JP7170042B2 - 生体試料から粒子を単離するための方法、システムおよび濾過ユニット - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、診断目的の高スループット試料処理の分野に関する。特に、本発明は、生体試料から粒子を単離するための、好ましくは（限定されないが）循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）または循環腫瘍微小塞栓（ＣＴＭ）などの循環微小塞栓を含む循環希少細胞（ＣＲＣ）といった希少粒子を血液試料から単離するための、方法、自動液体ハンドリングシステム、カラム、容器および濾過ユニットに向けられる。

発明の背景
腫瘍の多くは転移可能であり、それによって原発腫瘍の治療後のがん再発のリスクを増大させるため、がん検出の時点は、がん患者の治療における主要な予後因子の一つを示す。腫瘍細胞によって血液循環に播種された転移細胞は、非常に初期に生じる可能性があり、重要なことには原発腫瘍が通常のスクリーニングまたは診断で検出される前であっても生じる可能性がある。

がんの診断および予後のために、組織生検などの侵襲的処置を行なって腫瘍組織の存在および進行に対する見通しを得ることが一般的である。しかしながら、そのような侵襲的処置は高額であり、さらに患者の罹患率および心理的ストレスのリスクを増大させる。

その一方で、たとえば末梢血の液体生検は最小侵襲性であり、寛解中の経過観察検査を含む、さまざまな疾患およびそれらの治療処置のためのいくつかの予測因子およびバイオマーカの初期の経時的判定に適用され得る。たとえば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）およびＣＴＣを含む細胞の塊である循環腫瘍微小塞栓（ＣＴＭ）などの循環希少細胞（ＣＲＣ）は、末梢血流中の有用なバイオマーカとして確立されている。ＣＴＣおよび／またはＣＴＭの検出によって、腫瘍の組成、侵襲性、薬剤感受性および治療耐性を評価することができる。ＣＴＭの細胞クラスターは、個々のＣＴＣよりも転移能がはるかに高いと思われる（Fabisiewicz et al., Med Oncol. 2017; 34 (1)）ため、ＣＴＭの検出は特に重要である。

希少粒子単離技術の目的は、これらの粒子をその後の下流解析に好適であるように採取することである。希少粒子単離に基づいてシステムを評価するための３つの主な基準は、高捕獲効率、高単離純度および高スループットである。

高捕獲効率は、試料中に存在するすべての標的粒子を単離する能力によって規定される。高単離純度は、他の（非所望の）粒子を含まない標的粒子のみを選別する効率を指す。高スループットは、システムを臨床用途で使用できるようにするために短時間で大量の試料を処理することを指す。

ＣＴＣおよびＣＴＭの検出における主な技術的課題は、それらの数が血流中の他の細胞に対して極めて少ないことによって生じる。ＣＴＣは通常、５Ｍｉｏの他の単核細胞、特に白血球に対して１つのＣＴＣの割合で、かつ１０億個を超える赤血球に対して１つのＣＴＣの割合で含まれている。これらの細胞または微小塞栓の希少さに次いで、それらの形態に関する不均質性のために、いずれの検出方法もさらに困難になる。

ＣＴＣなどの循環希少細胞を単離するためのいくつかの方法が先行技術から知られており、それらは、特異的なＣＴＣ表面マーカーの検出に関するか、またはサイズ、密度、変形性、もしくは電気的性質などのＣＴＣと他の血液細胞との間の物理的差異に関する。さらに、希少細胞を単離するためのマイクロ流体デバイスが開発されている。

細胞表面マーカープロファイルの検出という文脈で、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）によって提供されるような免疫親和性に基づく富化システムは、ＣＴＣの上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を標的とするモノクローナル抗体に基づいている。当該抗体は、血液試料から磁気的に分離可能な強磁性流体ナノ粒子に結合される。

物理的な分離技術に関して、ＩＳＥＴ（上皮腫瘍細胞のサイズによる単離）およびＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ（商標）などの濾過方法は、赤血球および白血球からＣＴＣをサイズによって分離する多孔性フィルタを提供する。循環腫瘍細胞は１２～２５μｍの範囲の直径を有しており、したがってほとんどが、８～１４μｍの直径を有する白血球および約７μｍのサイズの赤血球よりも大きい（Ferreira et al., Mol Onc. 2016; 10）。適切な孔径のフィルタを選択することによって、より大きい循環腫瘍細胞をこうしてフィルタによって保持することができる。

ＯｎｃｏＱｕｉｃｋ（登録商標）は多孔性バリアを含む装置であり、赤血球および白血球は当該バリアを通過するが、ＣＴＣは保持される。当該装置は、ＣＴＣのより効果的な富化を達成する、密度に基づいた遠心分離ステップをさらに含む。

さらに、細胞をサイズの違いに基づいて分離するマイクロ流体デバイスが開発されている。たとえば、Ｚｈｅｎｇら（Biomed Microdevices 2011; 13）は、血液から実行可能なＣＴＣ富化のための３Ｄマイクロフィルタ装置を開発しており、２つの多孔性ＰＤＭＳ層がマイクロ流体デバイス内に積層されている。マイクロ流体デバイス内のこれら２層の構成は、試料の濾過中に細胞膜にかかる応力を低減させる。

さらなる分離技術が以下の先行技術文献に記載されている。
ＥＰ ０４８５２２８ Ａ１は、リガンドの結合を検出する方法であって、実質的に非圧縮性の微粒子のマトリックスの上のまたは内部の凝集塊の有無を検出することを含む方法に関する。

ＥＰ ０５３６６５８ Ａ１は、全血の試料中の赤血球のサブセットの密度の集団内頻度分布解析を行なう方法に関する。

ＵＳ ４，２３４，３１７は、とりわけ、実質的に乾燥した試薬アリコートでコーティングされた大きい表面積を有する複数の不活性部材を含む血漿または血清試料を分別する方法に関する。

ＵＳ ７，２１４，３４８は、流れ制限粒子を含むマイクロ流体デバイスに関する。流れ制限粒子はゲル濾過材料を含み得る。

しかしながら、先行技術に記載の各方法にはある一定の欠点がある。免疫親和性に基づくシステムは、がん細胞の特異的な細胞表面発現プロファイルに依存するが、これは大幅に変化し得る。特に、標的抗原ＥｐＣＡＭは、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を経る腫瘍細胞に発現されなくなる。さらに、細胞表面上の標的抗原が細胞の単離後にブロックされ続けるため、たとえば細胞表面発現プロファイルのさらなる解析が困難になる。

その一方で、物理的な分離技術にも欠点がある。たとえば、多孔性フィルタを用いて白血球からＣＴＣを分離する場合、サイズが部分的に重複するために結果に誤差が生じる。さらに、物理的な分離技術には、分離中に細胞が損傷し得るというリスクがある。細胞損傷は、たとえば、細胞が多孔性フィルタと非特異的に相互作用すると起こり得る。さらに、細胞間の相互作用または細胞とフィルタとの相互作用に起因して、フィルタの孔が目詰まりする場合がある。そのような目詰まりは濾過プロセスを妨げるだけでなく、濾過孔を通過するまたは濾過孔の内部に閉じ込められている細胞に対するせん断応力の増加にもつながり得る。また、高いせん断応力および圧力は、細胞の変形性と関連しており、最終的には濾過技術の性能に影響を及ぼす。たとえば、最大２０個の細胞を含むＣＴＣクラスターは全血中でも５～１０μｍの収縮部を横切ることが知られている（Au et al., PNAS 2016; 113(18)）。したがって、そのようなクラスターは変形することによってさらに小径の濾過孔をバイパスすることができるので、検出されない。

マイクロ流体デバイスには、非常に複雑な設計、長い処理時間、および低スループットという問題がある。さらに、捕獲した生細胞をマイクロ流体デバイスから抽出することは極めて困難である。しかしながら、マイクロ流体フローチャンバの外部でさらなる下流アプリケーションを実行しなければならない場合は、抽出が必要である。さらに、そのようなデバイスの体積は通常、わずか数ナノリットルから、さらには数フェムトリットルである。しかしながら、循環希少細胞は非常に低濃度で血液に含まれている（たとえば、全血１ｍｌ当たりのＣＴＣの濃度は約１～１０細胞に過ぎない：Millner et al., Ann Clin Lab Sci, 2013）ため、処理時間が極端に長くなってしまう。流量を増大させてこの時間制約を克服することは実行可能な選択肢ではない場合が多い。というのも、同時にせん断力が増大して最終的に細胞膜を損傷するからである。最後に、マイクロ流体デバイスは、実用的な理由でＰＤＭＳから構築されることが多い。しかしながら、ＰＤＭＳはガスおよび疎水性化合物を溶解させるので、気泡が形成されて細胞がＰＤＭＳ表面に非特異的に付着し、これは細胞にとって最終的に有害であり得る。

したがって、希少な腫瘍細胞を単離するための公知のシステムの上述の不利点に鑑みて、生体試料中に存在するすべての標的粒子を捕獲し、標的粒子のみを効率的に単離し、短時間で大量の試料を処理する方法が依然として必要とされている。また、そのような単離法を実行するように適合されたカラムおよび濾過マトリックスが、より正確には、好ましくは（限定されないが）血液試料を濾過し、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）または循環腫瘍微小塞栓（ＣＴＭ）を含む循環希少細胞（ＣＲＣ）といった希少粒子を単離するためのカラムとして使用される、生体試料中の選択された生体物質を単離して回収するためのカラムが必要とされている。そのようなカラムおよび／または濾過ユニットは好ましくは、短時間で大量の試料を処理する場合に使用されるようにさらに適合されるべきであり、たとえばカラム／濾過ユニットは、自動化および高スループット処理に好適なシステムに統合されるように適合されてもよい。

発明の概要
本発明は、生体試料から粒子を単離するための方法を提供することによって現行技術の短所を解決するものであり、上記方法は、
－ 上側開口部および下側開口部を有するカラムを提供するステップを含み、カラムは少なくとも第１のセクションを含み、第１のセクションは第１の直径の第１の複数のマイクロビーズを含み、第１の複数のマイクロビーズは、第１の複数のマイクロビーズが下側開口部を通過しないようにカラム内に保持され、上記方法はさらに、
－ 生体試料を、カラムの上側開口部を通して濾過マトリックスの上に適用するステップと、
－ 生体試料の粒子の第１の部分を生体試料の粒子の第２の部分から分離するステップとを含み、生体試料の粒子の第１の部分は第１のセクションを通過し、第１のセクションは生体試料の粒子の第２の部分を保持し、上記方法はさらに、
－ 保持された生体試料の粒子の第２の部分と第１のセクションとを緩衝液に懸濁させて懸濁液を形成するステップと、
－ 懸濁した生体試料の粒子の第２の部分を懸濁した第１のセクションから分離するステップとを含む。

生体試料からたとえば希少細胞などの粒子を単離するためのこの提案される方法は、サイズによる粒子の分離に基づいている。濾過マトリックスとして作用する第１のセクションは、特定の直径のマイクロビーズを含み、それによって、隣接したマイクロビーズ同士の間の明確に規定された隙間を提供する。これらの隙間は生体試料のフィルタとして作用し、すなわち、形成された隙間よりもサイズが大きい粒子はマイクロビーズによって捕捉される。選択されるマイクロビーズの直径が小さいほど、隙間が小さくなり、したがって有効フィルタサイズが小さくなる。こうして、マイクロビーズを含む第１のセクションは、マイクロビーズによって形成される隙間よりも直径が大きい粒子（「粒子の第２の部分」）を捕捉することができるが、残りの部分はこれらの隙間を通過する（「粒子の第１の部分」）。

一般的に３次元トンネル構造として成形される、マイクロビーズ同士の間の隙間体積は、標的粒子が隙間の内部に捕捉されるときに最小限の接触面積を提供する。同時に、捕捉された粒子に占有されていない隙間の残留体積は、捕捉された粒子が受けるせん断応力を低減させ、臨界隙間直径未満の粒子を通過させることによって濾過マトリックスの目詰まりを防ぐ。４０μｍのマイクロビーズサイズを仮定すると、これは１平方ミリメートル当たり５７６個の隙間に相当する。これは、他のサイズに基づく単離技術、すなわち多孔性の孔、収縮部／ポストを介するよりもはるかに高密度で安定している。その結果、以前より公知の方法のいくつかにおいて経験するような目詰まりに関連する性能問題が回避される。

マイクロビーズの少なくとも第１のセクションの別の有利な特徴は、高度な変形性を示す粒子を捕獲する能力である。特に、細胞のクラスターは、十分な圧力および応力が加えられるという条件で、従来の多孔性の濾過システムをくぐり抜けることができる。そのようなセクションに、濾過マトリックスとして作用する複数のマイクロビーズと、したがって流路に沿った複数の濾過隙間とを設けることによって、変形しやすい粒子でも捕獲される可能性が高くなる。さらに、濾過時に、マイクロビーズの湾曲は細胞損傷を軽減するのを助けるため、分離後に無傷の生細胞を単離することができる。

濾過されて捕捉された粒子の第２の部分を緩衝液に懸濁させることによって、第１のセクションの秩序配列が失われる。それによって、第１のセクションのマイクロビーズは、第１のセクションのマイクロビーズの直径に基づいて効果的なフィルタを形成しなくなる。その結果、粒子の第２の部分が緩衝液中に放出されて第１のセクションから分離することができる。

さらなる実施形態では、生体試料の粒子の第１の部分は、重力によってまたは遠心力の印加によって、生体試料の粒子の第２の部分から分離し、好ましくは、分離した生体試料の粒子の第１の部分は第１の容器に収集される。

特に、遠心力の印加により、粒子の第１の部分と第２の部分とを迅速に分離することができる。遠心力は、生体試料を損傷しないように、または生体試料の粒子を変形させないように、生体試料に適合されてもよい。

さらなる実施形態では、懸濁した粒子の第２の部分は、重力によってまたは遠心力の印加によって、懸濁した第１のセクションから分離する。マイクロビーズの密度およびサイズは粒子とは異なるため、遠心力により、特に残りのマイクロビーズから粒子を分離することができる。

懸濁した粒子の第２の部分は、これに代えてまたはこれに加えて、免疫親和性に基づく富化または密度に基づく富化など、他の手段によって単離されてもよい。

上記方法は、分離した粒子の第２の部分を濃縮するステップをさらに含んでもよい。
分離した粒子の第２の部分は、遠心力の印加によって濃縮されてもよい。たとえば、粒子の第２の部分を、遠心分離リザーバまたは第３の容器内で１０００～２０００ｇで１０～１５分間遠心分離して、遠心分離リザーバまたは第３の容器の底の粒子の第２の部分を収集してもよい。

上記方法は、分離した粒子の第２の部分を下流解析に移すステップをさらに含んでもよい。下流解析は、顕微鏡解析またはバルク生化学解析を含んでもよい。移すステップは、懸濁した生体試料の粒子の第２の部分を懸濁した第１のセクションから分離した後に、および／または分離した粒子の第２の部分を濃縮するステップの後に行なわれてもよい。

マイクロビーズは実質的に非圧縮性であってもよい。これにより、マイクロビーズの隙間のサイズ、すなわち有効フィルタまたは孔径を、遠心力が加えられても明確に規定し続けることができる。

マイクロビーズは実質的に非多孔性であってもよい。これにより、生体試料の粒子、すなわち粒子の第１の部分および第２の部分がマイクロビーズに浸透せず、したがってマイクロビーズの内部に捕捉されないようにすることができる。それによって、粒子の第１の部分からの粒子の第２の部分の分離時のフィルタサイズを決定するのは、マイクロビーズ同士の間に形成される隙間のみである。単離すべき粒子のサイズに応じて、上記方法を実行する前に隙間サイズをこうして計算することができる。それによって、従来のゲル濾過技術とは対照的に、濾過マトリックスの較正を行なう必要がない。

マイクロビーズは、ガラス；セラミック；ナイロン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、セファロース、アガロース、セルロース、セルロース誘導体、およびデキストランからなる群から選択される１つ以上のポリマー；ならびに／または金属で構成されてもよい。セファロース、アガロース、セルロース、セルロース誘導体、およびデキストランは任意に架橋されてもよい。これらの材料は生体試料と適合性があることが実証された。

マイクロビーズは磁性であってもよい。特に、１つ以上のセクションのマイクロビーズなど、マイクロビーズの一部のみが磁性であってもよい。たとえば、第２のセクションは磁気マイクロビーズを含んでもよい。粒子の第２の部分を分離するステップの間、次いで磁力を加えて粒子の第２の部分から第２のセクションを分離してもよい。

マイクロビーズは、血液流体などの生体試料に対して不溶性および／または不混和性であってもよい。それによって、マイクロビーズは粒子の単離時に安定し、再利用され得る。

マイクロビーズは生体試料に対して非反応性であってもよい。それによって、生体試料の粒子の分離および単離を決定するのは隙間サイズのみである。

あるいは、第１のセクションは、生体試料の粒子の少なくとも一部に対して反応性であるマイクロビーズを含んでもよい。特に、生体試料に含まれる抗原、好ましくは生体細胞の表面上に含まれる抗原に対するマイクロビーズに、抗原が結合されてもよい。

第１のセクションは懸濁可能であってもよい。したがって、第１のセクションは、濾過マトリックスの上下の固定フィルタなど、いずれの取り外し不可能な物理的な境界またはコンファインメントによっても閉じ込められないように設けられてもよい。その結果、粒子の第２の部分、第１のセクションのマイクロビーズ、および緩衝液は、懸濁液を形成することができ、この懸濁液から、粒子の第２の部分をたとえば遠心分離によって直接的な方法で分離することができる。

マイクロビーズの第１の直径は、２０～７００μｍ、好ましくは５０～６００μｍの範囲であってもよい。この直径により、３～１１０μｍの濾過隙間を形成することができる。そのような隙間サイズにより、たとえば細胞クラスターまたは大きいＣＴＣなど、さまざまな生体粒子を分離することができる。

マイクロビーズの第１の直径は、あるいは、１０～１０００ｎｍ、好ましくは５０ｎｍ～５００ｎｍ、より好ましくは１００ｎｍ～３００ｎｍの範囲であってもよい。これらのマイクロビーズサイズにより、サイズが２０～５０ｎｍ（エキソソーム）の細胞外小胞、またはサイズが５０～１０００ｎｍの微小胞など、ナノメートル領域内の生体粒子を分離することができる。

さらに、マイクロビーズの第１の直径は、あるいは、１μｍ～２０μｍの範囲であってもよい。この直径により、たとえばアポトーシス小体を分離することができる。

上述のマイクロビーズの特徴は、上述のおよび以下の実施形態の各々に適用され得る。
さらなる実施形態では、上側開口部および下側開口部を有するカラムを提供するステップにおいて、濾過マトリックスの第１のセクションは、下側開口部に位置付けられる収縮手段によってカラム内に保持される。それによって、第１のセクションはカラム内に安定して位置付けられて下側開口部を流れない。収縮手段は、カラム内の第１のセクションのマイクロビーズの安定化を可能にするが、緩衝液、およびたとえば粒子の第１の部分などのより小さいサイズの粒子が、カラムを流れて下側開口部から出ることも可能にする。したがって、収縮手段は下側開口部を完全には閉塞せず、下側開口部を収縮させるに過ぎない。

収縮手段は、カラムの下側開口部に一時的に位置付けられてもよく、および／または取り外し可能であってもよい。したがって、収縮手段は、粒子の第１の部分を粒子の第２の部分から分離するステップの間はカラムの下側開口部に位置付けられてもよく、粒子の第１の部分を粒子の第２の部分から分離するステップの後に、および／または粒子の第２の部分と濾過マトリックスとの懸濁液を形成するステップの間に、および／または粒子の第２の部分と濾過マトリックスとの懸濁液を形成するステップの後に、除去されてもよい。

一実施形態では、収縮手段は、第２の直径の第２の複数のマイクロビーズを含む第２のセクションを含み、第１の直径は第２の直径よりも小さい。第２のセクションは、カラムの下側開口部を効果的に塞ぐことよって第１のセクションを支持することができる。

さらなる実施形態では、収縮手段は、第２のセクション、および／またはカラムの下側開口部に位置付けられる機械的バリアを含む。機械的バリアは、フィルタであってもよいし、第２のセクションのマイクロビーズを支持するカラムの下側開口部の部分であってもよい。下側開口部は、たとえば第２のセクションを支持する十字としてまたはフィルタとして形成されてもよい。

代替の実施形態では、収縮手段はプラグであり、好ましくは取り外し可能なプラグである。たとえばプラグなどの収縮手段は、カラムの下に位置付けられる容器によって設けられてもよい。特に、収縮手段は、カラムの下側開口部に位置付けられる中心突出部であってよく、突出部の少なくとも一部はカラムの内部に収まる。中心突出部は少なくとも上部および下部を含んでもよく、上部はカラムの内部に収まり、下部はカラムの下側開口部の外側壁を支持する。あるいは、プラグは、カラムの下側開口部に位置付けられる多孔性の取り外し可能な蓋であってもよい。

さらなる実施形態では、第１のセクションおよび第２のセクションは積層された層として設けられ、第１のセクションは最上層である。

層状の幾何学的形状において直径の異なるマイクロビーズを含むセクションを適用することによって、カラムは、第１のセクションのマイクロビーズを保持する付加的な手段が不要である。むしろ、より大きいマイクロビーズを有する第２のセクションが、カラムの下側開口部を効果的に閉塞することができる。保持された粒子の第２の部分を緩衝液に懸濁させることによって、濾過マトリックスの第１および第２の両方のセクションの秩序配列が失われ、粒子の第２の部分が緩衝液中に放出され、同時にカラムの下側開口部の閉塞も減少するかまた取り除かれる。それによって、懸濁した粒子の第２の部分は、たとえば、より小さいサイズのマイクロビーズととともに下側開口部からカラムを出て、より大きいサイズのマイクロビーズをカラム内に残すことができる。

さらなる実施形態では、カラムは複数のセクションを含み、セクションのうちの２つは第１のセクションおよび第２のセクションであり、各セクションは特定の直径の複数のマイクロビーズを含み、複数のセクション同士は少なくともマイクロビーズの特定の直径が異なり、第１のセクションの第１の直径は最小直径を含む。

さらなる実施形態では、複数のセクションは積層された層として設けられ、第１のセクションは最上層であり、複数のセクションのマイクロビーズの特定の直径は最上層から最下層に向かって徐々に増加する。この幾何学的形状は、最下層に向かう各セクションが有する隙間が大きくなっていくので、流れ圧力の低下を促す。それによって、スループットが向上する。

さらなる実施形態では、複数のセクションは３～７個のセクションを含む。この範囲は、最適な流れ圧力プロファイル、ならびに、ＣＴＣまたは微小塞栓の分離および単離などの粒子の最適な分離を反映している。

さらなる実施形態では、生体試料の粒子は、第１のセクションの上に適用される前に密度勾配遠心分離ステップによって富化される。そのような富化ステップは特に、第１のセクションの上に適用される生体試料の体積を減少させるために有利であり得る。

さらなる実施形態では、上記方法は循環腫瘍細胞を単離するために適用され、第１の直径は８０～２００μｍの範囲である。

さらなる実施形態では、上記方法は循環微小塞栓を単離するために適用され、第１の直径は２００～６００μｍの範囲である。

さらなる実施形態では、上記方法は細胞外小胞を単離するために適用され、第１の直径は１０～１０００ｎｍ、好ましくは５０～５００ｎｍ、より好ましくは１００～３００ｎｍの範囲である。

さらなる実施形態では、上記方法は自動液体ハンドリングプラットフォームにおいて実現される。

別の局面において、本発明はまた、生体試料から粒子を単離するための自動液体ハンドリングシステムに関し、上記システムは、
－ 上側開口部および下側開口部を含むカラムを第１の容器の上に位置付けるための手段を含み、カラムには第１の直径の第１の複数のマイクロビーズを含む少なくとも第１のセクションが設けられ、生体試料の粒子の第１の部分を生体試料の粒子の第２の部分から分離するために、第１の複数のマイクロビーズは、第１の複数のマイクロビーズが下側開口部を通過しないようにカラム内に保持され、上記システムはさらに、
－ 溶液をカラム、第１の容器および／または第２の容器に移すための手段と、
－ 溶液をカラム、第１のリザーバ容器および／または第２の容器から吸引するための手段と、
－ カラム、第１のリザーバ容器および／または第２の容器を遠心分離するための手段とを含む。

液体試料の体積は少なくとも０．１ｍｌであってもよい。液体試料の体積は最大でも５００ｍｌであってもよい。そのような体積により、生体試料を効率的に処理することができる。たとえば、ＣＴＣの検出には、典型的に少なくとも２ｍｌの血液試料が必要である。ＣＴＣの希少さを考慮して、１０ｍｌの全血試料などのより大きい体積を採取して希少細胞を検出する可能性を高めることが好ましい。

別の局面において、本発明はまた、生体試料から粒子を単離するための方法で使用されるように適合されたカラムに関し、上記カラムは、
－ 生体試料を受けるための上側チャンバを含み、上側チャンバはその外側面が１つ以上の外側カラム壁によって規定され、外側カラム壁はその下端においてテーパ部内に延び、上記カラムはさらに、
－ テーパ部から下側開口部まで下方に延びる細長いチャネルを含み、
－ 細長いチャネルは、第１の直径の第１の複数のマイクロビーズを含む少なくとも第１のセクションで少なくとも部分的に充填され、第１の複数のマイクロビーズは、第１の複数のマイクロビーズが下側開口部を通過しないようにカラム内に保持される。

さらなる実施形態では、カラムは上側チャンバを封止するために蓋部をさらに含んでもよく、蓋部は上側開口部を含み、上側開口部を通して生体試料が受けられる。

さらなる実施形態では、第１の複数のマイクロビーズをカラム内に保持するために、細長いチャネルの下側開口部に収縮手段が位置付けられる。

収縮手段は、第２の直径の第２の複数のマイクロビーズを含む第２のセクションを含んでもよく、第１の直径は第２の直径よりも小さい。

収縮手段は、第２のセクションを保持する下側開口部の十字形の端部を含んでもよい。この寸法は、収縮手段の上方に位置付けられるマイクロビーズが当該手段の十字形状によって保持されるように選択される。十字形の端部の寸法は、マイクロビーズの少なくとも１つのセクション、特に第１の複数のマイクロビーズが収縮手段を通り抜けるように選択されることが考えられる。

収縮手段は多孔性フィルタを含んでもよい。
少なくとも第１のセクションおよび第２のセクションは、本発明に係る方法について上記に定義したマイクロビーズを含んでもよい。特に、マイクロビーズは実質的に非圧縮性であってもよい。さらに、マイクロビーズは非多孔性であってもよい。特に、マイクロビーズは、ガラス；セラミック；ナイロン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、セファロース、アガロース、セルロース、セルロース誘導体、およびデキストランからなる群から選択される１つ以上のポリマー；ならびに／または金属で構成されてもよい。マイクロビーズは磁性であってもよい。マイクロビーズは、血液流体などの生体試料に対して不溶性および／または不混和性であってもよい。マイクロビーズは生体試料に対して非反応性であってもよい。あるいは、カラムは、生体試料の粒子の少なくとも一部に対して反応性であるマイクロビーズを含んでもよい。第１のセクションおよび／または第２のセクションは懸濁可能であってもよい。マイクロビーズの第１の直径は、２０～７００μｍ、好ましくは５０～６００μｍの範囲、または１０ｎｍ～１μｍ、好ましくは５０ｎｍ～５００ｎｍ、より好ましくは１００～３００ｎｍの範囲、または１μｍ～２０μｍの範囲であってもよい。さらなる実施形態では、第１のセクションおよび第２のセクションは積層された層として設けられ、第１のセクションは最上層である。さらなる実施形態では、カラムは複数のセクションを含み、セクションのうちの２つは第１のセクションおよび第２のセクションであり、各セクションは特定の直径の複数のマイクロビーズを含み、複数のセクション同士は少なくともマイクロビーズの特定の直径が異なり、第１のセクションの第１の直径は最小直径を含む。さらなる実施形態では、複数のセクションは積層された層として設けられ、第１のセクションは最上層であり、複数のセクションのマイクロビーズの特定の直径は最上層から最下層に向かって徐々に増加する。さらなる実施形態では、複数のセクションは３～７個のセクションを含む。

さらに別の局面では、本発明はまた、容器に関し、上記容器は、生体試料の一部またはすべてを受けるための容器チャンバを含み、容器チャンバはその外側面が１つ以上の外側容器壁によって規定され、容器は、カラムが容器の上に載置されると、カラムの細長いチャネルが容器チャンバの内部に突き出るように配置される。

容器の底部は、捕捉部（３６）を構築するテーパ状の底壁を含んでもよい。
容器は、カラムの細長いチャネルの下側開口部に位置付けられる収縮手段として中心突出部（３９）を含んでもよく、突出部はカラムの細長いチャネルの内部に収まる。

中心突出部は少なくとも上部および下部を含んでもよく、上部はカラムの細長いチャネルの内部に収まり、下部は細長いチャネルの下側開口部の外側壁を支持する。下部は、たとえば、上部よりも大きい直径を有してもよい。直径の変化は連続的（たとえば、切頭円錐の形態）であってもよいし、直径の変化は不連続であってもよい。好ましくは、細長いチャネルの外側壁と突出部の外側壁との間に通路が形成され、これにより、液体が当該通路を通って容器チャンバに流れ込むことができる。そのような通路は、たとえば、１０～４０μｍ、好ましくは約２０μｍの幅を有してもよい。こうして、液体、およびより小さい粒子は、通路を通ってカラムから容器チャンバに流れ込むことができるが、より大きい粒子、特にこのサイズを超えるマイクロビーズは、カラム内に安定して位置付けられる。

本発明はまた、上述のカラムを含み、上述の容器をさらに含む、濾過ユニットに関する。

本明細書において使用する「粒子」という用語は、細胞、血液細胞、臍帯血液細胞、骨髄細胞、赤血球、白血球、リンパ球、上皮細胞、幹細胞、がん細胞、腫瘍細胞、循環腫瘍細胞、細胞前駆体、造血幹細胞、間葉細胞、間質細胞、血小板、精子、卵子、卵母細胞、病原菌、微生物、細菌、真菌、酵母菌、原生動物、ウイルス、細胞小器官、核、核酸、ミトコンドリア、ミセル、脂質、細胞外小胞、タンパク質、タンパク質複合体、細胞残屑、寄生生物、脂肪小滴、多細胞生物、胞子、藻類、上記のクラスターまたは凝集体を含むが、これらに限定されない。粒子は剛性または変形可能でもよく、さまざまなサイズおよび形状を有することができる。粒子はサイズが異なってもよく、たとえば約２０ｎｍ～約１ｍｍの最大直径を有してもよい。

生体試料は、生体元素を含有する任意の流体、ゲル、または溶液であり得る。たとえば、希少細胞が抽出される生体試料は、ヒトもしくは動物由来の任意の体液、または細胞組織の分散物であり得る。その例は、血液、特に末梢血、たとえば、静脈血または動脈血、リンパ液、尿、滲出液、浸出液、髄液、精液、唾液、天然または非天然の体腔液、骨髄および分散身体組織である。最も好ましい体液は末梢血である。

本発明の文脈における「実質的に非圧縮性」は、遠心力、磁力、電気力、静水圧、および負圧もしくは正圧による力などの、マイクロビーズへの力の印加によって、または通常の引力での長期間の保管によって生じ得る形状またはサイズの変化に対するマイクロビーズの抵抗に関連する。実質的に非圧縮性のマイクロビーズは、最大でも１．５、好ましくは最大でも１．２、より好ましくは最大でも１．１の圧縮率を示し、圧縮率（ＣＦ）はＣＦ＝重力沈降体積／充填層体積と定義される。マイクロビーズによるカラム内のパッキングは、２～１００ｇでの遠心分離によって、または充填層体積が一定であり続けるまでカラムを真空ポンプに適切な時間にわたって接続することによって行なうことができる。

本発明の文脈における「実質的に非多孔性」は、生体試料の対象粒子、すなわち分離および単離すべき粒子の第１の部分および第２の部分に対するマイクロビーズの多孔性を指す。これらの粒子は、実質的に非多孔性のマイクロビーズに浸透することができない。しかしながら、これは、マイクロビーズが粒子のサイズ未満のサイズ範囲の孔を含むことを排除するものではなく、すなわち、マイクロビーズは粒子のサイズ未満のカットオフ値（または排除限界）を有し得る。したがって、実質的に非多孔性のマイクロビーズは、一般に、マイクロビーズのサイズ排除限界未満であるオリゴヌクレオチドまたはペプチドなどの小分子によって浸透され得る。

第１の複数のマイクロビーズ、第２の複数のマイクロビーズ、およびさらなる複数のマイクロビーズのいずれか、のマイクロビーズの直径は、実際には、正確に均一のサイズではない。たとえば、市販のマイクロビーズは厳密には均質ではなく、直径の分布を含む。たとえば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）の製品番号Ｇ９１４３の未洗浄ガラスビーズはメッシュサイズを含み、マイクロビーズの９０％が２１２～３００μｍの範囲内にあることが示されている。１つのセクション内にこれらの未洗浄ガラスビーズを使用することは、「第１の直径」、「第２の直径」、および／または「特定の直径」のマイクロビーズと理解されるべきである。本発明の目的のために、マイクロビーズの直径の厳密な分布は所望の用途に応じて異なり得る。しかしながら、マイクロビーズのさまざまなセクションによって上述のような濾過効果が達成されることが必須である。好ましくは、ある用途では、マイクロビーズのマイクロビーズの少なくとも５０％が実質的に同じ直径または狭い分布を有する。他の用途では、マイクロビーズのマイクロビーズの少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が実質的に同じ直径または狭い分布を有する。また、マイクロビーズのマイクロビーズの１００％が実質的に同じ直径または狭い分布を有することも可能である。

本発明の現在の好ましい実施形態を以下の図面を参照して以下の詳細な説明において説明する。

本発明に係るフィルタとして使用可能な、隣接した３つのマイクロビーズによって形成される隙間の概略図である。 本発明に係るフィルタとして使用可能な、隣接した３つのマイクロビーズによって形成される隙間の概略図である。 本発明に係るフィルタとして使用可能な、隣接した３つのマイクロビーズによって形成される隙間の概略図である。 本発明に係る容器の概略図である。 本発明に係る容器の概略図である。 本発明に係る容器の概略図である。 本発明に係る方法のワークフローの図である。 本発明に係る方法のワークフローの図である。 本発明に係る方法のワークフローの図である。 本発明に係る容器の概略図である。 本発明に係る容器の概略図である。 本発明に係る容器の概略図である。 本発明に係る容器の概略図である。 本発明に係る容器の概略図である。 本発明に係る方法のワークフローの図である。 本発明に係る方法のワークフローの図である。 本発明に係る方法のワークフローの図である。 本発明に係る方法のワークフローの図である。 本発明に係る方法、システム、カラムおよび容器を利用可能な健康診断の図である。 平均直径２０μｍのシリカビーズの顕微鏡画像（倍率７６０倍）を示す図である。 平均直径３０μｍのシリカビーズの顕微鏡画像（倍率７６０倍）を示す図である。 バフィーコート試料の顕微鏡画像（倍率３５０倍）を示す図である。 ２０μｍのマイクロビーズマトリックス上への適用後のフロースルー（倍率３５０倍）を示す図である。 ２０μｍのマイクロビーズマトリックスの懸濁後の分離した粒子（倍率３５０倍）を示す図である。 ５０μｍのマイクロビーズマトリックス上への適用後のフロースルー（倍率３５０倍）を示す図である。 ５０μｍのマイクロビーズマトリックスの懸濁後の分離した粒子（倍率３５０倍）を示す図である。 ５０μｍのマイクロビーズマトリックス上への適用後のフロースルー（倍率７６０倍）を示す図である。 ５０μｍのマイクロビーズマトリックスの懸濁後の分離した粒子（倍率７６０倍）を示す図である。 平均サイズ３０μｍのマイクロビーズの隙間に捕捉された凝集赤血球の顕微鏡画像（倍率３５０倍）を示す図である。 平均サイズ３０μｍのマイクロビーズの隙間に捕捉された凝集赤血球の顕微鏡画像（倍率３５０倍）を示す図である。

実施形態の詳細な説明
本発明の好ましい実施形態および実施例を以下の詳細な説明において説明する。しかしながら、本発明はこれらの実施形態に限定されないことを強調しておく。

本発明は、先行技術から知られている上述の制限および課題を克服する、生体試料から粒子を単離するための方法、システム、カラム、容器および濾過ユニットに関する。有利なことに、当該方法、システム、カラム、容器および濾過ユニットは、細胞の生存能力を保ち、高収率および高純度を提供しつつ、大量の試料の高スループット濾過を提供し得る。

生体単離を目的とするこの提案される方法ならびにシステム、カラムおよび濾過ユニットは、特定の直径のマイクロビーズを含む第１のセクションに基いているか、または当該第１のセクションを含む。これらのマイクロビーズは、生体粒子のフィルタとして働く隙間を形成し、隙間のサイズを超える直径またはサイズの生体粒子はセクション内に捕捉される。有利なことに、３次元トンネル構造として成形される、マイクロビーズ同士の間の隙間体積は、標的粒子が隙間の内部に捕捉されるときに最小限の接触面積を提供する。同時に、捕捉された粒子に占有されていない隙間の残留体積は、捕捉された粒子が受けるせん断応力を低減させ、臨界隙間直径未満の粒子を通過させることによって濾過マトリックスの目詰まりを防ぐ。濾過隙間の３次元マトリックスである第１のセクションは、さらに、通常は収縮部で変形する粒子を分離して捕捉することによって、捕捉されることを避けることができる。

捕捉された粒子は、直接的な方法で第１のセクションから回収することができる。重要なことに、この提案される方法によれば、粒子は緩衝溶液中に残ることによって、生きている未損傷の生体粒子を単離する可能性を高める。

図１ａは、丸い粒子１０２を捕捉する隙間の形成を示す。隙間は、隣り合う少なくとも３つのマイクロビーズ１０１によって形成される。隣り合う３つのマイクロビーズによって形成される隙間直径は、以下の式に従って算出することができる。

ここで、ｄは３つのマイクロビーズによって形成される隙間の直径であり、Ｄは各マイクロビーズの直径である。図１ｂおよび表１は、均質なサイズの例示的なマイクロビーズについて計算された隙間を含む。

第１のセクションのマイクロビーズマトリックスの分布は、比較的一貫性がある。たとえば、５００μｍの特定の直径を有するマイクロビーズは、直径８０μｍ以上の粒子を捕捉する一定かつ正確な隙間を提供する。明らかに、実際には、正確な隙間は計算値からわずかに逸脱する場合がある。しかしながら、一般的に言えば、たとえばマイクロビーズが非圧縮性である場合は、計算された隙間直径に対応するかまたは非常に近い値が達成される。

異なるサイズのマイクロビーズの混合物を用いることによって、隙間直径は変化し、これを測定または計算することができる（図１ｃ、表２）。

図２ａは、カラム２および容器３を有する濾過ユニット１の形態の本発明の実施形態に係る装置を示す。異なる実施形態では、濾過ユニット１は（ならびにそのカラムおよび容器２および３はそれぞれ）実質的に円筒形状または長方形状を有し得る。異なる実施形態では、当該装置はカラム２のみを含むことができ、その場合、それはラックまたはリザーバに結合されるように適合されてもよい。１つの濾過ユニット１のカラム２および容器３は、それらがともに、または同じタイプの別の濾過ユニット１からのその他の相当物とともに組み立てられ得るように設計され、たとえば、カラム２は異なる容器３に連続して組み立てられ得る。

濾過ユニット１に好適な材料は、とりわけ、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラスを含む。一実施形態では、濾過ユニット１は射出成形によって形成される。いくつかの実施形態では、濾過ユニット１のさまざまな部分は同じ材料からなる必要はないことに留意されたい。

濾過ユニットのカラム２は、１つ以上の生体試料を収容するための上側チャンバ２１を有する。この上側チャンバ２１は、カラム２の１つ以上の外側壁２２の中央のキャビティによって形成される。一実施形態では、上側チャンバ２１は実質的に円筒形状であるため、管を形成し得る。カラム２はその上端（その上側チャンバ２１の上方）に、１つ以上の生体試料を上側チャンバ２１に導入して１つ以上の生体試料を上側チャンバ２１から流出させるための上側開口部２４を有する。上側開口部２４はその近傍に、（実験室自動化システムのピペットチャネルに接続するための）ピペットチャネル結合部２５、および／または上側開口部を閉じることによって上側チャンバ２１の上端を封止するためのカバー（図２ａには図示せず）が設けられ得る。一実施形態では、このカバーはエラストマーフラップである。ピペットチャネル結合部２５の存在によって、特異的なロボットアームの代わりにピペットチャネルで試料を直接移すことが促進されて容易になる。いずれの場合も、それは、直接静脈穿刺された場合であっても、送達試料の手段と一致するように特異的に設計されるべきである。

上側チャンバ２１の下部はテーパ部２９を形成し、テーパ部２９の外側壁はテーパ状であり、すなわち、対向壁間の距離（または１つ以上の連続的な外側壁の対向側面間の距離）は、下方向に（すなわち上側セクションの頂部から下側セクションの底部に）進むにつれて小さくなる。テーパ部２９は、下方向に向けられた、かつテーパ部２９に繋がる細長いチャネル２６に向かって開口している、開口部で終端する。いくつかの実施形態では、細長いチャネル２６はカラム２のテーパ部２９から下方に突き出る。好ましい実施形態では、細長いチャネル２６は、本明細書において詳細は後述するフィルタ要素４（図２ｂ参照）を含む。容器３を有する実施形態では、細長いチャネル２６は容器３の容器チャンバ３１の内部に突き出てもよい。細長いチャネル２６の長さおよび直径は、所与の生体試料のサンプリングの種類および方法に、すなわち、たとえば濾過結果を最適化するために、適合されてもよい。たとえば、いくつかの実施形態では、細長いチャネル２６は、カラムフィルタ要素の形態のフィルタ要素４を収容するのに十分な長さであってもよい。細長いチャネル２６は、その下側において下側開口部２７で終端して、上側チャンバ２１に含まれている生体試料の一部またはいくつかの部分の排出を可能にする。この下側開口部２７は、濾過されていない生体試料の流れを可能にするのに十分に大きい予め規定された間隔を有する収縮手段２７１で構成されてもよい。収縮手段２７１は、細長いチャネル２６内に延びるテーパ状の傾斜したスロープを含んでもよい。あるいは、収縮手段２７１は多孔性フィルタであってもよい。

好ましくは、濾過ユニット１のカラム２は、たとえば射出成形によって一体品として作られる。しかしながら、いくつかの実施形態では、カラム２は本体および蓋部２１０を含んでもよい。蓋部２１０は、カラム２の残りの部分（「本体」とも称される）とは別個に作製されてもよく、各部分は射出成形によって作製された後に組み立てられてもよい。この実施形態は、製造が容易であり、費用効率が高いことが実証されている。

蓋部２１０はカラム２の上端に位置付けられてもよい。それは、カラム２の外側壁２２に実質的に平行な外側壁２１１を含んでもよい。外側壁２１１は、好ましくは上側セクションの外側壁２２を取囲んでおり、摩擦力によってそれらに接続されてもよい。一実施形態では、カラム２の本体を蓋部２１０に接続するための接続ノッチ２１２が設けられる。この接続ノッチ２１２は、蓋部２１０の外側壁２１１に、またはカラム２の外側壁２２に載置されてもよい。この接続ノッチ２１２は、外側壁２２と２１１との間に載置されて、蓋部２１０をカラム２の本体に接続させ続ける摩擦力を置換または補足してもよい。蓋部２１０は内壁２１３をさらに含んでもよく、内壁２１３は、外側壁２１１と実質的に平行であり、カラム２の本体の上端に位置付けられているため、蓋部２１０がカラム２の本体に接続されると、内壁２１３および外側壁２１１がスロット２１４を形成し、このスロット内にカラム２の本体の外側壁２２の上部がクランプされることにより、カラム２の本体と蓋部２１０との間のさらに安定した接続が確保され、上側チャンバ２１のより良好な封止が確保され得る。

矩形形状の濾過ユニット１については、カラム２の外面は、好ましくは２個、４個、８個などの対になったアンカー突出部２３を含んでもよい。当該突出部により、カラム２を濾過ユニット１の容器３の上にまたは適合したラックの上に確実に位置付けることができる。

濾過ユニット１の容器３は開口上端を含んでもよく、この開口上端を通って上側セクションの下部を入れることができる。容器３は、たとえば分離した試料流体を収集するための容器チャンバ３１を含んでもよい。容器チャンバ３１は、容器の開口した上側の１つ以上の外側壁３２と、底端３４との間に形成された空間よって規定される。下側チャンバ３１も円筒形であってもよいし長方形であってもよい。最も好ましくは、下側チャンバは、下側チャンバが取り付けられるように設計されるカラム２と同じ形状を有する。

容器３はその上側開口端に、カラム２の１つ以上の突出部２３を受けるための、かつ濾過ユニット１のカラムと容器との間の接続を確保するためのフランジ３３をその開口部の周りに（外側壁３２の頂端に）有してもよい。そのようなフランジ３３はまた、遠心分離機および／または自動ハンドリングシステム上への着脱および／もしくは位置付けのための、ならびに／または適合したラック上に位置付けられるためのハンドリングを容易にするという利点を有する。

下側チャンバ３１の底端３４には、テーパ部を形成する１つ以上の底壁３５が設けられてもよい（すなわち、対向壁間の距離、または１つ以上の連続的な外側壁の対向側面間の距離は、下方向に進むにつれて小さくなる）。底端３４には、縮小した捕捉部３６が底壁３５の下端にさらに設けられてもよい。例示的な実施形態では、容器はまた、容器３およびカラム２から受けたその内容物をさらなる処理のために安全に搬送できるようにするための、かつ容器３内の内容物を失うおよび／または汚染するリスクを低下させるための蓋を含んでもよい。

容器３には、容器３の１つ以上の外側壁３１を実質的に下方向に延長する１つ以上の壁延長部３７がさらに設けられてもよい。これら１つ以上の壁延長部３７は、容器がカラム２に取り付けられて存在するか、カラム２から分離して存在するかに関わらず、平面上の容器の安定したフッティングを可能にするように構成されることが好ましい。たとえば、これらの壁延長部３７は、少なくとも容器３の１つ以上の底壁３５または捕捉部２６と同じくらい下方に延びてもよい。これらの壁延長部３４は実質的に水平な端面を有し、当該端面は壁延長部３４を支持するように、かつ容器２がその上に載置され得る外面との安定した接触を確保するように適合されてもよい。

好ましい実施形態では、カラムおよび容器は着脱可能に設計され、たとえば、カラムと容器が互いに取り付けられると摩擦力が加わるように、カラム２の縮小した外面は容器３の内面よりも小さい。上側セクション３が容器３に取り付けられると、カラム２の縮小した外面と、上側チャンバ２１のテーパ部２９と、カラム２の細長いチャネル２６とが容器チャンバ３１内に収容される。

図２ｂおよび図２ｃを参照して、細長いチャネル２６に含まれているフィルタ要素４は、マイクロビーズ４１１および４１２、４１３のマトリックス４１で形成されてもよい。この場合、１つのセクションは複数のマイクロビーズ４１１（上側セクション、すなわち「第１のセクション」）を含み、別のセクションは複数のマイクロビーズ４１２（中間セクション）を含む。さらに、１つのセクションは複数のマイクロビーズ４１３（下側セクション、すなわち「第２のセクション」）を含み、マイクロビーズ４１３はマイクロビーズ４１１および４１２をカラム内に保持するように構成されるが、より小さい粒子（すなわち「粒子の第１の部分」）および緩衝液は通過することができる。したがって、マイクロビーズマトリックス４１のマイクロビーズ（４１３）を含む下側または「第２の」セクションは、上記セクション４１１および４１２をカラム内に保持する収縮手段の一部である。いくつかの実施形態では、カラム２の細長いチャネル２６は、マイクロビーズマトリックス４１で充填される実質的に円筒形の内面を有する。

本発明に係るマイクロビーズマトリックス４１は、実質的に非圧縮性のマイクロビーズ１０１のサイズが連続的なまたはサイズが不連続のマトリックスを指す。「サイズが連続的なマトリックス」という文言は、マイクロビーズ１０１のサイズが徐々に増加することを意味することを意図している。「サイズが不連続の」という文言は、マトリックスがサイズ依存性のマイクロビーズセクションを含み、各セクション内のマイクロビーズが特定の直径を有し、細長いチャネル構造のコンファインメントの内部にランダムに拡散していることを意味することを意図している。

マイクロビーズ１０１に使用される非限定的で好適な非圧縮性材料は、ステンレス鋼、磁性、シリカを含み、すなわち、血液に対して不溶性および不混和性であり、血液に対して非反応性である。そのようなマイクロビーズ１０１はまた、ガラスもしくはセラミックス、および／または１つ以上のポリマー、たとえば、ナイロン、ポリテトラフルオロエチレン（テフロン（登録商標））、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、セファロース、アガロース、セルロース、セルロース誘導体、もしくはデキストランからなることができ、および／または金属を含むことができる。マイクロビーズ１０１の例としては、磁気単離、磁性粒子、プラスチック粒子、セラミック粒子、カーボン粒子、ガラス単離、金属粒子、複合組成の粒子、微細加工された自立微細構造などが挙げられるが、これらに限定されない。

図２ｂでは、濾過ユニット１のカラム２は、マイクロビーズ４１１、４１２および４１３の３つのセクションを有するマイクロビーズのマトリックス４１で充填される。複数のマイクロビーズ４１１を含むセクションはフィルタとして作用するが、セクション４１３は収縮手段の一部である。上記に説明したように、マイクロビーズ４１１、４１２および４１３の各セクション内のマイクロビーズは、好ましくは実質的に均一のサイズであってもよく、すなわち、市販のマイクロビーズについて通常通りの直径分布（上記参照）を含んでもよい。マイクロビーズのマトリックス４１は、この説明例に開示される３つのセクションよりも少ないセクション（すなわち、２つもしくは１つ）または多いセクションを有してもよいことに留意されたい。セクションは層状に配置され、最上層のマイクロビーズは最小直径（たとえば８０μｍ）を有し、最下層のマイクロビーズは最大直径（たとえば３００μｍ）を有する。中間層は、直径がたとえば２００μｍのマイクロビーズを含む。最下層は、マイクロビーズがアパーチャを目詰まりさせるまたは収縮させるように、カラムの下側開口部に配置される。最上層の８０μｍのサイズのマイクロビーズは、約１０μｍの有効隙間を形成し、ＣＴＣ、ＣＩＣおよびＣＴＭを分離するために適用され得る。

循環希少細胞を単離するための方法の実現態様を図３ａ～図３ｃに示す。生体試料８は、たとえばバフィーコートまたは全血試料であってもよい。マイクロビーズマトリックスの上に試料を適用する前に、いずれかの方法で全血試料が希釈されてもよいし、対象の生体粒子が富化されてもよい。たとえば、本出願人に代わって出願されたＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０７２６５４に記載されている密度勾配遠心分離法を適用して、濾過マトリックスの上に適用する前に試料中の生体粒子を富化することができる。

以下に説明する方法のステップはすべて、手動でまたは自動液体ハンドリングシステムにおいて実行可能である。

図３ａ～図３ｃの例示的な方法では、循環腫瘍細胞、循環免疫細胞（ＣＩＣ）および／または微小塞栓を検出するための試料流体として２ｍｌの全血を使用する。まず、試料を密度勾配遠心分離によって分離して、２つの画分、すなわち、約１ｍｌの血漿および単核細胞（ＭＮＣ）と、１ｍｌのＲＢＣおよび重細胞、ならびに／またはＲＢＣで捕らえたＣＴＣ／ＣＩＣ／微小塞栓とが得られる。次いで、ＲＢＣおよび重細胞を含む画分を、カラム２に含まれる濾過マトリックス４１の上に適用する。濾過マトリックスは、均一サイズのマイクロビーズ４１１、４１２および４１３の３つのセクションを含む。セクションは層状に配置され、好ましい実施形態によれば、最上層のマイクロビーズは最小直径（５０μｍ）を有し、最下層のマイクロビーズは最大直径（３００～５００μｍ）を有する。中間層は、６０μｍよりも大きい、好ましくは１００～２２０μｍの直径を有するマイクロビーズを含む。最上層の５０μｍのサイズのマイクロビーズは、約７．７μｍの有効隙間を形成し、したがってＣＴＣ、ＣＩＣおよびＣＴＭを分離するために適用され得る。マイクロビーズの最下層は、カラムの下側開口部を目詰まりさせる。それによって、マイクロビーズの上層がマイクロビーズ最下層の上方のカラム内に安定して位置付けられる。

マイクロビーズマトリックスによるカラム内の充填は、マイクロビーズ懸濁液（たとえば、水中または２０％エタノール中のマイクロビーズ）を上側開口部２４からカラム２内に連続的にピペッティングすることによって行なうことができ、各懸濁液は特定のサイズのマイクロビーズを含む。最小のマイクロビーズ（「第１のセクション」）を有する懸濁液を最後にカラム内にピペッティングする。次いで、生体試料を適用する前に、マイクロビーズマトリックスを遠心分離によって乾燥させ、たとえばＰＢＳなどの緩衝液で洗浄することができる。

図３ａのステップａにおいて、密度勾配遠心分離後に任意に富化されて潜在的にＣＴＣ、ＣＩＣおよび／またはＣＴＭを含む生体試料８を、上側開口部２４からマイクロビーズマトリックス４１の上に適用する。生体試料８はそれによってゆっくりと第１のセクションに入り、第１のセクション、すなわち最上マイクロビーズ層の隙間直径よりも大きい生体粒子は保持される。図３ａのステップｂにおいて、濾過ユニット１の一部であり得、さらに容器３の上に位置付けられ得るカラム２を、たとえば５～２０ｇで２～５分間、好ましくは２～３分間遠心分離する。遠心分離パラメータは、試料と、どの生体粒子を抽出すべきとかに応じて異なり得る。遠心分離によって、生体試料の粒子の第１の部分は、第１のセクションと、カラムの下側開口部における第２のセクションを含む他のセクションのマイクロビーズとを通り抜けて、下側開口部からカラムを出ることができる。原則として、粒子の第１の部分がマイクロビーズマトリックスを通過できるようにするには重力で十分であろうが、遠心分離によって、この通過時間を大幅に短縮することができる。そのような時間の短縮は、所要時間、および生体試料の粒子が処理中に損傷する可能性を減少させるので、有利である。遠心分離後、生体試料の流体８１２、たとえば生体粒子の富化時に使用される血漿または緩衝液と、１０μｍの臨界サイズ（すなわち、最小サイズのマイクロビーズを有するマイクロビーズ層の隙間のサイズ）未満の直径またはサイズを有する粒子の第１の部分８１１とが、セクション４１１、４１２、４１３を有するマイクロビーズマトリックス４１を通過して容器３に収集されるが、臨界値を超える粒子の第２の部分８１３は、もし存在する場合は、マイクロビーズの有効隙間の上方にまたは内部に保持される。第２の部分のこれらの粒子は１０μｍを超えるサイズまたは直径を有しているため、最小サイズのマイクロビーズ、すなわち第１のセクションのマイクロビーズの隙間に捕捉される。

図３ａのステップｃにおいて、容器３とカラム２とを分離する。臨界値未満の粒子の第１の部分８１１を含む容器３は、特に本発明に係る方法によって排出またはさらに処理することができる。したがって、図３ａのステップａ″おいて、粒子８１１を、セクション４１１内のビーズよりも直径が小さい複数のマイクロビーズを含むさらなるカラムの上に適用することができる。たとえば、カラムは、第１のセクションを形成する直径４０μｍのマイクロビーズを含むことよって、約６μｍの濾過隙間を提供することができる。そのようなカラムに粒子の第１の部分を適用することによって、６μｍを超えるサイズまたは直径を有する粒子の画分と、６μｍ未満のサイズを有する粒子の画分とへのさらなる分離を達成することができる。

マイクロビーズのマトリックス４１の隙間に捕捉された粒子の第２の部分は、本発明の方法に従ってさらに処理することができる。図３ｂのステップｄにおいて、マイクロビーズのマトリックス４１および粒子の第２の部分を緩衝液に懸濁させる。たとえば、２ｍｌのＰＢＳが、粒子とマイクロビーズとの懸濁液を形成するのに十分であり得る。粒子およびマイクロビーズを懸濁させることによって、セクション４１１、４１２および４１３の規定された構造が失われ、粒子が第１のセクション４１１から緩衝液中に放出される。この手順によって、捕捉されているすべての粒子を、生理学的な水性環境にある間に懸濁液から確実に単離することができるようになる。

本発明に係る好ましい実施形態の一つによれば、マイクロビーズのマトリックス４１および捕捉した生体粒子を含む濾過ユニット１のカラム２を、たとえば２ｍｌのＰＢＳなどの緩衝液９で満たされている容器３′の上に移す。この場合、濾過ユニット１のカラム２の下側開口部２７は容器３′内の緩衝液に浸漬する。下側開口部２７を介して緩衝液をカラム２内に吸引し、ピペットチャネルを用いて分注を繰り返すことによって、マイクロビーズのマトリックス４１は少なくとも大きく破壊される。特に、最初に下側開口部を収縮させる、すなわち収縮手段として作用する大きいマイクロビーズを含むマイクロビーズマトリックスの最下層が破壊されて、他のマイクロビーズ層のより小さいマイクロビーズと混合される。こうして、下側開口部は、より大きいマイクロビーズによって目詰まりしなくなり、生体粒子およびより小さいマイクロビーズは、カラム２の下側開口部２７から容器３′の容器チャンバ３１に入ることができる。

本発明の一実施形態によれば、第２のセクションのマイクロビーズ、すなわち、下側開口部を目詰まりさせて収縮手段として作用するより大きい直径のマイクロビーズは、磁性である。それによって、濾過ユニット１のカラム２を磁気要素を介してまたは磁気要素の横に配置することによって、磁気マイクロビーズが下側開口部２７から引き離され、粒子の第２の部分の生体粒子と第１のセクションのより小さい（非磁性の）マイクロビーズとの通過を容易にする。粒子の第２の部分と第１のセクションのマイクロビーズとをこうして第２の容器３′に収集する（図３ｂのステップｅ）。

あるいは、カラム２の下側開口部２７は、たとえば下側開口部の上に取り付けられる蓋で封止されてもよい。この場合、濾過ユニット１のカラム２の上側開口部２４を通って緩衝液９が適用され、分注と吸引を繰り返すことによってマトリックス４１が緩衝液に懸濁する。これによってマトリックス４１が少なくとも部分的に破壊される。捕捉された生体粒子はこうして緩衝液中に放出され、マイクロビーズ、粒子および緩衝液がカラム内に懸濁液を形成する。次いで、懸濁液を吸引して第２の容器３′に移す（図３ｂのステップｅ）。

原則として、懸濁および吸引のプロセスは、すべての標的粒子が濾過マトリックスから抽出されるように繰り返すことができる。

図３ｂのステップｆにおいて、第２の容器３′を遠心分離して、粒子の第２の部分を含む懸濁液８１４からマイクロビーズ４２１を分離できるようにする。たとえば、容器を２００ｇで５秒間遠心分離することができ、これにより、密度および／またはサイズの違いによってマイクロビーズおよび粒子を完全に分離することができる。あるいは、粒子およびマイクロビーズの分離は重力によって達成することもできる。密度および／またはサイズの違いのために、マイクロビーズは最終的に容器の底に沈澱するが、粒子は溶液中に残る。さらに、容器を、溶液のマイクロビーズ部分よりも密度が軽い分離ゲルまたは鉱油で予め充填することができる。これにより、粒子がマイクロビーズペレット内に捕捉されないことが確実になるため、全体的な捕獲効率が改善する。さらに、分離ゲルまたは鉱油を使用すると、明確な分離線が形成されるので、粒子を容易に吸引することができる。これは、たとえば下流アプリケーションの純度を確保する上で重要である。

懸濁液からマイクロビーズを分離した後、粒子の第２の部分を含む懸濁液８１４をさらなる容器３″に移すことができる（図３ｂのステップｇ）。この移すステップは、手動でまたは自動液体ハンドリングシステムによって実行可能である。図３ｂの次のステップｈにおいて、懸濁液を少なくとも１００ｇで１分間遠心分離して標的粒子８１５をペレット化してもよい。たとえば、容器は縮小した捕捉部３６を含んでもよく、ここで粒子のペレットが形成される。そのような捕捉部は、たとえばデカンテーションのピペッティング（図３ｂのステップｉ）によって、溶液の完全な除去を容易にすることができる。溶液の除去後、粒子をさらなる緩衝液に懸濁させることができる（図３ｂのステップｊ）。粒子を、たとえば染色または免疫親和性アッセイ用の適切な緩衝液に懸濁させることができる。こうして、図３ｂの遠心分離ステップｈにより、効果的な緩衝液交換が可能になり、さらなる下流アッセイはいずれも合理化される。あるいは、ステップｆの後、粒子の第２の部分を、新しい容器に移すことなく、濃縮することなく、かつ緩衝液交換することなく、顕微鏡解析などの下流アッセイに直接移してもよい。

図３ｃはさまざまな下流プロセスを例示する。粒子の第２の部分を、たとえば、染色し（図３ｃのステップｋ）、洗浄し（図３ｃのステップｌ）、懸濁させ（図３ｃのステップｍ）、その後、形態画像化または他の検証アッセイによって解析することができる。これらのアッセイにより、試料中のたとえばＣＴＣまたはＣＩＣなどの粒子を定量化することができる。

有利なことに、多数のカラム２および容器３を並列処理して、自動液体ハンドリングプラットフォームに容易に統合することができる。それによって、スループットが飛躍的に向上し得る。さらに、本発明に係る方法の間に試料を分割することができる。上記に説明したように、粒子の第１の部分を含む第１の濾液は、たとえばさらなる分離法によって、または検証アッセイによって直接、さらに処理することができる。その一方で、たとえば懸濁液８１４に含まれる粒子の第２の部分は、たとえば、マイクロビーズマトリックス４１の第１のセクション４１１の隙間よりも大きい隙間を有する第１のセクションまたはマイクロビーズマトリックスを含む別のカラムに懸濁液を適用することによって、さらに処理することができる。たとえば、１８μｍの臨界サイズで効果的に濾過する第１のセクションを用いて、このサイズ未満のおよびこのサイズを超える粒子を分離することができる。

図４ａは、カラム２および容器３を有する濾過ユニット１の形態の本発明の好ましい実施形態に係るさらなる装置を示す。図２ａについて上述したように、濾過ユニット１は（ならびにそのカラムおよび容器２および３はそれぞれ）実質的に円筒形状または長方形状を有し得る。当該装置はカラム２のみを含むことができ、その場合、それはラックまたはリザーバに結合されるように適合されてもよい。１つの濾過ユニット１のカラム２および容器３は、それらがともに、または同じタイプの別の濾過ユニット１からのその他の相当物とともに組み立てられ得るように設計され、たとえば、カラム２は異なる容器３に連続して組み立てられ得る。濾過ユニット１に好適な材料は、とりわけ、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラスを含む。濾過ユニット１は射出成形によって形成されてもよい。いくつかの実施形態では、濾過ユニット１のさまざまな部分は同じ材料からなる必要はないことに留意されたい。

この実施形態によれば、濾過ユニットのカラム２、上側チャンバ２１、１つ以上の外側壁２２、アンカー突出部２３、上側開口部２４、ピペットチャネル結合部２５、テーパ部２９、テーパ部２９に繋がる細長いチャネル２６、下側開口部２７は、図２ａについて説明したように形成される。細長いチャネル２６は、図２ｂおよび図２ｃについて上述したように、フィルタ要素４を含んでもよい（図４ｂ参照）。

図２ａについて説明したように、濾過ユニット１のカラム２は、たとえば射出成形によって一体品として作ることができ、またはカラム２は本体および蓋部２１０を含んでもよい。

蓋部２１０、その外側壁２１１、接続ノッチ２１２、内壁２１３およびスロット２１４は、図２ａについて説明したように設けられてもよい。

濾過ユニット１の容器３は開口上端を含んでもよく、この開口上端を通って上側セクションの下部を入れることができる。容器３は、図２ａについて説明したように、容器チャンバ３１と、容器の１つ以上の外側壁３２と、フランジ３３と、底壁３５と、１つ以上の壁延長部３７とを含んでもよい。

下側チャンバ３１の底端３４には、上部３９１および下部３９２を有する中心突出部３９が設けられてもよい。中心突出部３９は、カラム２の下側開口部２７を通って細長いチャネル２６の内部に収まることによって、細長いチャネル２６内に局在する濾過マトリックスが容器チャンバ３１に入らないように設けられる。好ましくは、細長いチャネルの外側壁と突出部の外側壁との間に通路が形成され、これにより、液体が当該通路を通って容器チャンバに流れ込むことができる。そのような通路は、たとえば、１０～４０μｍ、好ましくは約２０μｍの幅を有してもよい。こうして、液体、およびより小さい粒子は、通路を通ってカラムから容器チャンバに流れ込むことができるが、より大きい粒子、特にこのサイズを超えるマイクロビーズは、カラム内に安定して位置付けられる。

容器はまた、容器３およびカラム２から受けたその内容物をさらなる処理のために安全に搬送できるようにするための、かつ容器３内の内容物を失うおよび／または汚染するリスクを低下させるための蓋を含んでもよい。

好ましい実施形態では、カラムおよび容器は着脱可能に設計され、たとえば、カラムと容器が互いに取り付けられると摩擦力が加わるように、カラム２の縮小した外面は容器３の内面よりも小さい。上側セクション３が容器３に取り付けられると、カラム２の縮小した外面と、上側チャンバ２１のテーパ部２９と、カラム２の細長いチャネル２６とが容器チャンバ３１内に収容される。次いで、中心突出部３９が細長いチャネル２６の内部に収まり得る。

図４ｂは、上部３９１および下部３９２を有する中心突出部を含む容器３を示す。この実施形態では、上部は、細長いチャネル２６の下側開口部２７（図示せず）の内部に収まる直径を有するが、下部３９２の直径は、細長いチャネルの下側開口部の内部に収まらず、下側開口部の外側壁を支持する。下部３９２はそれによって、突出部３９が細長いチャネル２６を完全には充填しないことを確実にする保持装置として作用する。

図４ｃはカラム２および容器３を示しており、カラム２の細長いチャネル２６はマイクロビーズのマトリックス４１で充填されている。マイクロビーズマトリックス４１は、フィルタとして作用するマイクロビーズ４１１の１つのセクションを含む。容器３の中心突出部３９は、第１のセクションのマイクロビーズが細長いチャネル２６の下側開口部２７を通過しないようにする収縮手段として働く。

図４ｄは本発明に係るカラム２および容器３を示す。カラム２は図４ａについて説明したように提供され、上側チャンバ２１と、１つ以上の外側壁２２と、アンカー突出部２３と、上側開口部２４と、ピペットチャネル結合部２５と、テーパ部２９と、細長いチャネル２６と、下側開口部２７および蓋部２１０と、外側壁２１１と、接続ノッチ２１２と、内壁２１３およびスロット２１４とを含んでおり、図４ａについて説明したように、容器３は開口上端を含み、この開口上端を通って上側セクションの下部を入れることができ、容器３はさらに、容器チャンバ３１と、容器の１つ以上の外側壁３２と、フランジ３３と、底壁３５と、１つ以上の壁延長部３７とを含むが、中心突出部がない。そのような容器は、収縮手段を必要としない処理ステップに、または、狭窄手段が代替的な形態で、たとえばカラム２の下側開口部に位置付けられたマイクロビーズの第２のセクション、プラグ、もしくは多孔性フィルタとして設けられる処理ステップに、使用できる。容器３は図２に記載されるように設けられてもよい。特に、下側チャンバ３１の底端３４には、テーパ部を形成する１つ以上の底壁３５が設けられてもよい（すなわち、対向壁間の距離、または１つ以上の連続的な外側壁の対向側面間の距離は、下方向に進むにつれて小さくなる）。底端３４には、縮小した捕捉部３６が底壁３５の下端にさらに設けられてもよい（図示せず）。

図４ｅは、図４ｄに係るカラム２および容器を含む濾過ユニット１を示しており、カラム２が容器３の上に位置付けられている。容器が突出部を含んでいないので、カラム２の下側開口部は容器によって閉塞されず、むしろ容器３の壁に接触しない。

図５ａおよび図５ｂの例示的な方法では、図４ａ～図４ｅに係る濾過ユニットが適用される。図３ａ～図３ｃについて説明したように、循環腫瘍細胞、循環免疫細胞（ＣＩＣ）および／または微小塞栓を検出するための試料流体として２ｍｌの全血を使用できる。密度勾配遠心分離の後、次いでＲＢＣおよび重細胞を含む画分を、カラム２に含まれるマイクロビーズマトリックス４１の上に適用する。マイクロビーズマトリックスは、均一サイズのマイクロビーズの１つのセクションを含む。このセクションはフィルタとして作用する。マイクロビーズは約５０μｍの直径を有することによって約７．７μｍの有効隙間を形成することが好ましい。収縮手段として作用する容器３の突出部は、カラムの下側開口部を閉塞し、それによってマイクロビーズのセクションをカラム内に保持する。好ましくは、細長いチャネルの外側壁と突出部の外側壁との間に通路が形成され、これにより、液体が当該通路を通って容器チャンバに流れ込むことができる。そのような通路は、たとえば、１０～４０μｍ、好ましくは約２０μｍの幅を有してもよい。こうして、液体、およびより小さい粒子は、通路を通ってカラムから容器チャンバに流れ込むことができるが、より大きい粒子、特にこのサイズを超えるマイクロビーズは、カラム内に安定して位置付けられる。また、特に容器の突出部によってカラムの下側開口部が効果的に封止されるため、（粒子の第１の部分の分離後に）粒子の第２の部分と第１のセクションのマイクロビーズとを緩衝液に懸濁させる懸濁ステップが容易になる。

マイクロビーズのセクションによるカラム内の充填は、マイクロビーズ懸濁液（たとえば、水中または２０％エタノール中のマイクロビーズ）を上側開口部２４からカラム２内に連続的にピペッティングすることによって行なうことができる。次いで、気泡の形成を防ぐために、生体試料を適用する前に、セクションを遠心分離によって乾燥させ、たとえばＰＢＳなどの緩衝液で洗浄することができる。さらに、遠心分離によって高密度でコンパクトなマトリックスが得られる。充填は、同じ自動液体ハンドリングシステムによって行なうことができる。

図５ａのステップａ′において、密度勾配遠心分離後に任意に富化されて潜在的にＣＴＣ、ＣＩＣおよび／またはＣＴＭを含む生体試料８を、上側開口部２４からマイクロビーズマトリックス４１の上に、すなわち複数のマイクロビーズを含む第１のセクションの上に適用する。生体試料８はそれによってゆっくりとマイクロビーズマトリックスに入り、マイクロビーズの隙間直径よりも大きい生体粒子はマイクロビーズマトリックスの頂部に保持される。図５ａのステップｂ′において、濾過ユニット１の一部であり得、さらに容器３の上に位置付けられ得るカラム２を、試料に応じて５～２０ｇで２～５分間、好ましくは２～３分間遠心分離する。それによって、生体試料の粒子の第１の部分はマイクロビーズマトリックスを通り抜けて、下側開口部からカラムを出て、カラムの細長いチャネルの外側壁と容器の突出部との間に形成された通路を通り抜けることができる。原則として、粒子の第１の部分がセクションのマイクロビーズを通過できるようにするには重力で十分であろうが、遠心分離によって、この通過時間を大幅に短縮することができる。遠心分離後、生体試料の流体８１２、たとえば非標的粒子または生体粒子の富化時に使用される緩衝液と、１０μｍの臨界サイズ（すなわち、マイクロビーズセクションの隙間のサイズ）未満の直径またはサイズを有する粒子の第１の部分８１１とが、マイクロビーズマトリックス４１を通過して容器３に収集されるが、臨界値を超える粒子の第２の部分８１３は、マイクロビーズの有効隙間の上方にまたは内部に保持される。第２の部分のこれらの粒子は１０μｍを超えるサイズまたは直径を有しているため、マイクロビーズの隙間に捕捉される。

図５ａのステップｃ′において、容器３とカラム２とを分離する。臨界値未満の粒子の第１の部分８１１を含む容器３は、図３ａ、ステップａ″について説明したように、特に本発明に係る方法によって排出またはさらに処理することができる。

マイクロビーズマトリックス４１の隙間に捕捉された粒子の第２の部分は、本発明の方法に従ってさらに処理することができる。図５ａのステップｄ′において、マイクロビーズマトリックス４１と捕捉された生体粒子とを含む濾過ユニット１のカラム２を、たとえば２ｍｌのＰＢＳなどの緩衝液９で満たされている容器３′の上に移す。この場合、容器３′は、中心突出部を含んでいないが、カラムの細長いチャネルを収容するように形成されているため、カラム２が容器３′の上に位置付けられても細長いチャネルの下側開口部は容器３′のいずれの壁によっても閉塞されない。移すことは、特に、マイクロビーズマトリックスが実質的に乾燥しているときに行なうことができる。濾過ユニット１のカラム２の下側開口部２７は容器３′内の緩衝液に浸漬する（図５ｂ、ステップｅ′）。

図５ｂ、ステップｆ′に示すように、濾過マトリックスおよび捕捉された粒子は容器３′の容器チャンバに入ることができる。緩衝液をさらに、下側開口部２７を介してカラム２内に吸引し、ピペットチャネルで繰り返し分注することによって、マイクロビーズマトリックス４１が破壊されて下側開口部からカラムを出ることを確実にしてもよい。それによって、生体粒子および第１のセクションのマイクロビーズは、カラム２の下側開口部２７から容器３′の容器チャンバ３１に入って懸濁液を形成することができる。

次いで、空のカラムを容器から取り出す（ステップｇ′）。
試料からマイクロビーズを分離するステップｈ′における試料のさらなる処理は、図３ｂ、ステップｆについて上述したように行なうことができる。分離した粒子の第２の部分をマイクロビーズから新しい容器に移すステップｉにおける試料の処理は、図３ｂ、ステップｇについて上述したように行なうことができる。ステップｊ′においてたとえば遠心分離によって容器の底の粒子の第２の部分を濃縮することは、図３ｂ、ステップｈについて上述したように行なうことができる。ステップｋ′において上澄みを除去して粒子の第２の部分を適切な緩衝液に再懸濁させることは、図３ｂ、ステップｉおよびｊについて上述したように行なうことができる。最後に、図３ｃについて上述したようなプロセスステップｋ～ｍを行なうことができる。あるいは、図３ｂについて上記に説明したように、ステップｆの後、分離した粒子の第２の部分を、たとえば顕微鏡解析などの下流解析に直接移してもよい。

図６は、本発明の方法のための一般的なワークフローを示す。まず、マイクロビーズの少なくとも第１のセクションを含むカラムを提供する。次いで、生体試料を第１のセクションに適用し、試料中の粒子を互いに分離する。粒子の第１の部分は濾過マトリックスを通過してフロースルーで収集される。粒子の第２の部分は第１のセクションの隙間に残る。分離は重力または遠心力によって達成することができる。粒子の第１の部分は廃棄または回収することができる。収集した粒子の第１の部分をさらなるカラムの上に適用することができる。粒子の第２の部分を緩衝液に懸濁させる。懸濁液は、たとえば重力または遠心力によって収集することができる。以下では、粒子の第２の部分を、たとえば重力または遠心力によって第１のセクションのマイクロビーズから分離する。分離後、粒子を濃縮して解析してもよい。

本発明によれば、自動液体ハンドリングシステムは図６に示すようなワークフローを実行可能であってもよい。現代の検査機器は、たとえば、マトリックスを形成するマイクロビーズでカラムを充填し、生体試料でカラムを充填し、カラムをラックまたは遠心分離機内に位置付ける手段、液体試料を吸引するための手段、遠心分離のための手段などを含む。したがって、本発明によれば、非一時的なコンピュータ可読媒体上に記憶され、自動液体ハンドリングシステムの１つ以上のプロセッサによって実行されると本明細書に記載の実施形態のいずれかに係る方法を実行する命令を含む、コンピュータプログラムも提供され得る。たとえば、当該命令は図６に示すようなワークフローに従ってもよい。

図７は、本発明に係る方法を利用可能な健康診断手順を示す。第１のステップとして、がん患者から全血試料を採取し、本発明の方法に従って粒子を単離する。単離した粒子の細胞形態を画像化によって解析する。微小塞栓が検出された場合、ＮＡＡＴ（核酸増幅技術）またはＣＬＩＡ（化学発光イムノアッセイ）などのさらなるアッセイを行なって、検出された微小塞栓の転移能を検証する。

実施例
マイクロビーズのサイズ分布
市販のマイクロビーズのサイズ分布を定量化するために、平均直径２０μｍおよび３０μｍのシリカビーズを光学顕微鏡法により解析した。図８ａおよび図８ｂに示すように、画像化したいくつかのマイクロビーズ（完全に円形のマイクロビーズを仮定している）に対して画像解析を行ない、平均直径２０μｍのビーズについては直径約１μｍ～２．４μｍの偏差を示し、平均直径３０μｍのビーズについては最大４μｍの偏差を示した。

バフィーコートに対するフィルタ性能
マイクロビーズを支持する十字として形成された下側開口部を有する細長いチャネルを各々が含む４本のカラムを、３層からなるマイクロビーズマトリックスで各カラムを充填することによって準備した。すべてのカラムについて、最下層は５００μｍのサイズのマイクロビーズから形成し、中間層は２２０μｍのサイズのマイクロビーズから形成した。最上層のマイクロビーズのサイズは、４本のカラムについてそれぞれ２０μｍ（カラムＩＤ Ｗ１０３１－２０）、３０μｍ（カラムＩＤ Ｗ１０３１－３０）、４０μｍ（カラムＩＤ Ｗ１０３１－４０）および５０μｍ（カラムＩＤ Ｗ１０３１－５０）であり、それによって３．１μｍ、４．６μｍ、６．２μｍおよび７．７μｍの隙間サイズが提供された。

バフィーコートは、たとえばＥＤＴＡなどの抗凝固剤を用いて収集され、かつ４本の遠心分離管に分けられた、合計８ｍｌの全血の遠心分離（約３００ｇで１５分間）によって従来通りに調製した。これら４本の管から合計８４０μｌのバフィーコート層を吸引してプールした。２０μｌの試料を採取し、細胞含有量（白血球（ＷＢＣ）、赤血球（ＲＢＣ）、血小板（ＰＴＬ））をＳｙｓｍｅｘ ＸＳ－５００ｉシステムで解析した。残りの単離したバフィーコート層試料を４つの２００μｌのアリコートに分割し、各アリコートを上記に言及した４本のマイクロビーズマトリックスカラムの１本の上にピペッティングした。これら４本のカラムを２０ｇ未満で２分間遠心分離し、各フロースルーを収集してＳｙｓｍｅｘ ＸＳ－５００ｉシステムで解析した。これらのフロースルー試料は、バフィーコート層試料の粒子の第１の部分を含んでいた。遠心分離後、２００μｌの緩衝液（ＰＢＳ）を各マイクロビーズマトリックスの上にピペッティングし、分注および吸引を数回行なって、緩衝液中のマイクロビーズと粒子の第２の部分との懸濁液を形成した。懸濁液を４つの新しい容器に移し、マイクロビーズから粒子の第２の部分を分離するためにこれらの容器を５０ｇで３分間遠心分離した。粒子の第２の部分を含む上澄みから試料を採取し、続いてＳｙｓｍｅｘ ＸＳ－５００ｉシステムで解析した。

Ｓｙｓｍｅｘ ＸＳ－５００ｉ解析から得られた細胞濃度を表３にまとめる。

得られた処理前後の細胞濃度から導き出せるように、最上層に２０μｍのサイズのマイクロビーズを含むカラム（カラムＩＤ Ｗ１０３１－２０）は白血球および赤血球を首尾よく保持したが、より小さいサイズの血小板は有意な程度まで濾過して除去した。赤血球は、４．６μｍ、６．２μｍおよび７．７μｍの有効隙間を有するより大きいマイクロビーズを含むカラム（カラムＩＤ Ｗ１０３１－３０、Ｗ１０３１－４０、Ｗ１０３１－５０）によって保持されなかった。その一方で、白血球は、３０μｍおよび４０μｍのサイズのマイクロビーズを有するカラムによって一部が保持された。解析した細胞集団の平均サイズを考慮すると、これらの結果は、最上層内のマイクロビーズの平均直径が濾過プロセスのカットオフ値を決定することを示している。さらに、データは、変形して直径わずか３μｍの毛細管をくぐり抜けることができるＲＢＣ（たとえば、Jones et al., Measurement science in the circulatory system, Cell Mol Bioeng. 2014;7(1):1-14)）は２０μｍのサイズのマイクロビーズを有するマイクロビーズマトリックス内に依然として保持されて３．１μｍの隙間を提供することを示している。したがって、この方法は、一般に変形しやすい細胞を富化するのにも適している。

細胞サイズに関して細胞分布をさらに調べるために、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＳ－５００ｉ解析ツールにおいて、白血球群を好中球、リンパ球、単球および好塩基球に分解した。その結果を表４にまとめる。

表４の結果は、細胞集団に対するマイクロビーズマトリックスの濾過効率について、より差別化された考察を提供する。濾過効率は、ＷＢＣ群内のすべての細胞型について等しいわけではなく、むしろ、３０および４０μｍのサイズのマイクロビーズを有するカラムについて大きく変化する。好中球は８３％が、単球はさらに９６％が、３０μｍのサイズのマイクロビーズによって保持されるが、リンパ球および好塩基球はそれぞれ６６％および５７％しか保持されない。直径４０μｍのマイクロビーズを使用すると、これら４つの細胞型の濾過効率は２８％～６２％の範囲である。したがって、特定の直径のマイクロビーズを選択することによって、不均質な試料から一定の細胞集団を特異的に富化することができる。

表３および表４に記載されるような、バフィーコートおよび分離した血球の試料を、光学顕微鏡法によりさらに解析した。このプロセスのために、試料を新しい容器に移し、８０ｇで５分間遠心分離して上澄みを廃棄した。ペレット化した細胞を５０μｌの緩衝液（ＰＢＳ）に再懸濁させ、ロマノフスキー染色剤で染色し、２μｌの各試料を従来の顕微鏡カバースリップの上にピペッティングした。図９ａは、遠心分離によって全血試料から単離したバフィーコート試料の顕微鏡画像を示す。この試料は、サイズが不均質な細胞の分布を含む。図９ｂは、カラムＷ１０３１－２０の上にバフィコート試料を適用して遠心分離した後にフロースルーとして得られた試料の顕微鏡画像を示す。図９ｃは、カラムＷ１０３１－２０の捕捉された細胞とマイクロビーズマトリックスとを懸濁させて遠心分離した後に得られた試料の顕微鏡画像を示す。図９ｂと比較して、図９ｃでは有意量のより大きいサイズの細胞が観察され、それによって表３の結果を定性的に確認する。図９ｄは、カラムＷ１０３１－５０の上にバフィーコート試料を適用して遠心分離した後にフロースルーとして得られた試料の顕微鏡画像を示す。図９ｅは、カラムＷ１０３１－５０の捕捉された細胞とマイクロビーズマトリックスとを懸濁させて遠心分離した後に得られた試料の顕微鏡画像を示す。図９ｄと図９ｅを比較すると、５０μｍのサイズのマイクロビーズを有するカラムは小さな画分の細胞しか保持していないのに対して、大部分の細胞はフロースルー中に見出されることが明らかである。５０μｍのサイズのマイクロビーズを含むマトリックスによって保持された細胞を、それらのサイズに関してさらに解析した。図９ｆおよび図９ｇは、倍率を増大させたことを除いて、それぞれ図９ｄおよび図９ｅに従った顕微鏡画像を示す。丸で囲んだ細胞の直径を解析し（完全に円形の細胞を仮定している）、その結果を以下の表５に要約する。

これらのデータに基づいて、少なくとも、保持された部分におけるより大きい細胞に向かう傾向を導き出すことができる。

赤血球懸濁液に対するフィルタ性能
３層を有するマイクロビーズマトリックスを有するカラムを準備した。最上層は直径３０μｍのマイクロビーズからなり、中間層は直径２２０μｍのマイクロビーズズからなり、最下層は５００μｍのサイズのマイクロビーズから形成した。最上層の有効隙間直径は４．６μｍであった。

０．８％赤血球（ＲＢＣ）懸濁液をマイクロビーズマトリックスの上に添加し、カラムを２０ｇ未満で２分間遠心分離した。遠心分離後、カラムを光学顕微鏡下に置いて最上層を視覚化した（図１０ａ、図１０ｂ）。凝集したＲＢＣ（３～１０細胞）が最上層の隙間（矢印でラベル付けされた例示的なスポット）の内部に捕捉されることが観察された。

重要なことに、サイズが比較的一定であるＲＢＣおよび凝集したＲＢＣは、マイクロビーズマトリックスを循環腫瘍細胞などの他の標的細胞に最適化するための基準ラダーとして用いることができる。

Claims (22)

1. 生体試料から粒子を単離するための方法であって、
   － 上側開口部および下側開口部を有するカラムを提供するステップを備え、前記カラムは、第１の直径の第１の複数の実質的に非多孔性であるマイクロビーズを備える少なくとも第１のセクションを備え、前記第１の複数の実質的に非多孔性であるマイクロビーズは、前記第１の複数の実質的に非多孔性であるマイクロビーズが前記下側開口部を通過しないように前記カラム内に保持され、前記第１のセクションは、前記生体試料のフィルタとして作用する隣接した実質的に非多孔性であるマイクロビーズ同士の間の隙間を提供し、前記方法はさらに、
   － 前記生体試料を、前記カラムの前記上側開口部を通して前記第１のセクションの上に適用するステップと、
   － 前記生体試料の粒子の第１の部分を前記生体試料の粒子の第２の部分から分離するステップとを備え、前記生体試料の粒子の前記第１の部分は前記第１のセクションを通過し、前記第１のセクションは前記生体試料の粒子の前記第２の部分を保持し、保持された前記粒子の前記第２の部分は前記隙間の内部に捕捉され、前記方法はさらに、
   － 保持された前記生体試料の粒子の前記第２の部分と前記第１のセクションとを緩衝液に懸濁させて懸濁液を形成するステップと、
   － 懸濁した前記生体試料の粒子の前記第２の部分を懸濁した前記第１のセクションから分離するステップとを備える、方法。
2. 前記生体試料の粒子の前記第１の部分は、重力によってまたは遠心力の印加によって、前記生体試料の粒子の前記第２の部分から分離し、分離した前記生体試料の粒子の前記第１の部分は第１の容器に収集される、請求項１に記載の方法。
3. 懸濁した粒子の前記第２の部分は、重力によってまたは遠心力の印加によって、懸濁した前記第１のセクションから分離する、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記方法はさらに、
   － 分離した前記生体試料の粒子の前記第１の部分または前記第２の部分を濃縮するステップを備え、分離した前記生体試料の粒子の前記第１の部分または前記第２の部分を濃縮するために遠心力が印加される、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記マイクロビーズは実質的に非圧縮性であり、および実質的に非多孔性である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記第１の直径は、２０～７００μｍの範囲であるか、または１０ｎｍ～１μｍの範囲である、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記第１のセクションは懸濁可能である、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記上側開口部および下側開口部を有するカラムを提供するステップにおいて、前記第１の複数の実質的に非多孔性であるマイクロビーズは、前記下側開口部に位置付けられる収縮手段によって前記カラム内に保持される、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記収縮手段は、第２の直径の第２の複数のマイクロビーズを備える第２のセクションを備え、前記第１の直径は前記第２の直径よりも小さい、請求項８に記載の方法。
10. 前記収縮手段は取り外し可能なプラグを備え、および／または前記収縮手段は前記カラムの下に位置付けられる容器によって設けられ、前記収縮手段は前記容器の中心突出部であり、前記カラムの前記下側開口部に位置付けられ、前記突出部の少なくとも一部は前記カラムの内部に収まる、請求項８または９に記載の方法。
11. 前記中心突出部は少なくとも上部および下部を備え、前記上部は前記カラムの内部に収まり、前記下部は前記カラムの前記下側開口部の外側壁を支持し、および／または、
    細長いチャネルの外側壁と前記容器の前記中心突出部の外側壁との間に通路が形成され、これにより、液体が前記通路を通って容器チャンバに流れ込むことができ、前記通路は、１０～４０μｍの幅を有する、請求項１０に記載の方法。
12. － 前記懸濁液を吸引して前記懸濁液を第２の容器に移すことによって前記懸濁液を前記第２の容器に収集するステップをさらに備え、または、
    － 重力によってまたは遠心力の印加によって前記懸濁液を第２の容器に収集するステップをさらに備える、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記第１のセクションおよび前記第２のセクションは積層された層として設けられ、前記第１のセクションは最上層であり、
    前記カラムは複数のセクションを備え、前記複数のセクションのうちの２つは前記第１のセクションおよび前記第２のセクションであり、各セクションは特定の直径の複数の実質的に非多孔性であるマイクロビーズを備え、前記複数のセクション同士は少なくとも前記マイクロビーズの前記特定の直径が異なり、前記第１のセクションの前記第１の直径は最小直径を備え、
    前記複数のセクションは積層された層として設けられ、前記第１のセクションは最上層であり、前記複数のセクションの前記マイクロビーズの前記特定の直径は最上層から最下層に向かって徐々に増加する、請求項９に記載の方法。
14. 前記複数のセクションは３～７個のセクションを備える、請求項１３に記載の方法。
15. 前記方法は循環腫瘍細胞を単離するために使用され、前記第１の直径は８０～２００μｍの範囲であり、または、
    前記方法は循環微小塞栓を単離するために使用され、前記第１の直径は２００～６００μｍの範囲であり、または、
    前記方法は細胞外小胞を単離するために使用され、前記第１の直径は５０ｎｍ～５００ｎｍである、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 生体試料から粒子を単離するための自動液体ハンドリングシステムであって、
    － 上側開口部および下側開口部を有するカラムを提供するための手段を備え、前記カラムは、第１の直径の第１の複数の実質的に非多孔性であるマイクロビーズを備える少なくとも第１のセクションを備え、前記第１の複数の実質的に非多孔性であるマイクロビーズは、前記第１の複数の実質的に非多孔性であるマイクロビーズが前記下側開口部を通過しないように前記カラム内に保持され、前記第１のセクションは、前記生体試料のフィルタとして作用する隣接した実質的に非多孔性であるマイクロビーズ同士の間の隙間を提供し、前記システムはさらに、
    － 前記生体試料を、前記カラムの前記上側開口部を通して前記第１のセクションの上に適用するための手段と、
    － 前記生体試料の粒子の第１の部分を前記生体試料の粒子の第２の部分から分離するための手段とを備え、前記生体試料の粒子の前記第１の部分は前記第１のセクションを通過し、前記第１のセクションは前記生体試料の粒子の前記第２の部分を保持し、保持された粒子の前記第２の部分は前記隙間の内部に捕捉され、前記システムはさらに、
    － 保持された前記生体試料の粒子の前記第２の部分と前記第１のセクションとを緩衝液に懸濁させて懸濁液を形成するための手段と、
    － 懸濁した前記生体試料の粒子の前記第２の部分を懸濁した前記第１のセクションから分離するための手段とを備える、システム。
17. カラム（２）を備え、容器（３）をさらに備える濾過ユニット（１）であって、
    前記カラム（２）は生体試料から粒子を単離するための方法で使用されるように適合され、前記カラム（２）は、
    － 前記生体試料を受けるための上側チャンバ（２１）を備え、前記上側チャンバはその外側面が１つ以上の外側カラム壁（２２）によって規定され、前記外側カラム壁はその下端においてテーパ部（２９）内に延び、前記カラムはさらに、
    － 前記テーパ部（２９）から下側開口部（２７）まで下方に延びる細長いチャネル（２６）を備え、
    － 前記細長いチャネル（２６）は、第１の直径の第１の複数の実質的に非多孔性であるマイクロビーズを備える少なくとも第１のセクションで少なくとも部分的に充填され、前記第１の複数の実質的に非多孔性であるマイクロビーズは、第１の複数の実質的に非多孔性であるマイクロビーズが前記下側開口部を通過しないように前記カラム内に保持され、前記第１のセクションは、前記生体試料のフィルタとして作用する隣接した実質的に非多孔性であるマイクロビーズ同士の間の隙間を提供し、これによって粒子が前記隙間の内部に捕捉され、
    前記容器（３）は、前記生体試料の一部またはすべてを受けるための容器チャンバ（３１）を備え、前記容器チャンバはその外側面が１つ以上の外側容器壁（３２）によって規定され、前記容器は、前記カラム（２）が前記容器の上に載置されると、前記カラム（２）の前記細長いチャネル（２６）が前記容器チャンバ（３１）の内部に突き出るように配置される、濾過ユニット。
18. 前記カラムは前記上側チャンバ（２１）を封止するために蓋部（２１０）をさらに備え、前記蓋部は上側開口部（２４）を備え、前記上側開口部を通して前記生体試料が受けられる、請求項１７に記載の濾過ユニット。
19. 前記第１の複数のマイクロビーズを前記カラム内に保持するために、前記細長いチャネル（２６）の前記下側開口部（２７）に収縮手段が位置付けられ、前記収縮手段は、第２の直径の第２の複数の実質的に非多孔性であるマイクロビーズを備える第２のセクションを備え、前記第１の直径は前記第２の直径よりも小さい、請求項１７または１８に記載の濾過ユニット。
20. 前記収縮手段は、前記第２のセクションを保持する前記下側開口部の十字形の端部をさらに備え、または、前記収縮手段は多孔性フィルタを備える、請求項１９に記載の濾過ユニット。
21. 前記容器は、前記カラム（２）の前記細長いチャネル（２６）の前記下側開口部（２７）に位置付けられる収縮手段として中心突出部（３９）を備え、前記突出部の少なくとも一部は前記カラム（２）の前記細長いチャネル（２６）の内部に収まる、請求項１７から１９のいずれか１項に記載の濾過ユニット。
22. 前記中心突出部は少なくとも上部（３９１）および下部（３９２）を備え、前記上部（３９１）は前記カラム（２）の前記細長いチャネル（２６）の内部に収まり、前記下部（３９２）は前記細長いチャネル（２６）の前記下側開口部の外側壁を支持し、および／または、
    前記細長いチャネルの外側壁と前記容器の前記中心突出部の外側壁との間に通路が形成され、これにより、液体が前記通路を通って前記容器チャンバに流れ込むことができ、前記通路は、１０～４０μｍの幅を有する、請求項２１に記載の濾過ユニット。

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