JP6902052B2

JP6902052B2 - 複数のリガーゼ組成物、システム、および方法

Info

Publication number: JP6902052B2
Application number: JP2018560726A
Authority: JP
Inventors: ユー・ジェン; マンチン・ホン
Original assignee: Rgene Inc
Current assignee: Rgene Inc
Priority date: 2016-02-08
Filing date: 2017-02-07
Publication date: 2021-07-14
Anticipated expiration: 2037-02-07
Also published as: EP3414324A1; US10626390B2; CA3013916A1; US11124789B2; CN108779442A; AU2017218431A1; AU2017218431B2; CN108779442B; EP3414324B1; EP3848457A1; JP2019504645A; EP3414324A4; US20200248166A1; AU2022231746A1; WO2017139260A1; US20170226498A1

Description

本願は、２０１６年２月８日に出願された米国仮出願番号第６２／２９２，５５８号の優先権を主張し、出典明示によりその全体において本願明細書に包含させる。

分野
本願明細書は、複数のリガーゼを使用する組成物、システム、および方法であって、リガーゼの少なくとも１つはアデニル化欠損ＡＴＰ依存性リガーゼまたは非アデニル化ＡＴＰ依存性リガーゼ（例えば、ＡＴＰ非含有混合物中に存在する）である、組成物、システム、および方法を提供する。１つの態様において、複数のリガーゼは、プレアデニル化二本鎖配列を非アデニル化二本鎖配列にライゲートする（例えば、アデニル化欠損ＡＴＰ依存性リガーゼまたは非アデニル化ＡＴＰ依存性リガーゼは第１の鎖にライゲートし、異なるリガーゼは第２の鎖にライゲートする）ために使用される。他の態様において、本願明細書において変異体Ｔ４リガーゼ（例えば、Ｋ１５９Ｓ変異体またはＫ１５９Ｃ変異体）が提供される。

背景
ＤＮＡリガーゼは、ＡＴＰまたはＮＡＤ＋を利用し、３’−ヒドロキシルおよび５’−ホスフェートを有する隣接ポリヌクレオチド末端間でホスホジエステル結合形成を触媒する二価金属イオン依存性酵素である（Tomkinson AE, PNAS, 2006）。ＤＮＡリガーゼは、ＤＮＡ複製および修復のための重要な酵素であり、真核生物、細菌、古細菌および多数のウイルスにおいて普遍的に見いだされる。種の起源に依存して、天然に存在するＤＮＡリガーゼは、多数のユニークな特性、例えば、基質特異性、配列およびドメイン構成、最適な反応条件、例えばｐＨ、温度および耐塩性を有し得る。

全ての公知のＤＮＡリガーゼは、３つのヌクレオチジル転移反応に関与する共通の経路を介して触媒作用を行う（Lehman IR. et al, Science, 1974;およびLindahl T et al, Annu Rev Biochem, 1992参照；これら両方が出典明示によりそれら全体において、特にライゲーションに関するステップについて本願明細書に包含させる）。ＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼの場合、第１のステップ（ステップ１）は、リガーゼによるＡＴＰのα−ホスフェートに対する攻撃に関与し、ピロリン酸（pyrophosphate）の放出およびリガーゼ−ＡＭＰ中間体の形成をもたらす。ＡＭＰは、保存された配列モチーフ内でリジン残基のアミノ基に共有結合している。第２のステップ（ステップ２）において、ＡＭＰヌクレオチドは、５’−ホスフェート−末端ＤＮＡ鎖に移され、５’−Ａｐｐ−ＤＮＡ中間体を形成する。第３および最終ステップ（ステップ３）において、５’−Ａｐｐ−ＤＮＡ上の３’−ＯＨ鎖による攻撃は、２つのポリヌクレオチドを結合し、ＡＭＰを遊離させる。

Ｔ４ＤＮＡリガーゼは、単離された最初のＤＮＡリガーゼの１つであり（Weiss B, et al, PNAS, 1967）、該酵素はその後、クローニング、配列決定、および遺伝子合成などを含む分子生物学適用ならびに分子診断におけるツールとして広く使用されている。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは、相補的塩基対合にてニッキングされた二本鎖ＤＮＡおよび二本鎖切断の両方を容易に受け入れる。さらに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または他の小分子のようなライゲーションエンハンサーの非存在下でさえ、平滑末端または一塩基オーバーハングを有するＤＮＡフラグメントを結合する能力においてユニークである（Sogaramella V et al, JMB, 1972;米国特許第８，６９７，４０８号参照）。この理由のため、Ｔ４ＤＮＡリガーゼは、ハイスループット配列決定または次世代配列決定（ＮＧＳ配列決定）のためのライブラリー調製ワークフローのような多くのインビトロ適用において日常的に使用される。

二本鎖オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖ＤＮＡフラグメントのライブラリーにライゲートすることは、多くの分子生物学適用において一般的である。例えば、アダプターライゲーションは、ＮＧＳ配列決定のライブラリー調製ワークフローにおいて重要なステップである。未知の配列を有するＤＮＡフラグメントのライブラリーへの設計された既知の配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチドの結合は、ＰＣＲ増幅またはプライマー伸長のような下流操作を容易にする。効率的かつ完全なライゲーションステップは、ライブラリー調製の成功を保証し、ライブラリーのＰＣＲ増幅のために必要なサイクル数を減少させることができ、出発物質の必要な量を減少させ、得られる配列データの偏りを最小限にするために役立つ。これらの理由のため、多くの適用のためにライゲーション反応の効率および完全性の改善が必要である。

概要
本願明細書は、複数の異なるリガーゼを使用する組成物、システム、キット、および方法であって、リガーゼの少なくとも１つはアデニル化欠損ＡＴＰ依存性リガーゼまたは非アデニル化ＡＴＰ依存性リガーゼ（例えば、ＡＴＰ非含有混合物中に存在する）である、組成物、システム、キット、および方法を提供する。１つの態様において、複数のリガーゼは、プレアデニル化二本鎖配列を非アデニル化二本鎖配列にライゲートする（例えば、アデニル化欠損ＡＴＰ依存性リガーゼまたは非アデニル化ＡＴＰ依存性リガーゼは第１の鎖にライゲートし、異なるリガーゼは第２の鎖にライゲートする）ために使用される。他の態様において、本願明細書において変異体Ｔ４リガーゼ（例えば、Ｋ１５９Ｓ変異体またはＫ１５９Ｃ変異体）が提供される。

いくつかの態様において、本願明細書は、ａ）アデニル化欠損ＡＴＰ依存性リガーゼを含む第１のリガーゼ（すなわち、ＡＴＰと反応することによってＡＭＰ−リガーゼ中間体を形成することができないリガーゼ）；およびｂ）第２のリガーゼ、ここで、該第２のリガーゼはｉ）ＡＴＰ依存性リガーゼ、またはｉｉ）ＮＡＤ依存性リガーゼである、を含む、組成物（例えば、インビトロ組成物）を提供する。１つの態様において、第１および／または第２のリガーゼは、組換え的に生産される。１つの態様において、第１および第２のリガーゼは、１つの単一のポリペプチドに融合され、組換え的に生産されることができる。１つの態様において、該組成物は、該第１および第２のリガーゼ以外の生物学的分子を含まないか、または実質的に含まない（例えば、組成物は、ライゲートされる標的核酸配列は例外かもしれないが、他の生物学的分子なしで、本質的に第１および第２のリガーゼのみからなる）。

１つの態様において、本願明細書は、融合タンパク質を含む組成物であって、融合タンパク質は、ａ）アデニル化欠損ＡＴＰ依存性リガーゼを含む第１のリガーゼ（すなわち、ＡＴＰと反応することによってＡＭＰ−リガーゼ中間体を形成することができないリガーゼ）；およびｂ）第２のリガーゼ、ここで、該第２のリガーゼは：ｉ）ＡＴＰ依存性リガーゼ、またはｉｉ）ＮＡＤ依存性リガーゼである、を含む、組成物を提供する。

いくつかの態様において、本願明細書は、ａ）非アデニル化ＡＴＰ依存性リガーゼ；およびｂ）ＮＡＤ依存性リガーゼを含む、組成物であって、該組成物は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を含まないか、または検出可能に含まない、組成物を提供する。１つの態様において、非アデニル化ＡＴＰ依存性リガーゼおよび／またはＮＡＤ依存性リガーゼは組換え的に生産される。

いくつかの態様において、本願明細書は、ａ）第１のリガーゼを含む第１の組成物を含む第１の容器、ここで、該第１のリガーゼはｉ）アデニル化欠損ＡＴＰ依存性リガーゼ、またはｉｉ）非アデニル化ＡＴＰ依存性リガーゼであり、該非アデニル化ＡＴＰ依存性リガーゼが該第１の組成物中に存在するとき、該第１の組成物はアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を含まないか、または検出可能に含まない；およびｂ）第２のリガーゼを含む第２の組成物を含む第２の容器、ここで、該第２のリガーゼはｉ）ＡＴＰ依存性リガーゼ、またはｉｉ）ＮＡＤ依存性リガーゼである、を含む、システムおよび／またはキットを提供する。１つの態様において、第１および／または第２のリガーゼは組換え的に生産される。

いくつかの態様において、本願明細書は、核酸配列をライゲートする方法であって、ａ）以下の構成要素を反応混合物に混合すること：ｉ）第１のリガーゼ、ここで、該第１のリガーゼは、Ａ）アデニル化欠損ＡＴＰ依存性リガーゼ、またはＢ）非アデニル化ＡＴＰ依存性リガーゼであり、該非アデニル化ＡＴＰ依存性リガーゼが該反応混合物中に存在するとき、該反応混合物はアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を含まないか、または検出可能に含まない、ｉｉ）アデニル化二本鎖核酸配列（ＡＤＳＮＡＳ）（例えば、平滑末端を有するか、または付着末端または単一塩基オーバーハングのような、オーバーハングを有する）、およびｉｉｉ）非アデニル化二本鎖核酸配列（非ＡＤＳＮＡＳ）（例えば、平滑末端を有するか、または付着末端または単一塩基オーバーハングのような、オーバーハングを有する）、ここで、該非ＡＤＳＮＡＳは第２の鎖にハイブリダイズされた第１の鎖を含む（または、該非ＡＤＳＮＡＳは互いにハイブリダイズ可能な第１および第２の別々の一本鎖として提供される）、ここで、該構成要素を混合することは、該第１のリガーゼが該非ＡＤＳＮＡＳの該第１の鎖を該ＡＤＳＮＡＳに（すなわち該ＡＤＳＮＡの第１のアデニル化鎖に）ライゲートするような条件下である、およびｂ）該第２のリガーゼが該非ＡＤＳＮＡＳの該第２の鎖を該ＡＤＳＮＡＳに（すなわち、該ＡＤＳＮＡの第２の鎖に）ライゲートするような条件下で、第２のリガーゼを該反応混合物に加えること、ここで、該第２のリガーゼはｉ）ＡＴＰ依存性リガーゼ、またはｉｉ）ＮＡＤ依存性リガーゼである、を含む、方法を提供する。特定の態様において、方法は、ＡＤＳＮＡＳを非ＡＤＳＮＡＳにライゲートすることによって形成される核酸分子を配列決定反応に付し、（例えば、ライブラリーフラグメントにライゲートされるアダプターを使用する配列決定方法論を使用して）核酸配列分子の少なくとも一部を決定することをさらに含む。

いくつかの態様において、本願明細書は、以下の構成要素を反応混合物に混合することを含む核酸配列をライゲートする方法であって、ａ）第１のリガーゼ、ここで、該第１のリガーゼは、ｉ）アデニル化欠損ＡＴＰ依存性リガーゼ、またはｉｉ）非アデニル化ＡＴＰ依存性リガーゼであり、該非アデニル化ＡＴＰ依存性リガーゼが該反応混合物中に存在するとき、該反応混合物がアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を含まないか、または検出可能に含まない、ｂ）第２のリガーゼ、ここで、該第２のリガーゼはＮＡＤ依存性リガーゼである、ｃ）アデニル化二本鎖核酸配列（ＡＤＳＮＡＳ）、ｄ）非アデニル化二本鎖核酸配列（非ＡＤＳＮＡＳ）、およびここで、該構成要素を混合することは、該第１のリガーゼが該非ＡＤＳＮＡＳの該第１の鎖を該ＡＤＳＮＡＳにライゲートし、該第２のリガーゼが該非ＡＤＳＮＡＳの該第２の鎖を該ＡＤＳＮＡＳにライゲートするような条件下である、方法を提供する。特定の態様において、方法は、ＡＤＳＮＡＳを非ＡＤＳＮＡＳにライゲートすることによって形成される核酸分子を配列決定反応に付し、核酸配列分子の少なくとも一部を決定することをさらに含む。

１つの態様において、非アデニル化ＡＴＰ依存性リガーゼは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ＤＮＡリガーゼ、およびＰＢＣＶ−１ＤＮＡリガーゼ、またはそれらの見かけ上近いホモログからなる群から選択される。他の態様において、ＮＡＤ依存性リガーゼは、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、ＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓＤＮＡリガーゼ、およびＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡリガーゼ、またはそれらの見かけ上近いホモログからなる群から選択される。

１つの態様において、組成物は、（例えば、図２および３に示されるとおり、および一緒にハイブリダイズされる２つの別々の配列またはそれ自体にハイブリダイズされる一本鎖ヘアピンであり得る）アデニル化二本鎖核酸配列（ＡＤＳＮＡＳ）をさらに含む。特定の態様において、ＡＤＳＮＡＳは５から２０００塩基対の長さ（例えば、５…１５…３５…３００…５００…１０００…または２０００塩基対の長さ）である。いくつかの態様において、ＡＤＳＮＡＳは検出可能な標識または内部標識を含む。他の態様において、組成物は非アデニル化二本鎖核酸配列（非ＡＤＳＮＡＳ）をさらに含む。１つの態様において、非ＡＤＳＮＡＳは第２の鎖にハイブリダイズされた第１の鎖を含み、第１の鎖は第１のリガーゼによってＡＤＳＮＡＳにライゲートされることができ、第２の鎖は第２のリガーゼによってＡＤＳＮＡＳにライゲートされることができる。特定の態様において、非ＡＤＳＮＡＳは５から２０００塩基対の長さ（例えば、５…１５…３５…３００…５００…２０００…または４０００塩基対の長さ）である。特定の態様において、非ＡＤＳＮＡＳはタンパク質またはタンパク質の一部をコードする。いくつかの態様において、ＡＤＳＮＡＳは二本鎖配列決定アダプター（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａＴＲＵＳＥＱアダプター、ＩｌｌｕｍｉｎａＮＥＸＴＥＲＡアダプター、ＳＯＬＥＸＡ配列決定アダプター、ＲＯＣＨＥ４５４配列決定アダプター、ＳＯＬＩＤ配列決定アダプター、およびＩＯＮＴＯＲＲＥＮＴのためのＩＯＮＸＰＲＥＳＳバーコード(barcode)アダプター）を含む。特定の態様において、非ＡＤＳＮＡＳは配列決定ライブラリーフラグメントまたは興味ある他の核酸配列を含む。

特定の態様において、第１のリガーゼ（アデニル化欠損リガーゼ）は野生型リガーゼの変異体を含む。特定の態様において、第１のリガーゼはＫｘ（Ｄ／Ｎ）Ｇモチーフ（ｘは任意のアミノ酸である）を有する野生型リガーゼの変異体を含み、モチーフのリジンが、変異体がアデニル化欠損を引き起こすが、依然としてステップ３ライゲーションが可能である異なるアミノ酸で置換されている以外、変異体はＫｘ（Ｄ／Ｎ）Ｇモチーフを含む。特定の態様において、変異体は、Ｇｘ（Ｄ／Ｎ）Ｇ（配列番号：５）、Ｐｘ（Ｄ／Ｎ）Ｇ（配列番号：６）、Ａｘ（Ｄ／Ｎ）Ｇ（配列番号：７）、Ｖｘ（Ｄ／Ｎ）Ｇ（配列番号：８）、Ｌｘ（Ｄ／Ｎ）Ｇ（配列番号：９）、Ｉｘ（Ｄ／Ｎ）Ｇ（配列番号：１０）、Ｍｘ（Ｄ／Ｎ）Ｇ（配列番号：１１）、Ｃｘ（Ｄ／Ｎ）Ｇ（配列番号：１２）、Ｆｘ（Ｄ／Ｎ）Ｇ（配列番号：１３）、Ｙｘ（Ｄ／Ｎ）Ｇ（配列番号：１４）、Ｗｘ（Ｄ／Ｎ）Ｇ（配列番号：１５）、Ｈｘ（Ｄ／Ｎ）Ｇ（配列番号：１６）、Ｒｘ（Ｄ／Ｎ）Ｇ（配列番号：１７）、Ｑｘ（Ｄ／Ｎ）Ｇ（配列番号：１８）、Ｎｘ（Ｄ／Ｎ）Ｇ（配列番号：１９）、Ｅｘ（Ｄ／Ｎ）Ｇ（配列番号：２０）、Ｄｘ（Ｄ／Ｎ）Ｇ（配列番号：２１）、Ｓｘ（Ｄ／Ｎ）Ｇ（配列番号：２２）、Ｔｘ（Ｄ／Ｎ）Ｇ（配列番号：２３）およびｘ（Ｄ／Ｎ）Ｇ（配列番号：２４、リジンの点欠失）からなる群から選択されるリジン置換モチーフを含み、ｘは任意のアミノ酸であり、Ｎはアスパラギンである。

１つの態様において、変異体は（例えば、位置１５９でのリジンからのアミノ酸変化を有する）変異体Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む。特定の態様において、変異体Ｔ４ＤＮＡリガーゼは、Ｋ１５９Ｓ変異体、Ｋ１５９Ｃ変異体、およびＫ１５９Ａ変異体（例えば、配列番号：１−３に示されるとおり）、または、これらの配列と９７−９９％同一性を有するか、または正常ステップ３リガーゼ活性を実質的に変更しないこれらの配列のＮまたはＣ末端切断を有する、これらの配列の変異体からなる群から選択される。特定の態様において、Ｔ４ＤＮＡリガーゼは、リガーゼステップ３活性を実質的に変更しない（位置１５９でない）１つのアミノ酸変化を有する配列番号：１−３によってコードされる。１つの態様において、第１のリガーゼは、ＣｈｌｏｒｅｌｌａウイルスＰＢＣＶ−１ＤＮＡリガーゼからのＫ２７Ａ変異体である（Sriskana et al., Nucleic Acids Research, 1998, 26(2), 525-531参照、これを出典明示によりその全体において、特にＫ２７Ａ変異体について本願明細書に包含させる）。

いくつかの態様において、第２のリガーゼはＡＴＰ依存性リガーゼであり、ＡＴＰ依存性リガーゼはＴ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ＤＮＡリガーゼ、およびＰＢＣＶ−１ＤＮＡリガーゼからなる群から選択される。さらなる態様において、第２のリガーゼはＮＡＤ依存性リガーゼであり、ＮＡＤ依存性リガーゼは、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、ＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓＤＮＡリガーゼ、およびＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡリガーゼからなる群から選択される。

１つの態様において、本願明細書は、ａ）Ｔ４ＤＮＡリガーゼＫ１５９Ｓ変異体および／またはＴ４ＤＮＡリガーゼＫ１５９Ｃ変異体を含む第１の組成物を含む第１の容器；およびｂ）アデニル化二本鎖核酸配列（ＡＤＳＮＡＳ）を含む第２の組成物を含む第２の容器を含むシステムおよびキットを提供する。１つの態様において、第１および第２の容器の両方が、パッケージ（例えば、ボックスまたは他の輸送容器）中に存在する。特定の態様において、本願明細書は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼＫ１５９Ｓ変異体および／またはＴ４ＤＮＡリガーゼＫ１５９Ｃ変異体を含む組成物を提供する。

１つの態様において、Ｋ１５９Ｓ変異体は、配列番号：１のアミノ酸配列、または、この配列と９７−９９％同一性を有するか、または、正常リガーゼステップ３活性を実質的に変更しないこの配列のＮまたはＣ末端切断を有するこの配列の変異体によってコードされる。いくつかの態様において、Ｔ４ＤＮＡリガーゼは、リガーゼステップ３活性を実質的に変更しない（位置１５９でない）１つのアミノ酸変化を有する配列番号：１によってコードされる。他の態様において、Ｋ１５９Ｓ変異体は、配列番号：２のアミノ酸配列、または、この配列と９７−９９％同一性を有するか、または、正常リガーゼステップ３活性を実質的に変更しないこの配列のＮまたはＣ末端切断を有するこの配列の変異体によってコードされる。特定の態様において、Ｔ４ＤＮＡリガーゼは、リガーゼステップ３活性を実質的に変更しない（位置１５９でない）１つのアミノ酸変化を有する配列番号：２によってコードされる。

図１は、Ａ−テールライブラリーＤＮＡフラグメントおよびＴ−テールアダプター間の慣用のライゲーションにおける特定の反応ステップを描写する典型的なワークフローを示す。

図２は、（例えば、アデニル化欠損ＡＴＰ依存性リガーゼ、または非アデニル化ＡＴＰ依存性リガーゼを使用する）第１の鎖ライゲーションのためのステップ３、および、Ａ−テールＤＮＡフラグメントおよびアデニル化Ｔ−テールアダプターに関する第２の鎖ライゲーションのための別のリガーゼを使用するのみの典型的な非限定的な態様である。

図３は、（例えば、アデニル化欠損ＡＴＰ依存性リガーゼ、または非アデニル化ＡＴＰ依存性リガーゼを使用する）第１の鎖ライゲーションのためのステップ３、および、平滑末端ＤＮＡフラグメントおよびアデニル化平滑末端アダプターに関する第２の鎖ライゲーションのための別のリガーゼを使用するのみの典型的な非限定的な態様である。

図４は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼＫ１５９Ｘ変異体の活性がライゲーションのステップ３反応において試験された実施例１からの結果を示す。反応は、２５℃で７０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、５ｍＭＤＴＴｐＨ７．６を有するバッファー中で行われた。各１０ｕｌ反応物は０．２ｕｌ平滑末端ＰＣＲフラグメントおよび０．２ｕｌアデニル化平滑末端アダプターを含んだ。反応物は室温で１時間インキュベートされ、次に５０℃で１時間プロテイナーゼＫ消化に付された。次に、反応物は１０％ＴＢＥゲル上で動かされ、ＳＹＢＲＧｏｌｄで染色され、視覚化のためにＧＥＩｍａｇｅＱｕａｎｔ上でスキャンされた。ゲル中のレーンは、次のとおりである：Ｃ）野生型Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢｃａｔ＃：Ｍ０２０２Ｌ）でのポジティブコントロール反応；１）Ｋ１５９Ｙ；２）Ｋ１５９Ｗ；３）Ｋ１５９Ｐ；４）Ｋ１５９Ｒ；５）Ｋ１５９Ｄ；６）Ｋ１５９Ｎ；７）Ｋ１５９Ｔ；８）Ｋ１５９Ｑ；９）Ｋ１５９Ａ；１０）Ｋ１５９Ｅ；１１）Ｋ１５９Ｈ；１２）Ｋ１５９Ｖ；１３）Ｋ１５９Ｆ；１４）Ｋ１５９Ｉ；１５）Ｋ１５９Ｃ；１６）Ｋ１５９Ｓ；１７）Ｋ１５９Ｇ；および１８）Ｋ１５９Ｍ。

図５は、平滑末端ライゲーションが種々のリガーゼ混合物を使用して試験された実施例１からの結果を示す。ゲル中のレーンは、次のとおりである：レーン１、ＰＣＲフラグメントおよびアダプターのみ；レーン２、Ｋ１５９Ｓを有する；レーン３、Ｋ１５９Ｓおよび大腸菌リガーゼを有する；レーン４、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用するＰＣＲフラグメントおよびリン酸化平滑アダプターのライゲーション。

図６は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼＫ１５９Ｓ変異体（配列番号：１）に関するアミノ酸配列を示す。

図７は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼＫ１５９Ｃ変異体（配列番号：２）に関するアミノ酸配列を示す。

図８は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼＫ１５９Ａ変異体（配列番号：３）に関するアミノ酸配列を示す。

定義
本願明細書において使用される「アデニル化欠損ＡＴＰ依存性リガーゼ」なる用語は、ＡＴＰ依存性リガーゼによって通常行われるとおりＡＴＰと反応することによってＡＭＰ−リガーゼ中間体を形成することができないＡＴＰ依存性リガーゼを示す。かかるＤＮＡリガーゼの例は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼＫ１５９Ｓ、Ｋ１５９Ｃ、およびＫ１５９Ａ変異体、ならびにＣｈｌｏｒｅｌｌａウイルスＰＢＣＶ−１ＤＮＡリガーゼからのＫ２７Ａ変異体を含むが、これらに限定されない。例はまた、リガーゼの他の保存されたモチーフにおける突然変異誘発、例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２におけるＲ５５Ｋ、Ｋ２２７ＱおよびＫ２２５Ｒを含む（Yin et al., J Biol Chem 2003, 278:17601-17608、出典明示によりその全体において、特にかかる変異体について本願明細書に包含させる）。アデニル化欠損ＡＴＰ依存性リガーゼの他の例は、リガーゼのＫｘＤＧ（モチーフＩ）内のリジンが、リガーゼがアデニル化欠損であるが、ステップ３リガーゼが有能であるように他の１９アミノ酸の１つに変異されるＡＴＰ依存性リガーゼを含む。かかる変異体は、産生され、例えば以下の実施例の部において、示される方法を使用して、アデニル化欠損およびステップ３リガーゼ有能についてスクリーニングすることができる。

本願明細書において使用される、「非アデニル化ＡＴＰ依存性リガーゼ」なる用語は、ＡＴＰでの反応によって標準のＡＭＰ−リガーゼ中間体を形成することができるが、（例えば、ＡＴＰ非含有混合物中に存在するとき）かかるＡＭＰ−リガーゼ中間体を形成していないＡＴＰ依存性リガーゼを示す。

詳細な説明
本願明細書は、複数のリガーゼを使用する組成物、システム、および方法であって、リガーゼの少なくとも１つはアデニル化欠損ＡＴＰ依存性リガーゼまたは非アデニル化ＡＴＰ依存性リガーゼ（例えば、ＡＴＰ非含有混合物中に存在する）である、組成物、システム、および方法を提供する。１つの態様において、複数のリガーゼは、プレアデニル化二本鎖配列を非アデニル化二本鎖配列にライゲートする（例えば、アデニル化欠損ＡＴＰ依存性リガーゼまたは非アデニル化ＡＴＰ依存性リガーゼは第１の鎖にライゲートし、異なるリガーゼは第２の鎖にライゲートする）ために使用される。他の態様において、本願明細書において変異体Ｔ４リガーゼ（例えば、Ｋ１５９Ｓ変異体またはＫ１５９Ｃ変異体）が提供される。

ＩＬＬＵＭＩＮＡプラットフォーム（または他の次世代配列決定プラットフォーム）のためのような典型的なライブラリー調製ワークフローにおいて、大型ＤＮＡは最初に小さな断片に断片化される。断片化されたＤＮＡの不均一末端は、酵素の混合物によって平滑末端に修復され、次に、例えばＴａｑポリメラーゼの非鋳型依存性重合活性を利用することによって、３’−末端で余分なＡ−塩基の伸長が行われる（Clarks JM, NAR, 1988、出典明示により本願明細書に包含させる）。次に、Ａ−テールＤＮＡフラグメントは、相補的３’−Ｔオーバーハングを有する二本鎖オリゴヌクレオチドアダプターとライゲートされる。ライゲーション反応は、通常、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ単独によって触媒され、Ｔ／Ａ接合点で両方の鎖を結合する。相補的単一塩基Ｔ−およびＡ−末端間のライゲーションが一般的に非効率的であるため、ライゲーション反応は、通常、過剰量のリガーゼ酵素、ならびにライゲーションエンハンサー、例えばＰＥＧ８０００または他の分子で補われる（米国特許第８，６９７，４０８号参照、出典明示により本願明細書に包含させる）。Ａ−テールライブラリーＤＮＡフラグメントおよびＴ−テールアダプター間のライゲーションは、ライゲーションがライブラリーＤＮＡフラグメントおよびアダプター間の指向性であることを保証し、ライブラリーＤＮＡフラグメントそれら自体またはアダプターそれら自体内で最小限の望ましくないライゲーション産物が存在する。

平滑末端ライブラリーＤＮＡフラグメントおよびアダプター間のライゲーションもまた、ハイスループット配列決定のためのライブラリー調製ワークフローにおいて使用される。例えば、ＰＡＣＢＩＯ（Pacific Biosciences, CA）プラットフォームのためのライブラリー調製ワークフローにおいて、大型ＤＮＡは最初に制御されたサイズに断片化される。断片化されたＤＮＡの末端は、平滑末端に修復され、５’−リン酸化平滑末端アダプターでライゲートされる（Pacific Biosciences manual PN 001-143-835-08）。再び、このライゲーションは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのみによって触媒され、平滑末端接合点で両方の鎖を結合する。望ましくないライゲーション産物、例えばアダプターダイマーが、形成することができるが、サイズ選択によって、例えばＡＭＰｕｒｅビーズを使用することによって（Beckman Coulter）、効率的に除去することができる。他の望ましくないライゲーション産物、例えばライブラリーフラグメント間のコンカテマーもまた形成し得る。しかしながら、過剰量のアダプターをライブラリーフラグメントに与えると、かかる産物の画分が少量であると考えられる。

ＤＮＡライブラリーフラグメントおよびアダプター間の典型的なライゲーション反応は、一般的に、ライゲーションの複数のラウンド（すなわち、複数のターンオーバー条件）を実施するために各リガーゼ分子を必要とする。ライゲーション接合点での各鎖切断を閉ざすために、リガーゼは全３つのヌクレオチジル転移ステップを通過することを必要とする（図１参照）。しかしながら、第１のライゲーション事象は２つの別々の二本鎖ＤＮＡ分子の結合に関与するが、第２のライゲーション事象はすでに連結されているが、ニックされた二本鎖基質上で起こるため（図１）、第１の鎖のライゲーションは第２の鎖のライゲーションよりもはるかに困難である。第１のライゲーション事象が一般的に、平滑末端および単一塩基オーバーハングを結合時により良いＴ４ＤＮＡリガーゼのようなリガーゼの作用を必要とするが、第２のライゲーションは、他のＡＴＰ依存性またはＮＡＤ依存性ＤＮＡリガーゼ、例えばＴ７ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ＤＮＡリガーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、ＰＢＣＶ−１リガーゼなどによって触媒されることができることが予期され得る。Ｔ４ＤＮＡリガーゼそれ自体がまた二本鎖ニックライゲーションを触媒することにおいて効率的であるため、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのみがリガーゼの混合物を使用することよりもむしろ両方の鎖の密閉を触媒するために使用される。

ライゲーションプロセスでの反応動力学観点から、単一のターンオーバー条件下（酵素＞＞基質）での反応速度が、基質として二本鎖ニックＤＮＡを使用するＤＮＡリガーゼのための複数のターンオーバー条件下（酵素＜＜基質）でよりもはるかに速いことが観察されている。動力学試験は、相違を説明するために可能な律速段階として、ステップ３後に起こる酵素からの産物放出（Lohman GJ, J. Biol. Chem, 2011、出典明示により本願明細書に包含させる）、またはステップ１において起こる酵素アデニル化（Wang Y et al, Biochemistry, 2007、出典明示により本願明細書に包含させる）のいずれかを示唆している。アデニル化リガーゼからＤＮＡの５’−リン酸化末端へのヌクレオチジル転移ステップであるステップ２、および３’−ＯＨ攻撃による鎖を閉じるステップであるステップ３が、単一のターンオーバーおよび複数のターンオーバー条件下で同様の動力学で比較的効率的に起こることが観察されている。したがって、本願発明は特定のメカニズムに限定されず、メカニズムの理解が本願発明を実施するために必要ではないが、ライゲーション効率を改善するために、律速段階をバイパスし、速い動力学ステップで直接的に進行することが有利であることが考えられる。これは、例えば、（例えば、アデニル化欠損ＡＴＰ依存性リガーゼおよび／または非アデニル化ＡＴＰ依存性リガーゼを使用する）第１のリガーゼがプレアデニル化第１の鎖にライゲートし、第２のリガーゼ（例えば、任意の有用なリガーゼ）が第２の鎖にライゲートする酵素の組合せを使用することによって、成し遂げられ得る。

加えて、リガーゼがステップ２後に基質から離れ、ＤＮＡ上にアデニル化５’−末端を残すかもしれないことも認識される。リガーゼがステップ２後に基質から離れると、それはステップ１を再び再開始し、再アデニル化それ自体を受けることができる。リガーゼがアデニル化されると、それはアデニル化５’−末端に再結合することができず、ライゲーションのステップ３を触媒し、かかる末端をライゲーション不可能にさせる。この末端に、ライゲーション反応において５’−デアデニラーゼ(deandelyase)を補充することは、５’−アデニル化末端を５’−リン酸化末端に逆転させることによってかかる不全型末端を救う手助けとなり得、したがって時間とともにライゲーション収率を増加させる（米国特許公開第２０１５００３１０２６号および米国特許公開第２０１５０２１８６０８号参照）。しかしながら、ライゲーション反応における５’−デアデニラーゼ(deandenylase)の包含は５’−アデニル化末端の過剰量を逆転させることによって正常なライゲーションプロセスを妨げる可能性がある。

インビトロで別々のヌクレオチジル転移ステップにおいてライゲーション反応を行うことが考えられる（Shuman S., J. Bio. Chem, 2009、出典明示により本願明細書に包含させる）。例えば、ステップ１は、リガーゼがＡＴＰまたはＮＡＤのような補助因子に遭遇したときに起こる。大腸菌のような発現宿主からのＤＮＡリガーゼの異種発現および精製は、通常、アデニル化および非アデニル化リガーゼの混合物を生じる。リガーゼは、アデニル化または非アデニル化形態として、または１つの形態が大多数である混合物として精製することができることが当分野で知られている（Lohman GJ, JBC, 2011およびＷＯ２０１００９４０４０、これら両方を出典明示により、特に非アデニル化リガーゼを精製することについて包含させる）。アデニル化リガーゼの化学量論量を使用することによって、ライゲーションのステップ２および３を実施して、ステップ１反応をバイパスすることのみが可能である（ＷＯ２０１００９４０４０Ａ１）。かかる反応は、ＡＴＰまたはＮＡＤのような補助因子の存在を必要としない。しかしながら、アデニル化リガーゼを調製するために、酵素精製中の余分なステップを取る必要があり、酵素の化学量論量がライゲーション反応のために必要である。同様に、プレアデニル化５’−末端を使用することによって、ステップ１および２はバイパスすることができ、ステップ３ライゲーションはＡＴＰの非存在下で非アデニル化リガーゼの触媒作用下でプレアデニル化５’−末端および３’−ＯＨ末端間で直接的に行うことができる。第２のライゲーションステップの生成物である５’−アデニル化末端は、例えば、酵素的または化学的方法によって合成することができる（例えば、Torchia, Nucl. Acids, Res, 2008、出典明示により、特にアデニル化核酸を調製することについて本願明細書に包含させる）。「スプリット(split)」ライゲーションを行うための複数の手段は、ＲＮＡ研究分野においてＲＮＡライゲーションの人気が高まっている（Lau NC, Science, 2001; Zhelkovsky AM, BMC Mol Bio, 2012）。

野生型非アデニル化ＤＮＡリガーゼのほかに、アデニル化欠損であるがステップ−３−卓越ＤＮＡリガーゼ変異体を得ることも可能である。例えば、アデニル化欠損ＤＮＡリガーゼは、野生型Ｔ４ＤＮＡリガーゼの突然変異誘発を介して得ることができる。配列レベルにて、ＡＴＰ依存性リガーゼは、６つの短い保存されたモチーフ（Ｉ、ＩＩＩ、ＩＩＩａ、ＩＶ、ＶおよびＶＩ）のセットによって定義される（Shuman S, Mol. Microbio., 1995、出典明示により本願明細書に包含させる）。ＡＭＰが共有結合されるようになる活性部位リジン残基は、保存されたモチーフＩ（Ｋｘ（Ｄ／Ｎ）Ｇ）内に位置し、式中、ｘは任意のアミノ酸である。ＰＢＣＶ−１ＤＮＡリガーゼにおいて保存されたリジンのアラニンへの変異（Ｋ２７Ａ）は、アデニル基の転移をブロックし、酵素がアデニル化それ自体をできなくさせる。しかしながら、変異体酵素は、依然として、ライゲーション反応のステップ３を触媒することができる（Sriskanda V. et al, NAR, 1998、出典明示によりその全体において本願明細書に包含させる）。Ｔ４ＤＮＡリガーゼにおいて、リジン１５９はモチーフＩにおいて触媒リジンである。以前の研究は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにおける保存されたリジン１５９のロイシンへの変異がその全体的なライゲーション活性を破壊することを示している（Ross R., et al, NAR, 1997）。

本願の１つの態様において、プレアデニル化二本鎖アダプター（または他のプレアデニル化二本鎖核酸配列）を使用することによって、二本鎖ＤＮＡライゲーションにおける律速段階をバイパスすることができ、第１の鎖ライゲーションにおける比較的速いステップ３ライゲーション（図２）を行うことができる。例えば、図２に記載されているとおり、二本鎖３’−Ｔ−テールアダプターを（例えば酵素的または化学的方法を使用して）アデニル化することができる。Ａ−テールＤＮＡフラグメントおよびアデニル化アダプター間の第１の鎖ライゲーションを、例えば、ＡＴＰの非存在下で非アデニル化野生型リガーゼ（例えば、野生型Ｔ４ＤＮＡリガーゼ）、またはアデニル化欠損ＤＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ変異体または変異体ＰＢＣＶ−１ＤＮＡリガーゼ）によって触媒することができる。１つの態様において、Ｔ４ＤＮＡリガーゼは、平滑末端および単一塩基オーバーハングをライゲートすることにおいて効率的であるため、第１の鎖ライゲーションのために使用される。第１の鎖が結合されると、Ｔ７、Ｔ３、大腸菌、Ｔａｑ、ＰＢＣＶ−１リガーゼなどのような他のリガーゼを使用して第２の鎖ライゲーションを行うことができる。したがって、両方の鎖ライゲーションを行うために１つのリガーゼのみを使用する代わりに、リガーゼ混合物を各鎖を別々にライゲートするために使用することができる。

本願発明は特定のメカニズムに限定されず、メカニズムの理解は本願発明を実施するために必要としないが、別々の鎖の密閉を触媒するために複数の異なるリガーゼの混合物を使用するいくつかの利点が存在すると考えられる。第１に、第１の鎖ライゲーションにおいて、潜在的に律速段階１および２がバイパスされ、より速い動力学が予期されると考えられる。第２に、第２の鎖ニック密閉ライゲーションのために、第１の鎖ライゲーションを妨害することなく使用することができるリガーゼの多岐にわたる選択が存在する。例えば、ＮＡＤ依存性大腸菌リガーゼは、平滑末端または単一塩基末端をライゲートすることにおいて比較的不活性であるが、二本鎖ニックをライゲートすることにおいて効率的である。第２の鎖リガーゼとして大腸菌リガーゼを使用することによって、全体のライゲーションのためのＡＴＰの必要性を除去することが可能であり、これは特定の適用のために有用であり得る。第３に、以下に議論されるように、第１のライゲーションが核酸フラグメントの３’−ＯＨ末端およびアダプターの５’−アデニル化末端間で指向性であるため、第２の鎖リガーゼがニックの密閉を触媒するのみであるため、平滑末端ライゲーションにおける核酸フラグメント内で望ましくないライゲーションを最小限にすることができる。

一般的に、本願明細書に記載の方法において第２の鎖ライゲーションのためにＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼを使用するとき、これは通常、反応においてＡＴＰを必要とし、これは非アデニル化リガーゼ（例えば、野生型Ｔ４リガーゼ）が使用されるとき第１の鎖ライゲーションを妨げ得る。したがって、１つの態様において、ＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼが第２の鎖ライゲーションのために使用されるとき、アデニル化欠損変異体リガーゼ（例えば、変異体Ｔ４ＤＮＡリガーゼ変異体）が第１の鎖ライゲーションのために使用される。あるいは、ＮＡＤ＋依存性リガーゼが第２の鎖ライゲーション（例えば、大腸菌ＤＮＡリガーゼ）のために使用されるとき、非アデニル化野生型リガーゼまたはアデニル化欠損リガーゼ変異体のいずれかを第１の鎖ライゲーションのために使用することができる。したがって、いくつかの態様において、１つは、第１および第２の鎖ライゲーションを行うために、１つのポットにおいてリガーゼの混合物の組合せを使用することができる。

図３に記載されているように、ライブラリーＤＮＡフラグメントおよびアダプター間の平滑末端ライゲーションは、リガーゼ混合物を使用して同様に行うことができる。例えば、ＤＮＡライブラリーフラグメントおよびアデニル化アダプター間の第１の鎖ライゲーションは、ＡＴＰの非存在下で非アデニル化リガーゼ（例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ）、またはアデニル化欠損リガーゼ変異体（例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ変異体）によって触媒することができる。第２の鎖ライゲーションは、上記の同じ組合せガイドラインを使用して、Ｔ７、Ｔ３、大腸菌、ＴａｑＤＮＡリガーゼなどのような他のＤＮＡリガーゼを使用して行うことができる。ライゲーションがアダプターからライブラリーフラグメントへ指向性であるため、従来の平滑末端ライゲーションと比較して、大きな利点は、ライブラリーＤＮＡフラグメント内で形成される望ましくないライゲーション産物が一般的に回避されることである。アダプターダイマーが形成され得るが、例えばＡＭＰｕｒｅビーズを使用することによって、例えばサイズ選択によって、効率的に除去することができる。結果として、ライブラリー調製ワークフローにおいて提案された指向性平滑末端ライゲーションを使用することによって、種々の配列決定状況において異なる効率を有し（Magnuson VL et al, Biotechniques, 1996参照）、配列決定結果においてバイアスを起こしうるＡ−テールステップ、および一般的に平滑末端ライゲーションよりも効率的でない単一塩基Ｔ−Ａライゲーションを回避することができる。

以下の実施例に記載されているように、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのリジン１５９の全１９個の変異体を、平滑末端ＰＣＲフラグメントおよびアデニル化平滑末端アダプター間のステップ−３ライゲーションアッセイにおいて試験した。このデータは、（以前に試験されたＫ１５９Ｌを含む）全てのリジン変異体がステップ−３ライゲーションにおいて活性であるとは限らないことを示唆する。実施例は、Ｋ１５９Ｓ＞Ｋ１５９Ｃ＞Ｋ１５９Ａの効率順位で、少なくとも３つの活性なアデニル化欠損ステップ−３−卓越リジン変異体を同定した。リジンおよびセリンのアミノ酸側鎖の性質を考慮すると、Ｋ１５９Ｓ変異体がライゲーションのステップ３を触媒することにおいて最も高いレベルの活性を有するようであることは驚くべきことである。

１つの態様において、アデニル化５’−末端が生成されるとステップ−３ライゲーションを終了する能力のために、１つは、通常のライゲーション反応においてアデニル化欠損ステップ−３−卓越変異体をＤＮＡリガーゼと使用してもよい。例えば、リガーゼがステップ２後に基質から離れ、ＤＮＡ上にアデニル化５’−末端を残すかもしれないことが認識される。５’−アデニル化末端は、アデニル化欠損ステップ−３−卓越リガーゼ変異体によって認識され、鎖密閉を進行することができる。５’−デアデニラーゼを補充することと比較して（米国特許公開第２０１５００３１０２６号）、このアプローチは反応を逆転させない。

１つの態様において、複数のリガーゼ混合物および／または変異体リガーゼは、配列決定方法において、例えば後の配列決定のためにアダプターをライブラリーフラグメントに連結することにおいて使用される。例えば、いくつかの態様において、本願明細書において提供される記載は、限定はしないがピロシーケンシング（pyrosequencing）、ライゲーションによる配列決定（sequencing-by-ligation）、単一分子配列決定（single molecule sequencing）、合成による配列決定（sequence-by-synthesis）（ＳＢＳ）、半導体配列決定（semiconductor sequencing）、大規模並列クローン（massive parallel clonal）、大規模並列単一分子ＳＢＳ（massive parallel single molecule SBS）、大規模並列単一分子リアルタイム（massive parallel single molecule real-time）、大規模並列単一分子リアルタイムナノ細孔技術（massive parallel single molecule real-time nanopore technology）などを含む、ＳｅｃｏｎｄＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ（別名、ＮｅｘｔＧｅｎｅｒａｔｉｏｎまたはＮｅｘｔ−Ｇｅｎ）、ＴｈｉｒｄＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ（別名、Ｎｅｘｔ−Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎ）、またはＦｏｕｒｔｈＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ（別名、Ｎ３−Ｇｅｎ）配列決定技術における使用を見いだせる。ＭｏｒｏｚｏｖａおよびＭａｒｒａは、Genomics, 92: 255 (2008)におけるいくつかの係る技術のレビューを提供しており、これを出典明示によりその全体において本願明細書に包含させる。

蛍光ベースの配列決定方法論（例えば、Birren et al., Genome Analysis: Analyzing DNA, 1, Cold Spring Harbor, N.Y.参照；出典明示によりその全体において本願明細書に包含させる）を含むあらゆるＤＮＡ配列決定技術が適当である。いくつかの態様において、本願は、当分野で理解されている自動配列決定技術における使用を見いだせる。いくつかの態様において、本願技術は、分配されたアンプリコンの並列配列決定における使用（ＰＣＴ公開ＷＯ２００６０８４１３２、出典明示によりその全体において本願明細書に包含させる）を見いだせる。いくつかの態様において、技術は、並列オリゴヌクレオチド伸長によるＤＮＡ配列決定（例えば、米国特許第５，７５０，３４１号、および米国特許第６，３０６，５９７号参照、これら両方を出典明示によりそれら全体において本願明細書に包含させる）における使用を見いだせる。技術が使用を見いだせる配列決定技術のさらなる例は、Ｃｈｕｒｃｈｐｏｌｏｎｙ技術（Mitra et al., 2003, Analytical Biochemistry 320, 55-65; Shendure et al., 2005 Science 309, 1728-1732；米国特許第６，４３２，３６０号、米国特許第６，４８５，９４４号、米国特許第６，５１１，８０３号；これら全てを出典明示によりそれら全体において本願明細書に包含させる）、４５４ピコタイターピロシーケンシング技術（Margulies et al., 2005 Nature 437, 376-380；ＵＳ２００５０１３０１７３；出典明示によりそれら全体において本願明細書に包含させる）、Ｓｏｌｅｘａ単一塩基付加技術（Bennett et al., 2005, Pharmacogenomics, 6, 373-382；米国特許第６，７８７，３０８号；米国特許第６，８３３，２４６号；出典明示によりそれら全体において本願明細書に包含させる）、Ｌｙｎｘ大規模並列サイン(signature)配列決定技術（Brenner et al. (2000). Nat. Biotechnol. 18:630-634；米国特許第５，６９５，９３４号；米国特許第５，７１４，３３０号；これら全てを出典明示によりそれら全体において本願明細書に包含させる）、およびＡｄｅｓｓｉＰＣＲコロニー技術（Adessi et al. (2000). Nucleic Acid Res. 28, E87；ＷＯ０００１８９５７；出典明示によりその全体において本願明細書に包含させる）を含む。

次世代配列決定（ＮＧＳ）方法は、従来の配列決定方法と比較して低コストを目指して、大規模並列ハイスループット戦略の共通の特徴を共有している（例えば、Voelkerding et al., Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean et al., Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296参照；それぞれを出典明示によりそれら全体において本願明細書に包含させる）。ＮＧＳ方法は、鋳型増幅を典型的に使用する方法とそうでない方法に広範に分類することができる。増幅を必要とする方法は、４５４ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｐｌａｔｆｏｒｍｓ（例えばＧＳ２０およびＧＳＦＬＸ），ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔとしてＲｏｃｈｅによって市販されているピロシーケンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＧｎｕＢｉｏによって市販されているＳｏｌｅｘａプラットフォーム、およびＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって市販されているＳｕｐｐｏｒｔｅｄＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＬｉｇａｔｉｏｎおよびＤｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ）プラットフォームを含む。単分子配列決定としても知られている非増幅アプローチは、ＨｅｌｉｃｏｓＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓによって市販されているＨｅｌｉＳｃｏｐｅプラットフォーム、およびＶｉｓｉＧｅｎ，ＯｘｆｏｒｄＮａｎｏｐｏｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＬｔｄ．，およびＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓそれぞれによって市販されている新興プラットフォームによって例示される。

ピロシーケンシング（Voelkerding et al., Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean et al., Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296；米国特許第６，２１０，８９１号；米国特許第６，２５８，５６８号；それぞれを出典明示によりその全体において本願明細書に包含させる）において、鋳型ＤＮＡを断片化し、末端修復し、アダプターに連結し、およびアダプターに相補的なオリゴヌクレオチドを有するビーズで単一の鋳型分子を捕捉することによってｉｎ−ｓｉｔｕでクローン的に増幅する。単一の鋳型タイプを有する各ビーズを油中水型微小胞に区画化し、鋳型を、エマルジョンＰＣＲと呼ばれる技術を使用してクローン的に増幅する。増幅後にエマルジョンを破壊し、ビーズを配列決定反応中にフローセルとして機能するピコタイター(picotitre)プレートの個々のウェルに沈殿させる。４つのｄＮＴＰ試薬のそれぞれの順々の反復導入が、配列決定酵素および発光レポーター、例えばルシフェラーゼの存在下でフローセルにおいて起こる。適当なｄＮＴＰが配列決定プライマーの３’末端に加えられる場合、得られるＡＴＰの生産は、ウェル内で発光バーストを引き起こし、これをＣＣＤカメラを使用して記録する。４００ベース以上であるリード長をなし遂げることができ、１０^６配列リードをなし遂げることができ、最大５億塩基対（Ｍｂ）の配列が得られる。

Ｓｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム（Voelkerding et al., Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean et al., Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296；米国特許第６，８３３，２４６号；米国特許第７，１１５，４００号；米国特許第６，９６９，４８８号；それぞれの出典明示によりその全体において本願明細書に包含させる）において、配列決定データはより短い長さのリードの形成において生産される。この方法において、一本鎖断片化ＤＮＡを末端修復して５’−リン酸化平滑末端を産生し、次にフラグメントの３’末端に単一のＡビーズのＫｌｅｎｏｗ介在付加を行う。Ａ−付加は、次にオリゴヌクレオチドアンカーでスタッドされる(studded)フローセルの表面上で鋳型アダプター分子を捕捉するために使用される、Ｔ−オーバーハングアダプターオリゴヌクレオチドの付加を容易にする。アンカーはＰＣＲプライマーとして使用されるが、鋳型の長さおよび他の近くのアンカーオリゴヌクレオチドへのその近接性のために、ＰＣＲによる伸長は、分子の「アーチングオーバー(arching over)」を生じ、隣接アンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、フローセルの表面上にブリッジ構造を形成する。ＤＮＡのこれらのループは、変性され、切断される。次に、フォワード鎖が可逆性色素ターミネーターで配列決定される。導入されるヌクレオチドの配列は、導入後の蛍光の検出によって決定され、各蛍光およびブロックはｄＮＴＰ添加の次のサイクルの前に除去される。配列リード長は、分析実行あたり１０億ヌクレオチド対を超える総出力で、３６ヌクレオチドから２５０を超えるヌクレオチドの範囲である。

ＳＯＬｉＤ技術を使用する配列決定核酸分子（Voelkerding et al., Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean et al., Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296；米国特許第５，９１２，１４８号；米国特許第６，１３０，０７３号；それぞれを出典明示によりそれら全体において本願明細書に包含させる）はまた、鋳型の断片化、オリゴヌクレオチドアダプターへのライゲーション、ビーズへの付着、およびエマルジョンＰＣＲによるクローン増幅に関与する。これに続いて、鋳型を有するビーズをガラスフローセルの誘導体化(derivatized)表面上に固定し、アダプターオリゴヌクレオチドに相補的なプライマーをアニールする。しかしながら、３’伸長のためにこのプライマーを利用することよりもむしろ、代わりに２つのプローブ特異的塩基、次に６つの縮重塩基および４つの蛍光標識の１つを含むインテロゲーション(interrogation)プローブへのライゲーションのための５’リン酸基を提供するために使用される。ＳＯＬｉＤシステムにおいて、インテロゲーションプローブは、各プローブの３’末端に２つの塩基の１６の可能な組合せおよび５’末端で４つの蛍光の１つを有する。蛍光色、およびしたがって各プローブの特定は、特定の色空間コード体系に対応する。プローブアニーリング、ライゲーション、および蛍光検出の複数のラウンド（通常７回）に続いて変性が行われ、次に、最初のプライマーに対して１塩基補われるプライマーを使用する配列決定の第２のラウンドが行われる。このようにして、鋳型配列はコンピューター的に再構成することができ、鋳型塩基は２回インテロゲーションして(interrogated)、高めた精度をもたらす。配列リード長は３５ヌクレオチドの平均をとり、全出力は配列決定実行あたり４０億塩基を超える。

１つの態様において、本願明細書に記載の技術は、ナノ細孔配列決定（例えば、Astier et al., J. Am. Chem. Soc. 2006 Feb 8; 128(5):1705-10参照、出典明示により本願明細書に包含させる）における使用を見いだせる。ナノ細孔配列決定の背後にある理論は、ナノ細孔が導電性流体に浸され、電位（電圧）がそれを通って印加されるときに起こる現象と関連している。これらの条件下で、ナノ細孔を通るイオンの伝導によるわずかな電流を観察することができ、電流の量はナノ細孔のサイズに対して非常に感度が高い。核酸各塩基がナノ細孔を通過するとき、これは４つの塩基のそれぞれについて異なるナノ細孔を通る電流の大きさの変化を引き起こし、それにより決定されるべきＤＮＡ分子の配列決定を可能にする。

１つの態様において、本願明細書に記載されている技術は、ＨｅｌｉｃｏｓＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓによるＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（Voelkerding et al., Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean et al., Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296；米国特許第７，１６９，５６０号；米国特許第７，２８２，３３７号；米国特許第７，４８２，１２０号；米国特許第７，５０１，２４５号；米国特許第６，８１８，３９５号；米国特許第６，９１１，３４５号；米国特許第７，５０１，２４５号；それぞれを出典明示によりそれら全体において本願明細書に包含させる）における使用を見いだせる。鋳型ＤＮＡは３’末端で断片化されポリアデニル化され、最終的なアデノシンは蛍光標識を有する。変性されるポリアデニル化鋳型フラグメントは、フローセルの表面上でポリ（ｄＴ）オリゴヌクレオチドにライゲートされる。捕捉された鋳型分子の最初の物理的位置がＣＣＤカメラによって記録され、次に標識が切断され、洗い流される。配列決定は、ポリメラーゼの付加および蛍光標識されたｄＮＴＰ試薬の連続付加によってなし遂げられる。取り込み事象はｄＮＴＰに対応する蛍光シグナルをもたらし、シグナルはｄＮＴＰ付加の各ラウンド前にＣＣＤカメラによって捕捉される。配列リード長は２５−５０ヌクレオチドの範囲であり、全出力は分析実行あたり１０億ヌクレオチドを超える。

ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ技術は、ＤＮＡの重合中に放出される水素イオンの検出に基づくＤＮＡ配列決定の方法である（例えば、Science 327(5970): 1190 (2010)；米国特許出願第２００９００２６０８２、２００９０１２７５８９、２０１００３０１３９８、２０１００１９７５０７、２０１００１８８０７３、および２０１００１３７１４３号参照、全ての目的のために出典明示によりそれら全体において包含させる）。マイクロウェルは、配列決定されるべき鋳型ＤＮＡ鎖を含む。マイクロウェルの層の下は、高感度ＩＳＦＥＴイオンセンサーである。電子産業において使用されるものと同様に、全ての層がＣＭＯＳ半導体チップ内に含まれる。ｄＮＴＰが成長する相補鎖に組み込まれると、水素イオンが放出され、これが高感度イオンセンサーを誘発する。ホモポリマーリピートが鋳型配列中に存在するとき、複数のｄＮＴＰ分子が単一サイクルに組み込まれる。これは、対応する数の放出された水素および比例的により高い電子シグナルを生じる。この技術は、修飾ヌクレオチドまたは光学系が使用されない点で、他の配列決定技術とは異なる。ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔシーケンサーのベースごとの精度は、５０ベースリードあたり〜９９．６％であり、実行あたり〜１００Ｍｂから１００Ｇｂが生成される。リード長は１００−３００塩基対である。５リピート長のホモポリマーリピートに対する精度は、〜９８％である。イオン半導体配列決定の利点は、迅速な配列決定スピードおよび低い先行投資および操作コストである。

本願明細書に記載されている技術は、ＳｔｒａｔｏｓＧｅｎｏｍｉｃｓ、Ｉｎｃ．によって開発された別の核酸配列決定アプローチにおける使用を見いだせ、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒｓの使用に関与する。この配列決定処理は、一般的に、鋳型指向性合成によって生産される娘鎖を提供することを含む。娘鎖は、一般的に、個々のサブユニットがテザー、少なくとも１つのプローブまたは核酸塩基残基、および少なくとも１つの選択的に開裂可能な結合を含む標的核酸のすべてまたは一部の隣接するヌクレオチド配列に対応する配列に連結された複数のサブユニットを含む。選択的に開裂可能な結合は切断されて、複数の娘鎖のサブユニットよりも長い長さのＸｐａｎｄｏｍｅｒを生じる。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは、一般的に、標的核酸のすべてまたは一部の隣接するヌクレオチド配列に対応する配列において遺伝情報を説明するためのテザーおよびレポーターエレメントを含む。次に、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒのレポーターエレメントが検出される。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒベースのアプローチに関するさらなる詳細は、例えば米国特許公開第２００９００３５７７７号において記載されており、これをその全体において本願明細書に包含させる。

他の単一分子配列決定方法は、固定化されプライムされた(primed)ＤＮＡ鋳型が蛍光的に修飾されたポリメラーゼおよび蛍光受容体分子を使用して鎖伸長に付され、ヌクレオチド付加時に検出可能な蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を引き起こす、ＶｉｓｉＧｅｎプラットフォームを使用する合成によるリアルタイム配列決定を含む（Voelkerding et al., Clinical Chem., 55: 641-58, 2009；米国特許第７，３２９，４９２号；米国特許公開シリアルナンバー１１／６７１９５６；米国特許公開シリアルナンバー１１／７８１１６６；それぞれを出典明示により本願明細書にそれら全体において包含させる）。

１つの態様において、本願明細書は、配列番号：１によってコードされるか、または配列番号：１と実質的な同一性を有する配列によってコードされるＴ４ＤＮＡリガーゼＫ１５９Ｓ変異体、および／または配列番号：２によってコードされるか、または配列番号：２と実質的な同一性を有する配列によってコードされるＴ４ＤＮＡリガーゼＫ１５９Ｃ変異体を含む組成物、キット、およびシステムを提供する。かかるポリペプチドに適用されるとき、「実質的な同一性」なる用語は、２つのペプチド配列が、最適にアラインされるとき、例えばデフォルトのギャップ重さを使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによって、少なくとも８０パーセント配列同一性、または少なくとも９０パーセント配列同一性、または少なくとも９５パーセント配列同一性以上（例えば、９５％…９７％…または９９％パーセント配列同一性）を共有することを意味する。特定の態様において、同一ではない残基位置は保存的アミノ酸置換によって異なる。保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループはセリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループはアスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族性側鎖を有するアミノ酸のグループはフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループはリジン、アルギニン、およびヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループはシステインおよびメチオニンである。いくつかの態様において、保存的アミノ酸置換グループは、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。１つの態様において、本願明細書は、配列番号：１および２において示されるアミノ酸配列の少なくとも一部と実質的な同一性を有するペプチドを提供する。

実施例１
活性なアデニル化欠損ステップ−３−卓越Ｔ４ＤＮＡリガーゼ変異体の同定
野生型Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｔ４ＤＬ）をＮ−末端６ｘＨｉｓタグを有する最適化大腸菌コドンを使用して合成した。合成遺伝子をＴ７−プロモーター駆動発現ベクターｐＴＸＢ１（ＮＥＢ）にクローニングした。鋳型としてｐＴＸＢ１＿Ｔ４ＤＬＷＴを使用するＰＣＲベースの突然変異誘発を行い、リジン１５９を他の全ての１９個のアミノ酸に変化させた。全ての変異体発現ベクターを配列確認し、予期される変化を確認した。次に、各変異体をＴ７Ｅｘｐｒｅｓｓ株（＃Ｃ２５６６、ＮＥＢ）において発現させた。簡潔には、各６ｍｌ培養物を最初にＯ．Ｄ．〜０．６に増殖させ、ＩＰＴＧを０．５ｍＭの最終濃度に誘導させ、２０℃で一晩振盪震盪した。次に、発現培養物を遠沈し、２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ＝７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｘＦａｓｔＢｒｅａｋ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、２００ｕｇ／ｍｌリゾチームを含む４５０ｕｌバッファー中に再懸濁し、超音波処理した。次に、細胞溶解物を４℃で３０分間１４，０００ｒｐｍで遠心した。清澄化された溶解物をＮｉ−ＮＴＡビーズカラム上に負荷し、標的タンパク質を２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ＝７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌ、４００ｍＭイミダゾールを含む溶出バッファーを使用して溶出させた。

ステップ３ライゲーションアッセイのため、平滑末端アダプターを、ＩＤＴ（５’−ＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣ／ｉｄｅｏｘｙＵ／ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣ−３’配列番号：４）から合成し、次にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）を使用してリン酸化し、製造業者の指示（ＮＥＢ）にしたがって５’−アデニル化キットを使用してアデニル化した。短いＰＣＲフラグメント（〜２５０ｂｐ）をＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼを使用してｐＢＲ３２２ベクターから増幅させ、精製した。ステップ３ライゲーション反応を７０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ２、５ｍＭＤＴＴを含むバッファー中で行った。各反応は、０．２ｕｌＰＣＲフラグメント（〜６０ｎｇ／ｕｌ）および０．２ｕｌアデニル化アダプター（〜６ｕＭ）を含む。全ての反応物を室温で（２５℃）で１時間インキュベートし、この後、１ｕｌプロテイナーゼＫ（ＮＥＢ）を各反応物に加え、次に５０℃で１時間さらにインキュベーションした。次に、反応物を１０％ＴＢＥゲル上に流し、ＳＹＢＲＧｏｌｄで染色し、視覚化した。図４から、大多数のリジン変異体が有意なステップ３ライゲーション活性を示さないことを観察することができる。Ｋ１５９Ｓが他のリガーゼ変異体と比較して最も強いライゲーション活性を示し、続いてＫ１５９ＣおよびＫ１５９Ａが示す。

リガーゼ混合物を使用する平滑末端ライゲーションを試験するために、リガーゼ混合物を使用する反応をセットアップし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのみを使用する通常のライゲーションと比較した。図５に示されるとおり、レーン２はＫ１５９Ｓ変異体のみを使用する平滑末端ＰＣＲフラグメントおよびアデニル化平滑末端アダプター間のライゲーションを示し、レーン３はＫ１５９Ｓおよび大腸菌リガーゼのリガーゼ混合物を使用する同じライゲーションを示す。両方の場合において、ライゲーションは完了に近づく。レーン４はＴ４ＤＮＡリガーゼのみを使用する平滑末端ＰＣＲフラグメントおよびリン酸化アダプター間のライゲーションを示す。同様の効率であるが、ＰＣＲフラグメントの連結から形成できた余分な高分子バンドが存在することを見ることができる。

文献：

明細書に記載されている、および／または以下に列挙されている全ての文献および特許は、出典明示により本願明細書に包含させる。発明の記載された方法およびシステムの種々の修飾および変形は、発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。発明は特定の態様に関連して記載されているが、本願発明がかかる特定の態様に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、当業者に明らかである発明を実施するための記載された様式の種々の修飾が、本願明細書に記載されている範囲内であると意図される。

Claims

Ｔ４ＤＮＡリガーゼＫ１５９Ｓ変異体を含む組成物であって、アミノ酸１５９は配列番号：１の位置１５９でのセリンであり、変異体は配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性を有し、リガーゼ活性を有する、組成物。
Ｋ１５９Ｓ変異体が配列番号：１のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の組成物。
ａ）Ｔ４ＤＮＡリガーゼＫ１５９Ｓ変異体を含む第１の組成物を含む第１の容器、ここでアミノ酸１５９は配列番号：１の位置１５９でのセリンであり、変異体は配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性を有し、リガーゼ活性を有する；および
ｂ）アデニル化二本鎖核酸配列（ＡＤＳＮＡＳ）を有する核酸を含む第２の組成物を含む第２の容器
を含むキット。