JP6257172B2 - 顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は、顕微鏡装置に関するものである。

従来、落射蛍光観察とエバネッセント光を用いるＴＩＲＦ（Ｔｏｔａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）観察を切替えながら標本を観察することができる顕微鏡装置が知られている（例えば、特許文献１、特許文献２および特許文献３参照。）。特許文献１および特許文献２に記載の顕微鏡装置は、平行平板によって照明光を屈折させることにより、対物レンズの瞳位置において照明光を対物レンズの光軸と垂直な方向に移動させて、ＴＩＲＦ観察と落射蛍光観察とを切替えることができるようになっている。また、特許文献３に記載の顕微鏡装置は、照明光を射出する光ファイバの射出口の位置を切替えることにより、対物レンズの瞳位置において照明光を対物レンズの光軸と垂直な方向に移動させて、ＴＩＲＦ観察と落射蛍光観察とを切替えることができるようになっている。

特開２００３−２７９８６０号公報 特開２００３−２９１５３号公報 特開２００９−９８２２９号公報

しかしながら、特許文献１、特許文献２および特許文献３に記載のいずれの顕微鏡装置においても観察方法をＴＩＲＦ観察と落射蛍光観察とに切替えることはできるが、これらの各観察方法において最適な画像を取得するためには、観察方法を切替えるごとにユーザが照明光の強度や検出器の感度を設定し直さなければならず、手間がかかるという不都合がある。

本発明は、ＴＩＲＦ観察と落射蛍光観察とを切替えながら、これらの観察方法ごとに標本の最適な画像を簡易に取得することができる顕微鏡装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、光源から発せられた照明光を標本に照射して該標本から戻る戻り光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された前記戻り光を検出して前記標本の画像を構築する画像構築部と、前記対物レンズにより前記標本に照射される前記照明光の強度を調整可能な強度調整部と、前記対物レンズの瞳位置における前記照明光の光軸に交差する方向の集光位置を落射蛍光観察とエバネッセント光を用いるＴＩＲＦ（Total Internal Reflection Fluorescence）観察とで変更可能な集光位置変更部と、前記落射蛍光観察と前記ＴＩＲＦ観察のそれぞれにおける、前記強度調整部により調整する前記照明光の所定の強度、および、前記集光位置変更部により変更する前記照明光の集光位置を記憶する記憶部と、前記落射蛍光観察と前記ＴＩＲＦ観察とを切替え可能な観察方法切替部と、前記画像構築部により所定の時間間隔で前記画像を構築するフレーム信号に同期する同期信号に基づいて、該観察方法切替部により切替えられる前記落射蛍光観察と前記ＴＩＲＦ観察のそれぞれについて、前記記憶部に記憶されている前記照明光の所定の強度および前記照明光の集光位置を読み出して、前記強度調整部による前記照明光の強度の調整および前記集光位置変更部による前記照明光の集光位置の変更を制御する制御部とを備える顕微鏡装置を提供する。

本発明によれば、集光位置変更部により、対物レンズの瞳位置において瞳の中心に照明光を集光させると、いわゆる落射蛍光観察することができ、一方、ガラス板により照明光が全反射されるように、照明光の集光位置を対物レンズの瞳位置において瞳の中心からずらすと、ガラス板から染み出すエバネッセント光を用いたいわゆるＴＩＲＦ（Ｔｏｔａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）観察することができる。これらの観察方法は、観察方法切替部により切替えられる。

この場合において、制御部により、画像構築部によって画像が構築されるフレーム信号に同期する同期信号に基づいて、観察方法切替部により切替えられる観察方法に従い、記憶部に記憶されている照明光の所定の強度、および、照明光の集光位置が読み出されて、強度調整部および集光位置変更部が制御されることで、ＴＩＲＦ観察と落射蛍光観察とが混在するタイムラプスイメージングにおいて、これらの観察方法ごとに標本の最適な画像を簡易に取得することができる。

上記発明においては、前記画像構築部による前記戻り光の検出感度を調整可能な感度調整部を備え、前記記憶部が、前記感度調整部により調整する前記画像構築部の所定の検出感度をさらに記憶し、前記制御部が、前記画像構築部により所定の時間間隔で前記画像を構築するフレーム信号に同期する同期信号に基づいて、前記観察方法切替部により切替えられる前記落射蛍光観察と前記ＴＩＲＦ観察のそれぞれについて、前記記憶部に記憶されている前記画像構築部の所定の検出感度をさらに読み出して、前記感度調整部による前記画像構築部の検出感度の調整をさらに制御することとしてもよい。

上記発明においては、前記強度調整部が、前記照明光の透過率を変更可能な音響光学素子、前記照明光の透過率が異なる複数の減光フィルタを切替可能に備えるフィルタ装置、または、前記光源の出力を変更可能な出力変更装置であることとしてもよい。
このように構成することで、一般的に入手し易い装置により照明光の強度を簡易に調整することができる。音響光学素子としては、例えば、ＡＯＴＦ（Ａｃｏｕｓｔｏｏｐｔｉｃａｌ Ｔｕｎａｂｌｅ Ｆｉｌｔｅｒ）が挙げられる。

また、上記発明においては、前記画像構築部が２次元撮像素子であり、前記感度調整部が、前記２次元撮像素子の露光時間および／またはゲインを変更することとしてもよい。
このように構成することで、一般的に入手し易い装置により戻り光の検出感度を簡易に調整することができる。

本発明によれば、ＴＩＲＦ観察と落射蛍光観察とを切替えながら、これらの観察方法ごとに標本の最適な画像を簡易に取得することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡装置を示す概略構成図である。 図１のコントローラの構成を示すブロック図である。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡装置について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１００は、図１に示すように、励起光（照明光）を発する光源１と、光源１から発せられた励起光の強度を調整可能な照明強度変更部（強度調整部）３と、照明強度変更部３により調整された励起光を標本Ｓに照明する照明装置１０と、標本Ｓにおいて発生した蛍光（戻り光）を検出して標本Ｓの画像を構築するＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ：画像構築部、２次元撮像素子）５と、ＣＣＤ５により構築された画像を表示するモニタ７と、これらの照明強度変更部３、照明装置１０およびモニタ７等を制御するＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）のようなコントローラ２０とを備えている。

標本Ｓは、図示しないステージ上に載置され、スライドガラスやカバーガラス等のガラス板９により覆われるようになっている。
光源１としては、例えば、水銀ランプまたはレーザ光源等が用いられる。

照明強度変更部３としては、例えば、励起光の透過率が異なる複数のＮＤフィルタ（減光フィルタ、図示略）を切替可能に備えるフィルタホイール（フィルタ装置）を用いることができる。この照明強度変更部３は、コントローラ２０の制御により励起光の光路上にいずれかのＮＤフィルタを配置するようになっている。そして、照明強度変更部３は、光路上に配置するＮＤフィルタを切替えることで、励起光の強度を変更することができるようになっている。

照明装置１０は、照明強度変更部３により強度が調整された励起光を偏向可能なガルバノミラー（集光位置変更部）１１と、ガルバノミラー１１により偏向された励起光をリレーするリレーレンズ１３と、励起光の光束を制限する視野絞り（ＦＳ）１５と、視野絞り１５により光束が制限された励起光を標本Ｓに照射し、標本Ｓからの蛍光を集光する対物レンズ１７と、視野絞り１５から対物レンズ１７に入射される励起光を反射する一方、対物レンズ１７により集光されて光路を戻る蛍光を透過させるダイクロイックミラー１８とを備えている。符合１９は、ダイクロイックミラー１８を透過した蛍光を結像させる結像レンズを示している。

ガルバノミラー１１は、照明強度変更部３から入射される励起光をリレーレンズ１３に向けて反射するようになっている。このガルバノミラー１１は、励起光の光軸に直交する光軸回りに揺動可能に設けられており、コントローラ２０により制御されて揺動角度θを変化させることができるようになっている。そして、ガルバノミラー１１は、揺動角度θを変化させることにより、対物レンズ１７の瞳位置における励起光の光軸に交差する方向の集光位置を変化させることができるようになっている。

ガルバノミラー１１により、対物レンズ１７の瞳位置において瞳の中心に励起光を集光させると、ガラス板９に対して対物レンズ１７の光軸に沿ってほぼ垂直に励起光が入射し、いわゆる落射照明によって標本Ｓに励起光が照明されるようになっている。

そして、標本Ｓにおいて発生しダイクロイックミラー１８を透過した蛍光を結像レンズ１９を介してＣＣＤ５によって撮影することで、いわゆる落射蛍光観察することができるようになっている。この場合、落射照明により照明される標本Ｓ全体の蛍光像を観察することができる。

一方、ガルバノミラー１１を揺動させて、対物レンズ１７の瞳位置において瞳の中心から励起光の集光位置を光軸に直交する方向にずらし（図１において、光軸に直交する方向に距離Ｘ。）、ガラス板９内で励起光が全反射されるようにガラス板９に向かって励起光を斜め入射させると、ガラス板９から染み出すエバネッセント光によって標本Ｓが照明されるようになっている。

そして、標本Ｓにおいて発生しダイクロイックミラー１８を透過した蛍光を結像レンズ１９を介してＣＣＤ５によって撮影することで、いわゆるＴＩＲＦ（Ｔｏｔａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）観察することができるようになっている。この場合、標本Ｓにおけるエバネッセント光により照明されたガラス板９近傍の領域（図１において、染み出し深さｄ。）、すなわち、標本Ｓにおけるエバネッセント光が達した局所的な領域の蛍光像を観察することができる。

視野絞り１５は、開口径を調節することにより、標本Ｓへの照射範囲を調節することができるようになっている。
ＣＣＤ５は、ダイクロイックミラー１８を透過し結像レンズ１９により結像された蛍光を撮影して標本Ｓの画像を構築するようになっている。また、ＣＣＤ５は、画像を構築するフレーム信号をコントローラ２０に出力するようになっている。

コントローラ２０は、図２に示すように、ＣＣＤ５による蛍光の検出感度を調整可能な感度調整部２１と、この感度調整部２１、前記照明強度変更部３および照明装置１０を制御する制御部２３と、対物レンズ１７の瞳位置に集光する励起光の光軸に交差する方向の集光位置に応じた観察方法、すなわち、ＴＩＲＦ観察と落射蛍光観察のそれぞれにおける制御部２３による最適な制御情報を記憶する記憶部２５とを備えている。

感度調整部２１は、ＣＣＤ５の露光時間やゲインを変更することにより、ＣＣＤ５による蛍光の検出感度を調整することができるようになっている。
記憶部２５は、制御情報として、ＴＩＲＦ観察と落射蛍光観察のそれぞれについて、ガルバノミラー１１により変更する対物レンズ１７の瞳位置における励起光の光軸に交差する方向の集光位置と、照明強度変更部３により調整する励起光の最適な強度と、感度調整部２１により調整するＣＣＤ５の最適な検出感度とを記憶するようになっている。

制御部２３は、観察方法切替部としても機能し、予め設定された切替パターンに応じて、ＴＩＲＦ観察と落射蛍光観察とを切替えるようになっている。また、制御部２３は、落射蛍光観察であれば、対物レンズ１７の瞳位置における励起光の光軸に交差する方向の集光位置が対物レンズ１７の瞳の中心に位置するようにガルバノミラー１１の揺動角度θを設定し、また、ＴＩＲＦ観察であれば、対物レンズ１７の瞳位置における励起光の光軸に交差する方向の集光位置が対物レンズ１７の瞳の中心から光軸に直交する方向に距離Ｘずらした位置となるようにガルバノミラー１１の揺動角度θを設定するようになっている。

また、制御部２３は、ＣＣＤ５から入力されるフレーム信号に同期する同期信号に基づいて、予め設定されている切替パターンで切替える観察方法に従い、記憶部２５に記憶されている励起光の所定の強度、ＣＣＤ５の所定の検出感度および励起光の集光位置を読み出し、照明強度変更部３による励起光の強度の調整、感度調整部２１によるＣＣＤ５の検出感度の調整およびガルバノミラー１１による励起光の集光位置の変更を制御するようになっている。

このように構成された顕微鏡装置１００の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１００を用いて、ＴＩＲＦ観察と落射蛍光観察を切替えながら標本Ｓを観察するには、予め、制御部２３にＴＩＲＦ観察と落射蛍光観察の切替パターンを入力しておく。

次いで、ＴＩＲＦ観察と落射蛍光観察のそれぞれについて、照明強度変更部３により調整する励起光の最適な強度、感度調整部２１により調整するＣＣＤ５の最適な検出感度、および、ガルバノミラー１１により変更する対物レンズ１７の瞳位置における励起光の光軸に交差する方向の集光位置を記憶させる。

次に、図示しない入力装置によりユーザがコントローラ２０に観察開始を指示すると、制御部２３により、ＣＣＤ５から送られてくる画像を構築するフレーム信号に同期する同期信号に基づいて、予め設定された観察方法の切替パターンに従い、その観察方法に最適な励起光の強度、ＣＣＤ５の検出感度、および、励起光の集光位置が記憶部２５から読み出され、照明強度変更部３、感度調整部２１およびガルバノミラー１１が制御される。

そして、光源１から発せられ照明強度変更部３により強度が調整された励起光は、ガルバノミラー１１により反射されてリレーレンズ１３によりリレーされ、視野絞り１５を通過してダイクロイックミラー１８により反射された後、対物レンズ１７によりガラス板１９を介して標本Ｓに照射される。そして、標本Ｓにおいて発生した蛍光は、ガラス板９を介して対物レンズ１７により集光され、ダイクロイックミラー１８を透過した後、結像レンズ１９を介してＣＣＤ５により撮影される。

この場合において、例えば、観察方法の切替パターンとして１枚目の画像がＴＩＲＦ観察に設定されているとすると、制御部２３により、ガルバノミラー１１の揺動角度θが調整されて、対物レンズ１７の瞳位置における励起光の光軸に交差する方向の集光位置が、対物レンズ１７の瞳の中心から光軸に直交する方向に距離Ｘずらされる。これにより、ガラス板９に対して全反射される角度で励起光が入射される。また、制御部２３により、照明強度変更部３が制御されて励起光がＴＩＲＦ観察に最適な強度に調整されるとともに、感度調整部２１が制御されて、感度調整部２１によってＣＣＤ５がＴＩＲＦ観察に最適な検出感度に調整される。

その結果、ガラス板９において励起光が全反射されることによりガラス板９から染み出たエバネッセント光によって標本Ｓが局所的に照明され、１枚目の画像として、エバネッセント光が達したごく浅い領域の蛍光像がＣＣＤ５によって取得される。これにより、標本Ｓの局所的な領域をＴＩＲＦ観察することができる。

続いて、例えば、観察方法の切替パターンとして２枚目の画像が落射蛍光観察に設定されているとすると、制御部２３により、ガルバノミラー１１の揺動角度θが調整されて、対物レンズ１７の瞳位置において瞳の中心に励起光が集光させられる。これにより、ガラス板９に対して垂直に励起光が入射される。また、制御部２３により、照明強度変更部３が制御されて励起光が落射蛍光観察に最適な強度に調整されるとともに、感度調整部２１が制御されて、感度調整部２１によってＣＣＤ５が落射蛍光観察に最適な検出感度に調整される。

その結果、対物レンズ１７の瞳位置において瞳の中心に沿って励起光が標本Ｓに照明され、２枚目の画像として、落射照明された標本Ｓ全体の蛍光像がＣＣＤ５によって取得される。これにより、標本Ｓ全体を落射蛍光観察することができる。

このようにして、ＴＩＲＦ観察と落射蛍光観察とが混在しながら所定の切替パターンで切替えられるタイムラプスイメージングが行われる。そして、観察方法ごとに、制御部２３により、励起光の強度、ＣＣＤ５の検出感度および励起光の集光位置が変更されて、最適な画像が取得される。

以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡装置１００によれば、制御部２３により、ＣＣＤ５によって画像が構築されるフレーム信号に同期する同期信号に基づいて、所定の切替パターンで切替えられる観察方法に従い、記憶部２５に記憶されているその観察方法に最適な励起光の所定の強度、ＣＣＤ５の所定の検出感度、および、励起光の集光位置となるように、照明強度変更部３、感度調整部２１およびガルバノミラー１１が制御されることで、ＴＩＲＦ観察と落射蛍光観察とが混在するタイムラプスイメージングにおいて、これらの観察方法ごとに標本Ｓの最適な画像を簡易に取得することができる。

本実施形態に係る顕微鏡装置１００は、例えば、細胞膜と細胞質との間や細胞膜と核との間などの分子移動の観察に適用することができる。例えば、蛍光標識された標的分子が、細胞膜の近傍に存在するときはＴＩＲＦ観察により詳細に観察し、細胞膜を離れて細胞質や核に存在するときは落射蛍光観察することにより、標的分子の経時的な移動を詳細に観察することができる。

例えば、ＰＫＣ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ）は、ホルボールエステルなどの刺激により活性化されると、細胞質から細胞膜へ移動することが知られている。また、細胞膜の表面に存在するレセプターの中には、リガンドの結合により細胞質内に移行し、細胞質内でリガンドと解離後に再び細胞膜の表面に移行してリサイクルされるものが知られている。本実施形態に係る顕微鏡装置１００によれば、このような現象を詳細に観察することができる。

本実施形態においては、強度調整部として、励起光の透過率が異なる複数のＮＤフィルタを切替可能に備えるフィルタ装置を例示して説明したが、これに代えて、ＡＯＴＦ（Ａｃｏｕｓｔｏｏｐｔｉｃａｌ Ｔｕｎａｂｌｅ Ｆｉｌｔｅｒ）のような音響光学素子を採用することとしてもよいし、例えば、光源１の出力を変更可能な出力変更装置を採用することとしてもよい。このようにすることで、一般的に入手し易い装置により照明光の強度を簡易に調整することができる。

また、本実施形態においては、制御部２３が観察方法切替部の機能も兼ねることとしたが、予め設定された切替パターンで観察方法を切替える観察方法切替部を制御部２３とは別個に設けることとしてもよい。
また、本実施形態においては、ＴＩＲＦ観察と落射蛍光観察のそれぞれで最適な画像を取得するために、励起光の強度とＣＣＤ５の検出感度の両方を調整する態様を示したが、励起光の強度調整のみでＴＩＲＦ観察と落射蛍光観察のそれぞれで最適な画像が取得できる場合は、ＣＣＤ５の検出感度を調整しなくてもよい。

１ 光源
３ 照明強度変更部（強度調整部）
５ ＣＣＤ（画像構築部）
１１ ガルバノミラー（集光位置変更部）
１７ 対物レンズ
２１ 感度調整部
２３ 制御部（観察方法切替部）
２５ 記憶部
１００ 顕微鏡装置

Claims (4)

1. 光源から発せられた照明光を標本に照射して該標本から戻る戻り光を集光する対物レンズと、
   該対物レンズにより集光された前記戻り光を検出して前記標本の画像を構築する画像構築部と、
   前記対物レンズにより前記標本に照射される前記照明光の強度を調整可能な強度調整部と、
   前記対物レンズの瞳位置における前記照明光の光軸に交差する方向の集光位置を落射蛍光観察とエバネッセント光を用いるＴＩＲＦ（Total Internal Reflection Fluorescence）観察とで変更可能な集光位置変更部と、
   前記落射蛍光観察と前記ＴＩＲＦ観察のそれぞれにおける、前記強度調整部により調整する前記照明光の所定の強度、および、前記集光位置変更部により変更する前記照明光の集光位置を記憶する記憶部と、
   前記落射蛍光観察と前記ＴＩＲＦ観察とを切替え可能な観察方法切替部と、
   前記画像構築部により所定の時間間隔で前記画像を構築するフレーム信号に同期する同期信号に基づいて、該観察方法切替部により切替えられる前記落射蛍光観察と前記ＴＩＲＦ観察のそれぞれについて、前記記憶部に記憶されている前記照明光の所定の強度および前記照明光の集光位置を読み出して、前記強度調整部による前記照明光の強度の調整および前記集光位置変更部による前記照明光の集光位置の変更を制御する制御部とを備える顕微鏡装置。
2. 前記画像構築部による前記戻り光の検出感度を調整可能な感度調整部を備え、
   前記記憶部が、前記感度調整部により調整する前記画像構築部の所定の検出感度をさらに記憶し、
   前記制御部が、前記画像構築部により所定の時間間隔で前記画像を構築するフレーム信号に同期する同期信号に基づいて、前記観察方法切替部により切替えられる前記落射蛍光観察と前記ＴＩＲＦ観察のそれぞれについて、前記記憶部に記憶されている前記画像構築部の所定の検出感度をさらに読み出して、前記感度調整部による前記画像構築部の検出感度の調整をさらに制御する請求項１に記載の顕微鏡装置。
3. 前記強度調整部が、前記照明光の透過率を変更可能な音響光学素子、前記照明光の透過率が異なる複数の減光フィルタを切替可能に備えるフィルタ装置、または、前記光源の出力を変更可能な出力変更装置である請求項１または請求項２に記載の顕微鏡装置。
4. 前記画像構築部が２次元撮像素子であり、
   前記感度調整部が、前記２次元撮像素子の露光時間および／またはゲインを変更する請求項２または請求項３に記載の顕微鏡装置。

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