JP7236718B2 - Genome editing technology - Google Patents
Genome editing technology Download PDFInfo
- Publication number
- JP7236718B2 JP7236718B2 JP2018158921A JP2018158921A JP7236718B2 JP 7236718 B2 JP7236718 B2 JP 7236718B2 JP 2018158921 A JP2018158921 A JP 2018158921A JP 2018158921 A JP2018158921 A JP 2018158921A JP 7236718 B2 JP7236718 B2 JP 7236718B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- genome
- editing
- gene
- nanos
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 title claims description 71
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 title description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 50
- 241000549556 Nanos Species 0.000 claims description 42
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 41
- 101150090724 3 gene Proteins 0.000 claims description 39
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 39
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 33
- 229940123611 Genome editing Drugs 0.000 claims description 32
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 26
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 6
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 claims description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 52
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 52
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 52
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 39
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 36
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 12
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 11
- 241000276569 Oryzias latipes Species 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 10
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 6
- 108010021843 fluorescent protein 583 Proteins 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 5
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 5
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 5
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 5
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 5
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 241000205091 Sulfolobus solfataricus Species 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]propan-1-one Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)CCC(=O)N1CCN(CC1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 3
- 101710177611 DNA polymerase II large subunit Proteins 0.000 description 3
- 101710184669 DNA polymerase II small subunit Proteins 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 2
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 description 2
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241000251556 Chordata Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 241000276423 Fundulus heteroclitus Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 2
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 description 2
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 2
- 241000194020 Streptococcus thermophilus Species 0.000 description 2
- 241001441722 Takifugu rubripes Species 0.000 description 2
- 241000255588 Tephritidae Species 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 235000014705 isoleucine Nutrition 0.000 description 2
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 210000005132 reproductive cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 2
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 125000004200 2-methoxyethyl group Chemical group [H]C([H])([H])OC([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 1
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000589599 Francisella tularensis subsp. novicida Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 208000009869 Neu-Laxova syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 241000589892 Treponema denticola Species 0.000 description 1
- 241000251555 Tunicata Species 0.000 description 1
- 108091026822 U6 spliceosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000269457 Xenopus tropicalis Species 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 1
- 125000003282 alkyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 210000003890 endocrine cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- 230000002710 gonadal effect Effects 0.000 description 1
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 1
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 210000000441 neoplastic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 125000002813 thiocarbonyl group Chemical group *C(*)=S 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、ゲノム編集技術等に関する。 The present invention relates to genome editing technology and the like.
ガイドRNAとCasタンパク質との組合せにより、細胞のゲノム上の特定配列にDNA2本鎖切断を発生させることができる。このDNA切断端ではDNAのランダムな削り込みや付加等の変異が高頻度に起こるため、ガイドRNAとCasタンパク質との組合せにより、容易にゲノム編集が可能である。この技術は、CRISPR/Casシステムといわれており、近年、急速に開発・改良が進められている（特許文献１）。また、CISPR/Casシステム以外にも、TALENやZFN等、ゲノム編集用ヌクレアーゼは各種報告されている。 A combination of guide RNA and Cas protein can generate DNA double-strand breaks at specific sequences on the genome of cells. Since mutations such as random DNA deletions and additions occur frequently at these DNA cut ends, genome editing can be easily performed by combining guide RNAs and Cas proteins. This technology is called the CRISPR/Cas system, and has been rapidly developed and improved in recent years (Patent Document 1). In addition to the CISPR/Cas system, various genome editing nucleases such as TALENs and ZFNs have been reported.
ゲノム編集用ヌクレアーゼで受精卵のゲノム編集を行う際に、ファウンダー世代ではある程度の割合でモザイク状態となるため、生殖細胞にゲノム編集が起こらない場合も多い。この場合、次世代動物に生殖系列伝播した個体の作出や変異特定に手間や時間を要してしまう。 When fertilized eggs are edited with genome-editing nucleases, a certain percentage of founder generations are in a mosaic state, so genome editing often does not occur in reproductive cells. In this case, it takes time and effort to create individuals that have been germline-transmitted to next-generation animals and to identify mutations.
具体的には、例えば次のような事例が存在する。ゲノム編集技術を用いて変異を導入した脊椎動物を作成する場合、受精卵（初期胚）にガイド RNAを導入する方法が取られる。しかし、導入されたガイドRNAやCasタンパク質が発生過程のすべての細胞に均一に働くわけではないので、ファウンダー世代は（F0世代）はモザイク（変異が導入された細胞とされていない細胞が混在している）状態となる。F0 世代では目的遺伝子が改変されたかはわからないため、F1 世代でスクリーニングを行うが、目的の遺伝子が改変されている可能性は一般的に 10% 程度であるといわれている。そこで、F1 世代を掛け合せてホモ（F2）を選抜する。このため、ホモの選抜までに多大な労力を要する。 Specifically, there are the following examples. When creating vertebrates into which mutations are introduced using genome editing technology, a method of introducing guide RNA into a fertilized egg (early embryo) is adopted. However, since the introduced guide RNA and Cas protein do not work uniformly in all cells during the developmental process, the founder generation (F0 generation) is a mosaic (a mixture of cells with and without mutations introduced). is in place). Since it is not known whether the target gene has been modified in the F0 generation, screening is performed in the F1 generation, but the possibility that the target gene has been modified is generally said to be about 10%. Therefore, homozygotes (F2) are selected by crossing the F1 generation. For this reason, it takes a lot of effort to select homozygotes.
そこで、本発明は、生殖細胞においてより効率的にゲノム編集することができる技術を提供することを課題とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a technique that enables genome editing in germ cells more efficiently.
本発明者は、次世代に形質を伝えるためには、体細胞ではなく、生殖細胞特異的にゲノム編集できれば良いことに着目した。ファウンダー世代（F0）の生殖細胞をゲノム編集できれば、F1 世代は 100% ヘテロが得られる。当該F1 を掛け合せれば簡単にホモ（F2）が得られるので、ホモの選抜まで要する労力と時間を大幅に削減することが出来る。そこで、初期胚の初期生殖細胞に効率的にゲノム編集用ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを導入する方法を検討した。 The inventor of the present invention focused on the fact that genome editing should be performed specifically for germ cells rather than somatic cells in order to transmit traits to the next generation. If the germ cells of the founder generation (F0) can be edited, the F1 generation will be 100% heterozygous. Homozygous (F2) can be easily obtained by multiplying the F1, so that the labor and time required for the selection of homozygous can be greatly reduced. Therefore, we investigated a method for efficiently introducing a polynucleotide encoding a nuclease for genome editing into early germ cells of early embryos.
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、ゲノム編集用ヌクレアーゼのコード配列、及び該コード配列の3’側に配置されたnanos 3遺伝子3’UTRを含む、ポリヌクレオチドを用いることにより、上記課題を解決できることを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。
As a result of intensive research, the present inventors have found that the above problem can be solved by using a polynucleotide containing a coding sequence for a genome-editing nuclease and the 3'UTR of the
即ち、本発明は、下記の態様を包含する。 That is, the present invention includes the following aspects.
項１． ゲノム編集用ヌクレアーゼのコード配列、及び該コード配列の3’側に配置されたnanos 3遺伝子3’UTRを含む、ポリヌクレオチド。
項２． 前記ゲノム編集用ヌクレアーゼがCasタンパク質である、項１に記載のポリヌクレオチド。
Section 2. Item 2. The polynucleotide of
項３． 前記nanos 3遺伝子が動物由来nanos 3遺伝子である、項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
項４． 前記ゲノム編集用ヌクレアーゼが、核移行シグナルが付加されたゲノム編集用ヌクレアーゼである、項１～３のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
Section 4. Item 4. The polynucleotide according to any one of
項５． mRNAである、項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
Item 5.
項６． ベクターである、項１～４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
Item 6. Item 5. The polynucleotide according to any one of
項７． 前記ゲノム編集用ヌクレアーゼのコード配列の5’側に配置されたプロモーターを含む、項６に記載のポリヌクレオチド。 Item 7. 7. The polynucleotide of paragraph 6, comprising a promoter located 5' to the coding sequence of the genome-editing nuclease.
項８． さらに、ガイドRNA発現カセットを含む、項６又は７に記載のポリヌクレオチド。 Item 8. Item 8. The polynucleotide of Item 6 or 7, further comprising a guide RNA expression cassette.
項９． 項１～８のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。 Item 9. A cell comprising the polynucleotide of any one of Items 1-8.
項１０． 項１～８のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、ゲノム編集用組成物。
Item 10. A composition for genome editing, comprising the polynucleotide according to any one of
項１１． 項１～８のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、ゲノム編集用キット。
Item 11. A kit for genome editing, comprising the polynucleotide according to any one of
項１２． 項１～８のいずれかに記載のポリヌクレオチドを生物又は細胞に導入する工程を含む、ゲノム編集方法。
Item 12. Item 9. A genome editing method, comprising the step of introducing the polynucleotide according to any one of
項１３． 前記ポリヌクレオチドの導入対象が受精卵である、項１２に記載のゲノム編集方法。 Item 13. Item 13. The genome editing method according to Item 12, wherein the polynucleotide is introduced into a fertilized egg.
項１４． 項１～８のいずれかに記載のポリヌクレオチドを生物又は細胞に導入する工程を含む、ゲノム編集された生物又は細胞の製造方法。
Item 14. A method for producing a genome-edited organism or cell, comprising the step of introducing the polynucleotide according to any one of
項１５． 前記ポリヌクレオチドの導入対象が受精卵である、項１４に記載の製造方法。 Item 15. Item 15. The production method according to Item 14, wherein the polynucleotide is introduced into a fertilized egg.
本発明によれば、生殖細胞においてより効率的にゲノム編集することができる技術を提供することができる。これにより、例えば受精卵を対象としてゲノム編集する場合であれば、より多くの生殖細胞がゲノム編集されたファウンダー世代を作出することができ、ゲノム編集動物をより簡便且つ効率的に作出することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the technique which can edit genome more efficiently in germ cells can be provided. As a result, for example, in the case of genome editing targeting fertilized eggs, it is possible to create founder generations in which more germ cells are genome-edited, and to create genome-edited animals more easily and efficiently. can.
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。 As used herein, the expressions "contain" and "include" include the concepts "contain", "include", "consist essentially of" and "consist only of".
本明細書中において、アミノ酸配列の「同一性」とは、2以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対するアミノ酸配列の一致の程度をいう。従って、ある2つのアミノ酸配列の一致性が高いほど、それらの配列の同一性又は類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST（KarlinS，Altschul SF．“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc Natl Acad Sci USA．87:2264－2268（1990）、KarlinS，Altschul SF．“Applications and statistics for multiple high－scoring segments in molecular sequences．”Proc Natl Acad Sci USA．90:5873－7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたblastpと呼ばれるプログラムやtblastnと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information（NCBI）のウェエブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。また、塩基配列の「同一性」も上記に準じて定義される。 As used herein, the term “identity” of amino acid sequences refers to the degree of amino acid sequence matching between two or more comparable amino acid sequences. Therefore, the higher the identity or similarity between two amino acid sequences, the higher the identity or similarity between those sequences. The level of amino acid sequence identity is determined, for example, using the sequence analysis tool FASTA, using default parameters. or Algorithm BLAST by Karlin and Altschul (Karlin S, Altschul SF. "Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes" Proc Natl Acad Sci USA. 87:2264-2268 (1990) Karlin S, Altschul SF. "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences." Proc Natl Acad Sci USA. 90:5873-7 (1993)). A program called blastp and a program called tblastn based on such a BLAST algorithm have been developed. Specific methods of these analysis methods are known, and the website of the National Center of Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) can be referred to. The “identity” of base sequences is also defined according to the above.
本明細書中において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ－分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。 As used herein, "conservative substitution" means that an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain. For example, substitutions between amino acid residues having basic side chains such as lysine, arginine, and histidine correspond to conservative substitutions. In addition, amino acid residues having acidic side chains such as aspartic acid and glutamic acid; amino acid residues having uncharged polar side chains such as glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine and cysteine; alanine, valine, leucine, isoleucine, amino acid residues with nonpolar side chains such as proline, phenylalanine, methionine, tryptophan; amino acid residues with β-branched side chains, such as threonine, valine, isoleucine; and aromatic side chains, such as tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine. Substitutions between amino acid residues are also conservative substitutions.
1．ポリヌクレオチド
本発明は、その一態様において、ゲノム編集用ヌクレアーゼのコード配列、及び該コード配列の3’側に配置されたnanos 3遺伝子3’UTRを含む、ポリヌクレオチド（本明細書において、「本発明のポリヌクレオチド」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
1. In one aspect of the polynucleotide present invention, a polynucleotide (herein referred to as "the present Also referred to as "polynucleotide of the invention"). This will be explained below.
ゲノム編集用ヌクレアーゼのコード配列は、ゲノム編集用ヌクレアーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列である限り特に制限されない。 The coding sequence of the genome-editing nuclease is not particularly limited as long as it is a nucleotide sequence that encodes the amino acid sequence of the genome-editing nuclease.
ゲノム編集用ヌクレアーゼは、ゲノムDNA上の任意の箇所（意図した箇所）を切断して、切断断片を生じさせることができるヌクレアーゼである限り特に制限されない。ゲノム編集用ヌクレアーゼとしては、例えばTALEN、ZFN、Casタンパク質、などが挙げられる。 The genome-editing nuclease is not particularly limited as long as it is a nuclease capable of cleaving an arbitrary site (intended site) on genomic DNA to generate a cleaved fragment. Examples of genome-editing nucleases include TALENs, ZFNs, Cas proteins, and the like.
TALENは、DNA切断ドメイン（例えばFokIドメイン）に加えて転写活性化因子様（TAL）エフェクターのDNA結合ドメインを含む人工ヌクレアーゼである。TALENを細胞内に導入することにより、TALENがDNA結合ドメインを介して標的部位に結合し、そこでDNAを切断する。標的部位に結合するDNA結合ドメインは、公知のスキーム（例えばZhang, Feng et. al. (2011) Nature Biotechnology 29 (2)；この論文は、本明細書に参考として援用される）に従って設計することができる。 TALENs are artificial nucleases that contain transcriptional activator-like (TAL) effector DNA-binding domains in addition to DNA-cleaving domains (eg, FokI domains). By introducing TALENs into cells, TALENs bind to target sites via their DNA-binding domains and cleave DNA there. A DNA-binding domain that binds to the target site is designed according to known schemes (e.g., Zhang, Feng et. al. (2011) Nature Biotechnology 29 (2); this paper is incorporated herein by reference). can be done.
ZFNは、ジンクフィンガーアレイを含むDNA結合ドメインにコンジュゲートした核酸切断ドメインを含む人工ヌクレアーゼである。ZNFを細胞内に導入することにより、ZFNがDNA結合ドメインを介して標的部位に結合し、そこでDNAを切断する。標的部位に結合するDNA結合ドメインは、公知のスキームに従って設計することができる。 ZFNs are artificial nucleases containing a nucleic acid cleavage domain conjugated to a DNA binding domain containing a zinc finger array. By introducing the ZNF into the cell, the ZFN binds to the target site via its DNA-binding domain and cleaves the DNA there. A DNA-binding domain that binds to a target site can be designed according to known schemes.
Casタンパク質は、ガイドRNA（gRNA）と共に細胞内で協調して働くことにより、ゲノム中に切断断片を生じさせることができる。具体的には、ガイドRNAが標的部位に結合し、該都合部位に呼び込まれたCasタンパク質によってDNAを切断することができる。 Cas proteins can generate cleavage fragments in the genome by working cooperatively within the cell with guide RNAs (gRNAs). Specifically, the guide RNA binds to the target site, and the DNA can be cleaved by the Cas protein called into the convenient site.
本発明においては、好ましくはCasタンパク質が使用される。以下では、Casタンパク質について詳述する。 Cas protein is preferably used in the present invention. The Cas protein is detailed below.
Casタンパク質は、CRISPR/Casシステムにおいて用いられるものであれば特に制限されず、例えばガイドRNAと複合体を形成した状態でゲノムDNAの標的部位に結合し、該標的部位を切断できるものを各種使用することができる。Casタンパク質としては、各種生物由来のものが知られており、例えばS. pyogenes由来のCas9タンパク質（II型）、S. solfataricus由来のCas9タンパク質（I-A1型）、S. solfataricus由来のCas9タンパク質（I-A2型）、H. walsbyl由来のCas9タンパク質（I-B型）、E. coli由来のCas9タンパク質（I-E型）、E. coli由来のCas9タンパク質（I-F型）、P. aeruginosa由来のCas9タンパク質（I-F型）、S. Thermophilus由来のCas9タンパク質（II-A型）、S. agalactiae由来のCas9タンパク質（II-A型）、S. aureus由来のCas9タンパク質、N. meningitidis由来のCas9タンパク質、T. denticola由来のCas9タンパク質、F. novicida由来のCpf1タンパク質（V型）等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはCas9タンパク質が挙げられ、より好ましくはストレプトコッカス属に属する細菌が内在的に有するCas9タンパク質が挙げられる。各種Casタンパク質のアミノ酸配列、及びそのコード配列の情報は、NCBI等の各種データベース上で容易に得ることができる。 The Cas protein is not particularly limited as long as it is used in the CRISPR/Cas system. For example, various Cas proteins that can bind to a target site of genomic DNA in a complex with a guide RNA and cleave the target site can be used. can do. Cas proteins derived from various organisms are known, for example, S. pyogenes-derived Cas9 protein (II type), S. solfataricus-derived Cas9 protein (I-A1 type), S. solfataricus-derived Cas9 protein. (I-A2 type), Cas9 protein from H. walsbyl (type I-B), Cas9 protein from E. coli (type I-E), Cas9 protein from E. coli (type I-F), Cas9 protein from P. aeruginosa (type I-F), Cas9 protein from S. Thermophilus (type II-A), Cas9 protein from S. agalactiae (type II-A), Cas9 protein from S. aureus, Cas9 protein from N. meningitidis, T denticola-derived Cas9 protein, F. novicida-derived Cpf1 protein (type V), and the like. Among these, Cas9 protein is preferred, and Cas9 protein endogenously possessed by bacteria belonging to the genus Streptococcus is more preferred. Amino acid sequences of various Cas proteins and information on their coding sequences can be easily obtained on various databases such as NCBI.
Casタンパク質は、野生型の2本鎖切断型Casタンパク質であってもよいし、ニッカーゼ型Casタンパク質であってもよい。2本鎖切断型Casタンパク質は、通常、標的鎖の切断に関与するドメイン（RuvCドメイン）及び非標的鎖の切断に関与するドメイン（HNHドメイン）を含む。ニッカーゼ型Casタンパク質としては、例えば2本鎖切断型Casタンパク質のこれら2つのドメインの内のいずれかのドメインにおいて、その切断活性を損なわせる（例えば、その切断活性を1/2、1/5、1/10、1/100、1/1000以下にする）変異を有するタンパク質が挙げられる。 The Cas protein may be a wild-type double-strand truncated Cas protein or a nickase-type Cas protein. Double-strand truncated Cas proteins usually contain a domain involved in target strand cleavage (RuvC domain) and a domain involved in non-target strand cleavage (HNH domain). As a nickase-type Cas protein, for example, in one of these two domains of the double-strand truncated Cas protein, the cleavage activity is impaired (for example, the cleavage activity is reduced to 1/2, 1/5, 1/10, 1/100, 1/1000 or less) mutations.
Casタンパク質は、その活性を損なわない限りにおいて、アミノ酸配列の変異（例えば、置換、欠失、挿入、付加等）を有していてもよい。この観点から、Casタンパク質は、野生型Casタンパク質のアミノ酸配列と、例えば85％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つその活性（ガイドRNAと複合体を形成した状態でゲノムDNAの標的部位に結合し、該標的部位を切断する活性）を有するタンパク質であってもよい。或いは、同様の観点から、Casタンパク質は、野生型Casタンパク質のアミノ酸配列に対して1若しくは複数個（例えば2～100個、好ましくは2～50個、より好ましくは2～20個、さらに好ましくは2～10個、よりさらに好ましくは2～5個、特に好ましくは2個）のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入（好ましくは保存的置換）されたアミノ酸配列からなり、且つその活性（ガイドRNAと複合体を形成した状態でゲノムDNAの標的部位に結合し、該標的部位を切断する活性）を有するタンパク質であってもよい。なお、上記「活性」は、in vitro又はin vivoにおいて、公知の方法に従って又は準じて評価することができる。 Cas proteins may have amino acid sequence mutations (eg, substitutions, deletions, insertions, additions, etc.) as long as they do not impair their activity. From this point of view, the Cas protein consists of an amino acid sequence having, for example, 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 98% or more identity with the amino acid sequence of the wild-type Cas protein. and the activity (the activity of binding to a target site of genomic DNA in a complex with a guide RNA and cleaving the target site). Alternatively, from a similar point of view, one or more Cas proteins (eg, 2 to 100, preferably 2 to 50, more preferably 2 to 20, more preferably 2 to 10, more preferably 2 to 5, particularly preferably 2) amino acids are substituted, deleted, added, or inserted (preferably conservative substitution) consisting of an amino acid sequence, and its activity ( It may be a protein having an activity of binding to a target site of genomic DNA in a complex with a guide RNA and cleaving the target site. The above "activity" can be evaluated in vitro or in vivo according to or according to known methods.
Casタンパク質は、上記「活性」を有する限りにおいて、公知のタンパク質タグ、シグナル配列、酵素タンパク質等のタンパク質が付加されたものであってもよい。タンパク質タグとしては、例えばビオチン、Hisタグ、FLAGタグ、Haloタグ、MBPタグ、HAタグ、Mycタグ、V5タグ、PAタグ等が挙げられる。シグナル配列としては、例えば核移行シグナル等が挙げられる。酵素タンパク質としては、例えば、各種ヒストン修飾酵素、脱アミノ酵素等が挙げられる。 As long as the Cas protein has the above-mentioned "activity", it may be one to which a protein such as a known protein tag, signal sequence, or enzyme protein has been added. Examples of protein tags include biotin, His tag, FLAG tag, Halo tag, MBP tag, HA tag, Myc tag, V5 tag, PA tag and the like. Signal sequences include, for example, nuclear localization signals. Enzyme proteins include, for example, various histone modifying enzymes, deaminase and the like.
nanos 3遺伝子3’UTRは、nanos 3遺伝子の3’UTRである限り、特に制限されない。nanos 3遺伝子は初期生殖細胞の形成に関わっている遺伝子である。本発明では、初期生殖細胞の形成に関わっている遺伝子の中でもnanos 3遺伝子の3’UTRを採用することにより、生殖細胞においてより効率的に、且つ生殖細胞においてより特異的に、ゲノム編集することができる。
The
nanos 3遺伝子は、本発明のゲノム編集技術の対象生物由来のnanos 3遺伝子であってもよいし、異なる生物由来のnanos 3遺伝子であってもよい。nanos 3遺伝子の由来生物としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等の哺乳類動物； アフリカツメガエル等の両生類動物； ゼブラフィッシュ、メダカ、トラフグ等の魚類動物； ホヤ等の脊索動物； ショウジョウバエ、カイコ等の節足動物；等の動物： シロイヌナズナ、イネ、コムギ、タバコ等の植物：等が挙げられる。各種生物由来のnanos 3遺伝子は、（例えばNCBIデータベース上で、又は既報（例えば、ZOOLOGICAL SCIENCE 26: 112-118 (2009)）で）公知であるか、又は公知のnanos 3遺伝子との相同性検索及び／又はシンテニー解析によって容易に決定できる。
The
nanos 3遺伝子の3’UTRは、nanos 3遺伝子の既知のmRNA配列又は推定されるmRNA配列に基づいて、容易に決定することができる。典型的には、3’UTRは、nanos 3遺伝子コード配列のストップコドン直後から、ポリAテールまで、より具体的には、mRNA上、nanos 3遺伝子コード配列3’末端の3’側隣接塩基から、ポリAテール5’末端の5’側隣接塩基までである。
The 3'UTR of the nanos3 gene can be readily determined based on the known or deduced mRNA sequence of the nanos3 gene. Typically, the 3'UTR is from immediately after the stop codon of the
nanos 3遺伝子の3’UTRの塩基配列の具体例としては、メダカであれば例えば配列番号2で示される塩基配列が挙げられ、マウスであれば例えば配列番号5で示される塩基配列が挙げられ、ラットであれば例えば配列番号6で示される塩基配列が挙げられ、ヒトであれば例えば配列番号7で示される塩基配列が挙げられ、Xenopus tropicalisであれば例えば配列番号8で示される塩基配列が挙げられ、
nanos 3遺伝子3’UTRは、その活性を損なわない限りにおいて、塩基配列の変異（例えば、置換、欠失、挿入、付加等）を有していてもよい。この観点から、nanos 3遺伝子3’UTRは、野生型nanos 3遺伝子3’UTRの塩基配列と、例えば85％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上の同一性を有する塩基配列であってもよい。或いは、同様の観点から、nanos 3遺伝子3’UTRは、野生型nanos 3遺伝子3’UTRの塩基配列に対して1若しくは複数個（例えば2～8個、好ましくは2～5個、より好ましくは2～3個、さらに好ましくは2個）の塩基が置換、欠失、付加、又は挿入された塩基配列であってもよい。
Specific examples of the 3'UTR nucleotide sequence of the
The
本発明のポリヌクレオチドにおいて、nanos 3遺伝子3’UTRは、ゲノム編集用ヌクレアーゼコード配列の3’側に配置されている。具体的な配置の態様としては、例えばゲノム編集用ヌクレアーゼコード配列の3’側直下にnanos 3遺伝子3’UTRが配置されている態様（例えば、ゲノム編集用ヌクレアーゼコード配列3’末端の塩基とnanos 3遺伝子3’UTRの5´末端の塩基との間の塩基長が、例えば100塩基長以下、好ましくは50塩基長以下、より好ましくは20塩基長以下、さらに好ましくは10塩基長以下である態様）が挙げられる。
In the polynucleotides of the invention, the
本発明のポリヌクレオチドは、nanos 3遺伝子3’UTRの3’側に、ポリA付加シグナル配列、又はポリAテールを含むことが好ましい。具体的な配置の態様としては、例えばnanos 3遺伝子3’UTRの3’側直下にポリA付加シグナル配列又はポリAテールが配置されている態様（例えば、nanos 3遺伝子3’UTRの3’末端の塩基とポリA付加シグナル配列又はポリAテールの5´末端の塩基との間の塩基長が、例えば100塩基長以下、好ましくは50塩基長以下、より好ましくは20塩基長以下、さらに好ましくは10塩基長以下である態様）が挙げられる。
The polynucleotide of the present invention preferably contains a poly-A addition signal sequence or poly-A tail on the 3' side of the
本発明のポリヌクレオチドは、1本鎖であってもよいし、2本鎖であってもよい。また、本発明のポリヌクレオチドは、DNA、RNAのみならず、これらに、次に例示するように、公知の化学修飾が施されたものも包含する。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各リボヌクレオチドの糖（リボース）の2位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2´-O-Me）、CH2CH2OCH3（2´-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。さらには、リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えば、ビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されたものなどを挙げることができるが、これに限定されない。また、「ポリヌクレオチド」の語は、天然の核酸だけでなく、BNA（Bridged Nucleic Acid）、LNA（Locked Nucleic Acid）、PNA（Peptide Nucleic Acid）等の何れも包含する。 A polynucleotide of the present invention may be single-stranded or double-stranded. Moreover, the polynucleotides of the present invention include not only DNA and RNA, but also those subjected to known chemical modifications, as exemplified below. Substitution of the phosphate residue of each nucleotide with a chemically modified phosphate residue such as phosphorothioate (PS), methylphosphonate, phosphorodithionate, etc. to prevent degradation by hydrolases such as nucleases can be done. In addition, the hydroxyl group at the 2-position of the sugar (ribose) of each ribonucleotide is -OR (R is, for example, CH3 (2'-O-Me), CH2CH2OCH3 ( 2' -O-MOE) , CH 2CH2NHC (NH) NH2 , CH2CONHCH3 , CH2CH2CN, etc. ) . Furthermore, the base moiety (pyrimidine, purine) may be chemically modified, for example, introduction of a methyl group or cationic functional group to the 5-position of the pyrimidine base, or substitution of the carbonyl group at the 2-position with thiocarbonyl. is mentioned. Further examples include, but are not limited to, those in which the phosphate moiety or hydroxyl moiety has been modified with biotin, an amino group, a lower alkylamine group, an acetyl group, or the like. The term "polynucleotide" includes not only natural nucleic acids but also BNA (Bridged Nucleic Acid), LNA (Locked Nucleic Acid), PNA (Peptide Nucleic Acid) and the like.
本発明のポリヌクレオチドは、その一態様においては、1本鎖ポリヌクレオチド（例えばmRNA）である。この態様であれば、ゲノム編集対象に導入後、mRNAの転写工程を経ずに、ゲノム編集用ヌクレアーゼを対象細胞内で産生させることができる。 A polynucleotide of the present invention, in one aspect thereof, is a single-stranded polynucleotide (eg, mRNA). In this embodiment, the genome-editing nuclease can be produced in the target cell after introduction into the genome-editing target without going through the mRNA transcription step.
本発明のポリヌクレオチドは、別の一態様においては、2本鎖ポリヌクレオチド（例えばベクター）である。この態様においては、ゲノム編集対象に導入後、mRNAを産生し、それに基づいてゲノム編集用ヌクレアーゼを対象細胞内で産生させることができる。 The polynucleotide of the present invention, in another aspect, is a double-stranded polynucleotide (eg, vector). In this embodiment, after introduction into a genome-editing subject, mRNA can be produced, and based on this, a genome-editing nuclease can be produced in the subject's cells.
ベクターの種類は、特に制限されず、例えば動物細胞発現プラスミド等のプラスミドベクター； レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクター；等が挙げられる。 The type of vector is not particularly limited, and includes, for example, plasmid vectors such as animal cell expression plasmids; viral vectors such as retroviruses, lentiviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes viruses and Sendai viruses;
本発明のポリヌクレオチドが2本鎖ポリヌクレオチドである場合、本発明のポリヌクレオチドは、さらにゲノム編集用ヌクレアーゼのコード配列の5’側に配置されたプロモーターを含むことが好ましい。プロモーターとしては、特に制限されず、例えばpol II系プロモーターを各種使用することができる、pol II系プロモーターとしては、特に制限されないが、例えば例えばCMVプロモーター、EF1プロモーター、SV40プロモーター、MSCVプロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター、CAGプロモーター等が挙げられる。具体的な配置の態様としては、例えばプロモーターの3’側直下にゲノム編集用ヌクレアーゼのコード配列が配置されている態様（例えば、プロモーター3’末端の塩基からゲノム編集用ヌクレアーゼのコード配列の5´末端の塩基までの間の塩基対数（bp）が、例えば100 bp以下、好ましくは50 bp以下である態様）が挙げられる。 When the polynucleotide of the present invention is a double-stranded polynucleotide, the polynucleotide of the present invention preferably further comprises a promoter located 5' to the coding sequence of the genome-editing nuclease. The promoter is not particularly limited, and various types of pol II promoters can be used. Examples of pol II promoters include, but are not limited to, CMV promoter, EF1 promoter, SV40 promoter, MSCV promoter, and hTERT promoter. , β-actin promoter, CAG promoter and the like. As a specific arrangement embodiment, for example, the coding sequence of the genome-editing nuclease is arranged immediately below the 3' side of the promoter (e.g., 5' of the coding sequence of the genome-editing nuclease from the 3' end of the promoter The number of base pairs (bp) between the terminal bases is, for example, 100 bp or less, preferably 50 bp or less).
本発明のポリヌクレオチドが2本鎖ポリヌクレオチドであり、且つゲノム編集用ヌクレアーゼがCasタンパク質である場合、本発明のポリヌクレオチドは、さらにガイドRNA発現カセットを含むことが好ましい。Casタンパク質発現カセットとガイドRNA発現カセットが同一分子（ポリヌクレオチド）内に存在していることによって、Casタンパク質とガイドRNAとを効率的に細胞内で発現させることができ、ひいてはゲノム編集効率をより高めることが可能である。 When the polynucleotide of the present invention is a double-stranded polynucleotide and the genome-editing nuclease is a Cas protein, the polynucleotide of the present invention preferably further comprises a guide RNA expression cassette. Since the Cas protein expression cassette and the guide RNA expression cassette are present in the same molecule (polynucleotide), the Cas protein and the guide RNA can be efficiently expressed in cells, which in turn improves the genome editing efficiency. It is possible to increase
ガイドRNA発現カセットの典型例としては、プロモーター、及び該プロモーターの制御下に配置されたガイドRNA全体又は一部のコード配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。 A typical example of a guide RNA expression cassette includes a promoter and a polynucleotide comprising a coding sequence for all or part of the guide RNA placed under the control of the promoter.
ガイドRNA発現カセットのプロモーターとしては、特に制限されず、pol II系プロモーターを使用することもできるが、比較的短いRNAの転写をより正確に行わせるという観点から、pol III系プロモーターが好ましい。pol II系プロモーターとしては、例えばCMVプロモーター、EF1プロモーター、SV40プロモーター、MSCVプロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター、CAGプロモーター等が挙げられる。pol III系プロモーターとしては、例えばU6-snRNA（例えばU6.1-snRNA、U6.26-snRNA等）プロモーター、U3-snRNAプロモーター等が挙げられる。 The promoter for the guide RNA expression cassette is not particularly limited, and pol II promoters can be used, but pol III promoters are preferred from the viewpoint of more accurate transcription of relatively short RNAs. Pol II promoters include, for example, CMV promoter, EF1 promoter, SV40 promoter, MSCV promoter, hTERT promoter, β actin promoter, CAG promoter and the like. Examples of pol III promoters include U6-snRNA (eg, U6.1-snRNA, U6.26-snRNA, etc.) promoters, U3-snRNA promoters, and the like.
ガイドRNAコード配列は、ガイドRNAをコードする塩基配列である限り特に制限されない。 The guide RNA coding sequence is not particularly limited as long as it is a base sequence that codes for the guide RNA.
ガイドRNAは、CRISPR/Casシステムにおいて用いられるものであれば特に制限されず、例えばゲノムDNAの標的部位に結合し、且つCasタンパク質と結合することにより、Casタンパク質をゲノムDNAの標的部位に誘導可能なものを各種使用することができる。 The guide RNA is not particularly limited as long as it is used in the CRISPR/Cas system. For example, the guide RNA can guide the Cas protein to the target site of the genomic DNA by binding to the target site of the genomic DNA and binding to the Cas protein. Various things can be used.
本明細書において、標的部位とは、PAM（Proto-spacer Adjacent Motif）配列及びその5´側に隣接する17～30塩基長（好ましくは18～25塩基長、より好ましくは19～22塩基長、特に好ましくは20塩基長）程度の配列からなるDNA鎖（標的鎖）とその相補DNA鎖（非標的鎖）からなる、ゲノムDNA上の部位である。 As used herein, the target site refers to a PAM (Proto-spacer Adjacent Motif) sequence and its 5′-adjacent 17 to 30 base length (preferably 18 to 25 base length, more preferably 19 to 22 base length, Particularly preferably, it is a site on genomic DNA consisting of a DNA strand (target strand) having a sequence of about 20 nucleotides (base length) and its complementary DNA strand (non-target strand).
PAM配列は、利用するCasタンパク質の種類によって異なる。例えば、S. pyogenes由来のCas9タンパク質（II型）に対応するPAM配列は5´-NGGであり、S. solfataricus由来のCas9タンパク質（I-A1型）に対応するPAM配列は5´-CCNであり、S. solfataricus由来のCas9タンパク質（I-A2型）に対応するPAM配列は5´-TCNであり、H. walsbyl由来のCas9タンパク質（I-B型）に対応するPAM配列は5´-TTCであり、E. coli由来のCas9タンパク質（I-E型）に対応するPAM配列は5´-AWGであり、E. coli由来のCas9タンパク質（I-F型）に対応するPAM配列は5´-CCであり、P. aeruginosa由来のCas9タンパク質（I-F型）に対応するPAM配列は5´-CCであり、S. Thermophilus由来のCas9タンパク質（II-A型）に対応するPAM配列は5´-NNAGAAであり、S. agalactiae由来のCas9タンパク質（II-A型）に対応するPAM配列は5´-NGGであり、S. aureus由来のCas9タンパク質に対応するPAM配列は、5´-NGRRT又は5´-NGRRNであり、N. meningitidis由来のCas9タンパク質に対応するPAM配列は、5´-NNNNGATTであり、T. denticola由来のCas9タンパク質に対応するPAM配列は、5´-NAAAACである。 PAM sequences differ depending on the type of Cas protein used. For example, the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein (type II) from S. pyogenes is 5′-NGG, and the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein (type I-A1) from S. solfataricus is 5′-CCN. The PAM sequence corresponding to the Cas9 protein (I-A2 type) from S. solfataricus is 5'-TCN, and the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein (I-B type) from H. walsbyl is 5'-TTC. , the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein from E. coli (I-E type) is 5'-AWG, the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein from E. coli (I-F type) is 5'-CC, The PAM sequence corresponding to the Cas9 protein (I-F type) from P. aeruginosa is 5'-CC, and the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein (II-A type) from S. Thermophilus is 5'-NNAGAA, The PAM sequence corresponding to the Cas9 protein (II-A type) from S. agalactiae is 5'-NGG, and the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein from S. aureus is 5'-NGRRT or 5'-NGRRN. Yes, the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein from N. meningitidis is 5'-NNNNGATT, and the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein from T. denticola is 5'-NAAAC.
ガイドRNAはゲノムDNAの標的部位への結合に関与する配列（crRNA（CRISPR RNA）配列といわれることもある）を有しており、このcrRNA配列が、非標的鎖のPAM配列相補配列を除いてなる配列に相補的（好ましくは、相補的且つ特異的）に結合することにより、ガイドRNAはゲノムDNAの標的部位に結合することができる。 The guide RNA has a sequence (sometimes referred to as a crRNA (CRISPR RNA) sequence) that participates in the binding of the genomic DNA to the target site, and this crRNA sequence is the PAM sequence complementary sequence of the non-target strand. By binding complementary (preferably complementary and specific) to the sequence, the guide RNA can bind to the target site of the genomic DNA.
なお、「相補的」に結合とは、完全な相補関係（AとT、及びGとC）に基づいて結合する場合のみならず、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係に基づいて結合する場合も包含される。ストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「1×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。かかる条件で洗浄してもハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。 "Complementary" binding means not only binding based on complete complementary relationships (A and T, and G and C), but also complementary relationships that allow hybridization under stringent conditions. The case of combining based on is also included. Stringent conditions are the melting temperature of the nucleic acid binding complex or probe, as taught by Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego Calif.). (Tm) can be determined. For example, the conditions for washing after hybridization are usually about "1×SSC, 0.1% SDS, 37° C.". It is preferable that the hybridized state is maintained even after washing under such conditions. Although it is not particularly limited, a more stringent hybridization condition is about "0.5 x SSC, 0.1% SDS, 42°C", and an even more stringent hybridization condition is about "0.1 x SSC, 0.1% SDS, 65°C" for washing. can be done.
具体的には、crRNA配列の内、標的配列に結合する配列は、標的鎖と例えば90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上、特に好ましくは100％の同一性を有する。 Specifically, among the crRNA sequences, the sequence that binds to the target sequence is, for example, 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more, particularly preferably 100% or more of the target strand. % identity.
ガイドRNAは、Casタンパク質との結合に関与する配列（tracrRNA（trans-activating crRNA）配列といわれることもある）を有しており、このtracrRNA配列が、Casタンパク質に結合することにより、Casタンパク質をゲノムDNAの標的部位に誘導することができる。 The guide RNA has a sequence (sometimes referred to as a tracrRNA (trans-activating crRNA) sequence) involved in binding to the Cas protein, and the tracrRNA sequence binds to the Cas protein to activate the Cas protein. It can be directed to a target site in genomic DNA.
tracrRNA配列は、特に制限されない。tracrRNA配列は、典型的には、複数（通常、3つ）のステムループを形成可能な50～100塩基長程度の配列からなるRNAであり、利用するCasタンパク質の種類に応じてその配列は異なる。tracrRNA配列としては、利用するCasタンパク質の種類に応じて、公知の配列を各種採用することができる。 The tracrRNA sequence is not particularly limited. The tracrRNA sequence is typically an RNA consisting of a sequence of about 50-100 nucleotides in length that can form multiple (usually three) stem-loops, and the sequence differs depending on the type of Cas protein used. . As the tracrRNA sequence, various known sequences can be employed depending on the type of Cas protein to be used.
ガイドRNAは、通常、上記したcrRNA配列とtracr RNA配列を含む。ガイドRNAの態様は、crRNA配列とtracr RNA配列を含む一本鎖RNA（sgRNA）であってもよいし、crRNA配列を含むRNAとtracrRNA配列を含むRNAとが相補的に結合してなるRNA複合体であってもよい。 The guide RNA usually contains the crRNA and tracr RNA sequences described above. The guide RNA may be a single-stranded RNA (sgRNA) containing a crRNA sequence and a tracr RNA sequence, or an RNA complex formed by complementary binding of an RNA containing a crRNA sequence and an RNA containing a tracrRNA sequence. It can be a body.
本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法に従って容易に作製することができる。例えば、PCR、制限酵素切断、DNA連結技術、in vitro転写技術等を利用して作製することができる。 The polynucleotide of the present invention can be easily produced according to known genetic engineering techniques. For example, it can be produced using PCR, restriction enzyme cleavage, DNA ligation technology, in vitro transcription technology, and the like.
2．ゲノム編集用組成物、ゲノム編集用キット
本発明のポリヌクレオチドは、ゲノム編集用組成物として利用することもできるし、或いはゲノム編集用キットとして利用することもできる。
2. Genome-editing composition, genome-editing kit The polynucleotide of the present invention can be used as a genome-editing composition or as a genome-editing kit.
ゲノム編集用組成物は、本発明のポリヌクレオチドを含有する限りにおいて特に制限されず、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。本発明のポリヌクレオチドが1本鎖ポリヌクレオチドである場合であれば、ゲノム編集用組成物は、必要に応じて、ガイドRNA発現カセットを含むポリヌクレオチドを含んでいてもよい。また、必要に応じて、ドナーポリヌクレオチドを含んでいてもよい。 The composition for genome editing is not particularly limited as long as it contains the polynucleotide of the present invention, and may further contain other components as necessary. Examples of other components include, but are not limited to, bases, carriers, solvents, dispersants, emulsifiers, buffers, stabilizers, excipients, binders, disintegrants, lubricants, and thickeners. agents, moisturizing agents, coloring agents, fragrances, chelating agents, and the like. If the polynucleotide of the present invention is a single-stranded polynucleotide, the composition for genome editing may contain a polynucleotide containing a guide RNA expression cassette, if necessary. It may also contain a donor polynucleotide, if desired.
ゲノム編集用キットは、本発明のポリヌクレオチドが含まれている限りにおいて特に制限されず、必要に応じて核酸導入試薬、緩衝液等、本発明のゲノム編集方法の実施に必要な他の材料、試薬、器具等を適宜含んでいてもよい。本発明のゲノム編集方法の実施に必要な他の材料としては、本発明のポリヌクレオチドが1本鎖ポリヌクレオチドである場合であれば、ガイドRNA発現カセットを含むポリヌクレオチドが挙げられ、また必要に応じてドナーポリヌクレオチドが挙げられる。 The genome editing kit is not particularly limited as long as it contains the polynucleotide of the present invention, and if necessary other materials necessary for carrying out the genome editing method of the present invention, such as nucleic acid introduction reagents and buffers, Reagents, instruments, etc. may be included as appropriate. Other materials necessary for carrying out the genome editing method of the present invention include, if the polynucleotide of the present invention is a single-stranded polynucleotide, a polynucleotide containing a guide RNA expression cassette. Donor polynucleotides are included accordingly.
3．ゲノム編集方法、ゲノム編集された生物又は細胞の製造方法
本発明のポリヌクレオチドを生物又は細胞に導入する工程を含む方法により、これらの生物又は細胞のゲノムを編集することができる。
3. Genome Editing Methods, Methods for Producing Genome-Edited Organisms or Cells Genomes of these organisms or cells can be edited by a method comprising the step of introducing the polynucleotide of the present invention into an organism or cell.
導入対象である生物としては、特に制限されないが、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等の哺乳類動物； アフリカツメガエル等の両生類動物； ゼブラフィッシュ、メダカ、トラフグ等の魚類動物； ホヤ等の脊索動物； ショウジョウバエ、カイコ等の節足動物；等の動物： シロイヌナズナ、イネ、コムギ、タバコ等の植物：等が挙げられる。 The organism to be introduced is not particularly limited, but for example, mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, and rabbits; amphibians such as Xenopus; fish animals such as zebrafish, killifish, tiger puffer, etc. chordates such as sea squirts; arthropods such as fruit flies and silkworms; animals such as: plants such as Arabidopsis thaliana, rice, wheat and tobacco;
導入対象である細胞としては、特に制限されないが、各種組織由来又は各種性質の細胞、例えば血液細胞、造血幹細胞・前駆細胞、配偶子（精子、卵子）、受精卵、線維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、ケラチン生成細胞、筋細胞、表皮細胞、内分泌細胞、ES細胞、iPS細胞、組織幹細胞、がん細胞等が挙げられる。 Cells to be introduced are not particularly limited, but cells derived from various tissues or having various properties, such as blood cells, hematopoietic stem cells/progenitor cells, gametes (sperm, ovum), fertilized eggs, fibroblasts, epithelial cells, Vascular endothelial cells, nerve cells, hepatocytes, keratinocytes, muscle cells, epidermal cells, endocrine cells, ES cells, iPS cells, tissue stem cells, cancer cells and the like.
導入対象として、受精卵（例えば、受精直後の卵、前核期胚、初期胚、胚盤胞など）を使用することにより、生殖細胞においてより効率的にゲノム編集することができる。 By using fertilized eggs (for example, eggs immediately after fertilization, pronuclear stage embryos, early embryos, blastocysts, etc.) as introduction targets, genome editing can be performed more efficiently in germ cells.
導入方法は、特に制限されず、対象細胞又は生物の種類、本発明のポリヌクレオチドの種類に応じて、適宜選択することができる。導入方法としては、例えばマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、DEAE-デキストラン処理、リポフェクション、ナノ粒子媒介性トランスフェクション、ウイルス媒介性核酸送達等が挙げられる。 The introduction method is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the type of target cell or organism and the type of the polynucleotide of the present invention. Methods of introduction include, for example, microinjection, electroporation, DEAE-dextran treatment, lipofection, nanoparticle-mediated transfection, virus-mediated nucleic acid delivery, and the like.
導入により、本発明のポリヌクレオチドを含む、細胞又は生物が得られる。導入してから一定時間経過後に、対象細生物又は対象細胞内でゲノム編集が起こるので、この細胞又は生物を回収することにより、ゲノム編集された生物又は細胞を得ることができる。また、ファウンダー世代を作出後、該世代同士を掛け合わせることにより、全細胞がゲノム編集された生物又は細胞集団を得ることができる。 The introduction results in a cell or organism containing the polynucleotide of the invention. After a certain period of time has passed since the introduction, genome editing occurs in the target microorganism or target cell, and by collecting this cell or organism, a genome-edited organism or cell can be obtained. Moreover, after creating the founder generation, by crossing the generations, an organism or cell population in which all cells are genome-edited can be obtained.
本発明によれば、生殖細胞においてより効率的にゲノム編集することができる。さらには、体細胞におけるゲノム編集を低減しつつも、生殖細胞特異的により効率的にゲノム編集することも可能である。 According to the present invention, genome editing can be performed more efficiently in germ cells. Furthermore, while reducing genome editing in somatic cells, it is also possible to perform genome editing more efficiently specific to germ cells.
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。なお、本実施例及び図面においては、nanos 3を「nos3」と表記することもある。
EXAMPLES The present invention will be described in detail below based on examples, but the present invention is not limited by these examples. Note that
実施例1．メダカ由来nanos 3遺伝子3’UTRを含むCas9 mRNAの調製
まず、nanos 3遺伝子3’UTRを含むCas9 mRNAの発現ベクター（pCS2+hSpCas9-nos3 3’UTR (Cas9-nos3UTR)）を調製した。該ベクターの調製方法の概略を図１に示す。図１中に示される塩基配列の内、「Cas9-nos3UTR」の塩基配列は配列番号1に示し、「nos3UTR」の塩基配列は配列番号2に示す。nanos3 cDNAを鋳型として、5’側にXbaI認識配列が付加されたプライマーセット（nos3-F-XbaI：配列番号3と、nos3-R-XbaI：配列番号4とのセット）を用いてPCRを行い、nanos 3遺伝子3’UTRを含むDNA断片を得た。得られたDNA断片をXbaIで消化し、pCS2+hSpCas9 (addgene #51815)のXbaIサイトへ挿入して、pCS2+hSpCas9-nos3 3’UTR (Cas9-nos3UTR)を得た。
Example 1. Preparation of Cas9
続いて、作製したベクターをNotI制限酵素処理により線状化した後に、mMESSAGE mMACHINE（登録商標） SP6 Transcription Kit (Invitrogen, AM1340)を用いて、3’側にnanos 3遺伝子3’UTRが配置されたCas9 mRNA（Cas9-nos3 3’UTR mRNA）を合成した。
Subsequently, after linearizing the prepared vector by NotI restriction enzyme treatment, the
一方で、nanos 3遺伝子3’UTRを含まないCas9 mRNAの発現ベクター（pCS2+hSpCas9）から、同様にしてmRNA（Cas9 mRNA）を合成した。
On the other hand, mRNA (Cas9 mRNA) was similarly synthesized from a Cas9 mRNA expression vector (pCS2+hSpCas9) that does not contain the
実施例2．ゲノム編集試験
＜実施例2-1．卵細胞へのベクターの注入、及び生育＞
ゲノム編集対象として、生殖細胞をEGFPで可視化できるolvas-EGFPと軟骨細胞及び生殖腺体細胞をDsRedで可視化できるsox9b-DsRedの二重トランスジェニックメダカ（PNAS, vol.98, No.5, 2544-2549, 2001.）の受精卵を用いた。Cas9-nos3 3’UTR mRNA又はCas9 mRNA（濃度50ng/μl-100ng/μl ）と、EGFP及びDsRed遺伝子をターゲットとするgRNA（濃度10ng/μl-50ng/μl）とを、ガラスキャピラリー（Warner Instruments, G100F-4）に充填し、マイクロインジェクター FemtoJet (eppendorf)を用いて、メダカ受精卵の1細胞期に注入した。注入後、得られた受精卵を発生させ、受精後7日のメダカ胚を得た。
Example 2. Genome editing test <Example 2-1. Vector injection into egg cells and growth>
Genome-edited double transgenic medaka of olvas-EGFP, which can visualize germ cells with EGFP, and sox9b-DsRed, which can visualize chondrocytes and gonadal somatic cells with DsRed (PNAS, vol.98, No.5, 2544-2549 , 2001.) were used. Cas9-nos3 3'UTR mRNA or Cas9 mRNA (concentration 50 ng/μl-100 ng/μl) and gRNAs targeting EGFP and DsRed genes (concentration 10 ng/μl-50 ng/μl) were collected in glass capillaries (Warner Instruments, G100F-4) and injected into medaka fertilized eggs at the one-cell stage using a microinjector FemtoJet (eppendorf). After injection, the resulting fertilized eggs were allowed to develop to obtain medaka embryos 7 days after fertilization.
＜実施例2-2．卵細胞の観察＞
実施例蛍光実体顕微鏡SZX12（オリンパス）を用いて、メダカ胚のEGFP及びDsRedの蛍光を観察し、顕微鏡用カメラDP74(オリンパス)で撮影した。
<Example 2-2. Observation of egg cells>
EXAMPLE Fluorescence of EGFP and DsRed in medaka embryos was observed using a fluorescence stereomicroscope SZX12 (Olympus) and photographed with a microscope camera DP74 (Olympus).
＜実施例2-3．結果＞
観察像の例を図２に示す。生殖細胞が1つでも残って光っているメダカ胚をEGFR(+)と判定し、生殖細胞が全く光っていないメダカ胚、すなわちすべての生殖細胞のEGFP 遺伝子が破壊されているメダカ胚をEGFR(-)と判定した。
<Example 2-3. Results>
An example of an observed image is shown in FIG. Medaka embryos in which even one germ cell remains and glows are judged to be EGFR(+). -).
判定結果を図３に示す。Cas9-nos3 3’UTR mRNAを導入した場合は生殖細胞がまったく見えなくなった割合が50％以上増加していた。またこのグラフには表れていないが、例え生殖細胞が見えていたとしても（EGFP+と判断されても）その数は大幅に減っていた。以上より、nanos 3遺伝子3’UTRがCasコード配列の3’側に配置されたCas mRNAを用いることにより、効率的に生殖細胞内でゲノム編集が起こることが分かった。
The determination result is shown in FIG. When Cas9-nos3 3'UTR mRNA was introduced, the rate of germ cell blindness was increased by more than 50%. Also, although not shown in this graph, even if germ cells were visible (even if they were judged to be EGFP+), their number was greatly reduced. From the above, we found that genome editing occurs efficiently in germ cells by using Cas mRNA in which the 3'UTR of the
また、試験に用いたメダカでは、DsRedで一部の体細胞が可視化されている。上記試験では、DsRedを標的とするgRNAも導入したが、DsRed由来の蛍光は消失していなかった。このことから、nanos 3遺伝子3’UTRがCasコード配列の3’側に配置されたCas mRNAを用いることにより、生殖細胞内特異的にゲノム編集が起こることが示唆された。
In the medaka fish used in the test, some somatic cells were visualized with DsRed. In the above test, gRNA targeting DsRed was also introduced, but DsRed-derived fluorescence did not disappear. This suggests that the use of Cas mRNA in which the 3'UTR of the
Claims (7)
ゲノム編集用ヌクレアーゼのコード配列、及び該コード配列の3’側に配置されたnanos 3遺伝子3’UTRを含む、mRNAを含有し、且つ
前記mRNAの受精卵への導入に用いるための、
ゲノム編集用組成物。 A composition for genome editing,
An mRNA comprising a genome-editing nuclease coding sequence and a nanos 3 gene 3'UTR located on the 3' side of the coding sequence, and
For use in introducing the mRNA into a fertilized egg,
A composition for genome editing .
ゲノム編集用ヌクレアーゼのコード配列、及び該コード配列の3’側に配置されたnanos 3遺伝子3’UTRを含む、mRNAを含有し、且つ
前記mRNAの受精卵への導入に用いるための、
ゲノム編集用キット。 A genome editing kit,
containing an mRNA comprising a genome-editing nuclease coding sequence and a nanos 3 gene 3'UTR located 3' of the coding sequence, and
For use in introducing the mRNA into a fertilized egg ,
Genome editing kit.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018158921A JP7236718B2 (en) | 2018-08-28 | 2018-08-28 | Genome editing technology |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018158921A JP7236718B2 (en) | 2018-08-28 | 2018-08-28 | Genome editing technology |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2020031546A JP2020031546A (en) | 2020-03-05 |
| JP7236718B2 true JP7236718B2 (en) | 2023-03-10 |
Family
ID=69665993
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2018158921A Active JP7236718B2 (en) | 2018-08-28 | 2018-08-28 | Genome editing technology |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP7236718B2 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104195177A (en) | 2014-08-05 | 2014-12-10 | 南京大学 | Method for remarkably improving fish genome editing efficiency |
| CN105274141A (en) | 2015-11-20 | 2016-01-27 | 中国科学院水生生物研究所 | Transgenic vector for target mutation of primordial germ cells, method for preparing transgenic vector and application thereof |
-
2018
- 2018-08-28 JP JP2018158921A patent/JP7236718B2/en active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104195177A (en) | 2014-08-05 | 2014-12-10 | 南京大学 | Method for remarkably improving fish genome editing efficiency |
| CN105274141A (en) | 2015-11-20 | 2016-01-27 | 中国科学院水生生物研究所 | Transgenic vector for target mutation of primordial germ cells, method for preparing transgenic vector and application thereof |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Int. J. Biochem. Cell Biol., 2014, 55, pp.329-334 |
| Nat. Methods, 2015, 12(10), pp.982-988 |
| PLos Genet., 2017, 13(7): e1006796 |
| PLos One, 2013, 8(10): e76387 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2020031546A (en) | 2020-03-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6700306B2 (en) | Pre-fertilization egg cell, fertilized egg, and method for modifying target gene | |
| JP6480647B1 (en) | Method for producing eukaryotic cell in which DNA is edited, and kit used in the method | |
| JP6948718B2 (en) | Genome editing method | |
| JP5320546B2 (en) | Tol1 element transposase and DNA introduction system using the same | |
| Ivics et al. | Germline transgenesis in rabbits by pronuclear microinjection of Sleeping Beauty transposons | |
| JP6952315B2 (en) | Genome editing method | |
| KR20150105475A (en) | Hornless livestock | |
| JP6958917B2 (en) | How to make gene knock-in cells | |
| EP2690177B1 (en) | Protein with recombinase activity for site-specific DNA-recombination | |
| US20220145297A1 (en) | Rna-targeting cas enzymes | |
| KR20210105914A (en) | Nuclease-mediated repeat expansion | |
| US20200208146A1 (en) | Materials and methods for efficient targeted knock in or gene replacement | |
| JP7426120B2 (en) | Method for producing knock-in cells | |
| JP7236718B2 (en) | Genome editing technology | |
| US7883890B2 (en) | Transposon transfer factor functioned in mammal | |
| US20220162583A1 (en) | Mitochondrial genome editing methods | |
| JP6956995B2 (en) | Genome editing method | |
| WO2024116373A1 (en) | Nuclease domain for breaking dna into two strands | |
| JP2023038023A (en) | Nuclease domain forming double-stranded breaks in dna | |
| Lawson et al. | 5′ Modifications Improve Potency and Efficacy of DNA Donors for Precision Genome Editing 2 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210730 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220809 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221011 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230207 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230220 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7236718 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |