JP7114697B2 - リパーゼを含む洗剤組成物 - Google Patents

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Description

（配列表の参照）
本出願は、参照によって本明細書に組み込まれる、コンピュータで読み取り可能な形式の配列表を含む。
（発明の分野）
本発明は、リパーゼ酵素を含む、洗剤組成物及び洗剤組成物を含む水溶性単位用量物品、並びにこのような組成物の製造方法及び使用方法に関する。本発明はまた、リパーゼ変異体がマイクロカプセルに封入される、液体製品、洗剤組成物、及び洗剤組成物を含む水溶性単位用量物品にも関する。このような組成物及び物品は、好ましくは布地ケア及びホームケア製品であり、最も好ましくは洗濯用である。
洗剤製造業者は、最も堅牢な洗浄系を提供する洗浄組成物、特に布地及び食器洗浄組成物を提供しようとし続けている。リパーゼは、トリグリセリドを加水分解して脂肪酸を生成することによって油汚れ及び染みの除去に寄与する洗剤組成物において非常に有用であることが示されている、重要な生物触媒である。加水分解後、加水分解された汚れは、他の洗剤成分の存在下で洗浄プロセス中の布地表面からより容易に除去される。多くの既知のリパーゼは、良好な洗浄性能を提供するが、洗浄中に臭気発生短鎖脂肪酸を形成しやすく、かつ／又は保存安定性が短い場合もある。
安定性は、例えば、洗剤組成物の不適合な成分と接触しているとき、あるいは保存中又は洗浄若しくは処理工程中のいずれかの周囲温度よりも著しく高い又は低い温度に曝露されるときに、特に問題となり得る。安定性が十分に堅牢ではない場合、これは、組成物全体の活性又は有効性の損失、特に酵素活性の損失をもたらす。商品名ＬＩＰＯＬＡＳＥ（商標）で販売されている野生型サーモマイセス・ラヌギノサス（Thermomyces lanuginosus）（同義語フミコーラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa））リパーゼ及びその変異体は、トリグリセリドを加水分解して脂肪酸を生成することによって脂質の染みを除去するための洗剤組成物中の活性成分として商品化されている。しかし、良好な洗浄性能、臭気発生の低減、及び／又は保存安定性の改善／より長い保存寿命／熱安定性の増大をもたらすリパーゼを含む組成物の必要性が依然として存在する。
本発明は、変異体がリパーゼ活性を有する親リパーゼの変異体を含む洗剤組成物に関し、当該変異体は、配列番号２と少なくとも６０％であるが１００％未満の配列同一性を有し、かつ（ｉ）位置４０、１１８、Ｔ２４４Ｅ及びＶ６０Ｅに対応する位置に１つ以上の置換、並びに（ｉｉ）Ｔ２３１Ｒ及びＮ２３３Ｒ．に対応する位置に１つ以上の置換を含む。好ましくは、リパーゼ変異体は、位置４０及び１１８の両方に対応する位置に置換、より好ましくはＡ４０Ｉ及びＲ１１８Ｆに対応する位置に１つ以上の置換を含む。
本発明はまた、変異体がリパーゼ活性を有する親リパーゼの変異体であって、配列番号２と少なくとも６０％であるが１００％未満の配列同一性を有し、Ｇ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｆ５１Ｉ，Ｌ、Ｅ５６Ｒ、Ｄ５７Ｎ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｋ９８Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｒ１１８Ｆ、Ｇ１６３Ｓ、Ｔ２３１Ｒ、Ｎ２３３Ｒ、Ｙ２２０Ｆ、Ｔ２４４Ｅ、及びＰ２５６Ｔに対応する位置に１つ以上の置換を含む、変異体と、洗剤補助剤とを含む洗剤組成物に関する。好ましくは、洗剤組成物は、液体の形態であり、好ましくは２０重量％未満の水を含む。
更なる態様では、本発明はまた、変異体がリパーゼ活性を有する親リパーゼの変異体を含む洗剤組成物にも関し、当該変異体は、配列番号２と少なくとも６０％であるが１００％未満の配列同一性を有し、かつ（ｉ）位置２３、５１、及び５６に対応する位置における１つ以上の置換、好ましくはＧ２３Ｓ、Ｆ５１Ｉ，Ｌ、及びＥ５６Ｒに対応する位置に１つ以上の置換、並びに（ｉｉ）Ｔ２３１Ｒ及びＮ２３３Ｒに対応する位置に１つ以上の置換、好ましくは（ｉｉｉ）２７、４０、５７、６０、９８、１０１、１１８、１６３、２２０、２４４、及び２５６に対応する位置に１つ以上の置換、好ましくは、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｄ５７Ｎ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｋ９８Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｒ１１８Ｆ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、Ｔ２４４Ｅ、及びＰ２５６Ｔに対応する位置に１つ以上の置換を含む。
本発明はまた、水溶性フィルムと、上述のリパーゼ変異体及び洗剤補助剤を含む洗剤組成物とを含む、水溶性単位用量物品も提供する。リパーゼ変異体は、液体組成物中又は固体組成物中の水溶性単位用量物品に存在してもよい。好ましくは、リパーゼ変異体を含む洗剤組成物は、液体組成物である。
本発明はまた、リパーゼ変異体を含む洗剤組成物の製造方法にも関し、この方法は、洗剤補助剤及びリパーゼ変異体を混合して洗剤組成物を形成する第１の工程を含む。好ましくは、洗剤組成物は、次いで、任意追加的に、洗剤組成物をフィルム、好ましくは水溶性フィルムに包むことによって、単位用量形態に形成される。リパーゼ変異体は、好ましくは、２０重量％未満の水を含む組成物中の、本明細書の洗剤組成物中に存在する。水溶性単位用量物品は、１つの区画又は２つ以上の区画を含んでもよい。水溶性単位用量物品は、１つ以上の区画、最も好ましくは多区画単位用量洗剤の１つの区画にリパーゼ変異体を含む。
本発明は、
（ｉ）水と、本明細書に記載の洗浄組成物とを含む水性洗浄液を形成する工程と、
（ｉｉ）（ｉｉ）表面を水性洗浄液で、好ましくは６０℃以下、又は好ましくは４０℃以下、又は好ましくは３０℃以下の温度で処理する工程と、
（ｉｉｉ）（ｉｉｉ）表面をすすぐ工程と、を含む、布地を洗浄するための方法にも関する。好ましい方法では、本発明による水溶性単位用量物品を、水溶性フィルムを溶解し、洗濯洗剤組成物を好ましくは３００～３０００倍希釈するのに十分な水と合わせて、水性洗浄液を形成する。
好ましくは、リパーゼ変異体は、配列番号２と少なくとも６０％であるが１００％未満の配列同一性を有し、Ｇ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｆ５１Ｉ，Ｌ、Ｅ５６Ｒ、Ｄ５７Ｎ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｋ９８Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｒ１１８Ｆ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、Ｔ２４４Ｅ、及びＰ２５６Ｔに対応する位置に１つ以上の置換、並びにＴ２３１Ｒ及びＮ２３３Ｒに対応する位置に１つ又は好ましくは両方の置換を含む。
好ましい変異体は、Ｆ５１Ｉ，Ｌに対応する位置に置換を含む。好ましい変異体は、Ｅ５６Ｒに対応する位置に置換を含む。好ましい変異体は、Ｒ１１８Ｆに対応する位置に置換を含む。好ましい変異体は、Ｆ５１Ｉ，Ｌ、Ｅ５６Ｒ、及び／又はＲ１１８Ｆに対応する位置に１つ以上の置換を含む。好ましい変異体は、Ｐ２５６Ｔに対応する位置に置換を含む。好ましい変異体は、Ｄ２７Ｎに対応する位置に置換を含む。好ましい変異体は、Ｇ２３Ｓに対応する位置に置換を含む。好ましい変異体は、Ｔ２４４Ｅに対応する位置に置換を含む。好ましい変異体は、Ａ４０Ｉに対応する位置に置換を含む。好ましい変異体は、Ｋ９８Ｉに対応する位置に置換を含む。好ましい変異体は、Ｄ５７Ｎに対応する位置に置換を含む。好ましい変異体は、Ｙ２２０Ｆに対応する位置に置換を含む。好ましい変異体は、Ｇ１６３Ｓに対応する位置に置換を含む。
一態様では、本発明は、リパーゼ酵素、好ましくはリパーゼ変異体を含む洗剤組成物に関し、このリパーゼ変異体は、マイクロカプセルに封入されている。１つの好ましい態様によれば、マイクロカプセルの膜は、１ｋＤａを超える分子量を有する多分岐ポリアミンの架橋によって産生される。更なる態様では、洗剤組成物は、好ましくは、膜によって形成された区画に封入される、本発明のリパーゼ変異体を含むマイクロカプセル組成物を含み、この膜は、（ａ）８００Ｄａを超える分子量を有する多分岐ポリアミン、及び（ｂ）３００Ｄａ未満の分子量を有する脂肪族又は芳香族アミンの架橋により産生され、（ａ）／（ｂ）の重量比は、０．１～１０００の範囲である。
リパーゼ：用語「リパーゼ」、「リパーゼ酵素」、「脂肪分解酵素」、「脂質エステラーゼ」、「脂肪分解ポリペプチド」、及び「脂肪分解タンパク質」は、酵素命名法により定義されるＥＣ３．１．１クラスの酵素を指す。これは、リパーゼ活性（トリアシルグリセロールリパーゼ、ＥＣ３．１．１．３）、クチナーゼ活性（ＥＣ３．１．１．７４）、ステロールエステラーゼ活性（ＥＣ３．１．１．１３）、及び／又はワックス－エステルヒドロラーゼ活性（ＥＣ３．１．１．５０）を有し得る。本発明の目的では、リパーゼ活性は、実施例に記載の手順に従って決定される。一態様では、本発明の変異体は、配列番号２のポリペプチドのリパーゼ活性の少なくとも２０％、例えば、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％を有する。
一態様では、本発明は、水溶性フィルムと、リパーゼ変異体を含む洗剤組成物と、マイクロカプセル組成物を含む洗剤補助剤と、を含む水溶性単位用量物品に関し、マイクロカプセルの膜は、１ｋＤａを超える分子量を有する多分岐ポリアミンを架橋することにより産生され、マイクロカプセルは、本発明のリパーゼ変異体を含む。
対立遺伝子変異体：用語「対立遺伝子変異体」とは、同じ染色体座を占める遺伝子の２つ以上の代替形態のうちのいずれかを意味する。対立遺伝子変異は、突然変異によって自然発生し、個体群内の多形性をもたらし得る。遺伝子の突然変異はサイレント（コード化されたポリペプチドが変化しない）であり得、改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコード化されたポリペプチドである。
ｃＤＮＡ：用語「ｃＤＮＡ」は、真核細胞又は原核細胞から得られる成熟したスプライシングされたｍＲＮＡ分子からの逆転写によって調製できるＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に存在し得るイントロン配列を欠く。初期の一次ＲＮＡ転写物は、スプライシングされた成熟ｍＲＮＡとして現れる前に、スプライシングを含む一連のプロセシングをとおして加工されるｍＲＮＡの前駆体である。
コード配列：用語「コード配列」は、ポリヌクレオチドであって、変異体のアミノ酸配列を直接特定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般にオープンリーディングフレームで決定され、ＡＴＧ、ＧＴＧ、又はＴＴＧなどの開始コドンで開始し、ＴＡＡ、ＴＡＧ、又はＴＧＡなどの終止コドンで終了する。コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はこれらの組み合わせであり得る。
制御配列：用語「制御配列」は、本発明の変異体をコードしているポリヌクレオチドの発現に必要な核酸配列を意味する。各制御配列は、変異体をコードしているポリヌクレオチドに対してネイティブ（すなわち、同じ遺伝子に由来する）であっても外来（すなわち、異なる遺伝子に由来する）であってもよく、又は互いに対してネイティブであっても外来であってもよい。このような制御配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネータが挙げられるが、これらに限定されない。制御配列は、最低限、プロモータと、転写及び翻訳終止シグナルとを含む。制御配列は、制御配列と変異体をコードしているポリヌクレオチドのコード領域とのライゲーションを促進する特異的制限酵素部位を導入する目的のためのリンカーを備えていてもよい。
洗剤補助剤：所望の特定の種類の洗剤組成物及び製品形態（例えば、液体、顆粒、粉末、バー、ペースト、スプレー、錠剤、ゲル、又は発泡性組成物）のために選択される任意の液体、固体、又は気体状の材料を意味する。
洗剤組成物：用語「洗剤組成物」及び「洗剤配合物」は、汚れた対象を洗浄するための洗浄プロセスにおいて使用することを意図する混合物に関連して使用される。この用語は、特に、布地及び／又は衣類の洗濯に関連して使用される（例えば、「洗濯洗剤」）。特記しない限り、これらには、顆粒又は粉末形態の汎用又は強力洗浄剤、特に洗浄洗剤；液体、ゲル、又はペースト形態の汎用洗浄剤、特にいわゆる強力液体（ＨＤＬ）タイプのもの；繊細な布地用の液体洗剤；食器手洗い用洗剤又は軽作業用食器用洗剤、特に高発泡タイプのもの；食器洗浄機用洗剤（家庭用及び業務用の、様々なタブレット、顆粒、液体、及びすすぎ補助タイプのものを含む）；液体洗浄及び消毒剤、並びに、漂白用補助剤、及び「染み抜きスティック」又は前処理タイプ等の洗浄補助剤が含まれ得る。別の態様では、この用語は、例えば、食器、カトラリー等を洗浄するために使用されるもの（例えば「食器洗浄洗剤」）等の他の洗剤を指す。用語「洗剤組成物」は、界面活性剤を含有する組成物に限定されることを意図しない。本発明に不可欠な変異体に加えて、この用語は、任意の洗剤補助剤、例えば、界面活性剤、ビルダー、キレート剤又はキレート化剤、漂白系又は漂白成分、ポリマー、布地柔軟剤、起泡増進剤、発泡抑制剤、染料、香料、変色防止剤、蛍光増白剤、殺菌剤、抗かび剤、汚れ懸濁剤、防食剤、酵素阻害剤又は安定剤、酵素活性化剤、トランスフェラーゼ（複数可）、加水分解酵素、酸化還元剤、青味剤及び蛍光染料、酸化防止剤、可溶化剤、並びに溶媒を含有し得る洗剤を包含することを意図する。また、洗剤組成物は、洗浄工程又は布地処理工程のいずれかで布地処理に使用してもよく、例えば、布地フレッシュニング、布地柔軟化、及び／又は色再生工程を提供することができる。本明細書の洗剤組成物は、特に水溶性単位用量物品に含まれる。
発現：用語「発現」は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌が挙げられるがこれらに限定されない、変異体の産生に含まれる任意の工程を含む。
発現ベクター：用語「発現ベクター」は、変異体をコードしているポリヌクレオチドを含む直鎖又は環状のＤＮＡ分子を意味し、それを発現させる制御配列に操作可能に連結している。
フラグメント：用語「フラグメント」は、ポリペプチドのアミノ及び／又はカルボキシル末端から１つ以上の（例えば、いくつかの）アミノ酸が欠失したポリペプチドを意味し、このフラグメントは、リパーゼ活性を有する。一態様では、フラグメントは、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％であるが１００％未満の配列番号２のアミノ酸１～２６９の数を含有する。
高ストリンジェンシー条件：用語「高ストリンジェンシー条件」は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、標準的なサザンブロッティング手順に従って１２～２４時間、５Ｘ ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌの剪断及び変性されたサケ精子ＤＮＡ、並びに５０％ホルムアミドにおける４２℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを意味する。最後に、２Ｘ ＳＳＣ、６５℃の０．２％ ＳＤＳを使用して、担体材料をそれぞれ１５分間３回洗浄する。
宿主細胞：用語「宿主細胞」とは、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト又は発現ベクターを用いて形質転換、トランスフェクション、形質導入等をしやすい任意の細胞型を意味する。用語「宿主細胞」は、複製中に生じた突然変異に起因する、親細胞とは同一ではない親細胞の任意の後代を包含する。
改善された特性：用語「改善された特性」は、親リパーゼと比較して改善される変異体に関連する特性を意味する。このような改善された特性としては、洗剤安定性、プロテアーゼが存在する洗剤における安定性、プロテアーゼ安定性、化学安定性、酸化安定性、ｐＨ安定性、保存条件下での安定性、及び熱安定性が挙げられるが、これらに限定されない。
単離された：用語「単離された」は、自然に発生しない形態又は環境中の物質を意味する。単離された物質の非限定的な例としては、（１）天然に発生しない任意の物質、（２）天然に関連付けられる自然発生の構成成分の１つ以上若しくは全てから少なくとも部分的に除去された、任意の酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチド、若しくは補因子を含むが、これらに限定されない任意の物質、（３）天然に見出される物質に対して、人為的に修飾された任意の物質、又は（４）天然に関連付けられる他の成分に対して、物質の量を増加させることによって（例えば、物質をコードする遺伝子の複数のコピー；物質をコードしている遺伝子に天然に関連付けられるプロモータよりも強力なプロモータの使用）修飾された任意の物質、を含む。単離された物質は、発酵ブロス試料中に存在してもよい。
低ストリンジェンシー条件：用語「低ストリンジェンシー条件」は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、標準的なサザンブロッティング手順に従って１２～２４時間、５Ｘ ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌの剪断及び変性されたサケ精子ＤＮＡ、並びに２５％ホルムアミドにおける４２℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを意味する。最後に、２Ｘ ＳＳＣ、５０℃の０．２％ ＳＤＳを使用して、担体材料をそれぞれ１５分間３回洗浄する。
成熟ポリペプチド：用語「成熟ポリペプチド」は、翻訳、及びＮ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化等の任意の翻訳後修飾の後の最終形態のポリペプチドを意味する。一態様では、成熟ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１～２６９である。宿主細胞が、同一のポリヌクレオチドによって発現される２つ以上の異なる成熟ポリペプチド（すなわち、異なるＣ末端及び／又はＮ末端アミノ酸を有する）の混合物を産生し得ることが当該技術分野において知られている。
成熟ポリペプチドコード配列：用語「成熟ポリペプチドコード配列」は、リパーゼ活性を有する成熟ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを意味する。一態様において、成熟ポリペプチドコード配列は、配列番号１のヌクレオチド１～８０７である。
中程度のストリンジェンシー条件：用語「中程度のストリンジェンシー条件」は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、標準的なサザンブロッティング手順に従って１２～２４時間、５Ｘ ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌの剪断及び変性されたサケ精子ＤＮＡ、並びに３５％ホルムアミドにおける４２℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを意味する。最後に、２Ｘ ＳＳＣ、５５℃の０．２％ ＳＤＳを使用して、担体材料をそれぞれ１５分間３回洗浄する。
中高度のストリンジェンシー条件：用語「中高度のストリンジェンシー条件」は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、標準的なサザンブロッティング手順に従って１２～２４時間、５Ｘ ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌの剪断及び変性されたサケ精子ＤＮＡ、並びに３５％ホルムアミドにおける４２℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを意味する。最後に、２Ｘ ＳＳＣ、６０℃の０．２％ ＳＤＳを使用して、担体材料をそれぞれ１５分間３回洗浄する。
突然変異体：用語「突然変異体」は、変異体をコードするポリヌクレオチドを意味する。
核酸コンストラクト：用語「核酸コンストラクト」は、天然に存在する遺伝子から単離されたか若しくは修飾しなければ自然界には存在しない様式で核酸のセグメントを含有するように修飾された、又は合成である、１つ以上の制御配列を含有する、一本鎖又は二本鎖のいずれかである核酸分子を意味する。
操作可能に連結される：用語「操作可能に連結される」は、制御配列がコード配列の発現を指示するように、ポリヌクレオチドのコード配列に対して適切な位置に制御配列が配置される構成を意味する。
親又は親リパーゼ：用語「親」又は「親リパーゼ」は、本発明の酵素変異体を産生するために改変がなされるリパーゼを意味する。親リパーゼは、天然に存在する（野生型）ポリペプチド又はその変異体若しくはフラグメントであり得る。
配列同一性：２つのアミノ酸配列間、又は２つのヌクレオチド配列間の関連性は、パラメータ「配列同一性」によって表される。
本発明の目的では、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実施されるようなＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）、好ましくはバージョン５．０．０又はそれ以降を用いて決定される。用いられるパラメータは、ギャップ開始ペナルティが１０、ギャップ伸長ペナルティが０．５、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性（longest identity）」と表示されたＮｅｅｄｌｅの出力（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）を同一率として用い、これは以下のように計算される。
（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント中のギャップの総数）
本発明の目的では、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅら、２０００、上記参照）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実施されるようなＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０、上記参照）、好ましくはバージョン５．０．０又はそれ以降を用いて決定される。用いられるパラメータは、ギャップ開始ペナルティが１０、ギャップ伸長ペナルティが０．５、及びＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＥＭＢＯＳＳバージョンＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４）置換マトリックスである。「最長同一性（longest identity）」と表示されたＮｅｅｄｌｅの出力（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）を同一率として用い、これは以下のように計算される。
（同一デオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント中のギャップの総数）
安定性：本発明のリパーゼ変異体の安定性は、例えば、様々な試験条件、例えば、洗剤組成物中での保存、様々な温度で、様々なｐＨで、プロテアーゼ、化学物質、及び／又は酸化物質（ストレス条件）などの異なる成分の存在下などへの曝露中若しくは曝露後の、又は洗浄プロセスでの使用中の、当該リパーゼの残留活性又は残留性能として表すことができる。リパーゼ変異体の安定性は、親リパーゼ、例えば、配列番号２として示されるリパーゼの既知の活性若しくは性能、又は代替的に、任意追加的に冷蔵若しくは冷凍保存された洗剤組成物に最初に添加されたときのリパーゼ変異体の既知の活性若しくは性能に対して、又は冷蔵若しくは冷凍保存されたリパーゼ変異体（非ストレス条件）に対して測定され得る。
サブシークエンス：用語「サブシークエンス」は、成熟ポリペプチドコード配列の５’及び／又は３’末端から欠失した１つ以上の（例えば、いくつかの）ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを意味し、このサブシークエンスは、リパーゼ活性を有するフラグメントをコードする。一態様では、サブシークエンスは、配列番号１のヌクレオチドの数１～８０７のうちの少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％であるが１００％未満を含有する。
変異体：用語「変異体」は、１つ以上の（例えば、いくつかの）位置において改変、すなわち、置換、挿入、及び／又は欠失を含む、リパーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。置換は、ある位置を占有するアミノ酸を異なるアミノ酸で置き換えることを意味し、欠失は、ある位置を占有するアミノ酸の除去を意味し、挿入は、ある位置を占有するアミノ酸に隣接させ、その直後に、アミノ酸を付加することを意味する。本発明の変異体は、配列番号２のポリペプチドのリパーゼ活性の少なくとも２０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％を有する。
非常に高いストリンジェンシー条件：用語「非常に高いストリンジェンシー条件」は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、標準的なサザンブロッティング手順に従って１２～２４時間、５Ｘ ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌの剪断及び変性されたサケ精子ＤＮＡ、並びに５０％ホルムアミドにおける４２℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを意味する。最後に、２Ｘ ＳＳＣ、７０℃の０．２％ ＳＤＳを使用して、担体材料をそれぞれ１５分間３回洗浄する。
非常に低いストリンジェンシー条件：用語「非常に低いストリンジェンシー条件」は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、標準的なサザンブロッティング手順に従って１２～２４時間、５Ｘ ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌの剪断及び変性されたサケ精子ＤＮＡ、並びに２５％ホルムアミドにおける４２℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを意味する。最後に、２Ｘ ＳＳＣ、４５℃の０．２％ ＳＤＳを使用して、担体材料をそれぞれ１５分間３回洗浄する。
野生型リパーゼ：用語「野生型」リパーゼは、自然界に見られる細菌、酵母、又は糸状菌などの自然発生微生物によって発現されるリパーゼを意味する。
変異体指定の取り決め
本発明の目的では、配列番号２として開示されるポリペプチドは、別のリパーゼ中の対応するアミノ酸残基を決定するのに使用される。別のリパーゼのアミノ酸配列を配列番号２とアラインメントし、そのアラインメントに基づいて、配列番号２に開示されているポリペプチド中の任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号を、例えば、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）の好ましくはバージョン５．０．０以上のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実施される、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を使用して決定する。用いられるパラメータは、ギャップ開始ペナルティが１０、ギャップ伸長ペナルティが０．５、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。
別のリパーゼ中の対応するアミノ酸残基の同定は、限定するものではないが、ＭＵＳＣＬＥ（ｌｏｇ予測による多重配列比較；バージョン３．５以上；Ｅｄｇａｒ，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：１７９２－１７９７）、ＭＡＦＦＴ（バージョン６．８５７以上；Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｋｕｍａ，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０：３０５９－３０６６；Ｋａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３：５１１－５１８；Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｔｏｈ，２００７，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３：３７２－３７４；Ｋａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５３７：３９－６４；Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｔｏｈ，２０１０，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６：１８９９－１９００）、及びＣｌｕｓｔａｌＷ（１．８３以上Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：４６７３－４６８０）を使用するＥＭＢＯＳＳ ＥＭＭＡ、を含むいくつかのコンピュータプログラムを使用して、複数のポリペプチド配列をアラインメントすることにより、決定することができる。
他の酵素が配列番号２のポリペプチドから分岐しており、その結果、従来の配列に基づく比較がこれらの関係を検出できないとき（Ｌｉｎｄａｈｌ ａｎｄ Ｅｌｏｆｓｓｏｎ，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９５：６１３－６１５）、他のペアワイズ配列比較アルゴリズムを使用してもよい。データベースを検索するためにポリペプチドファミリーの確率的表現（プロファイル）を利用するサーチプログラムを使用して、配列に基づく検索においてより大きな感度を得ることができる。例えば、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴプログラムは、反復データベース検索プロセスをとおしてプロファイルを作成し、遠縁ホモログを検出することができる（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）。ポリペプチドのファミリー又はスーパーファミリーが、タンパク質構造データベースにおいて１つ以上の表現を有する場合、更に大きな感度を得ることができる。ＧｅｎＴＨＲＥＡＤＥＲ（Ｊｏｎｅｓ，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：７９７－８１５；ＭｃＧｕｆｆｉｎ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，２００３，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １９：８７４－８８１）などのプログラムは、クエリー配列の構造的折り畳みを予測するニューラルネットワークへのインプットとして、様々な情報源（ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ、二次構造予測、構造的アラインメントプロファイル、及び溶媒和物電位）からの情報を利用する。同様に、Ｇｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１３：９０３－９１９の方法を使用して、未知の構造の配列を、ＳＣＯＰデータベース中に存在するスーパーファミリーのモデルとアラインメントすることができる。次に、これらアラインメントを、ポリペプチドのホモロジーモデルを作成するために使用することができ、その目的のために開発された様々なツールを使用して、このようなモデルを精度について評価することができる。
既知の構造のタンパク質については、構造的アラインメントを検索し、作成するために、いくつかのツール及び情報源を利用可能である。例えば、タンパク質のＳＣＯＰスーパーファミリーは、構造的にアラインメントされており、これらのアラインメントは、アクセス可能であり、ダウンロード可能である。ディスタンスアラインメントマトリクス（Ｈｏｌｍ ａｎｄ Ｓａｎｄｅｒ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ３３：８８－９６）又はコンビナトリアルエクステンション（Ｓｈｉｎｄｙａｌｏｖ ａｎｄ Ｂｏｕｒｎｅ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：７３９－７４７）などの様々なアルゴリズムを使用して２つ以上のタンパク質構造体をアラインメントすることができ、これらアルゴリズムの実行は、更に、可能性のある構造的ホモログを見つけるために、対象構造について構造データベースにクエリーを行うために利用することができる（例えば、Ｈｏｌｍ ａｎｄ Ｐａｒｋ，２０００，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １６：５６６－５６７）。
本発明の変異体の記載においては、参照し易くするために下記命名法を適応する。一般に認められているＩＵＰＡＣの１文字又は３文字アミノ酸略記を用いる。
置換。アミノ酸置換に関しては、次の命名法、すなわち、元のアミノ酸、位置、置換アミノ酸、が使用される。したがって、位置２２６におけるスレオニンのアラニンでの置換は、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」又は「Ｔ２２６Ａ」と表される。複数の突然変異は、マーク（「＋」）を付加することによって区切られ、例えば、「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」若しくは「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」は、位置２０５及び４１１において、それぞれ、グリシン（Ｇ）をアルギン（Ｒ）で、及びセリン（Ｓ）をフェニルアラニン（Ｆ）で置換することを表す。
欠失。アミノ酸欠失に関しては、次の命名法、すなわち、元のアミノ酸、位置、アルタリスク（＊）が使用される。したがって、位置１９５におけるグリシンの欠失は、「Ｇｌｙ１９５＊」又は「Ｇ１９５＊」と表される。複数の欠失は、付加マーク（「＋」）によって区切られ、例えば、「Ｇｌｙ１９５＊＋Ｓｅｒ４１１＊」又は「Ｇ１９５＊＋Ｓ４１１＊」と表される。
挿入。アミノ酸挿入に関しては、次の命名法、すなわち、元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸、が使用される。したがって、位置１９５におけるグリシンの後のリジンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ」又は「Ｇ１９５ＧＫ」と表される。複数のアミノ酸の挿入は、［元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸＃１、挿入されたアミノ酸＃２；など］と表される。例えば、位置１９５におけるグリシンの後のリジン及びアラニンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａ」又は「Ｇ１９５ＧＫＡ」と表される。
このような場合、挿入されるアミノ酸残基（複数可）は、挿入されるアミノ酸残基（複数可）に先行するアミノ酸残基の位置番号に小文字を付加することによって付番される。上記の例では、配列は、以下のようになり得る：
Figure 0007114697000001
複数の改変。複数の改変を含む変異体は、更なる記号（「＋」）を付加することにより区切られ、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ」又は「Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ」は、それぞれ、位置１７０及び１９５におけるアルギニン及びグリシンのチロシン及びグルタミン酸での置換を表す。
異なる改変。異なる改変がある位置で導入され得る場合、異なる改変は、コンマにより区切られ、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ，Ｇｌｕ」又は「Ｒ１７０Ｙ，Ｅ」は、位置１７０におけるアルギニンのチロシン又はグルタミン酸での置換を表す。したがって、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ，Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，Ａｌａ」は、以下の変異体：
「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」、「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、及び「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」、を表す。
本発明による水溶性単位用量物品である。
変異体がリパーゼ活性を有し、例えば、サーモマイセス・ラヌギノサスに由来する、配列番号２と少なくとも６０％であるが１００％未満の配列同一性を有する、親リパーゼの変異体を含む組成物が開示される。
図１は、本発明による水溶性単位用量物品（１）を開示する。水溶性単位用量物品（１）は、第１の水溶性フィルム（２）と第２の水溶性フィルム（３）を含み、これらは密封領域（４）で共に封止されている。洗濯洗剤組成物（５）は、水溶性可溶性単位用量物品（１）内に含まれる。
変異体
本発明は、変異体がリパーゼ活性を有し、配列番号２と少なくとも６０％であるが１００％未満の配列同一性を有し、Ｇ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｆ５１Ｉ，Ｌ、Ｅ５６Ｒ、Ｄ５７Ｎ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｋ９８Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｒ１１８Ｆ、Ｇ１６３Ｓ、Ｔ２３１Ｒ、Ｎ２３３Ｒ、Ｙ２２０Ｆ、Ｔ２４４Ｅ、及びＰ２５６Ｔに対応する位置に１つ以上の（例えば、いくつかの）置換を含む親リパーゼの変異体を含む、洗剤組成物及び洗剤組成物を含む水溶性単位用量物品を提供する。
好ましくは、リパーゼ変異体は、配列番号２と少なくとも６０％であるが１００％未満の配列同一性を有し、Ｇ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｆ５１Ｉ，Ｌ、Ｅ５６Ｒ、Ｄ５７Ｎ，Ｅ、及びＰ２５６Ｔに対応する位置に１つ以上の置換を含む。好ましくは、変異体は、Ｔ２３１Ｒ及び／又はＮ２３３Ｒに対応する位置に１つ又は両方の置換を更に含む。
好ましい変異体は、Ｇ２３Ｓに対応する位置に置換を含む。好ましい変異体は、Ｄ２７Ｎに対応する位置に置換を含む。好ましい変異体は、Ａ４０ｌに対応する位置に置換を含む。好ましい変異体は、Ｆ５１Ｉ，Ｌに対応する位置に置換を含む。好ましい変異体は、Ｅ５６Ｒに対応する位置に置換を含む。好ましい変異体は、Ｄ５７Ｎに対応する位置に置換を含む。好ましい変異体は、Ｖ６０Ｅ，Ｋに対応する位置に置換を含む。好ましい変異体は、Ｋ９８Ｉに対応する位置に置換を含む。好ましい変異体は、Ｎ１０１Ｄに対応する位置に置換を含む。好ましい変異体は、Ｒ１１８Ｆに対応する位置に置換を含む。好ましい変異体は、Ｇ１６３Ｓに対応する位置に置換を含む。好ましい変異体は、Ｙ２２０Ｆに対応する位置に置換を含む。好ましい変異体は、Ｔ２４４Ｅに対応する位置に置換を含む。好ましい変異体は、Ｐ２５６Ｔに対応する位置に置換を含む。
好ましい変異体は、Ｆ５１Ｉ，Ｌ、Ｅ５６Ｒ、及び／又はＲ１１８Ｆに対応する位置に１つ以上の置換を含む。
好ましい実施形態では、本発明の変異体は、以下の置換の組のうちのいずれか１つを含む。
Figure 0007114697000002
ある実施形態では、変異体は、Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒに対応する位置に置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｆ５１Ｉ，Ｌ、Ｅ５６Ｒ、Ｄ５７Ｎ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｋ９８Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｒ１１８Ｆ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、Ｔ２４４Ｅ、及びＰ２５６Ｔに対応する位置に１つ以上の（例えば、いくつかの）置換を含む。
好ましい実施形態では、変異体は、Ｅ５６Ｒ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒに対応する置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｆ５１Ｉ，Ｌ、Ｄ５７Ｎ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｋ９８Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｒ１１８Ｆ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、Ｔ２４４Ｅ、及びＰ２５６Ｔに対応する位置に１つ以上の（例えば、いくつかの）置換を含む。
好ましい実施形態では、変異体は、Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒに対応する位置に置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｆ５１Ｉ，Ｌ、Ｅ５６Ｒ、Ｄ５７Ｎ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｋ９８Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、Ｔ２４４Ｅ、及びＰ２５６Ｔに対応する位置に１つ以上の（例えば、いくつかの）置換を含む。
より好ましい実施形態では、変異体は、Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒに対応する位置に置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｆ５１Ｉ，Ｌ、Ｄ５７Ｎ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｋ９８Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、Ｔ２４４Ｅ、及びＰ２５６Ｔに対応する位置に１つ以上の（例えば、いくつかの）置換を含む。
更により好ましい実施形態では、変異体は、Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔに対応する位置に置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｆ５１Ｉ，Ｌ、Ｄ５７Ｎ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｋ９８Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、及びＴ２４４Ｅに対応する位置に１つ以上の（例えば、いくつかの）置換を含む。
更により好ましい実施形態では、変異体は、Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒに対応する位置に置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｄ５７Ｎ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｋ９８Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、Ｔ２４４Ｅ、及びＰ２５６Ｔに対応する位置に１つ以上の（例えば、いくつかの）置換を含む。
更により好ましい実施形態では、変異体は、Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔに対応する位置に置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｄ５７Ｎ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｋ９８Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、及びＴ２４４Ｅに対応する位置に１つ以上の（例えば、いくつかの）置換を含む。
別のより好ましい実施形態では、変異体は、Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒに対応する位置に置換、並びにＤ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｄ５７Ｎ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｋ９８Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、Ｔ２４４Ｅ、及びＰ２５６Ｔに対応する位置に１つ以上の（例えば、いくつかの）置換を含む。
別のより好ましい実施形態では、変異体は、Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔに対応する位置に置換、並びにＤ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｄ５７Ｎ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｋ９８Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、及びＴ２４４Ｅに対応する位置に１つ以上の（例えば、いくつかの）置換を含む。
尚も更により好ましい実施形態では、変異体は、Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔに対応する位置に置換、並びに、Ｇ２３Ｓ、Ａ４０Ｉ、Ｄ５７Ｎ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｋ９８Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、及びＴ２４４Ｅに対応する位置に１つ以上の（例えば、いくつかの）置換を含む。
追加の更により好ましい実施形態では、変異体は、Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒに対応する位置に置換、並びに、Ｇ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ｄ５７Ｎ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｋ９８Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、Ｔ２４４Ｅ、及びＰ２５６Ｔに対応する位置に１つ以上の（例えば、いくつかの）置換を含む。
尚も更により好ましい実施形態では、変異体は、Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒに対応する位置に置換、並びに、Ｇ２３Ｓ、Ａ４０Ｉ、Ｄ５７Ｎ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｋ９８Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、Ｔ２４４Ｅ、及びＰ２５６Ｔに対応する位置に１つ以上の（例えば、いくつかの）置換を含む。
尚も更により好ましい実施形態では、変異体は、Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔに対応する位置に置換、並びに、Ｇ２３Ｓ、Ａ４０Ｉ、Ｄ５７Ｎ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｋ９８Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、及びＴ２４４Ｅに対応する位置に１つ以上の（例えば、いくつかの）置換を含む。
追加の更により好ましい実施形態では、変異体は、Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔに対応する位置に置換、並びに、Ｇ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ｄ５７Ｎ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｋ９８Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、及びＴ２４４Ｅに対応する位置に１つ以上の（例えば、いくつかの）置換を含む。
尚も更により好ましい実施形態では、変異体は、Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔに対応する位置に置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｋ９８Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、及びＴ２４４Ｅに対応する位置に１つ以上の（例えば、いくつかの）置換を含む。
更に好ましい実施形態では、変異体は、Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒに対応する位置に置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、Ｔ２４４Ｅ、及びＰ２５６Ｔに対応する位置に１つ以上の（例えば、いくつかの）置換を含む。
更に好ましい実施形態では、変異体は、Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔに対応する位置に置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、及びＴ２４４Ｅに対応する位置に１つ以上の（例えば、いくつかの）置換を含む。
更により好ましい実施形態では、変異体は、Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒに対応する位置に置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｖ６０ＥＫ、Ｎ１０１Ｄ、Ｙ２２０Ｆ、Ｔ２４４Ｅ、及びＰ２５６Ｔに対応する位置に１つ以上の（例えば、いくつかの）置換を含む。
更により好ましい実施形態では、変異体は、Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔに対応する位置に置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｖ６０ＥＫ、Ｎ１０１Ｄ、Ｙ２２０Ｆ、及びＴ２４４Ｅに対応する位置に１つ以上の（例えば、いくつかの）置換を含む。
尚も更により好ましい実施形態では、変異体は、Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅに対応する位置に置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｎ１０１Ｄ、Ｙ２２０Ｆ、及びＰ２５６Ｔに対応する位置に１つ以上の（例えば、いくつかの）置換を含む。
尚も更により好ましい実施形態では、変異体は、Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔに対応する位置に置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｎ１０１Ｄ、及びＹ２２０Ｆに対応する位置に１つ以上の（例えば、いくつかの）置換を含む。
尚も更により好ましい実施形態では、変異体は、Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔに対応する位置に置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｎ１０１Ｄ、及びＹ２２０Ｆに対応する位置に１つ以上の（例えば、いくつかの）置換を含む。
更に好ましい実施形態では、変異体は、Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｖ６０Ｅ，Ｋ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒに対応する位置に置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、Ｔ２４４Ｅ、及びＰ２５６Ｔに対応する位置に１つ以上の（例えば、いくつかの）置換を含む。
更に好ましい実施形態では、変異体は、Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｖ６０Ｅ，Ｋ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔに対応する位置に置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、及びＴ２４４Ｅに対応する位置に１つ以上の（例えば、いくつかの）置換を含む。
更に好ましい実施形態では、変異体は、Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｖ６０Ｅ，Ｋ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｎ１０１Ｄ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔに対応する位置に置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、及びＴ２４４Ｅに対応する位置に１つ以上の（例えば、いくつかの）置換を含む。
更に好ましい実施形態では、変異体は、Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｎ１０１Ｄ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔに対応する位置に置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、及びＴ２４４Ｅに対応する位置に１つ以上の（例えば、いくつかの）置換を含む。
特に好ましい実施形態は、以下の置換の組、
Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ａ４０Ｉ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｆ５１Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｅ５６Ｒ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｅ５６Ｒ＋Ｖ６０Ｋ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｖ６０Ｋ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｖ６０Ｅ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ａ４０Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｆ５１Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｄ５７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ａ４０Ｉ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ａ４０Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ａ４０Ｉ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ａ４０Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｆ５１Ｌ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｆ５１Ｌ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｆ５１Ｌ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｆ５１Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｄ５７Ｎ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｄ５７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｋ９８Ｉ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｌ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｌ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｌ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ａ４０Ｉ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ａ４０Ｉ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ａ４０Ｉ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ａ４０Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ａ４０Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ａ４０Ｉ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｆ５１Ｌ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｆ５１Ｌ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｆ５１Ｌ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｆ５１Ｌ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｆ５１Ｌ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｆ５１Ｌ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ５７Ｎ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｋ９８Ｉ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｌ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｌ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｌ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｌ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｌ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｌ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ａ４０Ｉ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ａ４０Ｉ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ａ４０Ｉ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ａ４０Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｆ５１Ｌ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｆ５１Ｌ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｆ５１Ｌ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｆ５１Ｌ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｌ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｌ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｌ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｌ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ａ４０Ｉ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｆ５１Ｌ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｌ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ａ４０Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ａ４０Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ａ４０Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ａ４０Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｖ６０Ｋ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｖ６０Ｅ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ａ４０Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ａ４０Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｖ６０Ｋ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｖ６０Ｅ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ａ４０Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｖ６０Ｋ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｖ６０Ｅ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｖ６０Ｋ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｖ６０Ｅ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｖ６０Ｋ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｖ６０Ｅ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ａ４０Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｖ６０Ｋ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｖ６０Ｅ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｖ６０Ｋ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｖ６０Ｋ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｖ６０Ｅ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｖ６０Ｋ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｖ６０Ｅ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｎ１０１Ｄ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｖ６０Ｋ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｖ６０Ｅ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｆ５１Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｆ５１Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｆ５１Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｆ５１Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔのうちの１つに対応する位置に置換を含む変異体を含む。
リパーゼ変異体は、好ましくは、親リパーゼと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％であるが１００％未満の配列同一性を有する。
変異体は、好ましくは、配列番号２と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％であるが１００％未満の配列同一性を有する。
変異体は、１～１２など、１～１１など、１～１０など、１～９など、１～８など、１～７など、１～６など、１～５など、１～４など、１～３など、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０の置換などの１～４０、１～３０、１～２０を有してもよい。
変異体は、親リパーゼと比較して、改善された洗浄性能、低減された臭気発生、改善された保存安定性、より長い保存寿命、及び／又は熱安定性の増大、の特性のうちの１つ以上を有し得る。
リパーゼ変異体は、１つ以上の（例えば、いくつかの）他の位置に１つ以上の追加の置換を更に含んでもよい。
アミノ酸の変化は、軽度のもの、すなわち、タンパク質の折り畳み及び／若しくは活性に著しく影響を及ぼさない保存的なアミノ酸置換又は挿入、小さい欠失、典型的には、１～３０個のアミノ酸の欠失、アミノ末端メチオニン残基などの小さいアミノ末端又はカルボキシ末端の伸長、最大２０～２５残基の小さいリンカーペプチド、又は、ポリ－ヒスチジントラクト、抗原エピトープ、若しくは結合ドメインなどの、正味電荷若しくは別の機能を変化させることによって精製を容易にする小さな伸長であり得る。
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び低分子アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン及びメチオニン）の群内のものである。一般的に比活性を変化させないアミノ酸の置換は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。一般的な置換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、及びＡｓｐ／Ｇｌｙである。
代替的に、アミノ酸の変化は、ポリペプチドの物理化学的特性が変化するような性質のものである。例えば、アミノ酸の変化は、ポリペプチドの熱安定性を改善し、基質特異性を改変し、ｐＨ最適を変化させることなどができる。
ポリペプチド中の必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発又はアラニン－スキャニング突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１－１０８５）等の当該技術分野において既知の手順によって同定され得る。後者の技術では、分子中の全ての残基に単一アラニン突然変異を導入し、得られた突然変異型分子をリパーゼ活性について試験して、当該分子の活性に重要なアミノ酸残基を同定する。Ｈｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９－４７０８も参照されたい。また、酵素又は他の生物学的相互作用の活性部位は、推定接触部位のアミノ酸の突然変異と併せて、核磁気共鳴、結晶学、電子線回折、又は光親和性標識等の技術によって決定されるように、構造の物理分析によっても決定することができる。例えば、ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６－３１２；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９－９０４、Ｗｌｏｄａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０９：５９－６４を参照されたい。必須アミノ酸の同一性は、関連するポリペプチドとのアラインメントから推測することもできる。
変異体は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列番号２のアミノ酸の数からなるか、又はそれを含有し得る。
親リパーゼ
親リパーゼは、
ａ）配列番号２と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド、
ｂ）低ストリンジェンシー条件、中程度のストリンジェンシー条件、中高度のストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は非常に高いストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１のポリペプチドコード配列又は（ｉｉ）（ｉ）の完全長補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、
ｃ）配列番号１と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、及び
ｄ）配列番号２のポリペプチドのフラグメントからなる群から選択され得る。
本発明のある態様では、親リパーゼは、リパーゼ活性を有する、配列番号２のポリペプチドと少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。
一態様では、親のアミノ酸配列は、配列番号２のポリペプチドと、最大４０個のアミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０個異なる。
別の態様では、親は、配列番号２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
別の態様では、親は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列番号２のアミノ酸の数を含有する配列番号２のポリペプチドのフラグメントである。
別の実施形態では、親は、配列番号２のポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
別の態様では、親リパーゼは、非常に低いストリンジェンシー条件、低ストリンジェンシー条件、中程度のストリンジェンシー条件、中高度のストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は非常に高いストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１のポリペプチドコード配列、（ｉｉ）（ｉ）の完全長補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
異なる属又は種の株から、当該技術分野において周知の方法によって、親をコードするＤＮＡを同定及びクローニングするために、配列番号１のポリヌクレオチド、あるいはそのサブシークエンス、並びに配列番号２のポリペプチド又はそのフラグメントを、核酸プローブの設計に使用することができる。特に、このようなプローブは、その中の対応する遺伝子を同定及び単離するために、標準的なサザンブロッティング手順に従い、対象の細胞のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡとハイブリダイズするために使用することができる。このようなプローブは全配列より大幅に短くてよいが、長さが少なくとも１５、例えば、少なくとも２５、少なくとも３５、又は少なくとも７０ヌクレオチドでなければならない。好ましくは、核酸プローブは、長さが少なくとも１００ヌクレオチド、例えば、長さが少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、又は少なくとも９００ヌクレオチドである。ＤＮＡとＲＮＡとの両方を使用することができる。プローブは、対応する遺伝子（例えば、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ、ビオチン、又はアビジンを有する）を検出するために、通常標識化される。かかるプローブは本発明に包含される。
このような他の株から調製されるゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリは、上述のプローブとハイブリダイズし、親をコードするＤＮＡについてスクリーニングされ得る。このような他の株からのゲノム又は他のＤＮＡは、アガロース若しくはポリアクリルアミド電気泳動、又は他の分離技術によって分離され得る。ライブラリからのＤＮＡ又は分離されたＤＮＡは、ニトロセルロース又はその他の好適な担体物質上に移動及び不動化されてもよい。配列番号１又はそのサブシークエンスとハイブリダイズするクローン又はＤＮＡを同定するために、サザンブロット法において担体物質を使用する。
本発明の目的では、ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドが、（ｉ）配列番号１、（ｉｉ）配列番号１のポリペプチドコード配列、（ｉｉｉ）その完全長補体、又は（ｉｖ）そのサブシークエンスに対応する標識された核酸プローブに、非常に低い～非常に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることを示す。核酸プローブがこれらの条件下でハイブリダイズする分子は、例えば、Ｘ線フィルム又は当該技術分野において既知である任意の他の検出手段を用いて検出され得る。
一態様において、核酸プローブは、配列番号１のポリペプチドコード配列である。別の態様において、核酸プローブは、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列番号１のヌクレオチドの数を含有する。別の態様において、核酸プローブは、配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのポリペプチド、又はそのフラグメントである。別の態様において、核酸プローブは、配列番号１である。
別の実施形態では、親は、配列番号１のポリペプチドコード配列と少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
ポリペプチドは、１つのポリペプチドの領域が別のポリペプチドの領域のＮ末端又はＣ末端で融合されるハイブリッドポリペプチドであってもよい。
親リパーゼは、別のポリペプチドが本発明のポリペプチドのＮ末端又はＣ末端で融合される融合ポリペプチド又は切断可能な融合ポリペプチドであってよい。融合ポリペプチドは、別のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、本発明のポリヌクレオチドに融合させることによって産生される。融合ポリペプチドを産生するための技術は、当該技術分野において既知であり、それらがフレーム内にあるようにポリペプチドをコードするコード配列をライゲーションすることを含み、融合ポリペプチドの発現は、同じプロモータ（複数可）及びターミネータの制御下にある。融合ポリペプチドはまた、翻訳後に融合ポリペプチドが生成されるインテイン技術を使用して構築されてもよい（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，ＥＭＢＯ Ｊ．１２：２５７５－２５８３；Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７７６－７７９）。
融合ポリペプチドは、２つのポリペプチド間に切断部位を更に含むことができる。融合タンパク質の分泌の際、部位は切断され、２つのポリペプチドを放出する。切断部位の例としては、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：５６８－５７６、Ｓｖｅｔｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６：２４５－２５１、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ－Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：３４８８－３４９３、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：４９８－５０３及びＣｏｎｔｒｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：３７８－３８１、Ｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：５０５－５１２、Ｃｏｌｌｉｎｓ－Ｒａｃｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：９８２－９８７、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：２４０－２４８、及びＳｔｅｖｅｎｓ，２００３，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｌｄ ４：３５－４８において開示されている部位が挙げられるが、これらに限定されない。
親リパーゼは、あらゆる属の微生物から得ることができる。本発明の目的では、用語「から得られる」は、所与の源に関連して本明細書で使用するとき、ポリヌクレオチドによってコードされる親が、源によって、又は源からのポリヌクレオチドが挿入された株によって産生されることを意味するものとする。一態様において、親は細胞外に分泌される。
親は、細菌リパーゼであってよい。例えば、親は、グラム陽性細菌ポリペプチド、例えば、バチルス、クロストリジウム、エンテロコッカス、ゲオバチルス（Geobacillus）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、オセカンバチルス（Oceanobacillus）、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、ストレプトマイセス、又はセルモビフィダであるか、又はグラム陰性細菌ポリペプチド、例えば、カンピロバクター（Campylobacter）、大腸菌（E.coli）、フラボバクテリウム（Flavobacterium）、フソバクテリウム（Fusobacterium）、ヘリコバクター（Helicobacter）、イリオバクター（Ilyobacter）、ナイセリア（Neissera）、シュードモナス（Pseudomonas）、サルモネラ（Salmonella）、又はウリプラマのリパーゼであり得る。
一態様において、親は、バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・シルクランス（Bacillus circulans）、バチルス・クラウシイ、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・フィルムス（Bacillus firmus）、バチルス・ラウタス（Bacillus lautus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・サブチリス、又はバチルス・チューリンゲンシスのリパーゼである。
別の態様において、親は、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Streptococcus equisimilis）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）、又はストレプトコッカス・イクイ（Streptococcus equi）亜種ズーエピデミカス（Zooepidemicus）のリパーゼである。
別の態様では、親は、ストレプトマイセス・アクロモゲネス（Streptomyces achromogenes）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトマイセス・コエリコラ（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、又はストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）のリパーゼである。
別の態様では、親は、サーモビフィダ・アルバ（Thermobifida alba）又はサーモビフィダ・フスカ（以前はサーモモノスポラ・フスカとして知られていた）のリパーゼである。
親は真菌リパーゼであってよい。例えば、親は、酵母リパーゼ、例えば、カンジダ属、クリベロマイセス属、ピキア属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、若しくはヤロウイア属のリパーゼ、又は糸状菌リパーゼ、例えば、アクレモニウム属、アガリクス属、アルテルナリア属、アスペルギルス属、アウレオバシディウム属、ボトリオスファエリア属、セリポリオプシス属、カエトミジウム属、クリソスポリウム属、クラビセプス属、コキオボラス属、コプリノプシス属（Coprinopsis）、コプトテルムス属（Coptotermes）、コリナスカス属、クリフォネクトリア属（Cryphonectria）、クリプトコッカス属、ディプロディア属、エキシディア属（Exidia）、フィリバシディウム属、フザリウム属、ギベレラ属（Gibberella）、ホロマスチゴトイデス属（Holomastigotoides）、フミコーラ属、イルペクス属（Irpex）、レンチヌラ属（Lentinula）、レプトスパエリア属（Leptospaeria）、マグナポルテ属、メラノカルプス属（Melanocarpus）、メリピルス属（Meripilus）、ムコール属（Mucor）、ミセリオフィソーラ属、ニューロスポラ属、ペシロマイセス属、ペニシリウム属、ファネロカエテ属、ピロマイセス属、ポイトラシア属（Poitrasia）、シュードプレクタニア属（Pseudoplectania）、シュードトリコニムファ属（Pseudotrichonympha）、リゾムコール属、シゾフィリウム属、スキタリジウム属、タラロマイセス属、サーモアスカス属、チェラビア属、トリポクラジウム属、トリコデルマ属、トリコファエア属（Trichophaea）、ベルチシリウム属（Verticillium）、ボルバリエラ属（Volvariella）、若しくはキシラリア属（Xylaria）のリパーゼであってよい。
別の態様では、親は、サッカロマイセス・カルルスベルゲンシス、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・ディアスタティカス、サッカロマイセス・ドゥグラシィ、サッカロマイセス・クルイベリ、サッカロマイセス・ノルベンシス、又はサッカロマイセス・オビホルミスのリパーゼであってよい。
別の態様では、親は、アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）、アスペルギルス・アキュリタス、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・フォエティダス、アスペルギルス・フミガーツス、アスペルギルス・ジャポニクス、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリザエ、クリソスポリウム・イノプス（Chrysosporium inops）、クリソスポリウム・ケラチノフィルム（Chrysosporium keratinophilum）、クリソスポリウム・ラックノウェンセ（Chrysosporium lucknowense）、クリソスポリウム・メルダリウム（Chrysosporium merdarium）、クリソスポリウム・パンニコラ（Chrysosporium pannicola）、クリソスポリウム・クイーンスランジクム（Chrysosporium queenslandicum）、クリソスポリウム・トロピクム（Chrysosporium tropicum）、クリソスポリウム・ゾナツム（Chrysosporium zonatum）、フザリウム・バクテリジオイデス（Fusarium bactridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フザリウム・クロークウェレンス（Fusarium crookwellense）、フザリウム・クルモルム（Fusarium culmorum）、フザリウム・グラミネアルム（Fusarium graminearum）、フザリウム・グラミヌム（Fusarium graminum）、フザリウム・ヘテロスポルム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネグンディ（Fusarium negundi）、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）、フザリウム・レチクランツム（Fusarium reticulatum）、フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サムブシヌム（Fusarium sambucinum）、フザリウム・サルコクロウム（Fusarium sarcochroum）、フザリウムス・ポロトリキオイデス（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・スルフレウム（Fusarium sulphureum）、フザリウム・トルロスム（Fusarium torulosum）、フザリウム・トリコテシオイデス（Fusarium trichothecioides）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）、フミコーラ・グリセア（Humicola grisea）、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコーラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）、イルペクス・ラクテウス（Irpex lacteus）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、ミセリオフィソーラ・テルモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ペニシリウム・フニクロサム、ペニシリウム・プルプロゲヌム（Penicillium purpurogenum）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、チエラビア・アクロマチカ（Thielavia achromatica）、チエラビア・アルボミセス（Thielavia albomyces）、チエラビア・アルボピロサ（Thielavia albopilosa）、チエラビア・アウストラレインシス（Thielavia australeinsis）、チエラビア・フィメチ（Thielavia fimeti）、チエラビア・ミクロスポラ（Thielavia microspora）、チエラビア・オビスポラ（Thielavia ovispora）、チエラビア・ペルビアナ（Thielavia peruviana）、チエラビア・セトサ（Thielavia setosa）、チエラビア・スペデドニウム（Thielavia spededonium）、チエラビア・サブサーモフィラ（Thielavia subthermophila）、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、トリコデルマ・ハルジアナム、トリコデルマ・コニンギイ、トリコデルマ・ロンギブラキアタム、トリコデルマ・レーシ、又はトリコデルマ・ビリデのリパーゼである。
別の態様では、親は、サーモマイセス・ラヌギノサスリパーゼ、例えば、特に配列番号２のリパーゼである。
前述の種については、本発明に有用な変異体は、それらについて知られている種名にかかわらず、完全及び不完全の両方の状態、並びに他の分類学上の等価物、例えばアナモルフ、を包含することが理解されるであろう。当業者は、適切な等価物の同一性を容易に認識するであろう。
これらの種の株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ Ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、及びＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）などの多数の培養コレクションにおいて、公衆に容易に利用可能とされている。
親リパーゼは、天然物（例えば、土壌、堆肥、水など）から単離された微生物、又は上述のプローブを使用して天然物質（例えば、土壌、堆肥、水など）から直接得られたＤＮＡ試料を含む他の供給源から同定及び取得され得る。天然生息物から直接微生物及びＤＮＡを単離するための技術は、当該技術分野において周知である。次いで、親をコードするポリヌクレオチドは、別の微生物のゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡライブラリ、又は混合ＤＮＡ試料を同様にスクリーニングすることによって、得ることができる。親をコードするポリヌクレオチドがプローブ（複数可）で検出されると、ポリヌクレオチドは、当業者に既知の技術を利用することによって単離されるか、又はクローニングされ得る（例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照されたい）。
変異体の調製
本発明に有用な変異体は、（ａ）Ｇ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｆ５１Ｉ，Ｌ、Ｅ５６Ｒ、Ｄ５７Ｎ、Ｋ９８Ｉ、Ｒ１１８Ｆ、Ｇ１６３Ｓ、Ｔ２３１Ｒ、Ｎ２３３Ｒ、Ｙ２２０Ｆ、Ｔ２４４Ｅ、及びＰ２５６Ｔに対応する位置に置換を導入することと、（ｂ）リパーゼ活性を有し、親リパーゼと比較して上に列記される所望の特性のうちの１つを有する変異体を選択することと、（ｃ）変異体を回収することと、を含む、リパーゼ変異体を得るための方法によって調製することができる。
変異体は、例えば、部位特異的な突然変異誘発、合成遺伝子構築、半合成遺伝子構築、ランダム突然変異誘発、シャッフルなどの、当該技術分野において既知である任意の突然変異誘発手順を使用して調製することができる。
部位特異的突然変異誘発は、親リパーゼをコードしているポリヌクレオチドにおける１つ以上の規定の部位に１つ以上の（例えば、いくつかの）突然変異を導入する技術である。
部位特異的突然変異誘発は、所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーの使用を伴うＰＣＲによって、インビトロで行うことができる。また、部位特異的突然変異誘発は、親リパーゼをコードしているポリヌクレオチドを含むプラスミド中のある部位を制限酵素によって切断し、続いて、ポリヌクレオチド中の突然変異を含有するオリゴヌクレオチドをライゲーションすることを伴うカセット式突然変異誘発によって、インビトロで行うこともできる。通常、上記プラスミド及びオリゴヌクレオチドを分解する制限酵素は同じであるので、プラスミドの付着末端及びインサートを互いにライゲーションさせることができる。例えば、Ｓｃｈｅｒｅｒ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：４９４９－４９５５及びＢａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：７３４９－４９６６を参照されたい。
また、部位特異的突然変異誘発は、当該技術分野において既知の方法によってインビボで行うこともできる。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１１５４号、Ｓｔｏｒｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：７７３－７７６；Ｋｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：２８５－２９０及びＣａｌｉｓｓａｎｏ ａｎｄ Ｍａｃｉｎｏ，１９９６，Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｎｅｗｓｌｅｔｔ．４３：１５－１６を参照されたい。
本発明では、任意の部位特異的な突然変異誘発手順を用いることができる。変異体を調製するために使用することができる多くの市販のキットが入手可能である。
合成遺伝子の構築は、対象ポリペプチドをコードするように設計されたポリヌクレオチド分子のインビトロ合成を必要とする。遺伝子合成は、オリゴヌクレオチドを合成し、フォトプログラム可能なマイクロ流体チップ上でアセンブルする、Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２００４，Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１０５０－１０５４）によって記載されているマルチプレックスマイクロチップベースの技術及び類似の技術等の多くの技術を利用して実施することができる。
単一又は複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入は、既知の突然変異誘発、組換え、及び／又はシャッフリングの方法、続いて、Ｒｅｉｄｈａａｒ－Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３－５７；Ｂｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２１５２－２１５６；国際公開第９５／１７４１３号、又は国際公開第９５／２２６２５号に開示されるものなどの適切なスクリーニング手順を使用して行い、試験することができる。使用することができる他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８３２－１０８３７、米国特許第５，２２３，４０９号、国際公開第９２／０６２０４号）、及び領域指向突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ ４６：１４５；Ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ ７：１２７）が挙げられる。
突然変異誘発／シャッフリング方法は、宿主細胞によって発現されるクローニングされた突然変異ポリペプチドの活性を検出するためにハイスループット自動スクリーニング法と組み合わせてもよい（Ｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８９３－８９６）。活性ポリペプチドをコードしている突然変異ＤＮＡ分子を宿主細胞から回収し、当該技術分野において標準的な方法を用いて迅速にシーケンスすることができる。これら方法は、ポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性を迅速に決定することができる。
半合成遺伝子構築は、合成遺伝子構築、並びに／又は部位特異的な突然変異誘発、及び／若しくはランダムな突然変異誘発、並びに／又はシャッフリングの側面を組み合わせることによって達成される。半合成構築は、ＰＣＲ技術と組み合わされた、合成されるポリヌクレオチドのフラグメントを利用するプロセスによって典型的に象徴される。このように、遺伝子の規定の領域をデノボ合成することができるが、他の領域は、部位特異的突然変異誘発プライマーを用いて増幅してもよく、また、更に他の領域は、エラープローンＰＣＲ又は非エラープローンＰＣＲ増幅に供してもよい。次いで、ポリヌクレオチドのサブシークエンスをシャッフリングしてもよい。
リパーゼ変異体は、（ａ）宿主細胞を、変異体の発現に好適な条件下で培養することと、（ｂ）変異体を回収することと、を含む方法により作製され得る。
核酸コンストラクト
本発明は、制御配列に適合する条件下で、好適な宿主細胞においてコード配列の発現を誘導する１つ以上の制御配列に操作可能に連結された、本発明の変異体をコードしているポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトにも関する。
ポリヌクレオチドは、変異体の発現を提供するために様々な方法で操作され得る。ベクターに挿入する前にポリヌクレオチドを操作することが、発現ベクターによっては望ましい又は必要な場合がある。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドを改変するための技術は、当該技術分野において周知である。
制御配列は、ポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識されるプロモータ、ポリヌクレオチドであってよい。プロモータは、変異体の発現を媒介する転写制御配列を含む。プロモータは、突然変異型、切断型、及びハイブリッド型のプロモータを含む、宿主細胞において転写活性を示す任意のポリヌクレオチドであってよく、宿主細胞に相同又は非相同な細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードしている遺伝子から得ることができる。
細菌宿主細胞における本発明の核酸コンストラクトの転写を誘導するための好適なプロモータの例は、バチルス・アミロリケファシエンスアルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルス・リケニフォルミスアルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルス・リケニフォルミスペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルス・ステアロサーモフィルスマルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、バチルス・サブチリスレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、バチルス・サブチリスｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子、バチルス・チューリンゲンシスｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（Ａｇａｉｓｓｅ ａｎｄ Ｌｅｒｅｃｌｕｓ，１９９４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １３：９７－１０７）、大腸菌ｌａｃオペロン、大腸菌ｔｒｃプロモータ（Ｅｇｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｇｅｎｅ ６９：３０１－３１５）、ストレプトマイセス・コエリコラアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、及び原核ベータ－ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ－Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７－３７３１）から得られるプロモータ、並びにｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１－２５）である。更なるプロモータは、Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２４２：７４－９４における「Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ」及び上記のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９に記載されている。タンデムプロモータの例は、国際公開第９９／４３８３５号に開示されている。
糸状菌宿主細胞における本発明の核酸コンストラクトの転写を誘導するための好適なプロモータの例は、アスペルギルス・ニデュランスアセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニガー中性アルファ－アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー酸安定性アルファ－アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・アワモリミラーゼアミラーゼ（ｇｌａＡ）、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・オリザエアルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエトリソースリン酸イソメラーゼ、フザリウム・オキシスポルムトリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号）、フザリウム・ベネナツムアミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号）、フザリウム・ベネナツムＤａｒｉａ（国際公開第００／５６９００号）、フザリウム・ベネナツムＱｕｉｎｎ（国際公開第００／５６９００号）、リゾムコール・ミエヘイリパーゼ、リゾムコール・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ、トリコデルマ・レーシベータ－グルコシダーゼ、トリコデルマ・レーシセロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・レーシセロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・レーシエンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・レーシエンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・レーシエンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・レーシエンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマ・レーシエンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・レーシキシラナーゼＩ、トリコデルマ・レーシキシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・レーシベータ－キシロシダーゼから得られるプロモータ、並びにＮＡ２－ｔｐｉプロモータ（非翻訳リーダーがアスペルギルス・トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダーで置換されているアスペルギルス中性アルファ－アミラーゼ遺伝子由来の修飾プロモータ；非限定的な例としては、非翻訳リーダーがアスペルギルス・ニデュランス又はアスペルギルス・オリザエトリソースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダーで置換されているアスペルギルス・ニガー中性アルファ－アミラーゼ遺伝子由来の修飾プロモータが挙げられる）、並びにそれらの突然変異体、切断型、及びハイブリッド型プロモータである。
酵母宿主では、有用なプロモータは、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ＥＮＯ－１）、サッカロマイセス・セレビシエガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロマイセス・セレビシエアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロマイセス・セレビシエトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロマイセス・セレビシエメタロチオネイン（ＣＵＰ１）、及びサッカロマイセス・セレビシエ３－ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモータは、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｙｅａｓｔ ８：４２３－４８８によって記載されている。
また、制御配列は、転写を終結するために宿主細胞によって認識される転写ターミネータであってもよい。ターミネータ配列は、変異体をコードしているポリヌクレオチドの３’末端に操作可能に連結される。宿主細胞において機能する任意のターミネータを使用してよい。
細菌宿主細胞に好ましいターミネータは、バチルス・クラウシイアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＨ）、バチルス・リケニフォルミスアルファ－アミラーゼ（ａｍｙＬ）、及び大腸菌リボソームＲＮＡ（ｒｒｎＢ）の遺伝子から得られる。
糸状菌宿主細胞に好ましいターミネータは、アスペルギルス・ニデュランスアントラニル酸合成酵素、アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーアルファ－グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、及びフザリウム・オキシスポルムトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞に好ましいターミネータは、サッカロマイセス・セレビシエエノラーゼ、サッカロマイセス・セレビシエシトクロムＣ（ＣＹＣ１）、及びサッカロマイセス・セレビシエグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネータは、上記のＲｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２によって記載されている。
また、制御配列は、遺伝子の発現を増加させる遺伝子のプロモータの下流かつコード配列の上流のｍＲＮＡ安定化領域であってもよい。
好適なｍＲＮＡ安定化領域の例は、バチルス・チューリンゲンシスｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（国際公開第９４／２５６１２号）及びバチルス・サブチリスＳＰ８２遺伝子（Ｈｕｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７７：３４６５－３４７１）から得られる。
また、制御配列は、宿主細胞による翻訳にとって重要なｍＲＮＡの非翻訳領域である、リーダーであってもよい。リーダー配列は、変異体をコードしているポリヌクレオチドの５’末端に操作可能に連結される。宿主細胞において機能する任意のリーダーを使用してよい。
糸状菌宿主細胞に好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ及びアスペルギルス・ニデュランストリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞に好適なリーダーは、サッカロマイセス・セレビシエエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、サッカロマイセス・セレビシエ３－ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロマイセス・セレビシエアルファ－因子、及びサッカロマイセス・セレビシエアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
また、制御配列は、変異体コード配列の３’末端に操作可能に連結しており、転写されるとき、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するためのシグナルとして宿主細胞によって認識される配列である、ポリアデニル化配列であってもよい。宿主細胞において機能する任意のポリアデニル化配列を使用してよい。
糸状菌宿主細胞に好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・ニデュランスアントラニル酸合成酵素、アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーアルファ－グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、及びフザリウム・オキシスポルムトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞のために有用なポリアデニル化配列は、Ｇｕｏ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ．１５：５９８３－５９９０によって記載されている。
また、制御配列は、変異体のＮ末端に連結されたシグナルペプチドをコードしており、変異体を細胞の分泌経路に誘導する、シグナルペプチドコード領域であってもよい。ポリヌクレオチドのコード配列の５’末端は、変異体をコードしているコード配列のセグメントと翻訳リーディングフレームで天然に連結されているシグナルペプチドコード配列を固有に含有していてもよい。代替的に、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来であるシグナルペプチドコード配列を含有していてもよい。外来シグナルペプチドコード配列は、そのコード配列がシグナルペプチドコード配列を天然には含有していない場合、必要になることがある。代替的に、変異体の分泌を強化するために、天然シグナルペプチドコード配列を単に外来シグナルペプチドコード配列に置き換えてもよい。しかし、発現された変異体を宿主細胞の分泌経路に誘導する任意のシグナルペプチドコード配列を使用してもよい。
細菌宿主細胞に有効なシグナルペプチドコード配列は、バチルスＮＣＩＢ １１８３７マルトース生成アミラーゼ、バチルス・リケニフォルミスサブチリシン、バチルス・リケニフォルミスベータ－ラクタマーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルスアルファ－アミラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルス中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、及びバチルス・サブチリスｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。更なるシグナルペプチドは、Ｓｉｍｏｎｅｎ ａｎｄ Ｐａｌｖａ，１９９３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５７：１０９－１３７よって記載されている。
糸状菌宿主細胞に有効なシグナルペプチドコード配列は、アスペルギルス・ニガー中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、フミコーラ・インソレンスセルラーゼ、フミコーラ・インソレンスエンドグルカナーゼＶ、フミコーラ・ラヌギノサリパーゼ、及びリゾムコール・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。
酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、サッカロマイセス・セレビシエアルファ－因子及びサッカロマイセス・セレビシエインベルターゼの遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード配列は、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，上記によって記載されている。
また、制御配列は、変異体のＮ末端に位置するプロペプチドをコードしているプロペプチドコード配列であってもよい。得られるポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又は場合によっては酵素原）として知られている。ポリペプチドは、一般的には不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的又は自己触媒的開裂によって活性ポリペプチドに変換され得る。プロペプチドコード配列は、バチルス・サブチリスアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、バチルス・サブチリス中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、ミセリオフィソーラ・サーモフィララッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号）、リゾムコール・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ、及びサッカロマイセス・セレビシエアルファ－因子の遺伝子から得ることができる。
シグナルペプチド及びプロペプチド配列の両方が存在する場合、プロペプチド配列は変異体のＮ末端に隣接して位置し、シグナルペプチド配列はプロペプチド配列のＮ末端に隣接して位置する。
また、宿主細胞の増殖に対して変異体の発現を調節する調節配列を付加することが望ましい場合もある。調節系の例は、調節化合物の存在を含む化学的又は物理的刺激に応答して遺伝子の発現をオン又はオフにするものである。原核細胞系における調節系としては、ｌａｃ、ｔａｃ、及びｔｒｐオペレータ系が挙げられる。酵母では、ＡＤＨ２システム又はＧＡＬ１システムを使用してもよい。糸状菌では、アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼプロモータ、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアルファ－アミラーゼプロモータ、及びアスペルギルス・オリザエグルコアミラーゼプロモータを使用してもよい。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核細胞系では、これら調節配列としては、メトトレキサートの存在下で増幅するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及び重金属で増幅するメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合、変異体をコードしているポリヌクレオチドは、調節配列と操作可能に連結される。
発現ベクター
本出願はまた、本発明において有用な変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター、プロモータ、並びに転写及び翻訳終止シグナルも開示する。様々なヌクレオチド及び制御配列は、１つ以上の便利な制限部位において変異体をコードしているポリヌクレオチドを挿入又は置換するのを可能にするために、このような部位を含み得る組換え発現ベクターを産生するために一緒に接合させてもよい。代替的に、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトを、発現に適したベクターに挿入することによって発現させることもできる。発現ベクターの作成において、コード配列は、コード配列が発現に適した制御配列と操作可能に連結されるように、ベクター内に位置する。
組換え発現ベクターは、便利に組換えＤＮＡ手順に供することができ、ポリヌクレオチドを発現させることができる任意のベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）であってよい。ベクターの選択は、典型的には、ベクターと、ベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存する。ベクターは、直鎖又は閉環状プラスミドであってよい。
ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち、その複製が染色体複製とは無関係な染色体外実体として存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外因子、ミニ染色体、又は人工染色体であってもよい。ベクターは、自己複製を保証するための任意の手段を含んでいてよい。代替的に、ベクターは、宿主細胞に導入されるときに、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体（複数可）と一緒に複製されるベクターであってもよい。更に、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡ又はトランスポゾンを一緒に含有する、単一のベクター若しくはプラスミド、又は２つ以上のベクター若しくはプラスミドを使用してもよい。
ベクターは、好ましくは、形質転換、トランスフェクト、形質導入などに供された細胞を容易に選択することを可能にする１つ以上の選択可能マーカーを含有する。選択可能マーカーは、その生成物が殺生物剤又はウイルス耐性、重金属耐性、栄養要求体に対する原栄養性などを備える遺伝子である。
細菌の選択可能マーカーの例は、バチルス・リケニフォルミス若しくはバチルス・サブチリスのｄａｌ遺伝子、又はアンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ネオマイシン、スペクチノマイシン、若しくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーである。酵母宿主細胞に好適なマーカーとしては、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、及びＵＲＡ３が挙げられるが、これらに限定されない。糸状菌宿主細胞において使用するための選択可能マーカーとしては、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸還元酵素）、ｐｙｒＧ（オロチジン－５’リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、及びｔｒｐＣ（アントラニル酸合成酵素）、並びにこれらの等価物が挙げられるが、これらに限定されない。アスペルギルスの細胞において使用するのに好ましいのは、アスペルギルス・ニデュランス又はアスペルギルス・オリザエのａｍｄＳ及びｐｙｒＧ遺伝子、並びにストレプトマイセス・ハイグロスコピカスのｂａｒ遺伝子である。
ベクターは、好ましくは、宿主細胞のゲノムにベクターを組み込むか、又はゲノムに依存せずに細胞内でベクターが自律複製することを可能にするエレメントを含有する。
宿主細胞のゲノムへの組み込みについて、ベクターは、変異体をコードしているポリヌクレオチドの配列、又は相同若しくは非相同組換えによってゲノムに組み込むためのベクターの任意の他のエレメントに依存し得る。代替的に、ベクターは、染色体中の正確な位置における宿主細胞のゲノムへの相同組換えによる組み込みを誘導するための追加のポリヌクレオチドを含有していてもよい。正確な位置における組み込みの可能性を高めるために、組み込みエレメントは、相同組換えの可能性を高めるために、対応する標的配列に対して高い配列同一度を有する、１００～１０，０００塩基対、４００～１０，０００塩基対、及び８００～１０，０００塩基対等の十分な数の核酸を含有しなければならない。組み込みエレメントは、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同な任意の配列であってもよい。更に、組み込みエレメントは、非コード又はコードポリヌクレオチドであってもよい。他方、ベクターは、非相同的組換えにより宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。
自律複製については、ベクターは、ベクターを対象宿主細胞中で自律的に複製することができる複製起点を更に含み得る。複製起点は、細胞内で機能する自律複製を媒介する任意のプラスミドレプリケータであり得る。用語「複製起点」又は「プラスミドレプリケータ」は、プラスミド又はベクターをインビボで複製させることができるポリヌクレオチドを意味する。
細菌の複製起点の例は、大腸菌における複製を可能にするｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、及びｐＡＣＹＣ１８４、並びにバチルスにおける複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０、及びｐＡＭβ１のプラスミドの複製起点である。
酵母宿主細胞で使用するための複製起点の例は、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３との組み合わせ、及びＡＲＳ４とＣＥＮ６との組み合わせである。
糸状菌細胞において有用な複製起点の例は、ＡＭＡ１及びＡＮＳ１である（Ｇｅｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ ９８：６１－６７；Ｃｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：９１６３－９１７５、国際公開第００／２４８８３号）。ＡＭＡ１遺伝子の単離及び当該遺伝子を含むプラスミド又はベクターの構築は、国際公開第００／２４８８３号に開示されている方法に従って実施され得る。
本発明のポリヌクレオチドの１つ超のコピーを宿主細胞に挿入して、変異体の産生を増加させることもできる。ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、配列の少なくとも１つの追加コピーを宿主細胞のゲノムに組み込むことによって、又は選択可能なマーカー遺伝子の増幅されたコピー、したがってポリヌクレオチドの追加のコピーを含む細胞が、適切な選択可能な薬剤の存在下で細胞を培養することによって選択され得る、ポリヌクレオチドと共に増幅可能かつ選択可能なマーカー遺伝子を含めることによって、得ることができる。
本発明の組換え発現ベクターを構築するために上述のエレメントをライゲーションするために使用される手順は、当業者に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９、上記を参照されたい）。
宿主細胞
本出願はまた、本発明の変異体の産生を誘導する１つ以上の制御配列に操作可能に連結された本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを含む、組換え宿主細胞も開示する。ポリヌクレオチドを含むコンストラクト又はベクターは、当該コンストラクト又はベクターが上記のように染色体組み込み体として又は自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞に導入される。用語「宿主細胞」は、複製中に生じた突然変異に起因する、親細胞と同一ではない親細胞の任意の後代を包含する。宿主細胞の選択は、変異体をコードしている遺伝子及びその起源に大きく依存する。
宿主細胞は、変異体の組換え産生において有用な任意の細胞、例えば原核生物又は真核生物であってもよい。
原核宿主細胞は、任意のグラム陽性又はグラム陰性細菌であってよい。グラム陽性細菌としては、バチルス属、クロストリジウム属、エンテロコッカス属、ゲオバチルス属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、オセアノバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、及びストレプトマイセス属が挙げられるが、これらに限定されない。グラム陰性細菌としては、カンピロバクター属、大腸菌（E.coli）、フラボバクテリウム属、フソバクテリウム属、ヘリコバクター属、イリオバクター属、ナイセリア属、シュードモナス属、サルモネラ属、及びウレアプラズマ属が挙げられるが、これらに限定されない。
細菌宿主細胞は、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・シルクランス、バチルス・クラウシイ、バチルス・コアグランス、バチルス・フィルムス、バチルス・ラウタス、バチルス・レンタス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・プミルス、バチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・サブチリス、及びバチルス・チューリンゲンシスの細胞が挙げられるがこれらに限定されない、任意のバチルス属の細胞であってもよい。
また、細菌宿主細胞は、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Streptococcus equisimilis）、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・ウベリス、及びストレプトコッカス・イクイ亜種ズーエピデミカスの細胞が挙げられるがこれらに限定されない、任意のストレプトコッカス属の細胞であってもよい。
また、細菌宿主細胞は、ストレプトマイセス・アクロモゲネス、ストレプトマイセス・アベルミチリス、ストレプトマイセス・コエリコラ、ストレプトマイセス・グリセウス、及びストレプトマイセス・リビダンスの細胞が挙げられるがこれらに限定されない、任意のストレプトマイセス属の細胞であってもよい。
バチルス属の細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，１９７９，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１－１１５を参照）、コンピテントセル形質転換（例えば、Ｙｏｕｎｇ ａｎｄ Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，１９６１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１：８２３－８２９、若しくはＤｕｂｎａｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｏｆｆ－Ａｂｅｌｓｏｎ，１９７１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６：２０９－２２１を参照）、エレクトロポレーション（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ ａｎｄ Ｄｏｗｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：７４２－７５１を参照）、又はコンジュゲーション（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｅ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５２７１－５２７８を参照）によって行うことができる。大腸菌細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｈａｎａｈａｎ，１９８３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７－５８０を参照）又はエレクトロポレーション（例えば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７－６１４５を参照）によって行うことができる。ストレプトマイセス属の細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション（例えば、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｐｒａｈａ）４９：３９９－４０５を参照）、コンジュゲーション（例えば、Ｍａｚｏｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：３５８３－３５８５）、又は形質導入（例えば、Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：６２８９－６２９４を参照）によって行うことができる。シュードモナス属の細胞へのＤＮＡの導入は、エレクトロポレーション（例えば、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６４：３９１－３９７を参照）、又はコンジュゲーション（例えば、Ｐｉｎｅｄｏ ａｎｄ Ｓｍｅｔｓ，２００５，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：５１－５７を参照）によって行うことができる。ストレプトコッカス属の細胞へのＤＮＡの導入は、天然コンピテント（例えば、Ｐｅｒｒｙ ａｎｄ Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ，１９８１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５－１２９７を参照）、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃａｔｔ ａｎｄ Ｊｏｌｌｉｃｋ，１９９１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ ６８：１８９－２０７を参照）、エレクトロポーテ－ション（例えば、Ｂｕｃｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３８００－３８０４を参照）、又はコンジュゲーション（例えば、Ｃｌｅｗｅｌｌ，１９８１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４５：４０９－４３６を参照）によって行うことができる。しかし、宿主細胞にＤＮＡを導入するための当該技術分野において既知の任意の方法を使用することができる。
また、宿主細胞は、哺乳類、昆虫、植物、又は真菌の細胞などの真核細胞であってもよい。
宿主細胞は、真菌細胞であってもよい。「真菌」とは、本明細書で使用するとき、子嚢菌類、担子菌類、ツボカビ類、及び接合菌類、並びに卵菌類及び全ての栄養胞子形成菌（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ ａｎｄ Ｂｉｓｂｙ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫによって定義）を含む。
真菌宿主細胞は、酵母細胞であってもよい。「酵母」は、本明細書で使用するとき、子嚢胞子形成酵母（エンドミセス目）、担子胞子形成酵母、及び不完全菌類（分芽菌）に属する酵母を含む。酵母の分類は将来的に変化する可能性があるので、本発明の目的では、酵母は、Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｙｅａｓｔ（Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｐａｓｓｍｏｒｅ，ａｎｄ Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ．９，１９８０）に記載のとおり定義されるものとする。
酵母宿主細胞は、カンジダ属、ハンゼヌラ属、クリベロマイセス属、ピキア属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、又はヤロウイア属の細胞、例えば、クリベロマイセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、サッカロマイセス・カルルスベルゲンシス、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・ジディアスタティカス、サッカロマイセス・ドゥグラシィ、サッカロマイセス・クルイベリ、サッカロマイセス・ノルベンシス、サッカロマイセス・オビホルミス、又はヤロウイア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）の細胞であってもよい。
真菌宿主細胞は、糸状菌細胞であってもよい。「糸状菌」は、（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９５，上記、によって定義される）真菌類及び卵菌類の亜門の全ての糸状体を含む。糸状菌は、一般的には、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合多糖類で構成される菌糸体壁を特徴とする。栄養生長は、菌糸の伸長によるものであり、炭素異化は、偏性好気性である。対照的に、サッカロマイセス・セレビシエなどの酵母による栄養生長は、単細胞の葉状体の出芽によるものであり、炭素異化は発酵性であり得る。
糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム、アスペルギルス、アウレオバシディウム、ビヤー力ンデラ、セリポリオプシス、クリソスポリウム、コプリヌス、コリオルス、クリプトコッカス、フィリバシディウム、フザリウム、フミコーラ、マグナポルテ、ムコール、ミセリオフィソーラ、ネオカリマスティクス、ニューロスポラ、ペシロマイセス、ペニシリウム、ファネロカエテ、フレビア、ピロマイセス、プレウロツス、シゾフィリウム、タラロマイセス、サーモアスカス、チェラビア、トリポクラジウム、トラメテス、又はトリコデルマの細胞であってもよい。
例えば、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・フォエティダス、アスペルギルス・フミガーツス、アスペルギルス・ジャポニクス、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリザエ、ヤケイロタケ（Bjerkandera adusta）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・カレギエア（Ceriporiopsis caregiea）、セリポリオプシス・ギルベスセンス（Ceriporiopsis gilvescens）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ceriporiopsis pannocinta）、セリポリオプシス・リブロサ（Ceriporiopsis rivulosa）、セリポリオプシス・スブルファ（Ceriporiopsis subrufa）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ceriporiopsis subvermispora）、クリソスポリウム・イノプス、クリソスポリウム・ケラチノフィルム、クリソスポリウム・ラックノウェンセ、クリソスポリウム・メルダリウム、クリソスポリウム・パンニコラ、クリソスポリウム・クイーンスランジクム、クリソスポリウム・トロピクム、クリソスポリウム・ゾナツム、コプリヌス・シネレウス、コリオルス・ヒルスツス、フザリウム・バクテリジオイデス、フザリウム・セレアリス、フザリウム・クロークウェレンス、フザリウム・クルモルム、フザリウム・グラミネアルム、フザリウム・グラミヌム、フザリウム・ヘテロスポルム、フザリウム・ネグンディ、フザリウム・オキシスポルム、フザリウム・レチクランツム、フザリウム・ロゼウム、フザリウム・サムブシヌム、フザリウム・サルコクロウム、フザリウムス・ポロトリキオイデス、フザリウム・スルフレウム、フザリウム・トルロスム、フザリウム・トリコテシオイデス、フザリウム・ベネナツム、フミコーラ・インソレンス、フミコーラ・ラヌギノサ、ムコール・ミエヘイ、ミセリオフィソーラ・テルモフィラ、ニューロスポラ・クラッサ、ペニシリウム・プルプロゲヌム、ファネロケーテ・クリソスポリウム、フレビア・ラジアタ（Phlebia radiata）、プレウロツス・エリンギイ（Pleurotus eryngii）、チエラビア・テレストリス、トラメテス・ビローサ（Trametes villosa）、トラメテス・ベルシコロル（Trametes versicolor）、トリコデルマ・ハルジアナム、トリコデルマ・コニンギイ、トリコデルマ・ロンギブラキアタム、トリコデルマ・レーシ、又はトリコデルマ・ビリデの細胞であってもよい。
真菌細胞は、それ自体既知のプロセスにおいて、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生を伴うプロセスによって形質転換され得る。アスペルギルス及びトリコデルマ宿主細胞の形質転換のための好適な手順は、欧州特許第２３８０２３号及びＹｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１４７０－１４７４、及びＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１４１９－１４２２に記載されている。フザリウム種を形質転換するのに好適な方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ ７８：１４７－１５６及び国際公開第９６／００７８７号に記載されている。酵母は、Ｂｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｉｎ Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １９４，ｐｐ １８２－１８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３及びＨｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２０によって記載されている手順を使用して形質転換され得る。
産生方法
本出願はまた、（ａ）本発明の宿主細胞を、変異体の発現に好適な条件下で培養することと、（ｂ）変異体を回収することと、を含む、本発明のリパーゼ変異体を産成する方法も開示する。
宿主細胞は、当該技術分野において既知の方法を使用して変異体の産生に好適な栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、実験室又は産業用発酵槽において、好適な培地中、変異体の発現及び／又は単離を可能にする条件下で実施される、振盪フラスコ培養又は小規模若しくは大規模発酵（連続、バッチ、流加、又は固形発酵を含む）によって培養され得る。培養は、当該技術分野において既知の手順を使用して、炭素及び窒素源並びに無機塩類を含む好適な栄養培地中で行われる。好適な培地は、商業供給者から入手可能であるか、又は（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログに）公開されている組成に従って調製され得る。変異体が栄養培地に分泌された場合、変異体を培地から直接回収することができる。変異体が分泌されない場合、細胞溶解物から回収することができる。
変異体は、変異体に特異的な当該技術分野において既知の方法を用いて検出され得る。これら検出方法としては、特異的抗体の使用、酵素生成物の形成、又は酵素基質の消失が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、酵素アッセイを使用して、実施例に記載されるものなどの変異体の活性を決定することができる。
変異体は、当該技術分野において既知の方法を使用して回収することができる。例えば、変異体は、回収、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、又は沈殿が挙げられるがこれらに限定されない、従来の手順によって栄養培地から回収することができる。
変異体は、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除）、電気泳動手順（例えば、分取等電点電気泳動）、溶解度差（例えば、硫安塩析）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、又は抽出が挙げられるがこれらに限定されない、当該技術分野において既知の様々な手順によって精製して（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）、実質的に純粋な変異体を得ることができる。
別の態様において、変異体を回収せずに、変異体を発現する本発明の宿主細胞を変異体源として使用する。
マイクロカプセル組成物
本発明において、リパーゼ、好ましくはリパーゼ変異体は、任意追加的にマイクロカプセルに封入される。マイクロカプセルの膜は、好ましくは、１ｋＤａを超える分子量を有する多分岐ポリアミンの架橋によって産生される。多分岐ポリアミンを架橋することによって形成される膜は、酵素を界面活性剤、特に洗剤中のアニオン性界面活性剤から分離することが可能であり、酵素の安定性に有害であることが知られている。
好ましくは、封入された酵素を洗剤中で使用する場合、カプセルは、例えば洗濯又は食器洗浄用途のように、洗剤を水に希釈した直後に酵素を実質的に放出することが可能である。好ましいマイクロカプセルは、この点に関して優れた特性を有し、好ましくは、封入された酵素全体を１分以内に放出することが可能である。
好ましいマイクロカプセルは、水で希釈すると、酵素を放出することが可能なコアポリマーの存在を必要としない。更に、本発明は、国際公開第９７／２４１７７号に記載されるように、早期放出を制御するために、酵素（複数可）がマイクロカプセルのコア内で沈殿した形態である必要はない。
半透膜を有し、カプセル内部の水分活性（液体洗剤に添加する前）が液体洗剤中よりも高いマイクロカプセル中に、本明細書に定義されるリパーゼ変異体及び任意追加的に他の酵素を封入すると、カプセルは、洗剤に添加されたときに（部分的に）崩壊を受け（水分が滲出する）、したがってより濃縮されてより粘稠な酵素がカプセル内部に包含されて残るであろう。膜の崩壊はまた、透過性の低下をもたらすことがある。これは、安定剤／ポリマー、特に膜を透過できないものを添加することによって、更に利用することができる。崩壊及び結果として生じる粘度の増加は、敵対成分（例えば、界面活性剤又は隔離剤）のカプセル内への拡散を低減／阻害し、したがって液体洗剤中の酵素の保存安定性が高まるであろう。酵素に感受性のある液体洗剤中の成分（例えば、酵素の基質として作用する成分）もまた、酵素による分解から保護される。洗浄中に液体洗剤は水で希釈され、したがって水分活性が高まる。水は、ここでカプセル内に拡散するであろう（浸透作用）。カプセルは膨潤し、膜が酵素に対して透過性になり、したがってカプセルが残り得るか、又は膜が単純に破裂して、この場合は酵素を放出するであろう。この概念は、液体洗剤中の敵対成分に対する酵素の安定化において非常に効率的であり、また逆に液体洗剤中の酵素感受性成分を酵素から保護する。
酵素に感受性があり、かつ酵素により分解され得る洗剤成分の例としては（カッコ内は関連酵素）、キサンタンガム（キサンタナーゼ）、エステル結合を有するポリマー（リパーゼ）、硬化ヒマシ油（リパーゼ）、香料（リパーゼ）、メチルエステルスルホネート界面活性剤（リパーゼ）、セルロース及びセルロース誘導体（例えば、ＣＭＣ）（セルラーゼ）、並びにデキストリン及びシクロデキストリン（アミラーゼ）が挙げられる。
また、感受性洗剤成分を本明細書に記載のマイクロカプセルに封入してもよく、したがって安定化することができる。感受性洗剤成分は、保存中に分解しやすい。このような洗剤成分としては、漂白化合物、漂白活性化剤、香料、ポリマー、ビルダー、界面活性剤などが挙げられる。
一般に、本明細書に記載のマイクロカプセルを使用して、洗剤組成物中の不適合／感受性成分／化合物を分離することができる。
洗剤組成物へのマイクロカプセルの添加は、例えば、不透明化効果（小型マイクロカプセルの使用）、又は明確に見える粒子の効果（大型マイクロカプセルの使用）を提供することにより、洗剤組成物又は単位用量物品の外観に影響を与えるために使用することができる。マイクロカプセルはまた、任意追加的に有色であってもよい。
マイクロカプセルは、酵素製品の取り扱い及び加工中に酵素の塵埃濃度を低減するために使用することができる。
特記しない限り、全ての百分率は、本出願全体にわたって重量パーセント（％ｗ／ｗ）として示される。
マイクロカプセルの調製
好ましいマイクロカプセルは、典型的には、水と非混和性である連続体に水滴を形成することによって、すなわち、典型的には油中水型エマルションを調製することによって、及び続いて架橋剤の添加による界面重合によって膜を形成することにより製造される。最終的に硬化させた後、カプセルを回収し、更にすすぎ、当該技術分野において既知の方法によって配合することができる。カプセル配合物は、その後、洗剤に添加される。
封入されるペイロード、主な膜構成要素、及び最終的な追加の成分は、水相中に見られる。水液滴を合体（乳化剤、エマルション安定剤、界面活性剤など）に安定化させる成分は連続体に見られ、架橋剤も連続体を介して添加される。
エマルションは、例えば、機械的撹拌、滴下プロセス、膜乳化、マイクロフルイディクス、音波処理などによって、当該技術分野において既知の任意の方法で調製することができる。場合によっては、相の単純な混合により、エマルションが自動的に生じ、しばしば自己乳化と呼ばれる。狭いサイズ分布をもたらす方法を使用することは、利点である。
架橋剤（１種又は複数）は、典型的には、その後、直接エマルションに添加されるか、又はより典型的には、連続相に可溶性の溶媒で架橋剤の溶液を調製することによってエマルションに添加される。本明細書のエマルション及び架橋剤又は溶液は、当該技術分野で使用される従来の方法によって、例えば、単純な混合によって、又はインラインミキサーによりエマルション及び架橋剤溶液の流れを慎重に制御することによって、混合することができる。
場合によっては、カプセルの硬化は、膜形成を完了するために必要とされ得る。硬化は、界面重合反応を終了させるためにしばらくカプセルを単純に撹拌することによって達成され得る。他の場合には、膜形成は、反応クエンチャの添加によって停止され得る。
カプセルは、例えば、国際公開第９９／０１５３４号に記載されているように、洗剤中の粒子の凝集を阻害又は低減するために、成分を膜上に反応させることによって事後修飾されてもよい。
製造されたカプセルは、当該技術分野において既知の方法によって、例えば、カプセル分散液の濾過、遠心分離、蒸留、又はデカンテーションによって、単離又は濃縮され得る。
得られたカプセルは、例えば、保存、輸送、及び後の取り扱い、並びに洗剤への添加のために、所望の特性を製品に付与するように界面活性剤を添加することにより、更に配合されてもよい。他のマイクロカプセル配合物としては、レオロジー変性剤、殺生物剤（例えば、Ｐｒｏｘｅｌ）、ｐＨ調整用の酸／塩基（マイクロカプセル内部も調整するであろう）、及び水分活性調整用の水が挙げられる。
カプセル形成プロセスは、以下の工程を含むことができる。
－最初の水相及び油相の調製、
－油中水型エマルションの形成、
－界面重合による膜形成、
－任意の事後修飾、
－任意の単離及び／又は配合、
－洗剤への添加。
プロセスは、バッチプロセス、又は連続若しくは半連続プロセスのいずれかであってもよい。
本明細書に記載されるように、マイクロカプセルは、その周囲に実質的に均一な膜を有する小さい水性球体である。マイクロカプセル内部の物質が、コア、内部相、又は充填物と称されるのに対して、この膜は、時としてシェル、コーティング、又は壁と称される。本明細書に記載の好ましいマイクロカプセルは、０．５μｍ～２ミリメートルの直径を有する。好ましくは、マイクロカプセルの平均径は、１μｍ～１０００μｍの範囲であり、より好ましくは５μｍ～５００μｍの範囲、更により好ましくは１０μｍ～５００μｍの範囲、更により好ましくは５０μｍ～５００μｍの範囲、最も好ましくは５０μｍ～２００μｍの範囲である。代替的に、マイクロカプセルの直径は、０．５μｍ～３０μｍの範囲、又は１μｍ～２５μｍの範囲である。マイクロカプセルの直径は、重合完了後に油相中で測定される。カプセルの直径は、周囲の化学環境の水分活性に応じて変化し得る。
本発明において使用され得る、酵素のマイクロカプセル化は、界面重合によって実施することができ、重合反応中の２つの反応物質は、界面で接触して急速に反応する。この方法の基本原理は、ポリアミンと、架橋剤として作用する酸誘導体（通常は酸ハロゲン化物）との反応である。ポリアミンは、好ましくは実質的に水溶性である（遊離塩基形態の場合）。適切な条件下では、薄い可撓性膜が界面で急速に形成される。重合を実施する１つの方法は、酵素及びポリアミンの水溶液を使用することであり、この水溶液は非水溶媒（及び乳化剤）で乳化され、酸誘導体を含有する溶液が添加される。アルカリ剤は、反応中に形成される酸を中和するために、酵素溶液中に存在してもよい。ポリマー（ポリアミド）膜は、エマルション液滴の界面で瞬時に形成される。マイクロカプセルのポリマー膜は、典型的にはカチオン性の性質であり、したがってアニオン性の化合物と結合／錯体化する。
マイクロカプセルの直径は、例えば撹拌速度によって制御される、エマルション液滴のサイズによって決定される。
エマルション
エマルションは、第２の液相内の１つの液相の一時的又は永久的な分散体である。第２の液体は、一般に連続相と呼ばれる。界面活性剤は、エマルションの形成及び安定化を補助するために一般的に使用される。全ての界面活性剤がエマルションを等しく安定化させるとは限らない。界面活性剤の種類及び量は、特にエマルションの調製及び物理的安定性、並びに希釈及び更なる加工中の安定性に関して最適なエマルションの有用性のために選択される必要がある。物理的安定性とは、分散形態でエマルションを維持することを指す。合体、凝集、容器壁への吸着、沈降、及びクリーミングなどのプロセスは、物理的不安定性の形態であり、回避されるべきである。好適な界面活性剤の例は、国際公開第９７／２４１７７号、ページ１９～２１及び国際公開第９９／０１５３４．号に記載されている。
エマルションは、分散液相が単純な均質な液体である単純なエマルション、又は分散液相が二重エマルション又は複数のエマルションなどの液相若しくは固相の不均質な組み合わせであるより複雑なエマルションのいずれかとして更に分類することができる。例えば、水相自体が乳化油相を更に含有する油中水型エマルション又は複数のエマルションが形成されてもよく、この種のエマルションは、油中水中油型（ｏ／ｗ／ｏ）エマルションと指定され得る。代替的に、水相が、懸濁液エマルションと呼ばれることが多い分散固体相を含有する油中水型エマルションが形成されてもよい。他のより複雑なエマルションが説明され得る。そのような系を説明するには困難が内在するため、用語エマルションは、エマルションの形態又は存在する相の種類及び数を必ずしも限定することなく、単純及びより複雑なエマルションの両方を説明するために使用される。
ポリアミン
膜の剛性／可撓性及び透過性は、主にポリアミンの選択によって影響を受ける。本明細書に記載のカプセル化に使用される好ましいポリアミンは、多分岐ポリアミンを含む。各分岐（好ましくは末端に一級アミノ基を有する）は、膜ネットワークにおける係留点として機能し、それによって本発明の有利な特性を付与する。本明細書に記載の多分岐ポリアミンは、好ましくは、２つより多い分岐点及び２つより多い反応性アミノ基（架橋剤と反応できる、すなわち一級及び二級アミノ基）を有するポリアミンを含む。好ましいマイクロカプセルの調製に関して、多分岐ポリアミンは、エマルションを調製する際に出発原料として使用される（エマルションは、他の出発原料からはそのままで形成されない）。好ましいマイクロカプセルの魅力的な特性を得るために、ポリアミンの多分岐構造は、出発原料として存在しなければならない。
一級アミンは常に分岐の末端に位置することになることから、分岐点の数と一級アミンの数との間には密接な関係があり、直鎖アミンは、２つの一級アミンのみを含有し得る。各分岐点について、このような直鎖ジアミンに仮定的に導入されると、１つ以上の一級アミンが導入分岐の末端に導入されることになる。この文脈において、一級アミノ基は、分岐の一部、すなわち分岐の終点として理解される。例えば、トリス（２－アミノエチル）アミン及び１，２，３－プロパントリアミンの両方を、１つの分岐点を有する分子とみなす。好ましいマイクロカプセルに関しては、ポリアミンは、少なくとも４つの一級アミンを有する。分岐点は、前述の実施例にあるような脂肪族炭化水素から、又は例えば、３，３’－ジアミノベンジジン中などの、不飽和炭素結合から、又はＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラキス－（２－アミノエチル）エチレンジアミン中などの、三級アミノ基から導入され得る。
好ましくは、多分岐ポリアミンは、ペプチド又はタンパク質ではない。好ましくは、反応性アミノ基は、多分岐ポリアミンの分子量の少なくとも１５％、例えば２０％超、又は２５％超を構成する。好ましくは、多分岐ポリアミンの分子量は、少なくとも１ｋＤａであり、より好ましくは、多分岐ポリアミンの分子量は、少なくとも１．３ｋＤａである。好ましくは、多分岐ポリアミンは、２つを超える分岐点及び２つを超える反応性アミノ基を有する、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、及びその修飾物であり、反応性アミノ基は、ＰＥＩの分子量の少なくとも１５％、例えば２０％超、又は２５％超を構成する。好ましくは、ＰＥＩの分子量は、少なくとも１ｋＤａである。異なる多分岐ポリアミンの組み合わせをマイクロカプセルの調製に使用してもよい。
マイクロカプセルの有利な特性（例えば、酵素保存安定性、酵素漏出の低減、洗剤成分の流入の低減）は、１ｋＤａ未満の分子量を有する１つ以上の小さなアミンを添加することによって向上され得る。小さなアミンは、好ましくは実質的に水溶性であり（遊離塩基形態の場合）、エチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ヘキサンジアミン、ジエチレンテトラミン、エチレンテトラミン、ジアミノベンゼン、ピペラジン、テトラメチレンペンタミン、又は好ましくはジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）などの物質であり得る。本発明のマイクロカプセルの調製時に、小さなアミンは、小さなアミン及び多分岐ポリアミンの総含有量の５０重量％以下、好ましくは４０重量％以下、３０重量％以下、２０重量％以下、１０重量％以下、又は５重量％以下の量で添加されてもよい。
好ましい架橋剤は、アミンと反応して共有結合を形成することが可能な少なくとも２つの基／部位を有する分子を含む。架橋剤は、好ましくは油溶性であり、酸無水物又は酸ハロゲン化物、好ましくは酸塩化物の形態であり得る。例えば、架橋剤は、アジピン酸クロリド、セバシン酸クロリド、ドデカン二酸クロリド、フタル酸クロリド、テレフタル酸クロリド、イソフタル酸クロリド、又はトリメソイルクロリドであってもよいが、好ましくは、架橋剤は、テレフタル酸クロリド又はトリメソイルクロリドである。
具体的に企図される実施形態において、本発明のマイクロカプセル組成物は、本発明のリパーゼ変異体を含む国際公開第２０１４／１７７７０９号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものである。また上述のように、マイクロカプセルは、ポリオールなどのアルコールを更に含んでもよい。好ましいマイクロカプセルにおいて、（ａ）はポリエチレンイミンを含む。好ましいマイクロカプセルにおいて、（ｂ）は、エチレンアミン又はアルカノールアミンを含む。好ましい実施形態において、（ｂ）は、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、ビス（３－アミノプロピル）アミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ヘキサメチレンジアミン、ジアミノベンゼン、ピペラジン、及びテトラエチレンペンタアミンからなる群から選択され、より好ましくは（ｂ）は、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、ビス（３－アミノプロピル）アミン、モノエタノールアミン、及びジエタノールアミンからなる群から選択される。好ましくは、マイクロカプセルは、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、又はＺｎ２＋イオンの供給源、例えばＭｇ２＋、Ｃａ２＋、又はＺｎ２＋の難溶性塩を含む。好ましくは、酸塩化物、例えば、イソフタロイルクロリド、テレフタロイルクロリド、又はトリメソイルクロリドは、架橋剤として使用される。好ましい実施形態では、膜は、界面重合によって産生される。
好適なマイクロカプセルは、本明細書に記載のリパーゼ変異体を含む国際公開第２０１５／１１４４７８４号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
洗剤組成物
好ましい洗剤組成物は、布地を洗浄及び／又は処理するための洗濯洗剤組成物である。好ましい洗剤組成物は、液体形態である。本発明は、特に、水溶性フィルムと、洗剤組成物、好ましくは液体洗濯洗剤組成物と、を含む、水溶性単位用量物品を対象とする。
水溶性単位用量物品
水溶性フィルム及び液体洗剤組成物について、以下により詳細に説明する。
水溶性単位用量物品は、単位用量物品が水溶性フィルムによって取り囲まれた少なくとも１つの内部区画を含むような形状の水溶性フィルムを含む。単位用量物品は、内部区画を画定するように互いに封止された、第１の水溶性フィルムと、第２の水溶性フィルムとを含んでよい。水溶性単位用量物品は、保管中に洗剤組成物が区画から漏れ出さないように構成される。しかしながら、水溶性単位用量物品を水に加えると、水溶性フィルムが溶解して、内部区画の内容物が洗浄液中に放出される。
区画は、洗剤組成物を保持する、単位用量物品内の密閉された内部空間を意味する、と理解すべきである。製造中、第１の水溶性フィルムは、洗剤組成物が添加される開口区画を含むような形状でよい。次に、区画の開口部を閉じる向きで、第１のフィルムを第２の水溶性フィルムで覆う。次いで、第１及び第２のフィルムは、封止領域に沿って共に封止される。
単位用量物品は、２つ以上の区画、更には少なくとも２つの区画、又は更には少なくとも３つの区画を含んでよい。区画は、重ね合わせる配置で、すなわち、一方が他方の上に位置するように配置されてよい。このような配向では、単位用量物品は、上部、中央部及び下部の３つのフィルムを含む。代替的に、区画は、隣り合った配置で、すなわち、一方が他方に隣接する配向で位置してよい。区画は、更には「タイヤ及びリム」構成での配置であってよく、すなわち、第１の区画は、第２の区画に隣接して位置するが、第１の区画は、第２の区画を少なくとも部分的に取り囲み、第２の区画を完全には囲まない。代替的に、１つの区画が別の区画内に完全に囲まれてもよい。
単位用量物品が少なくとも２つの区画を含む場合、区画の一方が他方の区画より小さくてもよい。単位用量物品が少なくとも３つの区画を含む場合、区画のうちの２つが第３の区画より小さくてもよく、好ましくは、小さい方の区画が大きい方の区画上に重ね合わせられている。重ね合わせられた区画は、好ましくは、隣り合って配置される。
多区画配向では、本発明による洗剤組成物が区画の少なくとも１つ内に含まれてもよい。例えば、洗濯洗剤組成物は１つの区画のみに含まれてもよく、あるいは２つの区画、又は更には３つの区画に含まれてもよい。
各区画は、同一の組成物又は異なる組成物を含んでもよい。異なる組成物は全て同一形態であってもよく、又は異なる形態であってもよい。
水溶性単位用量物品は少なくとも２つの内部区画を含んでよく、液体洗濯洗剤組成物が本区画の少なくとも１つ内に含まれ、好ましくは、単位用量物品が少なくとも３つの区画を含み、洗剤組成物が本区画の少なくとも１つ内に含まれる。
図１は、本発明による水溶性単位用量物品（１）を開示する。水溶性単位用量物品（１）は、第１の水溶性フィルム（２）と第２の水溶性フィルム（３）を含み、これらは密封領域（４）で共に封止されている。液体洗濯洗剤組成物（５）は、水溶性可溶性単位用量物品（１）内に含まれる。
水溶性フィルム
本発明に有用なフィルムは、水溶性又は水分散性である。好ましくは、水溶性フィルムの厚さは、２０μｍ～１５０μｍ、好ましくは３５μｍ～１２５μｍ、更により好ましくは５０μｍ～１１０μｍ、最も好ましくは約７６μｍである。
好ましくは、最大孔径が２０μｍのガラスフィルタの使用後に、本明細書に記載の方法によって測定したフィルムの水溶性は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、又は更には少なくとも９５％である。
予め秤量した３Ｌのビーカーに、５グラム±０．１グラムのフィルム材料を入れ、２Ｌ±５ｍＬの蒸留水を添加する。これを、３０℃にて３０分間、６００ｒｐｍに設定した電磁攪拌器（Ｌａｂｌｉｎｅモデル番号１２５０又は等価物）及び５ｃｍの電磁攪拌器により激しく攪拌した。次いで、混合物を、上記で定義した孔径（最大２０μｍ）の折り畳んだ定性分析用焼結ガラスフィルタにより濾過する。任意の従来の方法によって、回収した濾液から水を乾燥させ、残った材料の重量を求める（これが溶解画分又は分散画分である）。次いで、溶解度又は分散性の百分率を計算することができる。
好ましいフィルム材料は、好ましくはポリマー材料である。フィルム材料を、当該技術分野において公知の、例えば、ポリマー材料の注型成形、吹込成形、押出成形又は吹込押出成形によって得ることができる。
パウチ材料として使用するのに好適な好ましいポリマー、コポリマー又はこれらの誘導体は、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアルキレンオキシド、アクリルアミド、アクリル酸、セルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、セルロースアミド、ポリビニルアセテート、ポリカルボン酸及び塩、ポリアミノ酸又はペプチド、ポリアミド、ポリアクリルアミド、マレイン酸／アクリル酸のコポリマー、デンプン及びゼラチンを含む多糖類、キサンタン及びカラゴムなどの天然ゴムから選択される。より好ましいポリマーは、ポリアクリレート及び水溶性アクリレートコポリマー、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デキストリン、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マルトデキストリン、ポリメタクリレートから選択され、最も好ましくは、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルコールコポリマー及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、並びにこれらの組み合わせから選択される。好ましくは、パウチ材料中のポリマー、例えば、ＰＶＡポリマーの濃度は、少なくとも６０％である。ポリマーは、任意の重量平均分子量を有してもよく、好ましくは、約１０００～１，０００，０００、より好ましくは、約１０，０００～３００，０００、更により好ましくは、約２０，０００～１５０，０００である。
好ましくは、水溶性フィルムは、ポリビニルアルコールポリマー又はコポリマー、好ましくは、ポリビニルアルコールポリマー及び／又はポリビニルアルコールコポリマーのブレンドを含み、好ましくは、スルホン化及びカルボキシル化アニオン性ポリビニルアルコールコポリマー、特にカルボキシル化アニオン性ポリビニルアルコールコポリマーから選択され、最も好ましくは、ポリビニルアルコールホモポリマーとカルボキシル化アニオン性ポリビニルアルコールコポリマーのブレンドを含む。
好ましいフィルムは、冷水、すなわち、加熱されていない蒸留水中で良好な溶解を示すものである。好ましくは、このようなフィルムは、２４℃、更により好ましくは１０℃の温度で、良好な溶解を示す。良好な溶解とは、上述の最大孔径が２０μｍのガラスフィルタの使用後に、本明細書に記載の方法により測定したフィルムの示す水溶性が、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、又は更には少なくとも９５％であることを意味する。
好ましいフィルムには、Ｍｏｎｏｓｏｌによって商品参照番号Ｍ８６３０、Ｍ８９００、Ｍ８７７９、Ｍ８３１０として供給されているものがある。
フィルムは、不透明、透明又は半透明であってもよい。フィルムは、印刷された領域を含んでもよい。
印刷領域は、フレキソ印刷又はインクジェット印刷などの標準的な技術を使用して得ることができる。
フィルムは、嫌悪剤、例えば苦味剤を含んでもよい。好適な苦味剤としては、ナリンギン、サッカロースオクタアセテート、塩酸キニーネ、デナトニウムベンゾエート、又はこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。任意の好適な濃度の嫌悪剤をフィルムに使用してよい。好適な濃度としては、１～５０００ｐｐｍ、又は更には１００～２５００ｐｐｍ、又は更には２５０～２０００ｒｐｍが挙げられるが、これらに限定されない。
洗剤組成物
水溶性単位用量物品は、洗剤組成物、好ましくは液体洗濯洗剤組成物を含む。用語「液体洗濯洗剤組成物」は、布地を濡らし、処理することが可能な液体を含む、任意の洗濯洗剤組成物を指し、限定するものではないが、液体、ゲル、ペースト、分散液などが挙げられる。液体組成物は、好適に細分された形態の固体又は気体を含み得るが、液体組成物は、錠剤又は顆粒などの、全体として非流動性である形態を除外する。
理論に束縛されるものではないが、洗浄液中へのより迅速な放出が可能となるため、好ましくは、任意追加的に封入されたリパーゼ変異体は液体洗濯洗剤に配合される。これは、未溶解の粉末ペースト状相における固着のリスクが最小化された迅速かつ低温の洗浄サイクルにおいて特に有益である。
液体洗剤組成物は、布地の手洗い作業に使用されてもよいし、自動洗濯機での布地洗濯作業に使用されてもよい。
洗剤補助剤
繊細組成物、好ましくは液体洗濯洗剤組成物は、例えば、界面活性剤、ポリマー、ビルダー、移染防止剤、分散剤、酵素、酵素安定剤、触媒材料、漂白剤、漂白活性化剤、過酸化水素、過酸化水素源、事前形成された過酸、ポリマー分散剤、再付着防止剤、増白剤、抑泡剤、審美的染料、色相染料、乳白剤、香料、香料送達系、構造化剤、ヒドロトロープ、加工助剤、溶媒、顔料、凝集助剤、キレート剤、及びそれらの混合物から選択される洗剤補助剤を含む。
洗剤補助剤は、好ましくは界面活性剤を含み、特に洗浄組成物については、界面活性剤は、好ましくは５０：１～１：１０、又はより好ましくは２０：１～１：２の重量比で、好ましくはアニオン性及び／又は非イオン性界面活性剤を含む。
洗剤組成物は、好ましくは、当該洗剤組成物の５０重量％以下、好ましくは５重量％～５０重量％、より好ましくは７．５重量％～４５重量％、更により好ましくは１０重量％～４０重量％、又は更により好ましくは１２重量％～３７重量％、最も好ましくは１５重量％～３０重量％の非石鹸アニオン性界面活性剤を含む。好ましくは、非石鹸アニオン性界面活性剤は、直鎖アルキルベンゼンスルホネート、アルコキシル化アルキルサルフェート、又はこれらの混合物を含む。より好ましくは、非石鹸アニオン性界面活性剤は、直鎖アルキルベンゼンスルホネート及びアルコキシル化アルキルサルフェートの混合物、より好ましくは直鎖アルキルベンゼンスルホネート及びエトキシル化アルキルサルフェートの混合物である。
好ましくは、直鎖アルキルベンゼンスルホネートとアルコキシル化アルキルサルフェートとの重量比、より好ましくは直鎖アルキルベンゼンスルホネートとエトキシル化アルキルサルフェートとの重量比は、１：２～２０：１、好ましくは１．１：１～１５：１、より好ましくは１．２：１～１０：１、更により好ましくは１．３：１～５：１、最も好ましくは１．４：１～３：１である。
直鎖アルキルベンゼンスルホネートのエトキシル化アルキルサルフェートに対する重量比は、１：１０～２０：１、好ましくは１：７～３：１、より好ましくは１：５～１．５：１であり得る。
好ましくは、液体組成物中の全アニオン性界面活性剤（すなわち、当該液体組成物中に存在する全てのアニオン性界面活性剤）：非イオン性界面活性剤の重量比は、５：１～２３：１である。
好ましくは、非石鹸アニオン性界面活性剤は、アミン、好ましくは、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、又はこれらの混合物から選択されるアミン、より好ましくはモノエタノールアミンで中和される。
洗剤組成物は、好ましくは、当該液体洗濯洗剤組成物の０重量％～４０重量％、好ましくは０．０１重量％～３０重量％、より好ましくは０．１重量％～２０重量％、最も好ましくは０．１５重量％～１５重量％の非イオン性界面活性剤を含む。好ましくは、非イオン性界面活性剤は、アルコールアルコキシレート、オキソ合成アルコールアルコキシレート、ゲルベ（Guerbet）アルコールアルコキシレート、アルキルフェノールアルコールアルコキシレート、又はこれらの混合物から選択される。
好ましくは、洗剤組成物は、当該液体洗剤組成物の１．５重量％～２０重量％、より好ましくは２重量％～１５重量％、更により好ましくは３重量％～１０重量％、最も好ましくは４重量％～８重量％の石鹸、好ましくは脂肪酸塩、より好ましくはアミン中和された脂肪酸塩を含み、好ましくは、当該アミンは、アルカノールアミン、より好ましくは、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、又はこれらの混合物から選択され、より好ましくは、モノエタノールアミンである。
洗剤組成物は、好ましくは、カチオン性多糖類、好ましくは、カチオン変性ヒドロキシエチルセルロース、カチオン変性ヒドロキシプロピルセルロース、カチオン変性及び疎水変性ヒドロキシエチルセルロース、カチオン変性及び疎水変性ヒドロキシプロピルセルロース、又はこれらの混合物、より好ましくは、カチオン変性ヒドロキシエチルセルロース、カチオン変性及び疎水変性ヒドロキシエチルセルロース、又はこれらの混合物から選択されるカチオン性多糖類を含む。カチオン性多糖類は、好ましくは、液体洗濯洗剤組成物の０．０５重量％～３重量％、好ましくは０．１重量％～２重量％、より好ましくは０．２重量％～１重量％、最も好ましくは０．２５重量％～０．７５重量％存在する。
好ましくは、洗剤組成物は、アルコキシル化ポリエチレンイミン、好ましくは、エトキシル化ポリエチレンイミンを含む。好ましくは、液体洗濯洗剤組成物は、当該液体洗濯洗剤組成物の０．１重量％～１０重量％、好ましくは０．５重量％～７重量％、より好ましくは１重量％～５重量％のエトキシル化ポリエチレンイミンを含む。
水溶性単位用量物品は、好ましくは、当該単位用量物品の２０重量％以下、又はより好ましくは１５重量％以下の水を含み、好ましくは当該単位用量物品の０．１重量％～１５重量％、より好ましくは１重量％～１２．５重量％の水を含む。
好ましくは、水溶性単位用量物品は、液体洗濯洗剤組成物の１０重量％～６０重量％、好ましくは１２重量％～５０重量％、最も好ましくは１５重量％～４０重量％の非水性溶媒を含み、好ましくは、当該非水性溶媒は、１，２－プロパンジオール、グリセロール、ソルビトール、ジプロピレングリコール、トリプロピレングリコール、又はこれらの混合物から選択される。
酵素－組成物は、洗浄性能、及び／又は布地ケア効果を提供する、本明細書に記載のマイクロカプセルに任意追加的に封入された１種以上の酵素を含み得る。好適な酵素の例としては、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、ペクテートリアーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β－グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、クロロフィラーゼ、アミラーゼ、又はこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。典型的な組み合わせは、例えば、プロテアーゼ及びリパーゼをアミラーゼと共に含んでよい酵素カクテルである。本発明の組成物中に存在する場合、上記の更なる酵素は、組成物の約０．００００１重量％～約２重量％、約０．０００１重量％～約１重量％、又は約０．００１重量％～約０．５重量％の酵素タンパク質濃度で存在してよい。
概して、選択された酵素（複数可）の特性は、選択された洗剤と適合しなければならず（すなわち、ｐＨ最適条件、他の酵素及び非酵素成分との適合性等）、酵素（複数可）は、有効量で存在しなければならない。
リパーゼ変異体は、任意追加的にマイクロカプセルに封入されてもよい。加えて、本発明の洗剤組成物は、封入形態の１種以上の追加の酵素を更に含んでもよい。好適な酵素の例は、プロテアーゼ、アミラーゼ、追加のリパーゼ、セルラーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ、ＤＮＡｓｅ、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ペルヒドロラーゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
組成物中の酵素（複数可）は、プロテアーゼ（例えば、サブチリシン又はメタロプロテアーゼ）、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キサンタナーゼ、キシラナーゼ、ＤＮＡｓｅ、ペルヒドロラーゼ、オキシドレダクターゼ（例えば、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼ、ペルオキシゲナーゼ，及び／又はハロペルオキシダーゼ）などの、洗濯洗剤又は食器洗浄洗剤（洗剤酵素）に含むのに好適である１種以上の酵素を含み得る。好ましい洗剤酵素は、プロテアーゼ（例えば、サブチリシン又はメタロプロテアーゼ）、リパーゼ、アミラーゼ、リアーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、ＤＮＡｓｅ、ペルヒドロラーゼ、及びオキシドレダクターゼ（例えば、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼ、ペルオキシゲナーゼ、及び／又はハロペルオキシダーゼ）、又はこれらの組み合わせである。より好ましい洗剤酵素は、プロテアーゼ（例えば、サブチリシン又はメタロプロテアーゼ）、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、及びマンナナーゼ、又はこれらの組み合わせである。
組成物又はマイクロカプセル組成物は、０．１％（ｗ／ｗ）超の活性酵素タンパク質、特に本発明のリパーゼ変異体、好ましくは、０．２５％超、より好ましくは０．５％超、より好ましくは１％超、より好ましくは２．５％超、より好ましくは５％超、より好ましくは７．５％超、より好ましくは１０％超、より好ましくは１２．５％超、より好ましくは１５％超、更により好ましくは２０％超、最も好ましくは２５％（ｗ／ｗ）超の活性酵素タンパク質を含み得る。
一態様において、好ましい酵素は、セルラーゼを含む場合がある。好適なセルラーゼとしては、細菌由来又は真菌由来のセルラーゼが挙げられる。化学的に修飾された又はタンパク質操作された突然変異体が含まれる。好適なセルラーゼとしては、バチルス属、シュードモナス属、フミコーラ属、フザリウム属、チェラビア属、アクレモニウム属由来のセルラーゼ、例えば、米国特許第４４３５３０７号、米国特許第５６４８２６３号、同第５６９１１７８号、同第５７７６７５７号、及び国際公開第８９／０９２５９号に開示されているフミコーラ・インソレンス、ミセリオフィソーラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、及びフザリウム・オキシスポルムから産生される真菌セルラーゼが挙げられる。
特に好適なセルラーゼは、色彩維持利益（colour care benefits）を有するアルカリ性セルラーゼ又は中性セルラーゼである。このようなセルラーゼの例は、欧州特許第０４９５２５７号、同第０５３１３７２号、国際公開第９６／１１２６２号、同第９６／２９３９７号、同第９８／０８９４０号に記載のセルラーゼである。他の例は、国際公開第９４／０７９９８号、欧州特許第０５３１３１５号、米国特許第５４５７０４６号、同第５６８６５９３号同第５７６３２５４号、国際公開第９５／２４４７１号、同第９８／１２３０７号、及び国際出願ＰＣＴ／ＤＫ９８／００２９９号に記載されているものなどのセルラーゼ変異体である。
市販のセルラーゼとしては、Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ（商標）及びＣａｒｅｚｙｍｅ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、Ｃｌａｚｉｎａｓｅ（商標）、及びＰｕｒａｄａｘ ＨＡ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）、並びにＫＡＣ－５００（Ｂ）（商標）（Ｋａｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が挙げられる。
一態様では、好ましい酵素は、プロテアーゼを含む場合がある。好適なプロテアーゼとしては、細菌、真菌、植物、ウイルス、又は動物起源のもの、例えば植物又は微生物起源のものが挙げられる。微生物由来のプロテアーゼが好ましい。化学的に修飾された又はタンパク質操作された突然変異体が含まれる。これは、セリンプロテアーゼ又はメタロプロテアーゼ等のアルカリプロテアーゼであり得る。セリンプロテアーゼは、例えばトリプシンのようなＳ１ファミリーのものであってもよく、サブチリシンのようなＳ８ファミリーのものであってもよい。金属プロテアーゼは、例えばファミリーＭ４のテルモリシン、又はＭ５、Ｍ７若しくはＭ８ファミリーのもの等の他の金属プロテアーゼであってもよい。
用語「サブチラーゼ」は、Ｓｉｅｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｎｇ．４（１９９１）７１９－７３７及びＳｉｅｚｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６（１９９７）５０１－５２３によるセリンプロテアーゼのサブグループを指す。セリンプロテアーゼは、基質と共有結合による付加物を形成するセリンを活性部位に有することによって特徴付けられるプロテアーゼのサブグループである。サブチラーゼは、サブチリシンファミリー、テルミターゼファミリー、プロテイナーゼＫファミリー、ランチビオティックペプチダーゼファミリー、ケキシンファミリー、及びピロリシンファミリーの６つの下位分類に分類することができる。
サブチラーゼの例は、米国特許第７２６２０４２号及び国際公開第０９／０２１８６７号に記載のバチルス・レンタス、Ｂ．アルカロフィラス、Ｂ．バチルス、Ｂ．アミロリケファシエンス、バチルス・プミルス、及びバチルス・ギブソニイなどのバチルス属、並びに国際公開第８９／０６２７９号に記載されているサブチリシン・レンタス、サブチリシン・ノボ、サブチリシン・カールスベルク、バチルス・リケニフォルミス、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシン３０９、サブチリシン１４７、及びサブチリシン１６８、並びにプロテアーゼＰＤ１３８（国際公開第９３／１８１４０号）に由来するものである。他の有用なプロテアーゼは、国際公開第９２／１７５１７７号、同第０１／０１６２８５号、同第０２／０２６０２４号及び同第０２／０１６５４７号に記載されているものであり得る。トリプシン様プロテアーゼの例は、国際公開第８９／０６２７０号、同第９４／２５５８３号、及び同第０５／０４０３７２に記載されている（例えばブタ又はウシ起源）トリプシン及びフザリウムプロテアーゼ、並びに国際公開第０５／０５２１６１号及び同第０５／０５２１４６号に記載されているセルロモナス由来のキモトリプシンプロテアーゼである。
更なる好ましいプロテアーゼは、例えば、国際公開第９５／２３２２１号に記載されているようなバチルス・レンタスＤＳＭ ５４８３由来のアルカリプロテアーゼ、並びに国際公開第９２／２１７６０号、同第９５／２３２２１号、欧州特許第１９２１１４７号及び同第１９２１１４８号に記載されているその変異体である。
メタロプロテアーゼの例は、バチルス・アミロリケファシエンスに由来するもの等の国際公開第０７／０４４９９３号（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔ．）に記載されているような中性メタロプロテアーゼである。
有用なプロテアーゼの例としては、国際公開第９２／１９７２９号、同第９６／０３４９４６号、同第９８／２０１１５号、同第９８／２０１１６号、同第９９／０１１７６８号、同第０１／４４４５２号、同第０３／００６６０２号、同第０４／０３１８６号、同第０４／０４１９７９号、同第０７／００６３０５号、同第１１／０３６２６３号、同第１１／０３６２６４号に記載される変異体、特に、ＢＰＮ’番号付けを用いた場合に以下の位置３、４、９、１５、２７、３６、５７、６８、７６、８７、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１１８、１２０、１２３、１２８、１２９、１３０、１６０、１６７、１７０、１９４、１９５、１９９、２０５、２０６、２１７、２１８、２２２、２２４、２３２、２３５、２３６、２４５、２４８、２５２、及び２７４のうちの１つ以上に置換を有する変異体がある。より好ましいサブチラーゼ変異体は、以下の突然変異Ｓ３Ｔ、Ｖ４Ｉ、Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｋ２７Ｒ、＊３６Ｄ、Ｖ６８Ａ、Ｎ７６Ｄ、Ｎ８７Ｓ，Ｒ、＊９７Ｅ、Ａ９８Ｓ、Ｓ９９Ｇ，Ｄ，Ａ、Ｓ９９ＡＤ、Ｓ１０１Ｇ，Ｍ，Ｒ Ｓ１０３Ａ、Ｖ１０４Ｉ，Ｙ，Ｎ、Ｓ１０６Ａ、Ｇ１１８Ｖ，Ｒ、Ｈ１２０Ｄ，Ｎ、Ｎ１２３Ｓ、Ｓ１２８Ｌ、Ｐ１２９Ｑ、Ｓ１３０Ａ、Ｇ１６０Ｄ、Ｙ１６７Ａ、Ｒ１７０Ｓ、Ａ１９４Ｐ、Ｇ１９５Ｅ、Ｖ１９９Ｍ、Ｖ２０５Ｉ、Ｌ２１７Ｄ、Ｎ２１８Ｄ、Ｍ２２２Ｓ、Ａ２３２Ｖ、Ｋ２３５Ｌ、Ｑ２３６Ｈ、Ｑ２４５Ｒ、Ｎ２５２Ｋ、Ｔ２７４Ａ を含み得る（ＢＰＮ’番号付けを使用）。
好適な市販のプロテアーゼ酵素としては、商品名Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）、Ｂｌａｚｅ（登録商標）、Ｄｕｒａｌａｓｅ（商標）、Ｄｕｒａｚｙｍ（商標）、Ｒｅｌａｓｅ（登録商標）、Ｒｅｌａｓｅ（登録商標）Ｕｌｔｒａ、Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）Ｕｌｔｒａ、Ｐｒｉｍａｓｅ（登録商標）、Ｐｏｌａｒｚｙｍｅ（登録商標）、Ｋａｎｎａｓｅ（登録商標）、Ｌｉｑｕａｎａｓｅ（登録商標）、Ｌｉｑｕａｎａｓｅ（登録商標）Ｕｌｔｒａ、Ｏｖｏｚｙｍｅ（登録商標）、Ｃｏｒｏｎａｓｅ（登録商標）、Ｃｏｒｏｎａｓｅ（登録商標）Ｕｌｔｒａ、Ｎｅｕｔｒａｓｅ（登録商標）、Ｅｖｅｒｌａｓｅ（登録商標）、及びＥｓｐｅｒａｓｅ（登録商標）で販売されているもの（全てＵｌｔｒａ（登録商標）又はＥｖｉｔｙ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）として販売され得る）、商品名Ｍａｘａｔａｓｅ（登録商標）、Ｍａｘａｃａｌ（登録商標）、Ｍａｘａｐｅｍ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ Ｐｒｉｍｅ（登録商標）、Ｐｒｅｆｅｒｅｎｚ（商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ ＭＡ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ ＯＸ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ ＯｘＰ（登録商標）、Ｐｕｒａｍａｘ（登録商標）、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｚ（商標）、ＦＮ２（登録商標）、ＦＮ３（登録商標）、ＦＮ４（登録商標）、Ｅｘｃｅｌｌａｓｅ（登録商標）、Ｏｐｔｉｃｌｅａｎ（登録商標）、及びＯｐｔｉｍａｓｅ（登録商標）（Ｄａｎｉｓｃｏ／ＤｕＰｏｎｔ）、Ａｘａｐｅｍ（商標）（Ｇｉｓｔ－Ｂｒｏａｓｅ Ｎ．Ｖ．）、ＢＬＡＰ（登録商標）（米国特許第５３５２６０４号の図２９に示す配列）で販売されているもの、及びこれらの変異体（Ｈｅｎｋｅｌ ＡＧ）、並びにＫａｏからのＫＡＰ（バチルス・アルカロフィラスサブチリシン）が挙げられる。
一態様では、好ましい酵素は、アミラーゼを含む場合がある。好適なアミラーゼは、アルファ－アミラーゼ又はグルコアミラーゼであってよく、細菌由来又は真菌由来のものであってよい。化学的に修飾された又はタンパク質操作された突然変異体が含まれる。アミラーゼとしては、例えば英国特許第１２９６８３９号により詳細に記載されているバチルス属、例えばバチルス・リケニフォルミスの特殊な株から得られるアルファ－アミラーゼが挙げられる。
好適なアミラーゼとしては、国際公開第９５／１０６０３号の配列番号３を有するアミラーゼ、又はその配列番号３と９０％の配列同一性を有する変異体が挙げられる。好ましい変異体は、国際公開第９４／０２５９７号、同第９４／１８３１４号、同第９７／４３４２４号、及び同第９９／０１９４６７号の配列番号４に記載されており、例えば以下の位置：１５、２３、１０５、１０６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１７８、１７９、１８１、１８８、１９０、１９７、２０１、２０２、２０７、２０８、２０９、２１１、２４３、２６４、３０４、３０５、３９１、４０８、及び４４４のうちの１つ以上に置換を有する変異体である。
異なる適当なアミラーゼとしては、国際公開第０２／０１０３５５号の配列番号６を有するアミラーゼ、又は配列番号６と９０％の配列同一性を有するこのアミラーゼの変異体が挙げられる。配列番号６の好ましい変異体は、１８１位及び１８２位の欠失、並びに１９３位の置換を有するものである。
他の好適なアミラーゼは、国際公開第２００６／０６６５９４号の配列番号６に示されるＢ．アミロリケファシエンス由来のアルファ－アミラーゼの残基１～３３と、国際公開第２００６／０６６５９４号の配列番号４に示されるＢ．リケニフォルミスアルファ－アミラーゼの残基３６～４８３と、を含むハイブリッドアルファ－アミラーゼか、又はその９０％の配列同一性を有する変異体である。このハイブリッドアルファ－アミラーゼの好ましい変異型は、以下の位置：Ｇ４８、Ｔ４９、Ｇ１０７、Ｈ１５６、Ａ１８１、Ｎ１９０、Ｍ１９７、Ｉ２０１、Ａ２０９及びＱ２６４のうちの１つ以上における置換、欠失、又は挿入を有するものである。国際公開第２００６／０６６５９４号の配列番号６に示されるＢ．アミロリケファシエンス由来のアルファ－アミラーゼの残基１～３３と、配列番号４の残基３６～４８３と、を含むハイブリッドアルファ－アミラーゼの最も好ましい変異体は、以下の置換：
Ｍ１９７Ｔ、
Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ、又は
Ｇ４８Ａ＋Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ｉ２０１Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓを有するものである。
更なる適当なアミラーゼとしては、国際公開第９９／０１９４６７号の配列番号６を有するアミラーゼ、又は配列番号６と９０％の配列同一性を有するこのアミラーゼの変異体が挙げられる。配列番号６の好ましい変異体は、以下の位置：Ｒ１８１、Ｇ１８２、Ｈ１８３、Ｇ１８４、Ｎ１９５、Ｉ２０６、Ｅ２１２、Ｅ２１６及びＫ２６９のうちの１つ以上に置換、欠失、又は挿入を有するものである。特に好ましいアミラーゼは、Ｒ１８１位及びＧ１８２位、又はＨ１８３位及びＧ１８４位に欠失を有するものである。
使用することができる更なるアミラーゼは、国際公開第９６／０２３８７３号の配列番号１、配列番号３、配列番号２、若しくは配列番号７を有するもの、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、若しくは配列番号７と９０％の配列同一性を有するその変異体である。配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号７の好ましい変異体は、以下の位置：１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２１２、２４３、２６０、２６９、３０４、及び４７６のうちの１つ以上に置換、欠失、又は挿入を有するものである。更に好ましい変異型は、位置１８１及び１８２、又は位置１８３及び１８４において欠失を有するものである。配列番号１、配列番号２、又は配列番号７の最も好ましいアミラーゼ変異体は、１８３位及び１８４位に欠失を、そして、１４０、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４及び４７６位のうちの１つ以上に置換を有するものである。
使用され得る他のアミラーゼは、国際公開第０８／１５３８１５号の配列番号２、同第０１／６６７１２号の配列番号１０を有するアミラーゼか、又は同第０８／１５３８１５号の配列番号２と９０％の配列同一性若しくは同第０１／６６７１２号における配列番号１０と９０％の配列同一性を有するその変異体である。国際公開第０１／６６７１２号における配列番号１０の好ましい変異体は、以下の位置：１７６、１７７、１７８、１７９、１９０、２０１、２０７、２１１、及び２６４のうちの１つ以上において置換、欠失、又は挿入を有するものである。
更に適当なアミラーゼは、国際公開第０９／０６１３８０号の配列番号２を有するアミラーゼ、又は配列番号２と９０％の配列同一性を有するその変異体である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の好ましい変異型は、Ｃ末端の欠損、及び／又はＱ８７、Ｑ９８、Ｓ１２５、Ｎ１２８、Ｔ１３１、Ｔ１６５、Ｋ１７８、Ｒ１８０、Ｓ１８１、Ｔ１８２、Ｇ１８３、Ｍ２０１、Ｆ２０２、Ｎ２２５、Ｓ２４３、Ｎ２７２、Ｎ２８２、Ｙ３０５、Ｒ３０９、Ｄ３１９、Ｑ３２０、Ｑ３５９、Ｋ４４４及びＧ４７５の位置のうちの１つ又は２つ以上における置換、欠失、若しくは挿入を有するものである。配列番号２のより好ましい変異体は、以下の位置：Ｑ８７Ｅ，Ｒ、Ｑ９８Ｒ、Ｓ１２５Ａ、Ｎ１２８Ｃ、Ｔ１３１Ｉ、Ｔ１６５Ｉ、Ｋ１７８Ｌ、Ｔ１８２Ｇ、Ｍ２０１Ｌ、Ｆ２０２Ｙ、Ｎ２２５Ｅ，Ｒ、Ｎ２７２Ｅ，Ｒ、Ｓ２４３Ｑ，Ａ，Ｅ，Ｄ、Ｙ３０５Ｒ、Ｒ３０９Ａ、Ｑ３２０Ｒ、Ｑ３５９Ｅ、Ｋ４４４Ｅ及びＧ４７５Ｋのうちの１つ以上における置換、並びに／又はＲ１８０及び／若しくはＳ１８１、又はＴ１８２及び／若しくはＧ１８３位に欠失を有するものである。配列番号２の最も好ましいアミラーゼ変異体は、以下の置換：
Ｎ１２８Ｃ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｇ４７５Ｋ、
Ｎ１２８Ｃ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｆ２０２Ｙ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｄ３１９Ｔ＋Ｇ４７５Ｋ、
Ｓ１２５Ａ＋Ｎ１２８Ｃ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｇ４７５Ｋ、又は
Ｓ１２５Ａ＋Ｎ１２８Ｃ＋Ｔ１３１Ｉ＋Ｔ１６５Ｉ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｇ４７５Ｋを有するものであり、変異体は、Ｃ末端が切断されており、任意追加的に、２４３位における置換並びに／又は１８０位及び／若しくは１８１位における欠失を更に含む。
他の適当なアミラーゼとしては、国際公開第０１／６６７１２号の配列番号１２を有するα－アミラーゼ、又は配列番号１２と少なくとも９０％の配列同一性を有するこのアミラーゼの変異体が挙げられる。好ましいアミラーゼ変異体は、国際公開第０１／６６７１２号の配列番号１２の以下の位置：Ｒ２８、Ｒ１１８、Ｎ１７４；Ｒ１８１、Ｇ１８２、Ｄ１８３、Ｇ１８４、Ｇ１８６、Ｗ１８９、Ｎ１９５、Ｍ２０２、Ｙ２９８、Ｎ２９９、Ｋ３０２、Ｓ３０３、Ｎ３０６、Ｒ３１０、Ｎ３１４；Ｒ３２０、Ｈ３２４、Ｅ３４５、Ｙ３９６、Ｒ４００、Ｗ４３９、Ｒ４４４、Ｎ４４５、Ｋ４４６、Ｑ４４９、Ｒ４５８、Ｎ４７１、Ｎ４８４のうちの１つ以上に置換、欠失、又は挿入を有するものである。特に好ましいアミラーゼとしては、Ｄ１８３及びＧ１８４の欠失を有しかつＲ１１８Ｋ、Ｎ１９５Ｆ、Ｒ３２０Ｋ及びＲ４５８Ｋの置換を有する変異体、並びにＭ９、Ｇ１４９、Ｇ１８２、Ｇ１８６、Ｍ２０２、Ｔ２５７、Ｙ２９５、Ｎ２９９、Ｍ３２３、Ｅ３４５及びＡ３３９の群から選択される１つ以上の位置に更に置換を有する変異体が挙げられ、最も好ましいのは、これらの全ての位置に更に置換を有する変異体である。
他の例は、国際公開第２０１１／０９８５３１号、同第２０１３／００１０７８号、及び同第２０１３／００１０８７号に記載されるようなアミラーゼ変異型である。
市販のアミラーゼは、Ｄｕｒａｍｙｌ（商標）、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（商標）、Ｔｅｒｍａｍｙｌ Ｕｌｔｒａ（商標）、Ｆｕｎｇａｍｙｌ（商標）、Ｂａｎ（商標）、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ Ｐｌｕｓ（商標）、Ａｍｐｌｉｆｙ（登録商標）、Ｓｕｐｒａｍｙｌ（商標）、Ｎａｔａｌａｓｅ（商標）、Ｌｉｑｕｏｚｙｍｅ Ｘ ａｎｄ ＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓから）、ＫＥＭＺＹＭ（登録商標）ＡＴ ９０００ Ｂｉｏｚｙｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｔｒａｄｉｎｇ ＧｍｂＨ Ｗｅｈｌｉｓｔｒａｓｓｅ ２７ｂ Ａ－１２００ Ｗｉｅｎ Ａｕｓｔｒｉａ、並びにＲａｐｉｄａｓｅ（商標）、Ｐｕｒａｓｔａｒ（商標）／Ｅｆｆｅｃｔｅｎｚ（商標）、Ｐｏｗｅｒａｓｅ、Ｐｒｅｆｅｒｅｎｚ Ｓ１００、Ｐｒｅｆｅｒｅｎｘ Ｓ１１０、ＥＮＺＹＳＩＺＥ（登録商標）、ＯＰＴＩＳＩＺＥ ＨＴ ＰＬＵＳ（登録商標）、及びＰＵＲＡＳＴＡＲ ＯＸＡＭ（登録商標）、（Ｄａｎｉｓｃｏ／ＤｕＰｏｎｔ）、並びにＫＡＭ（登録商標）（Ｋａｏ）である。
好適な更なるリパーゼ及びクチナーゼとしては、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。化学的に修飾された又はタンパク質操作された突然変異体酵素が含まれる。例としては、サーモマイセス属、例えば、欧州特許第２５８０６８号及び同第３０５２１６号に記載されているＴ．ラヌギノサス（以前はフミコーラ・ラヌギノサと命名されていた）由来のリパーゼ、フミコーラ属、例えば、Ｈ．インソレンス由来のクチナーゼ（国際公開第９６／１３５８０号）、シュードモナス属の株（これらの一部は現在バークホルデリア属と再命名されている）、例えば、Ｐ．アルカリゲネス（P.alcaligenes）又はＰ．シュードアルカリゲネス（P.pseudoalcaligenes）（欧州特許第２１８２７２号）、Ｐ．セパシア（P.cepacia）（欧州特許第３３１３７６号）、Ｐ．ｓｐ．株ＳＤ７０５（国際公開第９５／０６７２０号及び同第９６／２７００２号）、Ｐ．ウィスコンシネンシス（P.wisconsinensis）（国際公開第９６／１２０１２号）由来のリパーゼ、ＧＤＳＬ型ストレプトマイセス属のリパーゼ（国際公開第１０／０６５４５５号）、マグナポルテ・グリセア（Magnaporthe grisea）由来のクチナーゼ（国際公開第１０／１０７５６０号）、シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）由来のクチナーゼ（米国特許第５，３８９，５３６号）、サーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）由来のリパーゼ（国際公開第１１／０８４４１２号、同第１３／０３３３１８号）、ゲオバチルス・ステロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）リパーゼ（国際公開第１１／０８４４１７号）、バチルス・サブチリス由来のリパーゼ（国際公開第１１／０８４５９９号）、並びにストレプトマイセス・グリセウス（国際公開第１１／１５０１５７号）及びＳ．プリスチナエスピラリス（S.pristinaespiralis）（国際公開第１２／１３７１４７号）由来のリパーゼが挙げられる。
他の例としては、欧州特許第４０７２２５号、国際公開第９２／０５２４９号、同第９４／０１５４１号、同第９４／２５５７８号、同第９５／１４７８３号、同第９５／３０７４４号、同第９５／３５３８１号、同第９５／２２６１５号、同第９６／００２９２号、同第９７／０４０７９号、同第９７／０７２０２号、同第００／３４４５０号、同第００／６００６３号、同第０１／９２５０２号、同第０７／８７５０８号、及び同第０９／１０９５００号に記載されるものなどのリパーゼ変異体がある。
好ましい市販のリパーゼ製品としては、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（商標）、Ｌｉｐｅｘ（商標）、Ｌｉｐｏｌｅｘ（商標）、Ｌｉｐｏｌａｓｅ Ｕｌｔｒａ（商標）、Ｌｉｐｅｘ Ｅｖｉｔｙ １００Ｌ、Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）、Ｌｉｐｏｐｒｉｍｅ（商標）、及びＬｉｐｏｃｌｅａｎ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、Ｌｕｍａｆａｓｔ（元はＧｅｎｅｎｃｏｒから）、並びにＬｉｐｏｍａｘ（元はＧｉｓｔ－Ｂｒｏｃａｄｅｓから）、及びＳｏｌｖａｙからのバチルス種が挙げられる。
更に他の例は、時にアシルトランスフェラーゼ又はペルヒドロラーゼと呼ばれるリパーゼ、例えば、カンジダ・アンタルクチカ（Candida antarctica）リパーゼＡと相同性を有するアシルトランスフェラーゼ（国際公開第１０／１１１１４３号）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）由来のアシルトランスフェラーゼ（国際公開第０５／５６７８２号）、ＣＥ ７ファミリー由来のペルヒドロラーゼ（国際公開第０９／６７２７９号）、及び市販製品Ｇｅｎｔｌｅ Ｐｏｗｅｒ Ｂｌｅａｃｈ（Ｈｕｎｔｓｍａｎ Ｔｅｘｔｉｌｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ Ｐｔｅ Ｌｔｄから）で使用されるＭ．スメグマチスペルヒドロラーゼの変異体、特にＳ５４Ｖ変異体（国際公開第１０／１０００２８号）である。
一態様では、他の好ましい酵素としては、エンド－ベータ－１，４－グルカナーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４）を呈する微生物由来のエンドグルカナーゼが挙げられ、これには米国特許第７１４１４０３号におけるアミノ酸配列の配列番号２と少なくとも９０％、９４％、９７％、又は９９％の同一性の配列を有するバチルス属
のメンバー、並びにこれらの混合物に対して内因性である細菌ポリペプチドが含まれる。好適なエンドグルカナーゼは、商品名Ｃｅｌｌｕｃｌｅａｎ（登録商標）及びＷｈｉｔｅｚｙｍｅ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）として販売されている。
他の好ましい酵素としては、商品名Ｐｅｃｔａｗａｓｈ（登録商標）、Ｐｅｃｔａｗａｙ（登録商標）、Ｘｐｅｃｔ（登録商標）として販売されているペクチン酸リアーゼ、並びに商品名Ｍａｎｎａｗａｙ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）及びＰｕｒａｂｒｉｔｅ（登録商標）（Ｄａｎｉｓｃｏ／ＤｕＰｏｎｔ）として販売されているマンナナーゼが挙げられる。
洗剤酵素（複数可）は、１種以上の酵素を含有する別個の添加物を添加することによって、又はこれらの酵素の全てを含む混合添加物を添加することによって、洗剤組成物に包含され得る。本発明の洗剤添加剤、すなわち、別個の添加剤又は複合添加剤は、例えば、顆粒、液体、スラリーなどとして配合することができる。好ましい洗剤添加剤配合物は、顆粒、特に非散粉顆粒（non-dusting granulates）、液体、特に安定化された液体、又はスラリーである。
非散粉顆粒は、例えば、米国特許第４１０６９９１号及び同第４６６１４５２号に開示されているように製造されてよく、任意追加的に、当該技術分野において既知の方法によってコーティングされてもよい。ワックス状コーティング材料の例は、平均モル重量が１０００～２００００であるポリ（エチレンオキシド）生成物（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６～５０個のエチレンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール；アルコールが１２～２０個の炭素原子を含有し、かつ１５～８０個のエチレンオキシド単位が存在するエトキシル化脂肪族アルコール；脂肪族アルコール；脂肪酸；並びに脂肪酸のモノ－及びジ－及びトリグリセリドである。流動床技術による適用に好適なフィルム形成コーティング材料の例は、英国特許第１４８３５９１号に記されている。液体酵素調製品は、例えば、確立されている方法に従ってプロピレングリコールなどのポリオール、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸を添加することによって安定化させてもよい。保護された酵素は、欧州特許第２３８２１６号に開示されている方法に従って調製することができる。
概して、選択された酵素の特性は、選択された洗剤と適合しなければならず（すなわち、ｐＨ最適条件、他の酵素及び非酵素成分との適合性等）、酵素は、有効量で存在しなければならない。
ポリマー
好ましくは、洗剤補助剤は、ポリマー又はポリマーの混合物を含む。洗剤組成物は、０～１０重量％、例えば０．５～５重量％、２～５重量％、０．５～２重量％、又は０．２～１重量％のポリマーを含有し得る。洗剤で用いるための当該技術分野において公知の任意のポリマーを利用してよい。ポリマーは、上述のとおりコビルダーとして機能してもよく、再付着防止、繊維保護、汚れ放出、移染阻害、グリース洗浄、及び／又は消泡特性を提供してもよい。いくつかのポリマーは、上述の特性のうちの１つ超及び／又は下記モチーフのうちの１つ超を有し得る。例示的なポリマーとしては、（カルボキシメチル）セルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（エチレングリコール）又はポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＧ）、エトキシル化ポリ（エチレンイミン）、カルボキシメチルイヌリン（ＣＭＩ）、及びＰＡＡ、ＰＡＡ／ＰＭＡ等のポリカルボキシレート、ポリアスパラギン酸、及びラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマー、疎水変性ＣＭＣ（ＨＭ－ＣＭＣ）及びシリコーン、テレフタル酸とオリゴマーグリコールとのコポリマー、ポリ（エチレンテレフタレート）とポリ（オキシエチレンテレフタレート）とのコポリマー（ＰＥＴ－ＰＯＥＴ）、ＰＶＰ、ポリ（ビニルイミダゾール）（ＰＶＩ）、ポリ（ビニルピリジン－Ｎ－オキシド）（ＰＶＰＯ又はＰＶＰＮＯ）、並びにポリビニルピロリドン－ビニルイミダゾール（ＰＶＰＶＩ）が挙げられる。更なる例示的なポリマーとしては、スルホン化ポリカルボキシレート、ポリエチレンオキシド及びポリプロピレンオキシド（ＰＥＯ－ＰＰＯ）、並びにジ四級エトキシサルフェートが挙げられる。
ビルダーの例としては、クエン酸塩、キレート剤、例えば、アミノカルボキシレート、アミノポリカルボキシレート、及びホスホネート、並びにアルキル－又はアルケニルコハク酸が挙げられる。追加の具体例としては、２，２’，２”－ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、イミノジコハク酸（ＩＤＳ）、エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、メチルグリシン－Ｎ，Ｎ－二酢酸（ＭＧＤＡ）、グルタミン酸－Ｎ，Ｎ－二酢酸（ＧＬＤＡ）、１－ヒドロキシエタン－１，１－ジホスホン酸、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＥＤＧ）、アスパラギン酸－Ｎ－一酢酸（ＡＳＭＡ）、アスパラギン酸－Ｎ，Ｎ－二酢酸（ＡＳＤＡ）、アスパラギン酸－Ｎ－一プロピオン酸（ＡＳＭＰ）、イミノジコハク酸（ＩＤＡ）、Ｎ－（スルホメチル）アスパラギン酸（ＳＭＡＳ）、Ｎ－（２－スルホエチル）－アスパラギン酸（ＳＥＡＳ）、Ｎ－（スルホメチルグルタミン酸（ＳＭＧＬ）、Ｎ－（２－スルホエチル）－グルタミン酸（ＳＥＧＬ）、Ｎ－メチルイミノ二酢酸（ＭＩＤＡ）、セリン－Ｎ，Ｎ－二酢酸（ＳＥＤＡ）、イソセリン－Ｎ，Ｎ－二酢酸（ＩＳＤＡ）、フェニルアラニン－Ｎ，Ｎ－二酢酸（ＰＨＤＡ）、アントラニル酸－Ｎ，Ｎ－二酢酸（ＡＮＤＡ）、スルファニル酸－Ｎ，Ｎ－二酢酸（ＳＬＤＡ）、タウリン－Ｎ，Ｎ－二酢酸（ＴＵＤＡ）、及びＮ’－（２－ヒドロキシエチル）エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’－三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエタノールグリシン（ＤＥＧ）、並びにこれらの組み合わせ及び塩が挙げられる。本明細書で使用するのに好適なリン酸塩としては、１－ヒドロキシエタン－１，１－ジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、エチレンジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＭＰＡ）、ジエチレントリアミンペンタキス（メチレンホスホン酸）（ＤＴＭＰＡ又はＤＴＰＭＰＡ又はＤＴＰＭＰ）、ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）（ＡＴＭＰ又はＮＴＭＰ）、２－ホスホノブタン－１，２，４－三カルボン酸（ＰＢＴＣ）、ヘキサメチレンジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）（ＨＤＴＭＰ）が挙げられる。
また、組成物は、０～５０重量％、例えば、約５重量％～約３０重量％の洗剤コビルダーを含有していてもよい。コビルダーの非限定的な例としては、ポリアクリレートのホモポリマー又はそのコポリマー、例えば、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）又はコポリ（アクリル酸／マレイン酸）（ＰＡＡ／ＰＭＡ）又はポリアスパラギン酸が挙げられる。
布地色相剤
また、本発明の洗剤組成物は、染料又は顔料等の布地色相剤も含んでいてよく、これらは、洗剤組成物に配合されたとき、上記洗剤組成物を含む洗浄液に布地を接触させるとその布地に付着し、それによって、可視光線の吸収／反射をとおして上記布地の色合いを変化させることができる。蛍光増白剤は、少なくともいくらかの可視光線を放出する。対照的に、布地色相剤は表面の色合いを変化させるが、その理由は、可視光スペクトルの少なくとも一部を吸収するためである。好適な布地色相剤としては、染料及び染料－粘土結合体が挙げられ、また、顔料も挙げることができる。好適な染料としては、低分子染料及びポリマー染料が挙げられる。好適な低分子染料としては、例えば国際公開第２００５／０３２７４号、同第２００５／０３２７５号、同第２００５／０３２７６号、及び欧州特許第１８７６２２６号（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されているダイレクトブルー、ダイレクトレッド、ダイレクトバイオレット、アシッドブルー、アシッドレッド、アシッドバイオレット、ベーシックブルー、ベーシックバイオレット及びベーシックレッド、又はこれらの混合物の染料索引（Ｃ．Ｉ．）分類の染料からなる群から選択される低分子染料が挙げられる。洗剤組成物は、好ましくは、約０．００００３重量％～約０．２重量％、約０．００００８重量％～約０．０５重量％、又は更には約０．０００１重量％～約０．０４重量％の布地色相剤を含む。組成物は、０．０００１重量％～０．２重量％の布地色相剤を含んでもよく、これは、組成物が単位用量パウチの形態であるときに特に好ましい場合がある。好適な色相剤は、例えば、国際公開第２００７／０８７２５７号及び同第２００７／０８７２４３号にも開示されている。
分散剤
本発明の洗剤組成物は、分散剤を含有していてもよい。特に、粉末洗剤は分散剤を含んでいてよい。好適な水溶性有機材料としては、ホモポリマー又はコポリマーの酸又はこれらの塩が挙げられ、この場合、ポリカルボン酸は、互いに炭素原子２個以下だけ離れている少なくとも２個のカルボキシルラジカルを含む。好適な分散剤は、例えば、Ｐｏｗｄｅｒｅｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｓｃｉｅｎｃｅ ｓｅｒｉｅｓ ｖｏｌｕｍｅ ７１，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．に記載されている。
移染防止剤
また、本発明の洗浄組成物は、１つ以上の移染防止剤を含んでいてもよい。好適な高分子移染防止剤としては、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ－オキシドポリマー、Ｎ－ビニルピロリドンとＮ－ビニルイミダゾールとのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン、並びにポリビニルイミダゾール、又はこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。移染防止剤は、対象組成物中に存在する場合、組成物の約０．０００１重量％～約１０重量％、約０．０１重量％～約５重量％、又は更には約０．１重量％～約３重量％の濃度で存在してよい。
蛍光増白剤
また、洗剤組成物は、好ましくは、蛍光増白剤又は光学光沢剤等の、淡い色の物品を洗浄することができる追加の成分を含有していてもよい。存在する場合、光沢剤は、好ましくは約０．０１％～約０．５％の濃度である。洗濯洗剤組成物に使用するのに好適な任意の蛍光増白剤は、本発明の組成物に使用されてもよい。通常用いられる蛍光増白剤は、ジアミノスチルベン－スルホン酸誘導体、ジアリールピラゾリン誘導体、及びビスフェニル－ジスチリル誘導体の分類に属するものである。ジアミノスチルベン－スルホン酸誘導体型の蛍光増白剤の例としては、４，４’ビス－（２－ジエタノールアミノ－４－アニリノ－ｓ－トリアジン－６－イルアミノ）スチルベン－２，２’－ジスルホネート、４，４’－ビス－（２，４－ジアニリノ－ｓ－トリアジン－６－イルアミノ）スチルベン－２．２’－ジスルホネート、４，４’－ビス－（２－アニリノ－４－（Ｎ－メチル－Ｎ－２－ヒドロキシ－エチルアミノ）－ｓ－トリアジン－６－イルアミノ）スチルベン－２，２’－ジスルホネート、４，４’－ビス－（４－フェニル－１，２，３－トリアゾール－２－イル）スチルベン－２，２’－ジスルホネート、及び５－（２Ｈ－ナフト［１，２－ｄ］［１，２，３］トリアゾール－２－イル）－２－［（Ｅ）－２－フェニルビニル］ベンゼンスルホン酸ナトリウムのナトリウム塩が挙げられる。好ましい蛍光増白剤は、Ｃｉｂａ－Ｇｅｉｇｙ ＡＧ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手可能なＴｉｎｏｐａｌ ＤＭＳ及びＴｉｎｏｐａｌ ＣＢＳである。Ｔｉｎｏｐａｌ ＤＭＳは、４，４’－ビス－（２－モルホリノ－４－アニリノ－ｓ－トリアジン－６－イルアミノ）スチルベン－２，２’－ジスルホン酸の二ナトリウム塩である。Ｔｉｎｏｐａｌ ＣＢＳは、２，２’－ビス－（フェニル－スチリル）ジスルホン酸の二ナトリウム塩である。また、市販されているＰａｒａｗｈｉｔｅ ＫＸ（Ｐａｒａｍｏｕｎｔ Ｍｉｎｅｒａｌｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａ）によって供給）である蛍光増白剤も好ましい。Ｔｉｎｏｐａｌ ＣＢＳ－Ｘは、ジスチリルビフェニルジスルホン酸二ナトリウムとしても知られている４．４’－ビス－（スルホスチリル）ビフェニル二ナトリウム塩である。本発明に使用されるのに好適な他の蛍光剤としては、１－３－ジアリールピラゾリン及び７－アルキルアミノクマリンが挙げられる。
好適な蛍光増白剤の濃度としては、約０．０１重量％、０．０５重量％、約０．１重量％、又は更には約０．２重量％のより低い濃度から、０．５重量％又は更には０．７５重量％のより高い濃度までが挙げられる。
汚れ放出ポリマー
また、洗剤組成物は、綿及びポリエステル系の布地などの布地からの汚れの除去、特にポリエステル系布地からの疎水性汚れの除去を支援する１つ以上の汚れ放出ポリマーを含んでいてもよい。汚れ放出ポリマーは、例えば、非イオン性又はアニオン性のテレフタレート系ポリマー、ポリビニルカプロラクタム及び関連するコポリマー、ビニルグラフトコポリマー、ポリエステルポリアミドであってよく、例えば、Ｐｏｗｄｅｒｅｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｓｃｉｅｎｃｅ ｓｅｒｉｅｓ ｖｏｌｕｍｅ ７１，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．の第７章を参照。
好ましくは、洗剤補助剤は、ポリエステルテレフタレートを含む。好ましくは、ポリエステルテレフタレートは、１つ以上のアニオン性基でグラフトしたポリエステルテレフタレート骨格を含み、より好ましくはプロピレンテレフタレートのアニオン性ポリエステルを含む。
好適なアニオン性ポリエステルは、テレフタル酸、５－スルホイソフタル酸又は５－スルホイソフタル酸の塩、エチレングリコール又はポリエチレングリコール、プロピレングリコール又はポリプロピレングリコール、及びポリアルキレングリコールモノアルキルエーテル、及び任意追加的に更なる追加のモノマーに由来するものである。
別の種類の汚れ放出ポリマーは、コア構造及びそのコア構造に結合している複数のアルコキシレート基を含む両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマーである。コア構造は、（参照によって本明細書に組み込まれる）国際公開第２００９／０８７５２３号に詳細に記載されているポリアルキレンイミン構造又はポリアルカノールアミン構造を含み得る。更に、ランダムグラフトコポリマーは、好適な汚れ放出ポリマーである。好適なグラフトコポリマーは、（参照によって本明細書に組み込まれる）国際公開第２００７／１３８０５４号、同第２００６／１０８８５６号、及び同第２００６／１１３３１４号により詳細に記載されている。
好ましくは、洗剤補助剤は、好ましくはポリアルキレンオキシド及びビニルエステルに基づく、好ましくは、グラフト基材としての水溶性ポリアルキレンオキシドと、ビニルエステル成分の重合によって形成される側鎖とに基づく両親媒性グラフトポリマーを含み、当該ポリマーは、アルキレンオキシド５０単位当たり平均＜１個のグラフト部位を有し、より好ましくは、グラフトされていないアルキレンオキシド単位に対するグラフトされているアルキレンオキシド単位のモル比は、０．００２～０．０５、好ましくは０．００２～０．０３５、より好ましくは０．００３～０．０２５、最も好ましくは０．００４～０．０２である。好ましいグラフトポリマーは、３０００～１００ ０００の平均分子量Ｍｗを有する。好ましいポリマーは、ポリマーの２０重量％～７０重量％、好ましくは２５重量％～６０重量％の、グラフト基材としてのポリアルキレンオキシド、好ましくは水溶性ポリアルキレンオキシドを含む。好ましくは、ポリアルキレンオキシドグラフト基材は、ポリエチレングリコールである。
好ましくは、ポリマーは、３０重量％～８０重量％のビニルエステル成分を含み、好ましくは、このビニルエステル成分は、ビニルアセテート、プロピオン酸ビニル、又はこれらの混合物と、任意追加的に、Ｃ１～Ｃ８アルキルアクリレート、より好ましくは７０重量％～１００重量％の酢酸ビニルと、０重量％～３０重量％のＣ１～Ｃ８アルキルアクリレートと、を含む。
他の汚れ放出ポリマーは、置換多糖構造、特に置換セルロース構造、例えば、変性セルロース誘導体、例えば（いずれも参照によって本明細書に組み込まれる）欧州特許第１８６７８０８号又は国際公開第２００３／０４０２７９号に記載されているものである。好適なセルロース性ポリマーとしては、セルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、セルロースアミド、及びこれらの混合物が挙げられる。好適なセルロース性ポリマーとしては、アニオン変性セルロース、非イオン変性セルロース、カチオン変性セルロース、双性イオン変性セルロース、及びこれらの混合物が挙げられる。好適なセルロース性ポリマーとしては、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エステルカルボキシメチルセルロース、及びこれらの混合物が挙げられる。好ましくは、洗剤補助剤は、好ましくは、カルボキシメチルセルロース、疎水変性カルボキシメチルセルロース、又はこれらの混合物から選択される、カルボキシメチルセルロース又はその誘導体を含み、疎水変性カルボキシメチルセルロースが特に好ましい。
再付着防止剤
また、本発明の洗剤組成物は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリオキシエチレン及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アクリル酸のホモポリマー、アクリル酸とマレイン酸とのコポリマー、並びにトキシル化ポリエチレンイミン等の１つ以上の再付着防止剤を含んでいてもよい。汚れ放出ポリマーにおいて上記されているセルロース系ポリマーは、再付着防止剤としても機能し得る。
レオロジー変性剤
また、本発明の洗剤組成物は、粘度低下剤とは別に、１つ以上のレオロジー変性剤、構造化剤又は増粘剤を含んでいてもよい。レオロジー変性剤は、非高分子結晶質ヒドロキシ官能性材料、高分子レオロジー変性剤からなる群から選択され、これらは液体洗剤組成物の水性液体マトリックスに剪断減粘特性を付与する。洗剤のレオロジー及び粘度は、例えば、欧州特許第２１６９０４０号に示されているように、当該技術分野において公知の方法によって変性及び調整することができる。
他の好適な補助剤としては、縮み防止剤、防しわ剤、殺菌剤、結合剤、担体、染料、酵素安定剤、布地柔軟剤、充填剤、泡調節剤、ヒドロトロープ、香料、顔料、発泡抑制剤、溶媒、並びに液体洗剤用の構造化剤及び／又は構造弾性剤が挙げられるが、これらに限定されない。
作製方法
当業者であれば、一般的に知られている製造技術を使用して、本発明の水溶性単位用量物品及び液体洗濯洗剤組成物を作製する方法を認識するであろう。
洗浄方法
本発明の更なる態様は、布地を洗浄する方法であり、この方法は、
ａ．本発明による水溶性単位用量物品を、水溶性フィルムを溶解させ、洗濯洗剤組成物を、好ましくは３００～３０００倍、好ましくは３００～８００倍希釈するのに十分な水と合わせて、洗浄液を形成する工程と、
ｂ．当該洗浄液を、洗浄される少なくとも１枚の布地と合わせる工程と、を含む。
酵素安定剤及び／又はレオロジー変性剤
本発明の組成物は、好ましくは酵素安定剤、例えば、ポリオール、ポリマー、可逆酵素阻害剤、二価カチオン、酵素基質、酸化防止剤等を含む。水溶性安定剤が好ましい。
ゆっくりと溶解する安定剤の添加を使用してカプセル内部に局所的環境を作り出すことができ、これはカプセル封入酵素／化合物により「優しい」ものであり、したがって保存中の安定性を改善する。
可逆性プロテアーゼ阻害剤の例は、ボロン酸、ペプチドアルデヒド、及びその誘導体、並びに高分子タンパク質型阻害剤（ＢＡＳＩ／ＲＡＳＩ阻害剤のような、国際公開第２００９／０９５４２５号を参照）である。メタロプロテアーゼ阻害剤の例は、国際公開第２００８／１３４３４３号に記載されている。プロテアーゼ阻害剤は、見出し「プロテアーゼ阻害剤」で以下により詳細に記載される。
安定化ポリマーは、例えば、ポリビニリピロリドン、ポリビニルアセテート、ポリビニルアルコール、及びそれらのコポリマーに基づくことができる。安定化ポリオールは、グリセロール、ソルビトール、プロピレングリコールなどのより小さい分子であってもよいが、ポリエチレングリコール、多糖類などのようなより大きな分子であってもよい。
二価カチオンＣａ２＋、Ｍｇ２＋及びＺｎ２＋を安定化させるものは、当該技術分野において周知である。したがって、ある実施形態において、本発明の組成物は、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、又はＺｎ２＋イオンの供給源を含む。好ましくは、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、又はＺｎ２＋イオンの供給源は、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、又はＺｎ２＋の難溶性（ゆっくり溶解する）塩である。難溶性とは、２０℃の純水への溶解度が、５ｇ／ｌ、２ｇ／ｌ、１ｇ／ｌ、０．５ｇ／ｌ、０．２ｇ／ｌ、０．１ｇ／ｌ、又は０．０５ｇ／ｌ未満であることを意味する。Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、又はＺｎ２＋の好ましい塩は、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、炭酸亜鉛、硫酸カルシウム、亜硫酸カルシウム、亜硫酸マグネシウム、亜硫酸亜鉛、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、リン酸マグネシウム、リン酸亜鉛、クエン酸カルシウム、クエン酸マグネシウム、クエン酸亜鉛、シュウ酸カルシウム、シュウ酸マグネシウム、シュウ酸亜鉛、酒石酸カルシウム、酒石酸マグネシウム、又は酒石酸亜鉛である。
また、ゆっくりと溶解する酸又は塩基を使用して、マイクロカプセル内部に局所的ｐＨを作り出すことができ、これは封入された酵素／化合物により「優しい」。
酵素は、ほとんどの場合、それらの基質（例えば、プロテアーゼのタンパク質、アミラーゼのデンプン等）を添加することによって安定化される。酸化防止剤又は還元剤、例えば、チオサルフェート、アスコルビン酸塩などは、酵素の酸化を低減するために適用することができる。洗剤１グラム当たりのこれらの安定剤の必要とされる正味用量は、安定剤を内部カプセル相に濃縮するため、安定剤を連続的な洗剤相に添加することと比較してはるかに低く、多くの場合、保存中に拡散しないか、又は安定剤の構造及び分子量に応じてゆっくりと拡散するだけのいずれかである。特に高分子量安定剤（例えば、１ｋＤａ超、又は２ｋＤａ超、より好ましくは５ｋＤａ超）は、改善された正味効率をもたらす。したがって、高分子量阻害剤、ポリマー、ポリオール、カチオン、酵素基質、及び酸化防止剤が好ましい。
酵素は、「スカベンジャー」タンパク質を添加することによって保護され得る。したがって、タンパク質上のアミノ酸基（例えば、アミン）上に反応させることによって、成分の不安定化酵素が、スカベンジャー又は添加される犠牲タンパク質と反応し得る。カプセル内部に留まるのに十分に大きな分子量を有するスカベンジャータンパク質が好ましい。
任意追加的に、レオロジー変性成分を添加することによって酵素安定性を改善し、それにより内部カプセル相の粘度を増加させることができる。増加した内部粘度は、酵素不安定化剤のカプセル内への拡散を遅くし（及び／又は酵素安定剤のカプセル外への拡散を遅らせる）、したがって酵素の寿命を延長する。このような粘度調整剤の例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、親水性ポリウレタン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及びＰＶＰビニルアセテートコポリマー、デンプン、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロースのような水溶性セルロース誘導体、アラビアガム、ローカストビーンガム、グアーガム又はキサンタンガム等の水溶性ガム、及びこれらの組み合わせ又はコポリマーが挙げられる。最も好ましいのは、分子量が１ｋＤａ超、又は２ｋＤａ超、より好ましくは５ｋＤａ超の非イオン性高分子量ポリマーである。非イオン性ポリマーは、ほとんどの場合、イオン性ポリマーよりも反応性膜ポリマーと適合性があるため、好ましい。
高粘度は、高粘度の水相を使用してカプセルを製造するか（より高度である）、又は粘度増加がエマルション／カプセルを製造した後に最初に生じるカプセルを製造することによって達成され得る。高粘度の水相を有するエマルションを調製することが困難である場合があるため、この「引き起こされる」粘度増加が好ましい。引き起こされる粘度増加は、添加される洗剤よりも高い水分活性を有する内部カプセル相によって、洗剤に添加される際にその場で行うことができ、したがって、水はカプセルの外に拡散し（レオロジー変性剤ではない）、洗剤への添加後に内部相の粘度を増加させる。これはまた、塩又は他の低分子成分の拡散を使用して、例えば、洗剤に添加することによって塩濃度が低下するときに粘度を増加させる成分（例えば、初期の高塩含有量で沈殿するが、洗剤に添加されたときに塩の拡散により塩濃度が低下するときに可溶性であるポリマー）を有することにより利用することもできる。粘度を引き起こす別の方法は、粘度がｐＨに依存する成分を使用することである。いくつかの界面重合プロセス（例えば、アミン－酸ハロゲン反応）に関して、内部相のｐＨは、封入中に変化し、アミン－酸ハロゲンの場合、ｐＨは界面重合中に低下する。これは、粘度の増加を引き起こすために使用され得る。ポリアクリレートのような多くのレオロジー変性剤は、特定のｐＨ又はｐＨ範囲で最大粘度を示す。Ｌｕｂｒｉｚｏｌからのカーボポール９３４及びＳｃｏｔｔ－ＢａｄｅｒからのＴｅｘｉｐｏｌ ６３－２５８は、ｐＨを１１から８に低下させるか又はｐＨを４から８に増加させるときに粘度が著しく増加する、レオロジー変性剤の例である。低ｐＨ及び高ｐＨで異なる粘度を有する別のポリマー型は、部分的に加水分解されたポリアクリルアミドである。更に別の可能性は、温度依存性のレオロジー変性剤を使用して、１つの温度でエマルション／封入を行い、続いて温度を変化させて粘度を増加させることである。また、光又は超音波誘導粘度を利用することができる。更に別の方法は、粘度が、エマルションが形成されるときの高剪断で低く、剪断が低減されるときに高いように、剪断減粘レオロジー変性剤を使用することである。
酵素が封入されるときの別の安定化技術は、例えば、塩又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような沈殿剤を添加することによって、保存中にカプセル内に酵素が沈殿することを確実にすることである。洗剤への添加後、酵素が沈殿する程度まで水が拡散することによって濃縮される、例えば、ＰＥＧを添加することによって、上述と同じ「引き起こされる安定化」を使用することができる。このようにして、酵素はカプセルの加工中に溶液中に存在し得るが、洗剤に添加されると沈殿する。
酵素は、マイクロカプセルを調製する際に沈殿又は結晶形態で使用することもできる。
本発明は更に以下の例によって説明されるが、これは本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１：ｐ－ニトロフェニル（ｐＮＰ）アッセイ
リパーゼの加水分解活性は、ｐ－ニトロフェニルアシルエステルを基質として使用する動力学的アッセイによって決定することができる。
基質ｐ－ニトロフェニルブチレート（Ｃ４）、ｐ－ニトロフェニルカプロエート（Ｃ６）、ｐ－ニトロフェニルカプレート（Ｃ１０）、ｐ－ニトロフェニルラウレート（Ｃ１２）、及びｐ－ニトロフェニルパルミテート（Ｃ１６）（全てＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｄａｎｍａｒｋ Ａ／Ｓ，Ｋｉｒｋｅｂｊｅｒｇ Ａｌｌｅ ８４，２６０５ Ｂｒｏｎｄｂｙ；カタログ番号：Ｃ３：Ｎ－９８７６、Ｃ６：Ｎ－０５０２、Ｃ１０：Ｎ－０２５２、Ｃ１２：Ｎ－２００２、Ｃ１６：Ｎ－２７５２）のそれぞれのＤＭＳＯ中の１００ｍＭの原液を、アッセイ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝７．７０．４％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）中１ｍＭ ２５ｍＭの最終濃度に希釈する。
リパーゼ変異体、親リパーゼ、及び適切な対照、例えば、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ中のＬｉｐｏｌａｓｅ（商標）（配列番号２）；ｐＨ８．０；１０ｐｐｍ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００；＋／－２０ｍＭ ＣａＣｌ２を、以下の最終タンパク質濃度：９６ウェルＮＵＮＣプレート（カタログ番号２６０８３６、Ｋａｍｓｔｒｕｐｖｅｊ ９０，ＤＫ－４０００，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ）中、０．０１ｍｇ／ｍｌ；５×１０－３ｍｇ／ｍｌ；２．５×１０－４ｍｇ／ｍｌ；及び１．２５×１０－４ｍｇ／ｍｌで基質溶液に添加する。緩衝液はまた、陰性対照として実行される。Ｐ－ニトロフェニルアシルの加水分解によるｐ－ニトロフェノールの放出は、Ｓｐｅｃｔｒａ ｍａｘ １９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＧｍｂＨ，Ｂｉｓｍａｒｃｋｒｉｎｇ ３９，８８４００ Ｂｉｂｅｒａｃｈ ａｎ ｄｅｒ Ｒｉｓｓ，ＧＥＲＭＡＮＹ）で、１０秒間隔で５分間４０５ｎｍで監視され得る。変異体の１つ以上の基質に対する加水分解活性は、親リパーゼの加水分解活性と比較され得る。
実施例２：部位特異的突然変異誘発による変異体の構築
部位特異的変異体は、サーモマイセス・ラヌギノサスリパーゼ（ＴＬＬ）（配列番号２）で構築された。得られる配列に所望の突然変異を導入するように適切に設計された突然変異誘発性オリゴヌクレオチドと共にＰＣＲを使用して、従来のＤＮＡフラグメントのクローニング（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９）によって変異体を作製した。
挿入／欠失／置換を規定するＤＮＡ塩基対によって隔てられている所望の突然変異部位に隣接するＤＮＡ配列に対応する突然変異誘発性オリゴを設計し、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ等のオリゴベンダーから購入した。
ＴＬＬ変異体を試験するために、変異体をコードする突然変異型ＤＮＡを相同組換えによってコンピテントＡ．オリザエ株に組み込み、標準的なプロトコル（酵母抽出物ベースの培地、３～４日間、３０℃）を使用して発酵させ、クロマトグラフィーにより精製した。このようにして、以下の表に列記される変異体を構築し、産生した。
Figure 0007114697000003
実施例３：相対洗浄性能（ＲＰ（洗浄））
洗濯における洗浄性能を評価するために自動機械的ストレスアッセイ（ＡＭＳＡ）を使用して洗浄実験を実施した。ＡＭＳＡプレートは、試験溶液のための多くのスロットと、洗浄される織物である洗濯試料をスロットの全開口部にしっかりと締め付けるリッドと、を有する。洗浄期間中、プレート、試験溶液、織物及びリッドを、試験溶液を織物と接触させ、規則的及び周期的な振動様式で機械的ストレスを印加するために、精力的に振盪する。更なる説明に関して、国際公開第０２／４２７４０号、特に２３～２４ページの段落「Ｓｐｅｃｉａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ」を参照されたい。
洗濯実験を、以下に指定される実験条件下で実行した。
Figure 0007114697000004
ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、及びＮａＨＣＯ３（Ｃａ２＋：Ｍｇ２＋：ＨＣＯ３ －＝４：１：７．５又は２：１：４．５）を添加することにより、水硬度を１５°ｄＨ又は６°ｄＨに調整した。
Figure 0007114697000005
Figure 0007114697000006
洗浄後、織物を水道水に流し、濾紙を使用して余分な水を織物から除去し、直後に、織物を１００℃で１５分間乾燥させた。
洗浄性能を、洗浄した汚れた織物の色変化として測定した。汚れを、アナトーとクリーム混合した。アナトーは、ｐＨ依存性色変化を有するｐＨインジケータとして機能する、着色剤ノルビキシンを含有する。リパーゼ活性は、クリームアシルグリセロールから遊離脂肪酸を放出させ、これにより、ｐＨが低下し、それによりノルビキシンｐＨインジケータの色変化が生じる。したがって、リパーゼ洗浄性能は、白色光で照らされたときの、洗浄された汚れた織物から反射放出された光の色変化の程度として表すことができる。
洗浄した汚れた織物の画像を捕捉するために使用した、専門のフラットベッドスキャナー（ＥＰＳＯＮ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ １１０００ＸＬ、Ａｔｅａ Ａ／Ｓ，Ｌａｕｔｒｕｐｖａｎｇ ６，２７５０ Ｂａｌｌｅｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて色測定を行った。スキャンした画像から光強度の値を抽出するために、画像からの２４ビットピクセル値を、レッド、グリーン、及びブルー（ＲＧＢ）の値に変換した。
リパーゼ活性による色変化は、以下のように計算された光強度値（Ｉｎｔ）に対するグリーンライト（Ｇ）の反射放出の変化として測定した。
Figure 0007114697000007
参照リパーゼに対するリパーゼの相対洗浄性能（ＲＰ（洗浄））は、以下のように計算された：
ＲＰ（洗浄）＝（Ｇ／Ｉｎｔ（試験したリパーゼ）－Ｇ／Ｉｎｔ（酵素なし））／（Ｇ／Ｉｎｔ（リパーゼ参照））－ｇ／Ｉｎｔ（酵素なし））。
リパーゼは、参照（ＲＰ（洗浄）＞１）よりも良好に機能する場合、改善された洗浄性能を示すと考えられる。本発明の文脈において、参照酵素は、配列番号２として示されるリパーゼである。
固相マイクロ抽出ガスクロマトグラフィー測定による臭気検出
リパーゼ洗浄されたスワッチからの酪酸放出（臭気）を、固相マイクロ抽出ガスクロマトグラフィー（ＳＰＭＥ－ＧＣ）によって以下の方法を用いて測定した。
上記に指定されるように、クリームアナトーで染みを付けたＥＭＰＡ２２１綿織物を洗浄し、洗浄後に、濾紙を使用して余分な水を織物から除去し、その後、織物を２５℃で２間乾燥させた。各ＳＰＭＥ－ＧＣ測定は、４片の洗浄及び乾燥した織物（直径５ｍｍ）を用いて実施し、これをガスクロマトグラフィー（ＧＣ）バイアルに移し、バイアルを閉じた。試料を３０℃で２４時間インキュベートし、続いて１４０℃に３０分間加熱し、分析前に２０℃～２５℃で少なくとも４時間保存した。Ｓｔａｂｉｌｗａｘ －ＤＡ ｗ／Ｉｎｔｅｇｒａ－Ｇｕａｒｄカラム（３０ｍ、０．３２ｍｍ ＩＤ及び０．２５マイクロｍ ｄｆ）及びＣａｒｂｏｘｅｎ ＰＤＭＳ ＳＰＭＥ繊維（８５マイクロｍ）を装備したＶａｒｉａｎ ３８００ ＧＣで分析を実施した。織物片の上のヘッドスペース内のＳＰＭＥ繊維を用いて、各ＧＣバイアルからのサンプリングを５０℃で８分間行い、続いてサンプリングした化合物をカラム（注入器温度＝２５０℃）に注入した。カラムフロー＝２ｍｌヘリウム／分。カラムオーブン温度勾配：０分＝５０℃、２分＝５０℃、６分４５秒＝２４０℃、１１分４５秒＝２４０℃。Ｆｌａｍｅ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＦＩＤ）を使用して検出を行い、酪酸の保持時間を真標準を用いて同定した。
リパーゼの相対臭気放出（ＲＰ（臭気））は、リパーゼ洗浄スワッチから放出される酪酸量（ピーク面積）と、参照リパーゼ洗浄スワッチから放出される酪酸量（ピーク面積）との間の比率であり、その後、両方の値が、非リパーゼ洗浄スワッチ（ブランク）から放出される酪酸の量（ピーク面積）について補正された。ポリペプチドの相対臭気性能（ＲＰ（臭気））は、以下の式に従って計算される：
ＲＰ（臭気）＝（臭気（試験したリパーゼ）－臭気（酵素なし））／（臭気（リパーゼ参照）－臭気（酵素なし））
ここで、臭気は、織物表面から放出された、測定された酪酸（ピーク面積）である。
利益リスク係数（ＲＰ（洗浄）／ＲＰ（臭気））
臭気放出（リスク）と比較した洗浄性能（利益）を説明する利益リスク係数（ＢＲＦ）は、ＲＰ（洗浄）／ＲＰ（臭気）として定義することができる。リパーゼの利益リスク係数が１より高い場合、リパーゼは、参照リパーゼ（配列番号２）と比較して、放出された臭気に対してより良好な洗浄性能を有する。
Figure 0007114697000008
実施例４：タンパク質熱変性分析（ＴＳＡ、熱シフトアッセイ）
配列番号１の変異体のタンパク質熱変性を、リアルタイムＰＣＲ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｓｔｅｐ－Ｏｎｅ－Ｐｌｕｓ）を使用して、Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓ－６６５０）で監視した。
９６ウェル白色ＰＣＲプレートにおいて、１５μｌの試料（１００ｍＭのＥＰＰＳ、０，０１％Ｔｒｏｔｏｎ－Ｘ－１００；ｐＨ８，０で希釈した精製酵素）を、水中のＳｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ（濃度＝１０Ｘ；供給元からの原液＝５０００Ｘ）と混合した（１：１）。
プレートを光学的ＰＣＲシールで封止した。ＰＣＲ機器を１時間当たり７６℃のスキャン速度に設定し、２５℃で開始し、９６℃で終結した。
励起及びＲＯＸ－フィルタ（６１０ｎｍ、発光）について、内蔵ＬＥＤブルーライトを使用して２０秒毎に蛍光を監視した。Ｔｍ値は、一次導関数（ｄＦ／ｄＫ）の最大値として計算した（Ｇｒｅｇｏｒｙ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．１４：７００）。
Figure 0007114697000009
実施例５：部位特異的突然変異誘発による変異体の構築
部位特異的変異体は、サーモマイセス・ラヌギノサスリパーゼ（ＴＬＬ）（配列番号２）で構築された。得られる配列に所望の突然変異を導入するように適切に設計された突然変異誘発性オリゴヌクレオチドと共にＰＣＲを使用して、従来のＤＮＡフラグメントのクローニング（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９）によって変異体を作製した。
挿入／欠失／置換を規定するＤＮＡ塩基対によって隔てられている所望の突然変異部位に隣接するＤＮＡ配列に対応する突然変異誘発性オリゴを設計し、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ等のオリゴベンダーから購入した。ＴＬＬ変異体を試験するために、変異体をコードする突然変異型ＤＮＡを相同組換えによってコンピテントＡ．オリザエ株に組み込み、標準的なプロトコル（酵母抽出物ベースの培地、３～４日間、３０℃）を使用して発酵させ、クロマトグラフィーにより精製した。このようにして、以下の表に列記される変異体を構築し、産生した。
Figure 0007114697000010
実施例６：相対洗浄性能（ＲＰ（洗浄））
洗濯における洗浄性能を評価するために自動機械的ストレスアッセイ（ＡＭＳＡ）を使用して洗浄実験を実施した。ＡＭＳＡプレートは、試験溶液のための多くのスロットと、洗浄される織物である洗濯試料をスロットの全開口部にしっかりと締め付けるリッドと、を有する。洗浄期間中、プレート、試験溶液、織物及びリッドを、試験溶液を織物と接触させ、規則的及び周期的な振動様式で機械的ストレスを印加するために、精力的に振盪する。更なる説明に関して、国際公開第０２／４２７４０号、特に２３～２４ページの段落「Ｓｐｅｃｉａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ」を参照されたい。
洗濯実験を、以下に指定される実験条件下で実行した。
Figure 0007114697000011
ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、及びＮａＨＣＯ３（Ｃａ２＋：Ｍｇ２＋：ＨＣＯ３ －＝４：１：７．５又は２：１：４．５）を添加することにより、水硬度を１５°ｄＨ又は６°ｄＨに調整した。
Figure 0007114697000012
Figure 0007114697000013
洗浄後、織物を水道水に流し、濾紙を使用して余分な水を織物から除去し、直後に、織物を１００℃で１５分間乾燥させた。
洗浄性能を、洗浄した汚れた織物の色変化として測定した。汚れを、アナトーとクリーム混合した。アナトーは、ｐＨ依存性色変化を有するｐＨインジケータとして機能する、着色剤ノルビキシンを含有する。リパーゼ活性は、クリームアシルグリセロールから遊離脂肪酸を放出させ、これにより、ｐＨが低下し、それによりノルビキシンｐＨインジケータの色変化が生じる。したがって、リパーゼ洗浄性能は、白色光で照らされたときの、洗浄された汚れた織物から反射放出された光の色変化の程度として表すことができる。
洗浄した汚れた織物の画像を捕捉するために使用した、専門のフラットベッドスキャナー（ＥＰＳＯＮ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ １１０００ＸＬ、Ａｔｅａ Ａ／Ｓ、Ｌａｕｔｒｕｐｖａｎｇ ６，２７５０ Ｂａｌｌｅｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて色測定を行った。スキャンした画像から光強度の値を抽出するために、画像からの２４ビットピクセル値を、レッド、グリーン、及びブルー（ＲＧＢ）の値に変換した。
リパーゼ活性による色変化は、以下のように計算された光強度値（Ｉｎｔ）に対するグリーン光（Ｇ）の反射放出の変化として測定した。
Figure 0007114697000014
参照リパーゼに対するリパーゼの相対洗浄性能（ＲＰ（洗浄））は、以下のように計算された：
ＲＰ（洗浄）＝（Ｇ／Ｉｎｔ（試験したリパーゼ）－Ｇ／Ｉｎｔ（酵素なし））／（Ｇ／Ｉｎｔ（リパーゼ参照））－ｇ／Ｉｎｔ（酵素なし））。
リパーゼは、参照（ＲＰ（洗浄）＞１）よりも良好に機能する場合、改善された洗浄性能を示すと考えられる。本発明の文脈において、参照酵素は、配列番号２として示されるリパーゼである。
固相マイクロ抽出ガスクロマトグラフィー測定による臭気検出
リパーゼ洗浄されたスワッチからの酪酸放出（臭気）を、固相マイクロ抽出ガスクロマトグラフィー（ＳＰＭＥ－ＧＣ）によって以下の方法を用いて測定した。
上記に指定されるように、クリームアナトーで染みを付けたＥＭＰＡ２２１綿織物を洗浄し、洗浄後に、濾紙を使用して余分な水を織物から除去し、その後、織物を２５℃で２間乾燥させた。各ＳＰＭＥ－ＧＣ測定は、４片の洗浄及び乾燥した織物（直径５ｍｍ）を用いて実施し、これをガスクロマトグラフィー（ＧＣ）バイアルに移し、バイアルを閉じた。試料を３０℃で２４時間インキュベートし、続いて１４０℃に３０分間加熱し、分析前に２０℃～２５℃で少なくとも４時間保存した。Ｓｔａｂｉｌｗａｘ －ＤＡ ｗ／Ｉｎｔｅｇｒａ－Ｇｕａｒｄカラム（３０ｍ、０．３２ｍｍ ＩＤ及び０．２５マイクロｍ ｄｆ）及びＣａｒｂｏｘｅｎ ＰＤＭＳ ＳＰＭＥ繊維（８５マイクロｍ）を装備したＶａｒｉａｎ ３８００ ＧＣで分析を実施した。織物片の上のヘッドスペース内のＳＰＭＥ繊維を用いて、各ＧＣバイアルからのサンプリングを５０℃で８分間行い、続いてサンプリングした化合物をカラム（注入器温度＝２５０℃）に注入した。カラムフロー＝２ｍｌヘリウム／分。カラムオーブン温度勾配：０分＝５０℃、２分＝５０℃、６分４５秒＝２４０℃、１１分４５秒＝２４０℃。Ｆｌａｍｅ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＦＩＤ）を使用して検出を行い、酪酸の保持時間を真標準を用いて同定した。
リパーゼの相対臭気放出（ＲＰ（臭気））は、リパーゼ洗浄スワッチから放出される酪酸量（ピーク面積）と、参照リパーゼ洗浄スワッチから放出される酪酸量（ピーク面積）との間の比率であり、その後、両方の値が、非リパーゼ洗浄スワッチ（ブランク）から放出される酪酸の量（ピーク面積）について補正された。相対臭気性能（ＲＰ（臭気））は、以下の式に従って計算される：
ＲＰ（臭気）＝（臭気（試験したリパーゼ）－臭気（酵素なし））／（臭気（リパーゼ参照）－臭気（酵素なし））
ここで、臭気は、織物表面から放出された、測定された酪酸（ピーク面積）である。
利益リスク係数（ＲＰ（洗浄）／ＲＰ（臭気））
臭気放出（リスク）と比較した洗浄性能（利益）を説明する利益リスク係数（ＢＲＦ）は、ＲＰ（洗浄）／ＲＰ（臭気）として定義することができる。リパーゼの利益リスク係数が１より高い場合、リパーゼは、参照リパーゼ（配列番号２）と比較して、放出された臭気に対してより良好な洗浄性能を有する。
Figure 0007114697000015
実施例７：タンパク質熱変性分析（ＴＳＡ、熱シフトアッセイ）
配列番号２の変異体のタンパク質熱変性を、リアルタイムＰＣＲ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｓｔｅｐ－Ｏｎｅ－Ｐｌｕｓ）を使用して、Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓ－６６５０）で監視した。
９６ウェル白色ＰＣＲプレートにおいて、１５μｌの試料（１００ｍＭのＥＰＰＳ、０，０１％Ｔｒｏｔｏｎ－Ｘ－１００；ｐＨ８，０で希釈した精製酵素）を、水中のＳｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ（濃度＝１０Ｘ；供給元からの原液＝５０００Ｘ）と混合した（１：１）。
プレートを光学的ＰＣＲシールで封止した。ＰＣＲ機器を１時間当たり７６℃のスキャン速度に設定し、２５℃で開始し、９６℃で終結した。
励起及びＲＯＸ－フィルタ（６１０ｎｍ、発光）について、内蔵ＬＥＤブルーライトを使用して２０秒毎に蛍光を監視した。Ｔｍ値は、一次導関数（ｄＦ／ｄＫ）の最大値として計算した（Ｇｒｅｇｏｒｙ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．１４：７００）。
Figure 0007114697000016
洗剤例
実施例１～５
単位用量洗濯洗剤組成物このような単位分量の配合物は、１つ又は複数の区画を含んでもよい。
Figure 0007114697000017
実施例６．多区画単位用量組成物
本発明の多区画単位分量洗濯洗剤配合物を以下に提供する。これらの実施例では、単位分量は３つの区画を有するが、同様の組成物を２、４、又は５つの区画で作製することもできる。区画を封入するために使用されるフィルムは、ポリビニルアルコールである。
Figure 0007114697000018
Figure 0007114697000019
洗剤実施例１～７の原材料及び注記
Ｃ１１～Ｃ１８の平均脂肪族炭素鎖長を有する直鎖アルキルベンゼンスルホネート
Ｃ１２～１８ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド
ＡＥ３Ｓは、Ｃ１２～１５アルキルエトキシ（３）サルフェートである。
ＡＥ７は、平均エトキシル化度７のＣ１２～１５アルコールエトキシレートである。
ＡＥ９は、平均エトキシル化度９のＣ１２～１６アルコールエトキシレートである。
ＨＳＡＳは、米国特許第６，０２０，３０３号及び同第６，０６０，４４３号に開示されているとおり、約１６～１７の炭素鎖長を有する中鎖分岐状一級アルキルサルフェートである。
ポリアクリレートＭＷ４５００は、ＢＡＳＦによって供給されている。
カルボキシメチルセルロースは、ＣＰ Ｋｅｌｃｏ（Ａｒｎｈｅｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により供給されているＦｉｎｎｆｉｘ（登録商標）Ｖである。
ＣＨＥＣは、カチオン変性ヒドロキシエチルセルロースポリマーである。
ホスホネートキレート剤は、例えば、ジエチレンテトラアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）ヒドロキシエタンジホスホネート（ＨＥＤＰ）である。
Ｓ－ＡＣＭＣは、Ｃ．Ｉ．Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｂｌｕｅ １９と共役しているカルボキシメチルセルロース、商品名ＡＺＯ－ＣＭ－ＣＥＬＬＵＬＯＳＥである。
汚れ放出剤は、Ｒｅｐｅｌ－ｏ－ｔｅｘ（登録商標）ＰＦである。
アクリル酸／マレイン酸コポリマーは、分子量７０，０００であり、アクリレート：マレエート比は、７０：３０であり、
色相染料は、は、Ｍｉｌｌｉｋｅｎ，Ｓｐａｒｔａｎｂｕｒｇ，Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ，ＵＳＡによって供給されているＬｉｑｕｉｔｉｎｔ（登録商標）Ｖｉｏｌｅｔ ＣＴポリマー色相染料である。
両親媒性グラフトランダムグラフトコポリマーは、ポリエチレンオキシド骨格と複数のポリビニルアセテート側鎖とを有する、ポリビニルアセテートグラフト化ポリエチレンオキシドコポリマーである。ポリエチレンオキシド骨格鎖の分子量は、約６０００であり、ポリエチレンオキシドのポリビニルアセテートに対する重量比は、約４０～６０であり、５０のエチレンオキシド単位当たり１個以下のグラフト点である。
２－ＮＨ１個当たり２０個のエトキシレート基を有するポリエチレンイミン（ＭＷ＝６００）。
３両親媒性アルコキシル化ポリマーは、－ＮＨ１個当たり２４個のエトキシレート基及び－ＮＨ１個当たり１６個のプロポキシレート基を含有するように誘導体化されたポリマーから調製されるポリエチレンイミン（ＭＷ ６００）である。
４リパーゼ及びアミラーゼは、洗剤１００ｇ当たりの活性酵素のｍｇとして示される。
ａＰｒｏｘｅｌ ＧＸＬ、Ｌｏｎｚａによって供給されている１，２－ベンズイソチアゾリン－３－オンの２０％水性ジプロピレングリコール溶液。
ｂＮ，Ｎ－ビス（ヒドロキシエチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド脂肪酸エステル。この材料の親脂肪酸のヨウ素価は、１８～２２である。Ｅｖｏｎｉｋから得られる材料は、遊離脂肪酸の形態の不純物、Ｎ，Ｎ－ビス（ヒドロキシエチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド脂肪酸エステルのモノエステル形態、及びＮ，Ｎ－ビス（ヒドロキシエチル）－Ｎ－メチルアミンの脂肪酸エステルである。
ｃＭＰ１０（登録商標）、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇによって供給、８％活性
ｄ米国特許第８，７６５，６５９号に記載のとおり、１００％カプセル化香油として表される
ｅＲｈｅｏｖｉｓ（登録商標）ＣＤＥ、ＢＡＳＦによって供給されているカチオン性高分子増粘剤
ｆ約５５：４５の重量比のＮ，Ｎ－ジメチルオクタンアミド及びＮ，Ｎ－ジメチルデカンアミド、Ｓｔｅｐａｎ Ｃｏｍｐａｎｙの商品名Ｓｔｅｐｏｓｏｌ（登録商標）Ｍ－８－１０
本明細書にて開示された寸法及び値は、列挙された正確な数値に厳密に限定されるものとして理解されるべきではない。その代わりに、特に指示がない限り、このような寸法はそれぞれ、列挙された値とその値を囲む機能的に同等な範囲との両方を意味することが意図されている。例えば、「４０ｍｍ」と開示された寸法は、「約４０ｍｍ」を意味することが意図される。

Claims (11)

  1. 水溶性フィルムと、液体洗濯洗剤組成物と、を含む水溶性単位用量物品であって、前記液体洗濯洗剤組成物は、親リパーゼの変異体であって、リパーゼ活性を有し、配列番号２と少なくとも９０％であるが１００％未満の配列同一性を有し、かつ（ｉ）Ｒ１１８Ｆに対応する位置に置換、（ｉｉ）Ｔ２３１Ｒ及びＮ２３３Ｒに対応する位置に置換、並びに（ｉｉｉ）Ｇ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｆ５１Ｉ，Ｌ、Ｅ５６Ｒ、Ｄ５７Ｎ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｋ９８Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、Ｔ２４４Ｅ、及びＰ２５６Ｔに対応する位置に１つ以上の置換を含む、変異体と、洗剤補助剤と、を含む、水溶性単位用量物品。
  2. 前記変異体が、Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒに対応する位置に置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｆ５１Ｉ，Ｌ、Ｄ５７Ｎ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｋ９８Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、Ｔ２４４Ｅ、及びＰ２５６Ｔに対応する位置に１つ以上の置換を含むか、又は
    前記変異体が、Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒに対応する位置に置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｄ５７Ｎ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｋ９８Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、Ｔ２４４Ｅ、及びＰ２５６Ｔに対応する位置に１つ以上の置換を含むか、又は
    前記変異体が、Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔに対応する位置に置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｆ５１Ｉ，Ｌ、Ｄ５７Ｎ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｋ９８Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、及びＴ２４４Ｅに対応する位置に１つ以上の置換を含むか、又は
    前記変異体が、Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔに対応する位置に置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｄ５７Ｎ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｋ９８Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、及びＴ２４４Ｅに対応する位置に１つ以上の置換を含むか、又は
    前記変異体が、Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒに対応する位置に置換、並びに、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｄ５７Ｎ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｋ９８Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、Ｔ２４４Ｅ、及びＰ２５６Ｔに対応する位置に１つ以上の置換を含む、請求項１に記載の水溶性単位用量物品。
  3. 前記変異体が、Ｐ２５６Ｔを更に含む、請求項１に記載の水溶性単位用量物品。
  4. 前記変異体が、Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔに対応する位置に置換、並びに、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｄ５７Ｎ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｋ９８Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、及びＴ２４４Ｅに対応する位置に１つ以上の置換を含むか、又は
    前記変異体が、Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔに対応する位置に置換、並びに、Ｇ２３Ｓ、Ａ４０Ｉ、Ｄ５７Ｎ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｋ９８Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、及びＴ２４４Ｅに対応する位置に１つ以上の置換を含むか、又は
    前記変異体が、Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔに対応する位置に置換、並びに、Ｇ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ｄ５７Ｎ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｋ９８Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、及びＴ２４４Ｅに対応する位置に１つ以上の置換を含むか、又は
    前記変異体が、Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔに対応する位置に置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｋ９８Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、及びＴ２４４Ｅに対応する位置に１つ以上の置換を含むか、又は
    前記変異体が、Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１
    Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔに対応する位置に置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、及びＴ２４４Ｅに対応する位置に１つ以上の置換を含むか、又は
    前記変異体が、Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔに対応する位置に置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｎ１０１Ｄ、Ｙ２２０Ｆ、及びＴ２４４Ｅに対応する位置に１つ以上の置換を含むか、又は
    前記変異体が、Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔに対応する位置に置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｎ１０１Ｄ、及びＹ２２０Ｆに対応する位置に１つ以上の置換を含むか、又は
    前記変異体が、Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｖ６０Ｅ，Ｋ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔに対応する位置に置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、及びＴ２４４Ｅに対応する位置に１つ以上の置換を含むか、又は
    前記変異体が、Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｎ１０１Ｄ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔに対応する位置に置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｖ６０Ｅ，Ｋ、Ｎ１０１Ｄ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、及びＴ２４４Ｅに対応する位置に１つ以上の置換を含むか、又は
    前記変異体が、Ｆ５１Ｉ，Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｖ６０Ｅ，Ｋ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｎ１０１Ｄ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔに対応する位置に置換、並びにＧ２３Ｓ、Ｄ２７Ｎ、Ａ４０Ｉ、Ｇ１６３Ｓ、Ｙ２２０Ｆ、及びＴ２４４Ｅに対応する位置に１つ以上の置換を含む、請求項１に記載の水溶性単位用量物品。
  5. 前記変異体が、以下の置換の組、
    Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ａ４０Ｉ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ｆ５１Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ｅ５６Ｒ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ｅ５６Ｒ＋Ｖ６０Ｋ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ｄ２７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ｄ２７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｖ６０Ｋ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｖ６０Ｅ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ
    ２５６Ｔ、
    Ａ４０Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ｆ５１Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ｄ５７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ａ４０Ｉ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ａ４０Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ａ４０Ｉ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ａ４０Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｆ５１Ｌ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ｆ５１Ｌ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ｆ５１Ｌ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ｆ５１Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ｄ５７Ｎ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ｄ５７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｋ９８Ｉ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｌ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｌ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｌ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｌ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ａ４０Ｉ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ａ４０Ｉ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ａ４０Ｉ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ａ４０Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ａ４０Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ａ４０Ｉ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｆ５１Ｌ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ｆ５１Ｌ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ｆ５１Ｌ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｆ５１Ｌ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ｆ５１Ｌ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｆ５１Ｌ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｄ５７Ｎ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｋ９８Ｉ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｌ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｌ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｌ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ
    ２５６Ｔ、
    Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｌ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｌ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ａ４０Ｉ＋Ｆ５１Ｌ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ａ４０Ｉ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ａ４０Ｉ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ａ４０Ｉ＋Ｄ５７Ｎ＋Ｇ１６３Ｓ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
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    Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
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    Ｇ２３Ｓ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
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    Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
    Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
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    Ｄ２７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
    Ｄ２７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｄ２７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｄ２７Ｎ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
    Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｆ５１Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
    Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｄ２７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ、
    Ｇ２３Ｓ＋Ｄ２７Ｎ＋Ｆ５１Ｉ＋Ｅ５６Ｒ＋Ｋ９８Ｉ＋Ｒ１１８Ｆ＋Ｙ２２０Ｆ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｔ２４４Ｅ＋Ｐ２５６Ｔ
    のうちの１つに対応する位置に置換を含む、請求項１に記載の水溶性単位用量物品。
  6. １種以上のリパーゼ酵素が、マイクロカプセルに封入される、請求項１～５のいずれか一項に記載の水溶性単位用量物品。
  7. 前記洗剤組成物が、液体の形態である、請求項１～６のいずれか一項に記載の水溶性単位用量物品。
  8. 前記洗剤組成物が、カルボキシメチルセルロース、疎水変性カルボキシメチルセルロース、又はこれらの混合物から選択されるポリマーを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の水溶性単位用量物品。
  9. 非石鹸アニオン性界面活性剤が、直鎖アルキルベンゼンスルホネート、アルコキシル化アルキルサルフェート、又はこれらの混合物を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の水溶性単位用量物品。
  10. 前記液体洗濯洗剤組成物が、
    ａ．カチオン変性ヒドロキシエチルセルロース、カチオン変性ヒドロキシプロピルセルロース、カチオン変性及び疎水変性ヒドロキシエチルセルロース、カチオン変性及び疎水変性ヒドロキシプロピルセルロース、又はこれらの混合物から選択されるカチオン性多糖類、
    ｂ．アルコキシル化ポリエチレンイミン、
    ｃ．これらの混合物を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の水溶性単位用量物品。
  11. 布地を洗浄するための方法であって、
    ａ．請求項１～１０のいずれか一項に記載の水溶性単位用量物品を、前記水溶性フィルムを溶解し、前記洗濯洗剤組成物を希釈するのに十分な水と合わせて、洗浄液を形成する工程と、
    ｂ．前記洗浄液を、洗浄される少なくとも１枚の布地と接触させる工程と、を含む、方法。
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