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Description
具体的な実施形態では、TCRは、配列番号1、配列番号2および/または配列番号3のアミノ酸配列のHLA-A*02結合型を認識する。具体的な実施形態では、TCRは、配列番号1、配列番号2および/または配列番号3のアミノ酸配列のHLA-A*02:01結合型を特異的に認識する。このTCRは、NY-ESOに対して高度に特異的であり、他のペプチドに対して低い交差反応性を示す。
- 配列番号4のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号5のアミノ酸配列を有するCDR2、および配列番号6の配列を有するCDR3を含むTCRα鎖と、
- 配列番号7のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号8のアミノ酸配列を有するCDR2、および配列番号9の配列を有するCDR3を含むTCRβ鎖と
を含み得る。
- 可変TCRα領域が、配列番号10と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号6に提示するアミノ酸配列を有するCDR3領域を含み、
- 可変TCRβ領域が、配列番号11と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号9に提示するアミノ酸配列を有するCDR3領域を含む、
TCRα鎖およびTCRβ鎖を含み得る。
本発明によるTCR、特に可溶型のTCRは、例えば、免疫原性を低下させる、流体力学的サイズ(溶液中のサイズ)可溶性および/もしくは安定性を増加させる(例えば、タンパク質分解に対する保護の増強により)、ならびに/または血清半減期を延長させるために、追加の機能性部分を結合させることにより修飾することができる。他の有用な機能性部分および修飾は、「自殺」または「安全スイッチ」を含み、これを使用して、患者の体内で本発明のTCRを保有するエフェクター宿主細胞を遮断するか、または作動させることができる。
グリコシル化パターンを改変したTCRもまた、本明細書において想定される。
薬物または治療物質、例えば、低分子化合物をTCR、特に、可溶型の本発明のTCRに加えることも考えられ得る。
TCR、特に、可溶型の本発明のTCRは、それぞれの分子(タグ)の同定、追跡、精製および/または単離に役立つ追加のドメインを導入するように、さらに修飾することができる。
それぞれCLL3およびCLL4とも呼ばれる、MIP-1αおよびMIP-1βなどのケモカイン、特にMIP-1αは、腫瘍増殖を助長することが知られているため(Liao et al. Oncotarget, 7(4): 4310-4325 (2015);Silva et al. Oncotarget 8 (11): 51024-51036 (2017))、MIP-1αおよびMIP-1βの分泌レベルが低いことは有利である。
本発明の別の態様は、本明細書に記載のTCRをコードするか、または上記のポリペプチドをコードする核酸に言及する。
a)上記の少なくとも1つの核酸を含む発現ベクター、または
b)本明細書に記載のTCRのアルファ鎖をコードする核酸を含む第1の発現ベクター、および本明細書に記載のTCRのベータ鎖をコードする核酸を含む第2の発現ベクター
を含み得る。
TCRは、2つの異なる別々のタンパク質鎖、すなわちTCRアルファ(α)およびTCRベータ(β)鎖から構成される。TCRα鎖は、可変(V)、連結(J)および定常(C)領域を含む。TCRβ鎖は、可変(V)、多様性(D)、連結(J)および定常(C)領域を含む。TCRαおよびTCRβ鎖の両方の再配列したV(D)J領域は、CDR3領域により特異的エピトープの認識が決定する、高頻度可変領域(CDR、相補性決定領域)を含有する。C末端領域において、TCRα鎖とTCRβ鎖はともに、疎水性膜貫通ドメインを含有し、短い細胞質尾部で終わる。
TCR座位および遺伝子は、国際免疫遺伝学(International Immunogenetics、IMGT)TCR命名法を使用して呼ばれる(IMGT Database, www. IMGT.org;Giudicelli, V., et al.,IMGT/LIGM-DB, the IMGT(R) comprehensive database of immunoglobulin and T cell receptor nucleotide sequences, Nucl. Acids Res., 34, D781-D784 (2006). PMID: 16381979;T cell Receptor Factsbook, LeFranc and LeFranc, Academic Press ISBN 0-12- 441352-8)。
本発明の第1の態様は、NY-ESO-1/LAGE-1に特異的な単離されたT細胞受容体(TCR)に関する。
NY-ESO-1/LAGE-1は、いわゆるがん/精巣抗原の群に属する。がん/精巣抗原は、種々の悪性腫瘍および胚細胞において発現するが、他の成体組織においては発現しない。したがって、NY-ESO-1/LAGE-1は、興味深い免疫治療標的抗原である。NY-ESO-1をコードするヒト遺伝子は、CTAG1A(ENSGT00000268651)と名付けられ、CTAG1A-002およびCTAG1A-201と呼ばれる2つのアイソフォーム(ENST00000599837およびENST00000593606)を有し、CTAG1B-001およびCTAG1B-002と呼ばれる2つのアイソフォーム(ENST00000359887およびENST00000328435)を有するCTAG1Bと名付けられたコピー(ENSG0000184033)を有する。LAGE-1をコードするヒト遺伝子は、CTAG2.1(ENSG0000126890)と名付けられ、CATG2.1と名付けられたアイソフォームおよびCATG2.2と名付けられたアイソフォーム(ENST0000247306およびENST0000369585)を有する。
一部の実施形態は、TCRα鎖およびTCRβ鎖を含む単離されたTCRであって、
- TCRα鎖が、配列番号6の配列を有する相補性決定領域3(CDR3)を含み、
- TCRβ鎖が、配列番号9のアミノ酸配列を有するCDR3を含む、
単離されたTCRに関する。
- 配列番号4のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号5のアミノ酸配列を有するCDR2、および配列番号6の配列を有するCDR3を含むTCRα鎖と、
- 配列番号7のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号8のアミノ酸配列を有するCDR2、および配列番号9の配列を有するCDR3を含むTCRβ鎖と
を含む単離されたTCRに言及する。
- 可変TCRα領域が、配列番号10と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号6に提示するアミノ酸配列を有するCDR3領域を含み、
- 可変TCRβ領域が、配列番号11と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号9に提示するアミノ酸配列を有するCDR3を含む、
単離されたTCRに言及する。
グリコシル化パターンを改変したTCRもまた、本明細書において想定される。当技術分野において公知のように、グリコシル化パターンは、アミノ酸配列(例えば、以下に考察する、特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在または非存在)および/またはタンパク質を産生する宿主細胞もしくは生物に依存し得る。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的に、N連結型またはO連結型のいずれかである。N連結型は、糖鎖の、アスパラギン残基の側鎖への結合を指す。N連結型グリコシル化部位の結合分子への付加は、アスパラギン-X-セリンおよびアスパラギン-X-スレオニン(ここで、Xは、プロリンを除く任意のアミノ酸である)から選択される1つまたは複数のトリペプチド配列を含有するようにアミノ酸配列を改変することにより、好都合に達成される。O連結型グリコシル化部位は、1つまたは複数のセリンまたはスレオニン残基の開始配列への付加または置換により導入することができる。
本発明のTCR、特に可溶型のTCRは、加えて、それぞれの分子(タグ)の同定、追跡、精製および/または単離に役立つ追加のドメインを導入するように修飾することができる。したがって、一部の実施形態では、TCRα鎖またはTCRβ鎖は、エピトープタグを含むように修飾され得る。
本発明のTCRを保有する宿主細胞を刺激し、増やすために、タグに特異的な結合分子(抗体)の存在下で細胞を培養することにより、前記タグをさらに用いることができる。
本発明の別の態様は、配列番号6および9のアミノ酸配列のうちの少なくとも1つを含む、本明細書に記載のTCRの機能性部分を含むポリペプチドに言及する。
一実施形態では、機能性部分は、本明細書に記載のTCRα可変鎖および/またはTCRβ可変鎖を含む。
一部の実施形態は、エフェクター細胞上に発現した本発明のTCRが、配列番号1~3からなる群から選択されるアミノ酸配列のHLA-A*02結合型に結合することにより、IFN-γ分泌が誘導される、本明細書に記載の単離されたTCR、本明細書に記載のポリペプチド、本明細書に記載の多価TCR複合体に言及する。
候補TCRまたはその断片が免疫応答を媒介するかどうかは、例えば、サイトカイン分泌、例えば、IFN-γ分泌の測定により決定することができる。上記のように、サイトカイン分泌は、配列番号1~3からなる群から選択されるアミノ酸配列のうちの1つ、好ましくは配列番号3をコードするivtRNAをトランスフェクトしたK562細胞(または他のAPC)を、調査するTCR、またはTCRの断片を含む分子を発現するCD8+富化PBMCとともにインキュベートするin vitroアッセイにより測定され得る。
本発明の別の態様は、本明細書に記載のTCRをコードする、または本明細書に記載のTCRをコードするポリヌクレオチドをコードする核酸に言及する。
本発明の別の態様は、本明細書に記載のTCRを発現する細胞に言及する。
a)本明細書に記載の少なくとも1つの核酸を含む発現ベクター、または
b)本明細書に記載のTCRのアルファ鎖をコードする核酸を含む第1の発現ベクター、および本明細書に記載のTCRのベータ鎖をコードする核酸を含む第2の発現ベクター
を含む、細胞に言及する。
一部の実施形態では、細胞は、幹細胞様メモリーT細胞である。
本発明の別の態様は、NY-ESO-1/LAGE-1に対する特異性を媒介する、本明細書に記載のTCRの部分に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合性断片に言及する。一実施形態では、NY-ESO-1/Lage-1特異性を媒介する、TCRの部分は、配列番号6のアルファ鎖のCDR3および/または配列番号9のベータ鎖のCDR3を含む。
本発明の別の態様は、本明細書に記載のTCR、前記TCRの機能性部分を含むポリペプチド、本明細書に記載の多価TCR複合体、TCRをコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記TCRを含む細胞、または本明細書に記載のTCRの部分に特異的に結合する抗体を含む、医薬組成物に言及する。
[実施例1]
NY-ESO-1/LAGE-1特異的T細胞クローンの単離
所望の任意のMHC制限および抗原特異性のT細胞クローンを単離するためにin vitroでのプライミングアプローチを使用した。プライミングシステムでは、HLA-A*02:01陰性ドナーの成熟樹状細胞(mDC)を抗原提示細胞として、自家CD8+富化T細胞を応答細胞として使用する。配列番号14に言及する完全長ヒトCTAG1A/Bアミノ酸配列をコードするin vitroで転写したRNA(ivtRNA)は、特異的抗原の供給源として作用する。同時に、ヒトHLA-A*02:01をコードするivtRNAを、mDCにトランスフェクトする制限要素の供給源として使用して、この特化したHLAアレルに関する同種プライミングを設定する(国際公開第2007/017201号パンフレットに記載のように)。mDCへのエレクトロポレーション後、CTAG1をコードするivtRNAは、完全長タンパク質に翻訳され、その後、プロセシングされて、トランスフェクトしたmDCにより発現するトランスジェニックHLA-A*02:01分子によりペプチドとして提示される。同一のドナー由来のT細胞の、ivtRNAトランスフェクトmDCとのin vitroでの共培養により、対応するTCRの供給源として作用する抗原特異的T細胞のde novo誘導が生じる。抗原特異的T細胞は、様々な方法により富化することができ、限界希釈またはFACSをベースとする単一細胞選別によりクローン化する。
HLA-A*02:01をコードするivtRNAをトランスフェクトした成熟樹状細胞を使用する同種プライミングアプローチ
高親和性TCRによるT細胞の樹状細胞プライミングは、同種HLA-A*02:01分子によるペプチド提示を使用して、以下のプロトコールに従って達成した:
HLA-A*02:01/CTAG1プライミング
適する成熟混合物を使用して、DCについてJonuleit et al.に従って(Jonuleit et al. 1997, Eur. J. Immunol. 1997, 27:3135-3142)、成熟樹状細胞を産生した(8日mDC)。
抗原提示細胞(8日成熟mDC)は、健常なドナーに由来し、所望の抗原およびHLA分子(HLA-A*02:01)をコードするivtRNA 20μgによりエレクトロポレートした。その後、調製したmDCは、健常ドナーのCD8+富化PBMCと1:10の比で約14日間、IL-2を添加した(1日おきに50単位/ml)適する細胞培地中に37℃(6%のCO2)で共培養した。その後、HLA-A*02:01 NY-ESO-1/LAGE-1157-165多量体(ProImmune)を使用してNY-ESO-1/LAGE-1157-165特異的細胞を同定し、その後、FACS技術を使用して単一細胞選別により分離した。
機能/特異性の解析
HLA-A2上の所望のNY-ESO-1/LAGE-1エピトープ(NY-ESO-1/LAGE-1157-165)に結合する候補TCR(T11.8-10-17)の同定後、機能および特異性についての完全な特徴付けを行った。解析により、T細胞クローンT11.8-10-17のNY-ESO-1、より正確には、NY-ESO-1/LAGE-1157-165に対する特異性(図1)、T11.8-10-17形質導入CD8+富化T細胞が、HLA-A2陽性NY-ESO-1/LAGE-1157-165ペプチド負荷腫瘍細胞株を特異的に溶解する能力(図2)およびT11.8-10-17形質導入CD8+富化T細胞の、種々のヒト腫瘍細胞株との共培養における腫瘍細胞認識(図3)が確認された。
オリジナルT細胞クローンT11.8-10-17の解析
[実施例2.1.1]
抗原特異性
実験計画:ivtRNA負荷K562またはペプチド負荷T2細胞による刺激
NY-ESO-1/LAGE-1157-165特異性を以下のプロトコールに従って確認した:標準的サンドイッチELISA解析を実施し、IFN-γを検出した(BDヒトIFN-γELISAセット)。
標的細胞として、T2細胞(HLA-A*02pos)に飽和量(10-5M)のNY-ESO-1/LAGE-1157-165ペプチド(「SLLペプチド」;配列番号3)または無関係なNY-ESO-1由来のペプチド(「FTVペプチド」;配列番号15)すなわち、FTVSGNILTIペプチド(「FTVペプチド」)もしくはRLLEFYLAMペプチド(「RLLペプチド」、配列番号16)を負荷した。
加えて、K562細胞(HLA-A*02:01を形質導入;「K562-A2」)に、NY-ESO-1/LAGE-1157-165をコードするivtRNA 20μgをトランスフェクトするか、または対照として水によりエレクトロポレートした。各標的細胞株をT細胞クローンT11.8-10-17と約2:1の比で、20,000個の標的細胞および10,000個のT細胞を使用して共培養した。IFN-γを標準的サンドイッチELISAにより検出した(BDヒトIFN-γELISAセット)。
候補クローンは、NY-ESO-1を発現するK562-A2細胞またはSLLペプチド負荷T2細胞で刺激した場合にのみIFN-γを分泌したが、水によりエレクトロポレートしたK562-A2または無関係なペプチド(FVTまたはRLL)を負荷したT2細胞との組合せでは、分泌しなかった(図1)。
腫瘍細胞の認識
実験計画:腫瘍細胞の殺傷
T11.8-10-17形質導入CD8+T細胞またはベンチマークTCR形質導入CD8+T細胞(CD8-T11.8-10-17またはCD8_ベンチマーク-TCR)の殺傷能を、HLA-A*02陽性NY-ESO-1/LAGE-1陽性腫瘍細胞株Mel624.38と共培養することにより評価した(図2a)。加えて、CD8-T11.8-10-17の殺傷もまた、HLA-A*02陽性NY-ESO-1/LAGE-1陽性腫瘍細胞株MM415を用いて試験した(図2b)。陰性対照として、非形質導入CD8+富化PBMCをエフェクター細胞(CD8_UT)として使用するか、またはHLA-A*02陽性であるがNY-ESO-1/LAGE-1陰性の腫瘍細胞株SK-Mel23を標的細胞として使用した。約4:1のエフェクターと標的との比で共培養を設定した。すなわち、共培養の1日前に10,000個の接着腫瘍細胞を播種し、その後、40,000個のトランスジェニックTCR+T細胞を加えた。標的細胞のアポトーシスの誘導を示す(アネキシンV、赤色)赤色蛍光標的細胞の増加(GCU×μm2/画像における総積分強度)を、生細胞モニタリング(IncuCyte(登録商標)ZOOM)を使用して67時間の全期間にわたって4時間毎に測定した。
T11.8-10-17形質導入CD8+T細胞またはベンチマークTCR形質導入CD8+T細胞は、NY-ESO-1/LAGE-1陽性およびHLA-A2陽性腫瘍細胞株Mel624.38(図2a)またはMM415(図2b)のみの殺傷を示し、このことは、10時間後から既に開始した、赤色蛍光(IncuCyte(登録商標)アネキシンV)の増加により表された。対照的に、エフェクター細胞なしで培養した腫瘍細胞の場合、またはT11.8-10-17形質導入CD8+T細胞とともに培養した、NY-ESO-1/LAGE-1陰性およびHLA-A2陽性腫瘍細胞株SK-Mel23の場合は、赤色蛍光の増加は観察されず、標的細胞の殺傷がなかったことを示した。非形質導入CD8+T細胞は、いかなる腫瘍細胞株の溶解も示さなかった。
腫瘍細胞の認識
実験計画:腫瘍細胞株による刺激
IFN-γ ELISAを使用して、T11.8-10-17形質導入T細胞(CD8_T11.8-10-17)による刺激時のサイトカイン分泌を、HLA-A*02:01陽性、NY-ESO-1/LAGE-1陽性ヒト腫瘍細胞株(Mel624.38、FM6、FM3.29、MM415、SAOS2、U266)のパネルを用いて評価した。NY-ESO-1/LAGE-1発現が、標的細胞において、NanoString nCounter(登録商標)解析により検出された。T11.8-10-17形質導入T細胞の陽性対照として、T2細胞にSLLペプチド(10-5M)を負荷した。エフェクター機能の陰性対照として、T11.8-10-17形質導入T細胞を、無関係な(FTV)ペプチド(10-5M)を負荷したT2細胞、SK-Mel23(HLA-A2pos、NY-ESO-1/LAGE-1neg)もしくはSKM1(HLA-A2pos、NY-ESO-1/LAGE-1neg)と共培養するか、または非形質導入T細胞を腫瘍細胞またはペプチド負荷T2細胞と共培養した。エフェクター細胞なしの標的細胞の培養は、追加の陰性対照として作用した。標的細胞は、T細胞と2:1の比で、40,000個のT11.8-10-17形質導入T細胞および20,000個の標的細胞を使用して共培養した(図3)。
T11.8-10-17トランスジェニックCD8+T細胞は、NY-ESO-1/LAGE-1pos、HLA-A*02pos腫瘍細胞株Mel624.38、FM6、FM3.29、MM415、SAOS2およびU266またはNY-ESO-1/LAGE-1157-165負荷T2細胞との共培養における、高いIFN-γ分泌量を示す。対照的に、HLA-A*02陽性、NY-ESO-1/LAGE-1陰性腫瘍細胞株SK-Mel23およびSKM1または無関係なペプチドを負荷したT2細胞のT11.8-10-17トランスジェニックCD8+T細胞による認識は、検出されなかった。任意の標的細胞またはエフェクターT細胞なしの標的細胞と共培養した非形質導入T細胞は、IFN-γ分泌を示さなかった(図3)。
不適合エピトープの認識
実験計画2.4.1:ペプチド負荷エピトープの認識
NY-ESO-1/LAGE-1157-165特異的ベンチマーク形質導入CD8+(CD8-ベンチマーク-TCR)T細胞またはT11.8-10-17-TCR形質導入CD8+(CD8_T11-10-17)T細胞のいずれかのIFN-γ分泌を、ペプチド認識(IFN-γ分泌)について、ペプチド負荷(10-5M)T2細胞を用いて試験した。実行したすべてのデータベースのin silicoでのExpitope(登録商標)解析(Expitope(R) 2.0; Jaravine et al. BMC Cancer 2017)、および合わせたスコア閾値を除去することにより(0に設定)、SLLペプチド配列(9mer)に対して少なくとも56%相同であり(不適合最大4)、MHC(IC50)結合スコアが20,000nMよりも低い、75のペプチドを試験した。陰性対照として、非形質導入CD8+富化PBMC(CD8_UT)をエフェクター細胞として使用するか、またはTCRトランスジェニックT細胞を無関係なペプチド(irr.;FTVSGNILTI)を負荷したT2細胞(10-5M)で刺激した。標的細胞のバックグラウンドのIFN-γ分泌も試験した(標的のみ)。陽性対照として、SLLペプチド(#10*)負荷T2細胞(10-5M)によりT細胞を活性化した。標的細胞をT細胞と1:1の比で、20,000個の標的細胞および20,000個のT11.8-10-17形質導入T細胞またはベンチマークTCR形質導入もしくは非形質導入T細胞を使用して共培養した。IFN-γ分泌を標準的ELISAにより[pg/mL]で測定した。6つの認識されたペプチドを示す(図4)。
T11.8-10-17トランスジェニックCD8+T細胞およびベンチマークTCRトランスジェニックCD8+T細胞により交差認識されたペプチドを示す(ペプチド配列を表1にまとめる)。トランスジェニックT細胞は、陽性対照ペプチド(SLL、SLLMWITQC)を認識したが、無関係なペプチド(irr.;FTVSGNILTI)は認識せず、これにより、トランスジェニックT細胞の機能性が立証された。加えて、ペプチド#3を交差認識したトランスジェニックT細胞と、T11.8-10-17トランスジェニックT細胞もともに、ペプチド#6、#11、#32、#34および#51を負荷したT2細胞により、わずかに活性化された。非形質導入T細胞による、いかなるT2細胞の認識も観察されなかった。別々に培養したT細胞またはT2標的細胞は、IFN-γを分泌しなかった(図4)。
ペプチド導入HLA-A*02:01トランスジェニックK562細胞(K562-A2+irr.、K562-A2+SLL)または標的ivtRNAをトランスフェクトしたHLA-A2トランスジェニックK562(K562-A2+NY-ESO-1、K562-A2+eGFP)のいずれかとの共培養における、NY-ESO-1/LAGE-1157-165特異的TCRであるT11.8-10-17(CD8_T11.8-10-17)またはベンチマークTCR(CD8_ベンチマーク-TCR)を発現するCD8+富化PBMCの特異的IFN-γ放出を、共培養の設定16時間後に試験した。この実験では、RPMI1640培地300μl中のK562細胞3×106に、NY-ESO-1またはeGFP-ivtRNAのいずれか20μgを用いてエレクトロポレートした(300ボルトおよび300μF;指数パルス)。陽性対照として、SLLペプチド(10-5M)(K562-A2+SLL)またはNY-ESO-1をコードするivtRNA 20μg(K562-A2+NY-ESO-1)のいずれかを負荷したHLA-A*02:01トランスジェニックK562細胞でT細胞を刺激した。陰性対照として、HLA-A*02:01トランスジェニックK562に、無関係なペプチド(10-5M;K562-A2+FTV)またはeGFPをコードするivtRNA 20μg(K562-A2+eGFP)のいずれかを負荷した。加えて、本発明のT11.8-10-17TCR(CD8_T11.8-10-17)またはベンチマークTCR(CD8_ベンチマーク-TCR)のいずれかを発現するトランスジェニックT細胞により交差認識されるエピトープおよび隣接する配列を含む、長いペプチドと組み合わせたeGFPをコードするivtRNA(K562-A2+#3、K562-A2+#6、K562-A2+#11、K562-A2+#32、K562-A2+#34、K562-A2+#51)20μgをHLA-A*02:01陽性K562細胞にトランスフェクトした。標的細胞をT細胞と2:1の比で、40,000個の標的細胞および20,000個のT11.8-10-17形質導入T細胞またはベンチマークTCR形質導入T細胞を使用して共培養した。IFN-γ分泌を標準的ELISAにより[pg/mL]で測定した(図5)。
T11.8-10-17トランスジェニックCD8+T細胞およびベンチマークTCRトランスジェニックCD8+T細胞は、陽性対照、すなわち、SLLペプチド負荷K562-HLA-A*02:01陽性細胞(K562-A2+SLL)またはNY-ESO-1-ivtRNAトランスフェクトK562-HLA-A*02:01陽性細胞(K562-A2+NYESO)のいずれかを認識したが、無関係に負荷したK562-HLA-A*02:01陽性細胞(K562-A2+irr.およびK562-A2+eGFP)は認識せず、これにより、トランスジェニックT細胞の特異性および機能性が立証された。ベンチマークTCRトランスジェニックT細胞は、細胞内でプロセシングされ、K562-HLA-A*02:01陽性細胞上に提示された場合、ペプチド#3を依然として認識することができたが、T11.8-10-17は、内部的にプロセシングされたいずれのペプチド(#3、#6、#11、#32、#34および#51)の交差認識もそれ以上示さなかった。このことにより、T11.8-10-17トランスジェニックT細胞が、内部的にプロセシングされた場合、ベンチマークTCRと比較して、試験したペプチドのいずれも交差認識しないという結論が導かれる。
サイトカインプロファイル
実験計画3.1:IFN-γ、TNF-αおよびグランザイムBの分泌
10-5MのNY-ESO-1/LAGE-1157-165(T2(SLL))ペプチドまたは10-5MのNY-ESO-1に由来する無関係なペプチド(T2(FTV))のいずれかを負荷したHLA-A*02:01陽性T2細胞による刺激時に、NY-ESO-1/LAGE-1157-165特異的TCRであるT11.8-10-17(CD8_T11.8-10-17)またはベンチマークTCR(CD8_ベンチマーク-TCR)を発現するように遺伝子改変した、2人の異なる健常ドナーの(図6a:ドナー1;図6b:ドナー2)CD8+トランスジェニックTCR富化PBMCの特異的サイトカイン放出([ng/mL]で測定したIFN-γ、TNF-αおよびグランザイムB)を評価した。
陰性対照として、T11.8-10-17トランスジェニックCD8+T細胞もしくはベンチマークトランスジェニックCD8+T細胞を、HLA-A*02:01陽性FTV負荷T2細胞(T2(FTV))で刺激するか、または非形質導入CD8+富化PBMC(CD8_ut)をペプチド負荷T2細胞と共培養した。さらに、T2細胞またはT細胞を別々に培養した。
標的細胞およびT細胞を1:1の比で、10,000個の標的細胞および10,000個のT11.8-10-17形質導入T細胞またはベンチマークTCR形質導入T細胞を使用して共培養した。T11.8-10-17トランスジェニックCD8+T細胞またはベンチマークトランスジェニックCD8+T細胞のいずれかによるIFN-γ、TNF-αおよびグランザイムBの分泌を、共培養の設定18時間後に、Milliplex MAP Kitを使用してマルチプレックスアッセイにより決定し、MagPix解析装置により解析した。
顕著なサイトカイン放出は、すべての陰性対照について測定されない。両方のトランスジェニックTCRは、それぞれのT細胞により同量のIFN-γ、TNF-αおよびグランザイムB分泌を生じ、エフェクター機能に関して好ましいサイトカインプロファイルを示す。
10-5MのNY-ESO-1/LAGE-1157-165(SLL)ペプチド(T2(SLL))または10-5MのNY-ESO-1に由来する無関係なペプチド(FTV)(T2(FTV))のいずれかを負荷したHLA-A*02:01陽性T2細胞による刺激時に、NY-ESO-1/LAGE-1157-165特異的TCRであるT11.8-10-17(CD8_T11.8-10-17)またはベンチマークTCR(CD8_ベンチマーク-TCR)を発現する、CD8+富化PBMC(図7a:ドナー1または図7b:ドナー2)の特異的ケモカイン放出(MIP-1αおよびMIP-1β)。ベンチマークTCRトランスジェニックT細胞は、SLLペプチド負荷T2細胞による刺激時に、TCR T11.8-10-17トランスジェニックT細胞と比較して高量のMIP-1αおよびMIP-1βを分泌した。
陰性対照として、T11.8-10-17トランスジェニックCD8+T細胞もしくはベンチマークトランスジェニックCD8+T細胞を、HLA-A*02:01陽性FTV負荷T2細胞により刺激するか、または非形質導入CD8+富化PBMC(CD8_ut)をペプチド負荷T2細胞と共培養した。さらに、T2細胞またはT細胞を別々に培養した。
標的細胞およびT細胞を1:1の比で、10,000個の標的細胞および10,000個のT11.8-10-17形質導入T細胞またはベンチマークTCR形質導入T細胞を使用して共培養した。T11.8-10-17トランスジェニックCD8+T細胞またはベンチマークトランスジェニックCD8+T細胞のいずれかによるMIP-1αおよびMIP-1βの分泌を、共培養の設定18時間後に、Milliplex MAP Kitを使用してマルチプレックスアッセイにより決定し、MagPix解析装置により解析した。
ごくわずかなケモカイン放出は、すべての陰性対照について測定される。さらに、別々に培養したT2細胞またはT細胞は、いかなるケモカイン放出も示さない。T11.8-10-17形質導入T細胞は、ベンチマークTCRトランスジェニックT細胞と比較して著しく低量のMIP-1αおよびMIP-1βを放出した。それぞれCCL3およびCLC4とも呼ばれる、MIP-1αおよびMIP-1βなどのケモカイン、特にMIP-1αは、腫瘍増殖を助長することが知られているため(Liao et al. Oncotarget, 7(4): 4310-4325 (2015);Silva et al. Oncotarget 8 (11): 51024-51036 (2017);Yu Wu et al. J Immunol., Nov 1;181(9):6384-93 (2008))、MIP-1αおよびMIP-1βの分泌レベルが低いことは有利である。
なお、本発明は、以下の態様をも含まれる。
<1> NY-ESO-1/LAGE-1に特異的な単離されたT細胞受容体(TCR)。
<2> - 配列番号4のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号5のアミノ酸配列を有するCDR2、および配列番号6の配列を有するCDR3を含むTCRα鎖と、
- 配列番号7のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号8のアミノ酸配列を有するCDR2、および配列番号9の配列を有するCDR3を含むTCRβ鎖と
を含む、上記1に記載の単離されたTCR。
<3> 配列番号1のアミノ酸配列またはその断片を特異的に認識する、上記1または2に記載の単離されたTCR。
<4> 配列番号2のアミノ酸配列またはその断片を特異的に認識する、先行する上記のいずれかに記載の単離されたTCR。
<5> 配列番号3のアミノ酸配列またはその断片を特異的に認識する、先行する上記のいずれかに記載の単離されたTCR。
<6> 配列番号1、配列番号2および/または配列番号3のアミノ酸配列のHLA-A * 02結合型を特異的に認識する、先行する上記のいずれかに記載の単離されたTCR。
<7> 配列番号1、配列番号2および/または配列番号3のアミノ酸配列のHLA-A * 02:01結合型を特異的に認識する、先行する上記のいずれかに記載の単離されたTCR。
<8> 配列番号10と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有する可変TCRα領域、および配列番号11と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有する可変TCRβ領域を含む、先行する上記のいずれかに記載の単離されたTCR。
<9> 配列番号10のアミノ酸配列を有する可変TCRα領域、および配列番号11のアミノ酸配列を有する可変TCRβ領域を含む、先行する上記のいずれかに記載の単離されたTCR。
<10> 配列番号12と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するTCRα鎖、および配列番号13と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するTCRβ鎖を含む、先行する上記のいずれかに記載の単離されたTCR。
<11> 配列番号12のアミノ酸配列を有するTCRα鎖、および配列番号13のアミノ酸配列を有するTCRβ鎖を含む、先行する上記のいずれかに記載の単離されたTCR。
<12> 単離または精製された、先行する上記のいずれかに記載の単離されたTCR。
<13> そのアミノ酸配列が、1つまたは複数の表現型サイレント置換を含む、先行する上記のいずれかに記載の単離されたTCR。
<14> そのアミノ酸配列が、検出可能な標識、治療剤または薬物動態学的修飾部分を含むように修飾されている、先行する上記のいずれかに記載の単離されたTCR。
<15> 前記治療剤が、免疫エフェクター分子、細胞毒性剤および放射性核種からなる群から選択される、上記14に記載の単離されたTCR。
<16> 前記免疫エフェクター分子が、サイトカインである、上記15に記載の単離されたTCR。
<17> 可溶性または膜結合性である、先行する上記のいずれかに記載の単離されたTCR。
<18> 前記薬物動態学的修飾部分が、少なくとも1つのポリエチレングリコール繰り返し単位、少なくとも1つのグリコール基、少なくとも1つのシアリル基またはこれらの組合せである、上記14に記載の単離されたTCR。
<19> 前記TCRα鎖および前記TCRβ鎖がリンカー配列により連結された、単鎖型のものである、先行する上記のいずれかに記載の単離されたTCR。
<20> 前記TCRα鎖または前記TCRβ鎖が、エピトープタグを含むように修飾されている、上記1~19に記載の単離されたTCR。
<21> 配列番号6および9のアミノ酸配列のうちの少なくとも1つを含む、上記1~20のいずれかに記載のTCRの機能性部分を含む単離されたポリペプチド。
<22> 前記機能性部分が、TCRα可変鎖および/またはTCRβ可変鎖を含む、上記21に記載の単離されたポリペプチド。
<23> 上記1~20のいずれかに記載の少なくとも2つのTCRを含む多価TCR複合体。
<24> 前記TCRのうちの少なくとも1つが治療剤と会合している、上記23に記載の多価TCR複合体。
<25> 配列番号1~3からなる群から選択されるアミノ酸配列のHLA-A * 02結合型に結合することにより、IFN-γ分泌が誘導される、上記1~20に記載の単離されたTCR、上記21および22に記載のポリペプチド、上記23および24に記載の多価TCR複合体。
<26> 配列番号1~3からなる群から選択されるアミノ酸配列のHLA-A * 02結合型に結合することにより誘導される前記IFN-γ分泌が、3ng/mlよりも多く、例えば、4ng/mlよりも多く、5ng/mlよりも多く、より好ましくは6ng/mlよりも多く、最も好ましくは、さらに7ng/mlよりも多い、上記25に記載の単離されたTCR、ポリペプチド、多価TCR複合体。
<27> 前記IFN-γ分泌が、配列番号1~3からなる群から選択されるアミノ酸配列のHLA-A * 02結合型に結合する場合、無関係なペプチド(例えば、配列番号15または16)のHLA-A * 02結合型への結合と比較して、少なくとも4倍高くなる、上記25または26に記載の単離されたTCR、ポリペプチド、多価TCR複合体。
<28> IFN-γ分泌が、配列番号1~3からなる群から選択されるアミノ酸配列のうちの1つ、好ましくは配列番号3をコードするivtRNAをトランスフェクトしたT2細胞を、調査するTCRを発現するCD8 + 富化PBMCとともにインキュベートするin vitroアッセイにより測定される、上記25~27に記載の単離されたTCR、ポリペプチド、多価TCR複合体。
<29> 配列番号1~3からなる群から選択されるアミノ酸配列またはそのHLA-A * 02結合型に結合することにより誘導される、MIP-1αおよび/またはMIP-1β分泌が、所定の閾値未満である、上記25~28に記載の単離されたTCR、ポリペプチド、多価TCR複合体。
<30> 配列番号1~3からなる群から選択されるアミノ酸配列のHLA-A * 02結合型に結合することにより誘導される前記MIP-1α分泌が、1ng/ml未満、好ましくは0.8ng/ml未満、より好ましくは0.7ng/ml未満である、上記29に記載の単離されたTCR、ポリペプチド、多価TCR複合体。
<31> 配列番号1~3からなる群から選択されるアミノ酸配列のHLA-A * 02結合型に結合することにより誘導される前記MIP-1β分泌が、3ng/ml未満、好ましくは2.8ng/ml未満、より好ましくは2.5ng/ml未満である、上記29または30に記載の単離されたTCR、ポリペプチド、多価TCR複合体。
<32> 上記1~20のいずれかに記載のTCRをコードするか、または上記21~22に記載のポリペプチドをコードする核酸。
<33> 上記32に記載の核酸を含むベクター。
<34> 発現ベクターである、上記33に記載のベクター。
<35> レトロウイルスベクターである、上記33または34に記載のベクター。
<36> レンチウイルスベクターである、上記33または34に記載のベクター。
<37> 上記1~20に記載のTCRを発現する細胞。
<38> 単離されているか、または天然に存在しない、上記37に記載の細胞。
<39> 上記32に記載の核酸または上記33~36に記載のベクターを含む細胞。
<40> a)上記35に記載の少なくとも1つの核酸を含む発現ベクター
b)上記1~23のいずれかに記載のTCRのアルファ鎖をコードする核酸を含む第1の発現ベクター、および上記1~23のいずれかに記載のTCRのベータ鎖をコードする核酸を含む第2の発現ベクター
を含む、上記37~39に記載の細胞。
<41> 末梢血リンパ球(PBL)または末梢血単核細胞(PBMC)である、上記37~40のいずれかに記載の細胞。
<42> T細胞である、上記37~41のいずれかに記載の細胞。
<43> NY-ESO-1/LAGE-1に対する特異性を媒介する、上記1~20に記載のTCRの部分に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片。
<44> 前記NY-ESO-1/LAGE-1特異性を媒介する、前記TCRの前記部分が、配列番号6のアルファ鎖のCDR3および/または配列番号9のベータ鎖のCDR3を含む、上記43に記載の抗体。
<45> 上記1~20および25~31に記載の単離されたTCR、上記21~22および25~31に記載のポリペプチド、上記23~24および25~31のいずれかに記載の多価TCR複合体、上記32に記載の核酸、上記33~36に記載のベクター、上記37~42のいずれかに記載の細胞、または上記43~44に記載の抗体を含む医薬組成物。
<46> 少なくとも1つの薬学的に許容される担体を含む、上記45に記載の医薬組成物。
<47> 医薬としての使用のための、上記1~20および25~31に記載の単離されたTCR、上記21~22および25~31に記載のポリペプチド、上記23~24および25~31のいずれかに記載の多価TCR複合体、上記32に記載の核酸、上記33~36に記載のベクター、上記37~42のいずれかに記載の細胞、または上記43~44に記載の抗体。
<48> がんの処置における使用のための、上記1~20および25~31に記載の単離されたTCR、上記21~22および25~31に記載のポリペプチド、上記23~24および25~31のいずれかに記載の多価TCR複合体、上記32に記載の核酸、または上記37~42のいずれかに記載の細胞。
<49> 前記がんが、血液学的がん、または固形腫瘍である、上記48に記載のTCR、ポリペプチド、多価TCR複合体、核酸または細胞。
<50> 前記がんが、肉腫、前立腺がん、子宮がん、甲状腺がん、精巣がん、腎がん、膵がん、卵巣がん、食道がん、非小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、肝細胞癌、頭頸部がん、胃がん、子宮内膜がん、結腸直腸がん、胆管癌、乳がん、膀胱がん、骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病からなる群から選択される、上記48および49に記載のTCR、ポリペプチド、多価TCR複合体、核酸または細胞。
Claims (23)
- NY-ESO-1/LAGE-1に特異的な単離されたT細胞受容体(TCR)であって、
- 配列番号4のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号5のアミノ酸配列を有するCDR2、および配列番号6の配列を有するCDR3を含むTCRα鎖と、
- 配列番号7のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号8のアミノ酸配列を有するCDR2、および配列番号9の配列を有するCDR3を含むTCRβ鎖と
を含む、前記単離されたTCR。 - 配列番号1のアミノ酸配列またはその断片を特異的に認識する、請求項1に記載の単離されたTCR。
- 配列番号2のアミノ酸配列またはその断片を特異的に認識する、請求項1または2に記載の単離されたTCR。
- 配列番号3のアミノ酸配列またはその断片を特異的に認識する、請求項1から3のいずれか一項に記載の単離されたTCR。
- 配列番号1、配列番号2および/または配列番号3のアミノ酸配列のHLA-A*02結合型を特異的に認識する、請求項1から4のいずれか一項に記載の単離されたTCR。
- 配列番号1、配列番号2および/または配列番号3のアミノ酸配列のHLA-A*02:01結合型を特異的に認識する、請求項1から5のいずれかに記載の単離されたTCR。
- 配列番号10と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するTCRα鎖可変領域、および配列番号11と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するTCRβ鎖可変領域を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の単離されたTCR。
- 配列番号12と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するTCRα鎖、および配列番号13と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するTCRβ鎖を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の単離されたTCR。
- 配列番号12のアミノ酸配列を有するTCRα鎖、および配列番号13のアミノ酸配列を有するTCRβ鎖を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の単離されたTCR。
- そのアミノ酸配列が、検出可能な標識、治療剤または薬物動態学的修飾部分を含むように修飾されている、請求項1から9のいずれか一項に記載の単離されたTCR。
- 前記TCRα鎖および前記TCRβ鎖がリンカー配列により連結された、単鎖型のものである、請求項1から10のいずれか一項に記載の単離されたTCR。
- 請求項1から11のいずれか一項に記載のTCRの機能性部分を含む単離されたポリペプチドであって、前記機能性部分が、配列番号10と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するTCRα鎖可変領域、および配列番号11と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するTCRβ鎖可変領域からなる、前記ポリペプチド。
- 請求項1から11のいずれか一項に記載の少なくとも2つのTCRを含む多価TCR複合体。
- 請求項1から11のいずれか一項に記載の単離されたTCRをコードするか、または請求項12に記載の単離されたポリペプチドをコードする核酸。
- 請求項14に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項1から11のいずれか一項に記載の単離されたTCRを発現する細胞。
- 請求項14に記載の核酸または請求項15に記載のベクターを含む細胞。
- a)請求項14に記載の少なくとも1つの核酸を含む発現ベクター、又は
b)請求項1から11のいずれか一項に記載の単離されたTCRのアルファ鎖をコードする核酸を含む第1の発現ベクター、および請求項1から11のいずれか一項に記載の単離されたTCRのベータ鎖をコードする核酸を含む第2の発現ベクター
を含む、請求項17に記載の細胞。 - 請求項1から11のいずれか一項に記載の単離されたTCR、請求項12に記載のポリペプチド、請求項13に記載の多価TCR複合体、請求項14に記載の核酸、請求項15に記載のベクター、または請求項16から18のいずれか一項に記載の細胞を含む医薬組成物。
- 少なくとも1つの薬学的に許容される担体を含む、請求項19に記載の医薬組成物。
- がんの処置のための、請求項19または20に記載の医薬組成物。
- 前記がんが、血液学的がん、または固形腫瘍である、請求項21に記載の医薬組成物。
- 前記がんが、肉腫、前立腺がん、子宮がん、甲状腺がん、精巣がん、腎がん、膵がん、卵巣がん、食道がん、非小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、肝細胞癌、頭頸部がん、胃がん、子宮内膜がん、結腸直腸がん、胆管癌、乳がん、膀胱がん、骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病からなる群から選択される、請求項21に記載の医薬組成物。
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