JP6918062B2 - 細胞の分化状態を評価する方法 - Google Patents
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Description
たとえば、光学的測定値(蛍光強度、濁度、吸光度など)、光学的測定値が所定の基準値に達したときの反応サイクル数または反応時間、検量線を用いて算出されるmiRNAの定量値(コピー数、質量、濃度)などが挙げられる。所定の基準値は、miRNA存在量または濃度を示す値の種類によって適宜設定することができる。たとえば、定量RT-PCR法を用いる場合、所定のサイクル数を基準値として、核酸増幅反応が対数増幅を示すときの蛍光強度の変化量を設定できる。
多能性幹細胞を定量する場合、たとえば、液相画分中のmiR302/miR367クラスターのmiRNA測定値から検量線に基づいて多能性幹細胞の個数を算出することができる。
多能性幹細胞を半定量的に検出する場合、複数の閾値と比較することにより判定が行われ得る。たとえば、第1の閾値未満の場合は多能性幹細胞が存在しない「-」と判定し、第1の閾値以上第2の閾値未満の場合は多能性幹細胞が少量存在する「+」と判定し、第2の閾値以上の場合は「++」と判定することができる。
(1)測定サンプル調製
細胞培養基質iMatrix-511(nippi社製)で内部をコーティングした75cm2フラスコ(コーニング社製)に細胞培養液Essential 8(Gibco社製)を15mL添加した。ここにiPS細胞(105 cells/1.5mL)を添加し、1日接着培養した。培養後、上清を回収した。
同様にして大腸がん細胞株HCT116(105 cells /1.5mL)を1日接着培養した。培養液を1500gで10分間遠心し、上清を回収した。
回収した上清50μLと、ネガティブコントロール(細胞を含まず細胞培養に供していないEssential 8)50μLとを測定サンプルとした。
High Pure miRNA isolation kit(Roche Diagnostics社製)を用いて各々の測定サンプルからTotal RNAを回収した。Total RNA 1μLを用いて定量RT-PCRを行い、miR302a, miR302b, miR302cおよびmiR302dをそれぞれ測定した。定量RT-PCRは、TaqMan(商標)MicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqMan(商標)MicroRNA AssaysおよびTaqMan(商標)Universal Master Mix II、Applied Biosystems(商標)7500fast(Thermo Fisher Scientific社製)を用い、添付プロトコルに従って行った。
結果を図1に示す。図1のグラフの縦軸はCt値40を発現量1とした場合のmiR302の相対発現量である。図1から分かるように、ネガティブコントロールおよび大腸がん細胞の培養上清からはmiR302は検出されなかったが、iPS細胞の培養上清からはmiR302a, miR302b, miR302cおよびmiR302dの何れも検出することができた。
iPS細胞の培養上清は、実施例1と同様にして行った。
細胞培養基質fibronectin (Invitorogen社製)で内部をコーティングした75cm2フラスコ(コーニング社製)に細胞培養液 VascuLife VEGF Medium Complete Kit(Kurabo社製)を15mL添加した。ここにiPS細胞から分化させた血管内皮細胞であるiCell(商標) Endotherial Cells(Cellular Dynamics International社製)(105 cells /1.5mL)を添加し、1日接着培養した。培養後、培養液を1500gで10分間遠心し、上清を回収した。
血管内皮細胞株HUVEC(105 cells /1.5mL)を、同様にして培養し、培養液を遠心し、上清を回収した。
回収した上清50μLと、ネガティブコントロール(細胞を含まず、細胞培養に供していないVascuLife VEGF Medium)50μLとを測定サンプルとした。
実施例2(1)で調製された測定サンプルを用い、実施例1と同様にしてmiR302およびmi367のmiRNA測定を行った。
結果を図2〜6に示す。図2〜6はそれぞれmiR302a〜dおよびmiR367のmiRNA測定値を示すグラフである。グラフの縦軸はCt値45を発現量1とした場合のmiRNAの相対発現量である。図2〜6から分かるように、ネガティブコントロールではmiRNAは検出されなかった。血管内皮細胞HUVECは細胞株であり、多能性幹細胞は含まれない。HUVECの培養上清からはmiRNAは検出されなかった。iPS細胞の培養上清からはmiR302a, miR302b, miR302c、miR302dおよびmiR367の何れも検出され、高い測定値を示した。iPS細胞から分化誘導されたiCell Endotherial Cellsの培養上清からはiPS細胞の培養上清に比べて低い発現量が検出された。iCell Endotherial Cellsは、添付文書には純度98%(血管内皮細胞マーカーの発現率)であることが記載されている。以上の結果より、血管内皮細胞への分化誘導操作完了後に分化せずに残存したiPS細胞が検出し得ることが示唆された。
比較例1では、多能性幹細胞マーカーとして知られているmiR371, miR372およびmiR373の発現量を比較した。miR371, miR372およびmiR373の成熟miRNAのヌクレオチド配列は、配列番号6〜8に示される。
測定サンプルおよびネガティブコントロールは実施例2と同様にして調製された。
実施例3(1)で調製された測定サンプルを用い、実施例2と同様にしてmiR371、miR372およびmiR373のmiRNA測定を行った。
miR371の測定結果を図7に示す。図7はmiR371のmiRNA測定値を示すグラフである。グラフの縦軸はCt値45を発現量1とした場合のmiRNAの相対発現量である。図7から分かるように、iPS細胞から分化誘導されたiCell Endotherial Cellsの培養上清からはmiRNAは検出されず、iPS細胞の培養上清からは僅かにmiRNAが検出された。また、いずれの培養上清からもmiR372およびmiR373は検出されなかった。
Claims (12)
- 細胞の分化状態を評価する方法であって、
細胞と液体培地とを含む細胞培養液の培養上清におけるmiR302/367クラスターのmiRNAを測定することを含み、前記miRNAの測定値と所定の閾値とを比較し、前記測定値が前記閾値以上の場合は前記細胞培養液が未分化細胞を含むことの指標となり、前記細胞がiPS細胞、ES細胞、ntES細胞またはEG細胞である、前記方法。 - 前記測定値と所定の閾値とを比較し、前記測定値が前記閾値未満の場合は前記細胞培養液が未分化細胞を含まないことの指標となる、請求項1に記載の方法。
- 細胞の分化状態をモニタリングする方法であって、
第1の時刻において細胞と液体培地とを含む細胞培養液の培養上清におけるmiR302/367クラスターのmiRNAを測定し、第2の時刻において前記細胞と液体培地とを含む細胞培養液の培養上清におけるmiR302/367クラスターのmiRNAを測定することにより前記細胞の分化状態をモニタリングすることを含み、
前記第2の時刻におけるmiRNAの測定値が前記第1の時刻におけるmiRNAの測定値未満の場合は、前記第2の時刻における前記細胞の分化が進行したことの指標となり、
前記細胞がiPS細胞、ES細胞、ntES細胞またはEG細胞である、前記方法。 - 前記第2の時刻におけるmiRNAの測定値が前記第1の時刻におけるmiRNAの測定値と実質的に同等である場合は前記第1の時刻における分化状態と前記第2の時刻における分化状態とが同等であることの指標となる、請求項3に記載の方法。
- 前記測定値が、miR302a測定値、miR302b測定値、miR302c測定値、miR302d測定値、miR367測定値またはこれらのうち少なくとも2の合計値である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記miRNAが、配列番号1〜5に記載されたRNAのいずれかまたはこれらのうち少なくとも2である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記測定が、定量RT-PCR法により行われる、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が、生体から採取された分化細胞をリプログラムして調製された多能性幹細胞である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が前記液体培地中で接着培養されている、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記培養上清からエクソソームを取得することを含まない、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- miRNAの測定値の、細胞の分化状態を評価するための指標としての使用であって、前記miRNAが、前記細胞と液体培地とを含む細胞培養液の培養上清におけるmiR302/367クラスターのmiRNAであり、前記miRNAの測定値と所定の閾値とを比較し、前記測定値が前記閾値以上の場合は前記細胞培養液が未分化細胞を含むことの指標となり、前記細胞がiPS細胞、ES細胞、ntES細胞またはEG細胞である、前記使用。
- 請求項1〜10のいずれかに記載の方法または請求項11に記載の使用に用いられる試薬キットであって、
前記miRNAを検出するオリゴヌクレオチドプローブおよび/またはオリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記試薬キット。
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