JP6380886B2 - Method for producing nucleoside compound - Google Patents
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Description
本発明はヌクレオシド化合物の製造方法およびヌクレオシド化合物含有組成物に関する。 The present invention relates to a method for producing a nucleoside compound and a nucleoside compound-containing composition.
２’−デオキシリボヌクレオシドおよびリボヌクレオシドは、リン酸と結合して、それぞれＤＮＡおよびＲＮＡの核酸となり得る重要な構成成分であり、医薬品開発分野等においても需要の高い化合物である。しかし、ヌクレオシドの化学的な合成は非常に効率が悪いため、これらの分子を工業的に得ようとした場合、一般的に、サケなどの卵巣からＤＮＡおよびＲＮＡを抽出し、これを分解、精製してヌクレオシドを得ていた。
この方法では、天然のＤＮＡおよびＲＮＡに含まれる各種ヌクレオシドの全てを含む混合物が必要不必要によらず得られ、例えば２’−デオキシリボヌクレオシド由来の場合は、デオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシグアノジン（ｄＧ）、デオキシシチジン（ｄＣ）およびチミジン（ｄＴ）が、リボヌクレオシド由来の場合は、アデノシン（Ａ）、グアノジン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）およびウリジン（Ｕ）が含まれる混合物が得られる。しかしながら、その誘導体が抗がん剤、抗ＨＩＶ剤に用いられるウリジンのように、特定のヌクレオシド化合物のみが選択的に又は高い割合で得られる方法の開発も求められていた。
従来、ヌクレオシド化合物を合成する方法として、イノシン又はデオキシイノシン（原料ヌクレオシド化合物）と、ピリミジン塩基又はプリン塩基とを、リン酸若しくはリン酸塩存在下の水溶液中において、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ又はピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼによって塩基交換反応させる方法が開示されていた（特許文献１）。また、ピリミジンヌクレオシド化合物（原料ヌクレオシド化合物）と、プリン塩基とを、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼおよびプリンヌクレオシドホスホリラーゼを用いて交換反応させるプリンヌクレオシド化合物の製造方法も開発されていた（特許文献２）。
2′-Deoxyribonucleoside and ribonucleoside are important components that can be combined with phosphoric acid to become DNA and RNA nucleic acids, respectively, and are highly demanded compounds in the field of drug development. However, chemical synthesis of nucleosides is very inefficient, so when these molecules are to be obtained industrially, DNA and RNA are generally extracted from saliva and other ovaries, and then decomposed and purified. To obtain nucleosides.
In this method, a mixture containing all of the various nucleosides contained in natural DNA and RNA can be obtained without necessity. For example, when derived from 2′-deoxyribonucleoside, deoxyadenosine (dA), deoxyguanosine ( When dG), deoxycytidine (dC) and thymidine (dT) are derived from ribonucleosides, a mixture containing adenosine (A), guanidine (G), cytidine (C) and uridine (U) is obtained. However, there has been a demand for the development of a method in which only a specific nucleoside compound can be obtained selectively or at a high ratio, such as uridine used as an anticancer agent or anti-HIV agent.
Conventionally, as a method for synthesizing a nucleoside compound, inosine or deoxyinosine (raw nucleoside compound) and a pyrimidine base or a purine base are mixed with purine nucleoside phosphorylase or pyrimidine nucleoside phosphorylase in an aqueous solution in the presence of phosphoric acid or phosphate. A method of base exchange reaction has been disclosed (Patent Document 1). In addition, a method for producing a purine nucleoside compound in which a pyrimidine nucleoside compound (raw material nucleoside compound) and a purine base are exchanged using a pyrimidine nucleoside phosphorylase and a purine nucleoside phosphorylase has also been developed (Patent Document 2).
しかしながら、ホスホリラーゼの反応は可逆的であり、ホスホリラーゼを用いた製造方法で得られるのは、出発材料である原材料ヌクレオシド化合物と目的物のヌクレオシドである目的ヌクレオシド化合物の混合物である。これは上記のヌクレオシド化合物の製造方法においても同様であり、特許文献１および２では原材料ヌクレオシド化合物と目的ヌクレオシド化合物の分離については何ら検討されていない。
また、目的ヌクレオシド化合物の取得のために、目的ヌクレオシド化合物以外のヌクレオシドを各種デヒドロゲナーゼにより分解した場合にも、分解によって生産された塩基等の副生成物が生じるので、やはり副生成物と目的ヌクレオシド化合物との分離が課題となる。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いれば、目的ヌクレオシド化合物の分離が可能ではあるが、分取には長い時間を要し、また得られる量も微量であるため、目的ヌクレオシドの量産化には不適である。
However, the reaction of phosphorylase is reversible, and the production method using phosphorylase obtains a mixture of a raw material nucleoside compound that is a starting material and a target nucleoside compound that is a target nucleoside. This also applies to the above-described method for producing a nucleoside compound, and Patent Documents 1 and 2 do not discuss any separation of a raw material nucleoside compound and a target nucleoside compound.
In addition, when a nucleoside other than the target nucleoside compound is decomposed by various dehydrogenases in order to obtain the target nucleoside compound, a by-product such as a base produced by the decomposition is generated, so that the byproduct and the target nucleoside compound are also produced. Separation is a challenge.
Although the target nucleoside compound can be separated by using high performance liquid chromatography (HPLC), it takes a long time for fractionation, and the amount obtained is very small, so it is not suitable for mass production of the target nucleoside. It is.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、短時間で目的ヌクレオシド化合物を精製でき且つ量産可能なヌクレオシド化合物の製造方法の提供を課題とする。 This invention is made | formed in view of the said situation, and makes it a subject to provide the manufacturing method of the nucleoside compound which can refine | purify the target nucleoside compound in a short time and can be mass-produced.
本発明者らは、目的ヌクレオシド化合物が備えた目的塩基と担体親和性の異なるよう改変された担体親和性改変塩基を備えた担体親和性改変ヌクレオシド化合物を用い、塩基交換反応によって目的ヌクレオシド化合物を製造することで、当該反応系から目的ヌクレオシド化合物を短時間で且つ大量に精製可能となることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の通りである。 The present inventors produce a target nucleoside compound by a base exchange reaction using a carrier affinity modified nucleoside compound having a carrier affinity modified base modified to have a carrier affinity different from that of the target base provided in the target nucleoside compound. Thus, it was found that the target nucleoside compound can be purified from the reaction system in a short time and in large quantities, and the present invention was completed. That is, the present invention is as follows.
（１）置換基を有する塩基である担体親和性改変塩基を備えたことにより、担体との親和性が改変された、担体親和性改変ヌクレオシド化合物を用いて、前記担体親和性改変塩基の前記置換基とは異なる側鎖を有する目的塩基を備えた目的ヌクレオシド化合物を得る、ヌクレオシド化合物の製造方法であって、前記担体親和性改変塩基の前記置換基とは異なる側鎖を有する塩基を備え、原材料として用いられる、原材料ヌクレオシド化合物と、前記担体親和性改変塩基とを、リン酸イオンを含む水溶液中において、ヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換反応させて、前記担体親和性改変ヌクレオシド化合物を得る工程Ａと、前記担体親和性改変ヌクレオシド化合物と、前記目的塩基とを、リン酸イオンを含む水溶液中において、ヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換反応させて、前記目的ヌクレオシド化合物を得る工程Ｃと、を含むことを特徴とするヌクレオシド化合物の製造方法。
（２）前記工程Ｃの後に、前記担体親和性改変ヌクレオシド化合物又は前記目的ヌクレオシド化合物を担体に結合させて該担体親和性改変ヌクレオシド化合物又は前記目的ヌクレオシド化合物を前記水溶液中から分離させる工程Ｄを含む前記（１）に記載のヌクレオシド化合物の製造方法。
（３）前記工程Ａの後に、前記担体親和性改変ヌクレオシド化合物又は前記原材料ヌクレオシド化合物を担体に結合させて該担体親和性改変ヌクレオシド化合物又は前記原材料ヌクレオシド化合物を前記水溶液中から分離させる工程Ｂを含む前記（１）又は（２）に記載のヌクレオシド化合物の製造方法。
（４）前記原材料ヌクレオシド化合物の塩基、及び、前記目的ヌクレオシド化合物の前記目的塩基が、ウラシル、チミン又はそれらの誘導体のいずれかである前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載のヌクレオシド化合物の製造方法。
（５）前記工程Ａ又は工程Ｃにおいて用いられる前記ヌクレオシドホスホリラーゼが、チミジンホスホリラーゼである前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載のヌクレオシド化合物の製造方法。
（６）前記工程Ｃにおいて、前記担体親和性改変ヌクレオシド化合物と反応する前記目的ヌクレオシド化合物の目的塩基が、安定同位体標識又は放射性同位体標識された塩基である前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載のヌクレオシド化合物の製造方法。
(1) The substitution of the carrier affinity-modified base by using a carrier affinity-modified nucleoside compound, which has a carrier affinity-modified base that is a base having a substituent, and has a modified affinity with the carrier. A method for producing a nucleoside compound, which obtains a target nucleoside compound having a target base having a side chain different from the group, comprising a base having a side chain different from the substituent of the carrier affinity modified base, A base exchange reaction of a raw material nucleoside compound and the carrier affinity modified base with a nucleoside phosphorylase in an aqueous solution containing a phosphate ion to obtain the carrier affinity modified nucleoside compound; and The carrier affinity modified nucleoside compound and the target base are nucleated in an aqueous solution containing phosphate ions. By base exchange reaction by Sid phosphorylase method nucleoside compound characterized by comprising a step C to obtain the objective nucleoside compound.
(2) After the step C, the method includes a step D in which the carrier affinity modified nucleoside compound or the target nucleoside compound is bound to a carrier and the carrier affinity modified nucleoside compound or the target nucleoside compound is separated from the aqueous solution. The manufacturing method of the nucleoside compound as described in said (1) .
( 3 ) After the step A, the step includes the step B of binding the carrier affinity modified nucleoside compound or the raw material nucleoside compound to a carrier and separating the carrier affinity modified nucleoside compound or the raw material nucleoside compound from the aqueous solution. The manufacturing method of the nucleoside compound as described in said (1) or ( 2 ).
( 4 ) The base of the raw material nucleoside compound and the target base of the target nucleoside compound are any one of uracil, thymine, or derivatives thereof (1) to ( 3 ) A method for producing a nucleoside compound.
( 5 ) The method for producing a nucleoside compound according to any one of (1) to ( 4 ), wherein the nucleoside phosphorylase used in Step A or Step C is thymidine phosphorylase.
( 6 ) In the step C, the target base of the target nucleoside compound that reacts with the carrier affinity-modified nucleoside compound is a stable isotope-labeled or radioisotope-labeled base described in (1) to ( 5 ) above The manufacturing method of the nucleoside compound as described in any one .
本発明のヌクレオシド化合物の製造方法によれば、目的ヌクレオシド化合物を短時間で精製でき、且つ目的ヌクレオシド化合物を量産することが可能である。 According to the method for producing a nucleoside compound of the present invention, the target nucleoside compound can be purified in a short time, and the target nucleoside compound can be mass-produced.
《ヌクレオシド化合物の製造方法》 << Method for Producing Nucleoside Compound >>
本発明における「ヌクレオシド化合物」とはヌクレオシドホスホリラーゼの基質となり得る化合物であれば特に制限されず、ＤＮＡ、又はＲＮＡ等の天然核酸の構成要素であるリボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドの他、人工核酸の構成要素、ＰＮＡ、ＬＮＡ等の人工的に合成される人工核酸類似化合物の構成要素を挙げることができる。
具体的なリボヌクレオシドとしては、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、５−メチルウリジン、イノシン、５−フルオロウリジン、などが挙げられ、デオキシリボヌクレオシドとしては、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシシチジン、デオキシウリジン、５’ −デオキシウリジン、アジドチミジンなどが挙げられる。
The “nucleoside compound” in the present invention is not particularly limited as long as it is a compound that can serve as a substrate for nucleoside phosphorylase. In addition to ribonucleosides and deoxyribonucleosides that are constituents of natural nucleic acids such as DNA or RNA, constituents of artificial nucleic acids , Constituent elements of artificially synthesized nucleic acid analogs such as PNA and LNA.
Specific examples of ribonucleosides include adenosine, guanosine, uridine, cytidine, 5-methyluridine, inosine, 5-fluorouridine, and the like. Deoxyribonucleosides include deoxyadenosine, deoxyguanosine, thymidine, deoxycytidine, deoxy. Examples include uridine, 5′-deoxyuridine, azidothymidine and the like.
前記ヌクレオシド化合物の塩基は、ヌクレオシドホスホリラーゼの基質となり得る範囲において、−Ｆ、−Ｃｌ等のハロゲノ基、メチル基、ヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ３アルキル基、アルケン、アルキン等の長鎖置換基で修飾されていてもよく、具体的には、５−フルオロウラシル、５−クロロウラシル、５−エチニルウラシル、５−ビニルウラシル、５−ヘキサ−５−エン−ウラシル等の塩基であってもよい。 The base of the nucleoside compound is modified with a long-chain substituent such as a halogeno group such as -F or -Cl, a methyl group, a hydroxyl group, a C1-C3 alkyl group, an alkene or an alkyne within the range that can serve as a substrate for a nucleoside phosphorylase. Specifically, it may be a base such as 5-fluorouracil, 5-chlorouracil, 5-ethynyluracil, 5-vinyluracil, 5-hex-5-ene-uracil.
本発明においてヌクレオシドホスホリラーゼとは、ヌクレオシドのリン酸加水分解を触媒する酵素を指す。具体的なヌクレオシドホスホリラーゼとしては、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ、チミジンホスホリラーゼ、ウリジンホスホリラーゼ、ピリミジントランスフェラーゼなどを挙げることができる。以下では、ヌクレオシドホスホリラーゼを例に挙げて説明する。 In the present invention, nucleoside phosphorylase refers to an enzyme that catalyzes phosphate hydrolysis of a nucleoside. Specific examples of the nucleoside phosphorylase include purine nucleoside phosphorylase, pyrimidine nucleoside phosphorylase, thymidine phosphorylase, uridine phosphorylase, and pyrimidine transferase. Hereinafter, nucleoside phosphorylase will be described as an example.
ヌクレオシドホスホリラーゼによるリボヌクレオシドのリン酸加水分解の反応は、例えば以下のように表される。 The reaction of phosphoric acid hydrolysis of ribonucleoside by nucleoside phosphorylase is expressed, for example, as follows.
上記の反応は可逆的であるので、 Since the above reaction is reversible,
の反応も同時に起こる。したがって、「塩基交換反応」では、リン酸加水分解によって生成した塩基が、再度リボース−１−リン酸とともにリボヌクレオシドを形成する反応において、反応系に二種以上の塩基が存在するとき、反応前とは異なる種類の塩基がリボース−１−リン酸塩基と反応し塩基が交換され得る。 This reaction also occurs at the same time. Therefore, in the “base exchange reaction”, when two or more kinds of bases exist in the reaction system in the reaction in which the base produced by the phosphoric acid hydrolysis again forms a ribonucleoside with ribose-1-phosphate, A different type of base may react with the ribose-1-phosphate base to exchange the base.
本発明のヌクレオシド化合物の製造方法は、置換基を有する塩基である担体親和性改変塩基を備えたことにより、担体との親和性が改変された、担体親和性改変ヌクレオシド化合物を用いて、前記担体親和性改変塩基の前記置換基とは異なる側鎖を有する目的塩基を備えた目的ヌクレオシド化合物を得る、ヌクレオシド化合物の製造方法であって、
前記担体親和性改変ヌクレオシド化合物と、前記目的塩基とを、リン酸イオンを含む水溶液中において、ヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換反応させて、前記目的ヌクレオシド化合物を得る工程Ｃを含む。
The method for producing a nucleoside compound of the present invention comprises using the carrier affinity modified nucleoside compound, which has a carrier affinity modified base that is a base having a substituent, so that the affinity with the carrier is modified. A method for producing a nucleoside compound, which obtains a target nucleoside compound having a target base having a side chain different from the substituent of the affinity-modified base,
A step C in which the carrier affinity-modified nucleoside compound and the target base are subjected to a base exchange reaction with a nucleoside phosphorylase in an aqueous solution containing a phosphate ion to obtain the target nucleoside compound.
上記の反応１および反応２を、目的ヌクレオシド化合物を得る工程Ｃに当てはめると、以下のように表される。 When the above reaction 1 and reaction 2 are applied to the step C to obtain the target nucleoside compound, it is expressed as follows.
反応１−２〜反応２−２までをまとめると、以下のように表すことができる。
工程Ｃの反応の概要を、図１において模式的に示して説明する。図１には、後述の工程Ｄも併せて示してある。
図１中の工程Ｃでは、置換基１３を有する担体親和性改変塩基２１と糖部分１２とを備えた担体親和性改変ヌクレオシド化合物２０と目的塩基３１とをヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換反応させて、目的塩基３１と糖部分１２とを備えた目的ヌクレオシド化合物３０を得る工程を示している。
An outline of the reaction in the step C will be schematically shown and described in FIG. FIG. 1 also shows a process D described later.
In Step C in FIG. 1, a carrier affinity modified nucleoside compound 20 having a substituent 13 having a substituent 13 and a sugar moiety 12 and a target base 31 are subjected to a base exchange reaction with a nucleoside phosphorylase, and a target exchange is performed. The process of obtaining the target nucleoside compound 30 provided with the base 31 and the sugar part 12 is shown.
ここで、本発明における担体親和性の対象となる「担体」とは、ヌクレオシド化合物と直接的又は間接的に結合し得るものであれば特に制限されず、好ましくは、結合後にそれらの塩基及びヌクレオシド化合物を再び分離（溶離）させ得る物である。そのようなより好ましい担体として、担体が有する官能基との反応を介して当該化合物と結合し得る、イオン交換性樹脂、キレート樹脂、アフィニティー樹脂を挙げることができる。 Here, the “carrier” that is the target of carrier affinity in the present invention is not particularly limited as long as it can be directly or indirectly bound to the nucleoside compound, and preferably the base and nucleoside after binding. The compound can be separated (eluted) again. Examples of such a more preferable carrier include an ion exchange resin, a chelate resin, and an affinity resin that can bind to the compound through a reaction with a functional group of the carrier.
「担体親和性改変」とは、所望のヌクレオシド又は所望の塩基と、反応系に存在する所望のヌクレオシド以外又は所望の塩基以外の化合物との間で、担体に対する親和性が本来は差別可能でなかった又は差別が容易ではなかったところ、差別可能又は差別が容易なようにヌクレオシド化合物又は塩基の担体親和性が改変されることを云う。
上記のヌクレオシドホスホリラーゼによる塩基交換反応を、工程Ｃにおける反応を例にすると、上記反応は可逆的であるため、反応系には、上記反応１−２の出発物質の担体親和性ヌクレオシド化合物と、上記反応２−２で生成された目的ヌクレオシド化合物とが混在している。したがって、前記工程Ｃにおける担体親和性改変は、工程Ｃにおける所望のヌクレオシド化合物である目的ヌクレオシド化合物が有する目的塩基と、目的ヌクレオシド化合物以外のヌクレオシド化合物の塩基との間で差別可能となるように改変されることが好ましい。
担体親和性が改変された「担体親和性改変塩基」を有するヌクレオシドは、同様に担体親和性が改変されるため、「担体親和性改変ヌクレオシド」となる。
改変としては、所望のヌクレオシド化合物は担体に結合するが、担体親和性改変ヌクレオシド化合物は担体に結合しないよう改変される場合が挙げられ、逆の場合としては、担体親和性改変ヌクレオシド化合物は担体に結合するが、所望のヌクレオシドは担体に結合しないよう改変される場合が挙げられる。さらに別の態様としては、担体に対しての結合においては差別可能ではないが、担体からの溶離（分離）に際し差別可能であってもよい。
“Carrier affinity modification” means that the affinity for a carrier is not inherently distinguishable between a desired nucleoside or a desired base and a compound other than the desired nucleoside present in the reaction system or a compound other than the desired base. In other words, the carrier affinity of the nucleoside compound or the base is changed so that the discrimination is possible or the discrimination is easy.
When the base exchange reaction by the nucleoside phosphorylase is taken as an example of the reaction in Step C, the reaction is reversible. Therefore, the reaction system includes a carrier-affinity nucleoside compound as a starting material of the reaction 1-2, The target nucleoside compound produced in Reaction 2-2 is mixed. Therefore, the carrier affinity modification in the step C is modified so that it can be discriminated between the target base of the target nucleoside compound, which is the desired nucleoside compound in the step C, and the base of a nucleoside compound other than the target nucleoside compound. It is preferred that
A nucleoside having a “carrier affinity modified base” having a modified carrier affinity is similarly changed to a “carrier affinity modified nucleoside” because the carrier affinity is similarly modified.
Modifications include cases where the desired nucleoside compound binds to the carrier, but the carrier affinity modified nucleoside compound is modified so that it does not bind to the carrier, and vice versa, the carrier affinity modified nucleoside compound is attached to the carrier. In some cases, the desired nucleoside is modified so that it does not bind to the carrier. In yet another embodiment, it is not distinguishable in binding to the carrier, but may be distinguishable in elution (separation) from the carrier.
このように、上記反応系には、反応１−２の出発物質のヌクレオシド化合物と反応２−２で生成された目的ヌクレオシド化合物とが混在しているが、本発明のヌクレオシド化合物の製造方法では、反応１−２の出発物質に担体親和性改変ヌクレオシド化合物を用いるので、担体への結合を利用して、反応２−２で生成された目的ヌクレオシド化合物と出発物質の担体親和性改変ヌクレオシド化合物とを容易に分離がすることが可能となる。 Thus, in the reaction system, the starting nucleoside compound of reaction 1-2 and the target nucleoside compound produced in reaction 2-2 are mixed, but in the method for producing a nucleoside compound of the present invention, Since the carrier affinity modified nucleoside compound is used as the starting material of Reaction 1-2, the target nucleoside compound produced in Reaction 2-2 and the carrier affinity modified nucleoside compound of Reaction 2-2 are used by utilizing the binding to the carrier. Separation can be easily performed.
したがって、本発明のヌクレオシド化合物の製造方法では、担体親和性改変ヌクレオシド化合物又は前記目的ヌクレオシド化合物を担体に結合させて該担体親和性改変ヌクレオシド化合物又は前記目的ヌクレオシド化合物を前記水溶液中から分離させる工程Ｄを含んでいても良い。 Therefore, in the method for producing a nucleoside compound of the present invention, the carrier affinity modified nucleoside compound or the target nucleoside compound is bound to a carrier, and the carrier affinity modified nucleoside compound or the target nucleoside compound is separated from the aqueous solution D. May be included.
工程Ｄの反応の概要を、図２において模式的に示して説明する。
工程Ｃで得られた組成物中には、目的ヌクレオシド化合物３０の他、塩基交換反応により生成された副生成物の担体親和性改変塩基２１も含まれている。さらには、該組成物中には未反応の目的塩基３１及び未反応の担体親和性改変ヌクレオシド化合物２０が含まれている。未反応の担体親和性改変ヌクレオシド化合物２０は担体親和性改変塩基２１を備えたことにより、目的ヌクレオシド化合物３０と担体親和性が異なる。図２は、工程Ｄにおける担体とヌクレオシド化合物の結合を模式的に示したものである。図２（ａ）に示すように、担体親和性改変ヌクレオシド化合物２０を担体に結合させることによって、工程Ｃで得られた組成物中から担体との親和性の低い目的ヌクレオシド化合物３０を分離させ、目的ヌクレオシド化合物を得てもよい。担体親和性改変ヌクレオシド化合物２０が分離された後の水溶液には、目的ヌクレオシド化合物３０以外に、担体親和性改変塩基２１及び目的塩基３１が含まれるが、これらは互いに担体親和性が異なっているため、目的ヌクレオシド化合物３０を容易に精製することが可能である。又は、図２（ｂ）に示すように、目的ヌクレオシド化合物３０を担体に結合させることによって、工程Ｃで得られた組成物中から、担体との親和性の高い目的ヌクレオシド化合物３０を分離（精製）させてもよい。担体親和性改変の手段としては、ヌクレオシドの塩基部分に官能基を付加（置換）し、置換基１３を有する塩基とすることで、担体親和性改変塩基とする方法が好ましい。
The outline of the reaction in the step D will be schematically shown and described in FIG.
In addition to the target nucleoside compound 30, the by-product carrier affinity modified base 21 produced by the base exchange reaction is also included in the composition obtained in Step C. Further, the composition contains an unreacted target base 31 and an unreacted carrier affinity modified nucleoside compound 20. Since the unreacted carrier affinity modified nucleoside compound 20 includes the carrier affinity modified base 21, the carrier affinity is different from that of the target nucleoside compound 30. FIG. 2 schematically shows the bond between the carrier and the nucleoside compound in Step D. As shown in FIG. 2 (a), by binding the carrier affinity modified nucleoside compound 20 to the carrier, the target nucleoside compound 30 having a low affinity for the carrier is separated from the composition obtained in step C, The target nucleoside compound may be obtained. The aqueous solution from which the carrier affinity modified nucleoside compound 20 has been separated contains a carrier affinity modified base 21 and a target base 31 in addition to the target nucleoside compound 30, but these have different carrier affinities. The target nucleoside compound 30 can be easily purified. Alternatively, as shown in FIG. 2B, by binding the target nucleoside compound 30 to a carrier, the target nucleoside compound 30 having a high affinity with the carrier is separated (purified) from the composition obtained in Step C. ). As a means for carrier affinity modification, a method of making a carrier affinity modified base by adding (substituting) a functional group to the base portion of the nucleoside to form a base having a substituent 13 is preferable.
前記置換基は、該置換基が付加されたことによって、ヌクレオシドホスホリラーゼによる反応が阻害されることのない官能基であれば特に制限されず、親和性の差別が可能となるよう種々のものを選択することができる。 The substituent is not particularly limited as long as it is a functional group that does not inhibit the reaction by the nucleoside phosphorylase due to the addition of the substituent, and various substituents are selected so that affinity discrimination is possible. can do.
担体としてイオン交換樹脂を用いる場合、担体親和性の改変により親和性の差異を与える置換基としては、種々の極性基を例示できる。極性基が付加されたことによる親和性（イオン性）の改変の結果に応じて、分離に適したイオン交換樹脂を選択すればよい。
担体親和性改変ヌクレオシド化合物がイオン交換樹脂に結合するようにイオン性を改変させる場合を例に挙げると、担体親和性改変ヌクレオシド化合物が分離に適した条件下で陽イオン性となる場合、イオン交換樹脂として、公知の強酸性陽イオン交換樹脂又は弱酸性陽イオン交換樹脂を担体として用いればよい。またそれとは逆に、担体親和性改変ヌクレオシド化合物が分離に適した条件下で陰イオン性となる場合、公知の強塩基性陰イオン交換樹脂または弱塩基性陰イオン交換樹脂を担体として用いればよい。
In the case of using an ion exchange resin as a carrier, various polar groups can be exemplified as a substituent that gives a difference in affinity by modifying carrier affinity. An ion exchange resin suitable for separation may be selected according to the result of the modification of affinity (ionicity) due to the addition of a polar group.
For example, when ionicity is modified so that the carrier affinity modified nucleoside compound binds to the ion exchange resin, ion exchange is performed when the carrier affinity modified nucleoside compound becomes cationic under conditions suitable for separation. A known strong acid cation exchange resin or weak acid cation exchange resin may be used as the carrier. On the contrary, when the carrier affinity modified nucleoside compound becomes anionic under conditions suitable for separation, a known strong basic anion exchange resin or weakly basic anion exchange resin may be used as the carrier. .
このように、ヌクレオシド化合物を陽イオン性へと改変し得る極性基としては、アミノ基（‐ＮＨ２、並びにメチルアミン又はジメチルアミンから１個の水素原子を除去した官能基）、ピリジン基等の官能基を挙げることができる。同様に、ヌクレオシド化合物を陰イオン性へと改変し得る極性基としては、カルボキシル基、スルホン酸基等の官能基を挙げることができる。 Thus, polar groups that can modify a nucleoside compound to be cationic include amino groups (-NH2 and functional groups obtained by removing one hydrogen atom from methylamine or dimethylamine), functional groups such as pyridine groups, and the like. The group can be mentioned. Similarly, examples of the polar group capable of modifying the nucleoside compound into an anionic group include functional groups such as a carboxyl group and a sulfonic acid group.
担体としてキレート樹脂を用いる場合、キレート樹脂の有するキレート形成基と結合する、担体親和性改変によって担体への親和性の結合の差異となる置換基としては、イミノジ酢酸、イミノジプロピオン酸等の有機酸から１個の水素原子を除いた基、ポリアミンから１個の水素原子を除いた基、グルカミン基等を付加することが挙げられる。 When a chelate resin is used as a carrier, the substituent that binds to the chelate-forming group of the chelate resin and becomes a difference in affinity binding to the carrier due to the carrier affinity modification includes organic solvents such as iminodiacetic acid and iminodipropionic acid. Examples thereof include a group obtained by removing one hydrogen atom from an acid, a group obtained by removing one hydrogen atom from a polyamine, a glucamine group, and the like.
担体親和性を改変されるヌクレオシドの種類としては特に制限されないが、例えば、担体親和性を改変されるヌクレオシドとしてウリジンを用いる場合、ウラシルのピリミジン環の５位又は６位の水素原子を前記極性基で置換することが挙げられる。具体的な極性基としては、上記のとおり、アミノ基、ピリジン基、カルボキシル基、スルホン酸基、イミノジ酢酸、イミノジプロピオン酸等の有機酸から１個の水素原子を除いた基、ポリアミンから１個の水素原子を除いた基、グルカミン基等を選択することができ、より具体的な態様としてアミノ基の場合を例示すると、ウラシルのピリミジン環の５位又は６位の水素原子をアミノ基に置換し、５−アミノウラシル又は、６−アミノウラシルとすることができる。この場合、担体親和性改変ヌクレオシド化合物は、ｄＵ−５−ＮＨ２又はｄＵ−６−ＮＨ２である。 The type of nucleoside whose carrier affinity is modified is not particularly limited. For example, when uridine is used as a nucleoside whose carrier affinity is modified, the hydrogen atom at the 5- or 6-position of the pyrimidine ring of uracil is substituted with the polar group. And may be substituted. Specific polar groups include, as described above, a group obtained by removing one hydrogen atom from an organic acid such as amino group, pyridine group, carboxyl group, sulfonic acid group, iminodiacetic acid, iminodipropionic acid, and 1 from polyamine. A group excluding a single hydrogen atom, a glucamine group, and the like can be selected. As a more specific embodiment, an amino group is exemplified. A hydrogen atom at the 5-position or 6-position of a pyrimidine ring of uracil is used as an amino group. It can be substituted to give 5-aminouracil or 6-aminouracil. In this case, the carrier affinity modified nucleoside compound is dU-5-NH 2 or dU-6-NH 2 .
また、担体親和性を改変されるヌクレオシドとしてチミジンを用いる場合、チミンのピリミジン環の６位の水素原子を前記官能基で置換することが挙げられる。具体的な官能基としては、上記のとおり、アミノ基、ピリジン基、カルボキシル基、スルホン酸基、イミノジ酢酸、イミノジプロピオン酸等の有機酸から１個の水素原子を除いた基、ポリアミンから１個の水素原子を除いた基、グルカミン基等を選択することができ、より具体的な態様としてアミノ基の場合を例示すると、チミジンのピリミジン環の６位の水素原子をアミノ基に置換し、６−アミノチミンとすることができる。この場合、担体親和性改変ヌクレオシド化合物は、ｄＴ−６ＮＨ２である。 In addition, when thymidine is used as a nucleoside whose carrier affinity is modified, the 6-position hydrogen atom of the pyrimidine ring of thymine may be substituted with the functional group. Specific examples of the functional group include, as described above, a group obtained by removing one hydrogen atom from an organic acid such as an amino group, a pyridine group, a carboxyl group, a sulfonic acid group, iminodiacetic acid, and iminodipropionic acid, and 1 from a polyamine. A group excluding a single hydrogen atom, a glucamine group, and the like can be selected. As a more specific embodiment, an amino group is exemplified. A 6-position hydrogen atom of a pyrimidine ring of thymidine is substituted with an amino group, It can be 6-aminothymine. In this case, the carrier affinity modified nucleoside compound is dT-6NH 2.
前記イオン交換樹脂、キレート樹脂等の樹脂からの溶離液は、用いる樹脂と結合する官能基の種類に応じて一般的に用いられている各種溶離液を用いることができ、溶離液の種類、濃度等を適宜選択することが可能であり、好ましい溶離液として、酢酸、ギ酸、アンモニア水、希塩酸などが挙げられる。 As the eluent from the resin such as the ion exchange resin and the chelate resin, various eluents that are generally used according to the type of the functional group that binds to the resin to be used can be used. Etc. can be appropriately selected, and preferable eluents include acetic acid, formic acid, aqueous ammonia, dilute hydrochloric acid and the like.
本発明のヌクレオシド化合物の製造方法が含む、目的ヌクレオシド化合物を得る反応工程Ｃを、上述したように、担体親和性を改変されるヌクレオシドとしてウリジンを用い、ウラシルのピリミジン環の５位又をアミノ基に置換し、５−アミノウラシルとし、目的ヌクレオシド化合物をチミジンとした場合、反応工程Ｃは以下のように表される。 In the reaction step C for obtaining the target nucleoside compound, which is included in the method for producing a nucleoside compound of the present invention, as described above, uridine is used as the nucleoside whose carrier affinity is modified, and the 5-position or the amino group at the pyrimidine ring of uracil Is substituted with 5-aminouracil and the target nucleoside compound is thymidine, reaction step C is represented as follows.
上記反応系には、目的ヌクレオシド化合物であるチミジンの他に、ｄＵ−５−ＮＨ２、５−アミノウラシルといった目的物以外のヌクレオシド及び塩基が含まれることとなるが、ｄＵ−５−ＮＨ２及び５−アミノウラシルはチミジンと比較して陽イオン交換樹脂に対する親和性が高められており、チミジンが陽イオン交換樹脂に結合しない条件で、ｄＵ−５−ＮＨ２及び５−アミノウラシルが陽イオン交換樹脂に結合するため、本発明のヌクレオシド化合物の製造方法では、容易に目的ヌクレオシドであるチミジンと目的物以外のヌクレオシド及び塩基を分離可能である。なお、ヌクレオシドと塩基では担体親和性、例えば水に対する溶解性が異なり、水で溶離を行う場合、先に析出される塩基をろ過することで、塩基とヌクレオシドとの分離も容易である。 The above reaction system, in addition to the thymidine is an object nucleoside compound, dU-5-NH 2, 5- such amino uracil becomes a may include the nucleosides and bases other than the desired product, dU-5-NH 2 and 5-Aminouracil has increased affinity for cation exchange resin compared to thymidine, and dU-5-NH 2 and 5-aminouracil are cation exchanged under the condition that thymidine does not bind to the cation exchange resin. Since it binds to the resin, in the method for producing a nucleoside compound of the present invention, it is possible to easily separate the target nucleoside thymidine from the nucleoside and base other than the target product. Nucleoside and base have different carrier affinity, for example, solubility in water. When elution is carried out with water, the base and nucleoside can be easily separated by filtering the base precipitated first.
このように担体を用いてのヌクレオシド化合物又は塩基の精製は、担体へ結合又は溶離の有無で精製することが可能であるので、精製量を容易に増加させることができ、短時間で大量の目的ヌクレオシドを精製できる。 As described above, the purification of a nucleoside compound or base using a carrier can be performed with or without binding to or eluted from the carrier, so that the amount of purification can be easily increased, and a large amount of objects can be obtained in a short time. Nucleosides can be purified.
本発明のヌクレオシド化合物の製造方法は、担体親和性改変塩基の置換基とは異なる側鎖を有する塩基を備え、原材料として用いられる、原材料ヌクレオシド化合物と、前記担体親和性改変塩基とを、リン酸イオンを含む水溶液中において、ヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換反応させて、担体親和性改変ヌクレオシド化合物を得る工程Ａを工程Ｃの前に含んでいてもよい。
担体親和性改変ヌクレオシド化合物も、目的ヌクレオシドの場合と同様に、塩基交換反応によって得ることができる。
The method for producing a nucleoside compound of the present invention comprises a base having a side chain different from a substituent of a carrier affinity modified base, and used as a raw material, the raw material nucleoside compound and the carrier affinity modified base, Step A may be included before Step C to obtain a carrier affinity modified nucleoside compound by base exchange reaction with nucleoside phosphorylase in an aqueous solution containing ions.
The carrier affinity modified nucleoside compound can also be obtained by base exchange reaction as in the case of the target nucleoside.
ここで、工程Ａにおける「担体親和性改変」ヌクレオシド化合物は、反応１−１の出発物質の原材料ヌクレオシド化合物との間で、担体に対する親和性が差別可能なように担体親和性が改変されていることが好ましい。親和性が差別可能であることにより、反応２−１における生成物である担体親和性改変ヌクレオシド化合物を精製して取得することがより容易となる。原材料ヌクレオシド化合物は、担体親和性改変塩基の置換基とは異なる側鎖を有する塩基を備えているため、担体親和性改変ヌクレオシド化合物との、担体に対する親和性が差別可能である。 Here, the carrier affinity modification of the “carrier affinity modification” nucleoside compound in step A is modified so that the affinity for the carrier can be differentiated from the starting nucleoside compound of reaction 1-1. It is preferable. Since the affinity can be differentiated, it becomes easier to purify and obtain the carrier affinity-modified nucleoside compound that is a product in the reaction 2-1. Since the raw material nucleoside compound has a base having a side chain different from the substituent of the carrier affinity modified base, the affinity for the carrier affinity modified nucleoside compound can be differentiated.
工程Ａの反応の概要を、図３において模式的に示して説明する。図３には、後述の工程Ｂも併せて示してある。
図３中の工程Ａでは、担体親和性改変塩基２１の置換基１３とは異なる側鎖を有する塩基１１と糖部分１２とを備え、原材料として用いられる、原材料ヌクレオシド化合物１０と、前記担体親和性改変塩基２１とをヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換反応させて、担体親和性改変塩基２１と糖部分１２とを備えた担体親和性改変ヌクレオシド化合物２０を得る工程を示している。
An outline of the reaction in the step A will be schematically shown and described in FIG. FIG. 3 also shows a process B described later.
In step A in FIG. 3, a raw material nucleoside compound 10 comprising a base 11 having a side chain different from the substituent 13 of the carrier affinity modified base 21 and a sugar moiety 12 and used as a raw material, and the carrier affinity The figure shows the step of obtaining a carrier affinity modified nucleoside compound 20 comprising a carrier affinity modified base 21 and a sugar moiety 12 by base exchange reaction of the modified base 21 with a nucleoside phosphorylase.
本発明のヌクレオシド化合物の製造方法では、前記担体親和性改変ヌクレオシド化合物又は前記原材料ヌクレオシド化合物を担体に結合させて該担体親和性改変ヌクレオシド化合物又は前記原材料ヌクレオシド化合物を前記水溶液中から分離させる工程Ｂを含んでいてもよい。 In the method for producing a nucleoside compound of the present invention, the step B of separating the carrier affinity modified nucleoside compound or the raw material nucleoside compound from the aqueous solution by binding the carrier affinity modified nucleoside compound or the raw material nucleoside compound to a carrier. May be included.
工程Ｂの反応の概要を、図４において模式的に示して説明する。
工程Ａで得られた組成物中には、担体親和性改変ヌクレオシド化合物２０の他、塩基交換反応により生成された副生成物の塩基１１も含まれている。さらには、該組成物中には未反応の担体親和性改変塩基２１及び未反応の原材料ヌクレオシド化合物１０が含まれている。担体親和性改変ヌクレオシド化合物２０は担体親和性改変塩基２１を備えたことにより、原材料ヌクレオシド化合物１０と担体親和性が異なる。図４は工程Ｄにおける担体とヌクレオシド化合物の結合を模式的に示したものである。図４（ａ）に示すように、担体親和性改変ヌクレオシド化合物２０を担体に結合させることによって、工程Ａで得られた組成物中から担体との親和性の低い原材料ヌクレオシド化合物１０を分離させ、担体親和性改変ヌクレオシド化合物２０を精製させてもよい。又は、図４（ｂ）に示すように、原材料ヌクレオシド化合物１０を担体に結合させることによって、工程Ａで得られた組成物中から担体との親和性の高い原材料ヌクレオシド化合物１０を分離させてもよい。原材料ヌクレオシド化合物１０が分離された後の水溶液には、担体親和性改変ヌクレオシド化合物２０以外に、担体親和性改変塩基２１及び塩基１１が含まれるが、これらは互いに担体親和性が異なっているため、担体親和性改変ヌクレオシド化合物２０を容易に精製することが可能である。
The outline of the reaction in the step B will be schematically shown and described in FIG.
In the composition obtained in the step A, in addition to the carrier affinity modified nucleoside compound 20, a by-product base 11 produced by a base exchange reaction is also included. Further, the composition contains an unreacted carrier affinity modified base 21 and an unreacted raw material nucleoside compound 10. Since the carrier affinity modified nucleoside compound 20 includes the carrier affinity modified base 21, the carrier affinity is different from that of the raw material nucleoside compound 10. FIG. 4 schematically shows the bond between the carrier and the nucleoside compound in Step D. As shown in FIG. 4 (a), by binding the carrier affinity modified nucleoside compound 20 to the carrier, the raw material nucleoside compound 10 having a low affinity for the carrier is separated from the composition obtained in step A, The carrier affinity modified nucleoside compound 20 may be purified. Alternatively, as shown in FIG. 4B, the raw material nucleoside compound 10 having a high affinity with the carrier can be separated from the composition obtained in step A by binding the raw material nucleoside compound 10 to the carrier. Good. The aqueous solution after separation of the raw material nucleoside compound 10 includes a carrier affinity modified base 21 and a base 11 in addition to the carrier affinity modified nucleoside compound 20, but these have different carrier affinity, The carrier affinity modified nucleoside compound 20 can be easily purified.
反応１−１〜反応２−２までをまとめると、以下のように表すことができる。 Summarizing reaction 1-1 to reaction 2-2 can be expressed as follows.
原材料ヌクレオシド化合物が有する塩基と目的ヌクレオシド化合物が有する目的塩基との間で、担体に対する親和性が本来は差別可能ではないとき、原材料ヌクレオシド化合物と目的ヌクレオシド化合物の分離（精製）は大変困難であった。例えば、原材料ヌクレオシド化合物が有する塩基及び目的ヌクレオシド化合物の目的塩基が、ウラシル、チミン又はそれらの誘導体のいずれかである場合、ウラシル及びチミンとの間では、イオン交換樹脂に対する親和性が少なく、差別が困難であるため、原材料ヌクレオシド化合物と目的ヌクレオシド化合物の分離（精製）が特に困難であった。しかし、本発明のヌクレオシド化合物の製造方法では、担体親和性ヌクレオシド化合物を介して目的ヌクレオシド化合物を製造するので、担体親和性改変ヌクレオシド化合物を反応系から分離させることで、目的ヌクレオシド化合物の精製を大変容易に行うことが可能である。 Separation (purification) of the raw material nucleoside compound and the target nucleoside compound was very difficult when the affinity for the carrier was not originally distinguishable between the base of the raw material nucleoside compound and the target base of the target nucleoside compound. . For example, when the base of the raw material nucleoside compound and the target base of the target nucleoside compound is uracil, thymine, or a derivative thereof, there is little affinity for ion exchange resin between uracil and thymine, and discrimination is difficult. Due to the difficulty, separation (purification) of the raw material nucleoside compound and the target nucleoside compound was particularly difficult. However, in the method for producing a nucleoside compound of the present invention, the target nucleoside compound is produced via the carrier-affinity nucleoside compound. Therefore, by separating the carrier-affinity modified nucleoside compound from the reaction system, the purification of the target nucleoside compound is extremely difficult. It can be done easily.
また、原材料ヌクレオシド化合物が有する塩基、担体親和性改変ヌクレオシド化合物が有する塩基又は目的ヌクレオシド化合物の塩基が、ウラシル、チミン又はそれらの誘導体のいずれかである場合、用いる前記ヌクレオシドホスホリラーゼが、チミジンホスホリラーゼとすることができる。チミジンホスホリラーゼは、チミジンの他にウリジンに対しても基質として認識可能であるため、チミジンホスホリラーゼによって反応を行うことが可能である。特に、原材料ヌクレオシド化合物が有する塩基、担体親和性改塩基及び目的塩基の全ての塩基が、ウラシル、チミン又はそれらの誘導体のいずれかである場合、チミジンホスホリラーゼのみで反応を行うことが可能である。 Further, when the base of the raw material nucleoside compound, the base of the carrier affinity modified nucleoside compound or the base of the target nucleoside compound is uracil, thymine or a derivative thereof, the nucleoside phosphorylase used is a thymidine phosphorylase. be able to. Since thymidine phosphorylase can be recognized as a substrate for uridine in addition to thymidine, the reaction can be carried out by thymidine phosphorylase. In particular, when all of the base, the carrier affinity modified base, and the target base of the raw material nucleoside compound are uracil, thymine, or derivatives thereof, the reaction can be performed only with thymidine phosphorylase.
また、原材料ヌクレオシド化合物が有する塩基と目的ヌクレオシド化合物の塩基との間で、担体に対する親和性が本来は差別可能ではない別の場合として、当該両塩基が同種の塩基である場合がある。この場合も、原材料ヌクレオシド化合物と目的ヌクレオシド化合物の分離（精製）は大変困難であった。
当該両塩基が同じ種類の塩基である場合としては、例えば、目的ヌクレオシド化合物の目的塩基が同位体標識された塩基であって、さらに原材料ヌクレオシド化合物が有する塩基と同じ種類の塩基である場合が挙げられる。ここで、同位体標識とは、安定同位体標識又は放射性同位体標識の両方を指す。このように、原材料ヌクレオシド化合物を安定同位体標識又は放射性同位体標識する場合に、担体親和性ヌクレオシド化合物を介して目的物である安定同位体標識又は放射性同位体標識されたヌクレオシド化合物を製造することにより、担体親和性改変ヌクレオシド化合物を反応系から分離させることで、安定同位体標識又は放射性同位体標識されたヌクレオシドのみを容易に得ることが可能となる。前記安定同位体としては、例えば１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈ、１７Ｏ、１８Ｏを挙げることができる。放射性同位体標識としては、一例として、３Ｈ、１４Ｃ、１３Ｎ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓを挙げることができる。
Further, as another case where the affinity for the carrier is not inherently distinguishable between the base of the raw material nucleoside compound and the base of the target nucleoside compound, both bases may be the same type of base. Also in this case, separation (purification) of the raw material nucleoside compound and the target nucleoside compound was very difficult.
Examples of the case where both of the bases are the same type of base include a case where the target base of the target nucleoside compound is an isotope-labeled base and further the same type of base as the base of the raw material nucleoside compound. It is done. Here, the isotope label refers to both a stable isotope label and a radioisotope label. Thus, when a raw material nucleoside compound is labeled with a stable isotope or a radioisotope, a target isotope-labeled or radioisotope-labeled nucleoside compound is produced via a carrier affinity nucleoside compound. Thus, by separating the carrier affinity-modified nucleoside compound from the reaction system, it is possible to easily obtain only a stable isotope-labeled or radioisotope-labeled nucleoside. Examples of the stable isotope include 13 C, 15 N, 2 H, 17 O, and 18 O. Examples of radioisotope labels include 3 H, 14 C, 13 N, 32 P, 33 P, and 35 S.
反応工程におけるヌクレオシドホスホリラーゼの反応条件は、酵素の性質や塩基およびヌクレオシドに合わせて適切な条件を適宜選択すればよい。好ましい反応条件としては、反応液中の塩基およびヌクレオシドの濃度は１〜１００ｍＭが好ましく、ヌクレオシドは２０〜５０ｍＭがより好ましく、塩基は５〜５０ｍＭがさらに好ましい。反応液中のリン酸濃度は１〜１０００ｍＭが好ましく、１〜５０ｍＭがより好ましい。反応開始時のヌクレオシドに対する塩基のモル比は、目的のヌクレオシドに応じて適宜設定すればよく、例えば0.1〜1倍とすることができる。特に塩基が安定同位体標識された塩基の場合、当該標識塩基が高価であり塩基収率を高める必要があるため、塩基のモル比を０．１〜０．２倍とすることが好ましい。反応液中のヌクレオシド量及び塩基量に対するリン酸のモル比は０．０１〜２５倍が好ましく、０．０１〜５倍がより好ましく、０．０２〜０．０３倍がさらに好ましい。ヌクレオシドホスホリラーゼの使用量は、反応液量に対して０．１〜１００Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．１〜１０Ｕ／ｍＬを用いることが例示できる。 The reaction conditions for the nucleoside phosphorylase in the reaction step may be appropriately selected according to the nature of the enzyme, the base and the nucleoside. As preferable reaction conditions, the concentration of the base and nucleoside in the reaction solution is preferably 1 to 100 mM, the nucleoside is more preferably 20 to 50 mM, and the base is further preferably 5 to 50 mM. The phosphoric acid concentration in the reaction solution is preferably 1-1000 mM, more preferably 1-50 mM. What is necessary is just to set suitably the molar ratio of the base with respect to the nucleoside at the time of reaction start according to the target nucleoside, for example, can be 0.1-1 times. In particular, when the base is a stable isotope-labeled base, the labeled base is expensive and it is necessary to increase the base yield, so the molar ratio of the base is preferably 0.1 to 0.2 times. The molar ratio of phosphoric acid to the amount of nucleoside and base in the reaction solution is preferably 0.01 to 25 times, more preferably 0.01 to 5 times, and still more preferably 0.02 to 0.03 times. As for the usage-amount of nucleoside phosphorylase, 0.1-100 U / mL with respect to the amount of reaction liquids, Preferably 0.1-10 U / mL can be illustrated.
反応液の温度は使用するホスホリラーゼの反応温度に合わせて定めればよいが、１０〜１００℃が好ましく、２５〜４０℃がより好ましく、３７℃がさらに好ましい。反応液のｐＨはｐＨ６〜９の範囲が好ましく、ｐＨ６．５〜７．５の範囲が好ましく、ｐＨ６．８〜７．２の範囲で行うことがより好ましい。反応時間についても、使用する材料（酵素の量、基質の量など）に合わせて適切な反応時間を適宜定めればよいが、０．５〜４８時間が好ましく、１〜１２時間がより好ましい。 The temperature of the reaction solution may be determined according to the reaction temperature of the phosphorylase to be used, preferably 10 to 100 ° C, more preferably 25 to 40 ° C, and further preferably 37 ° C. The pH of the reaction solution is preferably in the range of pH 6 to 9, more preferably in the range of pH 6.5 to 7.5, and more preferably in the range of pH 6.8 to 7.2. Regarding the reaction time, an appropriate reaction time may be appropriately determined according to the material to be used (amount of enzyme, amount of substrate, etc.), but 0.5 to 48 hours is preferable, and 1 to 12 hours is more preferable.
≪組成物≫
［第一実施形態］
本発明の第一実施形態の組成物は、目的塩基を備えた目的ヌクレオシド化合物と、置換基を有する塩基である担体親和性改変塩基を備えたことにより担体との親和性が改変された担体親和性改変ヌクレオシド化合物、前記担体親和性改変塩基、前記目的塩基、及びヌクレオシドホスホリラーゼからなる群から選ばれる一種以上と、を含有し、前記目的塩基は、前記担体親和性改変塩基の前記置換基とは異なる側鎖を有するものである。
ここで、目的塩基、目的ヌクレオシド化合物、担体親和性改変塩基、担体親和性改変ヌクレオシド化合物、又はクレオシドホスホリラーゼについては、上記≪ヌクレオシド化合物の製造方法≫において説明したものである。本発明の第一実施形態の組成物は、一例として、本発明のヌクレオシド化合物の製造方法により取得することが可能である。
≪Composition≫
[First embodiment]
The composition of the first embodiment of the present invention comprises a carrier affinity having a modified affinity for a carrier by comprising a target nucleoside compound having a target base and a carrier affinity modified base that is a base having a substituent. One or more selected from the group consisting of a sex-modified nucleoside compound, the carrier affinity modified base, the target base, and a nucleoside phosphorylase, and the target base is the substituent of the carrier affinity modified base It has different side chains.
Here, the target base, target nucleoside compound, carrier affinity modified base, carrier affinity modified nucleoside compound, or cleoside phosphorylase are those described in the above << Method for Producing Nucleoside Compound >>. The composition of the first embodiment of the present invention can be obtained, for example, by the method for producing a nucleoside compound of the present invention.
例えば、本発明のヌクレオシド化合物の製造方法を用いて取得された当該組成物には、下記に挙げたような高純度で目的ヌクレオシド化合物を含む組成物を得ることができる。本発明の第一の実施形態の組成物は、一例として、組成物中のヌクレオシド化合物、塩基、リン酸化糖、及びそれらの誘導体の総量に対して、前記目的ヌクレオシド化合物の含有率が９５ｍｏｌ％以上、９７ｍｏｌ％以上、又は９９ｍｏｌ％以上とすることができる。 For example, in the composition obtained by using the method for producing a nucleoside compound of the present invention, a composition containing the target nucleoside compound with high purity as described below can be obtained. In the composition of the first embodiment of the present invention, as an example, the content of the target nucleoside compound is 95 mol% or more with respect to the total amount of the nucleoside compound, base, phosphorylated sugar, and derivatives thereof in the composition. , 97 mol% or more, or 99 mol% or more.
また、本発明の第一の実施形態の組成物は、前記目的塩基が、安定同位体標識又は放射性同位体標識された塩基であることが好ましい。 In the composition of the first embodiment of the present invention, the target base is preferably a stable isotope-labeled or radioisotope-labeled base.
［第二実施形態］
本発明の第二実施形態の組成物は、置換基を有する塩基である担体親和性改変塩基を備えたことにより、担体との親和性が改変された、担体親和性改変ヌクレオシド化合物と、前記担体親和性改変塩基の前記置換基とは異なる側鎖を有する目的塩基と、を含有することを特徴とするものである。当該組成物は、先に記載した本発明のヌクレオシド化合物の製造方法に好適に用いられる。
また、本発明の第二実施形態の組成物は、前記目的塩基が安定同位体標識又は放射性同位体標識された塩基であることが好ましい。
[Second Embodiment]
The composition of the second embodiment of the present invention comprises a carrier affinity modified nucleoside compound whose affinity with a carrier is modified by providing a carrier affinity modified base which is a base having a substituent, and the carrier And a target base having a side chain different from the substituent of the affinity-modified base. The said composition is used suitably for the manufacturing method of the nucleoside compound of this invention described previously.
In the composition of the second embodiment of the present invention, the target base is preferably a stable isotope-labeled or radioisotope-labeled base.
以下に共通の測定条件であるＨＰＬＣの測定条件を記載する。
ＨＰＬＣの測定条件は以下の通りである。
使用カラム：ＯＤＳ−３、（ＧＬサイエンス社製）
カラムサイズ：φ４．６×Ｌ１５０ｍｍ
カラム温度：４０℃
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
溶離液：８０％メタノール
検出波長：２６５ｎｍ
The HPLC measurement conditions, which are common measurement conditions, are described below.
HPLC measurement conditions are as follows.
Column used: ODS-3 (GL Sciences)
Column size: φ4.6 × L150mm
Column temperature: 40 ° C
Flow rate: 1 mL / min
Eluent: 80% methanol Detection wavelength: 265 nm
＜反応工程Ａ：担体親和性改変ヌクレオシド化合物の製造＞
１．５ｍＬチューブ中に、リン酸緩衝液５０μＬ（ｐＨ６．８、リン酸濃度は表１参照）、原材料ヌクレオシド化合物５０ｍＭ（各Ｓｉｇｍａ社製）、担体親和性改変塩基（５-アミノウラシル、Ｓｉｇｍａ社製）５０ｍＭ、ヌクレオシドホスホリラーゼ（チミジンホスホリラーゼ、Ｓｉｇｍａ社製）１Ｕの混合液を得た。この混合液を、温水浴中３７℃で２４時間反応させた後、反応後の混合液の少量を取り分けてＨＰＬＣで測定し、担体親和性改変ヌクレオシド化合物の生成量を確認した。
表１に、反応に用いた化合物、リン酸濃度条件、および原材料ヌクレオシド化合物に対する担体親和性改変ヌクレオシド化合物の生成量（モル％）を示す。
<Reaction step A: Production of carrier affinity modified nucleoside compound>
In a 1.5 mL tube, 50 μL of phosphate buffer (pH 6.8, see Table 1 for phosphate concentration), raw material nucleoside compound 50 mM (manufactured by Sigma), carrier affinity modified base (5-aminouracil, Sigma) A mixed solution of 50 mM and nucleoside phosphorylase (thymidine phosphorylase, manufactured by Sigma) 1U was obtained. The mixture was reacted at 37 ° C. for 24 hours in a warm water bath, and then a small amount of the mixture after the reaction was separated and measured by HPLC to confirm the production amount of the carrier affinity modified nucleoside compound.
Table 1 shows the compound used in the reaction, the phosphate concentration conditions, and the amount (mol%) of the carrier affinity modified nucleoside compound relative to the raw material nucleoside compound.
ＨＰＬＣの測定結果から、ｄＵ−５−ＮＨ２又はＵ−５−ＮＨ２を高収率および高収量で短時間に得られたことが確認できた。 From the HPLC measurement results, it was confirmed that dU-5-NH 2 or U-5-NH 2 was obtained in high yield and high yield in a short time.
＜精製工程Ｂ：担体親和性改変ヌクレオシド化合物の精製＞
上記の反応工程Ａで得た反応後の混合液を、陽イオン交換樹脂（ＤＯＷＥＸ５０ＷＸ８、ダウ・ケミカル社製）が充填された１０ｍＬガラスカラムに流し、次いで、純水を流してカラムを洗浄した。この洗浄後の純水の分画を、ＨＰＬＣを用いて分析したところ、未反応の原材料ヌクレオシド化合物（ｄＴ、ｄＵ、Ｔ、Ｕ）及び副生成物塩基（チミン、ウラシル）が検出された。さらに十分に純水を流してカラムを洗浄した後、２％アンモニア水を流し、担体親和性改変塩基および担体親和性改変ヌクレオシド化合物を溶離させた。この溶離に用いたアンモニア水の分画を、ＨＰＬＣを用いて分析したところ、未反応の担体親和性改変塩基（５−アミノウラシル）および担体親和性改変ヌクレオシド化合物（ｄＵ−５−ＮＨ２、Ｕ−５−ＮＨ２）が検出された。前記アンモニア水の分画をエバポレーターで濃縮したところ、白色固体を得た。１Ｈ−ＮＭＲで分析した。
その結果、Ｕ−５−ＮＨ２については図５に示す結果が得られた。1H-NMR(Deuterium oxide, 400 MHz): d ppm = 7.131-7.924 (1H, s, 5-CH), 6.120 (1H, t, J = 6.8 Hz, 1’-CH), 4.305-4.269 (1H, m, 3’-CH), 3.861-3.830 (1H, m, 4’-CH), 3.687-3.566 (2H, m, 5’-CH2), 2.189-2.160 (2H, m, 2’-CH2)。
ｄＵ−５−ＮＨ２については図６に示す結果が得られた。1H-NMR(Deuterium oxide, 400 MHz): d ppm = 7.157 (1H, s, 5-CH), 5.190-5.778 (1H, m, 1’-CH), 4.162 (2H, t, J = 5.2 Hz, 2’-CH), 4.062 (1H, t, J = 4.8 Hz, 3’-CH), 3.960-3.930 (1H, Q, 4’-CH), 3.747-3.614 (2H, m, 5’-CH2)。
これらの結果から、得られた白色固体は、Ｕ−５−ＮＨ２、ｄＵ−５−ＮＨ２であることがそれぞれ確認された。ＮＭＲの解析結果では、Ｕ−５−ＮＨ２またはｄＵ−５−ＮＨ２の担体親和性改変ヌクレオシド化合物以外のシグナルがほぼ検出されなかったことから、当該白色固体中およそ９９％以上の高純度で担体親和性改変ヌクレオシド化合物が得られたことが確認できた。
<Purification Step B: Purification of Carrier Affinity Modified Nucleoside Compound>
The reaction mixture obtained in the above reaction step A was passed through a 10 mL glass column filled with a cation exchange resin (DOWEX50WX8, manufactured by Dow Chemical Co.), and then the column was washed with pure water. When the fraction of pure water after washing was analyzed using HPLC, unreacted raw material nucleoside compounds (dT, dU, T, U) and by-product bases (thymine, uracil) were detected. Further, after pure water was sufficiently flowed to wash the column, 2% aqueous ammonia was flowed to elute the carrier affinity modified base and the carrier affinity modified nucleoside compound. When the fraction of aqueous ammonia used for this elution was analyzed using HPLC, unreacted carrier affinity modified base (5-aminouracil) and carrier affinity modified nucleoside compound (dU-5-NH 2 , U -5-NH 2) were detected. The ammonia water fraction was concentrated with an evaporator to obtain a white solid. Analyzed by 1 H-NMR.
As a result, the results shown in Figure 5 for U-5-NH 2 was obtained. 1 H-NMR (Deuterium oxide, 400 MHz): d ppm = 7.131-7.924 (1H, s, 5-CH), 6.120 (1H, t, J = 6.8 Hz, 1'-CH), 4.305-4.269 (1H , m, 3'-CH), 3.861-3.830 (1H, m, 4'-CH), 3.687-3.566 (2H, m, 5'-CH 2 ), 2.189-2.160 (2H, m, 2'-CH 2 ).
The results shown in Figure 6 for dU-5-NH 2 was obtained. 1 H-NMR (Deuterium oxide, 400 MHz): d ppm = 7.157 (1H, s, 5-CH), 5.190-5.778 (1H, m, 1'-CH), 4.162 (2H, t, J = 5.2 Hz , 2'-CH), 4.062 (1H, t, J = 4.8 Hz, 3'-CH), 3.960-3.930 (1H, Q, 4'-CH), 3.747-3.614 (2H, m, 5'-CH 2 ).
From these results, it was confirmed that the obtained white solids were U-5-NH 2 and dU-5-NH 2 , respectively. In the NMR analysis results, since signals other than the carrier affinity modified nucleoside compound of U-5-NH 2 or dU-5-NH 2 were hardly detected, the white solid had a high purity of about 99% or more. It was confirmed that a carrier affinity modified nucleoside compound was obtained.
＜反応工程Ｃ：目的ヌクレオシド化合物の製造＞
１．５ｍＬチューブ中に、リン酸緩衝液５０μＬ（ｐＨ６．８、リン酸濃度は表２参照）、上記の生成工程Ｂで得られたｄＵ−５−ＮＨ２５０ｍＭ、目的ヌクレオシド化合物の目的塩基（表２参照、各Ｓｉｇｍａ社製）５０ｍＭ、ヌクレオシドホスホリラーゼ（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）又はチミジンホスホリラーゼ（ＴＰ））、各酵素の添加量は表２参照、Ｓｉｇｍａ社製）の混合液を得た。この混合液を、３７℃の温水浴中で２４時間反応させた後、反応後の混合液の少量を取り分けてＨＰＬＣで分析し、目的ヌクレオシド化合物の生成量を確認した。実施例１３では、３７℃で２時間反応させた。
表２に反応に用いた化合物、リン酸濃度条件、ヌクレオシドホスホリラーゼ、担体親和性改変ヌクレオシド化合物に対する目的ヌクレオシド化合物の生成量（モル％）を示す。なお、目的ヌクレオシド化合物の目的塩基がプリン塩基の場合、ＰＮＰとＴＰの両方のヌクレオシドホスホリラーゼを前記混合液に添加した。
<Reaction Step C: Production of Target Nucleoside Compound>
In a 1.5 mL tube, 50 μL of phosphate buffer (pH 6.8, see Table 2 for phosphate concentration), dU-5-NH 2 50 mM obtained in Production Step B above, the target base of the target nucleoside compound ( A mixed solution of 50 mM, nucleoside phosphorylase (purine nucleoside phosphorylase (PNP) or thymidine phosphorylase (TP)) and the amount of each enzyme added was obtained (see Table 2, see Sigma). This mixture was reacted in a warm water bath at 37 ° C. for 24 hours, and then a small amount of the mixture after the reaction was separated and analyzed by HPLC to confirm the production amount of the target nucleoside compound. In Example 13, it was made to react at 37 degreeC for 2 hours.
Table 2 shows the amount of the target nucleoside compound produced (mol%) relative to the compound used in the reaction, phosphate concentration conditions, nucleoside phosphorylase, and carrier affinity modified nucleoside compound. When the target base of the target nucleoside compound is a purine base, both PNP and TP nucleoside phosphorylases were added to the mixed solution.
例として、実施例１３で用いたｄＵ−５−ＮＨ２、及び実施例１３で得られたデオキシウラシル−１，３−１５Ｎ２の合成を以下に示す。 As an example, the synthesis of dU-5-NH 2 used in Example 13 and deoxyuracil-1,3- 15 N 2 obtained in Example 13 are shown below.
ＨＰＬＣ分析の結果から、ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＵ、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｕ及びデオキシウラシル−１，３−１５Ｎ２を高収率および高収量で短時間に得られたことが確認できた。 From the results of HPLC analysis, it was confirmed that dA, dT, dG, dU, A, T, G, U and deoxyuracil-1,3- 15 N 2 were obtained in a high yield and a high yield in a short time. It was.
＜精製工程Ｄ：目的ヌクレオシド化合物の精製＞
上記の反応工程Ｃで得た反応後の混合液を、陽イオン交換樹脂（ＤＯＷＥＸ５０ＷＸ８、ダウ・ケミカル社製）が充填された１０ｍＬガラスカラムに流し、次いで、純水を流してカラムを洗浄した。この洗浄後の純水の分画を、ＨＰＬＣを用いて分析したところ、目的ヌクレオシド化合物（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＵ、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｕ）及び未反応の目的ヌクレオシド化合物の目的塩基（アデニン、チミン、グアニン、ウラシル）が検出された。さらに十分に純水を流してカラムを洗浄した後、２％アンモニア水を流し、担体親和性改変塩基および担体親和性改変ヌクレオシド化合物を溶離させた。この溶離に用いたアンモニア水の分画を、ＨＰＬＣを用いて分析したところ、担体親和性改変塩基（５−アミノウラシル）および担体親和性改変ヌクレオシド化合物（ｄＵ−５−ＮＨ２）が検出された。前記純水の分画をエバポレーターで濃縮したところ、白色固体を得た。実施例１３で得られた白色固体について１Ｈ−ＮＭＲで分析したところ、図７に示す結果が得られた。1H-NMR(Metahnol-D4, 400 MHz): d ppm = 7.99-7.97 (1H, m, 5-CH), 6.27 (1H, t, J = 6.4 Hz, 1’-CH), 5.70-5.69 (1H, m, 6-CH), 4.39-4.38 (1H, m, 3’-CH), 3.86-3.83 (1H, m, 4’-CH), 3.77-3.72 (2H, m, 5’-CH2), 2.27-2.2 (2H, m, 2’-CH2)。また、実施例１３で得られた白色固体について１５Ｎ−ＮＭＲで分析したところ、図８に示す結果が得られた。15N-NMR（Methanol-D4, 400 MHz）；δppm=143,896, 143.829 (2N, s, 1,3-N)。15N-NMRスペクトルから、１，３位のＮに帰属されるシグナルが２本観測され、２か所１５Ｎ標識されていることが確認できた。
以上の結果から、実施例１３で得られた白色固体はｄＵ−１，３−１５Ｎ２であることが確認された。ＮＭＲの解析結果では、ｄＵ−１，３−１５Ｎ２以外のシグナルがほぼ検出されなかったことから、当該白色固体中およそ９９％以上の高純度で目的ヌクレオシド化合物が得られたことが確認できた。
<Purification Step D: Purification of Target Nucleoside Compound>
The reaction mixture obtained in the above reaction step C was poured into a 10 mL glass column packed with a cation exchange resin (DOWEX50WX8, manufactured by Dow Chemical Co.), and then the column was washed with pure water. The fraction of pure water after washing was analyzed using HPLC. As a result, the target nucleoside compound (dA, dT, dG, dU, A, T, G, U) and the target base of the unreacted target nucleoside compound ( Adenine, thymine, guanine, uracil) were detected. Further, after pure water was sufficiently flowed to wash the column, 2% aqueous ammonia was flowed to elute the carrier affinity modified base and the carrier affinity modified nucleoside compound. When the fraction of aqueous ammonia used for this elution was analyzed using HPLC, a carrier affinity modified base (5-aminouracil) and a carrier affinity modified nucleoside compound (dU-5-NH 2 ) were detected. . When the fraction of pure water was concentrated with an evaporator, a white solid was obtained. When the white solid obtained in Example 13 was analyzed by 1 H-NMR, the result shown in FIG. 7 was obtained. 1 H-NMR (Metahnol-D 4 , 400 MHz): d ppm = 7.99-7.97 (1H, m, 5-CH), 6.27 (1H, t, J = 6.4 Hz, 1'-CH), 5.70-5.69 (1H, m, 6-CH), 4.39-4.38 (1H, m, 3'-CH), 3.86-3.83 (1H, m, 4'-CH), 3.77-3.72 (2H, m, 5'-CH 2), 2.27-2.2 (2H, m , 2'-CH 2). Moreover, when the white solid obtained in Example 13 was analyzed by 15 N-NMR, the results shown in FIG. 8 were obtained. 15 N-NMR (Methanol-D4, 400 MHz); δ ppm = 143,896, 143.829 (2N, s, 1,3-N). From the 15 N-NMR spectrum, two signals attributed to N at positions 1 and 3 were observed, and it was confirmed that 15 N was labeled at two positions.
From the above results, it was confirmed that the white solid obtained in Example 13 was dU-1,3- 15 N 2 . In the NMR analysis results, since signals other than dU-1,3- 15 N 2 were hardly detected, it was confirmed that the target nucleoside compound was obtained with a high purity of about 99% or more in the white solid. It was.
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。 The configurations and combinations thereof in the embodiments described above are examples, and the addition, omission, replacement, and other modifications of the configurations can be made without departing from the spirit of the present invention. Further, the present invention is not limited by each embodiment, and is limited only by the scope of the claims.
本発明のヌクレオシド化合物の製造方法は、所望のヌクレオシド化合物を短時間で、高純度で製造可能であるため、化学あるいは医学等の分野におけるヌクレオシド化合物の製造に有用である。本発明の組成物は、ヌクレオシド化合物の製造に用いられるほか、それ自体を試薬として、又は医薬品原材料として使用できる。 The method for producing a nucleoside compound of the present invention is useful for producing a nucleoside compound in the field of chemistry or medicine because a desired nucleoside compound can be produced with high purity in a short time. The composition of the present invention is used for producing a nucleoside compound, and can itself be used as a reagent or a raw material for pharmaceuticals.
１０・・・原材料ヌクレオシド化合物、２０・・・担体親和性改変ヌクレオシド化合物、３０・・・目的ヌクレオシド化合物、１１・・・原材料ヌクレオシド化合物の塩基、２１・・・担体親和性改変塩基、３１・・・目的塩基、１２・・・糖部分、１３・・・置換基、１４・・・担体 10 ... Raw material nucleoside compound, 20 ... Carrier affinity modified nucleoside compound, 30 ... Target nucleoside compound, 11 ... Base of raw material nucleoside compound, 21 ... Carrier affinity modified base, 31 ... -Target base, 12 ... sugar moiety, 13 ... substituent, 14 ... carrier
Claims (6)
前記担体親和性改変塩基の前記置換基とは異なる側鎖を有する塩基を備え、原材料として用いられる、原材料ヌクレオシド化合物と、前記担体親和性改変塩基とを、リン酸イオンを含む水溶液中において、ヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換反応させて、前記担体親和性改変ヌクレオシド化合物を得る工程Ａと、
前記担体親和性改変ヌクレオシド化合物と、前記目的塩基とを、リン酸イオンを含む水溶液中において、ヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換反応させて、前記目的ヌクレオシド化合物を得る工程Ｃと、を含むことを特徴とするヌクレオシド化合物の製造方法。 By using a carrier affinity modified nucleoside compound in which the affinity with a carrier is modified by providing a carrier affinity modified base which is a base having a substituent, the substituent of the carrier affinity modified base is A method for producing a nucleoside compound, which obtains a target nucleoside compound having a target base having different side chains,
A raw material nucleoside compound used as a raw material, comprising a base having a side chain different from the substituent of the carrier affinity modified base, and the carrier affinity modified base, in an aqueous solution containing phosphate ions, is a nucleoside. A step A of carrying out a base exchange reaction with phosphorylase to obtain the carrier affinity modified nucleoside compound;
A step C in which the carrier affinity-modified nucleoside compound and the target base are subjected to a base exchange reaction with a nucleoside phosphorylase in an aqueous solution containing a phosphate ion to obtain the target nucleoside compound. A method for producing a nucleoside compound.
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