as they do not affect the membrane structure of exosomes and the structure of proteins present in the membrane.
解離バッファーにおける金属陽イオンの濃度は、複合体からエクソソームを解離させることが可能であり、かつ、エクソソームの膜構造および膜に存在するタンパク質の構造に影響を与えない限り、特に限定されない。つまり、使用する本発明のペプチドとエクソソームとの結合強度、および金属陽イオンの種類（価数）等に応じて最適な陽イオンの濃度は変わり得る為、適宜最適な濃度を検討の上、決定すればよい。なお、本発明の解離バッファーにおける金属陽イオンの濃度は、特に限定されるものではないが、例えば、０．０１～５Ｍであることが好ましく、０．０５～２Ｍであることがより好ましく、０．１～１Ｍであることがさらに好ましく、０．２～０．７Ｍであることがさらに好ましく、０．２～０．４Ｍであることが特に好ましい。 The concentration of metal cations in the dissociation buffer is not particularly limited as long as it can dissociate exosomes from the complex and does not affect the membrane structure of exosomes and the structure of proteins present in the membrane. In other words, the optimal cation concentration may vary depending on the binding strength between the peptide of the present invention and exosomes used, the type (valence) of the metal cation, etc., so the optimal concentration should be determined after considering the appropriate concentration. do it. Note that the concentration of metal cations in the dissociation buffer of the present invention is not particularly limited, but for example, it is preferably 0.01 to 5M, more preferably 0.05 to 2M, and It is more preferably from .1 to 1M, even more preferably from 0.2 to 0.7M, particularly preferably from 0.2 to 0.4M.
また、解離バッファーのｐＨは適宜設定され得る。解離バッファーのｐＨは、５～１０であることが好ましく、６～９であることがより好ましく、７～８であることがさらに好ましく、７．３～７．５であることが特に好ましい。解離バッファーのｐＨが前記範囲であれば、エクソソームの膜構造および膜に存在するタンパク質の構造に影響を与えないため好ましい。 Further, the pH of the dissociation buffer can be set as appropriate. The pH of the dissociation buffer is preferably 5 to 10, more preferably 6 to 9, even more preferably 7 to 8, and particularly preferably 7.3 to 7.5. If the pH of the dissociation buffer is within the above range, it is preferable because it does not affect the membrane structure of exosomes and the structure of proteins present in the membrane.
〔１－２．工程〕
（複合体形成工程）
本発明の単離方法に含まれる複合体形成工程（以下、適宜「本発明の複合体形成工程」という。）は、エクソソームを含む試料と、本発明のペプチドと、本発明の担体とを接触させるか、または、前記試料と、本発明の担体に担持された本発明のペプチドとを接触させることによって、前記エクソソームと前記担体に担持された前記ペプチドとが結合してなる複合体（エクソソーム－本発明のペプチド－本発明の担体の順で結合した複合体。以下、適宜「本発明の複合体」という。）を形成させる複合体形成工程である。つまり、本発明の複合体形成工程では、本発明のペプチドが本発明の担体に担持されていない状態で本発明のペプチドと本発明の担体と試料とを接触させた後に、エクソソーム－本発明のペプチド－本発明の担体の順で結合した複合体を形成させてもよいし、本発明の担体に本発明のペプチドが既に担持させた状態で、当該ペプチドと試料とを接触させて本発明の複合体を形成してもよいということである。ただし、より効率的に本発明の複合体を形成するという観点からは後者の態様がより好ましいといえる。
[1-2. Process]
(Complex formation process)
The complex formation step included in the isolation method of the present invention (hereinafter referred to as the "complex formation step of the present invention") involves contacting a sample containing exosomes, the peptide of the present invention, and the carrier of the present invention. Alternatively, by contacting the sample with the peptide of the present invention supported on the carrier of the present invention, a complex formed by binding the exosome and the peptide supported on the carrier (exosome- This is a complex formation step of forming a complex in which the peptide of the present invention and the carrier of the present invention are bound in this order (hereinafter referred to as "the complex of the present invention" as appropriate). That is, in the complex formation step of the present invention, after the peptide of the present invention is brought into contact with the carrier of the present invention and the sample in a state where the peptide of the present invention is not supported on the carrier of the present invention, A complex may be formed in which the peptide and the carrier of the present invention are bound in this order, or the peptide of the present invention is already supported on the carrier of the present invention, and the peptide and the sample are brought into contact with each other. This means that a complex may be formed. However, from the viewpoint of forming the complex of the present invention more efficiently, the latter embodiment is more preferable.
エクソソームを含む試料と本発明のペプチドと本発明の担体とを接触させる方法としては、試料中のエクソソームと本発明のペプチドと本発明の担体とが、それぞれ結合し、本発明の複合体を形成できるような条件下で行なわれるものであれば、その他の方法は限定されない。例えば、試料中に、本発明のペプチドと本発明の担体とを添加し、混合する方法が挙げられる。試料、本発明のペプチド、および本発明の担体を接触させる際の添加および混合する順序は特に限定されない。例えば、（１）本発明のペプチドおよび本発明の担体を同時に試料に添加し、混合してもよく、（２）試料に本発明のペプチドを添加し、混合した後に、本発明の担体を添加し、混合してもよく、（３）試料に本発明の担体を添加し、混合した後に、本発明のペプチドを添加し、混合してもよい。ただし、本発明のペプチドがエクソソームに結合し、本発明のペプチドと本発明の担体とが結合することから前記（２）の手順が好ましいといえる。上述した方法による、試料とペプチドと担体との接触によって、エクソソームとペプチドと担体とを含む本発明の複合体が形成され得る。 As a method for contacting a sample containing exosomes, a peptide of the present invention, and a carrier of the present invention, the exosomes in the sample, the peptide of the present invention, and the carrier of the present invention each bind to form a complex of the present invention. Other methods are not limited as long as they are carried out under conditions that allow for this. For example, a method may be mentioned in which the peptide of the present invention and the carrier of the present invention are added to a sample and mixed. The order of addition and mixing when bringing the sample, the peptide of the present invention, and the carrier of the present invention into contact is not particularly limited. For example, (1) the peptide of the present invention and the carrier of the present invention may be added to a sample at the same time and mixed, or (2) the peptide of the present invention is added to a sample and mixed, and then the carrier of the present invention is added. (3) After adding the carrier of the present invention to the sample and mixing, the peptide of the present invention may be added and mixed. However, since the peptide of the present invention binds to exosomes, and the peptide of the present invention binds to the carrier of the present invention, the above procedure (2) can be said to be preferable. By contacting a sample, a peptide, and a carrier by the method described above, a complex of the present invention containing an exosome, a peptide, and a carrier can be formed.
また、試料と、本発明の担体に担持された本発明のペプチドとを接触させる方法としては、試料中のエクソソームと本発明の担体に担持された本発明のペプチドとが結合し、本発明の複合体を形成できるような条件下で行なわれるものであれば、その他の方法は限定されない。例えば、試料中に本発明の担体に担持された本発明のペプチドを添加し、混合させる方法が挙げられる。 In addition, as a method for contacting a sample with the peptide of the present invention supported on the carrier of the present invention, exosomes in the sample and the peptide of the present invention supported on the carrier of the present invention are bonded, and the peptide of the present invention supported on the carrier of the present invention is bonded to the sample. Other methods are not limited as long as they are carried out under conditions that allow the formation of a complex. For example, a method may be mentioned in which the peptide of the present invention supported on the carrier of the present invention is added to a sample and mixed.
試料と本発明のペプチドと本発明の担体との接触時間、または、試料と本発明の担体に担持された本発明のペプチドとの接触時間は、本発明の複合体を形成するために十分な時間であれば限定されるものではなく、適宜最適な条件を検討の上、決定され得る。 The contact time between the sample, the peptide of the present invention, and the carrier of the present invention, or the contact time between the sample and the peptide of the present invention supported on the carrier of the present invention is sufficient to form the complex of the present invention. There is no limitation as long as it is a period of time, and it can be determined after considering the optimal conditions as appropriate.
また、エクソソームを含む試料と本発明のペプチドと本発明の担体との接触において、例えば柱状または円筒状の容器（カラム）に、本発明の担体または本発明のペプチドが担持された本発明の担体を充填することによって作製した、担体を含むカラム（本明細書中では、「担体カラム」という。）を用いることも可能である。担体カラムに試料を含む溶液およびペプチドを含む溶液を通液させて本発明の複合体を得る方法としては、試料中のエクソソームと本発明のペプチドと本発明の担体とが、それぞれ結合し、本発明の複合体を形成できるような条件下で行なわれるものであれば、その他の方法は限定されない。 In addition, in contacting the sample containing exosomes, the peptide of the present invention, and the carrier of the present invention, the carrier of the present invention or the carrier of the present invention on which the peptide of the present invention is supported, for example, in a columnar or cylindrical container (column). It is also possible to use a column containing a carrier (herein referred to as a "carrier column") prepared by filling the carrier with a carrier. A method for obtaining the complex of the present invention by passing a sample-containing solution and a peptide-containing solution through a carrier column is such that the exosome in the sample, the peptide of the present invention, and the carrier of the present invention bind to each other, and Other methods are not limited as long as they are carried out under conditions that allow the formation of the inventive complex.
担体カラムと、ペプチドおよび／もしくは試料、または、エクソソーム－ペプチド複合体を含む試料、との接触時間は、試料中のエクソソームとペプチドと担体とが本発明の複合体を形成するために十分な時間であることが好ましい。前記時間は、担体カラムへの試料溶液（エクソソームを含む試料をおよび/もしくは本発明のペプチドを含む溶液、またはエクソソーム－ペプチド複合体を含む溶液）の通液速度、または、当該試料溶液を添加してから通液を開始するまでの時間等を調整することによって、適宜設定できる。 The contact time between the carrier column and the peptide and/or sample, or the sample containing the exosome-peptide complex is sufficient for the exosomes in the sample, the peptide, and the carrier to form the complex of the present invention. It is preferable that The above-mentioned time is the rate at which the sample solution (a sample containing exosomes and/or a solution containing a peptide of the present invention, or a solution containing an exosome-peptide complex) is passed through the carrier column, or the time at which the sample solution is added. It can be set as appropriate by adjusting the time from when the liquid is passed until the start of liquid passage.
前記担体カラムに試料溶液を通液させるための物理的方法は従来公知の方法を用いることが可能である。例えば、以下（１）～（３）の方法が挙げられる。
（１）鉛直方向に載置された担体カラム上に、前記試料溶液を添加し、重力によって担体カラム内に前記試料溶液を通液させる方法。
（２）担体カラムの一方に前記試料溶液を添加し、試料溶液を添加した方向から加圧するか、または、試料溶液を添加した方向とは逆の方向から吸引することによって、担体カラム内に前記試料溶液を通液させる方法。
（３）担体カラムの一方に試料溶液を添加した後、当該担体カラムを遠心チューブ内に装填し、当該遠心チューブを遠心分離することによって、担体カラム内に前記試料溶液を通液させる方法。なお、前記（３）の方法は、いわゆる従来公知のスピンカラムを用いた方法である。
A conventionally known physical method can be used for passing the sample solution through the carrier column. Examples include methods (1) to (3) below.
(1) A method in which the sample solution is added onto a carrier column placed in the vertical direction, and the sample solution is passed through the carrier column by gravity.
(2) Add the sample solution to one side of the carrier column and apply pressure from the direction in which the sample solution was added, or by suctioning from the direction opposite to the direction in which the sample solution was added. A method of passing sample solution through.
(3) A method of adding a sample solution to one side of a carrier column, loading the carrier column into a centrifuge tube, and centrifuging the centrifuge tube to allow the sample solution to pass through the carrier column. Note that the method (3) above is a method using a so-called conventionally known spin column.
（解離工程）
本発明の単離方法に含まれる解離工程（以下、適宜「本発明の解離工程」という。）は、前記複合体形成工程によって得られた本発明の複合体と、金属陽イオンを含む本発明の解離バッファーとを接触させて、本発明の複合体からエクソソームを解離させる工程である。
(Dissociation step)
The dissociation step included in the isolation method of the present invention (hereinafter referred to as the "dissociation step of the present invention") is a method for combining the complex of the present invention obtained by the complex formation step and the present invention containing a metal cation. This is a step of dissociating exosomes from the complex of the present invention by contacting the complex with a dissociation buffer of the present invention.
本発明の複合体と本発明の解離バッファーとを接触させる方法としては、本発明の複合体からエクソソームを解離させるような条件下で行なわれるものであれば、その他の方法は限定されない。例えば、本発明の複合体を含む容器に本発明の解離バッファーを添加し、混合させる方法が挙げられる。本発明の複合体と本発明の解離バッファーとの接触時間は、複合体からエクソソームが解離するために十分な時間であれば特に限定されるものではない。本発明の複合体と本発明の解離バッファーとの接触によって、エクソソームは本発明の複合体から解離され、当該解離バッファーへ移動する。そして、当該解離バッファーと本発明の担体とを分離し当該解離バッファーを単離することにより、エクソソームを単離することができる。 The method for bringing the complex of the present invention into contact with the dissociation buffer of the present invention is not limited to any other method as long as it is carried out under conditions that dissociate exosomes from the complex of the present invention. For example, a method may be mentioned in which the dissociation buffer of the present invention is added to a container containing the complex of the present invention and mixed. The contact time between the complex of the present invention and the dissociation buffer of the present invention is not particularly limited as long as it is sufficient time for exosomes to dissociate from the complex. By contacting the complex of the present invention with the dissociation buffer of the present invention, exosomes are dissociated from the complex of the present invention and transferred to the dissociation buffer. Then, by separating the dissociation buffer and the carrier of the present invention and isolating the dissociation buffer, exosomes can be isolated.
本発明の解離工程において、本発明のペプチドは、本発明の担体に結合されたままでいてもよく、本発明の担体から解離されていてもよい。また、前記分離の後、単離された解離バッファー中に本発明のペプチドが含まれていてもよい。エクソソームをより純度高く単離する観点から、本発明の解離工程において本発明のペプチドは本発明の担体に結合されたままでいることが好ましく、前記分離の後、単離された解離バッファー中に本発明のペプチドが含まれていないことが好ましい。 In the dissociation step of the present invention, the peptide of the present invention may remain bound to the carrier of the present invention or may be dissociated from the carrier of the present invention. Furthermore, after the separation, the peptide of the present invention may be contained in the isolated dissociation buffer. From the viewpoint of isolating exosomes with higher purity, the peptide of the present invention preferably remains bound to the carrier of the present invention in the dissociation step of the present invention, and after the separation, the peptide of the present invention is added to the isolated dissociation buffer. Preferably, the peptide of the invention is not included.
また、複合体形成工程においてカラムが使用された場合には、複合体形成工程において本発明の複合体が形成されたカラムに、本発明の解離バッファーを通液させることによって、本発明の複合体と本発明の解離バッファーとを接触させることが可能である。カラムへ本発明の解離バッファーを通液させるための物理的方法としては、（複合体形成工程）の項に記載した（１）～（３）の方法が挙げられる。カラムと本発明の解離バッファーとを接触させた場合には、エクソソームは複合体から解離され当該解離バッファーへ移動する。従って、カラム通液後の解離バッファーを単離することによって、エクソソームを単離することができる。 In addition, when a column is used in the complex formation step, the complex of the present invention can be produced by passing the dissociation buffer of the present invention through the column on which the complex of the present invention has been formed in the complex formation step. and the dissociation buffer of the present invention. Physical methods for passing the dissociation buffer of the present invention through the column include methods (1) to (3) described in the section (complex formation step). When the column and the dissociation buffer of the present invention are brought into contact, the exosomes are dissociated from the complex and migrate to the dissociation buffer. Therefore, exosomes can be isolated by isolating the dissociation buffer after passing through the column.
本発明の単離方法は、上述した複合体形成工程および解離工程以外の工程が含まれていてもよい。その他の工程としては、例えば洗浄工程、および回収工程が挙げられる。 The isolation method of the present invention may include steps other than the above-described complex formation step and dissociation step. Other steps include, for example, a washing step and a recovery step.
（回収工程）
回収工程は、複合体形成工程と解離工程との間に設けられ、複合体形成工程によって得られた本発明の複合体を回収する工程である。回収工程は、複合体形成工程および担体等に応じて従来公知の方法が適宜採用され得る。
(Collection process)
The recovery step is provided between the complex formation step and the dissociation step, and is a step of recovering the complex of the present invention obtained by the complex formation step. In the recovery step, a conventionally known method may be appropriately adopted depending on the complex formation step, carrier, and the like.
担体が、〔１－１．材料〕の（担体）の項で説明したような構造物である場合には、遠心分離によって本発明の複合体を含む担体を回収することができる。例えば、５００～４０００×ｇの条件下で遠心を行なうことによって、本発明の複合体を含む担体を回収することが可能である。 The carrier is [1-1. In the case of a structure as explained in the section (Carrier) of [Materials], the carrier containing the complex of the present invention can be recovered by centrifugation. For example, the carrier containing the complex of the present invention can be recovered by centrifugation under conditions of 500 to 4000×g.
また担体が、磁性ビーズである場合には、従来公知のマグネティックスタンド等の磁性体を用いて外部から磁力を与えることによって、担体を容易に回収することができる。担体が磁性ビーズであり、磁性体を用いて回収する場合には、遠心の方法と比較して、以下の（１）および（２）の利点を有する：（１）磁性ビーズである担体は、磁性体に引き寄せられているため、上清をほぼ完全に取り除くことが可能であり、得られるエクソソームの純度が高くなること；（２）上清を取り除く際に、磁性ビーズを一緒に取り除いてしまう虞が小さくなり、得られるエクソソームの損失を防ぐことができること（エクソソームの単離率を向上することができる）。 Furthermore, when the carrier is a magnetic bead, the carrier can be easily recovered by applying magnetic force from the outside using a magnetic material such as a conventionally known magnetic stand. When the carrier is a magnetic bead and is recovered using a magnetic material, it has the following advantages (1) and (2) compared to a centrifugation method: (1) The carrier is a magnetic bead, Because they are attracted to the magnetic material, it is possible to remove the supernatant almost completely, increasing the purity of the resulting exosomes; (2) When removing the supernatant, the magnetic beads are also removed. It is possible to reduce the risk and prevent loss of the obtained exosomes (the isolation rate of exosomes can be improved).
なお、本発明の複合体形成工程において、担体カラムが用いられる場合には、本発明の複合体を含む担体はカラム内に留まることとなる。このため、上述の回収工程は必要とされない。 In addition, in the complex formation step of the present invention, when a carrier column is used, the carrier containing the complex of the present invention remains within the column. Therefore, the above-mentioned recovery step is not required.
（洗浄工程）
本発明の単離方法には、解離工程の前に、さらに洗浄工程が含まれていることが好ましい。
(Washing process)
Preferably, the isolation method of the present invention further includes a washing step before the dissociation step.
洗浄工程は、回収された本発明の複合体、または、カラム中の本発明の複合体を、適当な洗浄液を用いて、適当な回数洗浄する工程である。洗浄工程は、当該複合体が解離しない条件下で行なわれるものであれば、使用される洗浄液の種類および洗浄回数等は特に限定されない。 The washing step is a step of washing the recovered complex of the present invention or the complex of the present invention in the column an appropriate number of times using an appropriate washing solution. As long as the washing step is carried out under conditions that do not dissociate the complex, the type of washing liquid used, the number of washings, etc. are not particularly limited.
洗浄工程で使用される洗浄液としては、例えば、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（Phosphate buffered saline、ＰＢＳ）が挙げられる。 Examples of the washing liquid used in the washing step include physiological saline and phosphate buffered saline (PBS).
本発明の一実施形態が回収工程を含む場合には、洗浄工程としては、以下のような方法が挙げられる。（１）回収された本発明の複合体を含む担体を前記洗浄液と混合することによって、担体を当該洗浄液に再懸濁する。（２）再度、本発明の複合体を含む担体を回収する（すなわち、本発明の複合体を含む担体と洗浄液とを分離する。）。 When an embodiment of the present invention includes a recovery step, examples of the washing step include the following methods. (1) By mixing the recovered carrier containing the complex of the present invention with the washing solution, the carrier is resuspended in the washing solution. (2) Collect the carrier containing the complex of the present invention again (that is, separate the carrier containing the complex of the present invention from the washing liquid).
また本発明の複合体形成工程において、担体カラムを用いた場合には、本発明の複合体が形成された後のカラムに対して前記洗浄液を適当量通液すればよい。 Furthermore, in the case where a carrier column is used in the complex forming step of the present invention, an appropriate amount of the washing liquid may be passed through the column after the complex of the present invention is formed.
〔２．エクソソームの除去方法〕
本発明の一実施形態に係るエクソソームの除去方法（以下、適宜「本発明の除去方法」という。）は、エクソソームを含む試料からエクソソームを除去する、エクソソームの除去方法であって、
前記試料と、互いに近接した４つ以上のアルギニンを含むペプチドと、前記ペプチドを担持可能な担体とを接触させるか、または、前記試料と、前記担体に担持された前記ペプチドとを接触させることによって、前記エクソソームと前記担体に担持された前記ペプチドとが結合してなる複合体を形成させる複合体形成工程、および、
前記複合体形成工程によって得られた前記複合体を担持する前記担体と、前記試料とを分離して、前記試料から前記エクソソームの少なくとも一部が除去された分離液を得る分離工程を含んでいる。
[2. How to remove exosomes]
A method for removing exosomes according to an embodiment of the present invention (hereinafter referred to as "removal method of the present invention" as appropriate) is a method for removing exosomes from a sample containing exosomes, comprising:
By bringing the sample into contact with a peptide containing four or more arginines close to each other and a carrier capable of supporting the peptide, or by contacting the sample with the peptide supported on the carrier. , a complex forming step in which the exosome and the peptide supported on the carrier form a complex, and
The method includes a separation step of separating the carrier carrying the complex obtained by the complex formation step and the sample to obtain a separated liquid from which at least a portion of the exosomes have been removed from the sample. .
本発明の一実施形態に係るエクソソームの除去方法は、前記構成とすることから、下記（１）および（２）の効果を奏する。
（１）超遠心機等を使用する必要がないため、短時間に、かつ、簡便に、エクソソームを除去できる。
（２）アルギニンが、ＣＤ６３陽性エクソソームを含む多様なエクソソームの膜に結合することを利用しているため、広くエクソソームを捕捉し、単離することができる。
Since the method for removing exosomes according to an embodiment of the present invention has the above-mentioned configuration, it achieves the following effects (1) and (2).
(1) Since there is no need to use an ultracentrifuge or the like, exosomes can be removed easily and in a short time.
(2) Since arginine binds to the membranes of various exosomes, including CD63-positive exosomes, a wide range of exosomes can be captured and isolated.
前記（１）および（２）の効果により、本発明の除去方法によって、試料から、ＣＤ６３陽性エクソソームを含む多様な種類のエクソソームが効率的に除去された分離液を得ることができる。したがって、エクソソームの残留が極めて少ない分離液を、簡便な方法により容易に得ることができる。 Due to the effects of (1) and (2) above, the removal method of the present invention makes it possible to obtain a separated liquid from which various types of exosomes, including CD63-positive exosomes, are efficiently removed from a sample. Therefore, a separated liquid with extremely few remaining exosomes can be easily obtained by a simple method.
このようなエクソソームの除去方法は、例えばエクソソームを除去した血清の作製に有用である。培養細胞を培養する場合、一般的にウシ胎児血清（ＦＢＳ）が使用される。通常、ＦＢＳにはウシ由来のエクソソームが含まれるため、ヒト細胞から分泌されたエクソソームを回収したい場合、あらかじめウシ由来のエクソソームを除去したＦＢＳを使用する必要がある。このようなＦＢＳを作製するために、一般的には１０００００×ｇで１６時間以上、４℃で超遠心分離することで、エクソソームを除去する方法が用いられる。しかしながら、この超遠心法ではエクソソームの除去に長時間必要となる、ＦＢＳ中から完全にエクソソームを除去することは難しい（例えば、超遠心時間が１６時間だと、約２０％のエクソソームはＦＢＳ中に残存する）等の問題がある。一方、本発明の除去方法によれば、ウシ由来のエクソソームが含まれたＦＢＳから、担体を用いて容易にエクソソームを除去できるため、ウシ由来のエクソソームを除去したＦＢＳを容易に作製できる。 Such an exosome removal method is useful, for example, for producing serum from which exosomes have been removed. When culturing cultured cells, fetal bovine serum (FBS) is generally used. Usually, FBS contains bovine-derived exosomes, so if you want to collect exosomes secreted from human cells, it is necessary to use FBS from which bovine-derived exosomes have been removed in advance. In order to produce such FBS, a method is generally used in which exosomes are removed by ultracentrifugation at 100,000 xg for 16 hours or more at 4°C. However, this ultracentrifugation method requires a long time to remove exosomes, and it is difficult to completely remove exosomes from FBS (for example, if ultracentrifugation time is 16 hours, approximately 20% of exosomes are There are problems such as (remaining). On the other hand, according to the removal method of the present invention, since exosomes can be easily removed from FBS containing bovine-derived exosomes using a carrier, FBS from which bovine-derived exosomes have been removed can be easily produced.
〔３．エクソソームの単離キット〕
本発明の一実施形態に係るエクソソームの単離キット（以下、適宜「本発明のキット」という）は、上述した本発明の単離方法または本発明の除去方法を行なうためのキットであって、上述した本発明のペプチド、本発明の担体、および本発明の解離バッファー、を含む。よって、キットの構成の説明については、〔１．エクソソームの単離方法〕の説明が援用可能である。
[3. Exosome isolation kit]
The exosome isolation kit according to one embodiment of the present invention (hereinafter referred to as the "kit of the present invention" as appropriate) is a kit for carrying out the above-described isolation method of the present invention or removal method of the present invention, and includes: It includes the peptide of the invention described above, the carrier of the invention, and the dissociation buffer of the invention. Therefore, regarding the explanation of the configuration of the kit, please refer to [1. Exosome isolation method] can be referred to.
本発明のキットに含まれる本発明のペプチドおよび本発明の担体は、本発明のペプチドが本発明の担体に予め担持された状態で本発明のキットに含まれていてもよいし、それぞれが別体として含まれていてもよい。 The peptide of the present invention and the carrier of the present invention contained in the kit of the present invention may be included in the kit of the present invention in a state in which the peptide of the present invention is supported on the carrier of the present invention in advance, or each may be contained separately. It may be included as a body.
また、本発明のキットには、磁性ビーズ、ストレプトアビジンが固定化された磁性ビーズ、およびマグネティックスタンド等の磁性体、ならびにビオチン等が含まれていてもよい。 Further, the kit of the present invention may contain magnetic beads, streptavidin-immobilized magnetic beads, magnetic bodies such as a magnetic stand, biotin, and the like.
また本発明のキットには、前記の構成の他に、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュ、カラム等）が含まれていてもよい。本発明のキットは、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を内包した容器を備え得る。本発明のキットの説明において使用される用語「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図され得る。 In addition to the above-described configuration, the kit of the present invention may also include a container (for example, a bottle, plate, tube, dish, column, etc.) containing a specific material. Kits of the invention may include containers containing diluents, solvents, wash solutions, or other reagents. The term "comprising" used in the description of the kit of the present invention may mean that the kit is contained in any of the individual containers constituting the kit.
また本発明のキットは、本発明の単離方法または本発明の除去方法を実施するための説明書を備えていてもよい。 The kit of the present invention may also include instructions for carrying out the isolation method of the present invention or the removal method of the present invention.
以下、実施例により本発明の一実施形態をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, one embodiment of the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
＜１．ポリアルギニン固定化磁性ビーズを用いた培養上清からのエクソソームの単離および除去＞
〔材料および方法〕
（試料の調製）
エクソソームの多産生株として知られている乳がんの細胞株ＭＣＦ－７（ＪＣＲＢ細胞バンク）を用いて、以下の方法により試料の調製を行なった。培地はＤＭＥＭ培地（Dulbecco's modified Eagle medium、Thermo Fisher Scientific社）を用いた。
（１）ディッシュ中で、ＭＣＦ－７細胞を１０ｍＬのＤＭＥＭ培地に播種し（１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養を行なった。ＤＭＥＭ培地には予め、１０％（ｖ／ｖ）非働化ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ ＦＢＳ、GE Healthcare社）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン（ナカライテスク社）、および０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（Meiji Seikaファルマ社）を添加した。
（２）細胞がディッシュの培養面積に対して５０～８０％になるまで培養した。
（３）３ｍＬのＰＢＳ（ナカライテスク社）をゆっくりと添加してディッシュ全体に行き渡らせた後、ＰＢＳを取り除いた。
（４）（３）の洗浄工程を２回行ない、ディッシュからＦＢＳ由来のエクソソームを取り除いた。
（５）１０ｍＬのAdvanced ＤＭＥＭ培地（Thermo Fisher Scientific社）を添加して培養を行なった。２４時間培養後、エクソソームが含まれる培養上清を回収した。
（６）培養上清を２０００×ｇ、１０ｍｉｎの遠心分離を行ない、ディッシュから剥がれた培養上清中の細胞を取り除いた。
（７）培養上清を１００００×ｇ、３０ｍｉｎの遠心分離を行ない、培養上清中のデブリを取り除いた。
（８）培養上清を０．２２μｍフィルターで濾過し、試料（以下、「上清サンプル」という。）とした。上清サンプルは、必要に応じて－８０℃で保存した。
<1. Isolation and removal of exosomes from culture supernatant using polyarginine-immobilized magnetic beads>
〔material and method〕
(Sample preparation)
Using the breast cancer cell line MCF-7 (JCRB Cell Bank), which is known to be a prolific exosome producer, samples were prepared by the following method. The medium used was DMEM medium (Dulbecco's modified Eagle medium, Thermo Fisher Scientific).
(1) MCF-7 cells were seeded in 10 mL of DMEM medium (1.0×10 5 cells/mL) in a dish, and cultured at 37° C. and 5% CO 2 . The DMEM medium was preliminarily supplemented with 10% (v/v) inactivated fetal bovine serum (HyClone FBS, GE Healthcare), 100 units/mL penicillin (Nacalai Tesque), and 0.1 mg/mL streptomycin (Meiji Seika Pharma). was added.
(2) The cells were cultured until they accounted for 50 to 80% of the culture area of the dish.
(3) After slowly adding 3 mL of PBS (Nacalai Tesque) and distributing it throughout the dish, the PBS was removed.
(4) The washing step in (3) was performed twice to remove FBS-derived exosomes from the dish.
(5) 10 mL of Advanced DMEM medium (Thermo Fisher Scientific) was added and cultured. After culturing for 24 hours, the culture supernatant containing exosomes was collected.
(6) The culture supernatant was centrifuged at 2000×g for 10 minutes to remove cells in the culture supernatant that had detached from the dish.
(7) The culture supernatant was centrifuged at 10,000×g for 30 minutes to remove debris in the culture supernatant.
(8) The culture supernatant was filtered with a 0.22 μm filter and used as a sample (hereinafter referred to as “supernatant sample”). Supernatant samples were stored at -80°C if necessary.
（アルギニンが担持された磁性ビーズの作製）
互いに近接した４つ以上のアルギニンを含むペプチドを磁性ビーズ（担体）に結合させ（担持させ）、ペプチドが担持された磁性ビーズを作製した。
(Preparation of magnetic beads carrying arginine)
Peptides containing four or more arginines in close proximity to each other were bound (supported) to magnetic beads (carriers) to produce peptide-supported magnetic beads.
担体としては、ストレプトアビジンが固定化された磁性ビーズ（ExoIntact Exosome精製試薬キット付属、HMTバイオメディカル株式会社）（本明細書中では、「ストレプトアビジン磁性ビーズ」ともいう。）を用いた。 As the carrier, streptavidin-immobilized magnetic beads (exoIntact Exosome purification reagent kit included, HMT Biomedical Co., Ltd.) (herein also referred to as "streptavidin magnetic beads") were used.
ペプチドとしては、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３）またはＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号４）からなるリンカーペプチドと、４、８、または１６個の連続したアルギニン残基からなる配列と、を含むペプチド（以下、「ポリアルギニンペプチド」という。）を使用した。本実施例で用いたアミノ酸は全てＬ型アミノ酸である。当該ポリアルギニンペプチドは、さらに、ストレプトアビジンを有する磁性ビーズ（担体）と結合するために、ポリアルギニンペプチドのＮ末端にビオチンが結合されている。当該ビオチンが結合しているポリアルギニンペプチドを、以下、「ビオチン標識ポリアルギニンペプチド」と称する。なお、本実施例において使用したビオチン標識ポリアルギニンペプチドは、ユーロフィンジェノミクス社による受託合成により作製された。 The peptide includes a linker peptide consisting of GGGSGGGS (SEQ ID NO: 3) or GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 4) and a sequence consisting of 4, 8, or 16 consecutive arginine residues (hereinafter referred to as "polyarginine"). (referred to as "peptide") was used. All amino acids used in this example are L-type amino acids. The polyarginine peptide further has biotin bonded to the N-terminus of the polyarginine peptide in order to bind to magnetic beads (carrier) containing streptavidin. The polyarginine peptide to which biotin is bound is hereinafter referred to as a "biotin-labeled polyarginine peptide." The biotin-labeled polyarginine peptide used in this example was produced by contract synthesis by Eurofin Genomics.
本実施例において使用した、ビオチン標識ポリアルギニンペプチドの名称、およびそれぞれのビオチン標識ポリアルギニンペプチドが有するポリアルギニンペプチドのアミノ酸配列は、以下の通りである。
１．ＢＩＯＴＩＮ－Ｒ４；ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＲＲＲＲ（配列番号５）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端をビオチンによって修飾したもの。
２．ＢＩＯＴＩＮ－Ｒ８；ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号６）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端をビオチンによって修飾したもの。
３．ＢＩＯＴＩＮ－Ｒ１６；ＧＧＧＳＧＧＧＳＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端をビオチンによって修飾したもの。
The names of the biotin-labeled polyarginine peptides used in this example and the amino acid sequences of the polyarginine peptides possessed by the respective biotin-labeled polyarginine peptides are as follows.
1. BIOTIN-R4: A peptide consisting of the amino acid sequence GGGSGGGSGGGSRRRR (SEQ ID NO: 5) whose N-terminus is modified with biotin.
2. BIOTIN-R8: A peptide consisting of the amino acid sequence shown by GGGSGGGSGGGSRRRRRRRR (SEQ ID NO: 6) whose N-terminus is modified with biotin.
3. BIOTIN-R16; GGGSGGGSRRRRRRRRRRRRRRRR (SEQ ID NO: 7), whose N-terminus is modified with biotin.
ビオチン－ストレプトアビジンの相互作用を利用して、具体的には以下の方法によって、ポリアルギニンペプチドが担持された磁性ビーズを作製した。
（１）２０μＬ（０．２ｍｇ）のストレプトアビジン磁性ビーズを、１．５ｍＬのマイクロチューブ（単に「チューブ」ともいう。）に加え、当該チューブをマグネットスタンドにセットして１分静置し、上清を取り除いた。
（２）チューブをマグネットスタンドから外し、０．２ｍＬのBW Buffer（ExoIntact Exosome精製試薬キット付属、HMTバイオメディカル株式会社）を添加し、混合した。チューブをマグネットスタンドにセットして１分静置し、上清を取り除いた。当該（２）の操作（洗浄）を合計２回行なった。
（３）チューブに２００μＬのBW Bufferを添加し、ストレプトアビジン磁性ビーズをBW Buffer中に再懸濁し、洗浄したストレプトアビジン磁性ビーズ（１８０μＬ）を得た。
（４）チューブに、それぞれ、２０μＬのビオチン標識ポリアルギニンペプチド（Ｂｉｏｔｉｎ－Ｒ４、Ｂｉｏｔｉｎ－Ｒ８、またはＢｉｏｔｉｎ－Ｒ１６；１００μＭ）を加えた。
（５）チューブを室温で２０分混合し、ビオチン標識ポリアルギニンペプチドとストレプトアビジン磁性ビーズとを接触させることによって、ビオチン標識ポリアルギニンペプチドをストレプトアビジン磁性ビーズに結合させた（すなわち担持させた。）。
（６）チューブをマグネットスタンドにセットして１分静置し、上清を取り除いた。
（７）前記（２）と同様の操作（洗浄）を合計３回行なった。
（８）チューブに５０μＬのBW Bufferを添加し、ストレプトアビジン磁性ビーズをBW Buffer中に再懸濁し、ビオチン標識ポリアルギニンペプチドが担持されたストレプトアビジン磁性ビーズ（０．２ｍｇ／５０μＬ）を得た。
Specifically, magnetic beads carrying a polyarginine peptide were prepared by the following method using biotin-streptavidin interaction.
(1) Add 20 μL (0.2 mg) of streptavidin magnetic beads to a 1.5 mL microtube (also simply referred to as a “tube”), set the tube on a magnetic stand, let it stand for 1 minute, and then Removed the clear water.
(2) The tube was removed from the magnetic stand, and 0.2 mL of BW Buffer (attached to ExoIntact Exosome purification reagent kit, HMT Biomedical Co., Ltd.) was added and mixed. The tube was set on a magnetic stand, left to stand for 1 minute, and the supernatant was removed. The operation (2) (washing) was performed twice in total.
(3) 200 μL of BW Buffer was added to the tube, and the streptavidin magnetic beads were resuspended in BW Buffer to obtain washed streptavidin magnetic beads (180 μL).
(4) 20 μL of biotin-labeled polyarginine peptide (Biotin-R4, Biotin-R8, or Biotin-R16; 100 μM) was added to each tube.
(5) The biotin-labeled polyarginine peptide was bound (i.e. supported) to the streptavidin magnetic beads by mixing the tube at room temperature for 20 minutes and bringing the biotin-labeled polyarginine peptide into contact with the streptavidin magnetic beads. .
(6) The tube was set on a magnetic stand, left to stand for 1 minute, and the supernatant was removed.
(7) The same operation (washing) as in (2) above was performed three times in total.
(8) 50 μL of BW Buffer was added to the tube, and the streptavidin magnetic beads were resuspended in BW Buffer to obtain streptavidin magnetic beads (0.2 mg/50 μL) carrying biotin-labeled polyarginine peptide.
本明細書中では、ビオチン標識ポリアルギニンペプチドが担持されたストレプトアビジン磁性ビーズを、ポリアルギニン固定化磁性ビーズという。また、本明細書中では、特に、Ｂｉｏｔｉｎ－Ｒ４を担持させたストレプトアビジン磁性ビーズ、Ｂｉｏｔｉｎ－Ｒ８を担持させたストレプトアビジン磁性ビーズ、およびＢｉｏｔｉｎ－Ｒ１６を担持させたストレプトアビジン磁性ビーズを、それぞれ、「Ｒ４固定化磁性ビーズ」、「Ｒ８固定化磁性ビーズ」、および「Ｒ１６固定化磁性ビーズ」という。 In this specification, streptavidin magnetic beads carrying a biotin-labeled polyarginine peptide are referred to as polyarginine-immobilized magnetic beads. In addition, in this specification, in particular, streptavidin magnetic beads carrying Biotin-R4, streptavidin magnetic beads carrying Biotin-R8, and streptavidin magnetic beads carrying Biotin-R16 are, respectively, They are referred to as "R4 immobilized magnetic beads," "R8 immobilized magnetic beads," and "R16 immobilized magnetic beads."
（リジンが担持された磁性ビーズの作製）
比較例１として、８つのリジンを含むペプチドを磁性ビーズ（担体）に結合させ（担持させ）、ペプチドが担持された磁性ビーズを作製した。
(Preparation of magnetic beads carrying lysine)
As Comparative Example 1, a peptide containing eight lysines was bound (supported) to magnetic beads (carrier) to produce magnetic beads on which the peptide was supported.
担体としては前記ポリアルギニン固定化磁性ビーズと同様、ストレプトアビジン磁性ビーズを用いた。 Streptavidin magnetic beads were used as the carrier, similar to the polyarginine-immobilized magnetic beads described above.
ペプチドとしては、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号４）からなるリンカーペプチドと、８個の連続したリジン残基からなる配列と、を含むペプチド（以下、「ポリリジンペプチド」という。）を使用した。比較例１で用いたアミノ酸は全てＬ型アミノ酸である。当該ポリリジンペプチドは、ストレプトアビジンを有する磁性ビーズ（担体）と結合するために、ポリリジンペプチドのＮ末端にビオチンが結合されている。当該ビオチンが結合しているポリリジンペプチドを、以下、「ビオチン標識ポリリジンペプチド」と称する。なお、比較例１において使用したビオチン標識ポリリジンペプチドは、ユーロフィンジェノミクス社による受託合成により作製された。 As the peptide, a peptide (hereinafter referred to as "polylysine peptide") containing a linker peptide consisting of GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 4) and a sequence consisting of eight consecutive lysine residues was used. All amino acids used in Comparative Example 1 are L-type amino acids. Biotin is bound to the N-terminus of the polylysine peptide in order to bind to magnetic beads (carrier) containing streptavidin. The polylysine peptide to which biotin is bound is hereinafter referred to as a "biotin-labeled polylysine peptide." The biotin-labeled polylysine peptide used in Comparative Example 1 was produced by contract synthesis by Eurofin Genomics.
比較例１において使用した、ビオチン標識ポリリジンペプチドの名称、およびビオチン標識ポリリジンペプチドが有するポリリジンペプチドのアミノ酸配列は、以下の通りである。
４．Ｂｉｏｔｉｎ－Ｋ８；ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＫＫＫＫＫＫＫＫ（配列番号８）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端をビオチンによって修飾したもの。
The name of the biotin-labeled polylysine peptide used in Comparative Example 1 and the amino acid sequence of the polylysine peptide possessed by the biotin-labeled polylysine peptide are as follows.
4. Biotin-K8: A peptide consisting of the amino acid sequence shown by GGGSGGGSGGGSKKKKKKKK (SEQ ID NO: 8) whose N-terminus is modified with biotin.
ポリリジンペプチドが担持された磁性ビーズは、上述の（アルギニンが担持された磁性ビーズの作製）の方法（１）～（８）と同様の操作を行ない作製した。 Magnetic beads carrying a polylysine peptide were prepared by performing the same operations as methods (1) to (8) of the above (preparation of magnetic beads carrying arginine).
本明細書中では、ビオチン標識ポリリジンペプチドが担持されたストレプトアビジン磁性ビーズを、ポリリジン固定化磁性ビーズという。また、本明細書中では、特に、Ｂｉｏｔｉｎ－Ｋ８を担持させたストレプトアビジン磁性ビーズを、「Ｋ８固定化磁性ビーズ」という。 In this specification, streptavidin magnetic beads carrying a biotin-labeled polylysine peptide are referred to as polylysine-immobilized magnetic beads. Furthermore, in this specification, streptavidin magnetic beads carrying Biotin-K8 are particularly referred to as "K8-immobilized magnetic beads."
（ポリアルギニン固定化磁性ビーズを用いた培養上清からのエクソソームの単離および除去）
本発明の実施例１として、ポリアルギニン固定化磁性ビーズを用いて、上清サンプルからのエクソソームの単離および除去を行なった。また、比較例１としてポリリジン固定化磁性ビーズを用いて、上清サンプルからのエクソソームの単離および除去を行なった。
(Isolation and removal of exosomes from culture supernatant using polyarginine-immobilized magnetic beads)
As Example 1 of the present invention, exosomes were isolated and removed from a supernatant sample using polyarginine-immobilized magnetic beads. Furthermore, as Comparative Example 1, polylysine-immobilized magnetic beads were used to isolate and remove exosomes from a supernatant sample.
ポリアルギニン固定化磁性ビーズを用いた単離方法について、図１を参照して以下に説明する。
（１）０．５ｍＬの上清サンプルに５０μＬのBinding Buffer（ExoIntact Exosome精製試薬キット付属、HMTバイオメディカル株式会社）を添加した。
（２）Binding Bufferを添加した上清サンプル５５０μＬを含むチューブに、Ｒ４固定化磁性ビーズ、Ｒ８固定化磁性ビーズ、またはＲ１６固定化磁性ビーズを５０μＬ添加した。
（３）チューブを室温で、６０分混合させることによって、上清サンプル中のエクソソームとポリアルギニン固定化磁性ビーズとを接触させ、ポリアルギニンペプチドにエクソソームを結合させた。すなわち、当該（３）の工程にて、エクソソームとポリアルギニンペプチドとストレプトアビジン磁性ビーズ（担体）とを含む複合体が形成された。
（４）チューブをマグネットスタンドにセットして１分静置し、上清を取り除いた。
（５）次の操作を行ない、複合体を洗浄した：（５－１）チューブをマグネットスタンドから外し、１．０ｍＬのBW Bufferをチューブに添加して、混合した；（５－２）チューブをマグネットスタンドにセットして１分静置し、上清を取り除いた。
（６）前記（５）の操作（洗浄）をさらに２回（合計３回）行ない、上清サンプル中のエクソソームを複合体として含む、ポリアルギニン固定化磁性ビーズ（０．２ｍｇ）を回収した。
（７）解離バッファーとして、ＮａＣｌ溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ ＮａＣｌ］を５０μＬ添加して、混合した。
（８）１０分間静置し、複合体からエクソソームを解離させ、当該解離バッファー（５０μＬ）を回収して、溶出サンプルとした。
An isolation method using polyarginine-immobilized magnetic beads will be described below with reference to FIG. 1.
(1) 50 μL of Binding Buffer (attached to ExoIntact Exosome Purification Reagent Kit, HMT Biomedical Co., Ltd.) was added to 0.5 mL of supernatant sample.
(2) 50 μL of R4-immobilized magnetic beads, R8-immobilized magnetic beads, or R16-immobilized magnetic beads were added to a tube containing 550 μL of the supernatant sample added with Binding Buffer.
(3) By mixing the tube at room temperature for 60 minutes, the exosomes in the supernatant sample were brought into contact with the polyarginine-immobilized magnetic beads, and the exosomes were bound to the polyarginine peptide. That is, in step (3), a complex containing exosomes, polyarginine peptides, and streptavidin magnetic beads (carrier) was formed.
(4) The tube was set on a magnetic stand, left to stand for 1 minute, and the supernatant was removed.
(5) Perform the following operations to wash the complex: (5-1) Remove the tube from the magnetic stand, add 1.0 mL of BW Buffer to the tube, and mix; (5-2) Remove the tube from the magnetic stand. It was set on a magnetic stand, left to stand for 1 minute, and the supernatant was removed.
(6) The operation (washing) in (5) above was performed two more times (total of three times), and polyarginine-immobilized magnetic beads (0.2 mg) containing exosomes in the supernatant sample as a complex were recovered.
(7) As a dissociation buffer, 50 μL of NaCl solution [10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 M NaCl] was added and mixed.
(8) The complex was left to stand for 10 minutes to dissociate exosomes from the complex, and the dissociation buffer (50 μL) was collected and used as an elution sample.
比較例１としてＫ８固定化磁性ビーズ（５０μＬ）、ネガティブコントールとしてペプチドが担持されていないストレプトアビジン磁性ビーズ（０．２ｍｇ／５０μＬ）を用いて、前記（１）～（７）と同様の操作を行ない、エクソソームの溶出サンプルを得た。 The same operations as in (1) to (7) above were performed using K8-immobilized magnetic beads (50 μL) as Comparative Example 1 and streptavidin magnetic beads (0.2 mg/50 μL) on which no peptide was supported as a negative control. An elution sample of exosomes was obtained.
（エクソソームの定量）
上述のポリアルギニン固定化磁性ビーズによって得られた溶出サンプルのエクソソーム濃度は、ＣＤ９／ＣＤ６３ＥＬＩＳＡキット（コスモ・バイオ社）を用いて測定した。測定サンプルとしては、上清サンプルまたは各溶出サンプルを２０倍にアッセイバッファーで希釈して調製した。また、標準タンパク質として、ＣＤ９／ＣＤ６３融合タンパク質を使用した。測定方法は、同キットのプロトコールに従って行なった。具体的な測定方法を以下に示す。
（１）抗ＣＤ９抗体固相化９６ウェルプレートに、１００μＬの希釈した測定サンプル、または１００μＬのＣＤ９／ＣＤ６３融合タンパク質の段階希釈サンプル（１２．５～１００ｐｇ／ｍＬ）を添加して、２時間静置で反応させた。
（２）３００μＬの洗浄バッファー（１×）で３回洗浄した後、１００μＬのＨＲＰ標識抗ＣＤ６３抗体溶液を添加して２時間静置で反応させた。
（３）３００μＬの洗浄バッファー（１×）で３回洗浄した後、１００μＬの基質液を添加して１０分間発色反応させ、５０μＬの停止液を添加して発色反応を停止させた。
（４）プレートリーダー（ARVO MX 1420、パーキンエルマー社）でＡ４５０の吸光度を測定した。
(Quantification of exosomes)
The exosome concentration of the elution sample obtained using the above-mentioned polyarginine-immobilized magnetic beads was measured using a CD9/CD63 ELISA kit (Cosmo Bio). The measurement sample was prepared by diluting the supernatant sample or each elution sample 20 times with assay buffer. Furthermore, a CD9/CD63 fusion protein was used as a standard protein. The measurement method was performed according to the protocol of the same kit. The specific measurement method is shown below.
(1) Add 100 μL of diluted measurement sample or 100 μL of serially diluted sample of CD9/CD63 fusion protein (12.5 to 100 pg/mL) to an anti-CD9 antibody immobilized 96-well plate, and leave it for 2 hours. The reaction was allowed to take place.
(2) After washing three times with 300 μL of washing buffer (1×), 100 μL of HRP-labeled anti-CD63 antibody solution was added and allowed to react for 2 hours.
(3) After washing three times with 300 μL of washing buffer (1×), 100 μL of substrate solution was added to allow color reaction to occur for 10 minutes, and 50 μL of stop solution was added to stop the color reaction.
(4) Absorbance of A450 was measured using a plate reader (ARVO MX 1420, PerkinElmer).
標準タンパク質である、ＣＤ９／ＣＤ６３融合タンパク質の段階希釈サンプルの測定結果から検量線を作成し、測定サンプル中に含まれるエクソソーム濃度を、ＣＤ９／ＣＤ６３融合タンパク質の濃度で換算した。 A calibration curve was created from the measurement results of serially diluted samples of CD9/CD63 fusion protein, which is a standard protein, and the concentration of exosomes contained in the measurement sample was converted to the concentration of CD9/CD63 fusion protein.
また、ネガティブコントロールのエクソソーム濃度およびＫ８固定化磁性ビーズを用いた比較例１のエクソソーム濃度も、同様に、ＣＤ９／ＣＤ６３ＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。 Furthermore, the exosome concentration of the negative control and the exosome concentration of Comparative Example 1 using K8-immobilized magnetic beads were similarly measured using the CD9/CD63 ELISA kit.
〔結果：培養上清からのエクソソームの単離〕
図２に、Ｒ４固定化磁性ビーズ、Ｒ８固定化磁性ビーズ、またはＲ１６固定化磁性ビーズを用いた実施例１と、ストレプトアビジン磁性ビーズのみ（図２では「磁性ビーズのみ」と表記。）を用いたネガティブコントロールとの、エクソソーム濃度の測定結果を示す。図２で示すように、ネガティブコントロールではエクソソームが検出されなかったため、ストレプトアビジン磁性ビーズそれ自体にはほとんどエクソソームが結合しないことが分かった。一方、Ｒ４固定化磁性ビーズ、Ｒ８固定化磁性ビーズ、またはＲ１６固定化磁性ビーズを用いた実施例１では、溶出サンプルからエクソソームが検出された。
[Results: Isolation of exosomes from culture supernatant]
Figure 2 shows Example 1 using R4-immobilized magnetic beads, R8-immobilized magnetic beads, or R16-immobilized magnetic beads, and Example 1 using only streptavidin magnetic beads (indicated as "magnetic beads only" in Figure 2). The measurement results of exosome concentration are shown in comparison with the negative control. As shown in Figure 2, no exosomes were detected in the negative control, indicating that almost no exosomes bound to the streptavidin magnetic beads themselves. On the other hand, in Example 1 using R4-immobilized magnetic beads, R8-immobilized magnetic beads, or R16-immobilized magnetic beads, exosomes were detected from the elution sample.
したがって、４つ以上のアルギニンを含むペプチド（ポリアルギニンペプチド）を用いた本発明の単離方法は、当該ポリアルギニンペプチドに特異的にエクソソームが結合することによって、エクソソームを単離できることが示された。さらに、Ｒ４固定化磁性ビーズ、Ｒ８固定化磁性ビーズ、またはＲ１６固定化磁性ビーズを用いた実施例１のエクソソーム濃度を比較したところ、Ｒ８固定化磁性ビーズのエクソソーム濃度が最も高いことが示された。したがって、８つ以上のアルギニンを含むペプチドを用いた本発明の単離方法は、極めて効率よくエクソソームを単離できることが示された。 Therefore, it was shown that the isolation method of the present invention using a peptide containing four or more arginines (polyarginine peptide) can isolate exosomes by binding specifically to the polyarginine peptide. . Furthermore, when comparing the exosome concentrations in Example 1 using R4-immobilized magnetic beads, R8-immobilized magnetic beads, or R16-immobilized magnetic beads, it was shown that the exosome concentration of R8-immobilized magnetic beads was the highest. . Therefore, it was shown that the isolation method of the present invention using a peptide containing eight or more arginines can isolate exosomes extremely efficiently.
次に、Ｒ８固定化磁性ビーズを用いた実施例１と、Ｋ８固定化磁性ビーズを用いた比較例１との、エクソソーム濃度の測定結果を図３に示す。Ｋ８固定化磁性ビーズを用いた比較例１と比較して、Ｒ８固定化磁性ビーズを用いた実施例１ではエクソソーム濃度が約２．４倍に向上していることが分かった。したがって、ポリアルギニン固定化磁性ビーズを用いた本発明の単離方法では、同じ鎖長のポリリジン固定化磁性ビーズを用いた単離方法よりも、エクソソームを効率よく単離できることが示された。 Next, FIG. 3 shows the measurement results of exosome concentrations in Example 1 using R8-immobilized magnetic beads and Comparative Example 1 using K8-immobilized magnetic beads. It was found that the exosome concentration in Example 1 using R8-immobilized magnetic beads was improved by about 2.4 times compared to Comparative Example 1 using K8-immobilized magnetic beads. Therefore, it was shown that the isolation method of the present invention using polyarginine-immobilized magnetic beads can isolate exosomes more efficiently than the isolation method using polylysine-immobilized magnetic beads of the same chain length.
〔結果：培養上清からのエクソソームの除去〕
図２および図３で示すように、実施例１の溶出サンプルには、エクソソームがポリアルギニン固定化磁性ビーズに結合し、溶出していることが示された。よって、ポリアルギニン固定化磁性ビーズとエクソソームとを混合し、マグネットスタンドで静置した後の上清は、エクソソームを含む試料中からエクソソームの少なくとも一部が除去された分離液であるといえる。このことから、本発明の除去方法によれば、試料からエクソソームを高効率に除去できることが示された。
[Result: Removal of exosomes from culture supernatant]
As shown in FIGS. 2 and 3, the elution sample of Example 1 showed that exosomes were bound to polyarginine-immobilized magnetic beads and eluted. Therefore, it can be said that the supernatant obtained by mixing polyarginine-immobilized magnetic beads and exosomes and allowing them to stand still on a magnetic stand is a separated liquid in which at least a portion of exosomes have been removed from a sample containing exosomes. This indicates that exosomes can be removed from the sample with high efficiency according to the removal method of the present invention.
＜２．ポリアルギニン固定化磁性ビーズを用いた血清からのエクソソームの単離＞
〔材料および方法〕
（試料の調製）
血清としてHuman Serum（ＢＳＬ社）を用いて、以下の方法により試料の調整を行なった。スピンカラムとしてMicroSpin S-400 HR Columns（GE Healthcare社）を用いた。
（１）スピンカラムを１．５ｍＬのチューブにセットし、スピンカラムのレジンのボルテックスを行なった後、１分間静置した。
（２）スピンカラムを付属のコレクションチューブに取り付け、７３５×ｇ、１ｍｉｎの遠心分離を行ない、保存液を取り除いた。
（３）スピンカラムを新しい１．５ｍＬチューブに取り付け、０．１ｍＬの血清をスピンカラムにゆっくりと添加した。
（４）７３５×ｇ、２ｍｉｎの遠心分離を行ない、血清中のデブリを取り除いた。
（５）０．１ｍＬの上清に０．４ｍＬのBW Bufferを添加し、０．５ｍＬの試料（以下、「血清サンプル」という。）とした。
<2. Isolation of exosomes from serum using polyarginine-immobilized magnetic beads>
〔material and method〕
(Sample preparation)
Using Human Serum (BSL) as the serum, samples were prepared according to the following method. MicroSpin S-400 HR Columns (GE Healthcare) was used as a spin column.
(1) A spin column was set in a 1.5 mL tube, and after vortexing the resin in the spin column, it was left standing for 1 minute.
(2) The spin column was attached to the attached collection tube and centrifuged at 735×g for 1 min to remove the storage solution.
(3) The spin column was attached to a new 1.5 mL tube and 0.1 mL of serum was slowly added to the spin column.
(4) Centrifugation was performed at 735×g for 2 minutes to remove debris in the serum.
(5) 0.4 mL of BW Buffer was added to 0.1 mL of supernatant to obtain a 0.5 mL sample (hereinafter referred to as "serum sample").
（ポリアルギニン固定化磁性ビーズを用いた血清からのエクソソームの単離および定量）
本発明の実施例２として、ポリアルギニン固定化磁性ビーズを用いて血清からのエクソソームの単離を行なった。図４に、本発明の実施例２に係る単離方法の概要を示している。ポリアルギニン固定化磁性ビーズは、＜１．ポリアルギニン固定化磁性ビーズを用いた培養上清からのエクソソームの単離および除去＞で使用したＲ８固定化磁性ビーズを用いた。
(Isolation and quantification of exosomes from serum using polyarginine-immobilized magnetic beads)
As Example 2 of the present invention, exosomes were isolated from serum using polyarginine-immobilized magnetic beads. FIG. 4 shows an outline of the isolation method according to Example 2 of the present invention. Polyarginine-immobilized magnetic beads have <1. Isolation and removal of exosomes from culture supernatant using polyarginine-immobilized magnetic beads> R8-immobilized magnetic beads were used.
具体的な方法について、以下に示す。
（１）０．５ｍＬの血清サンプルに５０μＬのＲ８固定化磁性ビーズを添加した。
（２）チューブを室温で、６０分混合させることによって、血清サンプル中のエクソソームとＲ８固定化磁性ビーズとを接触させ、ポリアルギニンペプチドにエクソソームを結合させた。すなわち、当該（２）の工程にて、エクソソームとポリアルギニンペプチドとストレプトアビジン磁性ビーズ（担体）とを含む複合体が形成された。
（３）チューブをマグネットスタンドにセットして１分静置し、上清を取り除いた。
（４）次の操作を行ない、複合体を洗浄した：（４－１）チューブをマグネットスタンドから外し、１．０ｍＬのBW Bufferをチューブに添加して、混合した；（４－２）チューブをマグネットスタンドにセットして１分静置し、上清を取り除いた。
（５）前記（４）の操作（洗浄）をさらに２回（合計３回）行ない、血清サンプル中のエクソソームを複合体として含む、Ｒ８固定化磁性ビーズ（０．２ｍｇ）を回収した。
（６）解離バッファーとして、ＮａＣｌ溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ ＮａＣｌ］を５０μＬ添加して、混合した。
（７）１０分間静置し、複合体からエクソソームを解離させ、当該解離バッファー（５０μＬ）を回収して、溶出サンプルとした。
The specific method is shown below.
(1) 50 μL of R8-immobilized magnetic beads were added to 0.5 mL of serum sample.
(2) By mixing the tube at room temperature for 60 minutes, the exosomes in the serum sample were brought into contact with the R8-immobilized magnetic beads, and the exosomes were bound to the polyarginine peptide. That is, in step (2), a complex containing exosomes, polyarginine peptides, and streptavidin magnetic beads (carrier) was formed.
(3) The tube was set on a magnetic stand, left to stand for 1 minute, and the supernatant was removed.
(4) Perform the following operations to wash the complex: (4-1) Remove the tube from the magnetic stand, add 1.0 mL of BW Buffer to the tube, and mix; (4-2) Remove the tube from the magnetic stand. It was set on a magnetic stand, left to stand for 1 minute, and the supernatant was removed.
(5) The operation (washing) described in (4) above was performed two more times (total of three times), and R8-immobilized magnetic beads (0.2 mg) containing exosomes in the serum sample as a complex were collected.
(6) As a dissociation buffer, 50 μL of NaCl solution [10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 M NaCl] was added and mixed.
(7) The complex was left to stand for 10 minutes to dissociate exosomes from the complex, and the dissociation buffer (50 μL) was collected and used as an elution sample.
得られた溶出サンプルを、＜１．ポリアルギニン固定化磁性ビーズを用いた培養上清からのエクソソームの単離および除去＞で行なった定量方法と同様に、ＣＤ９／ＣＤ６３ＥＬＩＳＡキットを用いてエクソソーム濃度を測定した。 The obtained elution sample was rated at <1. Isolation and Removal of Exosomes from Culture Supernatant Using Polyarginine-Immobilized Magnetic Beads> Exosome concentration was measured using a CD9/CD63 ELISA kit in the same manner as the quantification method performed in the section.
〔結果〕
Ｒ８固定化磁性ビーズを用いた本発明の実施例２では、血清から１３２ｐｇ／ｍＬのエクソソームを回収できることが分かった。したがって、ポリアルギニン固定化磁性ビーズを用いた本発明の単離方法では、培養上清からだけでなく、エクソソーム以外の夾雑物を多く含む血清からも、エクソソームを回収できることが示された。すなわち、本発明の単離方法では、効率よく生体由来の試料からエクソソームの単離を行なうことができる。
〔result〕
In Example 2 of the present invention using R8-immobilized magnetic beads, it was found that 132 pg/mL of exosomes could be recovered from serum. Therefore, it was shown that the isolation method of the present invention using polyarginine-immobilized magnetic beads allows exosomes to be recovered not only from the culture supernatant but also from serum containing a large amount of contaminants other than exosomes. That is, according to the isolation method of the present invention, exosomes can be efficiently isolated from biological samples.
＜３．ポリアルギニン固定化磁性ビーズによる多様なエクソソームの単離＞
〔材料および方法〕
（ポリアルギニン固定化磁性ビーズを用いたエクソソームの単離およびマーカー解析）
本発明の実施例３として、ポリアルギニン固定化磁性ビーズを用いてエクソソームの単離を行なった。図５に、本発明の実施例３に係る単離方法の概要を示している。エクソソームを単離する試料は、＜１．ポリアルギニン固定化磁性ビーズを用いた培養上清からのエクソソームの単離および除去＞で使用した上清サンプルを用いた。また、ポリアルギニン固定化磁性ビーズは、＜１．ポリアルギニン固定化磁性ビーズを用いた培養上清からのエクソソームの単離および除去＞で使用したＲ８固定化磁性ビーズを用いた。比較例２として、＜１．ポリアルギニン固定化磁性ビーズを用いた培養上清からのエクソソームの単離および除去＞で使用したＫ８固定化磁性ビーズを用いた。
<3. Isolation of various exosomes using polyarginine-immobilized magnetic beads>
〔material and method〕
(Exosome isolation and marker analysis using polyarginine-immobilized magnetic beads)
As Example 3 of the present invention, exosomes were isolated using polyarginine-immobilized magnetic beads. FIG. 5 shows an outline of the isolation method according to Example 3 of the present invention. The sample from which exosomes are isolated is <1. The supernatant sample used in ``Isolation and removal of exosomes from culture supernatant using polyarginine-immobilized magnetic beads'' was used. Moreover, polyarginine-immobilized magnetic beads have <1. The R8-immobilized magnetic beads used in Isolation and Removal of Exosomes from Culture Supernatant Using Polyarginine-immobilized Magnetic Beads were used. As Comparative Example 2, <1. The K8-immobilized magnetic beads used in Isolation and removal of exosomes from culture supernatant using polyarginine-immobilized magnetic beads were used.
具体的な方法について、以下に示す。
（１）０．２ｍＬの上清サンプルに０．０２ｍＬのBinding Bufferを添加した。
（２）Binding Bufferを添加した上清サンプル２２０μＬを含むチューブに、Ｒ８固定化磁性ビーズ、またはＫ８固定化磁性ビーズを８μＬ添加した。
（３）チューブを室温で、３０分混合させることによって、上清サンプル中のエクソソームとＲ８固定化磁性ビーズまたはＫ８固定化磁性ビーズとを接触させ、ポリアルギニンペプチドまたはポリリジンペプチドにエクソソームを結合させた。すなわち、当該（２）の工程にて、エクソソームとポリアルギニンペプチドまたはポリリジンペプチドとストレプトアビジン磁性ビーズ（担体）とを含む複合体が形成された。
（４）チューブをマグネットスタンドにセットして１分静置し、上清を取り除いた。
（５）次の操作を行ない、複合体を洗浄した：（５－１）チューブをマグネットスタンドから外し、０．２ｍＬのBW Bufferをチューブに添加して、混合した；（５－２）チューブをマグネットスタンドにセットして１分静置し、上清を取り除いた。
（６）前記（５）の操作（洗浄）をさらに２回（合計３回）行ない、２００μＬのBW Bufferに再懸濁した。
（７）得られた懸濁液を、ＣＤ９陽性エクソソームの検出用と、ＣＤ６３陽性エクソソームの検出用とに分けて、それぞれ１００μＬずつ１．５ｍＬチューブに分注した。また陰性コントロールとして、１．５ｍＬチューブに、４μＬのＲ８固定化磁性ビーズまたはＫ８固定化磁性ビーズのみを分注したものを２本用意した。
（８）１．５ｍＬチューブをマグネットスタンドに１分間静置した後、上清を取り除き、１００μＬのブロッキング溶液を添加して、２０ｍｉｎ混和反応させた。Ｒ８固定化磁性ビーズのブロッキング溶液は、ＴＢＳ（ｐＨ７．４、ナカライテスク社）に、２％ブロックエース（ケー・エー・シー社）および０．０２５％ Tween 20（富士フィルム和光純薬社）を添加した溶液を用いた。Ｋ８固定化磁性ビーズのブロッキング溶液は、ＴＢＳ（ｐＨ７．４、ナカライテスク社）に、２％ＢＳＡ（富士フィルム和光純薬社）および０．０２５％ Tween 20（富士フィルム和光純薬社）を添加した溶液を用いた。
（９）さらに１００μＬの１次抗体溶液を添加して、３０ｍｉｎ混和反応させた。１次抗体溶液としては、抗ＣＤ９抗体（Anti-CD9 Human (Mouse) Unlabeled 12A12、コスモ・バイオ社）、または抗ＣＤ６３抗体（Anti-CD63、Monoclonal Antibody (3-13)、富士フィルム和光純薬社）を、それぞれブロッキング溶液で１０００倍希釈したものを用いた。
（１０）１次抗体溶液を添加して３０ｍｉｎ反応後、マグネットスタンドに１分間静置し、上清を取り除き、０．１ｍＬのＴＢＳ－Ｔ（ＴＢＳ（ｐＨ７．４）に０．０２５％ Tween 20を添加した溶液）で２回洗浄した。
（１１）それぞれの１．５ｍＬチューブをマグネットスタンドに１分間静置した後、上清を取り除き、１００μＬの２次抗体溶液を添加して、３０ｍｉｎ混和反応させた。２次抗体溶液としては、Anti-Mouse-HRP（Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP)、ab97023、Abcam社）をブロッキング溶液で５００００倍希釈したものを用いた。
（１２）２次抗体溶液を添加して３０ｍｉｎ反応後、１．５ｍＬチューブをマグネットスタンドに１分間静置し、上清を取り除き、０．１ｍＬのＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した。
（１３）１．５ｍＬチューブをマグネットスタンドに１分間静置した後、上清を取り除き、０．０４ｍＬのＴＢＳ（ｐＨ７．４）に懸濁した。
（１４）得られた懸濁液１０μＬに９０μＬの発光基質（ELISA-Starペルオキシダーゼ化学発光基質、富士フィルム和光純薬社）を添加して５ｍｉｎ反応後、プレートリーダーで発光値を測定した。
The specific method is shown below.
(1) 0.02 mL of Binding Buffer was added to 0.2 mL of supernatant sample.
(2) 8 μL of R8-immobilized magnetic beads or K8-immobilized magnetic beads were added to a tube containing 220 μL of supernatant sample added with Binding Buffer.
(3) By mixing the tube at room temperature for 30 minutes, exosomes in the supernatant sample were contacted with R8-immobilized magnetic beads or K8-immobilized magnetic beads, and the exosomes were bound to the polyarginine peptide or polylysine peptide. . That is, in step (2), a complex containing exosomes, polyarginine peptides or polylysine peptides, and streptavidin magnetic beads (carrier) was formed.
(4) The tube was set on a magnetic stand, left to stand for 1 minute, and the supernatant was removed.
(5) Perform the following operations to wash the complex: (5-1) Remove the tube from the magnetic stand, add 0.2 mL of BW Buffer to the tube, and mix; (5-2) Remove the tube from the magnetic stand. It was set on a magnetic stand, left to stand for 1 minute, and the supernatant was removed.
(6) The operation (washing) in (5) above was performed two more times (3 times in total) and resuspended in 200 μL of BW Buffer.
(7) The obtained suspension was divided into one for detection of CD9-positive exosomes and one for detection of CD63-positive exosomes, and 100 μL each was dispensed into 1.5 mL tubes. As a negative control, two 1.5 mL tubes were prepared in which 4 μL of R8-immobilized magnetic beads or K8-immobilized magnetic beads alone were dispensed.
(8) After leaving the 1.5 mL tube on a magnetic stand for 1 minute, the supernatant was removed, 100 μL of blocking solution was added, and the mixture was mixed and reacted for 20 minutes. The blocking solution for R8-immobilized magnetic beads was TBS (pH 7.4, Nacalai Tesque) containing 2% Block Ace (KAC) and 0.025% Tween 20 (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries). The added solution was used. The blocking solution for K8-immobilized magnetic beads was TBS (pH 7.4, Nacalai Tesque) with 2% BSA (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 0.025% Tween 20 (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) added. The solution was used.
(9) Furthermore, 100 μL of the primary antibody solution was added, and the mixture was reacted for 30 min. As the primary antibody solution, anti-CD9 antibody (Anti-CD9 Human (Mouse) Unlabeled 12A12, Cosmo Bio) or anti-CD63 antibody (Anti-CD63, Monoclonal Antibody (3-13), Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ) were used, each diluted 1000 times with a blocking solution.
(10) After adding the primary antibody solution and reacting for 30 minutes, leave it for 1 minute on a magnetic stand, remove the supernatant, and add 0.1 mL of TBS-T (0.025% Tween 20 in TBS (pH 7.4) (added solution) twice.
(11) After leaving each 1.5 mL tube on a magnetic stand for 1 minute, the supernatant was removed, 100 μL of secondary antibody solution was added, and the mixture was mixed and reacted for 30 minutes. As the secondary antibody solution, Anti-Mouse-HRP (Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP), ab97023, Abcam) diluted 50,000 times with a blocking solution was used.
(12) After adding the secondary antibody solution and reacting for 30 minutes, the 1.5 mL tube was left standing on a magnetic stand for 1 minute, the supernatant was removed, and the tube was washed three times with 0.1 mL of TBS-T.
(13) After leaving the 1.5 mL tube on a magnetic stand for 1 minute, the supernatant was removed and suspended in 0.04 mL of TBS (pH 7.4).
(14) 90 μL of luminescent substrate (ELISA-Star peroxidase chemiluminescent substrate, Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to 10 μL of the obtained suspension, and after reaction for 5 min, the luminescence value was measured using a plate reader.
得られた発光値から、陰性コントロールの発光値を差し引いて、Ｒ８固定化磁性ビーズまたはＫ８固定化磁性ビーズ結合したＣＤ９陽性エクソソームまたはＣＤ６３陽性エクソソームの量を定量した。 The amount of CD9-positive exosomes or CD63-positive exosomes bound to R8-immobilized magnetic beads or K8-immobilized magnetic beads was quantified by subtracting the luminescence value of the negative control from the obtained luminescence value.
〔結果〕
図６に示すように、Ｒ８固定化磁性ビーズを用いた本発明の実施例３では、Ｋ８固定化磁性ビーズを用いた比較例２と比べて、ＣＤ９陽性エクソソームおよびＣＤ６３陽性エクソソームの両方を、良好に単離できることが分かった。
〔result〕
As shown in FIG. 6, in Example 3 of the present invention using R8-immobilized magnetic beads, both CD9-positive exosomes and CD63-positive exosomes were detected better than in Comparative Example 2 using K8-immobilized magnetic beads. It was found that it could be isolated.
また、磁性ビーズに結合するＣＤ６３陽性エクソソームの量を、磁性ビーズに結合するＣＤ９陽性エクソソームの量で除した値（ＣＤ６３／ＣＤ９）を比較した結果を図７に示す。図７に示すように、Ｒ８固定化磁性ビーズでは、Ｋ８固定化磁性ビーズに比べてＣＤ６３／ＣＤ９の値が約１０倍高まった。言い換えれば、Ｋ８固定化磁性ビーズはＣＤ９陽性エクソソームへの結合と比較して、ＣＤ６３陽性エクソソームへの結合が非常に弱いことが示唆された。一方、Ｒ８固定化磁性ビーズはＣＤ９陽性エクソソームへの結合も、ＣＤ６３陽性エクソソームへの結合も良好であることが示唆された。 Further, FIG. 7 shows the results of comparing the amount of CD63-positive exosomes bound to magnetic beads divided by the amount of CD9-positive exosomes bound to magnetic beads (CD63/CD9). As shown in FIG. 7, the R8-immobilized magnetic beads increased the CD63/CD9 value by about 10 times compared to the K8-immobilized magnetic beads. In other words, it was suggested that K8-immobilized magnetic beads had very weak binding to CD63-positive exosomes compared to binding to CD9-positive exosomes. On the other hand, it was suggested that R8-immobilized magnetic beads bind well to CD9-positive exosomes and to CD63-positive exosomes.
以上より、エクソソームを単離するためにポリアルギニンを用いれば、ポリリジンを用いる場合と比較して、ＣＤ６３陽性エクソソームを含む多様な種類のエクソソームをより好適に単離できることが示された。 From the above, it has been shown that when polyarginine is used to isolate exosomes, various types of exosomes including CD63-positive exosomes can be isolated more favorably than when polylysine is used.
本発明によると、簡便に、かつインタクトな状態（インタクトに近い状態）で、ＣＤ６３陽性エクソソームを含む多様な種類のエクソソームを単離または試料から除去することができる。したがって、本発明によると、多様な種類のエクソソームの内部に包含される物質の解析を簡便に、かつ、詳細に行なうことができるようになる。したがって、本発明は、種々の技術分野、とりわけ、製薬および医療分野等において有用である。 According to the present invention, various types of exosomes including CD63-positive exosomes can be easily isolated or removed from a sample in an intact state (nearly intact state). Therefore, according to the present invention, it becomes possible to easily and precisely analyze substances contained inside various types of exosomes. Therefore, the present invention is useful in various technical fields, particularly in the pharmaceutical and medical fields.
Claims (7)
前記試料と、連続している４つ以上のアルギニンを含むペプチドと、前記ペプチドを担持可能な担体とを接触させるか、または、前記試料と、前記担体に担持された前記ペプチドとを接触させることによって、前記エクソソームと前記担体に担持された前記ペプチドとが結合してなる複合体を形成させる複合体形成工程、および、
前記複合体形成工程によって得られた前記複合体と、金属陽イオンを含む解離バッファーとを接触させて、前記複合体から前記エクソソームを解離させる解離工程を含むことを特徴とする、エクソソームの単離方法。 A method for isolating exosomes, the method comprising: isolating exosomes from a sample containing exosomes,
Contacting the sample, a peptide containing four or more consecutive arginines, and a carrier capable of supporting the peptide, or contacting the sample and the peptide supported on the carrier. a complex forming step in which the exosome and the peptide supported on the carrier form a complex by binding, and
Isolation of exosomes, comprising a dissociation step of dissociating the exosomes from the complex by contacting the complex obtained by the complex formation step with a dissociation buffer containing a metal cation. Method.
前記ペプチド、前記担体および前記解離バッファーを含むことを特徴とする、エクソソームの単離キット。 An exosome isolation kit for carrying out the exosome isolation method according to any one of claims 1 to 5 , comprising:
An exosome isolation kit comprising the peptide, the carrier, and the dissociation buffer.
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