JP6583682B2

JP6583682B2 - カチオン性脂質の製造方法

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Publication number: JP6583682B2
Application number: JP2015239062A
Authority: JP
Inventors: 太田雅己; 羽村健
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Current assignee: NOF Corp
Priority date: 2014-12-08
Filing date: 2015-12-08
Publication date: 2019-10-02
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Description

本発明は、カチオン性脂質の製造方法に関する。

核酸医薬品は次世代の医薬品として注目されているが、核酸を細胞内に効率良く導入するためには、キャリアが必要である。キャリアは大きく分けてウイルスキャリアと非ウイルスキャリアに分けられる。ウイルスキャリアは非ウイルスキャリアに比べて核酸の導入効率が高いが、毒性の問題を本質的に解決できない。そこで、ウイルスキャリアよりも導入効率は劣るものの、安全性が高い非ウイルスキャリアが注目されている。

非ウイルスキャリアには、カチオン性脂質やPEG脂質などからなる脂質膜を用いたキャリアやカチオン性ポリマーからなるミセルを用いたキャリアが報告されているが、脂質の組成によって機能を制御できる脂質膜を用いたキャリアの研究が、特に盛んに行われている。脂質膜に使用される脂質の中で、核酸の導入効率に最も影響を与えるのが、カチオン性脂質である。

カチオン性脂質は、一般的に一つの四級アンモニウム基と二本の疎水基を有している。代表的なカチオン性脂質としてはＮ−［１−（２，３−Ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍＣｈｌｏｒｉｄｅ（以下ＤＯＴＡＰ−Ｃｌ）とＮ−［１−（２，３−Ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍＣｈｌｏｒｉｄｅ（以下ＤＯＴＭＡ−Ｃｌ）が挙げられる。これらの脂質は、他の公知のカチオン性脂質と比較して、核酸の導入効率が高いため、最も汎用されているカチオン性脂質である。

ＤＯＴＡＰ−Ｃｌ、ＤＯＴＭＡ−Ｃｌは、ジメチルアミノプロパンジオールにオレオイル基もしくはオレイル基を導入した後、塩化メチルで四級化させることで得られる（非特許文献１）。しかしながら、塩化メチルは常温・大気圧下で気体であるため、オートクレーブのような高圧反応容器を使用しなければならない。さらに、塩化メチルは強毒性であるために、その取扱いや使用する装置に、安全上の特段の留意を要する難点がある。

上記の理由から、塩化メチルを使用しないＤＯＴＡＰ−Ｃｌ、ＤＯＴＭＡ−Ｃｌの製造方法が開発され、報告されている。非特許文献２では、ジメチルアミノプロパンジオールにオレオイル基を導入し、ヨウ化メチルを使用してＮ−［１−（２，３−Ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍＩｏｄｉｄｅ（以下ＤＯＴＡＰ−Ｉ）を合成した後、イオン交換樹脂を充填したカラムでＤＯＴＡＰ−Ｉのヨウ化物イオンを塩化物イオンに交換している。

しかし、非特許文献２記載の方法は、得られる脂質に対して大量のイオン交換樹脂が必要となる。さらに、効率的なアニオン交換を行うには溶液のＤＯＴＡＰ−Ｉの濃度を希薄にする必要があるため、ＤＯＴＡＰ−Ｉを大量の溶媒に溶解しなければならず、製造スケールが非常に大きくなる。しかも、イオン交換カラムでのアニオン交換後は大量の溶媒を除去しなければならず、非効率的であり工業的に好ましくない。

そこで、特許文献１では、Ｎ−［１−（２，３−Ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍＩｏｄｉｄｅやＮ−［１−（２，３−Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍＩｏｄｉｄｅのジクロロメタン溶液に、1Ｎ塩酸のメタノール溶液を加えて攪拌して、食塩水による水洗を行うという操作を４回繰り返すことでアニオン交換を行っている。しかし、この方法はアニオン交換率が低い上に、ＤＯＴＡＰ−Ｃｌのように分子内にエステル結合を有している場合には酸による加水分解で脂肪酸等の不純物が生じるため、医薬品として求められる純度のものを得るためには、カラム精製等の非効率的な精製工程が必要となる。

Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８４，７４１３（１９８７）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２９９，２８１（１９９８）

特開２０１４−１３２０１４号公報

以上述べてきたように、これまでに報告されている前記カチオン性脂質の製造方法は、特殊な製造設備を要する製法か、もしくはイオン交換カラムをはじめとする極めて非効率的な製法であり、高純度なカチオン性脂質の効率的な工業的製法は確立されていなかった。

本発明の課題は、特殊な設備を必要とせず、高純度なカチオン性脂質を効率的に得ることができる、工業的なカチオン性脂質の製造方法を提供することである。

一般的な平衡反応では、生成物を反応系外へ排出することで、平衡を一方へ傾けることができる。例えば、種々のハロゲン化アルキルからヨウ化アルキルを得るフィンケルシュタイン反応では、副生するナトリウム塩が析出することで反応が進行する。

そこで、本発明者らは、アニオン交換が平衡反応であることに着目し鋭意研究を重ねた結果、式（１）で表されるカチオン性脂質と任意のアニオンを有するテトラアルキルアンモニウム塩を有機溶媒中で反応させると、アニオン交換により生じたヨウ化テトラアルキルアンモニウムが析出することで効率的に反応が進行し、さらにその後、ヨウ化テトラアルキルアンモニウムをろ別してろ液を濃縮することで、アニオン交換率をより高められることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明に係るカチオン性脂質の製造方法は、式（１）で表されるカチオン性脂質と、Ｘ⁻を有するテトラアルキルアンモニウム塩とを有機溶媒中で混合し、析出したヨウ化テトラアルキルアンモニウムをろ別してろ液を得た後、前記ろ液を濃縮することで少なくともヨウ化テトラアルキルアンモニウムを析出させ、式（２）で表されるカチオン性脂質を得ることを特徴とする。

（式（１）において、
Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ、炭素数1〜６の炭化水素基を示し、
Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ、炭素数１０〜２２のアシル基または炭素数１０〜２２の炭化水素基を示す。）

（式（２）において、
Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ、炭素数1〜６の炭化水素基を示し、
Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ、炭素数１０〜２２のアシル基または炭素数１０〜２２の炭化水素基を示し、
Ｘ⁻は、塩化物イオン、臭化物イオン、フッ化物イオン、酢酸イオン、メタンスルホン酸イオン、またはｐ−トルエンスルホン酸イオンを示す。）

本発明は、特殊な設備を必要とせず、高純度なカチオン性脂質を効率的に得ることができるため、工業的なカチオン性脂質の製造方法として極めて有用である。

図１は、実施例１で得られたＤＯＴＡＰ−Ｃｌの滴定結果である。図２は、実施例２で得られたＤＯＴＭＡ−Ｃｌの滴定結果である。図３は、比較例１で得られたＤＯＴＡＰ−Ｃｌの滴定結果である。

式（１）および式（２）におけるＲ^１〜Ｒ^３は、炭素数１〜６の炭化水素基を表す。Ｒ^１〜Ｒ^３は、直鎖状であってもよく、分岐状であってもよく、環状であってもよく、Ｒ^１、Ｒ^２が相互に結合し環を形成していてもよい。また、Ｒ^１〜Ｒ^３は、同一であってもそれぞれ異なっていてもよい。該炭化水素基の炭素数は、好ましくは１〜３であり、より好ましくは１である。

Ｒ^１〜Ｒ^３を構成する炭素数１〜６の炭化水素基としては、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔ−ペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、２−メチルブチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、２，２−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、フェニル基等があげられる。Ｒ^１とＲ^２が相互に結合し環を形成している場合は、テトラメチレン基、ペンタメチレン基等が挙げられる。Ｒ^１〜Ｒ^３は、好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基であり、より好ましくはメチル基である。

式（１）および式（２）におけるＲ^４、Ｒ^５は、炭素数１０〜２２のアシル基もしくは炭素数１０〜２２の炭化水素基を表し、直鎖状であっても分岐状であっても、飽和であっても不飽和であってもよく、同一であってもよく、それぞれ異なっていてもよい。該アシル基もしくは炭化水素基の炭素数は、好ましくは１４以上であり、また好ましくは１８以下であり、より好ましくは１８である。

Ｒ^４、Ｒ^５を構成する炭素数１０〜２２のアシル基としては、デカノイル基、ウンデカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、テトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基、ヘプタデカノイル基、オクタデカノイル基、ノナデカノイル基、イコサノイル基、ヘンイコサノイル基、ドコサノイル基、デセノイル基、ウンデセノイル基、ドデセノイル基、トリデセノイル基、テトラデセノイル基、ペンタデセノイル基、ヘキサデセノイル基、ヘプタデセノイル基、オクタデセノイル基、ノナデセノイル基、イコセノイル基、ヘンイコセノイル基、ドコセノイル基、デカジエノイル基、ウンデカジエノイル基、ドデカジエノイル基、トリデカジエノイル基、テトラデカジエノイル基、ペンタデカジエノイル基、ヘキサデカジエノイル基、ヘプタデカジエノイル基、オクタデカジエノイル基、ノナデカジエノイル基、イコサジエノイル基、ヘンイコサジエノイル基、ドコサジエノイル基、オクタデカトリエノイル基、イコサトリエノイル基、イコサテトラエノイル基、イコサペンタエノイル基、ドコサヘキサエノイル基、イソステアリル基、テトラメチルヘキサデセニル基（フィトール残基）等が挙げられるが、好ましくはテトラデカノイル基、テトラデセノイル基、ヘキサデカノイル基、ヘキサデセノイル基、オクタデカノイル基、オクタデセノイル基、オクタデカジエノイル基であり、より好ましくはオクタデカノイル基、オクタデセノイル基、オクタデカジエノイル基である。

Ｒ^４、Ｒ^５を構成する炭素数１０〜２２の炭化水素基としては、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基、ヘンイコシル基、ドコシル基、デセニル基、ウンデセニル基、ドデセニル基、トリデセニル基、テトラデセニル基、ペンタデセニル基、ヘキサデセニル基、ヘプタデセニル基、オクタデセニル基、ノナデセニル基、イコセニル基、ヘンイコセニル基、ドコセニル基、デカジエニル基、ウンデカジエニル基、ドデカジエニル基、トリデカジエニル基、テトラデカジエニル基、ペンタデカジエニル基、ヘキサデカジエニル基、ヘプタデカジエニル基、オクタデカジエニル基、ノナデカジエニル基、イコサジエニル基、ヘンイコサジエニル基、ドコサジエニル基、オクタデカトリエニル基、イコサトリエニル基、イコサテトラエニル基、イコサペンタエニル基、ドコサヘキサエニル基、イソステアリル基、テトラメチルヘキサデセニル基（フィトール残基）等が挙げられるが、好ましくはテトラデシル基、テトラデセニル基、ヘキサデシル基、ヘキサデセニル基、オクタデシル基、オクタデセニル基、オクタデカジエニル基であり、より好ましくはオクタデシル基、オクタデセニル基、オクタデカジエニル基である。

式（２）におけるＸ⁻は、ヨウ化物イオン以外のハロゲン化物イオン、カルボキシレートイオン、または有機スルホネートイオンを表す。具体的には塩化物イオン、臭化物イオン、フッ化物イオン、酢酸イオン、メタンスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン等が挙げられるが、好ましくは塩化物イオン、メタンスルホン酸イオンであり、より好ましくは塩化物イオンである。

式（２）で表されるカチオン性脂質は、式（１）で表されるカチオン性脂質と、Ｘ⁻を有するテトラアルキルアンモニウム塩とを有機溶媒中で混合し、アニオン交換を行うことによって得られる。アニオン交換は平衡反応であり、交換によって副生させた難溶性のヨウ化テトラアルキルアンモニウムが析出することによって、系の平衡を、式（２）で表されるカチオン性脂質が生成する側に傾かせる。Ｘ⁻を有するテトラアルキルアンモニウム塩のＸ⁻は、式（２）で表されるカチオン性脂質のＸ⁻と同じである。

本製造方法のアニオン交換の工程で使用するＸ⁻を有するテトラアルキルアンモニウム塩としては、結合しているアルキル基の炭素数が大きすぎると、副生するヨウ化テトラアルキルアンモニウムが反応で使用する有機溶媒に溶解し易くなることで、平衡が傾き難くなるために、式（２）で表されるカチオン性脂質の生成量が低下する。このため、該テトラアルキルアンモニウム塩のアルキル基の炭素数は１〜４であり、好ましくは１〜２であり、より好ましくは１である。

Ｘ⁻を有するテトラアルキルアンモニウム塩としては、塩化テトラメチルアンモニウム、臭化テトラメチルアンモニウム、フッ化テトラメチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウムアセテート、テトラメチルアンモニウムメタンスルホネート、テトラメチルアンモニウムｐ−トルエンスルホネート、塩化テトラエチルアンモニウム、臭化テトラエチルアンモニウム、フッ化テトラエチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウムアセテート、テトラエチルアンモニウムメタンスルホネート、テトラエチルアンモニウムｐ−トルエンスルホネート、塩化テトラプロピルアンモニウム、臭化テトラプロピルアンモニウム、フッ化テトラプロピルアンモニウム、テトラプロピルアンモニウムアセテート、テトラプロピルアンモニウムメタンスルホネート、テトラプロピルアンモニウムｐ−トルエンスルホネート、塩化テトラブチルアンモニウム、臭化テトラブチルアンモニウム、フッ化テトラブチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウムアセテート、テトラブチルアンモニウムメタンスルホネート、テトラブチルアンモニウムｐ−トルエンスルホネート等が挙げられるが、好ましくは塩化テトラメチルアンモニウム、臭化テトラメチルアンモニウム、フッ化テトラメチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウムアセテート、テトラメチルアンモニウムメタンスルホネート、テトラメチルアンモニウムｐ−トルエンスルホネート、塩化テトラエチルアンモニウム、臭化テトラエチルアンモニウム、フッ化テトラエチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウムアセテート、テトラエチルアンモニウムメタンスルホネート、テトラエチルアンモニウムｐ−トルエンスルホネートであり、より好ましくは塩化テトラメチルアンモニウム、臭化テトラメチルアンモニウム、フッ化テトラメチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウムメタンスルホネート、テトラメチルアンモニウムｐ−トルエンスルホネートである。

Ｘ⁻を有するテトラアルキルアンモニウム塩の使用量は、少なすぎると、式（２）で表されるカチオン性脂質の収率が低下する。多すぎるとＸ⁻を有するテトラアルキルアンモニウム塩を溶解するための溶媒量が増加し、生産性が低下するため好ましくない。よって、Ｘ⁻を有するテトラアルキルアンモニウム塩の使用量は、式（１）で表されるカチオン性脂質に対して１．５〜１０．０当量が好ましく、２．０〜５．０当量がより好ましい。

本製造方法のアニオン交換の工程で使用する有機溶媒は、式（１）で表されるカチオン性脂質やテトラアルキルアンモニウム塩のイオンの解離度を高める目的からプロトン性極性溶媒が好ましい。具体的には、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等の低級アルコールが好ましく、エタノールがより好ましい。

本製造方法のアニオン交換の工程で使用する有機溶媒の使用量は、少なすぎると攪拌が困難になり、多すぎると生産性が低下するため好ましくない。有機溶媒の使用量は、具体的には、式（１）で表されるカチオン性脂質に対して５〜３０重量倍が好ましく、１０〜２０重量倍がより好ましい。

本製造方法における反応温度は、式（１）で表されるカチオン性脂質とＸ⁻を有するテトラアルキルアンモニウム塩が有機溶媒に溶解しうる温度であれば特に限定されないが、一般的には０〜１２０℃であり、好ましくは１０〜６０℃である。

本製造方法では、式（１）で表されるカチオン性脂質とＸ⁻を有するテトラアルキルアンモニウム塩を有機溶媒中で反応させた後、析出しているヨウ化テトラアルキルアンモニウムをろ別し、ろ液をエバポレーターで濃縮することで、ろ液中に溶解しているヨウ化テトラアルキルアンモニウムを析出させ、平衡を式（２）で表されるカチオン性脂質の生成系へ傾け、式（１）で表されるカチオン性脂質の残存量をさらに低減することができる。ろ液の濃縮が不十分で、濃縮物中に溶媒が大量に残存していると、式（１）で表されるカチオン性脂質が残存し、式（２）で表されるカチオン性脂質の純度が低下する。よって濃縮物の重量としては、式（１）で表されるカチオン性脂質の仕込み量の２重量倍以下が好ましく、１．６重量倍以下がより好ましい。

ろ液の濃縮物には、式（２）で表されるカチオン性脂質の他に、過剰に使用したＸ⁻を有するテトラアルキルアンモニウム塩が含まれている。これを除去するためには、Ｘ⁻を有するテトラアルキルアンモニウム塩が溶解し難い非プロトン性溶媒に濃縮物を分散させ、不溶物をろ別する。このろ別された不溶物中には、Ｘ⁻を有するテトラアルキルアンモニウム塩とヨウ化テトラアルキルアンモニウムとが含まれている。次いで、このろ液を脱溶剤することで、容易に高純度の式（２）で表されるカチオン性脂質を得ることができる。使用できる非プロトン性溶媒としてはアセトン、アセトニトリル、メチル−ｔ−ブチルエーテル、酢酸エチル、クロロホルム、ヘキサン等が挙げられるが、好ましくはアセトン、酢酸エチルである。

非プロトン性溶媒の使用量としては、少なすぎると攪拌が困難になり、多すぎると生産性が低下するため好ましくない。非プロトン性溶媒の使用量は、具体的には、式（１）で表されるカチオン性脂質に対して５〜３０重量倍が好ましく、１０〜２０重量倍がより好ましい。

式（１）で表されるカチオン性脂質は、式（３）で表される化合物の、ヨウ化アルキルによる四級化によって得られる。

（式（３）中のＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、Ｒ^５は式（１）、式（２）と同じである。）

ヨウ化アルキルの使用量は、少なすぎると反応が完結せず、多すぎると生産性が低下するため好ましくない。よって、ヨウ化アルキルの使用量は、式（３）で表される化合物に対して１．１〜３．０当量が好ましく、１．２〜２．０当量がより好ましい。

四級化の際は溶媒を使用することができる。使用される溶媒としては、式（３）で表される化合物とヨウ化アルキルが溶解し、反応を阻害しないものであれば、特に限定されない。
四級化の際の溶媒の使用量は、少なすぎると攪拌が困難になり、多すぎると生産性が低下するため好ましくない。よって溶媒の使用量は、式（３）で表される化合物に対して５〜３０重量倍が好ましく、８〜２０重量倍がより好ましい。

四級化の反応温度は、低すぎると反応が進行せず、高すぎると副反応が起き目的物の収率が低下するため好ましくない。よって、四級化の反応温度は、０〜１００℃が好ましく、２０〜７０℃がより好ましい。

式（３）で表される化合物は、３−（ジアルキルアミノ）−１，２−プロパンジオールと、脂肪酸とのエステル化、もしくは脱離基を有する炭化水素とのエーテル化によって得られる。３−（ジアルキルアミノ）−１，２−プロパンジオールは適宜合成してもよいし、市販されているものを用いてもよい。市販されている３−（ジアルキルアミノ）−１，２−プロパンジオールとしては、３−（ジメチルアミノ）−１，２−プロパンジオール、３−（ジエチルアミノ）−１，２−プロパンジオール、３−（ジプロピルアミノ）−１，２−プロパンジオール、３−ピロリジノ−１，２−プロパンジオール、３−ピペリジノ−１，２−プロパンジオール、３−（ジフェニルアミノ）−１，２−プロパンジオール等が挙げられるが、好ましくは３−（ジメチルアミノ）−１，２−プロパンジオール、３−（ジエチルアミノ）−１，２−プロパンジオール、３−（ジプロピルアミノ）−１，２−プロパンジオールであり、より好ましくは３−（ジメチルアミノ）−１，２−プロパンジオールである。

エステル化で使用する脂肪酸の量は、多すぎると脂肪酸が残存し、目的物純度が低下してしまう。少なすぎると反応がモノエステル体で停止してしまい、目的物純度が低下してしまう。よって、脂肪酸の使用量は３−（ジアルキルアミノ）−１，２−プロパンジオールに対して１．９〜２．５当量が好ましく、２．０〜２．４当量がより好ましい。

エステル化には縮合剤を使用してもよい。縮合剤としてはカルボジイミド系縮合剤、ウロニウム系縮合剤、ホスホニウム系縮合剤などが使用できるが、反応性と入手性の高さからカルボジイミド系縮合剤が好ましい。カルボジイミド系縮合剤としては、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩等が挙げられるが、反応後の除去の簡便さから１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩が好ましい。

エステル化で使用する縮合剤の量は、多すぎると中間体である酸無水物の生成を阻害する。少なすぎると原料が残存し、収率が低下する。よって縮合剤の使用量は３−（ジアルキルアミノ）−１，２−プロパンジオールに対して２．０〜３．０当量が好ましく、２．２〜２．６当量がより好ましい。

エステル化で使用する溶媒としては、反応効率を高めて、副生成物の生成を抑制できる観点から原料の溶解度が高いものが好ましい。また、縮合剤として１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を使用した場合、副生成物の一つであるウレアが水洗で除去可能であることから、水と相溶しないものが好ましい。具体的にはクロロホルム、ジクロロメタン等が好ましい。

エステル化で使用する溶媒の量は、多すぎると生産性が低下する。少なすぎると反応溶液の粘度が上昇し攪拌が困難になる。よって、３−（ジアルキルアミノ）−１，２−プロパンジオールに対して３０〜１２０重量倍が好ましく、５０〜１００重量倍がより好ましい。

エステル化の反応温度は、低すぎると反応が進行せず、高すぎるとＮ−アシルウレアが副生し、収率が低下する。エステル化の反応温度は、具体的には、０〜４０℃が好ましく、１０〜３０℃がより好ましい。

エーテル化で使用する脱離基を有する炭化水素の使用量は、多すぎると脱離基を有する炭化水素が残存し、目的物純度が低下してしまう。少なすぎると反応がモノエーテル体で停止してしまい、目的物純度が低下してしまう。よって、脱離基を有する炭化水素の使用量は３−（ジアルキルアミノ）−１，２−プロパンジオールに対して１．９〜３．０当量が好ましく、２．０〜２．５当量がより好ましい。

エーテル化には触媒として塩基を使用する。塩基としては水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水素化ナトリウム、t-ブトキシカリウムなどが使用できる。使用量は少なすぎると反応が進行せず、多すぎると生産性が低下するため好ましくない。よって、塩基の使用量は、３−（ジアルキルアミノ）−１，２−プロパンジオールに対して２．０〜１５．０当量が好ましく、５．０〜１０．０当量がより好ましい。

エーテル化で使用する溶媒としては、塩基に対して安定で水と相溶しないものが好ましい。具体的にはヘキサン、トルエンが好ましく、ヘキサンがより好ましい。

エーテル化の反応温度としては、低すぎると反応が進行せず、高すぎると副反応が進行し、目的物の収量が低下するため好ましくない。具体的には４０〜１２０℃が好ましく、６０〜１００℃がより好ましい。

（ヨウ化物イオン量と塩化物イオン量の分析方法）
本製造方法によって得られた式（２）で表されるカチオン性脂質中のヨウ化物イオン量と塩化物イオン量は、例えば電極として銀／塩化銀電極を用い、滴定液として硝酸銀を用いた電位差滴定法によって確認することができる。具体的には、式（２）で表されるカチオン性脂質約１ｇをエタノール１００ｍｌに溶解する。その溶液に銀／塩化銀電極を浸して、スターラーで攪拌しながら硝酸銀水溶液（Ｎ／１００、Ｎ／１０）で滴定し、電位差を測定する。滴定量に対する電位差をプロットして、最初に表れる変曲点（変曲点１）の滴定量からヨウ化物イオン量を、二つ目の変曲点（変曲点２）の滴定量と変曲点１の滴定量の差から塩化物イオン量を求めることができる。

（製造例１）
Ｎ−［１−（２，３−Ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（以下ＤＯＤＡＰ）の製造
３−（ジメチルアミノ）−１，２−プロパンジオール２．００ｇ（１６．７８ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社品）、オレイン酸９．４８ｇ（３３．５６ｍｍｏｌ、日油株式会社品「ＥＸＴＲＡＯＬＥＩＮ９９」）、４−ジメチルアミノピリジン０．４１ｇ（３．３６ｍｍｏｌ、広栄化学工業株式会社品）をクロロホルム１２０ｇに溶解した。そこに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩７．７２ｇ（４０．２７ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社品）を加えて、２０〜３０℃で攪拌した。１時間後、イオン交換水１２０ｇと２５ｗｔ％食塩水１２０ｇで水洗し、有機層に無水硫酸マグネシウム３．０ｇを加えて攪拌した。硫酸マグネシウムをろ別し、ろ液をエバポレーターで脱溶剤してＤＯＤＡＰを得た（収量：１１．１２ｇ、１７．１６ｍｍｏｌ）。

（製造例２）
Ｎ−［１−（２，３−Ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍＩｏｄｉｄｅ（以下ＤＯＴＡＰ−Ｉ）の製造
ＤＯＤＡＰ３．００ｇ（４．６３ｍｍｏｌ）をアセトン３０ｇに溶解し、そこに、ヨウ化メチル０．９９ｇ（６．９４ｍｍｏｌ、関東化学株式会社品）を加え、２０〜３０℃で攪拌した。５時間後、析出している結晶をろ別、乾燥してＤＯＴＡＰ−Ｉを得た(収量：２．９４ｇ、３．７２ｍｍｏｌ)。

（製造例３）
Ｏｌｅｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（以下Ｏｌｅ−Ｍｓ）の製造
オレイルアルコール２９０ｇ（１．０８ｍｏｌ、日油株式会社品「ＮＯＦＡＢＬＥ（登録商標）ＡＯ−９９」）を脱水トルエン１４５０ｇに溶解し、５〜１０℃まで冷却した。そこにトリエチルアミン１３１ｇ（１．３０ｍｏｌ、関東化学株式会社品）を加えて５〜１０℃で１０分攪拌した後、塩化メタンスルホニル１３６ｇ（１．１９ｍｏｌ、関東化学株式会社品）をゆっくり滴下した。５〜１５℃で１時間攪拌した後、析出しているトリエチルアミン塩酸塩をろ別し、ろ液をイオン交換水５８０ｇで２回水洗した。有機層に無水硫酸マグネシウム８７ｇを加えて攪拌した後、ろ過し、ろ液をエバポレーターで脱溶剤してＯｌｅ−Ｍｓを得た（収量：３３５ｇ、０．９７ｍｏｌ）。

（製造例４）
Ｎ−［１−（２，３−Ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（以下ＤＯＤＭＡ）の製造
水酸化カリウム２３３ｇ（４．１５ｍｏｌ、関東化学株式会社品）をヘキサン１１６８ｇに加え、攪拌しながら３−（ジメチルアミノ）１，２−プロパンジオール５５ｇ（０．４６ｍｏｌ、東京化成工業株式会社品）を加えた。さらに、Ｏｌｅ−Ｍｓ３２０ｇ（０．９２ｍｏｌ）を加え、３８〜４２℃で攪拌した。７時間後、反応液を１５℃まで冷却し、蒸留水６４０ｇとアセトニトリル２５６ｇで３回水洗した。さらにアセトニトリル７６８ｇで４回抽出洗浄した後、上層をエバポレーターで脱溶剤して黄色液体を得た。この黄色液体をシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝９５／５〜７０／３０（ｖ／ｖ））によって精製し、ＤＯＤＭＡを得た（収量：１５７ｇ、０．２５ｍｏｌ）。

（製造例５）
Ｎ−［１−（２，３−Ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍＩｏｄｉｄｅ（以下ＤＯＴＭＡ−Ｉ）の製造
ＤＯＤＭＡ３．００ｇ（４．８４ｍｍｏｌ）をアセトン３０ｇに溶解し、そこに、ヨウ化メチル１．０３ｇ（７．２６ｍｍｏｌ）を加え、２０〜３０℃で攪拌した。３時間後、反応溶液をエバポレーターで脱溶剤し、ＤＯＴＭＡ−Ｉを得た(収量：３．７０ｇ、４．８６ｍｍｏｌ)。

（実施例１）
Ｎ−［１−（２，３−Ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍＣｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＯＴＡＰ−Ｃｌ）の製造
テトラメチルアンモニウムクロリド１．３９ｇ（１２．６６ｍｍｏｌ、関東化学株式会社品）をエタノール２０ｇに溶解し、ＤＯＴＡＰ−Ｉ２．０ｇ（２．５３ｍｍｏｌ）を加え、２０〜３０℃で攪拌した。１時間後、析出している結晶をろ別し、ろ液をエバポレーターで濃縮した。濃縮物に酢酸エチル２０ｇを加え、２０〜３０℃で攪拌した。１時間後、不溶物をろ別し、ろ液を脱溶剤してＤＯＴＡＰ−Ｃｌを得た（収量：１．６５ｇ、２．３６ｍｍｏｌ）。

（実施例２）
Ｎ−［１−（２，３−Ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍＣｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＯＴＭＡ−Ｃｌ）の製造
テトラメチルアンモニウムクロリド１．４４ｇ（１３．１２ｍｍｏｌ）をエタノール２０ｇに溶解し、ＤＯＴＭＡ−Ｉ２．０ｇ（２．６３ｍｍｏｌ）を加え２０〜３０℃で攪拌した。１時間後、析出している結晶をろ別し、ろ液をエバポレーターで濃縮した。濃縮物に酢酸エチル２０ｇを加え、２０〜３０℃で攪拌した。１時間後、不溶物をろ別し、ろ液を脱溶剤してＤＯＴＭＡ−Ｃｌを得た（収量：１．６５ｇ、２．３６ｍｍｏｌ）。

（比較例１）
ＤＯＴＡＰ−Ｉ１．５０ｇ（１．９０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン３５ｍｌに溶解した。そこに、１Ｎ塩酸のメタノール溶液を８ｍｌ加え、２０〜３０℃で攪拌した。さらに２５ｗｔ％食塩水を１２ｍｌ加え、２０〜３０℃で攪拌した後、有機層を分離回収した。残った水層にジクロロメタン４ｍｌを加え攪拌し、回収した有機層を先の有機層に混合した。この１Ｎ塩酸のメタノール溶液を加えてからの一連の操作を４回繰り返した後、回収した有機層を２５ｗｔ％食塩水１８ｍｌで水洗し、無水硫酸ナトリウム５．０ｇを加え攪拌した後、ろ過、脱溶剤してＤＯＴＡＰ−Ｃｌの粗体を得た。粗体を、シリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝１００／０〜７５／２５（ｖ／ｖ））で精製し、脂肪酸等の副生物を除去してＤＯＴＡＰ−Ｃｌを得た（収量：１．２６ｇ、１．８０ｍｍｏｌ）。

（ＤＯＴＡＰ−ＣｌまたはＤＯＴＭＡ−Ｃｌ中のヨウ化物イオン量と塩化物イオン量の分析）
実施例または比較例で得られたＤＯＴＡＰ−ＣｌまたはＤＯＴＭＡ−Ｃｌ約１ｇをエタノール１００ｍｌに溶解した。その溶液に銀／塩化銀電極を浸して、スターラーで攪拌しながら硝酸銀水溶液（Ｎ／１００、Ｎ／１０）で滴定し、電位差を測定した。滴定量に対する電位差をプロットして、変曲点１の滴定量からヨウ化物イオン量を、変曲点２の滴定量と変曲点１の滴定量の差から塩化物イオン量を求めた。

ＤＯＴＡＰ−Ｃｌの分析結果をプロットした(図１、２、３)。図１は、実施例１で得られたＤＯＴＡＰ−Ｃｌの滴定結果である。図２は、実施例２で得られたＤＯＴＭＡ−Ｃｌの滴定結果である。図３は、比較例１で得られたＤＯＴＡＰ−Ｃｌの滴定結果である。

実施例１、２で得られたＤＯＴＡＰ−Ｃｌ、ＤＯＴＭＡ−Ｃｌについては、滴定開始直後の変曲点1の滴定量（０．００１ｍｍｏｌ未満）から、ヨウ化物イオンの量が極めて少ないことが分かった。さらに変曲点2の滴定量と変曲点１の滴定量の差から、塩化物イオンの量が理論値とほぼ同量含まれていることが分かり、イオン交換が定量的に進行し、ＤＯＴＡＰ−Ｃｌ、またはＤＯＴＭＡ−Ｃｌが得られていることが確認できた。塩化物イオン純度（ヨウ化物イオンと塩化物イオンの和に対する塩化物イオンの割合）は９９ｍｏｌ％以上であった。

一方、比較例１で得られたＤＯＴＡＰ−Ｃｌについては、ヨウ化物イオンが０．１８１ｍｍｏｌ含まれており、塩化物イオン純度は９０ｍｏｌ％であった（表１）。以上の結果から、本製造方法は式（２）で表されるカチオン性脂質の製造方法として有用であることが確認された。

Claims

式（１）で表されるカチオン性脂質と、Ｘ⁻を有するテトラアルキルアンモニウム塩とを有機溶媒中で混合し、析出したヨウ化テトラアルキルアンモニウムをろ別してろ液を得た後、前記ろ液を濃縮することで少なくともヨウ化テトラアルキルアンモニウムを析出させ、式（２）で表されるカチオン性脂質を得ることを特徴とする、カチオン性脂質の製造方法。

（式（１）において、
Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ、炭素数1〜６の炭化水素基を示し、
Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ、炭素数１０〜２２のアシル基または炭素数１０〜２２の炭化水素基を示す。）

（式（２）において、
Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ、炭素数1〜６の炭化水素基を示し、
Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ、炭素数１０〜２２のアシル基または炭素数１０〜２２の炭化水素基を示し、
Ｘ⁻は、塩化物イオン、臭化物イオン、フッ化物イオン、酢酸イオン、メタンスルホン酸イオン、またはｐ−トルエンスルホン酸イオンを示す。）
前記テトラアルキルアンモニウム塩がテトラメチルアンモニウム塩である、請求項１記載の方法。
前記式（２）において、Ｘ⁻が塩化物イオンである、請求項１または２記載の方法。