JP6124205B2 - Artificial lipid film forming apparatus and artificial lipid film forming method - Google Patents
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Description
本発明は、イオンチャネルをはじめとする膜タンパク質解析に用いられる人工脂質膜の形成装置に関する。また、本発明は、その装置を使用した人工脂質膜形成方法に関する。 The present invention relates to a device for forming an artificial lipid membrane used for analysis of membrane proteins including ion channels. The present invention also relates to a method for forming an artificial lipid film using the apparatus.
生物を構成する細胞や、細胞内に存在するミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体等の各種オルガネラ、細胞核等は、外側が生体膜で覆われており、この生体膜は、脂質膜から構成されている。生理活性を有する様々なタンパク質、すなわち、レセプターや酵素等がこの脂質膜を貫通する形で脂質膜上に保持されている。これら膜タンパク質は、生体内で重要な役割を果たしている。特に、細胞膜上に存在する各種レセプターは、生体内に存在するリガンドと結合することにより、様々な生理学的反応を引き起こす引き金になることがわかっている。このため、医薬品を開発するためには、これら膜タンパク質の、各種リガンドや阻害剤との結合能や、それらの結合によって引き起こされる機能に関して、詳細に解析することが必要とされる。 Cells that make up living organisms, various organelles such as mitochondria, Golgi bodies, and endoplasmic reticulum, cell nuclei, etc. are covered with a biological membrane on the outside, and this biological membrane is composed of a lipid membrane. . Various proteins having physiological activity, that is, receptors, enzymes, and the like are held on the lipid membrane in a form penetrating the lipid membrane. These membrane proteins play an important role in vivo. In particular, it has been found that various receptors present on cell membranes trigger various physiological reactions by binding to ligands present in the living body. For this reason, in order to develop pharmaceuticals, it is necessary to analyze in detail the ability of these membrane proteins to bind to various ligands and inhibitors and the functions caused by their binding.
これらの膜タンパク質を解析するためには、生体内と同じ状態、すなわち、膜タンパク質が生体膜に保持された状態で各種測定を行うことが望まれる。これを実現するための模擬生体膜として、種々の人工脂質膜形成方法が提案されており、人工脂質膜を用いた膜タンパク質の解析も既に報告されている。 In order to analyze these membrane proteins, it is desired to perform various measurements in the same state as in the living body, that is, in a state where the membrane protein is held on the biological membrane. Various artificial lipid membrane formation methods have been proposed as simulated biological membranes for realizing this, and analysis of membrane proteins using artificial lipid membranes has already been reported.
これまで報告されてきた人工脂質膜を用いた膜タンパク質解析の方法は、主に以下の二つに分けられる。第一に脂質膜の両側に電圧を印加することにより、電気的に計測する方法、第二に光学顕微鏡を用いて脂質二重膜を観察しながら、蛍光検出により計測する方法である。長年これら二つの計測方法は別々に開発されてきたが、近年これら電気計測と蛍光検出を同時に行う方法が開発された（特許文献１、特許文献２、非特許文献１）。電気計測と蛍光検出は、膜タンパク質解析において互いに不足する情報を補う関係にあるため、これまで不可能であった解析が可能となり、新たな膜タンパク質の機能の解明に繋がることが期待されている。例えば、リガンドや阻害剤とリガンド結合型チャネルタンパク質の相互作用と、そのリガンド結合型チャネルタンパク質のゲーティングに伴う構造変化、の関連性等を解析することが可能となる。さらに最近では、電気計測と蛍光検出を同時に行える人工脂質膜を具備する微小なチャンバを作製することで、膜タンパク質の輸送機能も解析可能となった（非特許文献２、特許文献３）。これは、膜タンパク質による物質の輸送量は微量であるため、それらを高感度に蛍光検出するためには、微小なチャンバの作製により、チャンバ内の物質濃度を上げる必要があったためである。 The methods for membrane protein analysis using artificial lipid membranes that have been reported so far are mainly divided into the following two methods. The first is a method of electrical measurement by applying a voltage to both sides of the lipid membrane, and the second is a method of measurement by fluorescence detection while observing the lipid bilayer using an optical microscope. Although these two measurement methods have been developed separately for many years, recently, a method of simultaneously performing these electrical measurements and fluorescence detection has been developed (Patent Document 1, Patent Document 2, Non-Patent Document 1). Electrical measurement and fluorescence detection complement each other's lack of information in membrane protein analysis, making it possible to perform analyzes that were not possible before and are expected to lead to the elucidation of new membrane protein functions. . For example, it is possible to analyze the relationship between the interaction between a ligand or an inhibitor and a ligand-binding channel protein and the structural change accompanying gating of the ligand-binding channel protein. Furthermore, recently, it has become possible to analyze the transport function of membrane proteins by producing a minute chamber equipped with an artificial lipid membrane capable of simultaneously performing electrical measurement and fluorescence detection (Non-patent Documents 2 and 3). This is because the amount of substances transported by membrane proteins is very small, and in order to detect them with high sensitivity, it is necessary to increase the substance concentration in the chamber by producing a minute chamber.
非特許文献２の同時計測微小チャンバシステム、すなわち電気計測と蛍光検出を同時に行う微小チャンバを備えたシステムでは、ガラス基板上にアガロースゲル層を形成し、脂質が分散した有機溶媒中で、微小液滴と、前記アガロースゲル層と、を接触させることにより、脂質膜および微小な脂質膜チャンバを形成している。この微小な脂質膜チャンバを用いて、蛍光検出による膜タンパク質の物質輸送の解析が可能である。また、電気計測用の電極をマニピュレータなどで精密に操作しながらチャンバとなる微小液滴内に導入することにより、電気計測も可能である。 In the simultaneous measurement micro-chamber system of Non-Patent Document 2, that is, a system equipped with a micro-chamber that simultaneously performs electrical measurement and fluorescence detection, an agarose gel layer is formed on a glass substrate, and the micro liquid is dispersed in an organic solvent in which lipids are dispersed. A lipid membrane and a minute lipid membrane chamber are formed by bringing a droplet into contact with the agarose gel layer. Using this minute lipid membrane chamber, it is possible to analyze membrane protein mass transport by fluorescence detection. In addition, electrical measurement can be performed by introducing an electrode for electrical measurement into a micro droplet serving as a chamber while precisely operating it with a manipulator or the like.
特許文献３の同時計測微小チャンバシステム、すなわち電気計測と蛍光検出を同時に行う微小チャンバを備えたシステムでは、マイクロ流体デバイスを用いており、前記マイクロ流体デバイスは体積が数ｐＬである微小なチャンバを備えている。電気計測用の電極は予めチャンバ内となる部分の基板上にパターンされている。マイクロ流路に、水溶液、脂質溶液、水溶液の順に溶液を注入することにより、人工脂質膜チャンバを形成することができる。本システムにより形成された人工脂質膜は顕微鏡の対物レンズに対して垂直である。 In the simultaneous measurement microchamber system of Patent Document 3, that is, a system including a microchamber that simultaneously performs electrical measurement and fluorescence detection, a microfluidic device is used, and the microfluidic device has a microchamber having a volume of several pL. I have. Electrodes for electrical measurement are previously patterned on a portion of the substrate in the chamber. An artificial lipid membrane chamber can be formed by injecting the solution into the microchannel in the order of aqueous solution, lipid solution, and aqueous solution. The artificial lipid membrane formed by this system is perpendicular to the microscope objective.
上記同時計測微小チャンバシステムに関する従来技術には以下のような課題があった。 The prior art related to the simultaneous measurement micro-chamber system has the following problems.
非特許文献２記載の従来技術には次のような課題があった。第一に、利便性に欠ける点である。従来技術では、計測する際には毎回、チャンバとなる液滴毎に、電極をマニピュレータなどで精密に操作しながら液滴内に導入する必要があるので、計測のために時間と労力、技術を要する。第二に、同時計測のマルチチャネル化が困難でありスループット性に欠ける点である。非特許文献２記載の従来技術において、チャンバ毎に電極を導入する工程が必要であるため、本従来技術を用いたマルチチャネル化は現実的ではない。膜タンパク質の解析には一つのタンパク質につき多くのデータを取得する必要があるため、実用化に向けてはマルチチャネル化が望まれている。 The prior art described in Non-Patent Document 2 has the following problems. First, it is not convenient. In the prior art, each time a measurement is made, it is necessary to introduce the electrode into the droplet while accurately manipulating the electrode with a manipulator or the like for each droplet serving as a chamber. Cost. Second, multi-channel simultaneous measurement is difficult and lacks throughput. In the prior art described in Non-Patent Document 2, since a process of introducing an electrode for each chamber is required, multi-channeling using this prior art is not realistic. In order to analyze membrane proteins, it is necessary to acquire a large amount of data for each protein, and therefore, multichanneling is desired for practical use.
特許文献３記載の従来技術には次のような課題があった。第一に、利便性に欠ける点である。従来技術では、人工脂質膜を形成するために、マイクロ流路中に複数種類の溶液を注入する工程を含むため、溶液を注入するためのシリンジやシリンジポンプなどの特別な装置が必要となる。第二に、形成した人工脂質膜を顕微鏡で観察できないことである。特許文献３記載の従来技術を用いて形成された人工脂質膜は、顕微鏡の対物レンズに対して垂直であるため、顕微鏡で人工脂質膜の様子を観察できない。人工脂質膜上または内部でのリガンドと膜タンパク質の結合の様子などを蛍光顕微鏡などで観察するためには、人工脂質膜を顕微鏡により直接観察できることが必要である。また、人工脂質膜が形成されているのかを確認するためにも、人工脂質膜を顕微鏡により直接観察できることが望ましい。 The prior art described in Patent Document 3 has the following problems. First, it is not convenient. In the prior art, in order to form an artificial lipid membrane, a step of injecting a plurality of types of solutions into the microchannel is included, so that a special device such as a syringe or syringe pump for injecting the solution is required. Second, the formed artificial lipid membrane cannot be observed with a microscope. Since the artificial lipid film formed using the prior art described in Patent Document 3 is perpendicular to the objective lens of the microscope, the state of the artificial lipid film cannot be observed with a microscope. In order to observe the state of binding of a ligand and a membrane protein on or inside the artificial lipid membrane with a fluorescence microscope or the like, it is necessary that the artificial lipid membrane can be directly observed with a microscope. In order to confirm whether an artificial lipid membrane is formed, it is desirable that the artificial lipid membrane can be directly observed with a microscope.
本発明は、上記従来の課題を解決し、
（ａ）電極と、
（ｂ）顕微鏡により直接観察可能な人工脂質膜と、
を具備する、微小な人工脂質膜チャンバを作製するための、
（ｃ）簡便で、
（ｄ）スループット性を有する、
人工脂質膜形成方法、
および、その方法を実施するための装置を提供することを目的とする。
The present invention solves the above conventional problems,
(A) an electrode;
(B) an artificial lipid membrane that can be directly observed with a microscope;
For producing a minute artificial lipid membrane chamber comprising:
(C) Simple and
(D) has throughput.
Artificial lipid membrane formation method,
And it aims at providing the apparatus for enforcing the method.
本発明は、上記目的を達成するために、
（１)人工脂質膜形成装置において、前記装置は、疎水性層および親水性パターンを具備する基板と、前記基板の親水性パターンの上に液滴を形成するための溶液注入部と、を含むことを特徴とする。
In order to achieve the above object, the present invention provides
(1) In the artificial lipid film forming apparatus, the apparatus includes a substrate having a hydrophobic layer and a hydrophilic pattern, and a solution injection part for forming droplets on the hydrophilic pattern of the substrate. It is characterized by that.
（２）上記（１）記載の人工脂質膜形成装置において、前記親水性パターンの径が１０μｍ以上２０００μｍ以下であることを特徴とする。 (2) The artificial lipid film forming apparatus according to (1), wherein the hydrophilic pattern has a diameter of 10 μm or more and 2000 μm or less.
（３）上記（１）記載の人工脂質膜形成装置において、前記基板がガラスであることを特徴とする。 (3) The artificial lipid film forming apparatus according to (1), wherein the substrate is glass.
（４〕上記（１）記載の人工脂質膜形成装置において、前記疎水性層がサイトップまたはパリレンであることを特徴とする。 (4) The artificial lipid film forming apparatus according to the above (1), wherein the hydrophobic layer is Cytop or Parylene.
（５）上記（１）記載の人工脂質膜形成装置において、前記親水性パターンの表面に前記基板の外部と接続される電極が配置されていることを含むことを特徴とする。 (5) The artificial lipid film forming apparatus according to (1), wherein an electrode connected to the outside of the substrate is disposed on the surface of the hydrophilic pattern.
（６）上記（１）載の人工脂質膜形成装置において、前記電極が金電極または銀塩化銀電極であることを特徴とする。 (6) In the artificial lipid film forming apparatus according to (1), the electrode is a gold electrode or a silver-silver chloride electrode.
（７）人工脂質膜チャンバにおいて、前記人工脂質膜チャンバは、本発明の人工脂質膜形成装置を用いて形成され、前記基板の親水性パターンの上に配置された液滴と、前記液滴の上方の水または水溶液と、の接触部分に人工脂質膜を備えることを特徴とする。 (7) In the artificial lipid membrane chamber, the artificial lipid membrane chamber is formed using the artificial lipid membrane forming apparatus of the present invention, and a droplet disposed on the hydrophilic pattern of the substrate; An artificial lipid membrane is provided in a contact portion with the upper water or aqueous solution.
（８）人工脂質膜形成方法において、前記方法は、本発明の人工脂質膜形成装置を用いて、前記基板に、水または水溶液を注入し、親水性パターンの上に液滴を配置する、第１溶液注入工程；前記第１溶液注入工程の前または後に前記基板に脂質溶液を注入する脂質溶液注入工程；および水または水溶液を注入し、前記脂質溶液を介して、前記水または水溶液と、前記第１溶液注入工程によって形成された前記液滴と、を接触させる第２溶液注入工程を含むことを特徴とする。 (8) In the artificial lipid film forming method, the method uses the artificial lipid film forming apparatus of the present invention to inject water or an aqueous solution into the substrate and dispose droplets on the hydrophilic pattern. 1 solution injection step; a lipid solution injection step of injecting a lipid solution into the substrate before or after the first solution injection step; and water or an aqueous solution is injected, and the water or the aqueous solution is injected through the lipid solution; It includes a second solution injection step of bringing the droplets formed by the first solution injection step into contact with each other.
（９）上記（８）記載の人工脂質膜形成方法において、前記脂質溶液は脂質を分散させたヘキサデカンまたはデカンまたはスクアレンであることを特徴とする。 (9) In the method for forming an artificial lipid film described in (8) above, the lipid solution is hexadecane, decane or squalene in which lipid is dispersed.
（１０）上記（８）記載の人工脂質膜形成方法において、前記脂質溶液に分散した脂質はアゾレクチンまたはジフィタノイルホスファチジルコリンまたはEggPCまたはDOPCであることを特徴とする。 (10) In the method for forming an artificial lipid film described in (8) above, the lipid dispersed in the lipid solution is azolectin, diphytanyl phosphatidylcholine, EggPC, or DOPC.
（１１）脂質膜の分析システムにおいて、前記脂質膜の分析システムは、計測部と、表示部とを含み、本発明の人工脂質膜形成方法を実行することを特徴とする。 (11) In the lipid membrane analysis system, the lipid membrane analysis system includes a measurement unit and a display unit, and executes the artificial lipid membrane formation method of the present invention.
本発明の上記目的、他の目的、特徴および利点は、添付図面参照の下、以下の好適な実施態様な説明から明らかにされる。 The above object, other objects, features and advantages of the present invention will become apparent from the following description of preferred embodiments with reference to the accompanying drawings.
本発明の人工脂質膜形成方法および人工脂質膜形成装置によれば、人工脂質膜チャンバの作製にはシリンジやシリンジポンプ等の特別な装置を使用する必要がない。また、予め電極をチャンバ内部となる部分にパターンすることができるので、電極を導入する工程を含まずに、電極を具備する人工脂質膜チャンバを作製することができる。また、形成される人工脂質膜は対物レンズに対して平行となる。その結果、従来の人工脂質膜形成方法および装置よりも、簡便で、スループット性良く、電極と、顕微鏡で直接観察可能な人工脂質膜と、を具備する微小な人工脂質膜チャンバを作製することができる。 According to the artificial lipid film forming method and the artificial lipid film forming apparatus of the present invention, it is not necessary to use a special device such as a syringe or a syringe pump for producing the artificial lipid film chamber. In addition, since the electrode can be patterned in advance in the chamber, the artificial lipid membrane chamber including the electrode can be produced without including the step of introducing the electrode. Moreover, the artificial lipid film to be formed is parallel to the objective lens. As a result, it is possible to produce a minute artificial lipid membrane chamber comprising an electrode and an artificial lipid membrane that can be directly observed with a microscope, easier and with better throughput than conventional artificial lipid membrane formation methods and devices. it can.
１００ 人工脂質膜形成装置
１０１ 基板
１０２ 疎水性層
１０３ 親水性パターン
１０４ 親水性パターンの直径
１０５ 溶液注入部
２０１ 第１溶液
２０２ 脂質溶液
２０３ 第２溶液
３０１ 電極
３０２ 電極
DESCRIPTION OF SYMBOLS 100 Artificial lipid membrane formation apparatus 101 Substrate 102 Hydrophobic layer 103 Hydrophilic pattern 104 Diameter of hydrophilic pattern 105 Solution injection part 201 First solution 202 Lipid solution 203 Second solution 301 Electrode 302 Electrode
（実施形態１）
以下、本発明の実施形態について、図面を参照しながら説明する。
(Embodiment 1)
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
図１および図２は、本発明の実施形態１における人工脂質膜形成装置の断面図および斜投影図である。 1 and 2 are a cross-sectional view and a perspective view of an artificial lipid film forming apparatus according to Embodiment 1 of the present invention.
本実施形態において、人工脂質膜形成装置１００は基板１０１を備えている。基板１０１の材料はガラスが最も好ましい。ガラスはソーダガラスでも良いし、石英、ホウケイ酸ガラス、低融点ガラス、感光性ガラスなどでも良い。基板１０１は、光学計測の観点から透明であることが好ましい。なお、基板１０１は他の親水性材料でも良い。なお本発明では、基板１０１の形状は限定されない。 In the present embodiment, the artificial lipid film forming apparatus 100 includes a substrate 101. The material of the substrate 101 is most preferably glass. The glass may be soda glass, quartz, borosilicate glass, low-melting glass, photosensitive glass, or the like. The substrate 101 is preferably transparent from the viewpoint of optical measurement. The substrate 101 may be another hydrophilic material. In the present invention, the shape of the substrate 101 is not limited.
基板１０１の上には疎水性層１０２が設けられている。疎水性層１０２は、基板１０１上に疎水性薄膜を形成することにより作製することが最も好ましい。疎水性薄膜の材料は、サイトップ（登録商標）が最も好ましいが、パリレン（登録商標）やテフロン（登録商標）などの有機ポリマーでも良い。疎水性薄膜の形成方法は、スピンコート法や、蒸着やスパッタリングによる方法を利用しても良い。また、疎水性層の作製には、シラン化などの表面処理を利用しても良い。疎水性層１０２の厚みは、１０ｎｍ以上２μｍ以下であることが好ましく、１００ｎｍ以上１μｍ以下であることが最も好ましい。 A hydrophobic layer 102 is provided on the substrate 101. The hydrophobic layer 102 is most preferably produced by forming a hydrophobic thin film on the substrate 101. Cytop (registered trademark) is the most preferable material for the hydrophobic thin film, but organic polymers such as parylene (registered trademark) and Teflon (registered trademark) may be used. As a method for forming the hydrophobic thin film, a spin coating method, a method by vapor deposition or sputtering may be used. In addition, a surface treatment such as silanization may be used for producing the hydrophobic layer. The thickness of the hydrophobic layer 102 is preferably 10 nm or more and 2 μm or less, and most preferably 100 nm or more and 1 μm or less.
基板１０１の上には親水性パターン１０３が設けられている。親水性パターン１０３は、基板１０１にガラスなどの親水性材料を用い、基板１０１上の疎水性層を除去し、親水性材料を露出させることにより作製するのが最も好ましい。また、親水性パターン１０３は、疎水性層１０２上に親水性材料をパターンすることで作製しても良い。また、親水性パターン１０３は、疎水性層１０２を除去した後に、露出した基板１０１表面を、親水性薄膜形成または表面処理を用いて、親水性材料で被覆にすることにより作製しても良い。また、親水性パターン１０３は、疎水性層１０２上に親水性材料をパターンすることで作製しても良い。また、親水性パターン１０３は、疎水性層１０２を除去した後に、露出した基板１０１表面を、一般的に知られている他の親水化処理により親水化することで作製しても良い。 A hydrophilic pattern 103 is provided on the substrate 101. The hydrophilic pattern 103 is most preferably produced by using a hydrophilic material such as glass for the substrate 101, removing the hydrophobic layer on the substrate 101, and exposing the hydrophilic material. Alternatively, the hydrophilic pattern 103 may be produced by patterning a hydrophilic material on the hydrophobic layer 102. Alternatively, the hydrophilic pattern 103 may be produced by removing the hydrophobic layer 102 and then covering the exposed substrate 101 surface with a hydrophilic material using hydrophilic thin film formation or surface treatment. Alternatively, the hydrophilic pattern 103 may be produced by patterning a hydrophilic material on the hydrophobic layer 102. Alternatively, the hydrophilic pattern 103 may be produced by removing the hydrophobic layer 102 and then hydrophilizing the exposed surface of the substrate 101 by another generally known hydrophilic treatment.
親水性パターン１０３の形状は円形が最も好ましいが、楕円形や多角形など他の形状でも良い。親水性パターン１０３の直径１０４は、１μｍ以上３ｍｍ以下が好ましく、１０μｍ以上２ｍｍ以下がより好ましい。親水性パターン１０３は一つでも良いし、複数でも良い。図２に示した人工脂質膜形成装置１００は、親水性パターン１０３が６つである場合のものである。 The shape of the hydrophilic pattern 103 is most preferably circular, but may be other shapes such as an ellipse or a polygon. The diameter 104 of the hydrophilic pattern 103 is preferably 1 μm or more and 3 mm or less, and more preferably 10 μm or more and 2 mm or less. One or more hydrophilic patterns 103 may be used. The artificial lipid film forming apparatus 100 shown in FIG. 2 is for the case where there are six hydrophilic patterns 103.
次に、人工脂質膜の形成手順を説明する。図３は本発明の実施形態１における人工脂質膜形成装置の動作図を表す。なお、図３において、図１および図２と同様の構成については、同一符号を付し、その説明を省略する。 Next, a procedure for forming an artificial lipid membrane will be described. FIG. 3 shows an operation diagram of the artificial lipid film forming apparatus according to Embodiment 1 of the present invention. In FIG. 3, the same components as those in FIGS. 1 and 2 are denoted by the same reference numerals, and the description thereof is omitted.
まず、図３（a）は第１溶液注入工程を表す。第１溶液注入工程では、親水性パターン１０３上にのみ第１溶液２０１をパターンする。 First, FIG. 3A shows the first solution injection step. In the first solution injection step, the first solution 201 is patterned only on the hydrophilic pattern 103.
第１溶液２０１は水または水溶液である。第１溶液２０１には、リポソームやミセルを混合しても良い。リポソームやミセルを構成する脂質は、リン脂質であることが好ましい。なお、脂質は糖脂質でも良いし、リポ脂質でも良いし、他の脂質でも良い。脂質は、その他の天然由来の脂質であっても良いし、合成脂質でも良い。合成脂質は高純度で化学的に安定なものが得やすいのでより好ましい。具体的にはリン脂質であるジフィタノイルホスファチジルコリン、グリセルモノオレエイト、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンでも良いし、その他のリン酸脂質でも良い。 The first solution 201 is water or an aqueous solution. The first solution 201 may be mixed with liposomes and micelles. The lipid constituting the liposome or micelle is preferably a phospholipid. The lipid may be a glycolipid, a lipolipid, or another lipid. The lipid may be other naturally derived lipids or synthetic lipids. Synthetic lipids are more preferred because they are easy to obtain highly pure and chemically stable. Specifically, diphytanoyl phosphatidylcholine, glyceryl monooleate, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, dipalmitoylphosphatidylcholine, which are phospholipids, or other phospholipids may be used.
第１溶液２０１には、受容体、イオンチャネル、Ｇタンパク質などの生体膜タンパク質や分泌タンパク質を混合しても良い。第１溶液２０２にはグラミシジンなどのポリペプチドを混合しても良い。生体膜タンパク質や分泌タンパク質、ポリペプチドなどは、１種類だけ混合しても良いし、複数種類を混合しても良い。 The first solution 201 may be mixed with biological membrane proteins such as receptors, ion channels, G proteins, and secreted proteins. The first solution 202 may be mixed with a polypeptide such as gramicidin. Only one type of biological membrane protein, secreted protein, polypeptide or the like may be mixed, or a plurality of types may be mixed.
第１溶液注入工程では、溶液注入部１０５に第１溶液２０１を注入し、その後余分な第１溶液２０１を除去することにより、親水性パターン１０３上にのみ第１溶液２０１をパターンすることが最も好ましい。前記余分な第１溶液２０１を除去する方法は、第１溶液２０１を吸い取る方法でも良いし、人工脂質膜形成装置１００を傾ける方法でも良い。 In the first solution injection step, the first solution 201 is most preferably patterned only on the hydrophilic pattern 103 by injecting the first solution 201 into the solution injection unit 105 and then removing the excess first solution 201. preferable. The method of removing the excess first solution 201 may be a method of sucking out the first solution 201 or a method of tilting the artificial lipid film forming apparatus 100.
また、第１溶液注入工程では、第１溶液２０１をピペットやキャピラリーなどを用いて、直接、親水性パターン１０３上にパターンしても良い。 In the first solution injection step, the first solution 201 may be directly patterned on the hydrophilic pattern 103 using a pipette, capillary, or the like.
次に、図３（ｂ）は脂質溶液注入工程を表す。脂質溶液注入工程では、前記第１溶液注入工程によって人工脂質膜形成装置１００の親水性パターン１０３上に形成された第１溶液２０１に接するように脂質溶液２０２を溶液注入部１０５に注入する。 Next, FIG.3 (b) represents a lipid solution injection | pouring process. In the lipid solution injection step, the lipid solution 202 is injected into the solution injection unit 105 so as to be in contact with the first solution 201 formed on the hydrophilic pattern 103 of the artificial lipid film forming apparatus 100 in the first solution injection step.
脂質溶液注入工程では、親水性パターン１０３上に第１溶液２０１がパターンされた後で、人工脂質膜形成装置１００上の溶液注入部１０５に適量の脂質溶液２０２を注入することが好ましい。 In the lipid solution injection step, it is preferable to inject an appropriate amount of lipid solution 202 into the solution injection unit 105 on the artificial lipid film forming apparatus 100 after the first solution 201 is patterned on the hydrophilic pattern 103.
脂質溶液２０２は、脂質を有機溶媒に分散したものであることが好ましい。脂質はアゾレクチンまたはジフィタノイルホスファチジルコリンまたはＥｇｇＰＣまたはＤＯＰＣであることが最も好ましい。なお、脂質は糖脂質でも良いし、リポ脂質でも良いし、他の脂質でも良い。脂質は、天然由来の脂質であっても良いし、合成脂質でも良い。合成脂質は高純度で化学的に安定なものが得やすいのでより好ましい。具体的にはリン脂質である、グリセルモノオレエイト、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンでも良いし、その他のリン酸脂質でも良い。また脂質分子の脂肪酸部分は単独で用いても良いし、２種類以上混合して用いても良い。また有機溶媒に対する脂質の濃度は３〜５０ｍｇ／ｍＬが好ましく、４〜４０ｍLがより好ましい。 The lipid solution 202 is preferably one in which lipid is dispersed in an organic solvent. Most preferably, the lipid is azolectin or diphytanoylphosphatidylcholine or EggPC or DOPC. The lipid may be a glycolipid, a lipolipid, or another lipid. The lipid may be a naturally derived lipid or a synthetic lipid. Synthetic lipids are more preferred because they are easy to obtain highly pure and chemically stable. Specifically, glyceryl monooleate, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, dipalmitoylphosphatidylcholine or other phospholipids may be used. Moreover, the fatty acid part of a lipid molecule may be used independently and may be used in mixture of 2 or more types. The lipid concentration relative to the organic solvent is preferably 3 to 50 mg / mL, more preferably 4 to 40 mL.
脂質溶液２０２において、有機溶媒は、ヘキサデカン、デカン、スクアレンが最も好ましいが、他の炭化水素鎖を有する有機溶媒を用いても良い。 In the lipid solution 202, the organic solvent is most preferably hexadecane, decane, or squalene, but an organic solvent having another hydrocarbon chain may be used.
脂質溶液２０２には、脂質と有機溶媒のほかに、人工脂質膜に正味の表面電荷を持たせる物質を混合しても良い。人工脂質膜の表面電荷はマイナスであることが好ましい。人工脂質膜に電荷を持たせるためのホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールなどを混合しても良い。人工脂質膜に電荷を持たせるための物質は、脂質溶液注入工程の前に予め混合しても良いし、人工脂質溶液注入工程の後で混合しても良い。なお本発明では、人工脂質膜に電荷を持たせるための物質量は限定されない。 In addition to the lipid and the organic solvent, the lipid solution 202 may be mixed with a substance that gives the artificial lipid membrane a net surface charge. The surface charge of the artificial lipid membrane is preferably negative. You may mix the phosphatidylserine, the phosphatidylinositol, etc. for giving an electric charge to an artificial lipid membrane. The substance for imparting electric charge to the artificial lipid membrane may be mixed in advance before the lipid solution injection step, or may be mixed after the artificial lipid solution injection step. In the present invention, the amount of substance for imparting electric charge to the artificial lipid membrane is not limited.
脂質溶液２０２には、脂質と有機溶媒のほかに、受容体、イオンチャネル、Ｇタンパク質などの生体膜タンパク質や分泌タンパク質を混合しても良い。脂質溶液２０２にはグラミシジンなどのポリペプチドを混合しても良い。生体膜タンパク質や分泌タンパク質、ポリペプチドなどは、１種類だけ混合しても良いし、複数種類を混合しても良い。生体膜タンパク質や分泌タンパク質、ポリペプチドなどは、脂質溶液注入工程の前に予め混合しても良いし、人工脂質溶液注入工程の後で混合しても良い。 The lipid solution 202 may be mixed with biological membrane proteins such as receptors, ion channels, G proteins, and secreted proteins in addition to lipids and organic solvents. The lipid solution 202 may be mixed with a polypeptide such as gramicidin. Only one type of biological membrane protein, secreted protein, polypeptide or the like may be mixed, or a plurality of types may be mixed. Biological membrane proteins, secreted proteins, polypeptides and the like may be mixed in advance before the lipid solution injection step, or may be mixed after the artificial lipid solution injection step.
次に、図３（ｃ）は第２溶液注入工程を表す。第２溶液注入工程では、脂質溶液注入工程の後で、第２溶液２０３が脂質溶液２０２を介して第１溶液２０１と接触するように第２溶液２０３を溶液注入部１０５に注入する。 Next, FIG.3 (c) represents a 2nd solution injection | pouring process. In the second solution injection step, after the lipid solution injection step, the second solution 203 is injected into the solution injection unit 105 so that the second solution 203 comes into contact with the first solution 201 via the lipid solution 202.
第２溶液２０３は水または水溶液である。 The second solution 203 is water or an aqueous solution.
第２溶液２０３には、リポソームやミセルを混合しても良い。リポソームやミセルを構成する脂質は、リン脂質であることが好ましい。なお、脂質は糖脂質でも良いし、リポ脂質でも良いし、他の脂質でも良い。脂質は、その他の天然由来の脂質であっても良いし、合成脂質でも良い。合成脂質は高純度で化学的に安定なものが得やすいのでより好ましい。具体的にはリン脂質であるジフィタノイルホスファチジルコリン、グリセルモノオレエイト、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンでも良いし、その他のリン酸脂質でも良い。 Liposomes and micelles may be mixed in the second solution 203. The lipid constituting the liposome or micelle is preferably a phospholipid. The lipid may be a glycolipid, a lipolipid, or another lipid. The lipid may be other naturally derived lipids or synthetic lipids. Synthetic lipids are more preferred because they are easy to obtain highly pure and chemically stable. Specifically, diphytanoyl phosphatidylcholine, glyceryl monooleate, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, dipalmitoylphosphatidylcholine, which are phospholipids, or other phospholipids may be used.
第２溶液２０３には、受容体、イオンチャネル、Ｇタンパク質などの生体膜タンパク質や分泌タンパク質を混合しても良い。第２溶液２０３にはグラミシジンなどのポリペプチドを混合しても良い。生体膜タンパク質や分泌タンパク質、ポリペプチドなどは、１種類だけ混合しても良いし、複数種類を混合しても良い。 The second solution 203 may be mixed with biological membrane proteins such as receptors, ion channels and G proteins, and secreted proteins. The second solution 203 may be mixed with a polypeptide such as gramicidin. Only one type of biological membrane protein, secreted protein, polypeptide or the like may be mixed, or a plurality of types may be mixed.
なお、人工脂質膜が形成された後で生体膜タンパク質や分泌タンパクなどを混合する場合、生体膜タンパク質や分泌タンパク質などを一旦ベシクルに組み込んで、ベシクルを人工脂質膜へ融合しても良いし、公知の混合技術を用いても良い。 In addition, when mixing biological membrane protein or secreted protein after the artificial lipid membrane is formed, the biological membrane protein or secreted protein may be once incorporated into the vesicle, and the vesicle may be fused to the artificial lipid membrane, A known mixing technique may be used.
第２溶液２０３の注入方法は、人工脂質膜形成装置１００の溶液注入部１０５に適量の第２溶液２０３を注入する方法が好ましい。シャーレなどの入れ物に注がれた第２溶液２０３の中に人工脂質膜形成装置１００を沈める方法により、溶液注入部１０５に第２溶液２０３を導入しても良い。 The method of injecting the second solution 203 is preferably a method of injecting an appropriate amount of the second solution 203 into the solution injection unit 105 of the artificial lipid film forming apparatus 100. The second solution 203 may be introduced into the solution injection unit 105 by a method of sinking the artificial lipid film forming apparatus 100 into the second solution 203 poured into a container such as a petri dish.
このようにして、第１溶液２０１と第２溶液２０３の界面に人工脂質膜が形成される。人工脂質膜は脂質二重膜であることが最も好ましい。ここでは、第２溶液２０３の自重により、脂質溶液２０２の薄膜から有機溶媒が除去される。余剰な有機溶媒は、疎水性層１０２に沿って除去されることが好ましい。 In this way, an artificial lipid membrane is formed at the interface between the first solution 201 and the second solution 203. Most preferably, the artificial lipid membrane is a lipid bilayer membrane. Here, the organic solvent is removed from the thin film of the lipid solution 202 by the dead weight of the second solution 203. Excess organic solvent is preferably removed along the hydrophobic layer 102.
人工脂質膜形成工程には、人工脂質膜の形成を検出する工程を含んでいても良い。人工脂質膜の形成を検出するには、光学顕微鏡による観察でも良い。第１溶液２０１内部と第２溶液２０３内部に複数の電極を設けて、人工脂質膜の膜抵抗や膜容量、膜電流などを測定しても良いし、他の電気特性を測定しても良い。第１溶液２０１内部に電極を設ける方法は、親水性パターン１０３上に電極を予めパターンする方法が好ましい。 The artificial lipid film forming step may include a step of detecting the formation of the artificial lipid film. In order to detect the formation of the artificial lipid film, observation with an optical microscope may be used. A plurality of electrodes may be provided inside the first solution 201 and the second solution 203, and the membrane resistance, membrane capacitance, membrane current, etc. of the artificial lipid membrane may be measured, or other electrical characteristics may be measured. . As a method of providing an electrode inside the first solution 201, a method of previously patterning an electrode on the hydrophilic pattern 103 is preferable.
かかる構成と動作の手順によれば、シリンジやシリンジポンプ等の特別な装置を使用する必要がないため、簡便に、顕微鏡で直接観察可能な人工脂質膜を具備する微小な人工脂質膜チャンバを作製することができる。形成された人工脂質膜チャンバの体積は、１００ｆＬ以上５００ｎＬ以下であることが好ましく、１００ｐＬ以上２００ｎＬ以下であることが最も好ましい。 According to such a configuration and operation procedure, it is not necessary to use a special device such as a syringe or a syringe pump, so a minute artificial lipid membrane chamber having an artificial lipid membrane that can be directly observed with a microscope can be easily produced. can do. The volume of the formed artificial lipid membrane chamber is preferably 100 fL or more and 500 nL or less, and most preferably 100 pL or more and 200 nL or less.
本実施形態において、第１溶液注入工程から第２溶液注入工程までの一連の工程は、２０℃以上６０℃以下で行うことが好ましく、２５℃以上４０℃以下がより好ましい。 In the present embodiment, a series of steps from the first solution injection step to the second solution injection step is preferably performed at 20 ° C. or more and 60 ° C. or less, and more preferably 25 ° C. or more and 40 ° C. or less.
本実施形態において、分析装置へ上述の人工脂質膜形成方法を採用することが好ましい。分析装置は、臨床検査用分析装置、電気化学分析装置、ガス分析装置、味覚分析装置、神経生理解析装置、イオンチャネル解析装置、イオンチャネル機能解析装置、ドラッグスクリーニング分析装置、バイオセンシング装置などに用いても良い。前記分析装置の計測部は、光学的に観察可能な顕微鏡や蛍光検出可能な蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡が好ましい。前記顕微鏡はカメラが取り付けられていることが好ましい。前記顕微鏡とカメラを備えた計測部を利用して、脂質膜の様子を観察しても良いし、膜タンパク質の物質輸送を計測しても良い。また、計測部は、電極を第１溶液２０１や第２溶液２０３に挿入したものであっても良い。電極には増幅器を接続することが好ましい。増幅器はパッチクランプアンプが最も好ましいが、電界効果トランジスタ、バイポーラトランジスタ、オペアンプ、作動アンプなどの増幅器を接続しても良い。前記電極を用いて、脂質膜の電気的特性を計測しても良いし、イオンチャネルの機能を計測しても良い。前記分析装置の表示部は、パソコンのモニターであることが好ましいが、計測した値を表示するために計測装置に付属したモニターであっても良い。 In this embodiment, it is preferable to employ the above-described artificial lipid film forming method for the analyzer. Analytical devices are used for clinical laboratory analyzers, electrochemical analyzers, gas analyzers, taste analyzers, neurophysiology analyzers, ion channel analyzers, ion channel function analyzers, drug screening analyzers, biosensing devices, etc. May be. The measurement unit of the analyzer is preferably an optically observable microscope, a fluorescent microscope capable of detecting fluorescence, or a confocal microscope. It is preferable that a camera is attached to the microscope. The state of the lipid membrane may be observed using the measurement unit equipped with the microscope and the camera, or the mass transport of the membrane protein may be measured. Further, the measurement unit may be one in which an electrode is inserted into the first solution 201 or the second solution 203. An amplifier is preferably connected to the electrode. The amplifier is most preferably a patch clamp amplifier, but an amplifier such as a field effect transistor, bipolar transistor, operational amplifier, or operational amplifier may be connected. Using the electrode, the electrical characteristics of the lipid membrane may be measured, or the function of the ion channel may be measured. The display unit of the analyzer is preferably a personal computer monitor, but may be a monitor attached to the measuring device to display the measured value.
（実施形態２）
以下、本発明の実施形態２における人工脂質膜形成方法について、図面を参照しながら説明する。
(Embodiment 2)
Hereinafter, the artificial lipid film forming method in Embodiment 2 of the present invention will be described with reference to the drawings.
図４は、実施形態２における人工脂質膜形成装置の動作図を表す。なお、図４において、図１〜図３と同様の構成については、同一符号を付し、その説明を省略する。 FIG. 4 shows an operation diagram of the artificial lipid film forming apparatus according to the second embodiment. In FIG. 4, the same components as those in FIGS. 1 to 3 are denoted by the same reference numerals, and the description thereof is omitted.
本実施形態と実施形態１との相違点は、第１溶液注入工程である。 The difference between the present embodiment and the first embodiment is the first solution injection step.
図４（ａ）に示すように、まず、人工脂質膜形成装置１００の溶液注入部１０５に脂質溶液２０２を注入し、親水性パターン１０３上を脂質溶液２０２で満たす。 As shown in FIG. 4A, first, the lipid solution 202 is injected into the solution injection unit 105 of the artificial lipid film forming apparatus 100, and the hydrophilic pattern 103 is filled with the lipid solution 202.
次に、図４（ｂ）に示すように、溶液注入部１０５に第１溶液２０１を注入し、親水性パターン１０３上に第１溶液２０１をパターンする。 Next, as shown in FIG. 4B, the first solution 201 is injected into the solution injection unit 105, and the first solution 201 is patterned on the hydrophilic pattern 103.
親水性パターン１０３上に第１溶液２０１をパターンする方法は、第１溶液２０１を封入したキャピラリーの先端から第１溶液２０１を溶液注入部１０５に注入しながら、第１溶液２０１が親水性パターン１０３と接触するようにキャピラリーを移動する方法が最も好ましいが、脂質溶液２０２中で第１溶液２０１を親水性パターン１０３に接触させる他の方法でも良い。 In the method of patterning the first solution 201 on the hydrophilic pattern 103, the first solution 201 is injected into the solution injection unit 105 from the tip of the capillary in which the first solution 201 is sealed, while the first solution 201 is in the hydrophilic pattern 103. The method of moving the capillary so as to come into contact with is most preferable, but other methods of bringing the first solution 201 into contact with the hydrophilic pattern 103 in the lipid solution 202 may be used.
（実施形態３）
以下、本発明の実施形態３における人工脂質膜形成方法について、図面を参照しながら説明する。
(Embodiment 3)
Hereinafter, the artificial lipid film forming method in Embodiment 3 of the present invention will be described with reference to the drawings.
図５は、実施形態３における人工脂質膜形成装置の動作図を表す。なお、本実施形態において、実施形態１と同様の構成については、同一符号を付し、その詳細な説明は省略する。 FIG. 5 shows an operation diagram of the artificial lipid film forming apparatus according to the third embodiment. In the present embodiment, the same components as those in the first embodiment are denoted by the same reference numerals, and detailed description thereof is omitted.
本実施形態と実施形態１との相違点は、第２溶液注入工程である。 The difference between this embodiment and Embodiment 1 is a 2nd solution injection process.
図５に示すように、第２溶液２０３は適量の液滴である。 As shown in FIG. 5, the second solution 203 is an appropriate amount of droplets.
第２溶液２０３は、水または水溶液である。前記液滴の体積は、１０ｎＬ以上１０μＬ以下であることが好ましい。 The second solution 203 is water or an aqueous solution. The volume of the droplet is preferably 10 nL or more and 10 μL or less.
第２溶液２０３には、リポソームやミセルを混合しても良い。リポソームやミセルを構成する脂質は、リン脂質であることが好ましい。なお、脂質は糖脂質でも良いし、リポ脂質でも良いし、他の脂質でも良い。脂質は、その他の天然由来の脂質であっても良いし、合成脂質でも良い。合成脂質は高純度で化学的に安定なものが得やすいのでより好ましい。具体的にはリン脂質であるジフィタノイルホスファチジルコリン、グリセルモノオレエイト、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンでも良いし、その他のリン酸脂質でも良い。 Liposomes and micelles may be mixed in the second solution 203. The lipid constituting the liposome or micelle is preferably a phospholipid. The lipid may be a glycolipid, a lipolipid, or another lipid. The lipid may be other naturally derived lipids or synthetic lipids. Synthetic lipids are more preferred because they are easy to obtain highly pure and chemically stable. Specifically, diphytanoyl phosphatidylcholine, glyceryl monooleate, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, dipalmitoylphosphatidylcholine, which are phospholipids, or other phospholipids may be used.
第２溶液２０３には、受容体、イオンチャネル、Ｇタンパク質などの生体膜タンパク質や分泌タンパク質を混合しても良い。第２溶液２０３にはグラミシジンなどのポリペプチドを混合しても良い。生体膜タンパク質や分泌タンパク質、ポリペプチドなどは、１種類だけ混合しても良いし、複数種類を混合しても良い。 The second solution 203 may be mixed with biological membrane proteins such as receptors, ion channels and G proteins, and secreted proteins. The second solution 203 may be mixed with a polypeptide such as gramicidin. Only one type of biological membrane protein, secreted protein, polypeptide or the like may be mixed, or a plurality of types may be mixed.
なお、人工脂質膜が形成された後で生体膜タンパク質や分泌タンパクなどを混合する場合、生体膜タンパク質や分泌タンパク質などを一旦ベシクルに組み込んで、ベシクルを人工脂質膜へ融合しても良いし、公知の混合技術を用いても良い。 In addition, when mixing biological membrane protein or secreted protein after the artificial lipid membrane is formed, the biological membrane protein or secreted protein may be once incorporated into the vesicle, and the vesicle may be fused to the artificial lipid membrane, A known mixing technique may be used.
第２溶液２０３は、第２水溶液２０３を封入したキャピラリーの先端から適量の第２溶液２０３を排出することにより形成されることが好ましいが、適量の第２溶液２０３を形成し、脂質溶液２０２を介して、第１溶液２０１と接触させる他の方法も用いても良い。第２水溶液２０３を封入したキャピラリーの先端から適量の第２溶液２０３を排出することにより形成した第２溶液２０３は、キャピラリー内に残っている第２溶液２０３と繋がっていても良い。 The second solution 203 is preferably formed by discharging an appropriate amount of the second solution 203 from the tip of the capillary in which the second aqueous solution 203 is enclosed. However, the appropriate amount of the second solution 203 is formed, and the lipid solution 202 is formed. Alternatively, other methods for contacting the first solution 201 may be used. The second solution 203 formed by discharging an appropriate amount of the second solution 203 from the tip of the capillary in which the second aqueous solution 203 is sealed may be connected to the second solution 203 remaining in the capillary.
このようにして、第１溶液２０１と第２溶液２０３の界面に人工脂質膜が形成される。人工脂質膜は脂質二重膜であることが最も好ましい。ここでは、第１溶液２０１と第２溶液２０３とが接触することにより、脂質溶液２０２の薄膜から有機溶媒が除去される。 In this way, an artificial lipid membrane is formed at the interface between the first solution 201 and the second solution 203. Most preferably, the artificial lipid membrane is a lipid bilayer membrane. Here, the organic solvent is removed from the thin film of the lipid solution 202 by the contact between the first solution 201 and the second solution 203.
第１溶液２０１内部と第２溶液２０３内部に複数の電極を設けて、人工脂質膜の膜抵抗や膜容量、膜電流などを測定しても良いし、他の電気特性を測定しても良い。 A plurality of electrodes may be provided inside the first solution 201 and the second solution 203, and the membrane resistance, membrane capacitance, membrane current, etc. of the artificial lipid membrane may be measured, or other electrical characteristics may be measured. .
第２溶液注入工程には、人工脂質膜の形成を検出する工程を含んでいても良い。人工脂質膜の形成を検出するには、光学顕微鏡による観察でも良い。第１溶液２０１内部と第２溶液２０３内部に複数の電極を設けて、人工脂質膜の膜抵抗や膜容量、膜電流などを測定しても良いし、他の電気特性を測定しても良い。第１溶液２０１内部に電極を設ける方法は、親水性パターン１０３上に電極を予めパターンする方法が好ましい。 The second solution injection step may include a step of detecting the formation of the artificial lipid film. In order to detect the formation of the artificial lipid film, observation with an optical microscope may be used. A plurality of electrodes may be provided inside the first solution 201 and the second solution 203, and the membrane resistance, membrane capacitance, membrane current, etc. of the artificial lipid membrane may be measured, or other electrical characteristics may be measured. . As a method of providing an electrode inside the first solution 201, a method of previously patterning an electrode on the hydrophilic pattern 103 is preferable.
本実施形態において、分析装置へ上述の人工脂質膜形成方法を採用することが好ましい。分析装置は、臨床検査用分析装置、電気化学分析装置、ガス分析装置、味覚分析装置、神経生理解析装置、イオンチャネル解析装置、イオンチャネル機能解析装置、ドラッグスクリーニング分析装置、バイオセンシング装置などに用いても良い。前記分析装置の計測部は、光学的に観察可能な顕微鏡や蛍光検出可能な蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡が好ましい。前記顕微鏡はカメラが取り付けられていることが好ましい。前記顕微鏡とカメラを備えた計測部を利用して、脂質膜の様子を観察しても良いし、膜タンパク質の物質輸送を計測しても良い。また、計測部は、電極を第１溶液２０１や第２溶液２０３に挿入したものであっても良い。電極には増幅器を接続することが好ましい。増幅器はパッチクランプアンプが最も好ましいが、電界効果トランジスタ、バイポーラトランジスタ、オペアンプ、作動アンプなどの増幅器を接続しても良い。前記電極を用いて、脂質膜の電気的特性を計測しても良いし、イオンチャネルの機能を計測しても良い。前記分析装置の表示部は、パソコンのモニターであることが好ましいが、計測した値を表示するために計測装置に付属したモニターであっても良い。 In this embodiment, it is preferable to employ the above-described artificial lipid film forming method for the analyzer. Analytical devices are used for clinical laboratory analyzers, electrochemical analyzers, gas analyzers, taste analyzers, neurophysiology analyzers, ion channel analyzers, ion channel function analyzers, drug screening analyzers, biosensing devices, etc. May be. The measurement unit of the analyzer is preferably an optically observable microscope, a fluorescent microscope capable of detecting fluorescence, or a confocal microscope. It is preferable that a camera is attached to the microscope. The state of the lipid membrane may be observed using the measurement unit equipped with the microscope and the camera, or the mass transport of the membrane protein may be measured. Further, the measurement unit may be one in which an electrode is inserted into the first solution 201 or the second solution 203. An amplifier is preferably connected to the electrode. The amplifier is most preferably a patch clamp amplifier, but an amplifier such as a field effect transistor, bipolar transistor, operational amplifier, or operational amplifier may be connected. Using the electrode, the electrical characteristics of the lipid membrane may be measured, or the function of the ion channel may be measured. The display unit of the analyzer is preferably a personal computer monitor, but may be a monitor attached to the measuring device to display the measured value.
（実施形態４）
以下、本発明の実施形態４における人工脂質膜形成方法について、図面を参照しながら説明する。
(Embodiment 4)
Hereinafter, the artificial lipid film forming method in Embodiment 4 of the present invention will be described with reference to the drawings.
図６および図７は、実施形態４における人工脂質膜形成装置の断面図および斜投影図である。また、図８は、実施形態４における人工脂質膜形成装置の動作図である。なお、本実施形態において、実施形態１と同様の構成については、同一符号を付し、その詳細な説明は省略する。 6 and 7 are a cross-sectional view and a perspective view of the artificial lipid film forming apparatus according to the fourth embodiment. FIG. 8 is an operation diagram of the artificial lipid film forming apparatus according to the fourth embodiment. In the present embodiment, the same components as those in the first embodiment are denoted by the same reference numerals, and detailed description thereof is omitted.
本実施形態と実施形態１との相違点は、親水性パターン１０３上に電極３０１を設けることである。電極３０１は親水性パターン１０３の上のみに予めパターンされていることが好ましい。 The difference between this embodiment and Embodiment 1 is that the electrode 301 is provided on the hydrophilic pattern 103. The electrode 301 is preferably patterned in advance only on the hydrophilic pattern 103.
電極３０１とは別に、第２溶液２０３中に電極３０２を設置しても良い。電極３０２は電気化学測定に適した電極が好ましい。非分極性の電極であることが好ましい。電極３０２はＡｇ／ＡｇＣｌ電極が最も好ましいが、Ａｇ電極、Ｐｔ電極、Ａｕ電極などの金属電極でも良いし、カーボン電極、グラファイト電極、カーボンナノチューブ電極などでも良い。 Apart from the electrode 301, the electrode 302 may be provided in the second solution 203. The electrode 302 is preferably an electrode suitable for electrochemical measurement. A non-polarizable electrode is preferred. The electrode 302 is most preferably an Ag / AgCl electrode, but may be a metal electrode such as an Ag electrode, a Pt electrode, or an Au electrode, or may be a carbon electrode, a graphite electrode, a carbon nanotube electrode, or the like.
本実施形態において、電極３０１は１つでも良いし、複数でも良い。電極３０１は電気化学測定に適した電極が好ましい。非分極性の電極であることが好ましい。電極３０１はＡｇ／ＡｇＣｌ電極が最も好ましいが、Ａｇ電極、Ｐｔ電極、Ａｕ電極などの金属電極でも良いし、カーボン電極、グラファイト電極、カーボンナノチューブ電極などでも良い。電極３０１と、電極３０２と、を用いて人工脂質膜のコンダクタンス、電気容量を測定しても良い。 In the present embodiment, the electrode 301 may be one or plural. The electrode 301 is preferably an electrode suitable for electrochemical measurement. A non-polarizable electrode is preferred. The electrode 301 is most preferably an Ag / AgCl electrode, but may be a metal electrode such as an Ag electrode, a Pt electrode, or an Au electrode, or may be a carbon electrode, a graphite electrode, a carbon nanotube electrode, or the like. The conductance and electric capacity of the artificial lipid membrane may be measured using the electrode 301 and the electrode 302.
また、電極３０１と、電極３０２と、を用いて、第１溶液２０１または第２溶液２０３に含まれるイオン、酵素、反応生成物、基質などの化学物質を測定しても良い。また、電極３０１と、電極３０２と、を用いて、形成された人工脂質膜に電圧を印加しても良い。 Alternatively, the electrode 301 and the electrode 302 may be used to measure chemical substances such as ions, enzymes, reaction products, and substrates contained in the first solution 201 or the second solution 203. Alternatively, a voltage may be applied to the formed artificial lipid membrane using the electrode 301 and the electrode 302.
親水性パターン１０３の上のみに電極３０１がパターンされた人工脂質膜形成装置１００は、フォトリソグラフィなどを利用し電極材料を親水性基板上にパターンし、その後電極材料がパターンされた親水性基板上に疎水性絶縁薄膜を形成し、その後、親水性パターン１０３となるべき部分の前記疎水性絶縁薄膜を除去することにより作製することが好ましい。 The artificial lipid film forming apparatus 100 in which the electrode 301 is patterned only on the hydrophilic pattern 103 patterns the electrode material on the hydrophilic substrate using photolithography or the like, and then on the hydrophilic substrate on which the electrode material is patterned. It is preferable that a hydrophobic insulating thin film is formed on the surface, and then the hydrophobic insulating thin film is removed from a portion that should become the hydrophilic pattern 103.
電極３０１が銀塩化銀電極の場合、上記方法により、まず電極材料の金を親水性パターン１０３上にパターンした基板を作製し、前記金を電気めっき法により銀めっきし、最後に前記銀を塩化物イオン存在下で還元することにより電極３０１が作製されることが好ましい。 When the electrode 301 is a silver-silver chloride electrode, a substrate in which gold as an electrode material is patterned on the hydrophilic pattern 103 is first prepared by the above method, the gold is silver-plated by an electroplating method, and finally the silver is chlorinated. It is preferable that the electrode 301 is produced by reduction in the presence of a product ion.
かかる構成と動作の手順によれば、簡便に、スループット性良く、電極と、顕微鏡で直接観察可能な人工脂質膜と、を具備する微小な人工脂質膜チャンバを作製することができる。形成された電極３０１を具備する人工脂質膜チャンバの体積は、１００ｆＬ以上５００ｎＬ以下であることが好ましく、１００ｐＬ以上２００ｎＬ以下であることが最も好ましい。また、電極３０１の形状は特に限定されないが、倒立顕微鏡を用いて観察することを考え、電極３０１は、親水性パターン１０３の一部にパターンされていることが好ましい。電極３０１に透明電極を用いた場合は、親水性パターン１０３の全部に電極３０１がパターンされていても良い。電極３０１の寸法は親水性パターン１０３の径によって変化させることが好ましい。 According to such a configuration and operation procedure, a minute artificial lipid membrane chamber including an electrode and an artificial lipid membrane that can be directly observed with a microscope can be easily produced with high throughput. The volume of the artificial lipid membrane chamber having the formed electrode 301 is preferably 100 fL or more and 500 nL or less, and most preferably 100 pL or more and 200 nL or less. The shape of the electrode 301 is not particularly limited, but it is preferable that the electrode 301 is patterned on a part of the hydrophilic pattern 103 in consideration of observation using an inverted microscope. When a transparent electrode is used as the electrode 301, the electrode 301 may be patterned on the entire hydrophilic pattern 103. The dimensions of the electrode 301 are preferably changed according to the diameter of the hydrophilic pattern 103.
電極３０１および電極３０２には、増幅器を接続することが好ましい。増幅器はパッチクランプアンプが最も好ましいが、電界効果トランジスタ、バイポーラトランジスタ、オペアンプ、作動アンプなどの増幅器を接続しても良い。また、これら増幅器を介して得られた信号は記録装置に記録されることが好ましい。 An amplifier is preferably connected to the electrode 301 and the electrode 302. The amplifier is most preferably a patch clamp amplifier, but an amplifier such as a field effect transistor, bipolar transistor, operational amplifier, or operational amplifier may be connected. The signals obtained through these amplifiers are preferably recorded in a recording device.
本実施形態において、分析装置へ上述の人工脂質膜形成方法を採用することが好ましい。分析装置は、臨床検査用分析装置、電気化学分析装置、ガス分析装置、味覚分析装置、神経生理解析装置、イオンチャネル解析装置、イオンチャネル機能解析装置、ドラッグスクリーニング分析装置、バイオセンシング装置などに用いても良い。前記分析装置の計測部は、電極３０１であることが最も好ましい。前記計測部は、光学的に観察可能な顕微鏡や蛍光検出可能な蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡であっても良い。前記顕微鏡はカメラが取り付けられていても良い。前記顕微鏡とカメラを備えた計測部を利用して、脂質膜の様子を観察しても良いし、膜タンパク質の物質輸送を計測しても良い。また、前記分析装置の表示部は、パソコンのモニターであることが好ましいが、その他の計測した値を表示するために計測装置に付属したモニターであっても良い。 In this embodiment, it is preferable to employ the above-described artificial lipid film forming method for the analyzer. Analytical devices are used for clinical laboratory analyzers, electrochemical analyzers, gas analyzers, taste analyzers, neurophysiology analyzers, ion channel analyzers, ion channel function analyzers, drug screening analyzers, biosensing devices, etc. May be. Most preferably, the measuring unit of the analyzer is an electrode 301. The measurement unit may be an optically observable microscope, a fluorescent microscope capable of detecting fluorescence, or a confocal microscope. A camera may be attached to the microscope. The state of the lipid membrane may be observed using the measurement unit equipped with the microscope and the camera, or the mass transport of the membrane protein may be measured. Further, the display unit of the analyzer is preferably a personal computer monitor, but may be a monitor attached to the measuring device to display other measured values.
１．人工脂質膜形成装置１００の作製
まず、人工脂質膜形成装置１００の作製方法を説明する。基板１０１としてガラスを用いた。まず、ガラス基板をアセトン中で５分間超音波洗浄し、イソプロパノール（ＩＰＡ）によってリンスし、窒素ガスでブローした後、１５０℃で１５分間加熱した。
1. Production of Artificial Lipid Film Forming Apparatus 100 First, a production method of the artificial lipid film forming apparatus 100 will be described. Glass was used as the substrate 101. First, the glass substrate was ultrasonically cleaned in acetone for 5 minutes, rinsed with isopropanol (IPA), blown with nitrogen gas, and then heated at 150 ° C. for 15 minutes.
次に、ガラス基板表面にスピンコート法によりサイトップ（登録商標）溶液をコートし、５０℃で３０分その後１８０℃で加熱し、ガラス基板上に、疎水性層１０２となるサイトップ薄膜を形成した。この時、サイトップ溶液は８ｗ％、スピンコートの条件は３０００ｒｐｍだった。 Next, a Cytop (registered trademark) solution is coated on the surface of the glass substrate by spin coating, and heated at 50 ° C. for 30 minutes and then at 180 ° C. to form a Cytop thin film that becomes the hydrophobic layer 102 on the glass substrate. did. At this time, the CYTOP solution was 8 w% and the spin coating conditions were 3000 rpm.
サイトップ薄膜の上に真空蒸着によりアルミ層を形成した。 An aluminum layer was formed on the CYTOP thin film by vacuum deposition.
アルミ層の上にポジ型のフォトレジストＳ１８１８をスピンコート、ベイクし、親水性パターン１０３のパターンをガラスマスクを使用し露光、現像することで、親水性パターン１０３となる部分の上方のアルミ層を露出させた。 A positive photoresist S1818 is spin coated and baked on the aluminum layer, and the pattern of the hydrophilic pattern 103 is exposed and developed using a glass mask, so that the aluminum layer above the portion that becomes the hydrophilic pattern 103 is formed. Exposed.
混酸アルミ液を用いてアルミ層をエッチングし、親水性パターン１０３となる部分の上方のサイトップ薄膜を露出させた。 The aluminum layer was etched using a mixed acid aluminum solution to expose the Cytop thin film above the portion to be the hydrophilic pattern 103.
酸素プラズマエッチングによりサイトップ薄膜をエッチングし、親水性パターン１０３となる部分のガラス基板表面を露出させた。この時、酸素プラズマエッチングの条件は５０Ｗ、１０ｍｌ、１０ｍｉｎだった。 The Cytop thin film was etched by oxygen plasma etching to expose the surface of the glass substrate where the hydrophilic pattern 103 was to be formed. At this time, the conditions for oxygen plasma etching were 50 W, 10 ml, and 10 min.
その後、Ｓ１８１８をアセトンを用いて除去し、最後に、アルミ層を混酸アルミ液を用いて除去した。 Thereafter, S1818 was removed using acetone, and finally the aluminum layer was removed using a mixed acid aluminum solution.
２．親水性パターン１０３上に電極３０１を設けた人工脂質膜形成装置１００の作製
次に、親水性パターン１０３上に電極３０１を設けた人工脂質膜形成装置１００の作製方法を説明する。
2. Production of Artificial Lipid Membrane Forming Apparatus 100 with Electrode 301 Provided on Hydrophilic Pattern 103 Next, a method for producing the artificial lipid membrane formation apparatus 100 with the electrode 301 provided on the hydrophilic pattern 103 will be described.
基板１０１としてガラスを用いた。まず、ガラス基板をアセトン中で５分間超音波洗浄し、イソプロパノール（ＩＰＡ）によってリンスし、窒素ガスでブローした。 Glass was used as the substrate 101. First, the glass substrate was ultrasonically cleaned in acetone for 5 minutes, rinsed with isopropanol (IPA), and blown with nitrogen gas.
ネガ型フォトレジストＺＰＮをガラス基板上にスピンコート、ベイクした。 A negative photoresist ZPN was spin coated and baked on a glass substrate.
電極３０１のパターンをガラスマスクを使用し露光、現像することで、電極３０１のパターンとなる部分のガラス基板表面を露出させた。 By exposing and developing the pattern of the electrode 301 using a glass mask, the glass substrate surface of the part used as the pattern of the electrode 301 was exposed.
次に、真空蒸着により金を蒸着し、アセトン中で１分程度超音波洗浄することでＺＰＮを基板１０１から引き剥がし、基板１０１上に電極３０１のパターンの金薄膜を形成した。 Next, gold was deposited by vacuum deposition, and ZPN was peeled off from the substrate 101 by ultrasonic cleaning in acetone for about 1 minute, and a gold thin film having a pattern of an electrode 301 was formed on the substrate 101.
電極３０１の形状に金薄膜をパターンしたガラス基板を１５０℃で１５分間加熱した。 A glass substrate in which a gold thin film was patterned in the shape of the electrode 301 was heated at 150 ° C. for 15 minutes.
次に、ガラス基板表面にスピンコート法によりサイトップ（登録商標）溶液をコートし、５０℃で３０分その後１８０℃で加熱し、電極３０１の形状に金薄膜をパターンしたガラス基板上に、疎水性層１０２となるサイトップ薄膜を形成した。形成したサイトップ薄膜は絶縁膜を兼ねている。この時、サイトップ溶液は９ｗ％、スピンコートの条件は２０００ｒｐｍだった。 Next, a Cytop (registered trademark) solution is coated on the surface of the glass substrate by spin coating, heated at 50 ° C. for 30 minutes and then at 180 ° C. A Cytop thin film to be the conductive layer 102 was formed. The formed Cytop thin film also serves as an insulating film. At this time, the CYTOP solution was 9 w% and the spin coating condition was 2000 rpm.
サイトップ薄膜の上に真空蒸着によりアルミ層を形成した。 An aluminum layer was formed on the CYTOP thin film by vacuum deposition.
アルミ層の上にポジ型のフォトレジストＳ１８１８をスピンコート、ベイクし、親水性パターン１０３のパターンをガラスマスクを使用し露光、現像することで、親水性パターン１０３となる部分の上方のアルミ層を露出させた。 A positive photoresist S1818 is spin coated and baked on the aluminum layer, and the pattern of the hydrophilic pattern 103 is exposed and developed using a glass mask, so that the aluminum layer above the portion that becomes the hydrophilic pattern 103 is formed. Exposed.
混酸アルミ液を用いてアルミ層をエッチングし、親水性パターン１０３となる部分の上方のサイトップ薄膜を露出させた。 The aluminum layer was etched using a mixed acid aluminum solution to expose the Cytop thin film above the portion to be the hydrophilic pattern 103.
酸素プラズマエッチングによりサイトップ薄膜をエッチングし、親水性パターン１０３となる部分のガラス基板表面を露出させた。この時、酸素プラズマエッチングの条件は５０Ｗ、１０ｍｌ、１０ｍｉｎだった。電極３０１の材料である金薄膜のパターンは親水性パターン１０３上の一部に露出した。 The Cytop thin film was etched by oxygen plasma etching to expose the surface of the glass substrate where the hydrophilic pattern 103 was to be formed. At this time, the conditions for oxygen plasma etching were 50 W, 10 ml, and 10 min. The pattern of the gold thin film that is the material of the electrode 301 was exposed on a part of the hydrophilic pattern 103.
その後、Ｓ１８１８をアセトンを用いて除去し、アルミ層を混酸アルミ液を用いて除去した。結果として、電極３０１の材料である金薄膜のパターンは親水性パターン１０３上の一部に露出し、それ以外の金薄膜のパターンは疎水性絶縁膜で被覆された構造を得た。 Thereafter, S1818 was removed using acetone, and the aluminum layer was removed using a mixed acid aluminum solution. As a result, a gold thin film pattern as a material of the electrode 301 was exposed on a part of the hydrophilic pattern 103, and the other gold thin film pattern was covered with a hydrophobic insulating film.
前記金薄膜を電気めっき法により銀めっきし、最後に前記銀を塩化物イオン存在下で還元することにより電極３０１が銀塩化銀電極である人工脂質膜形成装置１００を得た。 The gold thin film was silver-plated by electroplating, and finally the silver was reduced in the presence of chloride ions to obtain an artificial lipid film forming apparatus 100 in which the electrode 301 was a silver-silver chloride electrode.
３．人工脂質膜形成装置を使用した人工脂質膜の形成
次に、人工脂質膜の形成手順を説明する。上記実施例において作製した人工脂質膜形成装置１００を用いて、実施形態１に示す方法により人工脂質膜を形成した。
3. Formation of Artificial Lipid Membrane Using Artificial Lipid Membrane Forming Apparatus Next, a procedure for forming an artificial lipid membrane will be described. An artificial lipid membrane was formed by the method shown in Embodiment 1 using the artificial lipid membrane forming apparatus 100 produced in the above example.
人工脂質膜形成装置１００において、親水性パターン１０３は円形でその直径１０４は１ｍｍだった。まず、第１溶液注入工程を行った。第１溶液２０１として純水を用いた。 In the artificial lipid film forming apparatus 100, the hydrophilic pattern 103 was circular and its diameter 104 was 1 mm. First, the first solution injection step was performed. Pure water was used as the first solution 201.
次に脂質溶液注入工程を行った。脂質溶液２０２は２０ｍｇ／ｍＬの濃度で大豆アゾレクチンをヘキサデカンに分散させたものだった。２００μＬの脂質溶液２０２を第１溶液注入工程を実施した人工脂質膜形成装置１００上に注入した。 Next, a lipid solution injection step was performed. The lipid solution 202 was obtained by dispersing soybean azolectin in hexadecane at a concentration of 20 mg / mL. 200 μL of the lipid solution 202 was injected onto the artificial lipid film forming apparatus 100 in which the first solution injection step was performed.
次に第２溶液注入工程を行った。第２溶液２０３として純水を用いた。シャーレに第２溶液２０３を１０ｍＬ注ぎ、そのシャーレの底に第１溶液注入工程および脂質溶液注入工程を順に実施した人工脂質膜形成装置１００を沈めた。この状態で放置することにより、第１溶液２０１と第２溶液２０３が接触し、第１溶液２０１と第２溶液２０３の界面に人工脂質膜が形成された。形成された人工脂質膜の顕微鏡写真を図９（ａ）に示す。また、図９（ｂ）に、図９（ａ）に示した顕微鏡写真の断面図を示す。 Next, a second solution injection step was performed. Pure water was used as the second solution 203. 10 mL of the second solution 203 was poured into the petri dish, and the artificial lipid film forming apparatus 100 in which the first solution injection step and the lipid solution injection step were sequentially performed on the bottom of the petri dish. By leaving in this state, the first solution 201 and the second solution 203 contacted, and an artificial lipid membrane was formed at the interface between the first solution 201 and the second solution 203. A micrograph of the formed artificial lipid membrane is shown in FIG. FIG. 9B shows a cross-sectional view of the micrograph shown in FIG.
親水性パターン１０３が円形でその直径１０４が４０μｍの場合も、同様の方法を用いて人工脂質膜を形成することができた。 Even when the hydrophilic pattern 103 was circular and its diameter 104 was 40 μm, an artificial lipid membrane could be formed using the same method.
人工脂質膜形成装置１００、および、親水性パターン１０３上に電極３０１を設けた人工脂質膜形成装置１００、のいずれも、同様の方法で人工脂質膜を形成することができた。 Both the artificial lipid film forming apparatus 100 and the artificial lipid film forming apparatus 100 in which the electrode 301 was provided on the hydrophilic pattern 103 were able to form an artificial lipid film by the same method.
４．電気化学的計測
次に、上記実施例において作製された、親水性パターン１０３上に電極３０１を設けた人工脂質膜形成装置１００を用いた電気化学的計測について説明する。親水性パターン１０３の表面に電極３０１を設けた人工脂質膜形成装置１００を用いた人工脂質膜形成方法において、第１溶液２０１には１００ｎＭのαヘモリシンを含む１ＭのＫＣｌ水溶液、第２溶液２０３には１ＭのＫＣｌ水溶液を用いた。脂質溶液２０２は２０ｍｇ／ｍＬの濃度で大豆アゾレクチンをヘキサデカンに分散させたものを用いた。電極３０２には銀塩化銀電極を用いた。
4). Electrochemical measurement Next, electrochemical measurement using the artificial lipid film forming apparatus 100 provided with the electrode 301 on the hydrophilic pattern 103 produced in the above embodiment will be described. In the artificial lipid film forming method using the artificial lipid film forming apparatus 100 in which the electrode 301 is provided on the surface of the hydrophilic pattern 103, the first solution 201 includes a 1M KCl aqueous solution containing 100 nM α-hemolysin, and the second solution 203 includes Used 1M KCl aqueous solution. The lipid solution 202 used was a dispersion of soybean azolectin in hexadecane at a concentration of 20 mg / mL. A silver-silver chloride electrode was used as the electrode 302.
αヘモリシンは、生体内では生体膜中に保持されて１．５ｎｍ程度の貫通孔を形成するタンパク質であるので、脂質二重膜に適切に保持されていれば貫通孔を形成して、脂質二重膜の両側が電気的に導通される。従って、電極３０１および電極３０２を用いて、第１溶液２０１と第２溶液２０３の間に直流電圧をかけると、電流が測定される。図８に示すように、第１溶液２０１と第２溶液２０３を配線し、電流を経時的に測定した。なお、図８には示していないが、回路中には、５０ｍＶの印加電圧がかけられている。 Since α-hemolysin is a protein that is retained in the biological membrane in the living body and forms a through-hole of about 1.5 nm, if it is appropriately retained in the lipid bilayer membrane, it forms a through-hole, and the lipid bilayer. Both sides of the heavy membrane are electrically connected. Accordingly, when a DC voltage is applied between the first solution 201 and the second solution 203 using the electrode 301 and the electrode 302, the current is measured. As shown in FIG. 8, the first solution 201 and the second solution 203 were wired, and the current was measured over time. Although not shown in FIG. 8, an applied voltage of 50 mV is applied in the circuit.
図１０（ａ）に、電気化学的計測中の、人工脂質膜および電極３０１の顕微鏡写真を示す。電気化学的計測の結果を図１０（ｂ）に示す。αヘモリシンを適切に保持する脂質二重膜が第１溶液２０１と第２溶液２０３の界面に形成されると、貫通孔が形成されるので、電流が流れる。脂質二重膜に形成された貫通孔の数が増えるごとに電流は増大するので、電流の大きさはステップ状に増大する。なお、図１０に示す結果は、親水性パターン１０３上に電極３０１を設けた人工脂質膜形成装置１００において、電極３０１に銀塩化銀電極を、親水性パターン１０３の直径１０４は１ｍｍのものを用いた場合の結果である。 FIG. 10A shows a photomicrograph of the artificial lipid membrane and the electrode 301 during electrochemical measurement. The result of electrochemical measurement is shown in FIG. When a lipid bilayer membrane that appropriately retains α-hemolysin is formed at the interface between the first solution 201 and the second solution 203, a through-hole is formed, so that a current flows. Since the current increases as the number of through-holes formed in the lipid bilayer increases, the magnitude of the current increases stepwise. Note that the results shown in FIG. 10 show that in the artificial lipid film forming apparatus 100 in which the electrode 301 is provided on the hydrophilic pattern 103, a silver-silver chloride electrode is used for the electrode 301, and the diameter 104 of the hydrophilic pattern 103 is 1 mm. It is the result when there was.
５．蛍光検出
次に、上記実施例において作製した人工脂質膜形成装置１００を用いた蛍光検出について説明する。人工脂質膜形成装置１００を用いた人工脂質膜形成方法において、第１溶液２０１には純水を、第２溶液２０２にはカルセインを純水に溶かしたものを用いた。
5. Fluorescence detection Next, fluorescence detection using the artificial lipid film forming apparatus 100 produced in the above embodiment will be described. In the artificial lipid film forming method using the artificial lipid film forming apparatus 100, pure water was used for the first solution 201, and calcein dissolved in pure water was used for the second solution 202.
人工脂質膜形成工程を実施し人工脂質膜チャンバを作製した後で、倒立型共焦点レーザー顕微鏡を用いて人工脂質膜チャンバ内部、すなわち人工脂質膜と基板表面の間の特定領域、の蛍光強度を経時的に測定した。測定中に上記のαヘモリシンを純水に溶かした溶液を第２溶液２０３に添加した。 After performing the artificial lipid membrane formation process and creating the artificial lipid membrane chamber, the fluorescence intensity inside the artificial lipid membrane chamber, that is, a specific region between the artificial lipid membrane and the substrate surface, is measured using an inverted confocal laser microscope. Measured over time. During the measurement, a solution obtained by dissolving the above α-hemolysin in pure water was added to the second solution 203.
αヘモリシンが第１溶液２０１と第２溶液２０３の界面に形成された人工脂質膜に導入されると、人工脂質膜に貫通孔が形成されるので、カルセインが第２溶液２０３中から第１溶液２０１中に拡散により移動する。そのため、人工脂質膜チャンバ内部の蛍光強度の測定値は、αヘモリシンを添加する前に比べて、添加した後の方が、上昇が顕著であった。なお、本実験には、人工脂質膜形成装置１００において、親水性パターン１０３の直径１０４は１ｍｍのものを用いた。 When α-hemolysin is introduced into the artificial lipid membrane formed at the interface between the first solution 201 and the second solution 203, a through-hole is formed in the artificial lipid membrane, so that calcein is contained in the first solution from the second solution 203. It moves by diffusion into 201. Therefore, the measured value of the fluorescence intensity inside the artificial lipid membrane chamber was more markedly increased after the addition of α-hemolysin than before the addition of α-hemolysin. In this experiment, in the artificial lipid film forming apparatus 100, the hydrophilic pattern 103 having a diameter 104 of 1 mm was used.
本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づき種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。
The present invention is not limited to the above embodiments, and various modifications are possible based on the spirit of the present invention, and these are not excluded from the scope of the present invention.
Claims (11)
前記装置は、表面上または表面上方に複数の親水性パターンが配置され、前記親水性パターン以外の箇所は疎水性層で覆われた平面状の基板と、
前記基板上において前記親水性パターンの上に前記基板の表面から盛り上がるように液滴を形成するための溶液注入領域と、を有し、
前記疎水性層の厚みが１０ｎｍ以上２μｍ以下であること、
を特徴とする、人工脂質膜形成装置。An artificial lipid film forming device,
The apparatus has a planar substrate in which a plurality of hydrophilic patterns are arranged on the surface or above the surface, and portions other than the hydrophilic pattern are covered with a hydrophobic layer ;
Anda solution injection region for forming the droplets to rise from the surface of the substrate on the hydrophilic patterns in said substrate,
The hydrophobic layer has a thickness of 10 nm to 2 μm,
An artificial lipid film forming apparatus characterized by the above.
（ａ）前記基板の上に設けられた疎水性層の上に、親水性材料をパターン化することにより、(A) By patterning a hydrophilic material on the hydrophobic layer provided on the substrate,
（ｂ）前記基板の上に設けられた疎水性層の一部が欠除し、前記親水性材料が露出することにより、または、(B) a part of the hydrophobic layer provided on the substrate is removed, and the hydrophilic material is exposed; or
（ｃ）前記基板の上に設けられた疎水性層の一部が欠除し、露出した前記基板表面上に親水性薄膜が形成され、または親水性材料が被覆されていることにより、(C) A portion of the hydrophobic layer provided on the substrate is removed, a hydrophilic thin film is formed on the exposed substrate surface, or a hydrophilic material is coated,
前記親水性パターンが配置されていること、を特徴とする請求項１に記載の人工脂質膜形成装置。The artificial lipid film forming apparatus according to claim 1, wherein the hydrophilic pattern is arranged.
前記人工脂質膜チャンバは、
前記基板の親水性パターンの上に配置された液滴と、
前記液滴の上方に載置された水または水溶液と、の接触部分に人工脂質膜を備える、
人工脂質膜チャンバ。An artificial lipid membrane chamber formed using the artificial lipid membrane forming device according to any one of claims 1 to 6,
The artificial lipid membrane chamber is
Droplets disposed on the hydrophilic pattern of the substrate;
Provided with an artificial lipid membrane in contact with water or an aqueous solution placed above the droplet,
Artificial lipid membrane chamber.
前記方法は、
前記溶液注入領域に、第１の水または水溶液を注入し、親水性パターンの上に液滴を配置する、第１溶液注入工程；
前記第１溶液注入工程の前または後に前記溶液注入領域に脂質溶液を注入する脂質溶液注入工程；
および
前記溶液注入領域に第２の水または水溶液を注入し、前記脂質溶液を介して、前記第２の水または水溶液と、前記第１溶液注入工程によって形成された前記液滴と、を接触させる第２溶液注入工程
を含む、人工脂質膜形成方法。An artificial lipid film forming method using the artificial lipid film forming apparatus according to any one of claims 1 to 6,
The method
Wherein the solution injection region, injecting first water or an aqueous solution, to place droplets on the hydrophilic patterns, first solution injection step;
A lipid solution injection step of injecting a lipid solution into the solution injection region before or after the first solution injection step;
And injecting the second water or aqueous solution into the solution injection region , and bringing the second water or aqueous solution into contact with the droplets formed by the first solution injection step via the lipid solution. An artificial lipid film forming method including a second solution injection step.
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