JP6208166B2 - 単一分子全ゲノム解析のための方法及び装置 - Google Patents
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Description
本明細書は、2008年6月30日に出願された米国出願第61/076,785号に対して優先権を主張するものである。
本発明は、ナノ流体工学の領域、及びDNA配列の領域に関連するものである。
付加的な実施形態
本明細書の他の所で記載したように、請求された本発明は、とりわけ、長いゲノムDNAを産生する方法、配列特異的タグ化の方法、及び、個々のDNAの直接的画像化及びナノチャネル(直径<500nm)内部の単一DNA分子上の複数配列モチーフ或いは多型部位の局在化に基づいた及びDNAバーコード化戦略を含む、DNAマッピング及びシークエンシングに関連した方法を提供する。その方法はさらに、DNAマップの構成内の、塩基配列情報による連続塩基も提供する。先行する方法と比較して、DNAマッピングの請求された方法は、改善された標識化効率、より安定な標識化、高感度、及びより良い解像度を提供し;DNAシークエンシングの本発明者らの方法は、長い鋳型構成における塩基解読、構築の容易さ、及び他のシークエンシング技術では利用できない、ハプロタイプや構造多型などの情報を提供する。
a)特異的配列モチーフでニックを導入するために、1若しくはそれ以上のニッキングエンドヌクレアーゼを用いて、長い(例えば2kb以上)の二本鎖ゲノムDNAの一本鎖にニッキングする工程;
b)DNAポリメラーゼを用いて、ニックにて蛍光色素−標識化ヌクレオチドを取り込ませる工程;
c)ナノチャネル内部に直線形態で標識化されたDNAを伸長させる工程であって、チャネルを通じて流れるその分子或いはその分子の一部はDNAの一端が次にチャネル内に配置されるように固定化されるものである、工程;
d)DNAのマップ或いはバーコードを得るために、蛍光顕微鏡を用いて、DNA骨格に関連した蛍光標識の位置を決定する工程、を有している。
a)特異的配列モチーフにニックを導入するために、ニッキングエンドヌクレアーゼで、長い(>2Kb)二本鎖ゲノムDNA分子の1本鎖をニッキングする工程、
b)フラップ配列を産生するために下流鎖を置換するように、DNAポリメラーゼを用いて、蛍光色素−標識化ヌクレオチド或いは非蛍光色素−標識化ヌクレオチドをニックで取り込む工程、
c)標識化されたヌクレオチドのポリメラーゼ取り込み;或いは蛍光プローブの直接的ハイブリダイゼーション;或いはリガーゼを用いた蛍光プローブのライゲーションによってフラップ配列を標識化する工程、
d)本明細書の他の所に記載されたように、直線形態へ標識化されたDNA分子を伸長させる工程;
e)DNAのマップ或いはバーコードを得るために、蛍光顕微鏡を用いて、DNA骨格に関連した蛍光標識の位置を決定する工程、を有するものである。
a)特異的配列モチーフでニックを導入するために、ニッキングエンドヌクレアーゼを用いて、長い(>2Kb)二本鎖ゲノムDNA分子の一本鎖をニッキングする工程、
b)1若しくはそれ以上のフラップ配列を産生するために下流鎖を置換するように、DNAポリメラーゼを用いて、蛍光色素−標識化ヌクレオチドプローブ、或いは非蛍光色素−標識化ヌクレオチドをニックで取り込む工程、
c)新たに伸長した鎖にニックを入れ、新たに形成されたフラップ配列をフラップエンドヌクレアーゼで切断するために、ニッキングエンドヌクレアーゼを利用する工程、(脱離したssDNAは、それらの結合を遊離させるように例えば温度を上げるなどによって除去され得るものである。)
d)標識化されたヌクレオチドの取り込み;或いは蛍光プローブの直接的ハイブリダイゼーション;若しくはリガーゼを用いた蛍光プローブのライゲーションを介して(ニッキング及びそれに続くフラップの形成によって発展した)ssDNAギャップを標識化する工程、
e)本明細書の他の所に記載されたように、直線形態へ標識化されたDNA分子を伸長させる工程、
f)DNAのマップ或いはバーコードを得るために、蛍光顕微鏡を用いてDNA骨格に関連した蛍光標識の位置を決定する工程、を有するものである。
a)特異的配列モチーフでニックを導入するために、ニッキングエンドヌクレアーゼを用いて、長い(>2Kb)二本鎖ゲノムDNA分子の一本鎖にニッキングする工程、
b)ニック−取り込み;フラップ標識化、ssDNA標識化、或いはそれらのいくつかの組み合わせを通じて、蛍光色素分子によってニッキング部位をタグ化する工程、
c)本明細書の他の所に記載したように、直線形態へ標識化DNA分子を伸長させる工程、
d)DNAのマップ或いはバーコードを得るために、蛍光顕微鏡を用いて、DNA骨格に関連した蛍光標識の位置を決定する工程、
e)シークエンシング反応の初期化ポイントとしてニッキング部位を使用する工程、を有するものである。これに限定されるものではないが以下のものを含む、異なるDNA構造は、DNAシークエンシングに有用である。
ゲノムDNAサンプルは、ニッキング反応において使用するために、50ngに希釈した。10μLのラムダDNA(50ng/μL)を0.2mL PCR遠心管へ添加し、その後2μLの10X NEバッファー#2、及びこれに限定されるものではないが、Nb.BbvCI;Nb.BsmI;Nb.BsrDI;Nb.BtsI;Nt.AlwI;Nt.BbvCI;Nt.BspQI;Nt.BstNBI;Nt.CviPIIを含む、3μLのニッキングエンドヌクレアーゼを添加した。混合物は1時間37℃でインキュベーションした。
フラップ産生後、オリジナルニッキングエンドヌクレアーゼは、充填された二本鎖DNAに切れ目を入れるために使用し、これに限定されるものではないがFEN1を含むフラップエンドヌクレアーゼは、フラップ配列を切断するために使用した。温度が上昇するにつれて、切れ目を入れられた一本鎖DNA分子は二本鎖DNA分子から除去されて、二本鎖DNA分子上に一本鎖DNAギャップを産生した。
ニッキング反応が完了後、実験では、3’下流鎖を置換し一本鎖DNA分子を産生するために、ニッキング部位での、これに限定されるものではないがBstポリメラーゼであるPhi29を含む完全なポリメラーゼ伸長を進めた。
ゲノムDNAサンプルは、ニッキング反応において使用するために50ngに希釈した。10μLのラムダDNA(50ng/μL)を0.2mL PCR遠心管へ添加し、その後2μLの10X NEバッファー#2(New England BioLabs,www.neb.com)、及びこれに限定されるものではないが、Nb.BbvCI;Nb.BsmI;Nb.BsrDI;Nb.BtsI;Nt.AlwI;Nt.BbvCI;Nt.BspQI;Nt.BstNBI;Nt.CviPIIを含む、3μLのニッキングエンドヌクレアーゼを添加した。混合物は、1時間37℃でインキュベーションした。
フラップ配列が産生された時点で、そのフラップは、これに限定されるものではないが、以下の方法、プローブのハイブリダイゼーション、ポリメラーゼによる蛍光ヌクレオチドの取り込み、及び蛍光プローブのライゲーションを含む方法によって、蛍光色素分子で標識化され得る。
500nm或いはそれ以下の幅、深さ或いはその両者を持つナノ流体チップを、染色されたゲノムDNAを含有するバッファー溶液によって毛細管現象を利用して満たし、電場を用いてチャネルへとDNA高分子を引き寄せた。バクテリアファージDNA分子ラムダ(48.5kb)及びヒトBACクローン(170kb)は、色素YOYO−1で染色した。染色されたDNAのこの溶液は、抗酸化剤として使用される0.1Mジチオスレイトール及び抗固着剤として使用される0.1%の直鎖状アクリルアミドを含有する0.5X TBE中へと0.5μg/mLになるように希釈した。
検出スキームの1実施例において、流動モードにおけるDNA移動のビデオ画像は、時間遅延積分方式(TDI)カメラによって捉えた。そのような実施形態において、DNAの移動はTDIを用いて同期化した。
Claims (14)
- DNAをプロセシングする方法であって、
1若しくはそれ以上のニッキング部位を生じさせるために二本鎖DNAの第一のDNA鎖をニッキングする工程と、
前記ニッキング部位で1若しくはそれ以上のヌクレオチドを組み込む工程であって、前記第一のDNA鎖と、ポリメラーゼ、1若しくはそれ以上のヌクレオチド、及びリガーゼとを接触させる工程を有し、これにより、前記二本鎖DNAに前記1若しくはそれ以上のヌクレオチドを組み込む、前記組み込む工程と、
前記第一のDNA鎖上の1若しくはそれ以上の配列特異的位置を標識化する工程と、
前記第一のDNA鎖の伸長された領域の少なくとも一部を引き延ばす工程であって、これにより、前記第一のDNA鎖の伸長された領域の少なくとも一部を有する前記二本鎖DNAの少なくとも一部を直線化する、前記引き延ばす工程と
を有する方法。 - 請求項1記載の方法において、前記ニッキングする工程は、1若しくはそれ以上の配列特異的位置で達成される、方法。
- 請求項1記載の方法において、前記ニッキングする工程は、1若しくはそれ以上の非配列特異的位置で達成される、方法。
- 請求項1記載の方法において、前記標識化する工程は、(a)前記二本鎖DNAの少なくとも一部に対して、少なくとも1つの相補的プローブを結合させる工程であって、前記プローブは1若しくはそれ以上のタグを有するものである、前記結合させる工程、(b)1若しくはそれ以上のタグを有する1若しくはそれ以上のヌクレオチドを有する前記第二のDNA鎖の対応する領域に沿って前記第一のDNA鎖を伸長させる工程、または(a)及び(b)の組み合わせによって達成される、方法。
- 請求項4記載の方法であって、さらに、1若しくはそれ以上のタグ由来の配列情報を取得する工程を有する、方法。
- 請求項5記載の方法において、前記配列情報は前記二本鎖DNA上の2若しくはそれ以上の位置に由来する、方法。
- 請求項4記載の方法において、前記標識化する工程は、フルオロフォア、量子ドット、デンドリマー、ナノワイヤー、ビーズ、ペプチド、タンパク質、磁気ビーズ、メチル基、メチルトランスフェラーゼ、非切断制限酵素、亜鉛フィンガータンパク質、抗体、転写因子、DNA結合タンパク質、ヘアピンポリアミド、三重鎖形成オリゴデオキシヌクレオチド、ペプチド核酸、またはそれらの任意の組み合わせを有するタグを付着させる工程を有する、方法。
- 請求項4記載の方法であって、さらに、1若しくはそれ以上のタグからの1若しくはそれ以上のシグナルを検出する工程を有し、前記シグナルは蛍光シグナル、化学発光シグナル、電磁気シグナル、電気シグナル、電位差、物理的なサイズの差、またはそれらの任意の組み合わせを有する、方法。
- 請求項1記載の方法であって、さらに、2若しくはそれ以上のタグの間の距離を測定する工程を有する、方法。
- 請求項9記載の方法であって、さらに、前記距離と、構造、配列構築、遺伝的または細胞遺伝学的マップ、メチル化パターン、CpG島の位置、エピゲノムパターン、生理学的特徴、またはそれらの任意の組み合わせとを相関させる工程を有する、方法。
- 請求項1記載の方法において、前記直線化は、チャネル内でのDNAの閉じ込めによって達成される、方法。
- 請求項7記載の方法であって、さらに、少なくとも1つのタグからの少なくとも1つのシグナルの強度を測定する工程を有する、方法。
- 請求項12記載の方法であって、さらに、前記少なくとも1つのシグナルの強度と、構造、配列構築、遺伝的または細胞遺伝学的マップ、メチル化パターン、生理学的特徴、CpG島の位置、エピゲノムパターン、またはそれらの任意の組み合わせとを相関させる工程を有する、方法。
- 請求項1記載の方法であって、さらに、前記直線化された第一のDNA鎖上の2若しくはそれ以上の標識化された配列特異的位置の相対的位置を決定する工程を有する、方法。
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