JP6740768B2

JP6740768B2 - Lyophilized sample dilution reagent

Info

Publication number: JP6740768B2
Application number: JP2016141944A
Authority: JP
Inventors: 信之河合
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2016-07-20
Filing date: 2016-07-20
Publication date: 2020-08-19
Anticipated expiration: 2036-07-20
Also published as: JP2018013364A

Description

本発明は、体外診断薬等に使用される凍結乾燥状態の検体希釈試薬であって、糖アルコールおよび蛋白質を含有することにより測定再現性を向上させることに関するものである。 The present invention relates to a freeze-dried sample diluting reagent used for in-vitro diagnostics and the like, and to improving measurement reproducibility by containing a sugar alcohol and a protein.

体外診断薬等に使用される検体希釈試薬は、液状形態である検体希釈液として、臨床検査等の分野で広く利用されている。この液状形態である検体希釈液はそのまま使用できる点で測定者への負担は軽いものの、体積と重さの点で運送面においては不利である。また通常はバルク品として供給および使用されているので、環境温度や環境湿度の影響を受けやすい。つまり、開封された状態で使用されるので濃縮の影響を避けることができず、使用継続時間毎に検体希釈液中の有効成分濃度が変動し、使用継続時間毎に正確な測定値から変動していくことが危惧される。よってこれらの問題を解決するための方法が提案されている。 Specimen diluting reagents used for in-vitro diagnostics and the like are widely used in the field of clinical examination and the like as specimen diluting liquids in liquid form. Although the sample diluent in the liquid form can be used as it is, the burden on the measurer is light, but it is disadvantageous in terms of volume and weight in terms of transportation. Also, since they are usually supplied and used as bulk products, they are easily affected by environmental temperature and environmental humidity. In other words, since it is used in the opened state, the effect of concentration cannot be avoided, the concentration of the active ingredient in the sample diluent changes with each use duration, and it changes from the accurate measured value with each use duration. I'm afraid that I will go. Therefore, methods for solving these problems have been proposed.

特許文献１では、自動分析装置で使用する凍結乾燥状態の検体希釈試薬が報告されている。しかしながら特許文献１においては、検体希釈試薬の組成や製法に関しては、何ら記載されていない。凍結乾燥形態の各種試薬においては、賦形剤としての糖や蛋白質などが使用されている。糖や蛋白質などが少ない場合には形状を維持することが困難であり、輸送中に凍結乾燥物が剥離、破砕され容器の壁や蓋に付着することに起因して測定時の有効成分濃度が変動してしまい、正確な測定値から逸脱することが問題となっている。糖や蛋白質などが多い場合には形状を維持することが可能となるが、その成分や濃度が適切でない場合には再溶解した後の溶解性が悪く、その結果、測定再現性が悪くなり測定対象成分を高精度に測定することが妨げられることが問題となっていた。 Patent Document 1 reports a freeze-dried sample diluting reagent used in an automatic analyzer. However, in Patent Document 1, there is no description about the composition of the sample diluting reagent or the manufacturing method. In various lyophilized reagents, sugars, proteins and the like are used as excipients. It is difficult to maintain the shape when the amount of sugars and proteins is small, and the concentration of the active ingredient at the time of measurement is due to the freeze-dried product being separated and crushed during transportation and adhered to the wall and lid of the container. It is a problem that it fluctuates and deviates from an accurate measured value. It is possible to maintain the shape when there are a lot of sugars and proteins, but when the component and concentration are not appropriate, the solubility after re-dissolving is poor, resulting in poor reproducibility of the measurement It has been a problem that measurement of the target component with high accuracy is hindered.

特許第５８１１２４４号公報Japanese Patent No. 5811244

臨床検査の分野において、試薬の測定時における再現性は種々の試薬で求められている。そこで本発明の目的は、測定再現性が良好な、体外診断薬等に使用される凍結乾燥状態の検体希釈試薬を提供することである。 In the field of clinical examination, reproducibility at the time of measuring a reagent is required for various reagents. Therefore, an object of the present invention is to provide a freeze-dried sample diluting reagent which is used for in-vitro diagnostics or the like and has good measurement reproducibility.

本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を行なった結果、凍結乾燥状態の検体希釈試薬に存在する糖および蛋白質の濃度を最適化することにより、測定再現性が良好となることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that the measurement reproducibility is improved by optimizing the concentrations of sugars and proteins present in a freeze-dried sample dilution reagent. Heading out, the present invention has been completed.

即ち本発明は以下のとおりである。
（１）凍結乾燥濃度３０．０〜９０．０ｍｇ／ｃｍ^３の糖アルコール、および凍結乾燥濃度３０．０〜１００．０ｍｇ／ｃｍ^３の蛋白質を含有することを特徴とする、凍結乾燥状態の検体希釈試薬。
（２）糖アルコールがマンニトールである、（１）に記載の検体希釈試薬。
（３）蛋白質がウシ血清アルブミンである、（１）又は（２）に記載の検体希釈試薬。 That is, the present invention is as follows.
(1), characterized in that it contains a lyophilized concentration 30.0~90.0mg / cm ³ sugar alcohols, and proteins lyophilized concentration 30.0~100.0mg / cm ^3, specimens of lyophilized Diluting reagent.
(2) The sample dilution reagent according to (1), wherein the sugar alcohol is mannitol.
(3) The sample dilution reagent according to (1) or (2), wherein the protein is bovine serum albumin.

以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.

本発明の検体希釈試薬は、測定範囲を超える濃度で存在する測定対象や過剰な妨害成分を含む検体を希釈するために使用される。使用にあたって、溶解液を加えて溶解させて検体希釈液として使用する。 The sample diluting reagent of the present invention is used for diluting a sample containing a measurement target or an excessive interfering component which exists at a concentration exceeding the measurement range. Before use, add the lysis solution and dissolve it to use as a sample diluent.

本発明の検体希釈試薬が用いられる測定対象としては、特に限定されるものではないが、例えばヒトイムノグロブリン、β２−ミクログロブリン、フェリチン、α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原、ＣＡ１９−９、ＳＣＣ抗原、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、前立腺特異抗原、甲状腺刺激ホルモン、抗甲状腺ペルオキシターゼ抗体、抗サイログロブリン抗体、肝炎ウイルス抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、トリヨードサイロニン、サイロキシン、エストラジオール、プロゲステロン、コルチゾール、テストステロン、デヒドロエピアンドロステロンサルフェイト、インスリン、脳性ナトリウム利尿ペプチド、心房性ナトリウム利尿ペプチド、２５−ヒドロキシビタミンＤ、ビタミンＢ１２又は葉酸等があげられる。 The measurement target for which the sample dilution reagent of the present invention is used is not particularly limited, and examples thereof include human immunoglobulin, β2-microglobulin, ferritin, α-fetoprotein, carcinoembryonic antigen, CA19-9, SCC antigen. , CA15-3, CA125, prostate-specific antigen, thyroid stimulating hormone, anti-thyroid peroxidase antibody, anti-thyroglobulin antibody, hepatitis virus antigen, human chorionic gonadotropin, triiodothyronine, thyroxine, estradiol, progesterone, cortisol, testosterone, dehydroepiepita. Examples thereof include androsterone sulfate, insulin, brain natriuretic peptide, atrial natriuretic peptide, 25-hydroxyvitamin D, vitamin B12 or folic acid.

本発明において糖アルコールとしてはマンニトール、キシリトール、ソルビトール、ガラクチトール、リビトール等が好ましく、中でもマンニトールが好ましい。糖アルコールは、本発明の凍結乾燥状態の検体希釈試薬において、凍結乾燥濃度３０．０〜９０．０ｍｇ／ｃｍ^３含有されるものであり、好ましくは３５．０〜８０．０ｍｇ／ｃｍ^３、更に好ましくは３７．５〜７５．０ｍｇ／ｃｍ^３である。ここで凍結乾燥濃度とは、［凍結乾燥状態の検体希釈試薬に含有される糖アルコールの重量］／［凍結乾燥状態の検体希釈試薬の見かけ体積］で表わされる値である。なお、凍結乾燥状態の検体希釈試薬は、内部が緻密ではなく微小な空隙を有するが、その空隙を含めて１つの固体として見た場合の体積をここでは見かけ体積とした。 As the sugar alcohol in the present invention, mannitol, xylitol, sorbitol, galactitol, ribitol and the like are preferable, and mannitol is particularly preferable. The sugar alcohol is contained in the freeze-dried sample diluting reagent of the present invention in a freeze-drying concentration of 30.0 to 90.0 mg/cm ³ , and preferably 35.0 to 80.0 mg/cm ³ . It is preferably 37.5 to 75.0 mg/cm ³ . Here, the freeze-dried concentration is a value represented by [weight of sugar alcohol contained in freeze-dried sample dilution reagent]/[apparent volume of freeze-dried sample dilution reagent]. In addition, the sample-diluted reagent in the freeze-dried state has minute voids instead of being dense, but the volume when viewed as one solid including the voids is referred to as an apparent volume here.

一方、本発明に用いられる蛋白質としては、例えばヒト血清、ヒト血清アルブミン、ウシ血清、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、コラーゲンペプチド、スキムミルク等を使用することができる。その中でもウシ血清アルブミンが好ましい。蛋白質は、本発明の凍結乾燥状態の検体希釈試薬において、凍結乾燥濃度３０．０〜１００．０ｍｇ／ｃｍ^３で含有されるものであり、４０．０〜９０．０ｍｇ／ｃｍ^３とすることが好ましく、特に４２．２〜８４．４ｍｇ／ｃｍ^３とすることが好ましい。ここで凍結乾燥濃度とは、［凍結乾燥状態の検体希釈試薬に含有される蛋白質の重量］／［凍結乾燥状態の検体希釈試薬の見かけ体積］で表わされる値である。なお、見かけ体積とは前述のとおりである。 On the other hand, as the protein used in the present invention, for example, human serum, human serum albumin, bovine serum, bovine serum albumin (BSA), collagen peptide, skim milk and the like can be used. Among them, bovine serum albumin is preferable. The protein is contained at a freeze-drying concentration of 30.0 to 100.0 mg/cm ³ in the freeze-dried sample diluting reagent of the present invention, and may be 40.0 to 90.0 mg/cm ^3. It is particularly preferably 42.2 to 84.4 mg/cm ³ . Here, the freeze-dried concentration is a value represented by [weight of protein contained in sample-diluted reagent in freeze-dried state]/[apparent volume of sample-diluted reagent in freeze-dried state]. The apparent volume is as described above.

本発明の凍結乾燥状態の検体希釈試薬には、緩衝液の構成成分が含まれることが好ましい。また界面活性剤や塩類が含まれることも好ましい。それらは特に限定されるものではないが、界面活性剤であればアニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤を使用することができる。緩衝液の構成成分としては、例えばＴｒｉｓ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳやＭＥＳ等の構成成分をあげることができ、塩類としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛等を使用することができる。凍結乾燥状態の検体希釈試薬にはこれら以外にも、必要に応じて他の試薬成分等を共存させることもできる。 The freeze-dried sample diluting reagent of the present invention preferably contains the components of the buffer solution. It is also preferable that a surfactant and salts are included. Although they are not particularly limited, anionic surfactants, cationic surfactants, amphoteric surfactants and nonionic surfactants can be used as long as they are surfactants. Examples of constituents of the buffer solution include constituents such as Tris, MOPSO, MOPS and MES, and examples of salts include sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride, zinc chloride and the like. In addition to the above, other reagent components and the like can coexist in the freeze-dried sample diluting reagent.

本発明の凍結乾燥状態の検体希釈試薬は、必要な成分と共に糖アルコール及び蛋白質を共存させた溶液を凍結乾燥することにより、製造することができる。このとき、目的とする凍結乾燥濃度となるよう、溶液中の糖アルコール及び蛋白質の濃度や凍結乾燥条件を適宜設定すればよい。 The freeze-dried sample diluting reagent of the present invention can be produced by freeze-drying a solution in which a sugar alcohol and a protein coexist with necessary components. At this time, the concentrations of sugar alcohol and protein in the solution and the freeze-drying conditions may be appropriately set so that the desired freeze-drying concentration is obtained.

本発明の凍結乾燥状態の検体希釈試薬は、凍結乾燥した際の容器への適度な固着性を有し、また適当な硬さを有する凍結乾燥ケーキとして得られるため、溶解液を加えた際の溶解性に優れたものである。そのため、本発明の凍結乾燥状態の検体希釈試薬を体外診断薬等に用いれば、精度よく測定することができる。 The sample-diluted reagent in the freeze-dried state of the present invention has an appropriate adhesiveness to the container when freeze-dried, and is also obtained as a freeze-dried cake having an appropriate hardness, so that when a solution is added, It has excellent solubility. Therefore, if the freeze-dried sample dilution reagent of the present invention is used as an in-vitro diagnostic agent or the like, accurate measurement can be performed.

実施例及び比較例で、２穴容器を用いて凍結乾燥ケーキの見かけ体積を測定する方法を示す図である。It is a figure which shows the method of measuring the apparent volume of a freeze-dried cake using a 2-well container in an Example and a comparative example.

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。なお、免疫測定装置として全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ−ＣＬ２４００、東ソー社製を用い、免疫測定用試薬として当該装置用のＡＩＡ−パックＣＬプロゲステロンを用い、１ステップディレイ競合法により各測定を行った。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples. Each measurement was performed by a one-step delay competition method using a fully automatic enzyme immunoassay device AIA-CL2400, manufactured by Tosoh Corporation as an immunoassay device, and AIA-pack CL progesterone for the device as an immunoassay reagent.

（実施例１，２、比較例１）
Ｔｒｉｓ緩衝液に、表１に記載の濃度となるよう、ＢＳＡ及びマンニトールを添加した溶液を調製し、表１に記載の量を、２穴を有する試薬容器の一方の穴に分注した。なおこの試薬容器は、同等の２穴を有するものである。 (Examples 1 and 2, Comparative Example 1)
A solution was prepared by adding BSA and mannitol to the Tris buffer so as to have the concentrations shown in Table 1, and the amounts shown in Table 1 were dispensed into one hole of a reagent container having two holes. This reagent container has two equivalent holes.

この結果、各試薬容器の一方の穴に存在するＢＳＡとマンニトールの絶対量は試薬容器間で差がなく、同一である。これらについて凍結乾燥を行った。凍結乾燥後、得られた凍結乾燥ケーキの見かけ体積を以下のようにして図１に示すように測定した。即ち、２穴試薬容器の空の１穴に、凍結乾燥ケーキと同一の高さまで純水を分注し、その純水の重量から体積を求め、凍結乾燥ケーキの見かけ体積とした。なお、図１では左から順に実施例１，２、比較例１の２穴試薬容器を示す。その結果、凍結乾燥ケーキはそれぞれ表１に記載の見かけ体積を有し、それをもとにそれぞれのＢＳＡとマンニトールの凍結乾燥濃度を求め、表１に示した。

As a result, the absolute amounts of BSA and mannitol existing in one hole of each reagent container are the same without any difference between the reagent containers. These were freeze-dried. After freeze-drying, the apparent volume of the obtained freeze-dried cake was measured as shown in FIG. 1 as follows. That is, pure water was dispensed into one empty hole of a 2-well reagent container to the same height as the freeze-dried cake, and the volume was calculated from the weight of the pure water to obtain the apparent volume of the freeze-dried cake. In FIG. 1, the 2-well reagent containers of Examples 1 and 2 and Comparative Example 1 are shown in order from the left. As a result, the freeze-dried cakes had the apparent volumes shown in Table 1, respectively, and the freeze-dried concentrations of BSA and mannitol were calculated based on the apparent volumes and shown in Table 1.

（測定再現性試験）
プロゲステロン濃度３１．２ｎｇ／ｍＬであるヒト血清を検体として、実施例１，２、比較例１にて調製した凍結乾燥状態の検体希釈試薬に溶解液（アジ化ナトリウムを含む分注水）を７５μＬ加えて溶解し、検体希釈液を調製した。それを用いて検体を希釈し、プロゲステロン濃度を測定した。これら一連の操作は前記自動免疫測定装置で行った。検体の希釈倍率は１０倍と設定し、希釈操作は装置上の自動希釈で実施した。希釈をした後にプロゲステロン濃度を測定する一連の操作を１０回繰り返して、プロゲステロン測定値の平均値を求めた。さらにその測定値を基に、測定再現性を算出した。結果を表１に示す。 (Measurement reproducibility test)
Using human serum having a progesterone concentration of 31.2 ng/mL as a sample, 75 μL of a lysis solution (dispensed water containing sodium azide) was added to the lyophilized sample dilution reagents prepared in Examples 1 and 2 and Comparative Example 1. And dissolved to prepare a sample diluent. The sample was diluted with it and the progesterone concentration was measured. These series of operations were performed by the automatic immunoassay device. The dilution ratio of the sample was set to 10 times, and the dilution operation was performed by automatic dilution on the device. After dilution, a series of operations for measuring the concentration of progesterone was repeated 10 times, and the average value of the measured values of progesterone was obtained. Further, the measurement reproducibility was calculated based on the measured value. The results are shown in Table 1.

表１から明らかなように、実施例１，２、比較例１は、含有されるマンニトールの絶対量及びＢＳＡの絶対量はそれぞれ同一である。しかしながら、得られた凍結乾燥ケーキの見かけ体積が異なるため、ＢＳＡ凍結乾燥濃度やマンニトール凍結乾燥濃度は異なっている。それを一定量の分注水で溶解したので、得られた検体希釈液の濃度は同一のはずだが、凍結乾燥濃度によって溶解のしやすさが異なり、比較例１では飴状となった部分が固まって溶解しにくくなったり、溶解しても試薬容器内で均一にならず濃度勾配が生じたりして、測定の間差が大きくなり、ＣＶ１２．１％と測定値に大きなばらつきを生じたと考えられる。これに対し、実施例１，２では、ＣＶ４．０％、３．６％と測定再現性が良く、これはＢＳＡとマンニトールとがそれぞれ適切な凍結乾燥濃度で凍結乾燥状態の検体希釈試薬に含有されていたため、溶解性に優れていたと考えられる。 As is clear from Table 1, the absolute amounts of mannitol and BSA contained in Examples 1 and 2 and Comparative Example 1 are the same. However, since the apparent volumes of the obtained freeze-dried cakes are different, the BSA freeze-dried concentration and the mannitol freeze-dried concentration are different. Since it was dissolved in a fixed amount of dispensed water, the concentration of the obtained sample diluent should be the same, but the ease of dissolution differs depending on the freeze-dried concentration, and in Comparative Example 1, the candy-like portion solidified. It is thought that it became difficult to dissolve it, or even if it was dissolved, it was not uniform in the reagent container and a concentration gradient occurred, the difference between the measurements became large, and there was a large variation in the measured value with CV 12.1%. .. On the other hand, in Examples 1 and 2, the measurement reproducibility was good with CV of 4.0% and 3.6%, which contained BSA and mannitol in the freeze-dried sample diluting reagent at appropriate freeze-drying concentrations. Therefore, it is considered that the solubility was excellent.

Claims

Characterized in that it contains a lyophilized concentration 30.0~90.0mg / cm ³ sugar alcohols, and proteins lyophilized concentration 30.0~100.0mg / cm ^3, sample dilution reagent lyophilised.

The sample dilution reagent according to claim 1, wherein the sugar alcohol is mannitol.

The sample dilution reagent according to claim 1 or 2, wherein the protein is bovine serum albumin.