JP6017422B2 - 赤血球結合療法 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、出典明示により本明細書に組み込まれる、２０１０年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／３７２，１８１号の優先権を主張する。
本技術分野は、医療用組成物および赤血球に結合するリガンドまたは抗体の使用に関する。具体的な使用には、免疫寛容化、薬物送達および癌治療がある。
治療薬剤の臨床効果は、標的組織および器官に影響を与えるその効力だけでなく、実行可能な送達様式により、予想することができる。最適な薬物送達プラットフォームは、患者および専門介護者の介入を最小限に抑えながら、作用に最適な濃度で療法剤の正味重量を送達および維持し、かつ作用に最適な細胞標的に送達するものである。
赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）（赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）とも呼ばれる）に特異的に結合するペプチドが発見されてきた。そうしたペプチドリガンドは、血液中に存在する他の因子の存在下でも赤血球に特異的に結合する。こうしたリガンドは様々な方法で使用することができる。一実施形態では、リガンドと治療薬との分子融合体（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｕｓｉｏｎ）の形成を行う。リガンドは体内で赤血球に結合するため、治療薬は赤血球に結合して赤血球と一緒に循環する。赤血球はヒトの場合、約９０〜１２０日という長期間にわたり血流中を循環し、腫瘍血管床など疾患に関連する体内コンパートメント、ならびに肝臓および脾臓などの生理現象に関連する体内コンパートメントの多くを通過する。これらの特徴を使用すれば、治療薬送達に有用な、たとえば血液中の治療薬の循環を長時間持続させるのに有用な赤血球を作ることができる。
さらに意外にも驚くべきことに、これらの赤血球親和性リガンドまたは類似の抗体を使用して、免疫寛容を引き起こすことができることが明らかになった。本実施形態では、寛容誘導抗原および赤血球親和性リガンドを含む分子融合体を作製する。融合体は、トレランスが観察されるまで、十分な量で、注射または他の方法で投与する。これに対し、従来の報告は、赤血球の表面に抗原が結合するにより免疫拒絶が引き起こされるとしていた。
実施形態はまた、腫瘍を塞栓することにより癌を処置することも対象とする。腫瘍抗原および／または腫瘍微小血管抗原は、多く知られている。これらの抗原に特異的に結合する抗体は、容易に作製することができる。こうした腫瘍結合リガンドは、赤血球に結合するリガンド、すなわち、抗体（もしくはそのフラグメント）またはペプチド性リガンドと分子的に融合する。これらの融合体は、腫瘍部位で結合し、さらに赤血球にも結合するため、腫瘍への血液供給を遮断する。これらの実施形態および他の実施形態については、本明細書に記載される。
ＥＲＹ１ファージの赤血球結合のフローサイトメトリー解析の散布図である。 可溶性ビオチン化ＥＲＹ１ペプチドを用いた親和性プルダウンのモンタージュ写真である。図Ａ：ＥＲＹ１ペプチドおよびミスマッチペプチドを用いて溶出したサンプルのストレプトアビジン−ＨＲＰウエスタンブロット；図Ｂ：全赤血球ライセートと比較した、ＥＲＹ１ペプチドを用いて溶出したサンプルの抗マウスＧＹＰＡウエスタンブロット。 細胞結合の図をプロットしたものである。 静脈内投与後の血漿中ＭＢＰ濃度、およびＭＢＰと比較したＥＲＹ１−ＭＢＰの濃度−対−時間を示す、ＥＲＹ１−ＭＢＰの静脈内ボーラスの片対数プロットである。 皮下投与後の血漿中ＭＢＰ濃度；ＭＢＰ−対−ＥＲＹ１−ＭＢＰについての濃度−対−時間を示す、ＥＲＹ１−ＭＢＰの皮下ボーラスを片対数プロットである。 ｓｃＦｖの操作設計の模式図である；図Ａ：ｓｃＦｖドメインのＮ末端からＣ末端への直線表記；図Ｂ：フォールディングされたｓｃＦｖの構造；図Ｃ：化学的にコンジュゲートされたＥＲＹ１ペプチドを有する、フォールディングされたｓｃＦｖの構造。図６は、４回繰り返されるリンカー配列ＧＧＧＧＳ（配列番号１８）を含む。 フローサイトメトリーにより判定された、結合した細菌を有する細胞の割合を示す棒グラフの図である；図（Ａ）では、細菌表面のペプチドが、ＥＲＹ５０を除き、赤血球に結合するが、上皮２９３Ｔまたは内皮ＨＵＶＥＣには結合しない；図（Ｂ）では、各ペプチドが複数のヒトサンプルに結合するが、マウス血液に結合しない。 ＥＲＹ１−ＯＶＡ融合体が高親和性でマウス赤血球の赤道周辺に結合する、ＥＲＹ１とオボアルブミン（ＯＶＡ）との分子融合体の実験のスキームおよび結果を示す；図（ａ）オボアルブミン（ＯＶＡ）へのＥＲＹ１ペプチドのコンジュゲーションが、赤血球表面グリコホリンＡに結合する模式図；図（ｂ）フローサイトメトリーにより特徴付けられた、各ＯＶＡコンジュゲートおよび中間体の結合；黒塗りのヒストグラムはＥＲＹ１−ＯＶＡ；白抜きのヒストグラムはＳＭＣＣ−ＯＶＡ；点線のヒストグラムはＭＩＳ−ＯＶＡ；ＥＲＹ１＝赤血球結合ペプチドＷＭＶＬＰＷＬＰＧＴＬＤ（配列番号１）、ＭＩＳ＝ミスマッチペプチドＰＬＬＴＶＧＭＤＬＷＰＷ（配列番号２）、ＳＭＣＣ＝ＥＲＹ１をＯＶＡにコンジュゲートするのに使用したスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート；図（ｃ）フローサイトメトリーにより判定された、ＥＲＹ１−ＯＶＡの低解離定数（Ｒ２＝０．９７、単一部位結合）を証明する、ＥＲＹ１−ＯＶＡの赤血球に対する平衡結合。 ＥＲＹ１をコンジュゲートした抗原の分子融合体の結合および循環に関する実験のスキームおよび結果を示す：この融合体は静脈内投与されると、循環している健康な赤血球およびエリプトーシス（ｅｒｙｐｔｏｔｉｃ）の赤血球に生体特異的に結合し、特異的抗原提示細胞サブセットによる取り込みを誘導する；図（ａ）フローサイトメトリーにより判定された、非−注射マウス（白抜きのヒストグラム）と比較して、インビボで赤血球（ＣＤ４５−）集団に結合し、白血球（ＣＤ４５＋）集団には結合しない、ＯＶＡ（灰色の塗りのヒストグラム）およびＥＲＹ１−ＯＶＡ（黒塗りのヒストグラム）；図（ｂ）フローサイトメトリーにより判定された、循環しているエリプトーシス（ｅｒｙｐｔｏｔｉｃ）の（アネキシン−Ｖ＋）赤血球、および健康な（アネキシン−Ｖ−）赤血球に結合するＥＲＹ１−ＯＶＡ、およびそれらに結合しないＯＶＡ；図（ｃ）フローサイトメトリー測定の幾何平均蛍光強度（ｎ＝２、Ｒ２＝０．９８、１相指数関数的減衰（ｏｎｅ−ｐｈａｓｅ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｄｅｃａｙ））により判定された、循環赤血球に結合したＥＲＹ１−ＯＶＡの細胞表面半減期；図（ｄ）投与用量１５０μｇで、ＥＬＩＳＡにより判定された、時間依存性のＥＲＹ１−ＯＶＡ細胞表面濃度（ｎ＝２）。 赤血球結合が血液学的挙動を変化させないことを示すプロット図である；１０μｇのＯＶＡ（白丸）あるいはＥＲＹ１−ＯＶＡ（黒丸）の投与後様々な時点で測定された、図（ａ）ヘマトクリット；図（ｂ）平均血球容積、図（ｃ）赤血球ヘモグロビン含有量。 ＥＲＹ１をコンジュゲートした抗原が、特異的抗原提示細胞サブセットによる取り込みを生体特異的に誘導する結果の棒グラフである：図（ａ）ＭＩＳ−アロフィコシアニンと比較した、注射から１２時間および３６時間後での、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−ＣＤ１１ｃ＋およびＭＨＣＩＩ＋ＣＤ８α＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ２０５＋脾臓樹状細胞（ＤＣ）によるＥＲＹ１−アロフィコシアニンの増加した細胞取り込み；図（ｂ）静脈内投与後３６時間、ＭＩＳ−アロフィコシアニンと比較した、肝実質細胞（ＣＤ４５−ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１ｄ−）および肝星細胞（ＣＤ４５−ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１ｄ＋）によるが、肝臓のＤＣ（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｃ＋）またはクッパー（ＣＤ４５＋ＭＨＣＩＩ＋Ｆ４／８０＋）細胞にはよらない、肝臓でのＥＲＹ１−アロフィコシアニンの増加した細胞取り込み。（ｎ＝２、＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１）。データは平均±標準偏差を表す。 ＥＲＹ１−ＯＶＡの分子融合体がインビボで、抗原特異的ＯＴＩ ＣＤ８＋Ｔ細胞のクロスプライミング、およびアポトーシスの運命にある除去性増殖（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ−ｆａｔｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を増強することを示す結果の図である；図（ａ）１０μｇのＥＲＹ１−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＥＲＹ１−ＧＳＴ、左図）、１０μｇのＯＶＡ（中図）または１０μｇのＥＲＹ１−ＯＶＡ（右図）の静脈内投与から５日後の、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識された脾臓ＯＴＩ ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３ε＋ＣＤ８α＋ＣＤ４５．２＋）の増殖；図（ｂ）Ａならびに同一の１μｇ用量試験からの、ＯＴＩ ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の、用量依存的に定量された増殖集団、データは中央値±最小値〜最大値を表す（ｎ＝５、＊＊Ｐ≦０．０１、＃＃Ｐ＜０．０１）；図（ｃ）ＯＶＡ（中図）またはＥＲＹ１−ＧＳＴ（左図）と比較した、ＥＲＹ１−ＯＶＡ（右図）投与時の、より大きなアネキシン−Ｖ＋集団を示す、ＯＴＩ ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖世代；図（ｄ）ＥＲＹ１−ＯＶＡがＯＴＩ ＣＤ８＋Ｔ細胞アポトーシスを誘導したことを証明する、定量されたアネキシン−Ｖ＋ＯＴＩ ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖世代、データは平均±標準偏差を表す（ｎ＝５、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。すべてのデータは多重パラメーターフローサイトメトリーにより判定された。 ＥＲＹ１−ＯＶＡの分子融合体が抗原と接触した表現型に対してＯＴＩ ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導することを示す結果を、棒グラフで表した図である。図（ａ）１μｇのＯＶＡまたは１μｇのＥＲＹ１−ＯＶＡの投与から５日後の、脾臓でのＣＤ４４＋ＯＴＩ ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３ε＋ＣＤ８α＋ＣＤ４５．２＋ＣＤ４４＋）の定量（＊＊＊Ｐ＜０．０００１）；図（ｂ）１μｇのＯＶＡまたは１μｇのＥＲＹ１−ＯＶＡの投与から５日後の、脾臓でのＣＤ６２Ｌ−ＯＴＩ ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３ε＋ＣＤ８α＋ＣＤ４５．２＋ＣＤ６２Ｌ−の定量（＊Ｐ＜０．０５）；図（ｃ）１０μｇのＯＶＡまたは１０μｇのＥＲＹ１−ＯＶＡの投与から５日後の、脾臓でのＣＤ４４＋ＯＴＩ ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３ε＋ＣＤ８α＋ＣＤ４５．２＋ＣＤ４４＋）の定量（＊＊＊Ｐ＝０．０００５）；図（ｄ）１０μｇのＯＶＡまたは１０μｇのＥＲＹ１−ＯＶＡの投与から５日後の、脾臓でのＣＤ６２Ｌ−ＯＴＩ ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３ε＋ＣＤ８α＋ＣＤ４５．２＋ＣＤ６２Ｌ−の定量（＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。データは平均±標準偏差を表す（ｎ＝５）。 赤血球結合が抗原チャレンジに対してトレランスを誘導することを示す結果の図である：図（ａ）実験群ならびにチャレンジ群および未処置対照群に関する実験プロトコルを示す、ＯＴＩ ＣＤ８＋Ｔ細胞の養子移入トレランス（ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）モデル（ｎ＝５）；図（ｂ）ＯＴＩ ＣＤ８＋Ｔ細胞集団（ＣＤ３ε＋ＣＤ８α＋ＣＤ４５．２＋）のフローサイトメトリーによる検出；図（ｃ）ＣＤ４５．１＋マウスにおける、抗原チャレンジから４日後の、流入領域リンパ節（鼠径部および膝窩）でのＯＴＩ ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の定量（＊＊Ｐ＜０．０１）；図（ｄ）ＩＦＮγ発現ＯＴＩ ＣＤ８＋Ｔ細胞のフローサイトメトリーによる検出；図（ｅ）抗原チャレンジおよびＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（配列番号３）による再刺激から４日後の、流入領域リンパ節でのＩＦＮγ発現ＯＴＩ ＣＤ８＋Ｔ細胞（＊＊Ｐ＜０．０１）；図（ｆ）ＥＬＩＳＡにより判定された、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（配列番号３）による再刺激から４日後の、リンパ節細胞培養培地におけるＩＦＮγ濃度（＊＊Ｐ＜０．０１）；図（ｇ）ＥＬＩＳＡにより判定された、ＯＶＡによる再刺激から４日後の、リンパ節細胞培養培地におけるＩＬ−１０濃度（＊Ｐ＜０．０５）。データは中央値±最小値〜最大値を表す；図（ｈ）１９日目の、ＯＶＡ特異的血清ＩｇＧ力価（＊Ｐ＜０．０５）、データは平均±標準偏差を表す；図（ｉ）は、実験群および対照群（それぞれｎ＝４、３）の実験プロトコルを示す、ＯＴＩおよびＯＶＡ発現ＥＬ４胸腺腫（Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ）の組み合わせの腫瘍トレランスモデル；図（ｊ）養子移入から５日後の、血液中を循環する増殖していない（０世代）ＯＴＩ ＣＤ８＋Ｔ細胞の定量、データは中央値±最小値〜最大値を表す（＊＊Ｐ＜０．０１）；図（ｋ）ＯＴＩの養子移入から９日後に皮下注射された、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍の増殖プロファイル、データは平均±標準偏差を表す（＊Ｐ＜０．０５）。 Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて赤血球結合が抗原特異的液性応答をどの程度減弱するかを示す棒グラフである。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１μｇのＯＶＡまたは１μｇのＥＲＹ１−ＯＶＡを６日間の間隔を置いて２回投与してから１９日後の、血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＧを検出する（＊Ｐ≦０．０５）。 ８アームＰＥＧ−ＥＲＹ１がインビトロおよびインビボで赤血球に結合する実験結果を表す；図（ａ）８アームＰＥＧ−ＥＲＹ１（黒塗りのヒストグラム）はインビトロでのインキュベーション後にマウス赤血球に結合するが、８アームＰＥＧ−ＭＩＳ（灰色の塗りのヒストグラム）または８アームＰＥＧ−ピリジルジスルフィドは結合しない；図（ｂ）静脈内注射すると、８アームＰＥＧ−ＥＲＹ１（黒塗りのヒストグラム）は循環赤血球に結合するが、８アームＰＥＧ−ＭＩＳ（灰色の塗りのヒストグラム）は結合しない。 フローサイトメトリーにより判定された、８アームＰＥＧ−ＥＲＹ１（黒塗りの丸）および８アームＰＥＧ−ＭＩＳ（白抜きの四角）の赤血球細胞表面半減期を示す実験結果を表す。
好ましい実施形態の詳細な説明
本明細書は、赤血球に特異的に結合するペプチドについて記載する。これらは、赤血球に特異的に結合する配列を有するペプチド性リガンドとして、または赤血球に特異的に結合する抗体もしくはそのフラグメントとして提供される。ペプチドは、治療薬、寛容抗原または標的化ペプチドとの分子融合体として調製してもよい。治療薬は、融合体の一部分である場合、インビボの長い循環半減期を有利に有し得る。免疫寛容は、融合体の使用およびトレランスが望まれる物質上の抗原の選択により引き起こすことができる。標的化ペプチドを有する融合体は、融合体を標的、たとえば腫瘍に誘導し、そこで赤血球結合リガンドが、赤血球を標的にリクルートすることにより腫瘍への血液の流れを減少させる、または完全に阻止する。
したがって、タンパク質薬剤などの薬剤の循環半減期を延長するための、赤血球結合に関する分子設計を教示する。薬剤は、分子融合体、たとえば組換え融合体または化学的コンジュゲートとも呼ばれ、赤血球結合リガンドとのコンジュゲートとして形成してもよい。免疫寛容誘導のための分子設計も教示する。トレランスが求められるタンパク質抗原は、赤血球結合リガンドとのコンジュゲート、たとえば組換え融合体、または化学的コンジュゲート、たとえばポリマーまたはポリマーミセルもしくはポリマーナノ粒子コンジュゲート、として形成される。腫瘍塞栓術のための分子設計も教示する。赤血球結合リガンドは、腫瘍血管系のリガンドとのコンジュゲートとして形成され、腫瘍血管系を標的とすることで、腫瘍血管系内での赤血球結合を標的とする。
赤血球に特異的に結合するペプチド性配列
赤血球に特異的に結合するペプチドが発見された。実施例１は、赤血球に特異的に結合するペプチド（ＥＲＹ１）の発見について記載する。実施例８は、ヒト赤血球に特異的に結合する６種のペプチド（ＥＲＹ１９、ＥＲＹ５９、ＥＲＹ６４、ＥＲＹ１２３、ＥＲＹ１４１およびＥＲＹ１６２）の発見について記載する。本発明の一実施形態は、ＥＲＹ１のアミノ酸配列、もしくはヒト赤血球結合ペプチドのアミノ酸配列、またはそれらの保存的置換、あるいはそれらをコードする核酸を含む、実質的に純粋なポリペプチドである。こうしたポリペプチドは赤血球に特異的に結合するもので、赤血球に対するリガンドである。リガンドとは、標的分子に特異的に結合する化学部分をいう用語である。標的とは、使用者がリガンドと結合させようとする所定の分子、組織または部位をいう。したがって組織への標的送達とは、分子または細胞などの他の材料を目的の標的組織に送達することをいう。このため、実施形態は、赤血球への結合に使用される本明細書に開示されたリガンドの少なくとも１つを含む、分子または組成物を含む。ポリペプチドの赤血球への結合活性は、本明細書に記載するような以下の実験プロトコルだけで決定することができる。こうした方法を用いれば、一定の生理的条件下で、ＥＲＹ１またはヒト赤血球結合ペプチドと比較して、ポリペプチドバリアントの結合力を決定することができ、たとえば、保存的置換、隣接する基の付加または除去、または水溶液に対する配列の溶解性を調節するための変化または付加により配列を作製することができる。
実施例２に詳述するように、これらのペプチド性リガンドは、細胞形態を変化させず、かつ細胞質移行をせずに、赤血球細胞表面に結合した。リガンドは細胞表面全体に分布し、クラスター形成は認められない。グリコホリンＡ（ＧＹＰＡ）をＥＲＹ−１の標的として同定した実施例３のように、リガンドの標的であった特定のタンパク質を同定することができる。ＥＲＹ−１はマウス種およびラット種とのみ反応した（実施例４）。ヒト赤血球に特異的に結合したペプチド性リガンドはヒト赤血球に特異的であり、他の種には特異的ではなかった（実施例９）。
精製された赤血球細胞表面タンパク質に対するスクリーニングではなく、全赤血球を含むナイーブペプチドライブラリーをスクリーニングして、親和性パートナー（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐａｒｔｎｅｒ）を発見した。密度勾配遠心分離および十分な洗浄の使用の間、回転除去から逃れる非結合ファージの数を最小限に抑えるように細心の注意を払った。さらに、選択を停止して、スクリーニングプロセスの初期にクローンを解析して、高度に感染性のファージクローンが集団を支配しないようにした。非特異的結合現象を減らすため、また、血清中で好ましい結合特性を持つペプチドを選択するため（より重要と考えられる）、高濃度の血清アルブミン（５０ｍｇ／ｍＬ）の存在下で３７℃にて全スクリーニングプロセスを行った。最初の一連の実験（実施例１）では、クローン解析から、マウス赤血球細胞表面に対して高親和性ペプチド、ＷＭＶＬＰＷＬＰＧＴＬＤ（本明細書でＥＲＹ１という配列番号１）を提示する１つのファージクローンが明らかになった（図１）。ＵｎｉＰｒｏｔのＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて類似性を検索したところ、完全なペプチドに対して関連するタンパク質配列相同性は確認されなかった。他の実験（実施例８）では、表１〜２に示されるようにヒト赤血球に対する結合リガンドが確認された。６つの配列がヒト赤血球に特異的に結合した。ＥＲＹ５０と名付けた７番目の配列はヒト赤血球に結合するだけでなく、上皮／内皮細胞にも結合した。
Figure 0006017422
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本発明の実施形態は、赤血球の表面に特異的に結合するペプチドを含む。配列は、最小長に最適化しなかった。こうした最適化は当該技術分野の技術の範囲内であり、本明細書に記載の技術を用いて実施してもよい。たとえば、Ｋｅｎｒｉｃｋら（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．（２０１０）２３（１）：９−１７）は、１５残基のライブラリーからスクリーニングし、次いで７残基長の最小の結合配列を特定した。Ｇｅｔｚ（ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，Ｍａｙ ２６，２０１１は、５残基長という小さな最小結合ドメインを特定した。赤血球結合ペプチドは、同じ配列の反復配列、たとえば、２〜２０の反復配列に存在してもよい；当業者であれば、すべての範囲および明記した範囲内の値を意図していることをすぐに理解するであろう。さらに、ペプチドは、同じペプチド内にある、または単一の分子融合体の一部分である、２つ以上の異なる配列と組み合わせて存在してもよい。
特異的結合を与える連続した残基の数は、約４〜１２残基であると予想される。したがって、表２に掲載した長さが４個の連続した残基のペプチドの全部のほか、たとえば、５個、６個、７個または８個の連続した残基のペプチドもすべて開示する。この数は、他のペプチド性タンパク質結合リガンドに対する残基数に基づく。本発明の実施形態は、表１を含む本明細書に示した赤血球に結合する配列番号の１つに対する最小長の配列を含む。したがって、ある種の実施形態は、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１およびそれらの保存的置換体からなる群から選択される配列の４〜１２個の連続したアミノ酸残基のいくつかの連続したアミノ酸配列を含み、前記配列は赤血球に特異的に結合するペプチドまたは単離された（または精製された）ペプチドを含む組成物を対象とする。あるいは、連続した残基の数は、約５〜約１８であるように選択してもよい；当業者であれば、たとえば、７、８、９、１０または８〜１８など、すべての範囲および明記した範囲内の値を意図していることをすぐに理解するであろう。赤血球結合配列は、たとえば、配列の少なくとも１個および２個以下のアミノ酸の保存的置換、または１、２もしくは３つの置換、または１〜５つの置換を有してもよい。さらにＧｉｏｒｄａｎｏにあるのと同様に、発見された配列のＬ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との置換を頻繁に行ってもよい。いくつかの実施形態では、ペプチドまたは組成物は、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１からなる群から選択される配列を必須としてなってもよい。ペプチドは長さを限定してもよく、たとえば、約１０〜約１００の多くの残基を有する；当業者であれば、たとえば、約１０〜約５０または約１５〜約８０など、すべての範囲および明記した範囲内の値を意図していることをすぐに理解するであろう。ペプチドと赤血球との平衡状態における結合の測定により判定した場合に約１０μＭ〜０．１ｎＭの解離定数を有するペプチドリガンドを含むペプチドの赤血球結合部分を提供してもよい；当業者であれば、たとえば、約１μＭ〜約１ｎＭなど、すべての範囲および明記した範囲内の値を意図していることをすぐに理解するであろう。ペプチドは、治療薬をさらに含んでもよい。治療薬は、たとえば、タンパク質、生物製剤、抗体フラグメント、ＳｃＦｖ、またはペプチドであってもよい。ペプチドは、寛容誘導抗原、たとえば、タンパク質が欠損したヒトに使用されるヒトタンパク質（たとえば、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子などの血液因子）、非ヒト型グリコシル化を含むタンパク質、ヒトに天然には見出されない合成タンパク質、ヒト食物アレルゲンまたはヒト自己免疫抗原をさらに含んでもよい。
他の研究者も、赤血球の表面に特異的に結合するペプチド性リガンドについて探索してきた。以前の研究では、細菌表面に提示された新規なペプチドライブラリーをスクリーニングする方法の使用により赤血球結合ペプチドの発見が試みられた（Ｈａｌｌ，Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉら，２００７年）。その研究の中心は、赤血球に対して親和性を有するペプチドのナイーブライブラリーをスクリーニングするための新規な細菌のペプチドディスプレイシステムを確立し、ペプチドを使用して０．２２μｍの粒子を赤血球に結合することにあった。この課題を達成するいくつかのペプチドが同定されたことが報告されたものの、応用的な考察に必要な結合現象の特徴付けは十分に行われなかった。ペプチドの細胞結合特異性については報告されなかった。すなわち、ペプチドが他のどの細胞型に結合するかという問題が検討されなかった。ペプチドの細胞表面リガンドについても報告されなかった。ペプチド官能基を持たせた０．２２μｍの粒子で標識した赤血球を撮影した電子顕微鏡写真には、１個の細胞につき単一の粒子集合体を含む赤血球が示された。有望な結合部位の大部分は、細胞表面全体に広く分布していると予想され、かつ試験したリガンドがすべて小さな細胞領域に局在していることから、これらの結果は実験上のアーチファクトであることが示される。こうしたアーチファクトは、モル過剰で標識を行ったか、または他の要因の結果である可能性がある。最も重要なのは、インビボでのペプチド−粒子の赤血球結合または薬物動態の特徴付けを行わなかったことである。以上を総合すると、Ｈａｌｌらにより説明された結果は、赤血球に対するペプチドリガンドが療法剤の薬物動態を改善するツールとしてまたは他の医療方法または治療方法において、使用し得ることを示唆しない。
特定の用途に応じて様々な長さのポリペプチドを使用することができる。一般に、ポリペプチドリガンド配列を含むポリペプチドは、インビボで赤血球と相互作用することができれば、特異的結合を示す。フォールドする可能性があるペプチドについては、本明細書に記載の方法を用いて試験してもよい。したがって、ある種の実施形態は、ポリペプチドリガンドを有するが、自然界に存在しないポリペプチドを対象とし、ある種の他の実施形態は、特定の長さ、たとえば、６〜３０００残基、または１２〜１０００残基または１２〜１００残基または１０〜５０残基を有するポリペプチドを対象とする；当業者であれば、明記した範囲内のあらゆる値および範囲を意図していることをすぐに理解するであろう。
ある種の実施形態は、様々なポリペプチド配列および／または精製されたもしくは単離されたポリペプチドを提供する。ポリペプチドとは、翻訳後修飾（たとえば、リン酸化またはグリコシル化）および／またはさらなるポリペプチドとの複合体形成、核酸および／もしくは糖質または他の分子とのマルチサブユニット複合体の合成に関係になく、アミノ酸残基鎖をいう用語である。したがって本明細書では、プロテオグリカンもポリペプチドという。本明細書で使用する場合、「機能性ポリペプチド」とは、表記の機能を促進することができるポリペプチドである。ポリペプチドは、いくつかの方法により作製することができ、その多くが当該技術分野において周知である。たとえば、ポリペプチドは、抽出（たとえば、単離された細胞から）、ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現、または化学合成により得ることができる。ポリペプチドは、たとえば、組換え技術、およびコードされたポリペプチドの発現のために宿主細胞に導入される（たとえば、形質転換またはトランスフェクションにより）ポリペプチドをコードする発現ベクターを使用して、作製できる。
活性を変化させずにアミノ酸配列に一般に行うことができる保存的変化には様々ある。これらの変化は、保存的置換または突然変異と呼ばれる；すなわち、特定の大きさまたは特性を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸を別のアミノ酸と置換することができる。アミノ酸配列の置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択してもよい。たとえば、無極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンおよびチロシンが挙げられる。極性で中性のアミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正電荷を持つ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負電荷を持つ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。こうした変化は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または等電点により判定した場合、見かけの分子量に実質的に影響を与えないと予想される。保存的置換は、配列の光学異性体と他の光学異性体との置換、具体的には配列の１つ以上の残基に関するＤアミノ酸とＬアミノ酸との置換をさらに含む。さらに、配列中のアミノ酸をすべてＤ異性体からＬ異性体に置換してもよい。例示的保存的置換には、正電荷が維持されるＡｒｇからＬｙｓへの置換およびその逆；負電荷が維持されるＡｓｐからＧｌｕへの置換およびその逆；遊離−ＯＨが維持されるようなＴｈｒからＳｅｒへの置換；ならびに遊離ＮＨ２が維持されるＡｓｎからＧｌｎへの置換があるが、これに限定されるものではない。さらに場合によっては、ポリペプチドまたは核酸フラグメントの機能を失わせずに、ポリペプチド配列または対応する核酸配列の点突然変異、欠失および挿入を行ってもよい。置換は、たとえば、１、２、３またはそれ以上の残基をさらに含んでもよい。本明細書に記載のアミノ酸残基は、アミノ酸の１文字表記または３文字略語を使用する。本明細書に使用した略語は、標準的なポリペプチド命名法、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９６９），２４３，３５５２−３５５９に従う。本明細書のアミノ酸残基の配列はすべて、左および右の方向性を、従来のアミノ末端からカルボキシ末端方向とする方式で表される。
場合によっては、本明細書に示した配列に対するペプチドの同一性パーセントの判定が必要になる場合がある。こうした場合には、ペプチドまたはペプチドの一部分の残基数の観点から同一性パーセントを測定する。さらに、たとえば、９０％同一のポリペプチドは、より大きなペプチドの一部分であってもよい。
本明細書で使用する場合、ポリペプチドに関連する精製されたという用語とは、ポリペプチドが化学的に合成されており、したがって実質的に他のポリペプチドが混入していないこと、あるいは天然に伴う他の大部分の細胞成分（たとえば、他の細胞タンパク質、ポリヌクレオチドまたは細胞成分）から分離または精製されていることをいう。精製されたポリペプチドの例として、乾燥重量で少なくとも７０％であり、天然に結合するタンパク質および天然の有機分子を含まないポリペプチドが挙げられる。このため、精製されたポリペプチドの調製物は、たとえば、そのポリペプチドの乾燥重量で少なくとも８０％でも、少なくとも９０％でも、または少なくとも９９％でもよい。ポリペプチドはまた、ポリペプチドを精製したり、または目印を付けたり（たとえば、親和性マトリックス上に捕捉し、顕微鏡下で可視化する）しやすくするタグ配列（たとえば、ポリヒスチジンタグ、ｍｙｃタグまたはＦＬＡＧ（登録商標）タグ）を含むように操作されてもよい。このため、ポリペプチドを含む精製された組成物とは、他に記載がない限り、精製されたポリペプチドをいう。単離されたという用語は、本発明のポリペプチドまたは核酸がその天然の環境にないことを示す。したがって、本発明の単離された産物は、たとえば培養上清中に含まれていても、部分的に濃縮されていても、異種供給源から産生されても、ベクターにクローニングされていても、またはビヒクルと共に製剤化されていてもよい。
ポリペプチドは、化学修飾を含んでもよい；この文脈でこの用語は、アミノ酸の天然の化学構造における変化をいう。こうした修飾は側鎖または末端に行い、たとえば、アミノ末端またはカルボキシル末端を変化させてもよい。いくつかの実施形態では、修飾は、ポリペプチドを他の材料に結合する、または治療薬を結合するのに使用すると都合がよい場合がある化学基を作るのに有用である。
生物学の技術分野で一般に使用される特異的結合という用語は、非標的組織と比較して比較的高い親和性で分子が標的に結合することをいい、一般に静電的相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合等などの複数の非共有結合性相互作用が関係する。特異的結合相互作用は、抗体−抗原結合、酵素−基質結合および特異的に結合するタンパク質−受容体相互作用を特徴付けるものである；一方、こうした分子は、随時その標的以外の組織に結合することがあり、こうした結合は特異性がないとされ、特異的結合ではない。ペプチドＥＲＹ１およびその誘導体、ならびにヒト赤血球結合ペプチドおよびその誘導体は、一部の環境で赤血球以外に結合する場合があり、こうした結合は非特異的であることが観察されたものの、ペプチドのより多くの結合が他の細胞またはタンパク質ではなく赤血球への結合であることが証明された。
したがって、実施形態は、赤血球に特異的に結合し、かつ他の血液成分、たとえば、血液タンパク質、アルブミン、フィブロネクチン、血小板、白血球、典型的なヒトから採取した血液サンプル中に認められる実質的にすべての成分のうち１つ以上に特異的に結合しないリガンドを含む。血液サンプルの文脈では、「実質的にすべて」という用語は、典型的に存在する成分をいうが、他の体内吸収されるリガンドの力価を事実上低下させない非常に低濃度の付随的な成分を除外することをいう。
抗体ペプチド
本明細書には、赤血球に結合するペプチドだけでなく、タンパク質、特に抗体、とりわけ一本鎖抗体も提示する。抗原に対する抗体の産生技術はよく知られている。この文脈で抗原という用語は、抗原に反応する宿主免疫系により認識される部位をいう。抗原の選択は、数ある技術分野の中でも抗体を産生する技術分野において公知である。実施形態は、分子融合体および本明細書に示した他の方法を用いた、これらのペプチドの使用を含む。本開示を読んだ当業者であれば、赤血球に特異的に結合する抗体を作製することができよう。実施例１５〜１７は、抗体もしくはそのフラグメントの作製に関する。
本明細書では、ペプチドという用語をポリペプチドという用語と同義で使用する。抗体および抗体フラグメントはペプチドである。抗体フラグメントという用語は、抗体の抗原結合機能を保持する抗体の一部分をいう。フラグメントは、文字通り、より大きな抗体の一部分から作製してもよいし、あるいはその代わりに新規に（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成してもよい。抗体フラグメントは、たとえば、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは、リンカーペプチド、たとえば、約１０〜約５０アミノ酸で連結された、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と連結でき、またはその逆もできる。ｓｃＦｖという用語は、二価のｓｃＦｖ、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）および抗体フラグメントの他の組み合わせを含む。抗体は、パラトープと呼ばれる抗原結合部分を有する。ペプチドリガンドという用語は、パラトープの一部分ではないペプチドをいう。
赤血球に特異的に結合するアプタマー
赤血球に結合するペプチドリガンドだけでなく、赤血球表面成分に対するヌクレオチドアプタマーリガンドも教示する。したがって、アプタマーは、本明細書に記載するように他の赤血球結合部分に対して作製および使用してもよい。ＤＮＡアプタマーおよびＲＮＡアプタマーを使用して、非共有結合性の赤血球結合を提供してもよい。それらはヌクレオチドのみからなるため、スクリーニング手法が十分に確立しており、化学合成しやすいうえ、インビボでのクリアランスが速いことから副作用の毒性および／または免疫原性が限られているという点で、アプタマーは有望な生体分子の標的化部分となる（Ｋｅｅｆｅ，Ｐａｉら，２０１０年）。さらに、ヌクレオチド−標的タンパク質相互作用の非標準的（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ）性質により、インビボでの標的結合時に任意の増殖性（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）アゴニストシグナル伝達が起こるが可能性が少なく、したがって免疫原性および毒性への寄与が低い。このため、多くのアプタマーに基づく分子が現在、白血病、黄斑変性症、血栓症および２型糖尿病などいくつかの臨床適応症に関するヒト臨床試験に入っている（Ｋｅｅｆｅ，Ｐａｉら，２０１０年）。アプタマーはまた、癌化学療法および蛍光または放射性物質による腫瘍検出技術などの分野で、薬剤の正味重量をインビボで特定の組織に送達するための標的化剤としても使用されてきた（Ｒｏｃｋｅｙ，Ｈｕａｎｇら，２０１１年；Ｓａｖｌａ，Ｔａｒａｔｕｌａら，２０１１年）。
アプタマーは、特定の標的分子に結合するオリゴ核酸またはペプチドである。アプタマーは通常、大きなランダム配列プールからそれらを選択することにより目的の標的に結合するように作製される。アプタマーは、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマーまたはペプチドアプタマーに分類することができる。核酸アプタマーは、インビトロセレクション法、すなわち試験管内進化法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ＳＥＬＥＸ）法（Ａｒｃｈｅｍｉｘ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）（Ｓａｍｐｓｏｎ，２００３）を複数回繰り返して、小分子、タンパク質、核酸、細胞、組織および生体などの標的に特異的に結合するように操作された核酸種である。ペプチドアプタマーは典型的には、タンパク質の骨格に両端で結合する短い可変ペプチドドメインを有する。ペプチドアプタマーは、細胞内での他のタンパク質との相互作用を阻害するように設計されたタンパク質である。ペプチドアプタマーは、タンパク質の骨格に両端で結合する可変ペプチドループからなる。この二重の構造的制約により、ペプチドアプタマーの結合親和性が抗体に匹敵するように大きく高められる。可変ループ長は典型的には約１０〜約２０アミノ酸からなり、骨格は、十分な溶解性を有する小型のタンパク質である。たとえば細菌タンパク質チオレドキシン−Ａは、その野生型タンパク質の−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ループ（２つのシステイン側鎖がジスルフィド架橋を形成できる）である還元活性部位内に挿入される可変ループを備える、骨格タンパク質である。
アプタマーを作製するためのいくつかの技術については、Ｌｕら，Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ ２００９年：１０９（５）：１９４８〜１９９８、さらに米国特許第７，８９２，７３４号明細書、米国特許第７，８１１，８０９号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０１２９８２０号明細書、米国特許出願公開第２００９／０１４９６５６号明細書、米国特許出願公開第２００６／０１２７９２９号明細書および米国特許出願公開第２００７／０１１１２２２号明細書に詳述されている。実施例１９には、本明細書に開示された実施形態に使用されるアプタマーを作製および使用するための材料および方法がさらに詳述される。
分子融合体
分子融合体は、第１のペプチド性赤血球結合リガンドと第２のペプチドとの間で形成してもよい。融合体は、相互に、直接的または間接的にコンジュゲートされたペプチドを含む。ペプチドは、相互に、直接的にコンジュゲートしても、またはリンカーを介して間接的にコンジュゲートしてもよい。リンカーはペプチドでも、ポリマーでも、アプタマーでも、核酸でも、または粒子でもよい。粒子は、たとえばマイクロ粒子でも、ナノ粒子でも、ポリマーソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ）でも、リポソームでも、またはミセルでもよい。ポリマーは、たとえば天然でも、合成でも、線状でも、または分岐でもよい。第１のペプチドおよび第２のペプチドを含む融合タンパク質は、ペプチドの分子融合体の一例であり、この融合タンパク質は、相互に直接結合したペプチドを含むか、あるいは、介在するリンカー配列および／またはさらなる配列を一端または両端に含む。リンカーとのコンジュゲーションは、共有結合を介したものでもよい。他の結合としてはイオン結合がある。方法は、分子融合体、または分子融合体を含む組成物を調製することを含み、該分子融合体は、赤血球に特異的に結合するペプチドおよび、治療薬、寛容抗原または他の物質を含むものである。
分子融合体という用語またはコンジュゲートされたという用語は、共有結合、静電気的イオン的結合、電荷−電荷結合などの化学結合による直接的または間接的結合をいう。コンジュゲーションは、化学結合により維持される単位を作る。直接コンジュゲーションとは、介在するリンカーまたは化学基を用いたあるいは用いない、作用物質との化学結合をいう。間接コンジュゲーションとはキャリアとの化学結合をいう。キャリアは、作用物質を主として封入してもよく、たとえば、ポリマーソーム、リポソームもしくはミセルまたはある種のナノ粒子、または、作用物質をその表面に有してもよく、たとえば、金属ナノ粒子もしくはビーズ、あるいは、その両方に有してもよい、たとえば、作用物質のいくらかをその内部および外面に含む粒子。キャリアはまた、免疫寛容のための抗原を封入してもよい。たとえば抗原を封入するポリマーソーム、リポソームまたは粒子を作製してもよい。封入するという用語は、まったく露出されることなく効率的に全体を被覆することを意味し、たとえば、抗原または作用物質を封入するポリマーソームを作製してもよい。治療薬の例には、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、抗体フラグメント、小分子薬剤、生理活性ペプチド、生理活性タンパク質および生理活性生体分子がある。
コンジュゲーションは、リンカーを使用してあるいは使用せずにペプチドを別の分子に共有結合することにより達成してもよい。こうしたコンジュゲートの形成は当業者の技術の範囲内であり、コンジュゲーションを達成するための様々な技術が知られており、個々の技術の選択は、コンジュゲートとされる材料により左右される。イオン性側鎖を含有し、すなわちアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、システイン、ヒスチジンまたはチロシン、かつポリペプチド配列の活性部分に含まれないアミノ酸の、ポリペプチドへの付加（ＣまたはＮ末端）は、それらの非プロトン化状態で、ポリマーに結合した反応基との様々なバイオコンジュゲーション反応に関与する強力な求核試薬、すなわちホモまたはヘテロ２官能性ＰＥＧ、としての役割を果たす（たとえば、Ｌｕｔｏｌｆ ａｎｄ Ｈｕｂｂｅｌｌ，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００３；４：７１３−２２， Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｌｏｎｄｏｎ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ；１９９６）。いくつかの実施形態では、可溶性のポリマーリンカーを使用し、薬学的に許容される形態で患者に投与してもよい。あるいは、薬剤をポリメロソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｏｓｏｍｅ）またはベシクル（ｖｅｓｉｃｌｅ）に封入してもよく、またはペプチドリガンドに共有結合してもよい。
一実施形態は、非タンパク質治療薬と、赤血球に特異的に結合するペプチドリガンド、抗体、抗体フラグメントまたはアプタマーとのコンジュゲーションである。赤血球結合ペプチド法の応用は、ポリペプチド療法剤に限定されるものではなく、むしろ小分子およびポリマー粒子など他の薬剤製剤という形で現れている。小分子および医療におけるその応用の長い歴史の中で、循環半減期の短さおよびバイオアベイラビリティーの低さが常にそのインビボでの有効性を妨げてきた。ポリマーミセルおよびナノ粒子は比較的新しい世代の薬剤クラスであるが、細網内皮系の作用による高いクリアランス速度などの理由から、その薬物動態学的挙動は依然として不十分なままである（Ｍｏｇｈｉｍｉ ａｎｄ Ｓｚｅｂｅｎｉ，２００３）。赤血球結合設計をこれらの他の薬剤クラスに広げて、それらの循環半減期を長くし、臨床的有効性を高めることができる。
コンジュゲートは粒子を含んでもよい。赤血球結合ペプチドは、粒子に結合させてもよい。抗原、作用物質または他の物質は粒子中にあっても、または粒子上にあってもよい。ナノ粒子、ミセルおよび他の粒子の例については、たとえば、米国特許出願公開第２００８／００３１８９９号明細書、米国特許出願公開第２０１０／００５５１８９号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０００３３３８号明細書に掲載されており、これらの明細書は、それらを本明細書で説明されるリガンドと組み合わせることを含む、あらゆる目的のため出典明示により本明細書に組み込まれる；ただし、矛盾する場合は、本明細書が優先する。実施例１１および１２は、ある種の粒子の作製について詳細に記載する。
ナノ粒子は、平均直径約１０ｎｍ〜約２００ｎｍを有する粒子の集合体として調製してもよく、調製方法により得られる多分散に応じて、明記した範囲、たとえば、約２０〜約２００ｎｍ、および約２０〜約４０ｎｍ、〜約７０ｎｍまたは〜約１００ｎｍの、すべての範囲および値を含む。ポリ（エチレングリコール）とポリ（乳酸）とのコポリマーから形成されたもの、ポリ（エチレンオキシド）とポリ（β−アミノエステル）とのコポリマーから形成されたもの、および血清アルブミンなどのタンパク質から形成されたものなど様々なナノ粒子系を利用してもよい。他のナノ粒子系も当業者に知られている。さらに、Ｄｅｖａｌａｐａｌｌｙら，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，０７−２５−０６；Ｌａｎｇｅｒ ｅｔら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２５７：１６９〜１８０（２００３年）；およびＴｏｂｉｏら，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５（２）：２７０〜２７５（１９９８年）も参照されたい。
軟骨組織結合リガンドを組み込んだ平均直径約２００ｎｍを超えるより大きな粒子を調製してもよく、これらの粒子は、ミクロンスケールに近づきつつあるため本明細書ではマイクロ粒子といい、ほぼ光学分解能の限界内にとどまる。たとえば、マイクロ粒子を作製するある種の技術については、米国特許第５，２２７，１６５号明細書、同第６，０２２，５６４号明細書、同第６，０９０，９２５号明細書および同第６，２２４，７９４号明細書に記載されている。
ターゲティング能を利用するためにナノ粒子を機能化するには、たとえば、バイオコンジュゲーション技術を用いて共有結合により標的化ポリペプチドを粒子と結合させる必要があり、個々の技術の選択は、ポリペプチドが結合する粒子もしくはナノ粒子または他のコンストラクトにより左右される。一般に、ペプチドを他の材料に結合する多くのバイオコンジュゲーション技術がよく知られており、個々の材料に最も好適な技術を選択してもよい。たとえば、ポリペプチドをチオール反応分子に結合させる場合は、システインなど、ポリペプチド配列にさらなるアミノ酸を結合させてもよい。
実施例１８は、赤血球に特異的に結合する部分を含む多量体の分岐ポリマーの作製について詳述する。複数の異なる生理活性分子を提示できる多量体分子を作製するために、市販されている８アームＰＥＧデンドリマーを化学修飾して、コンジュゲーション反応を容易にする反応基を含めた。８アームＰＥＧ−ピリジルジスルフィドは、小分子および／またはシステイン含有ペプチドもしくはタンパク質のチオレートと容易に反応するピリジルジスルフィド基を含有し、結合した生理活性部分と８アームＰＥＧ骨格との間でジスルフィド結合が生じた。８アームＰＥＧの多量体構造により、その骨格と、様々なペプチドまたは分子とのコンジュゲーションが可能になり、したがってその結合された部分によって複数の活性を有するヘテロ官能性の生体分子が作製される。インビトロ（図１６Ａ）およびインビボ（図１６Ｂ）で赤血球に結合できる、ヘテロ官能性の蛍光８アームＰＥＧコンストラクトを作製した。この結合は、非特異的ＭＩＳペプチドを持つコンジュゲートが赤血球にほとんど、あるいはまったく結合しないことを証明したため、ＥＲＹ１ペプチドに特異的な配列であった。蛍光８アームＰＥＧ−ＥＲＹ１−ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ６４７が静脈内投与から５時間後に循環赤血球上で検出され、細胞表面における半減期が２．２時間を示したため、インビボでの結合は、長く続いた（図１７）。自己免疫糖尿病マウスモデルにおけるトレランスの誘導を証明するため、ＥＲＹ１および糖尿病抗原クロモグラニンＡ（ＣｒＡ）の両方とコンジュゲートされた８アームＰＥＧを作製した。８アームＰＥＧ−ピリジルジスルフィド骨格のモジュール性により、様々なチオール含有分子を、化学量論的に決定された量の分子を連続的に加えることにより共コンジュゲート（ｃｏ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）することが可能になる。
分子融合体はポリマーを含んでもよい。ポリマーは分岐状でも、または線状でもよい。分子融合体はデンドリマーを含んでもよい。コンジュゲートは可溶性であり、患者への導入後に生体内で利用されるので、一般に、可溶性親水性の生体適合性ポリマーが使用され得る。可溶性ポリマーの例には、少なくとも１００、４００または１００〜４００，０００（すべての範囲およびこれらの明示的な各値の間の値を意図している）の分子量を有するポリビニルアルコール、ポリエチレンイミンおよびポリエチレングリコール（本用語はポリエチレンオキシドを含む）がある。この文脈では、溶解性とは、水または生理食塩水中で１リットル当たり少なくとも１グラムの溶解性をいう。また、生分解性ポリマー、たとえば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸とポリグリコール酸とのコポリマー、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピランおよびポリシアノアシレートのドメインを使用してもよい。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド−ポリマー結合、たとえば、コンジュゲート、を調製し、精製された組成物として薬学的に許容される状態でまたは医薬品賦形剤と共に体内に導入する。導入の部位は、たとえば、全身であっても、または組織もしくは移植部位であってもよい。
当業者であれば、当該技術で知られた技術を用いて融合タンパク質を調製することができる。実施形態は、融合タンパク質を調製すること、それらを単離すること、および、他の作用物質を用いてまたは用いずに薬学的に許容される形態で、たとえば、ＴＧＦ−βのインターロイキンとの組み合わせで、それらを投与することを含む。実施形態は、細胞をトランスフェクトすることにより、細胞を操作してインビボで融合タンパク質を作製するためのベクターおよび方法を含み、細胞はインビトロ、エキソビボまたはインビボでトランスフェクトされるものであり、かつ細胞は、組織移植片またはそれと異なるメンバーであるものである。以下の米国特許出願は、融合タンパク質を作製する目的を含むあらゆる目的のため出典明示により本明細書に組み込まれ、矛盾が生じた場合は、本明細書が優先する：米国特許第５２２７２９３号明細書、同第５３５８８５７号明細書、同第５８８５８０８号明細書、同第５９４８６３９号明細書、同第５９９４１０４号明細書、同第６５１２１０３号明細書、同第６５６２３４７号明細書、同第６９０５６８８号明細書、同第７１７５９８８号明細書、同第７７０４９４３号明細書、米国特許出願公開第２００２／０００４０３７号明細書、米国特許出願公開第２００５／００５３５７９号明細書、米国特許出願公開第２００５／０２０３０２２号明細書、米国特許出願公開第２００５／０２５０９３６号明細書、米国特許出願公開第２００９／０３２４５３８号明細書。
分子融合体の実施形態は、たとえば、寛容誘導抗原、および患者の赤血球に特異的に結合し、それにより抗原を赤血球に結合する赤血球結合部分を含む分子融合体を含み、寛容誘導抗原を含む物質に免疫寛容を引き起こすのに効果的な量で分子融合体は投与されるものである。実施形態は、たとえば、赤血球に特異的に結合し、ポリマー、分岐ポリマーおよび粒子からなる群から選択されるキャリアに結合した赤血球結合部分を含む組成物を含み、キャリアは治療薬に結合しているものである。粒子は、たとえば、マイクロ粒子でも、ナノ粒子でも、ポリマーソームでも、リポソームでも、またはミセルでもよい。赤血球結合部分は、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１、およびそれらの保存的置換体からなる群から選択される配列の少なくとも５個の連続したアミノ酸残基を含むペプチドを含んでもよく、前記配列は赤血球に特異的に結合するものである。赤血球結合部分は、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、ｓｃＦｖまたはペプチドリガンドを含んでもよい。分子融合体の実施形態は、赤血球結合部分、および、寛容誘導抗原、抗体、抗体フラグメント、ＳｃＦｖ、小分子薬剤、粒子、タンパク質、ペプチドまたはアプタマーを含む。
改善された薬物動態のための赤血球結合リガンド
多くの薬剤は血液循環系に全身的に送達されるため、効果的な薬物送達という問題に対する解決策は、多くの場合、血液中の薬剤を長時間にわたり維持することに焦点を当てる。このため、長時間にわたり血液中で生物学的に利用可能な状態にある、長時間循環型（長い半減期の）療法剤の開発は、有効性、安全性および経済的実現可能性の観点から操作された新世代の薬剤を代表する。
本発明の実施形態は、赤血球結合ペプチドと治療薬との分子融合体を含む。赤血球に特異的に結合するペプチドと治療薬または他の物質との分子融合体は、治療薬／物質の循環時間（インビボでの血液中の循環半減期）を長くする。実施例５および６は、その実施例を提供する。長くなるのは、たとえば血清中半減期が約１．５倍から２０倍長くなり、当業者であれば、たとえば、約３倍または約６倍または約３倍から約６倍など、すべての範囲および明記した範囲内の値を意図していることをすぐに理解するであろう。
分子融合体は、たとえば、ペプチドの組換え体の添加または化学的コンジュゲーションにより、治療薬または結合される分子もしくは粒子の反応性部位にペプチドを加えることにより達成することができる。固相ペプチド合成法を用いて様々な末端反応基を持つ純粋なペプチドを高収率で合成できるため、ペプチドを療法剤に結合するコンジュゲーション戦略は複数存在する。この官能基化法はタンパク質を併用した組換え法と異なるが、効果（赤血球結合が循環半減期の延長につながる）は同じであると想定される。
本発明の一実施形態は、治療薬の薬物動態パラメーターを改善するツールとして、赤血球に特異的に結合する短いペプチドリガンドを用いて、治療薬に機能を付与することを含む。この半減期の延長法は、治療薬剤設計の重要なパラメーター、すなわち、製造が簡素であること、モジュール性および延長効果を調整できることを考慮に入れている。標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて、新しい機能性または変化した機能性を含むようにタンパク質をアミノ酸レベルで容易に変化させられる。一般に、製造のしやすさ、機能的な治療用タンパク質への正確なフォールディング、および当初の療法剤そのものに対し生物物理学的変化がほとんどないことなどの理由から、機能を得るには、より短いペプチドドメインの使用に依存することは、より大きなポリペプチドドメインを使用することより好ましい。ポリペプチド、たとえば、ＥＲＹ１、ヒト赤血球結合リガンドまたは抗体もしくは抗体フラグメントは、赤血球に特異的に結合し、さらに、たとえば、治療薬の循環半減期で判定されるバイオアベイラビリティーを向上させるべく治療薬にコンジュゲートするように操作してもよい。
本明細書に報告した結果は、インスリン、酢酸プラムリンチド、成長ホルモン、インスリン様成長因子−１、エリスロポエチン、１型インターフェロンα、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂ、インターフェロンβ１ａ、インターフェロンβ１ｂ、インターフェロンγ１ｂ、β−グルコセレブロシダーゼ、アデノシンデアミナーゼ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン１１、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、エクセナチド、Ｌ−アスパラギナーゼ、ラスブリカーゼ、腫瘍壊死因子受容体およびエンフビルチドなどの治療薬の薬物動態パラメーターを改善する分子融合体を作製する機会を与える。
受動的な半減期の改善法を作り出そうとする他の研究者らによる試みは、薬剤の見かけの流体力学的半径を増大させることに焦点を当てている。腎臓の糸球体濾過装置は、血液成分が濾過される体内の主要部位である。濾過の主な決定因子は、血液中の分子の流体力学的半径である；すなわち、より大きな分子より、より小さな分子（＜８０ｋＤａ）の方が血液から濾過される程度が大きい。研究者は、この一般化された規則を用いて、より大きな流体力学的半径を示し、その結果、より長い半減期を示すように、主にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの大きな分子量の水溶性ポリマーへの化学的コンジュゲーションにより薬剤を修飾してきた。この方法が効果を上げることは、臨床現場で提供される多くのＰＥＧ化タンパク質および小分子療法剤で明らかである（Ｐａｓｕｔ ａｎｄ Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，２００９；Ｆｉｓｈｂｕｒｎ，２００８）。特にグラフト体または融合体の流体力学的半径が増大すると、多くの場合、循環半減期を長くするには効果的であるとはいえ、（Ｇａｏ，Ｌｉｕら，２００９年）、これらの方法は、製造および生物学的エフェクター機能の維持に際して課題を提示する。コンジュゲーション反応が不均一になると、主に部位非特定的な化学作用の利用に起因して、様々な生物活性を持つ複雑な産物の混合物を生じさせることがある。詳細な生化学的特徴付けは、多くの場合、均一な治療製品を維持するため精密な精製方法に従って実施される（Ｈｕａｎｇ，Ｇｏｕｇｈら，２００９年；Ｂａｉｌｏｎ，Ｐａｌｌｅｒｏｎｉら，２００１年；Ｄｈａｌｌｕｉｎ，Ｒｏｓｓら，２００５年）。さらに、分岐ＰＥＧなどの大きな部分をタンパク質の反応領域に結合させると、受容体親和性が低下することもある（Ｆｉｓｈｂｕｒｎ，２００８年）。
他の研究者による他の研究は、薬剤の循環を長くするため、アルブミンに結合する治療用タンパク質を可能にした（Ｄｅｎｎｉｓ，２００２；Ｗａｌｋｅｒ，Ｄｕｎｌｅｖｙら，２０１０年）。腎臓濾過に関する前述と同じ一般的な規則を考慮して、Ｄｅｎｎｉｓらは、療法剤を血液中の別のタンパク質（血清アルブミンなど）に結合するように操作することにより療法剤の見かけの大きさを増大させると、薬剤クリアランス速度が低下するとの仮説を立てた。この方法では、薬剤は、血流に投与された場合に限り大きな分子サイズになる。親和性成熟した血清アルブミン結合ペプチドを抗体フラグメントに付加すると、マウスではその循環時間が２４倍長くなった（Ｄｅｎｎｉｓ，２００２）。この方法は効果的であるものの、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）によるアルブミンの再利用の動態、および機能性のためのシステイン拘束性（ｃｙｓｔｅｉｎ−ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）環状ペプチドの使用によって複雑になる。Ｗａｌｋｅｒらは、２００２年にＤｅｎｎｉｓにより得られた結果、すなわち血清アルブミン親和性をタンパク質に付与すると、その半減期が長くなるということを裏付けた。Ｗａｌｋｅｒらが記載した方法は、タンパク質薬剤への大きな抗体フラグメントの組換え体添加を含むものであり、これが、構造上および製造上の複雑さの原因となり得る。ＤｅｎｎｉｓおよびＷａｌｋｅｒの方法は、明確かつ効果的ではあるものの、機能性のため複雑な環状ドメインまたは大きなドメインを使用することから複雑である。Ｄｅｎｎｉｓらにより発見されたペプチドはアルブミンに対して高親和性を示すとはいえ、使用前に環状構造を正確に形成するという物理的制約を必要とする。よりかさ高いアプローチである、より大きな抗体フラグメントを融合するＷａｌｋｅｒの方法は、もともと複雑なフォールディング構造を持つか、または発現収率が低いタンパク質に対応できない場合がある。
一本鎖抗体
本発明の実施形態は、ｓｃＦｖと赤血球に特異的に結合するペプチドとの分子融合体である。ｓｃＦｖは治療薬として使用することができ、赤血球結合ペプチドとの組み合わせを使用してその循環半減期を延長し、体内コンパートメントにアクセスさせてもよい。組換え抗体および組換え抗体フラグメントは、生物製剤産業において療法剤として有望である（Ｓｈｅｒｉｄａｎ，２０１０）。
一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体フラグメントは、全長ＩｇＧの全抗原結合ドメインを含むが、ヒンジおよび定常フラグメント領域がない（Ｍａｙｎａｒｄ ａｎｄ Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，２０００）。ｓｃＦｖの組換え体構築は、可変重鎖（ＶＨ）ドメインと可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを、グリシンおよびセリンのタンデムリピート（たとえば（ＧＧＧＧＳ）４）（配列番号１８）からなる短いポリペプチドリンカーで融合することを含む。ｓｃＦｖの単純性は治療用途に好ましいものであるが、その主な問題は、分子量が２６〜２８ｋＤａと比較的小さいため、短い循環半減期を示すことである（Ｗｅｉｓｓｅｒ ａｎｄ Ｈａｌｌ，２００９）。
ｓｃＦｖの設計に一般に使用されるグリシン−セリンリンカーは元来非機能性であり、どちらかと言えば、正確なＶＨ−ＶＬフォールディングを確保する物理的架橋として存在するため、本明細書では、血液中の赤血球に結合する機能を示すリンカードメインを試験した。このため、操作したｓｃＦｖは、ＶＨ−ＶＬドメインによりそのネイティブ抗原に対する親和性、およびそのリンカードメインにおいて赤血球に対する親和性を示す、多機能性かつ二重特異性であり得る。赤血球への結合において、操作したｓｃＦｖは、これと同じ機能性を有する別のモデルタンパク質について証明されているように、より長い循環半減期を示す。ｓｃＦｖ抗体フラグメントは、本明細書に記載するようなリンカーを有してもよいし、または当業者に周知の他のリンカーを与えてもよい。代替の実施形態は、ｓｃＦｖのリンカー領域に操作した遊離システイン基を供給し、このシステインのチオールを使用して化学的コンジュゲーションにより赤血球結合リガンドに結合する。
ｓｃＦｖ抗体は、実施例７に詳述するように操作した。操作したｓｃＦｖ抗体の設計は、リンカードメインの長さ、並びに赤血球結合ペプチドの間隔の重要性に着目して行った。野生型バリアントを設計し、抗原と（ＧＧＧＧＳ）４リンカー（配列番号１８）との結合を検証してから、２０アミノ酸の最小リンカー長のリンカーを含む変異体を設計した（図６Ａ）。このリンカードメインは、ｓｃＦｖの正確なフォールディングをその正確な三次構造に調節できるため（図６Ｂ）、２つのＥＲＹ１を含む変異体を設計した。ＲＥＰ変異体は、リンカードメインの中央に正確な数のＧｌｙ残基およびＳｅｒ残基に挟まれたＥＲＹ１ペプチドを含み、親の２０アミノ酸リンカー長を維持している。疎水性のＥＲＹ１ペプチドが線状にならずに、より短い集合したドメインにクラスター化し得る場合には、ＲＥＰのリンカー長が短いと考えられ、結果として正確なフォールディングを妨げる恐れがある。こうした理由から、ＥＲＹ１ペプチドが、３２アミノ酸に延長した親リンカードメインの中央に付加されるようにＩＮＳ変異体を設計した。ＥＲＹ１ペプチドは遊離Ｎ末端を含むことが分かったため、制約のある（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ポリペプチド立体構造におけるその存在が赤血球結合に影響するかどうかは、不明であった。この挙動の可能性を検討するため、合成ＥＲＹ１ペプチドとの化学的コンジュゲーションによりｓｃＦｖバリアントを作製した。これにより、ペプチドのＮ末端は遊離状態で、Ｃ末端はｓｃＦｖにコンジュゲートしている（図６Ｃ）。
この方法では、赤血球結合ペプチドの数、したがってｓｃＦｖの赤血球結合能を、コンジュゲーション反応の間、化学量論的に調整することができる。そのため、本明細書に教示した赤血球結合ペプチドを含むようにＳｃＦｖを操作することができる。実施形態は、１〜２０の範囲の多くのリガンドを含むｓｃＦｖを含む；当業者であれば、たとえば、２〜６など、すべての範囲および明記した範囲内の値を意図していることをすぐに理解するであろう。
実施形態は、たとえば、ｓｃＦｖに結合したＯＶＡに対してトレランスを引き起こすことを例示して、トレランスを引き起こすことについて詳細を記載した実施例１７のように、トレランスを誘導する分子融合体を作製するため寛容誘導抗原にコンジュゲートしたｓｃＦｖを含む。実施例１７はまた、抗原の免疫認識エピトープと組換え技術で融合したｓｃＦｖタンパク質コンストラクトを作製するための材料および方法についても詳述する。ｓｃＦｖは、赤血球の認識を対象とする。抗原は、本明細書に記載するような抗原、たとえば、寛容誘導抗原である。本明細書に報告された実施例は、マウスのＴＥＲ１１９ ｓｃＦｖをコンストラクトの抗体ドメインとして使用したマウスモデルを用いた結果について記載する。ＴＥＲ１１９は、マウス赤血球に結合する抗体である。ＴＥＲ１１９抗体ドメインは、他の抗体ドメイン、たとえばヒトまたは他の動物の赤血球に対するドメインで置き換えてもよい。たとえば、１０Ｆ７抗体ドメインを使用して、ヒト赤血球に結合できる抗体−抗原コンストラクトを作製してもよい。ＴＥＲ−１１９由来のｓｃＦｖと、ＯＶＡの免疫優性（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ）ＭＨＣ−Ｉエピトープ、クロモグラニンＡミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）１０４０−ｐ３１、およびプロインスリンを含む実施例１７に報告されるような３種の抗原とのさらなる融合体を作製した。
実施形態は、実施例１０および１３と同様に、腫瘍マーカーに結合し、腫瘍への血液の流れを遮断するｓｃＦｖを含む。たとえば、ｓｃＦｖは、腫瘍マーカーに結合し、さらに赤血球結合ペプチドとの分子融合体の一部分であってもよい。これらのコンジュゲートを使用して、腫瘍への血液の流れを遮断することにより癌を処置してもよい。
腫瘍血管系などの特定の部位への赤血球の結合
操作された療法剤が赤血球に結合する能力は、薬剤の半減期を長くするだけでなく、赤血球に選択的に結合して体内の特定の部位に局在化させるためにも有用である。固形癌（ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒ）の処置では、肝動脈化学塞栓療法（ＴＡＣＥ）を用いて腫瘍への血液供給を限定し、それにより腫瘍の増殖に必要な栄養素との接触を妨げる。ＴＡＣＥの処置は、腫瘍の血液供給の上流へのポリマー固体マイクロ粒子の外科的挿入を含む。マイクロ粒子が腫瘍血管床に到達すると、血管網に物理的に捕捉されることで、腫瘍への血液供給の遮断が引き起こされる（Ｖｏｇｌ，Ｎａｇｕｉｂら，２００９年）。
ＴＡＣＥの主題に従えば、本明細書の実施形態は、赤血球結合ペプチドを含むように腫瘍ホーミング療法剤を操作することにより、血液中に循環する自家赤血球を、腫瘍塞栓術のための天然のマイクロ粒子として使用する。この方法では、療法剤は腫瘍血管床に局在化し、血管に結合する通過赤血球をリクルートし、それにより腫瘍塊への血液の流れを限定し、遮断する。こうした処置は、古典的なＴＡＣＥより侵襲性が低い；本薬剤は、単純に静脈内注射し、塞栓術粒子として血液中に既に存在する天然の赤血球を使用するためである。腫瘍結合または腫瘍ホーミングという用語は、腫瘍血管系または腫瘍細胞の血液コンパートメントから接触できる成分に結合するペプチドをいう。
癌研究の分野では、特異的な腫瘍ホーミング療法剤の発見が知られている。腫瘍の生理活性標的化のパラダイムは、腫瘍環境で特異的に発現するタンパク質マーカーに対する結合に依拠している。これには、ＲＧＤ依存性インテグリン、アミノペプチダーゼＡおよびＮ、エンドシアリン、細胞表面ヌクレオリン、細胞表面アネキシン−１、細胞表面ｐ３２／ｇＣ１ｑ受容体、細胞表面プレクチン−１、フィブロネクチンＥＤＡおよびＥＤＢ、インターロイキン１１受容体α、テネイシン−Ｃ、エンドグリン／ＣＤ１０５、ＢＳＴ−２、ガレクチン−１、ＶＣＡＭ−１、フィブリンならびに組織因子受容体があるが、これに限定されるものではない。（Ｆｏｎｓａｔｔｉ，Ｎｉｃｏｌａｙら，２０１０年；Ｄｉｅｎｓｔ，Ｇｒｕｎｏｗら，２００５年；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｂｈａｔｉａら，２０１０年；Ｔｈｉｊｓｓｅｎ，Ｐｏｓｔｅｌら，２００６年；Ｓｃｈｌｉｅｍａｎｎ，Ｒｏｅｓｌｉ年，２０１０年；Ｂｒａｃｋ，Ｓｉｌａｃｃｉら，２００６年；Ｒｙｂａｋ，Ｒｏｅｓｌｉら，２００７年）。これらの分子のいずれかを標的とした療法剤は、赤血球結合ペプチドを腫瘍血管系に運び、特異的閉塞を引き起こすベクターであってもよい。
一実施形態は、癌性細胞または腫瘍血管系もしくは腫瘍血管系の成分、たとえば、内皮下層（一部が腫瘍の血液にさらされている）のタンパク質または腫瘍内皮細胞の表面のタンパク質に特異的に結合する第２のリガンドとコンジュゲートされた、赤血球に特異的に結合する第１のリガンドである。リガンドは、患者、たとえば、血流に導入される薬学的に許容される組成物の一部分であってもよい。リガンドは赤血球に結合し、腫瘍ホーミングリガンドは、腫瘍もしくは腫瘍血管系部位またはそれに近い部位、あるいは癌性細胞に結合する。赤血球は標的化部位に集まり、たとえば、血管を塞栓することにより、標的部位の栄養素への接触を遮断する。塞栓術が赤血球の物理的大きさにより決定され、力学的であることを考慮すると、塞栓術は急速になされる。
固形癌はその血管供給に大きく依存しており、その血管供給の増加を遮断するため、あるいは、その血管供給の流れを遮断するため、生体分子療法剤および材料療法剤が開発されてきた。一実施形態は、既知または未知の部位の原発腫瘍または転移において、固形癌の血管系を迅速に閉塞するために全身注射される生体分子製剤または生体分子−ナノ粒子製剤である。
腫瘍塞栓術は、粒子および生体分子を用いた方法の使用などいくつかの方法で行われてきた。ポリビニルアルコールから作られるものを含むバイオマテリアル粒子は、直径が腫瘍微小血管、たとえば直径５０〜５００マイクロメートルより大きいもので、経カテーテル動脈塞栓術またはＴＡＣＥで臨床使用するために開発されてきた（Ｍａｌｕｃｃｉｏ，Ｃｏｖｅｙら，２００８年）。同様のアプローチとして、主に肝細胞癌の処置に使用される肝動脈化学塞栓療法（ＴＡＣＥ）において徐放のため粒子内に導入された化学療法薬がある（Ｇａｄａｌｅｔａ ａｎｄ Ｒａｎｉｅｒｉ，２０１０年）。どちらの場合も、通常、透視下でインターベンショナルラジオロジストにより動脈循環に粒子が注射され、これらの粒子は、腫瘍血管系に流れ込み、それを閉塞し、流れを遮断する（Ｍａｌｕｃｃｉｏ，Ｃｏｖｅｙら，２００８年）。これらの局所アプローチを用いる場合、カテーテルの留置により直接標的となる腫瘍のみが処置され、粒子は血管中で容易に標的化できないため、既知または未知の部位の転移などの他の腫瘍は処置されない。最近になって、たとえば、正常な血管系に存在しない血栓症因子および腫瘍血管内皮のマーカーの両方を認識する二重特異性抗体を用いる、生体分子アプローチが検討されている。抗体は、腫瘍血管系に特異的に結合した後、蓄積し、腫瘍血管内で凝血の形成を惹起して血管を遮断する；この作用は、抗体が腫瘍を標的とした場合のみ誘導された（Ｈｕａｎｇ，Ｍｏｌｅｍａら，１９９７年）。これらの生体分子アプローチは、特異的腫瘍血管の特徴（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を同定できる場合に、点滴静注から原発腫瘍および二次腫瘍の両方を標的とする利点がある；ただし、このアプローチは、腫瘍に対して迅速に機械的閉塞を与えないという問題がある。
本発明の実施形態は、患者の腫瘍を塞栓する方法であって、標的化部分に結合する赤血球結合部分を含む組成物を患者に投与することを含み、標的化部分が、腫瘍および腫瘍微小血管からなる群から選択される標的に方向付けられた抗体、抗体フラグメントまたはペプチドであり、かつ赤血球結合部分が、赤血球に特異的に結合するペプチド、抗体、抗体フラグメントまたはアプタマーを含むものである、方法を含む。ペプチドは、たとえば、本明細書に記載されているような配列であってもよい。
抗原特異的免疫学的トレランス
治療薬の薬物動態学的挙動を改善するだけでなく、赤血球親和性が、抗原特異的トレランスを引き起こす方法に使用され得ることが発見されている。ある種の実施形態を、実施例に記載する。
実施例１４は、ヒト挙動を予測するマウス動物モデルでトレランスがどのように引き起こされたかを詳述する。簡単に言えば、マウス赤血球に結合するペプチド、ＥＲＹ１が発見された。ＥＲＹ１と試験用抗原、オボアルブミン（ＯＶＡ）との分子融合体が作製された。この融合体はインビボで赤血球に特異的に結合し、血液または血管系の分子など他の分子には結合しなかった。長い循環半減期が観察された。ＥＲＹ１−ＯＶＡの赤血球結合は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＯＶＡ免疫優性ＭＨＣ Ｉエピトープ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）の効率的なクロスプレゼンテーションおよび対応する反応性Ｔ細胞のクロスプライミングを起こすことが観察された。ＥＲＹ１−ＯＶＡは、ＯＶＡよりも、非常に多くのアネキシン−Ｖ＋の増殖するＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導した（図１２ｄ）ことから、最終的にクローン除去が生じるであろうアポトーシスの運命が示唆された。確立されたＯＴ−Ｉチャレンジ対トレランスモデル（Ｌｉｕ，Ｉｙｏｄａら，２００２年）（図１４ａ）を用いて、ＥＲＹ１−ＯＶＡが、非常に強力な細菌由来のアジュバントを用いても、ワクチン介在性抗原チャレンジに対してその後の免疫応答を妨げることが証明された。ＥＲＹ１−ＯＶＡの静脈内投与の結果、ＬＰＳでの抗原チャレンジ前に非修飾ＯＶＡを投与したマウスと比較して（図１４ｃ）、流入領域リンパ節（図１４；図１４ｂにゲーティング）および脾臓におけるＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞集団が顕著に減少したことから、除去性トレランスが証明された。ＥＲＹ１−ＯＶＡを投与したマウスで示されたこの効果的なクローン除去は、ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞のクロスプライミングの増強という前述の観察結果を支持するものであり（図１２）、さらにクロスプライミングが共刺激分子のＡＰＣ提示の非存在下で起こり、除去性トレランスを起こしたことも示す。ＥＲＹ１−ＯＶＡの静脈内投与により、ＯＶＡ処置マウスと比較して、第１の抗原投与から１９日後、ＯＶＡ特異的血清ＩｇＧのレベルは３９．８倍低くなった（図１５）。抗原特異的免疫トレランスの誘導をさらに検証するため、ＯＴ−Ｉチャレンジ対トレランスモデルをＯＶＡ発現腫瘍移植片モデルと組み合わせたところ（図１４）、好ましい結果が得られた。この実施例に詳述された結果から、ＥＲＹ１−ＯＶＡによる赤血球結合は、抗原特異的免疫トレランスを誘導することが証明される。これは、強力なアジュバントチャレンジ、および異種抗原を発現する移植された細胞移植片に応答して示された。さらに、トレランスは、直接的なＣＤ４＋Ｔ細胞の制御に関係なく、循環赤血球上に存在する抗原との相互作用を介した反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能的不活性化および除去によっても達成された。ＥＲＹ１、マウス赤血球結合ペプチド、を用いたこれらの詳細な実験から、いくつかの本明細書に教示されたヒト赤血球結合ペプチドを用いて、ヒトでも同様の結果が予測される。さらに、ペプチドリガンドが効果的であることが示されたため、他の赤血球結合リガンド、たとえば、抗体、抗体フラグメントまたはアプタマーとのコンジュゲートを用いても同様の結果が得られ得る。
これに対し、従来の報告は、赤血球の表面への抗原の結合により免疫拒絶が引き起こされ、それによりワクチンを製造するとし、また、他の報告は、ワクチンを製造するため、赤血球内に封入された抗原を使用していた。たとえば、赤血球内に抗原を封入すると、それによりワクチンが製造される（Ｍｕｒｒａｙら，Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：６１２９〜６１３９（２００６年））。あるいは、赤血球表面にコンジュゲートした抗原は免疫原性を持ち、ワクチンとして提案された（Ｃｈｉａｒａｎｔｉｎｉ年，Ｖａｃｃｉｎｅ １５（３）：２７６〜２８０（１９９７年））。これらの参考文献は、赤血球送達アプローチが、アジュバントを含む通常のワクチンで得られるのと同様の免疫応答を誘導することを示す。肝臓でのクッパー（Ｋｕｐｆｅｒ）細胞によるクリアランスを高めるように赤血球表面を改変するためのいくつかの手段を教示する、国際公開第２０１１／０５１３４６号パンフレットのように、他の研究者らは、トレランスを誘導するには、赤血球内への配置が必要であると報告している。この同じ出願にはまた、グリコホリンＡなどの赤血球表面タンパク質に結合する抗体も教示されているが、クッパー細胞によるそのクリアランスを高めるために、赤血球上に免疫複合体を作ることを目的としたものである。
本明細書に記載された実施形態は、免疫寛容を引き起こす方法であって、寛容誘導抗原、および患者の赤血球に特異的に結合し、それにより抗原を赤血球に結合する赤血球結合部分を含む分子融合体を含む、組成物を投与することを含み、ここに、該分子融合体は寛容誘導抗原を含む物質への免疫寛容を引き起こすために効果的な量で投与されるものである方法を提供する。赤血球および患者は、赤血球に他の変化を引き起こす処置を受けなくてもよく、また、赤血球架橋、化学的共有結合コンジュゲーション、コーティング、およびペプチドの特異的結合以外の他の変化を受けなくてもよい。分子融合体は、抗原に直接共有結合した赤血球結合部分を含んでもよく、またはそれからなってもよい。分子融合体は、抗原に結合する粒子に結合した赤血球結合部分を含んでもよい。粒子は、マイクロ粒子、ナノ粒子、リポソーム、ポリマーソームまたはミセルを含んでもよい。寛容誘導抗原は、治療用タンパク質の一部分、たとえば、血液因子の産生欠如を患う患者に投与される血液因子を含んでもよい。実施形態は以下の例を含む：患者がヒトであり、寛容誘導抗原が、患者が遺伝的に欠損しているヒトタンパク質である例；患者がヒトであり、寛容誘導抗原が、非ヒトタンパク質の一部分を含む例；患者がヒトであり、寛容誘導抗原が、ヒトに天然には見出されない操作された治療用タンパク質の一部分を含む例；患者がヒトであり、寛容誘導抗原が、非ヒト型グリコシル化を含むタンパク質の一部分を含む例；寛容誘導抗原がヒト自己免疫疾患タンパク質の一部分を含む例；寛容誘導抗原が同種移植における抗原である例；寛容誘導抗原が、ヒトの食品からなる群から選択される物質の一部分を含む例；ならびに／または赤血球結合部分がペプチド、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される例。実施形態は、赤血球結合部分が配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１およびそれらの保存的置換体からなる群から選択される配列の少なくとも５個の連続したアミノ酸残基を含むペプチドを含み、前記配列は赤血球に特異的に結合する、寛容化の材料および方法を含む。
分子融合体は、抗原を赤血球の内側に配置するように選択しても、または外側に配置するように選択してもよい。特定の作用機序に拘束されるものではないが、以下の理論を提示する。ヒトの場合、赤血球の約１％がアポトーシス性（エリプトーシス性（ｅｒｙｐｔｏｔｉｃ））になり、毎日除去され、多くの細胞およびそのタンパク質が、赤血球自己抗原に対するトレランスを維持するように処理される。ＥＲＹ１ペプチドまたはヒト赤血球結合ペプチドの使用により赤血球に結合するように操作された抗原、赤血球結合一本鎖抗体もしくは抗体、赤血球結合アプタマー、または別の赤血球結合剤もまた、同じ寛容誘導応答を惹起させることができる。Ｍｉｌｌｅｒらにより開発された現在の最新の方法（上記を参照）が、再投与のためドナー脾細胞を採取し、反応させる必要があるという点で煩雑であることを踏まえると、我々の非共有結合的赤血球結合法は、より簡素な代替法となる。ＥＲＹ１−赤血球、もしくはヒト赤血球結合ペプチド−赤血球、または他の親和性生体分子（一本鎖抗体、抗体もしくはアプタマーなど）の相互作用は、インビボで抗原コンジュゲートまたは融合体を導入した後、自然に起こるため、操作された抗原は注射により単純に投与され、結合はｉｎ ｓｉｔｕで起こる。
場合によっては、寛容誘導抗原は、トレランスが望まれる治療薬タンパク質から得る。例として、野生型のタンパク質薬剤、たとえば、ヒト第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子（患者にこれらのタンパク質が欠損していたため、中枢性トレランスを確立できなかったもの）；またはヒトに使用される非ヒトタンパク質薬剤が挙げられる。他の例として、製造のため非ヒトでグリコシル化されるタンパク質薬剤、または操作されたタンパク質薬剤、たとえば、望ましくない免疫応答を誘発し得る非ネイティブ配列を有するものが挙げられる。ヒトに天然には見出されない操作された治療用タンパク質である寛容誘導抗原の例には、操作された変異、たとえば、薬理学的特性を向上させるための変異を持つヒトタンパク質がある。非ヒト型グリコシル化を含む寛容誘導抗原の例には、酵母または昆虫細胞で産生されたタンパク質がある。
実施形態は、ある頻度Ｘまたは用量Ｙでタンパク質を投与し、さらに、そのタンパク質由来の抗原をより低い頻度および／または用量、たとえば、０．２Ｘ以下の頻度、または０．２Ｙ以下の用量で投与することを含む；当業者であれば、たとえば、０．０１または００５Ｘまたはその間のある範囲など、すべての範囲および明記した範囲内の値を意図していることをすぐに理解するであろう。
実施形態は、タンパク質が欠損しているヒトに投与されるタンパク質由来の寛容誘導抗原を選択することを含む。欠損とは、タンパク質を投与される患者が自然にそのタンパク質を十分に生成しないことを意味する。さらに、タンパク質は、患者が遺伝的に欠損しているタンパク質であってもよい。こうしたタンパク質には、たとえば、アンチトロンビン−ＩＩＩ、タンパク質Ｃ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、成長ホルモン、ソマトトロピン、インスリン、酢酸プラムリンチド、メカセルミン（ＩＧＦ−１）、β−グルコセレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ−α、ラロニダーゼ（α−Ｌ−イズロニダーゼ）、イデュルスファーゼ（イズロネート−２−スルファターゼ）、ガルスルファーゼ、アガルシダーゼ−β（α−ガラクトシダーゼ）、α−１プロテイナーゼ阻害剤およびアルブミンがある。
実施形態は、非ヒトタンパク質由来の寛容誘導抗原を選択することを含む。こうしたタンパク質の例には、アデノシンデアミナーゼ、膵リパーゼ、膵アミラーゼ、ラクターゼ、Ａ型ボツリヌストキシン、Ｂ型ボツリヌストキシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、パパイン、Ｌ−アスパラギナーゼ、ラスブリカーゼ、レピルジン、ストレプトキナーゼ、アニストレプラーゼ（アニソイル化プラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性化因子複合体）、抗胸腺細胞グロブリン、マムシ科多価免疫Ｆａｂ、ジゴキシン免疫血清Ｆａｂ、Ｌ−アルギナーゼおよびＬ−メチオナーゼがある。
実施形態は、ヒト同種移植抗原由来の寛容誘導抗原を選択することを含む。これらの抗原の例には、様々なＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩハプロタイプタンパク質のサブユニット、ならびにＲｈＣＥ、Ｋｅｌｌ、Ｋｉｄｄ、ＤｕｆｆｙおよびＳｓなどの少ない血液型抗原の単一アミノ酸多型がある。
場合によっては、寛容誘導抗原は、患者が自己免疫応答を示しているか、または自己免疫応答を示す可能性がある自己抗原である。例として、プロインスリン（糖尿病）、コラーゲン（関節リウマチ）、ミエリン塩基性タンパク質（多発性硬化症）がある。ヒト自己免疫タンパク質である多くのタンパク質が存在する；言い換えれば、疾患を引き起こすタンパク質が公知であるかまたは通常の検査で確認できる、様々な自己免疫疾患が存在する。実施形態は、自己免疫タンパク質を同定するため患者を検査すること、および分子融合体に使用される抗原を作製すること、およびタンパク質に対する免疫寛容を引き起こすことを含む。実施形態は、以下のタンパク質の１つ以上に由来の抗原、または以下のタンパク質の１つ以上に由来の抗原を選択することを含む。１型糖尿病では、以下のいくつかの主要な抗原が同定されている：インスリン、プロインスリン、プレプロインスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ−６５（ＧＡＤ−６５）、ＧＡＤ−６７、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ−２）およびインスリノーマ関連タンパク質２β（ＩＡ−２β）；他の抗原として、ＩＣＡ６９、ＩＣＡ１２（ＳＯＸ−１３）、カルボキシペプチダーゼＨ、Ｉｍｏｇｅｎ ３８、ＧＬＩＭＡ ３８、クロモグラニンＡ、ＨＳＰ−６０、カルボキシペプチダーゼＥ、ペリフェリン、グルコーストランスポーター２、肝細胞癌−腸−膵臓／膵臓関連タンパク質（ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ−ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ−ｐａｎｃｒｅａｓ／ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｓ１００β、グリア線維性酸性タンパク質、リジェネレーティングジーンＩＩ（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｇｅｎｅ ＩＩ）、膵臓十二指腸ホームボックス１（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｏｄｅｎａｌ ｈｏｍｅｏｂｏｘ １）、筋強直性ジストロフィーキナーゼ、膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質およびＳＳＴ Ｇタンパク質共役型受容体１〜５がある。橋本甲状腺炎およびグレーブス病などの甲状腺の自己免疫疾患には、主要な抗原として、チログロブリン（ＴＧ）、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）およびサイロトロピン受容体（ＴＳＨＲ）があり；他の抗原として、ナトリウムヨウ素共輸送体（ＮＩＳ）およびメガリンがある。甲状腺関連眼疾患および皮膚症には、ＴＳＨＲなどの甲状腺自己抗原だけでなく、抗原としてインスリン様成長因子１受容体がある。副甲状腺機能低下症には、主要な抗原としてカルシウム感受性受容体がある。アジソン病には、主要な抗原として、２１−ヒドロキシラーゼ、１７α−ヒドロキシラーゼおよびＰ４５０側鎖切断酵素（Ｐ４５０ｓｃｃ）があり；他の抗原として、ＡＣＴＨ受容体、Ｐ４５０ｃ２１およびＰ４５０ｃ１７がある。早期卵巣機能不全には、主要な抗原として、ＦＳＨ受容体およびα−エノラーゼがある。自己免疫性下垂体炎、または下垂体自己免疫疾患には、主要な抗原として、下垂体特異的タンパク質因子（ＰＧＳＦ）１ａおよび２があり；別の抗原には、２型ヨードチロニンデヨージナーゼがある。多発性硬化症には、主要な抗原として、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質およびプロテオリピドタンパク質がある。関節リウマチには、主要な抗原としてコラーゲンＩＩがある。免疫胃炎には、主要な抗原として、Ｈ＋，Ｋ＋−ＡＴＰアーゼがある。悪性貧血（ｐｅｒｎｉｃｉｏｕｓ ａｎｇｅｍｉｓ）には、主要な抗原として内因子がある。セリアック病には、主要な抗原として、組織トランスグルタミナーゼおよびグリアジンがある。白斑には、主要な抗原として、チロシナーゼならびにチロシナーゼ関連タンパク質１および２がある。重症筋無力症には、主要な抗原として、アセチルコリン受容体がある。尋常性天疱瘡およびバリアントには、主要な抗原として、デスモグレイン３、１および４があり；他の抗原として、ペンファキシン（ｐｅｍｐｈａｘｉｎ）、デスモコリン、プラコグロビン、ペルプラキン（ｐｅｒｐｌａｋｉｎ）、デスモプラキンおよびアセチルコリン受容体がある。水疱性類天疱瘡には、主要な抗原としてＢＰ１８０およびＢＰ２３０があり；他の抗原として、プレクチンおよびラミニン５がある。ジューリング疱疹状皮膚炎には、主要な抗原として、筋内膜および組織トランスグルタミナーゼがある。後天性表皮水疱症には、主要な抗原として、コラーゲンＶＩＩがある。全身性硬化症には、主要な抗原として、マトリックスメタロプロテイナーゼ１および３、コラーゲン特異的分子シャペロン熱ショックタンパク質４７、フィブリリン−１ならびにＰＤＧＦ受容体があり；他の抗原として、Ｓｃｌ−７０、Ｕ１ ＲＮＰ、Ｔｈ／Ｔｏ、Ｋｕ、Ｊｏ１、ＮＡＧ−２、セントロメアタンパク質、トポイソメラーゼＩ、核小体タンパク質、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩ、ＰＭ−Ｓｌｃ、フィブリラリンならびにＢ２３がある。混合性結合組織病には、主要な抗原として、Ｕ１ｓｎＲＮＰを含む。シェーグレン症候群には、主要な抗原として、核抗原ＳＳ−ＡおよびＳＳ−Ｂがあり；他の抗原として、フォドリン、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼおよびトポイソメラーゼがある。全身性紅斑性狼瘡には、主要な抗原として、ＳＳ−Ａ、ハイモビリティ・グループ・ボックス１（ＨＭＧＢ１）、ヌクレオソーム、ヒストンタンパク質および二本鎖ＤＮＡなどの核タンパク質がある。グッドパスチャー症候群には、主要な抗原として、コラーゲンＩＶなどの糸球体基底膜タンパク質がある。リウマチ性心疾患には、主要な抗原として心筋ミオシンがある。多腺性自己免疫症候群１型で明らかにされた他の自己抗原には、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ、ヒスチジンデカルボキシラーゼ、システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ、トリプトファンヒドロキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、肝臓Ｐ４５０チトクロームＰ４５０ １Ａ２および２Ａ６、ＳＯＸ−９、ＳＯＸ−１０、カルシウム感知受容体タンパク質ならびに１型インターフェロンのインターフェロンα、βおよびωがある。
場合によっては、寛容誘導抗原は、患者が望ましくない免疫応答を示したことがある外来抗原である。例として、食物抗原がある。実施形態は、外来抗原を同定するため患者を検査すること、および抗原を含む分子融合体を作製すること、および抗原または食品に対する免疫寛容を起こすように患者を処置することを含む。こうした食品および／または抗原の例を提供する。例として、ピーナッツ由来のもの：コンアラキン（Ａｒａ ｈ １）、アレルゲンＩＩ（Ａｒａ ｈ ２）、ピーナッツアグルチニン、コングルチン（Ａｒａ ｈ ６）；リンゴ由来のもの：３１ｋｄａの主要アレルゲン／耐病性タンパク質ホモログ（Ｍａｌ ｄ ２）、脂質転移タンパク質前駆物質（Ｍａｌ ｄ ３）、主要アレルゲンＭａｌ ｄ １．０３Ｄ（Ｍａｌ ｄ １）；乳由来のもの：α−ラクトアルブミン（ＡＬＡ）、ラクトトランスフェリン；キウイ由来のもの：アクチニジン（Ａｃｔ ｃ １、Ａｃｔ ｄ １）、フィトシスタチン、タウマチン様タンパク質（Ａｃｔ ｄ ２）、キウェリン（ｋｉｗｅｌｌｉｎ）（Ａｃｔ ｄ ５）；カラシナ由来のもの：２Ｓアルブミン（Ｓｉｎ ａ １）、１１Ｓグロブリン（Ｓｉｎ ａ ２）、脂質転移タンパク質（Ｓｉｎ ａ ３）、プロフィリン（Ｓｉｎ ａ ４）；セロリ由来のもの：プロフィリン（Ａｐｉ ｇ ４）、高分子量糖タンパク質（Ａｐｉ ｇ ５）；エビ由来のもの：Ｐｅｎ ａ １アレルゲン（Ｐｅｎ ａ １）、アレルゲンＰｅｎ ｍ ２（Ｐｅｎ ｍ ２）、速筋トロポミオシンアイソフォーム；コムギおよび／または他の穀類由来のもの：高分子量グルテニン、低分子量グルテニン、α−およびγ−グリアジン、ホルデイン、セカリン、アベニン；イチゴ由来のもの：主要イチゴアレルギーＦｒａ ａ １−Ｅ（Ｆｒａ ａ １）、バナナ由来のもの：プロフィリン（Ｍｕｓ ｘｐ １）がある。
ヒトおよび動物医薬に使用される多くのタンパク質薬剤は、患者にリスクとなる免疫応答を誘導し、薬剤の有効性を限定的なものにする。これは、操作されたヒトタンパク質、ヒトタンパク質の生成に先天性欠損のある患者に使用したヒトタンパク質、および非ヒトタンパク質で起こる場合がある。最初の投与の前にこれらのタンパク質薬剤の被投与者を寛容化することは都合がよいと考えられ、さらに最初の投与後、および免疫応答を示した後に、これらのタンパク質薬剤の被投与者を寛容化することも、都合がよいと考えられる。自己免疫の患者では、自己免疫を示す自己抗原が知られている。こうした場合には、自己免疫を示す前にリスクのある被検体を寛容化することが有利であると考えられ、さらに初期の自己免疫の生体分子指標を示した時点またはその後に、被検体を寛容化することも有利であると考えられる。たとえば、１型糖尿病の場合、膵臓のβ細胞の広範な破壊の前、およびグルコースホメオスタシスに関係する臨床疾患の発症の前に自己免疫の免疫学的指標が存在する。臨床疾患の発症の前これらの免疫学的指標を検出したら被検体を寛容化することは、有利であると考えられる。
Ｍｉｌｌｅｒらをリーダーとした最近の研究により、抗原をエキソビボで同種脾細胞に共有結合的にコンジュゲートしてマウスに静脈内投与すると、抗原特異的免疫トレランスが引き起こされることが示された（Ｇｏｄｓｅｌ，Ｗａｎｇ年，２００１年；Ｌｕｏ，Ｐｏｔｈｏｖｅｎら，２００８年）。このプロセスは、ドナー脾臓の抗原提示細胞を採取すること、およびアミン−カルボン酸架橋反応スキームでそれらを化学的に反応させることを含む。この技術は、多発性硬化症（Ｇｏｄｓｅｌ，Ｗａｎｇら，２００１年）、初発１型糖尿病（Ｆｉｆｅ，Ｇｕｌｅｒｉａら，２００６年）、および同種膵島移植（Ｌｕｏ，Ｐｏｔｈｏｖｅｎら，２００８年）のマウスモデルに抗原特異的トレランスを誘導するのに効果的であることが立証されている。寛容誘導応答に関与する正確なメカニズムは明らかにされていないが、主要な要件として、アポトーシスの抗原結合細胞に共刺激分子を発現してない抗原提示があることが提唱されている（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｔｕｒｌｅｙら，２００７年）。さらに、国際公開第２０１１／０５１３４６号パンフレットのように赤血球ゴースト内に抗原を封入し、赤血球をエキソビボで処理し、再注射することも検討されてきた。
投与
本明細書に記載した本発明の多くの実施形態は、ヒトまたは他の動物患者に投与してもよい組成物について記載する。本発明の実施形態は、たとえば、赤血球または腫瘍または腫瘍血管系のほか、これらの組み合わせの抗原を認識する分子融合体、融合タンパク質、ペプチドリガンド、抗体、ｓｃＦｖを含む。これらの組成物は、好適な薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤と共に薬学的に許容される組成物として調製してもよい。
赤血球に結合する組成物は、特異的に結合することができる。この特異性は、インビボでの組成物と赤血球との結合のほか、代替のエキソビボでのプロセスを可能にする。したがって、組成物は、患者の血管系に直接注射してもよい。それに代わるものとして、その後の赤血球との接触および取り込みのため、組織、たとえば、筋肉、皮膚または皮下への注射がある。
本明細書に記載するような実施形態を送達するため、薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤を使用してもよい。賦形剤とは、治療薬に希釈剤または媒体として使用される不活性な物質をいう。薬学的に許容されるキャリアは一般に、治療のためにまたは製品として化合物が有用となるように化合物と一緒に使用する。一般に、任意の物質の場合、薬学的に許容されるキャリアは、動物に送達するためにその物質と組み合わせる材料である。通常の薬学的キャリア、水性基剤、粉末基剤または油性基剤、増粘剤および同種のものが必要であるか、または望ましいことがある。場合によっては、キャリアは、たとえば、液体送達のため不溶性化合物を可溶化するため送達に不可欠であり、活性を維持するため物質のｐＨを制御するための緩衝剤；または貯蔵容器内の物質の消失を防ぐための希釈剤がある。一方、他の場合には、キャリアは便宜上、たとえば、より投与に都合がよいような液体である。当業者に公知の方法により、本明細書に記載の化合物の薬学的に許容される塩を合成してもよい。したがって、薬学的に許容される組成物は、混入物を含まないように高度に精製され、生体適合性であり、かつ毒性がなく、患者への投与に適したキャリア、塩または賦形剤をさらに含むものである。水がキャリアの場合は、水を高度に精製し、混入物、たとえば、エンドトキシンを含まないように処理する。
本明細書に記載の化合物は典型的には、目的の投与形態に関連して適切に選択され、かつ従来の医療慣行に沿った好適な薬学的希釈剤、賦形剤、増量剤またはキャリア（本明細書では薬学的に許容されるキャリアまたはキャリアという）との混合物として投与する。したがって送達可能な化合物は、経口投与、直腸投与、局所投与、静脈内注射、関節内注射または非経口（ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ）投与に好適な形態で製造してもよい。キャリアは固体または液体を含み、キャリアの種類は、用いられる投与の種類に基づき選択される。たとえば、丸剤の場合には、キャリアとして好適な結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、着香剤、流動化剤および溶解剤を含めてもよい。たとえば、活性成分は、薬学的に許容される無毒の不活性な経口キャリア、たとえばラクトース、ゼラチン、寒天、デンプン、スクロース、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、マンニトール、ソルビトールおよび同種のものと組み合わせてもよい。化合物は、カプセル剤、錠剤および散剤など固形剤形で経口投与しても、またはエリキシル剤、シロップ剤および懸濁剤など液体剤形で経口投与してもよい。また活性化合物は、無菌の液体剤形で非経口投与してもよい。生理的ｐＨまたはモル浸透圧濃度を達成するため緩衝液を使用してもよい。
実施例１：マウス赤血球を用いた赤血球結合ペプチドのスクリーニング
選択には、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）から市販されているＰｈＤナイーブ１２アミノ酸ペプチドファージライブラリーを使用した。スクリーニングの各ラウンドに、５０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ＰＢＳＡ−５０）を含むＰＢＳ中、１０１１のインプットファージをマウス赤血球とインキュベートした。３７Ｃで１時間後、非結合ファージを、パーコール（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて１５００ｇで１５分間遠心分離により除去した。引き続き、低親和結合ファージを除去するためＰＢＳＡ−５０中で解離ステップを行った。選択プロセスの厳密性を高めるため、後のラウンドのスクリーニングでは解離の持続時間を長くし、温度を上昇させた。ラウンド１では、ファージの結合後に、洗浄および溶出の前に２分の解離ステップを室温で行った。ラウンド２では、ファージの結合後に、１０分の解離を３７℃で行った。ラウンド３および４では、２種の連続した解離ステップを３７℃で行った。すなわち、ラウンド３では１０分に続き１５分、ラウンド４では１０分に続き３０分行った。赤血球結合ファージを０．２Ｍのグリシン、ｐＨ２．２で１０分間溶出し、この溶液を０．１５量の１Ｍのトリス、ｐＨ９．１で中和させた。全赤血球に対して４ラウンドの選択を行い、フローサイトメトリーで示されるように、ライブラリーを高親和性ファージクローンに実質的に濃縮した。感染またはプラーク形成単位を標準的な力価測定法により算出した。ファージサンプルを新鮮なＬＢ培地に段階希釈し、１０μＬのファージ希釈液を２００μＬの対数期初期ＥＲ２７３８大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＮＥＢ）に加えた。室温で３分のインキュベーション後、この溶液を３ｍＬの上層寒天に加え、混合し、ＩＰＴＧおよびＸＧａｌを含むＬＢプレートに注いだ。３７℃で一晩インキュベーション後、青色のコロニーをプラーク形成単位（ｐｆｕ）と見なした。
実施例２：マウス赤血球に対する結合の特徴付け
結果：顕微鏡観察から、ＥＲＹ１ファージが細胞形態を変化させず、かつ細胞質移行をせずに、赤血球細胞表面に結合することが確認された。蛍光および位相差画像により、非選択ライブラリーと比較してＥＲＹ１ファージの赤血球結合能が再確認された。高解像度共焦点イメージングからは、ＥＲＹ１ファージが細胞表面全体に分布し（単一部位でクラスター化するのではなく）、細胞表面の赤道周辺に優先的に結合すること、および結合が赤血球間で均一であることが明らかになった（図１）。
方法：すべてのサンプルについて、ＰＢＳ−５０中で１０１１のインプットファージをマウス赤血球とインキュベートした。３７Ｃで１時間後、２００ｇで３分間の遠心分離により非結合ファージを除去した。標準的な蛍光顕微鏡サンプルの場合は、ＰＢＳＡ−５を用いて１：２０で希釈した抗Ｍ１３コートタンパク質−ＰＥ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））と細胞を室温で１時間インキュベートした。細胞を２００ｇで３分間回転させ、１０μＬのｈａｒｄ−ｓｅｔ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ）に再懸濁し、顕微鏡用スライドに載せ、カバースリップでカバーし、可視化した。共焦点顕微鏡サンプルの場合は、細胞をウサギ抗ｆｄバクテリオファージ（Ｓｉｇｍａ）および抗ウサギＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベートした。

実施例３：マウス赤血球に結合する分子標的の特徴付け
結果：ＥＲＹ１ペプチドの分子標的の探索には、ビオチン化した可溶性ペプチドを用いた親和性プルダウン法を利用した。この方法により、赤血球膜上のＥＲＹ１リガンドとしてグリコホリンＡ（ＧＹＰＡ）が明らかになった。ビオチン官能基を有するＥＲＹ１ペプチドおよび光活性化型クロスリンカーと全赤血球をインキュベートして、ストレプトアビジンウエスタンブロットで検出したところ、単一の２８ｋＤａのタンパク質がペプチド−ビオチン複合体とコンジュゲートした（図２Ａ）。この反応ライセートを十分に洗浄し、赤血球ライセートに非標識タンパク質が確実に残存しないようにストレプトアビジン磁性ビーズを用いて精製した。予想通り、ミスマッチペプチドは、どの赤血球タンパク質ともコンジュゲートしなかった。ミスマッチペプチドＰＬＬＴＶＧＭＤＬＷＰＷ（配列番号２）は、ＥＲＹ１と同じアミノ酸残基を含み、その疎水性分布（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ）と一致するように設計した。この相互作用タンパク質の見かけの大きさの証明から、考えられるリガンドとしていくつかのより小さい１回膜貫通タンパク質、すなわち、グリコホリンが示唆された。架橋反応から精製された同じサンプルの抗ＧＹＰＡウエスタンブロッティングにより、この候補ビオチン化タンパク質が実際にＧＹＰＡであることが確認された（図２Ｂ）。
ＥＲＹ１ファージとＧＹＰＡとの共局在を高解像度の共焦点顕微鏡により解析した。ＧＹＰＡは自然に発現し、いくつかの膜および細胞骨格タンパク質を含む複合体の一部分として存在する（Ｍｏｈａｎｄａｓ ａｎｄ Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，２００８）。これは、ＧＹＰＡの染色で視覚的に明らかになり、そのため細胞の赤道周辺では不均一性の標識が認められる。ＥＲＹ１ファージによる標識も、非常に類似した染色分布が得られた。共局在解析におけるオーバーラップ係数が０．９７と高いことから、ＥＲＹ１ファージおよび抗ＧＹＰＡが同じタンパク質に結合するという結論が裏付けられる。また、ライブラリーファージで標識しても、ファージの結合がなかった赤血球ではＧＹＰＡクラスター形成も認められたため、共局在がないことが明らかであった。
方法：ＴＧＲ樹脂上の標準的な固相ｆ−ｍｏｃ化学を用いて、ＥＲＹ１（Ｈ２Ｎ−ＷＭＶＬＰＷＬＰＧＴＬＤＧＧＳＧＣＲＧ−ＣＯＮＨ２）（配列番号１９）ペプチドおよびミスマッチ（Ｈ２Ｎ−ＰＬＬＴＶＧＭＤＬＷＰＷＧＧＳＧＣＲＧ−ＣＯＮＨ２）（配列番号２０）ペプチドを合成した。ペプチドは、９５％トリフルオロ酢酸、２．５％エタンジチオール、２．５％水中で樹脂から切り離し、氷冷ジエチルエーテルで沈殿させた。精製は、Ｃ１８逆相カラムを用いてＷａｔｅｒｓ分取ＨＰＬＣ−ＭＳで行った。
ＥＲＹ１およびミスマッチペプチドをＭｔｓ−Ａｔｆ−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に、製造者が推奨にようにコンジュゲートした。簡単に言えば、ペプチドをＰＢＳ／ＤＭＦに可溶化し、１．０５当量のＭｔｓ−ａｔｆ−ビオチンと一晩４Ｃで反応させた。反応物を遠心分離により清澄化した後、ＰＢＳＡ−５０中、１時間３７Ｃでビオチン化ペプチドを赤血球とインキュベートし、細胞を新しいＰＢＳで２回洗浄し、３６５ｎｍにて室温で８分間ＵＶ照射した。細胞を音波処理により溶解させ、ライセートを、ストレプトアビジンコート磁性ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて精製した。溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＰＶＤＦ膜に転写し、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）または抗マウスＧＹＰＡでイムノブロットした。
実施例４：他のマウス細胞および他の種由来の赤血球に対する、ＥＲＹ１の結合の、またはＥＲＹ１の結合がないことの、特徴付け
結果：一連の種間細胞株のフローサイトメトリーによるスクリーニングにより、ＥＲＹ１ファージがマウスおよびラット赤血球に対して特異的であり、マウス白血球またはヒト細胞に測定できるほど結合しないことが証明された（図３）。これらのデータから、ＥＲＹ１リガンドとして働く特異的膜タンパク質は、赤血球細胞にのみ認められ、骨髄またはリンパ系細胞系譜には認められないことが示唆された。さらに、このことにより、標的の遠心分離以外に事前の精製をほとんど行わずに新たに単離された血液を使用するスクリーニング方法の妥当性も立証された。
方法：ファージ結合を判定するため、約１０１０のファージ粒子を使用して５×１０５細胞をＰＢＳＡ−５０中、３７Ｃで１時間標識した。２００ｇで４分の遠心分離後、細胞をＰＢＳＡ−５に再懸濁し、１：２０希釈にて室温で１時間抗ファージ−ＰＥを加えた。最終の回転／洗浄サイクル後、細胞をＰＢＳＡ−５に再懸濁し、フローサイトメーターで解析した。
実施例５：モデルタンパク質による血管内薬物動態の特徴付け
結果：我々は、タンパク質の薬物動態に対するＥＲＹ１ペプチドの作用の特徴付けを行うため、モデルタンパク質マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をＥＲＹ１ペプチドとのＮ末端融合体として発現させた（ＥＲＹ１−ＭＢＰ）。血管内投与すると、このＥＲＹ１−ＭＢＰバリアントは、野生型タンパク質と比較して循環の延長を示した（図４）。注射直後に取得した時点での血液サンプルから、どちらの製剤も初濃度、したがってその用量が同一であることが確認された。静脈内注射の４時間後から、ＥＲＹ１−ＭＢＰは、非結合の生型ＭＢＰより統計学的に有意にゆっくりとした速度で循環から除去された。
ＥＲＹ１−ＭＢＰは野生型ＭＢＰと比較して、血清中半減期が３．２８倍（シングルコンパートメントモデルの場合）から６．３９倍（２−コンパートメントモデル）長くなること、さらに、クリアランスが２．１４倍低下することが証明された。標準的な１−コンパートメント薬物動態モデルを用いて濃度解析を行ったところ、野生型バリアントおよびＥＲＹ１バリアントの半減期はそれぞれ０．９２時間および３．０２時間であった。このデータは２−コンパートメントモデル（Ｒ２≧０．９８）にも正確に適合し、野生型バリアントおよびＥＲＹ１バリアントのα半減期およびβ半減期はそれぞれ０．４１時間および１．１１時間、および２．６２時間および３．１７時間であった。したがって、本明細書に教示されたヒト赤血球結合ペプチドおよび他の赤血球結合リガンドによる半減期の延長を予想することができる。
方法：標準的なプラスミド単離キットを用いて、クローン複製形態Ｍ１３ＫＥ ＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドをＡｃｃ６５１およびＥａｇＩで消化してｇＩＩＩ融合遺伝子を得、次いでｐＭＡＬ−ｐＩＩＩの同じ部位にライゲートし、本明細書でｐＭＡＬ−ＥＲＹ１と呼ぶプラスミドを得た。配列確認済みのクローンをＢＬ２１ 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に発現させた。簡単に言えば、対数増殖中期のＢＬ２１培養物を最終濃度０．３ｍＭになるようにＩＰＴＧで３７Ｃにて３時間誘導した。２０ｍＭのトリス、２０％スクロース、２ｍＭのＥＤＴＡで１０分間浸透圧ショック処理し、続いて５ｍＭのＭｇＳＯ４中、４℃で１５分間第２の処理を行い、ペリプラズムに発現したＭＢＰ融合体を細胞片から単離できるようにした。アミロースセファロースで融合タンパク質の精製を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度を解析した。
Ｓｗｉｓｓ Ｖａｕｄ獣医局（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｏｆｆｉｃｅ）は既にすべての動物処置を承認した。ケタミン／キシラジンによる麻酔下で、マウス尾を４２℃の水で温め、１５０μｇのタンパク質を１００μＬ量で直接尾静脈に注射した。マウスを麻酔下で３７℃に確実に維持するように注意した。尾の付け根を小刀で切開して血液を採取し、ＰＢＳＡ−５、１０ｍＭのＥＤＴＡで１０倍希釈し、その後解析まで−２０Ｃで保存した。サンドイッチＥＬＩＳＡにより血液サンプルをＭＢＰ濃度について解析した。簡単に言えば、モノクローナルマウス抗ＭＢＰを捕捉抗体として、ポリクローナルウサギ抗ＭＢＰを一次抗体として、およびヤギ抗ウサギＨＲＰを二次抗体として使用した。下記式１および式２を使用し、標準的な薬物動態コンパートメント解析を用いてＰＲＩＳＭ４でデータを解析した
式１：標準的な１−コンパートメントモデル
Figure 0006017422
 式中、Ａはｔ時における体内の遊離薬剤の量、Ａ０はゼロ時における薬剤の初期量である。
式２：標準的な２−コンパートメントモデル
Figure 0006017422
 式中、Ａはｔ時の中心コンパートメントにおける遊離薬剤の量である。
実施例６：モデルタンパク質による皮下薬物動態の特徴付け
結果：ＥＲＹ１−ＭＢＰバリアントは血管外投与すると、野生型タンパク質と比較して、循環の延長を示した（図５）。注射直後に取得した時点での血液サンプルから、どちらの製剤も初濃度、したがってその用量が同一であることが確認された。皮下注射後も、ＥＲＹ１−ＭＢＰの血中濃度の上昇という同様の傾向が見られ、実験期間を通して維持された。血中濃度の解析から、ＥＲＹ１−ＭＢＰバリアントは野生型ＭＢＰと比較して、バイオアベイラビリティーが１．６７の上昇を示すことが明らかになった。したがって、本明細書に教示されたヒト赤血球結合ペプチドおよび他の赤血球結合リガンドにより半減期が延長される可能性がある。
方法：標準的なプラスミド単離キットを用いてクローン複製形態Ｍ１３ＫＥ ＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドをＡｃｃ６５１およびＥａｇＩで消化してｇＩＩＩ融合遺伝子を得、次いでｐＭＡＬ−ｐＩＩＩの同じ部位にライゲートし、本明細書でｐＭＡＬ−ＥＲＹ１と呼ぶプラスミドを得た。配列確認済みのクローンをＢＬ２１ 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に発現させた。簡単に言えば、対数増殖中期のＢＬ２１培養物を最終濃度０．３ｍＭになるようにＩＰＴＧで３７Ｃにて３時間誘導した。２０ｍＭのトリス、２０％スクロース、２ｍＭのＥＤＴＡで１０分間浸透圧ショック処理し、続いて５ｍＭのＭｇＳＯ４中、４Ｃで１５分間第２の処理を行い、ペリプラズムに発現したＭＢＰ融合体を細胞片から単離できるようにした。アミロースセファロースで融合タンパク質の精製を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度を解析した。
Ｓｗｉｓｓ Ｖａｕｄ獣医局（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｏｆｆｉｃｅ）は既にすべての動物処置を承認した。イソフルランによる麻酔下で、１５０μｇのタンパク質を１００μＬ量で直接マウスの背部皮膚に注射した。マウスを麻酔下で３７Ｃに確実に維持するように注意した。尾の付け根を小刀で切開して血液を採取し、ＰＢＳＡ−５、１０ｍＭのＥＤＴＡで１０倍希釈し、その後解析まで−２０Ｃで保存した。サンドイッチＥＬＩＳＡにより血液サンプルをＭＢＰ濃度について解析した。簡単に言えば、モノクローナルマウス抗ＭＢＰを捕捉抗体として、ポリクローナルウサギ抗ＭＢＰを一次抗体として、およびヤギ抗ウサギＨＲＰを二次抗体として使用した。下記式３を使用し、標準的な薬物動態コンパートメント解析を用いてＰｒｉｓｍ４でデータを解析した。
式３：バイオアベイラビリティー
Figure 0006017422
 式中、ＡＵＣは血漿中濃度と時間のグラフの曲線下面積、ｓ．ｃ．は皮下およびｉ．ｖ．は静脈内である。
実施例７：ｓｃＦｖ抗体のリンカードメインの操作
方法：フィブロネクチンのエキストラドメインＡに対するｓｃＦｖフラグメントをコードする遺伝子を注文し、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）で合成した：
５’ＡＴＧＧＣＡＡＧＣＡＴＧＡＣＣＧＧＴＧＧＣＣＡＡＣＡＡＡＴＧＧＧＴＡＣＧＧＡＡＧＴＧＣＡＡＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＴＣＡＧＣＣＧＧＧＴＧＧＣＡＧＣＴＴＧＣＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧＴＧＣＧＧＣＧＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＧＣＧＴＣＡＴＧＡＡＡＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＴＣＧＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＴＣＧＧＣＡＡＴＣＡＧＣＧＧＴＴＣＣＧＧＴＧＧＴＡＧＣＡＣＣＴＡＴＴＡＣＧＣＴＧＡＣＡＧＣＧＴＧＡＡＡＧＧＣＣＧＴＴＴＴＡＣＧＡＴＴＴＣＧＣＧＴＧＡＴＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＣＴＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＴＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＡＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＡＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＧＡＡＧＡＧＣＡＣＴＣＡＣＣＴＧＴＡＣＴＴＧＴＴＴＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＴＡＣＣＧＴＴＡＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧＡＡＡＴＴＧＴＣＣＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＣＧＧＧＴＧＡＧＣＧＣＧＣＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＴＧＣＣＧＴＧＣＧＡＧＣＣＡＧＴＣＣＧＴＴＡＧＣＡＡＣＧＣＧＴＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＣＡＧＧＣＣＣＣＴＣＧＣＣＴＧＣＴＧＡＴＴＴＡＣＧＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＣＣＧＴＧＣＧＡＣＧＧＧＣＡＴＣＣＣＧＧＡＣＣＧＴＴＴＴＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＧＴＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＧＣＣＴＧＧＡＧＣＣＧＧＡＧＧＡＴＴＴＣＧＣＧＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＡＡＴＧＣＧＴＧＧＣＣＧＴＣＣＧＣＣＧＡＣＣＴＴＣＧＧＴＣＡＧＧＧＴＡＣＣＡＡＧＧＴＣＧＡＧＡＴＴＡＡＧＧＣＴＧＣＧＧＣＣＧＡＡＣＡＧＡＡＡＣＴＧＡＴＣＡＧＣＧＡＡＧＡＡＧＡＴＴＴＧＡＡＴＧＧＴＧＣＣＧＣＧ−３’（配列番号２１）。野生型ｓｃＦｖを含む発現プラスミドを構築する場合には、プライマーＳＫ０１およびＳＫ０２を使用して遺伝子をＰＣＲ増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩ（５’末端）およびＸｈｏＩ（３’末端）制限部位のほか、３’末端に２つの終止コドンを付加した。ｓｃＦｖのリンカー領域にＥＲＹ１ペプチドを含むＲＥＰ変異体ｓｃＦｖを構築する場合には、オーバーラップエクステンションＰＣＲを使用した。プライマーＳＫ０１およびＳＫ０３を用い、ｓｃＦｖの５’半分に続きＥＲＹ１遺伝子フラグメントを含む遺伝子フラグメントをＰＣＲにより作製した。プライマーＳＫ０２およびＳＫ０４を用い、ＥＲＹ１遺伝子フラグメント（前述のフラグメントに相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ））に続きｓｃＦｖの３’半分を含む遺伝子フラグメントをＰＣＲにより作製した。標準的なキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、この遺伝子フラグメントをアガロース電気泳動後に精製し、ＰＣＲを用いて２つのフラグメントを融合した。ＳＫ０１およびＳＫ０２プライマーを用いた最終の増幅ＰＣＲを行い、正しい制限部位および終止コドンを作製した。ＩＮＳ変異体ｓｃＦｖの構築については、プライマーＳＫ０３の代わりにＳＫ０５を使用し、ＳＫ０４の代わりにＳＫ０６を使用したこと以外はＲＥＰ変異体とちょうど同じようにした。最終的に完成したｓｃＦｖ遺伝子産物をそれぞれＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）で消化し、ｐＳｅｃＴａｇＡ哺乳動物発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）の同じ部位にライゲートした。
Figure 0006017422
配列確認済みのクローンを増幅し、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞で発現させるためそのプラスミドＤＮＡを精製した。発現プラスミドは、目的の組換えタンパク質を培地に分泌させるＮ末端シグナル配列を含む。発現から７日後、細胞をペレット状にし、培地を回収し、ＳＵＰＥＲＤＥＸ ７５カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによりｓｃＦｖを精製した。
Ｃ末端システインを含むＥＲＹ１ペプチドを、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ、ＣＡＳ番号６４９８７−８５−５，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をクロスリンカーとして使用して野生型ｓｃＦｖにコンジュゲートした。ＳＭＣＣをジメチルホルムアミドに溶解させ、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、３０倍モル過剰でｓｃＦｖに加えた。４Ｃで２時間後、反応物をＺＥＢＡＳＰＩＮ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で脱塩し、産物を５モル過剰のペプチドでＥＲＹ１ペプチドと反応させた。４Ｃで２時間後、１０ｋＤａのＭＷＣＯ透析チューブを用いて２日間４Ｃで反応物をＰＢＳに対して透析した。コンジュゲートされたｓｃＦｖをＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティングおよびＭＡＬＤＩにより解析した。
実施例８：ヒト赤血球による赤血球結合ペプチドのスクリーニング
結果：ヒト赤血球に結合する７種の新規なペプチドを選択するため、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）表面提示ライブラリーを利用した。白血球への非特異的結合を減らすため、高濃度の血清アルブミン（５０ｍｇ／ｍＬ）を用いて４Ｃで洗浄した全血を用いてスクリーニングプロセスを行った。３つのラウンドで最初に、ペプチドライブラリーを血液とインキュベートしてから、細菌の結合した赤血球を十分な洗浄および密度勾配遠心分離により他の細胞から慎重に分離して濃縮した。その後、選択したペプチドをコードする細菌プラスミドを、緑色蛍光タンパク質バリアントを発現する細菌に形質転換した。これにより、赤血球に結合した緑色細菌をハイスループットＦＡＣＳでソートできるようになり、回収された個々の細菌クローンについて、赤血球への結合をサイトメトリーによりアッセイした。表１に示すように７種の赤血球結合ペプチドを同定した。これらのペプチドは、ＵｎｉＰｒｏｔのＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて既知のタンパク質に対して解析したところ、コンセンサスモチーフを含まず、関連するタンパク質配列の相同性も認められなかった。
方法：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）表面提示は１０億を超える異なる細菌からなり、各々が骨格タンパク質のＮ末端に１５ｍｅｒのランダムペプチド、外膜タンパク質Ｘの円順列バリアントｅＣＰＸを約１０００コピー提示していた（Ｒｉｃｅ ａｎｄ Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，２００８）。選択の第１の３サイクルでは、ヒト赤血球に結合している細菌を共沈降を用いて選択し、続いて１ラウンドのＦＡＣＳで選択した（Ｄａｎｅ，Ｃｈａｎら，２００６年）。ｅＣＰＸ表面提示ライブラリーを含む１０１１細胞の凍結したアリコートを解凍し、３７℃で３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール（Ｃｍ）および０．２％Ｄ−（＋）−グルコースを補充したＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロスで一晩増殖した。細菌を、Ｃｍを補充したＬＢにて１：５０で３時間サブカルチャーし、０．０２％Ｌ−（＋）−アラビノースで１時間誘導した。健常ドナーのヒト血液（Ｂ型）を５％ＨＳＡ、２％ＦＢＳを含むＰＢＳ（ＨＦＳ）で２回洗浄し、コニカルチューブに再懸濁し、１０１１細菌細胞と回転シェーカー（ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｓｈａｋｅｒ）で４℃にて１時間コインキュベートした。細胞浮遊液を５００ｇで５分間遠心し、上清の非結合細菌を除去した。赤血球を５０ｍＬのＨＦＳで３回洗浄し、ＬＢに再懸濁して結合細菌を一晩増殖した。回収した細菌クローンを、Ｃｍを補充したＬＢ寒天プレートに蒔いてカウントした。２および３ラウンドでは、１０８および５×１０７の細菌を加え、上記のように１回洗浄し、７０％パーコール（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）グラジエントを用いて１０００ｇで１０分間赤血球を分離した。フローサイトメトリーのソーティングでは、選択されたｅＣＰＸライブラリー集団のプラスミドを、Ｚｙｐｐｙ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いて細菌細胞から抽出した。その後、ＧＦＰの誘導発現のため、これらのプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１／ｐＬＡＣ２２Ｇｒｎ１に形質転換した。ＧＦＰの発現を１ｍＭのＩＰＴＧで２時間、続いてペプチド表面発現を０．０２％Ｌ−（＋）−アラビノースで１時間、どちらも３７Ｃで誘導した。ＦＡＣＳのサンプル調製は、上記に記載したのと同様の技術を用いて行い、赤血球に結合しているラウンド３の蛍光集団は、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてソートした。
実施例９：ヒト赤血球に対する結合の特徴付け
結果：ヒト赤血球に結合した選択されたペプチドの特徴付けを行うため、個々のペプチドを提示している細菌を、複数の細胞型による結合アッセイに供した。７種のうち６種（ＥＲＹ１９、ＥＲＹ５９、ＥＲＹ６４、ＥＲＹ１２３、ＥＲＹ１４１およびＥＲＹ１６２）のペプチドが、ヒト上皮２９３Ｔ細胞およびヒト内皮ＨＵＶＥＣ（図７Ａ）に対する結合と比較してヒト赤血球に特異的に結合した。加えて、ヒト血液型ＡおよびＢに結合したが、マウス血液に結合しなかったペプチドがあることから（図７Ｂ）、これらのペプチドは、ヒト血液に特異的であるが、共通の血液型抗原に依存しないことが示唆された。ペプチドは、標準的な固相ｆ−ｍｏｃ化学を用いて合成し、ナノ粒子にコンジュゲートし、上述の個々の細胞型に対する結合について解析する。赤血球表面への結合は、顕微鏡観察およびフローサイトメトリーの両方を用いて調べた。
方法：特異性の特徴付けを行うため、ヒト赤血球（Ａ型およびＢ型）、マウス赤血球、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＨＵＶＥＣに対する結合について、配列決定された個々のクローンをサイトメトリーを用いて解析した。結合アッセイでは、１０６哺乳動物細胞を５×１０７細菌と４Ｃで１時間コインキュベートし、続いてＨＦＳ（５％ＨＳＡ、２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で３回の洗浄後、ＡｃｃｕｒｉＡ６で走査した。緑色細菌の結合した細胞の割合をＦＬＯＷＪＯソフトウェアを用いて計算した。
実施例１０：ｓｃＦｖ抗体のリンカードメインの操作
腫瘍血管マーカーフィブロネクチンＥＤＡ（ＥＤＡ）に対して操作したｓｃＦｖを、ヒト赤血球に特異的に結合するペプチドとの融合体として作製することができる。実施例８の複数のペプチドまたは各々のペプチドを、２つのＥＲＹ１を含むように設計した変異体と同様に（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号１８）リンカー領域または同等の領域に挿入する。したがって、ＲＥＰおよびＩＮＳ変異体（図６Ａ）の配列中のＥＲＹ１の代わりにペプチドＥＲＹ１９、ＥＲＹ５０、ＥＲＹ５９、ＥＲＹ６４、ＥＲＹ１２３、ＥＲＹ１４１、ＥＲＹ１６２を加えることになる。ヒトＥＲＹペプチドは、骨格タンパク質ｅＣＰＸのＮ末端につながっていることが分かったため、リンカー領域に挿入されたこれらのコンストラクトは、赤血球結合に影響を与える可能性がある。このことを検討するため、ＥＲＹ１（図６Ｃ）と同様に合成ヒトＥＲＹペプチドとの化学的コンジュゲーションによりｓｃＦｖバリアントを作製する。これにより、単独あるいは組み合わせて最適な数のＥＲＹペプチドをｓｃＦｖに加えて赤血球結合を刺激することができる。
実施例１１：ポリマーナノ粒子およびミセルの薬物動態および体内分布の特徴付け
本発明の研究室は以前に、薬物送達および免疫調節に使用されるポリマーを用いたナノ粒子およびミセルを多く開発したことがある。この技術は、チオールを含む分子のナノ粒子への定量的な部位特異的コンジュゲーションを容易に行うことができるため強力である（ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｌｉｅｓ，Ｏ’Ｎｅｉｌら，２０１０年）。本研究室はまた、単一のミセル上に複数の化学基を提示するミセル製剤、および疎水性薬剤の制御送達を可能にする製剤も開発した（Ｏ’Ｎｅｉｌ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｌｉｅｓら，２００９年；Ｖｅｌｌｕｔｏ，Ｄｅｍｕｒｔａｓら，２００８年）。本研究室はさらに、それらの製剤がリンパ節の抗原提示細胞を標的とするため、研究室のナノ粒子技術を免疫応答のモジュレーターとして使用することも検討してきた（Ｒｅｄｄｙ，Ｒｅｈｏｒら，２００６年；Ｒｅｄｄｙ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｌｉｅｓら，２００７年）。本明細書の材料および方法を組み合わせるミセル技術および粒子技術は、米国特許出願公開第２００８／００３１８９９号明細書、米国特許出願公開第２０１０／００５５１８９号明細書、および米国特許出願公開第２０１０／０００３３３８号明細書に記載されており、これらを本明細書に援用する。
これらのナノ粒子およびミセルのプラットフォームにＥＲＹ１ペプチドまたはヒト赤血球結合ペプチドを付加すると、それらの薬物動態学的挙動が改善され、それにより、循環する薬剤キャリアとしてのそれらの性能が高まる。ナノ粒子またはミセルの任意のバリアントへのＥＲＹ１またはヒト赤血球結合ペプチドのコンジュゲーションは様々な反応スキームにより行うことができ、直交化学を用いて最終産物への検出分子のコンジュゲーションを行ってもよい。ＥＲＹ１またはヒト赤血球結合ペプチド基の存在に起因する赤血球に対するナノ粒子またはミセルの結合の検証は、フローサイトメトリーおよび顕微鏡観察により確認することができ、マウスに投与後の様々な時点で検出分子を定量して、インビボでの特徴付けによる詳細な検証を行ってもよい。
実施例１２：腫瘍血管系を閉塞するためのポリマーナノ粒子およびミセルの操作
赤血球および腫瘍血管マーカーの両方に対する二重特異性を持つように設計された操作されたポリマーナノ粒子およびミセルを調製して、腫瘍血管床に赤血球の凝集現象を引き起こし、その血液供給を特異的に閉塞することができる。リンカー領域にシステインを含むフィブロネクチンＥＤＡの修飾ｓｃＦｖ、ＧＰＲＰペプチドモチーフを含むフィブリノーゲン結合ペプチドの修飾ｓｃＦｖ、および切断型組織因子融合タンパク質の修飾ｓｃＦｖ（各々粒子に結合できるように操作されたシステインまたはビオチンを含む）など、いくつかの腫瘍標的化マーカーを評価して利用してもよい。これらの腫瘍標的化リガンドは、赤血球結合ペプチドまたはグリコホリンＡ ｓｃＦｖと組み合わせてナノ粒子およびミセルに二重標的化を達成するのに最適な比率でつなげてもよい。ジスルフィド結合またはアビジン−ビオチン相互作用により、複数のリガンドを粒子に結合することができる。検証のため、標準的なマウス固形癌モデルを利用することにより、マウスの背部皮膚にマウス腫瘍細胞を注射し、所定の期間増殖させ、この時点でマウスにナノ粒子またはミセルを投与してもよい。投与量および処置レジメンは、療法剤の薬物動態の特徴付け後に決定してもよい。さらに検証するには、処置後の様々な時点で処置群間の腫瘍容積を比較して、腫瘍塊のさらなる増殖を阻止する療法剤の能力を評価してもよい。赤血球による腫瘍血管系の遮断の詳細な確認は、腫瘍を有する生きたマウスを用いた灌流実験により評価してもよい。赤血球に対する療法剤の親和性と腫瘍血管閉塞との間で正の相関関係が観察されよう。
実施例１３：腫瘍血管系の閉塞のためのｓｃＦｖ抗体の操作
腫瘍血管マーカーＥＤＡおよび赤血球に対して特異的である操作されたｓｃＦｖは、腫瘍血管床に赤血球の凝集現象を引き起こし、その血液供給を特異的に閉塞することができる。ＥＤＡに対して修飾されたｓｃＦｖは、融合体としてリンカー領域に、またはｓｃＦｖとのコンジュゲートとして、ヒトＥＲＹ結合ペプチドを含む。標準的なマウス固形癌モデルを利用することにより、マウスの背部皮膚にマウス腫瘍細胞を注射し、所定の期間増殖させ、この時点でマウスにナノ粒子またはミセルを投与してもよい。投与量および処置レジメンは、療法剤の薬物動態の特徴付け後に決定する。処置後の様々な時点で、処置群間の腫瘍容積を比較して、腫瘍塊のさらなる増殖を阻止する療法剤の能力を評価してもよい。赤血球による腫瘍血管系の遮断の確認は、腫瘍を有する生きたマウスを用いた灌流実験により評価してもよい。赤血球に対する療法剤の親和性は、腫瘍血管閉塞に相関する。
実施例１４：ＥＲＹ１ペプチド−コンジュゲート抗原またはヒト赤血球結合ペプチド−コンジュゲート抗原との非共有結合的赤血球結合による抗原特異的免疫学的トレランスの誘導
我々は、赤血球に対する抗原の強力で特異的な生物物理学的結合を得るため、我々がファージディスプレイによりマウスグリコホリンＡに特異的に結合することを発見した合成１２アミノ酸ペプチド（ＥＲＹ１）を使用した（Ｋｏｎｔｏｓ ａｎｄ Ｈｕｂｂｅｌｌ，２０１０）。この研究では、モデル抗原ＯＶＡを、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団がＭＨＣ Ｉ免疫優性ＯＶＡペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号３）に特異的なＴ細胞受容体を発現するトランスジェニックマウス株（ＯＴ−Ｉ）と共に使用した。ＥＲＹ１ペプチドをＯＶＡに化学的にコンジュゲートして、高い親和性および特異性でマウス赤血球に結合するＯＶＡバリアント（ＥＲＹ１−ＯＶＡ）を作製した（図８ａ）。高解像度供焦点顕微鏡観察から、ＥＲＹ１結合に関して従来の観察結果が確認された（Ｋｏｎｔｏｓ ａｎｄ Ｈｕｂｂｅｌｌ，２０１０）、すなわち細胞膜赤道周辺に局在するが、ＥＲＹ１−コンジュゲートタンパク質の細胞内トランスロケーションがないことが確認された。ＥＲＹ１と同一のアミノ酸を含むが、一次配列の順序を入れ換えたミスマッチペプチド（ＭＩＳ−ＯＶＡ）とコンジュゲートしたＯＶＡバリアントは、無視できる程度の結合を示したため（図８ｂ）、ＥＲＹ１によるグリコホリンＡへの結合は配列特異的であった。ＯＶＡペプチドをコンジュゲートするのに使用した架橋分子のみとコンジュゲートしたＯＶＡは、赤血球に対して測定可能な親和性を何ら示さなかったことから、ＥＲＹ１−ＯＶＡ結合は、赤血球表面でのＥＲＹ１ペプチドとグリコホリンＡとの非共有結合性相互作用によるものであることが示唆された。さらに、ＥＲＹ１−ＯＶＡは、高親和性で赤血球に結合し、平衡状態における結合の測定により判定すると、６．２±１．３ｎＭという抗体と同様の解離定数（Ｋｄ）を示した（図８ｃ）。
マウスへの静脈内投与後、循環赤血球に対するＥＲＹ１−ＯＶＡの結合をインビボで検証した。１５０μｇのＯＶＡまたはＥＲＹ１−ＯＶＡの注射から３０分後に採取した全血サンプルから、血液の複雑で不均一な環境および血管系の中でもＥＲＹ１−ＯＶＡの特異的な赤血球結合能が確認された（図９ａ）。ＥＲＹ１−ＯＶＡは、グリコホリンＡとの結合を裏付けるように、赤血球（ＣＤ４５−）に結合するが、白血球（ＣＤ４５＋）には結合しなかった。ＥＲＹ１−ＯＶＡの結合は、赤血球のアポトーシス状態に関して偏ることなく、アネキシン−Ｖ＋およびアネキシン−Ｖ−のＣＤ４５−集団の両方に強く結合した（図９ｂ）。ＯＶＡコンジュゲートの薬物動態研究から、ＥＲＹ１−ＯＶＡの赤血球結合がインビボで長く続くものであり、細胞表面半減期が１７．２時間を示すことが証明された（図９ｃ）。ＥＲＹ１−ＯＶＡは投与後、７２時間という長時間にわたり赤血球に結合した状態が続いた。マウスでは、この期間に約１３％の赤血球が除去される（Ｋｈａｎｄｅｌｗａｌ ａｎｄ Ｓａｘｅｎａ，２００６）。インビボで赤血球に結合したＥＲＹ１−ＯＶＡの定量により、１０６赤血球当たり０．１７４±０．００５ｎｇのＯＶＡという比較的高い負荷が示された。
ＯＶＡの負荷により赤血球機能に対して起こり得る任意の生理的作用を排除するため、ＥＲＹ１−ＯＶＡまたはＯＶＡの静脈内投与後の様々な時点で血液学的パラメーターの特徴付けを行った。ＥＲＹ１−ＯＶＡによる赤血球結合はＯＶＡの投与と比較して、ヘマトクリット、血球容積または赤血球ヘモグロビン量に検出可能な相違を惹起しなかった（図１０）。これらの結果により、抗原とのグリコホリンＡを介した赤血球結合は、その血液学的パラメーターを変化させなかったことが証明される。
投与時の赤血球結合抗原の細胞標的を明らかにするため、ＥＲＹ１（ＥＲＹ１−アロフィコシアニン）またはＭＩＳペプチド（ＭＩＳ−アロフィコシアニン）とコンジュゲートした強い蛍光を発するアロフィコシアニンタンパク質をマウスに静脈内注射した。投与から１２時間後および３６時間後の脾臓のＤＣ集団のフローサイトメトリー解析により、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−ＣＤ１１ｃ＋ＤＣによるＥＲＹ１−アロフィコシアニンの取り込みがＭＩＳ−アロフィコシアニンと比較して９．４倍増強する一方、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋ＤＣによるＥＲＹ１−アロフィコシアニンおよびＭＩＳ−アロフィコシアニンの取り込みは同等であることが示された（図１１ａ）。加えて、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ８α＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ２０５＋脾臓ＤＣは、ＭＩＳ−アロフィコシアニンより３．０倍程度多くＥＲＹ１−アロフィコシアニンを取り込むものの、絶対量は、脾臓の他のＤＣ集団の場合より著しく低いことが明らかになった。非活性およびＣＤ８α＋ＣＤ２０５＋脾臓のＤＣに対する抗原のこうした標的化は、これらの集団が、アポトーシス細胞による免疫寛容誘導に関係していることが広く知られているため、赤血球結合の寛容誘導の可能性を高め得る（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｃｈｏｉら，２０１１年；Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｄｕｄｚｉａｋら，２００８年）。肝臓では、ＥＲＹ１−アロフィコシアニンはＭＩＳ−アロフィコシアニンと比較して、肝実質細胞（ＣＤ４５−ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１ｄ−；７８．４倍）および肝星細胞（ＣＤ４５−ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１ｄ＋；６０．６倍）による取り込みも大きく増強した（図１１ｂ）。どちらの集団も、ＣＤ８＋Ｔ細胞除去性トレランスを誘発する抗原提示細胞として報告されている（Ｈｏｌｚ，Ｗａｒｒｅｎら，２０１０年；Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｍｕｃｉｄａら，２０１１年；Ｔｈｏｍｓｏｎ ａｎｄ Ｋｎｏｌｌｅ，２０１０）。興味深いことに、こうした取り込みは、赤血球および補体被覆粒子のクリアランスを助ける細網内皮系のメンバーとして働く肝臓ＤＣ（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｃ＋）またはクッパー細胞（ＣＤ４５＋ＭＨＣＩＩ＋Ｆ４／８０＋）では見られない。寛容誘導性の脾臓ＤＣおよび肝臓細胞集団による赤血球結合抗原の取り込みの増大からは、非リンパ球肝細胞と標準的な脾臓細胞とのクロストークにより生じる抗原特異的Ｔ細胞欠損の相互に関係する複雑なメカニズムの可能性が示唆される。
ＥＲＹ１−ＯＶＡの赤血球結合は、ＡＰＣによるＯＶＡ免疫優性ＭＨＣ Ｉエピトープ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）（配列番号３）の効率的なクロスプレゼンテーションおよび対応する反応性Ｔ細胞のクロスプライミングを起こすことが観察された。ＣＦＳＥ標識ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ４５．２＋）をＣＤ４５．１＋マウスに養子移入した。１０μｇのＯＶＡ、１０μｇのＥＲＹ１−ＯＶＡ、または１０μｇの無関係な赤血球結合抗原、ＥＲＹ１−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＥＲＹ１−ＧＳＴ）の静脈内投与後５日にわたり、ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖について測定を行った。フローサイトメトリーで測定したｆｌｕｏｒ ＣＦＳＥの希釈により判定すると、ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖（図１２ａ）は、ＯＶＡと比較してＥＲＹ１−ＯＶＡを投与されたマウスで著しく増強された（図１２ｂ）ことから、赤血球結合により、可溶性抗原と比較して抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のクロスプライミングが増強された。同様の結果は、１０倍低い１μｇという抗原用量の投与によっても得られたことから、赤血球結合抗原により誘導されるＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の有効性の作用範囲が広いことが証明された。クロスプレゼンテーションおよびクロスプライミングの結果は、アポトーシス細胞由来抗原を貪食するＡＰＣによるＭＨＣ Ｉの寛容誘導抗原提示に関する他の研究と一致する（Ａｌｂｅｒｔ，Ｐｅａｒｃｅら，１９９８年；Ｇｒｅｅｎ，Ｆｅｒｇｕｓｏｎら，２００９年）。
機能的なエフェクター表現型になるＴ細胞と増幅および除去されるＴ細胞とを区別するため、増殖するＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞はアポトーシス、したがって除去の特徴としてアネキシン−Ｖについて、解析された（図１２ｃ）。ＥＲＹ１−ＯＶＡによりＯＶＡと比較して、非常に多くのアネキシン−Ｖ＋の増殖するＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞が誘導された（図１２ｄ）ことから、アポトーシスが不可避であり、最終的にクローン除去が生じるであろうことが示唆された。ＥＲＹ１−ＯＶＡ投与により誘導された同じ増殖するＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞は、１μｇおよび１０μｇの用量の両方で抗原と接触した表現型を示し、ＣＤ４４のアップレギュレーションおよびＣＤ６２Ｌのダウンレギュレーションを示した（図１３）。増殖するＣＤ８＋Ｔ細胞のこの表現型は、ＡＰＣにより制御された抗原特異的Ｔ細胞受容体の結合が炎症応答を誘導できないと報告された他のＯＴ−Ｉ養子移入モデルと一致する（Ｂｕｒｓｃｈ，Ｒｉｃｈら，２００９年）。
確立されたＯＴ−Ｉチャレンジ対トレランスモデル（Ｌｉｕ，Ｉｙｏｄａら，２００２年）（図１４ａ）を用いて、ＥＲＹ１−ＯＶＡが、非常に強力な細菌由来のアジュバントを用いたワクチン介在性抗原チャレンジに対してその後の免疫応答を妨げることが証明された。我々は、寛容化するため、ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋（ＣＤ４５．２＋）Ｔ細胞の養子移入から１日後および６日後、１０μｇのＯＶＡあるいはＥＲＹ１−ＯＶＡをＣＤ４５．１＋マウスに静脈内投与した。さらに９日後、移入したＴ細胞が除去され得るように、我々は次いで、皮内注射によりリポ多糖（ＬＰＳ）をアジュバント添加したＯＶＡを被投与マウスにチャレンジした。チャレンジから４日後、流入領域リンパ節および脾臓細胞のほか、その炎症応答の特徴付けにより、除去が実際に生じたかどうかを判定することができた。
ＥＲＹ１−ＯＶＡの静脈内投与の結果、流入領域リンパ節（図１４；図１４ｂにゲーティング）および脾臓のＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞集団が、ＬＰＳによる抗原チャレンジの前に非修飾ＯＶＡを投与したマウス（図１４ｃ）と比較して顕著に減少したことから、除去性トレランスが証明された。ＥＲＹ１−ＯＶＡで処置したマウス由来の流入領域リンパ節に含まれたＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＯＶＡで処置したマウスと比較して１１倍を超えて減少し、抗原の静脈内注射をしなかったチャレンジ対照マウスより３９倍減少した。脾臓細胞の応答も同様であった。ＥＲＹ１−ＯＶＡを投与されたマウスに示されたこの効果的なクローン除去は、ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞のクロスプライミングの増強という前述の観察結果（図１２）を支持するものであり、さらにクロスプライミングが、共刺激分子のＡＰＣ提示の非存在下で起こり、除去性トレランスを起こしたことを示す。
抗原チャレンジ後の免疫応答をさらに評価するため、ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞によるインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の発現から、常在性のリンパ節および脾臓細胞の炎症特性の特徴付けを行った（図１４ｄ）。ＯＶＡおよびＬＰＳによるチャレンジ後、ＥＲＹ１−ＯＶＡで予め処置したマウスのリンパ節のＩＦＮγ発現細胞は、チャレンジ対照マウス（抗原を予め投与していない）と比較して５３倍少なく、同用量のＯＶＡで予め処置したマウスと比較して１９倍を超えて減少した（図１４ｅ）ことから、チャレンジに対する寛容誘導による保護における赤血球結合の重要性が証明された。脾臓細胞の応答も同様であった。さらに、ＥＲＹ１−ＯＶＡで予め処置したマウスのリンパ節および脾臓に存在する少ないＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の中で、ＩＦＮγを発現する割合が低いことから、クローンの不活化が示唆された。さらに、ＥＲＹ１−ＯＶＡで予め処置したマウスでは、ＳＩＩＮＦＥＫＬの再刺激時に流入領域リンパ節から単離された細胞で産生される総ＩＦＮγレベルの大きさも、実質的に低下し（図１４ｆ）、赤血球結合はＩＦＮγレベルをＯＶＡの投与と比較して１６倍低下させ、チャレンジ対照と比較して１１５倍を超えて低下させた。特記される点として、この抑制性の現象は、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）発現のダウンレギュレーションとも相関関係にあり、ＥＲＹ１−ＯＶＡで予め処置したマウス由来のリンパ節細胞に発現したＩＬ−１０は、ＯＶＡで予め処置したマウスおよびチャレンジ対照マウスと比較してそれぞれ３８％および５０％減少した（図１４ｇ）。Ｔｈ１応答を抑制するＡＰＣとＴ細胞とのコミュニケーションの文脈では、制御性ＣＤ４＋Ｔ細胞に発現されるサイトカインを考慮するのが一般的であり（Ｄａｒｒａｈ，Ｈｅｇｄｅら，２０１０年；Ｌｅｅ ａｎｄ Ｋｉｍ，２００７年）、ＩＬ−１０の発現は、チャレンジに対する減感作には不要であった。ＩＬ−１０のダウンレギュレーションは同様に、ＣＤ８＋Ｔ細胞による免疫寛容誘導にも関係していると考えられてきた（Ｆｉｆｅ，Ｇｕｌｅｒｉａら，２００６年；Ａｒｎａｂｏｌｄｉ，Ｒｏｔｈ−Ｗａｌｔｅｒら．，２００９年；Ｓａｉｎｔ−Ｌｕ，Ｔｏｕｒｄｏｔら，２００９年）。さらに、ＥＲＹ１−ＯＶＡで処置したマウス血清中の抗原特異的なＩｇＧ力価が、可溶性ＯＶＡで処置したマウスと比較して１００倍低下したため、赤血球結合は、抗原に対する液性免疫応答も実質的に減弱した（図１４ｈ）。赤血球結合に起因するＯＶＡ特異的なＩｇＧ力価の同様の低下は、非養子移入のＣ５７ＢＬ／６（ＣＤ４５．２＋）マウスでも見られた。１μｇのＯＶＡまたはＥＲＹ１−ＯＶＡを７日間の間隔を置いて２回静脈内投与した後、ＥＲＹ１−ＯＶＡで処置したマウスは、血清中のＯＶＡ特異的なＩｇＧレベルが、第１の抗原投与から１９日後３９．８倍の低下を示した（図１５）。抗原による赤血球の連結後のＢ細胞活性化におけるこの明らかな低下は、トレランスの誘導における非炎症性の抗原提示に関する現在の仮説を裏付けるものである（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｔｕｒｌｅｙら，２００７年；Ｇｒｅｅｎ，Ｆｅｒｇｕｓｏｎら，２００９年；Ｍｕｅｌｌｅｒ，２０１０年）。
抗原特異的免疫トレランスの誘導をさらに検証するため、ＯＴ−Ｉチャレンジ対トレランスモデルをＯＶＡ発現腫瘍移植片モデルと組み合わせた（図１４ｉ）。以前の実験デザインと同様に、ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞の養子移入後に１０μｇのＥＲＹ１−ＯＶＡまたは１０μｇのＯＶＡを２回静脈内投与して、マウスを寛容化した。第１の抗原投与から５日後、ＥＲＹ１−ＯＶＡを注射したマウスの血液の増殖していない（０世代）ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞は２．９倍減少したため、顕著なＴ細胞除去が検出された（図１４ｊ）。外部から投与される強力なアジュバントの非存在下で増殖するＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能応答性を判定するため、養子移入から９日後、ＯＶＡ発現ＥＬ−４胸腺腫細胞（Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ）をマウスの背部皮膚に皮内注射した。赤血球結合抗原の寛容誘導の有効性を評価するため、用量およびスケジュールをチャレンジ対トレランスモデルと同様にして、腫瘍移植から６日後、腫瘍を持つマウスにＬＰＳをアジュバント添加したＯＶＡをチャレンジした。ＥＲＹ１−ＯＶＡで処置したマウスではＯＶＡで処置したマウスまたは未処置対照マウスと比較して、十分な腫瘍増殖が腫瘍移植から８日後まで持続的に観察された（図１４ｋ）ことから、ＥＲＹ１−ＯＶＡによるＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖が、ＯＶＡに対する機能的な免疫非応答性を誘導することが確認された。腫瘍の大きさが移植から８日後に定常状態になったことは、ＥＲＹ１−ＯＶＡによる除去性トレランスをまだ受けていないＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞が残存していたことを示唆し得る。
動物
スイス獣医当局は既にすべての動物処置を承認した。インビボ結合研究には８〜１２週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）をＥ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍の宿主として使用した。Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１１００Ｍｊｂ（ＯＴ−Ｉ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）をＥＰＦＬ動物施設で飼育し、脾細胞単離には６〜１２週齢の雌を使用した。ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞の養子移入およびトレランス誘導研究には、８〜１２週齢の雌Ｂ６．ＳＪＬ−ＰｔｐｒｃａＰｅｐｃｂ／Ｂｏｙ（ＣＤ４５．１）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を対象宿主として使用した。
ペプチドの設計および合成
ＥＲＹ１
Figure 0006017422
 ペプチドおよびミスマッチ（Ｈ２Ｎ−ＰＬＬＴＶＧＭＤＬＷＰＷＧＧＳＧＣＲＧ−ＣＯＮＨ２）（配列番号２０）ペプチドは、ＴＧＲ樹脂（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ）を用いて自動リキッドハンドラー（ＣＨＥＭＳＰＥＥＤ）で標準的な固相ｆ−ｍｏｃ化学により合成した。下線で示した配列は、我々が以前ファージディスプレイによりマウスグリコホリンＡバインダーとして発見したＥＲＹ１の１２−ｍｅｒ配列である（Ｋｏｎｔｏｓ ａｎｄ Ｈｕｂｂｅｌｌ，２０１０）。ＧＧＳＧ領域は、コンジュゲーションに使用されるシステイン残基とのリンカーとして機能した。隣接するアルギニン残基はｐＫａを低下させ、したがってシステイン残基の反応性を高める役割を果たした（Ｌｕｔｏｌｆ，Ｔｉｒｅｌｌｉら，２００１年）。ペプチドは、９５％トリフルオロ酢酸、２．５％エタンジチオール、２．５％水を用いて樹脂から３時間かけて切断し、氷冷ジエチルエーテルで沈殿させた。精製は、Ｃ１８逆相カラム（ＰｅｒＳｐｅｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分取ＨＰＬＣ−ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ）で行った。
ＥＲＹ１−抗原のコンジュゲーション
ジメチルホルムアミドに溶解させた１０モル当量のスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ、ＣＡＳ番号６４９８７−８５−５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を５ｍｇ／ｍＬのエンドトキシンフリー（＜１ＥＵ／ｍｇ）ＯＶＡ（Ｈｙｇｌｏｓ ＧｍｂＨ）とＰＢＳ中、１時間室温で反応させた。２ｍＬのＺｅｂａ脱塩スピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で脱塩後、３Ｍのグアニジン−ＨＣｌに溶解させた１０当量のＥＲＹ１またはＭＩＳペプチドを加え、２時間室温で反応させた。このコンジュゲートを２ｍＬのＺｅｂ脱塩スピンカラムを用いて脱塩し、０．２μｍのフィルターで濾過滅菌し、作業アリコート（ｗｏｒｋｉｎｇ ａｌｉｑｕｏｔ）に分け、−２０Ｃで保存した。タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により決定した。このスキームにより、ペプチドのシステイン側鎖と抗原のリジン側鎖とのコンジュゲーションが得られる。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をＢＬ２１エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に発現させ、標準的なグルタチオンアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。十分なトリトン−Ｘ１１４（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）洗浄によりオンカラムエンドトキシン除去を行い、エンドトキシンの除去は、ＴＨＰ−１Ｘ Ｂｌｕｅ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）で確認した。同じ反応手順を使用してＥＲＹ１をＧＳＴにコンジュゲートした。マレイミド活性化アロフィコシアニン（Ｉｎｎｏｖａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＰＢＳに溶解させ、上記のようにＥＲＹ１またはＭＩＳとコンジュゲートした。
赤血球への結合の顕微鏡観察
単離されたばかりのマウス赤血球５×１０５を、１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＰＢＳ中の１００ｎＭのＥＲＹ１−ＯＶＡまたはＯＶＡに３７Ｃで１時間さらした。遠心分離および洗浄の後、１：２００希釈ヤギ抗マウスグリコホリンＡ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）およびウサギ抗ＯＶＡ（ＡｂＤ ＳＥＲＯＴＥＣ）で細胞を氷上にて２０分間標識した。遠心分離および洗浄の後、１：２００ ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ４８８抗ヤギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞を氷上にて２０分間標識した。最終の回転／洗浄サイクル後、細胞を固化固定し、６３×油浸対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ７００共焦点倒立顕微鏡で画像を取得した。画像解析は、ＩＭＡＧＥＪ（ＮＩＨ）で行い、どちらの画像も同一の処理を行った。
インビボでの結合および体内分布
１５０μｇのＥＲＹ１−ＯＶＡまたはＯＶＡを含む０．９％食塩水（Ｂ．Ｂｒａｕｎ）を１００μＬの量で８〜１２週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾に、イソフルランによる麻酔下で静脈内注射した。実験中は、加温パッドを用いてマウスを３７Ｃに確実に維持するように注意した。所定の時点で、尾に小さな切れ目を入れて５μＬの血液を採取し、１０ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳに１００倍希釈し、１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＰＢＳで３回洗浄し、フローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡによりＯＶＡ含有量について解析した。ＯＶＡは、サンドイッチＥＬＩＳＡにより定量し、捕獲用にマウスモノクローナル抗ＯＶＡ抗体（Ｓｉｇｍａ）、検出用にポリクローナルウサギ抗ＯＶＡ抗体（ＡｂＤ ＳＥＲＯＴＥＣ）、最終検出用にヤギ抗ウサギ−ＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（ＢｉｏＲａｄ）を、続いてＴＭＢ基質（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。ＡＤＶＩＶＡ ２１２０ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｅｍｅｎｓ）で血液学的特徴付けを行った。赤血球結合ＥＲＹ１−ＧＳＴは、標識細胞をヤギ抗ＧＳＴ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）とインキュベートし、続いてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ロバ抗ヤギ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベーションすることにより検出し、フローサイトメトリーにより解析した。体内分布の研究では、上記のような８〜１２週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に２０μｇのＥＲＹ１−ＡＰＣまたはＭＩＳ−ＡＰＣを静脈内注射した。マウスを所定の時点で屠殺し、脾臓、血液および肝臓を除去した。各器官をコラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ）で消化し、ホモジナイズしてフローサイトメトリー染色のための単一細胞浮遊液を得た。
Ｔ細胞の養子移入
ＣＤ８磁性ビーズネガティブ選択キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を製造者の指示通り用いて、ＯＴ−Ｉ（ＣＤ４５．２＋）マウス脾臓由来のＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。単離されたばかりのＣＤ８＋ＯＴ−Ｉ細胞をＰＢＳに再懸濁し、１μＭのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で６分間室温にて標識し、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含む等量のＩＭＤＭで反応を１分間クエンチした。細胞を洗浄し、カウントし、注射前に純粋なＩＭＤＭに再懸濁した。ＣＦＳＥ標識ＣＤ８＋ＯＴ−Ｉ細胞３×１０６を被注射ＣＤ４５．１＋マウス尾静脈に静脈内注射した。短期増殖研究では、養子移入から２４時間後に１０μｇのＥＲＹ１−ＯＶＡまたはＯＶＡを１００μＬ量で注射した。抗原投与から５日後に脾細胞を採取し、フローサイトメトリーによる解析のため染色した。
ＯＴ−Ｉのトレランスおよびチャレンジモデル
ＣＦＳＥ標識ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞３×１０５を上記のようにＣＤ４５．１＋被注射マウスに注射した。養子移入から１日後および６日後に、マウスの尾静脈に１０μｇのＥＲＹ１−ＯＶＡまたはＯＶＡを含む１００μＬの食塩水を静脈内投与した。養子移入から１５日後、５μｇのＯＶＡおよび２５ｎｇの超高純度のエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＬＰＳ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を２５μＬでマウスの後肢の肉趾それぞれに皮内チャレンジした（Ｈｏｃｋ法、１０μｇのＯＶＡおよび５０ｎｇのＬＰＳの総投与量）。マウスをチャレンジから４日後に屠殺し、再刺激のため脾臓および流入領域リンパ節細胞を単離した。細胞内サイトカインのフローサイトメトリー解析では、細胞を１ｍｇ／ｍＬのＯＶＡまたは１μｇ／ｍＬのＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号３）ペプチド（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）の存在下で３時間再刺激した。ブレフェルジンＡ（Ｓｉｇｍａ、５μｇ／ｍＬ）を加え、染色およびフローサイトメトリー解析の前に再刺激をさらに３時間続けた。分泌因子のＥＬＩＳＡ測定では、１００μｇ／ｍＬのＯＶＡまたは１μｇ／ｍＬのＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号３）ペプチドの存在下で４日間細胞を再刺激した。細胞を回転させ、ＩＦＮγおよびＩＬ−１０のＲｅａｄｙ−Ｓｅｔ−Ｇｏキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造者の指示通り使用してＥＬＩＳＡ解析のため培地を集めた。ＯＶＡ特異的血清ＩｇＧを、ＯＶＡコートプレートでマウス血清を様々に希釈してインキュベートしてから、最後にヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）とインキュベートして検出した。
ＯＴ−ＩのＥ．Ｇ７−ＯＶＡトレランスモデル
ＣＦＳＥ標識ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞１×１０６を、上記のように８〜１２週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに注射した。養子移入から１日後および６日後、１０μｇのＥＲＹ１−ＯＶＡまたは１０μｇのＯＶＡを含む１００μＬの食塩水をマウスの尾静脈に静脈内投与した。養子移入から５日後、フローサイトメトリーによるＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の特徴付けのため血液を採取した。ＯＶＡ発現ＥＬ−４胸腺腫細胞（Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２１１３）をＡＴＣＣガイドライン通りに培養した。簡単に言えば、１０％ウシ胎仔血清、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．０５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％ピューロマイシン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇｉｂｃｏ）および０．４ｍｇ／ｍＬのＧ４１８（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を補充したＲＰＭＩ１６４０で細胞を培養した。注射の直前に、Ｇ４１８を含まない培地で細胞を増幅させ、回収時にＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁した。養子移入から９日後、マウスをイソフルランで麻酔し、背部を剪毛し、両肩甲骨の間にＥ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞を皮内注射した。Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ移植から４日後、腫瘍寸法を２４時間毎にデジタルカリパスで測定し、腫瘍容積を楕円体（Ｖ＝（π／６）ｌ・ｗ・ｈ）として計算した。式中、Ｖは腫瘍の容積、ｌは長さ、ｗは幅、ｈは高さである）。養子移入から１５日後、５μｇのＯＶＡおよび２５ｎｇの超高純度のエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＬＰＳ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を２５μＬでマウスの前肢の肉趾それぞれに皮内チャレンジした（１０μｇのＯＶＡおよび５０ｎｇのＬＰＳの総投与量）。
抗体およびフローサイトメトリー
フローサイトメトリーには以下の抗マウス抗体：ＣＤ１ｄ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＣＤ３ε ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ８α ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ１１ｂ ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ１１ｃ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ビオチン化ＣＤ４５、ＣＤ４５．２ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＣＤ４５ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＩＦＮγ−ＡＰＣ、ＣＤ８α ＡＰＣ−ｅＦ７８０、ＣＤ４４ ＰＥ−Ｃｙ５．５、ＣＤ６２Ｌ ＰＥ、ＣＤ２０５ ＰＥ−Ｃｙ７、Ｆ４／８０ ＰＥ、Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ ＭＨＣＩＩ ＦＩＴＣ（すべてｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のほか、ｆｉｘａｂｌｅ ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、アネキシン−Ｖ−Ｃｙ５標識キット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）、ストレプトアビジン Ｐａｃｉｆｉｃ Ｏｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および抗ＯＶＡ−ＦＩＴＣ（Ａｂｃａｍ）を使用した。サンプルは、ＣｙＡｎ ＡＤＰフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で解析した。最初にＰＢＳで細胞を洗浄し、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ色素にて２０分間氷上で染色し、２４Ｇ２ハイブリドーマ培地にて２０分間氷上でブロッキングし、２０分間氷上で表面染色し、２％パラホルムアルデヒドで２０分間氷上にて固定し、０．５％サポニンの存在下で４５分間氷上にて細胞内染色してから、解析の前に最後の洗浄を行った。アポトーシス染色の場合、解析の前にアネキシン−Ｖ−Ｃｙ５を５分加えた。ＣＤ４５染色では、細胞をストレプトアビジンＰａｃｉｆｉｃ Ｏｒａｎｇｅで２０分間氷上にて染色し、洗浄して解析した。
粒子を用いた実施
免疫寛容誘導のため、ＥＲＹ１ペプチドを、ＥＲＹ１ペプチドおよび寛容誘導抗原の両方をコンジュゲートしたナノ粒子の形態でも実施した。
ＥＲＹ１とポリマーナノ粒子とのコンジュゲートであって、ペプチドまたはタンパク質抗原にもコンジュゲートされたコンジュゲートを形成するには、コンジュゲーションの変換を制御するため、化学量論量の各成分を連続して加えることができる。ＯＶＡとＥＲＹ１またはミスマッチペプチドとの両方とコンジュゲートしたナノ粒子を形成するには、ペプチドを最初に３Ｍの水性グアニジンＨＣｌに溶解させ、０．５当量を、チオール反応性ピリジルジスルフィド基を含むナノ粒子に加えた。３４３ｎｍの吸光度測定を行い、反応変換をモニターした。本反応では、この波長で高い吸光度を持つ非反応性ピリジン−２−チオン種が発生するためである。室温で２時間後、３４３ｎｍの吸光度は安定し、ＯＶＡを３Ｍの水性グアニジンＨＣｌに溶解させ、２倍モル過剰でナノ粒子溶液に加えた。室温で２時間後、３４３ｎｍの吸光度はより高い値に再び安定し、溶液中のペプチドおよびＯＶＡの両方の濃度を算出した。この二機能性ナノ粒子を、セファロースＣＬ６Ｂ充填カラムを用いたゲル濾過により非反応成分から精製された。０．５ｍＬの各画分をフルオレサミンによりタンパク質および／またはペプチドについて解析し、ナノ粒子の大きさを動的光散乱（ＤＬＳ）により評価した。
抗原が、こうした反応を行うための遊離チオール基をまったく含まない場合、遊離チオール基を組換えＤＮＡ技術により導入して変異体を作製してもよく、その後変異体を組換え技術で発現させ、精製することができる。あるいは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を用いてナノ粒子と抗原との間でアミン−カルボン酸架橋を行うことができる。
ＥＲＹ１とポリマーミセルとのコンジュゲートであって、ペプチドまたはタンパク質抗原にもコンジュゲートされたコンジュゲートを形成するには、ポリマーナノ粒子で記載したのと同様の反応を使用することができる。ミセルは、当該コンジュゲーションスキームに望ましい官能基を含むように形成されるであろう。我々のナノ粒子およびミセルが多様な官能化学基を含むように合成し得ることを踏まえれば、ナノ粒子／ミセル−抗原−ＥＲＹ１複合体の作製に利用するコンジュゲーションスキームには、多くの可能性が存在する。
実施例１５：マウス赤血球および／またはヒト赤血球に結合する抗体および抗体フラグメントの開発
抗原特異的免疫学的トレランスを誘導するため、赤血球に非共有結合的に結合する別の方法として、赤血球結合抗体を使用してもよい。最新のディスプレイプラットフォーム、以下に限定されるものではないが、バクテリオファージディスプレイ、酵母および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）表面提示を使用した抗体ライブラリーのスクリーニングにより、赤血球表面タンパク質に対して高親和性を示す抗体を単離することができる。新規な赤血球結合抗体を発見したら、ＥＲＹ１で行ったのと同様に結合に関する生化学的特徴付けを評価することができる。結合特性の向上した、より高い親和性の変異体を作製するには、最初のライブラリーのスクリーニングから赤血球に結合することが分かった抗体フラグメントに対し親和性成熟を行う。エラープローンＰＣＲおよび部位特異的変異誘発などの標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて、親結合配列から新しいライブラリーを作製する。次いで上記のような最新のディスプレイプラットフォームを用いて、親結合配列と比較して赤血球に対する親和性が増強された他の抗体フラグメントの親和性成熟ライブラリーを提示させる。
親和性成熟はまた、マウス赤血球またはヒト赤血球に結合する既存の抗体で行ってもよい。ラットモノクローナルＴＥＲ−１１９クローン抗体（Ｋｉｎａら，Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ，２０００年）は、まだ十分に明らかにされていない部位でマウス赤血球に結合するが、その特異性は、不均一な細胞集団から赤血球を除去するのに一般に使用されている。マウス赤血球に対する親和性の増強された新しい抗体を発見するには、全長抗体またはｓｃＦｖなどの抗体フラグメントとしてのＴＥＲ−１１９抗体の親和性成熟を行う。マウスモノクローナル１０Ｆ７クローン抗体（Ｌａｎｇｌｏｉｓら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９８４年）は、ヒト赤血球細胞表面のヒトグリコホリンＡに結合する。ヒト赤血球に対する親和性の増強された新しい抗体を発見するには、全長抗体またはｓｃＦｖなどの抗体フラグメントとしての１０Ｆ７抗体の親和性成熟を行う。
我々は、ＴＥＲ−１１９抗体の一次配列を判定するため、ＴＥＲ−１１９ハイブリドーマから単離された抗体特異的ｃＤＮＡを、遺伝子フラグメントを容易にシーケンシングできるプラスミドにクローニングした。遺伝子セグメントの複数の可変ドメインの増幅を可能にする抗体遺伝子のＰＣＲ増幅プロセスには、特定のプライマーセットを使用した（Ｋｒｅｂｂｅｒら，１９９７年；Ｒｅｄｄｙら，２０１０年）。抗体ドメインのＤＮＡ配列から、ＴＥＲ−１１９ ＩｇＧ抗体の重鎖および軽鎖の可変領域を決定することができた。我々は、ＴＥＲ−１１９ ＩｇＧのｓｃＦｖ体を構築するため、アセンブリーＰＣＲを使用して、ＴＥＲ−１１９の可変重鎖、続いて（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）４（配列番号１８）リンカー、続いてＴＥＲ−１１９の可変軽鎖を含む遺伝子を作製した。
Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＴＥＲ−１１９ハイブリドーマクローン由来のｍＲＮＡについて標準的な逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を行い、クローンの相補（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製した。次いで以下のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、抗体の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）領域のＤＮＡ配列を特異的に増幅した。
Figure 0006017422
Figure 0006017422
Figure 0006017422
次いで、増幅したＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を制限エンドヌクレアーゼ（ＶＬにはＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ、ＶＨにはＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）で消化し、遺伝子フラグメントを、アガロース電気泳動後に標準的なキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて精製し、クローニングプラスミドｐＭＡＺ３６０にライゲートした。ＶＨまたはＶＬの遺伝子を含むプラスミドの配列決定を行い、アセンブリーＰＣＲを用いて新しい遺伝子を構築し、下記のＴＥＲ−１１９ ｓｃＦｖ配列を得た。
５’−ＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＧＣＡＡＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＡＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＴＡＧＣＣＴＣＡＧＧＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＡＴＴＧＧＧＴＣＣＧＧＣＡＧＧＣＴＣＣＣＧＧＡＡＡＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＴＡＴＴＡＧＡＣＣＴＧＡＴＧＧＣＡＧＴＧＡＣＡＣＡＡＡＣＴＡＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＧＡＧＧＡＡＴＡＧＡＴＴＣＡＣＡＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＧＣＣＡＧＧＡＧＣＡＴＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＧＣＡＡＴＡＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＴＴＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＴＴＡＧＡＧＡＣＴＣＡＣＣＴＡＣＣＣＧＧＧＣＴＧＧＧＣＴＴＡＴＧＧＡＴＧＣＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＣＧＣＡＧＴＣＴＣＣＴＴＣＡＧＴＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＧＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＴＣＴＣＡＡＣＴＧＣＡＡＡＧＣＡＡＧＴＣＡＧＡＡＴＡＴＴＡＡＣＡＡＧＴＡＣＴＴＡＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＡＡＡＧＣＴＴＧＧＡＧＡＡＧＣＴＣＣＣＡＡＡＧＴＣＣＴＧＡＴＡＴＡＴＡＡＴＡＣＡＡＡＣＡＡＴＴＴＧＣＡＡＡＣＧＧＧＣＡＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＡＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＴＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＣＡＣＡＴＡＴＴＴＣＴＧＣＴＴＴＣＡＧＣＡＴＴＡＴＡＣＴＴＧＧＣＣＣＡＣＧＴＴＴＧＧＡＧＧＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＴＡＣＴ−３’（配列番号７６）。この配列は、翻訳されたタンパク質のＮ末端にＴＥＲ−１１９クローンのＶＨ領域、続いて（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）４（配列番号１８）リンカードメイン、続いて翻訳されたタンパク質のＣ末端にＴＥＲ−１１９クローンのＶＬ領域をコードする。ＴＥＲ−１１９ ｓｃＦｖ遺伝子は、下記のＶＨ領域に特異的なプライマーＳＫ０７およびＳＫ０８、ならびにＶＬ領域に特異的なＳＫ０９およびＳＫ１０を用いてＴＥＲ−１１９ ｃＤＮＡを増幅することにより構築した。
Figure 0006017422
最終的に完成したｓｃＦｖ遺伝子産物をそれぞれＳｆｉＩおよびＸｈｏＩ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）で消化し、ｐＳｅｃＴａｇＡ哺乳動物発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）の同じ部位にライゲートした。
ヒトグリコホリンＡに結合する１０Ｆ７ ｓｃＦｖを親和性成熟させるため、遺伝子を商業的に合成し、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）から以下の配列として得た：
５’−ＧＴＴＡＴＴＡＣＴＣＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣＧＣＡＧＧＴＧＡＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＣＧＣＧＡＧＣＧＴＧＡＡＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＧＡＧＣＧＧＣＴＡＴＡＣＣＴＴＴＡＡＣＡＧＣＴＡＴＴＴＴＡＴＧＣＡＴＴＧＧＡＴＧＡＡＡＣＡＧＣＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＣＡＴＧＡＴＴＣＧＣＣＣＧＡＡＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＣＣＧＡＴＴＡＴＡＡＣＧＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＡＡＡＣＡＡＡＧＣＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＴＡＡＡＡＧＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＧＣＧＴＡＴＡＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＡＴＡＧＣＧＣＧＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＣＧＣＧＣＧＣＴＧＧＧＡＡＧＧＣＡＧＣＴＡＴＴＡＴＧＣＧＣＴＧＧＡＴＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＡＴＡＴＴＧＡＡＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＧＧＣＧＡＴＴＡＴＧＡＧＣＧＣＧＡＣＣＣＴＧＧＧＣＧＡＡＡＡＡＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＣＧＣＧＣＧＡＧＣＡＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＡＴＡＴＡＴＧＴＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＡＧＣＧＧＣＧＣＧＡＧＣＣＣＧＡＡＡＣＴＧＴＧＧＡＴＴＴＡＴＴＡＴＡＣＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＧＣＧＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＧＣＣＧＣＴＴＴＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＴＡＴＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＴＴＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＡＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣＴＡＴＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＴＴＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＣＧＴＡＴＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＴＴＡＡＡＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＴＣＧＧＧＧＧＣＣＧＡＧＧＧＣＧＧＣＧＧＴＴＣＴ−３’（配列番号８１）。
上述の組換えＤＮＡ技術を用いてＴＥＲ−１１９と同様の親和性成熟を１０Ｆ７遺伝子に行い、ヒト赤血球に対して強化された結合をスクリーニングできる変異体のライブラリーを得る。
実施例１６：抗体コンジュゲート抗原との非共有結合的赤血球結合による抗原特異的免疫学的トレランスの誘導
抗体は、実施例１４および本明細書の他の箇所で言及された標準的な架橋反応を用いて抗原とコンジュゲートしてもよい。精製された抗体−抗原コンジュゲートは、１型糖尿病、多発性硬化症、膵島移植の標準的なマウスモデルにおける抗原、およびＯＶＡモデル抗原に対するトレランスの誘導を示す。
ＯＶＡに対するトレランスの誘導を証明するには、ＯＶＡ−抗体コンジュゲートまたはＯＶＡ−ナノ粒子−抗体コンジュゲートをマウスに静脈内投与あるいは血管外投与してもよい。投与後所定の日数で、マウスを屠殺し、解析のためリンパ節、脾臓および血液を採取する。脾細胞およびリンパ節由来の細胞を蒔き、ＯＶＡおよび／またはＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドにてエキソビボで３日間再刺激し、トレランスの確認された証拠である、それらによるＩＦＮγ、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−２およびＩＬ−４の発現のダウンレギュレーション、ならびにＴＧＦ−β１のアップレギュレーションをＥＬＩＳＡにより測定する。ＩＦＮγ、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−２およびＩＬ−４の細胞内染色は、ＯＶＡおよび／またはＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドによるエキソビボでの再刺激から６時間後、脾細胞およびリンパ節由来細胞のフローサイトメトリーを用いて行う。さらに、フローサイトメトリーを用いて、リンパ節、脾臓および血液由来細胞のＣＤ４と、ＣＤ８と、制御性Ｔ細胞との発現プロファイルの特徴付けを行う。加えて、様々な時点でマウスから血液サンプルを採取してＯＶＡ抗原に対する液性抗体応答も測定する。エキソビボでの再刺激のバリアント実験を行って、全身性免疫トレランスが確立しているかどうかを判定する。マウスに上記のようにＯＶＡ−抗体コンジュゲートまたはＯＶＡ−抗体−ナノ粒子コンジュゲートを投与し、アジュバント（リポ多糖、完全フロイトアジュバント、ミョウバンまたはその他）と一緒に９日後にＯＶＡを再投与し、ＯＶＡ抗原に対する脾細胞の応答を上記のようにＥＬＩＳＡおよび／またはフローサイトメトリーにより評価する。ＯＶＡ−抗体コンジュゲートおよび／またはＯＶＡ−抗体−ナノ粒子製剤により、脾細胞はＯＶＡおよびアジュバントによる第２のチャレンジに応答しなくなり、これは全身性免疫トレランスの効果的な確立を証明するための１つの方法である。ＯＶＡ−抗体コンジュゲートおよび／またはＯＶＡ−抗体−ナノ粒子製剤による最初の投与後、トレランスをさらに証明するものとして、実施例１４に詳細に記載した研究と同様にＯＴ−Ｉ Ｔ細胞の養子移入など、遺伝子導入細胞株を用いてインビボで同様のチャレンジ実験を行ってもよい。自己免疫マウスモデルの免疫トレランスまたは療法剤分子の脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）を証明するため、本明細書に記載したようにＯＶＡと関連する抗原に対する類似の抗体コンジュゲートを作製してもよい。
実施例１７：一本鎖抗体融合抗原との非共有結合的赤血球結合による抗原特異的免疫学的トレランスの誘導
一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）は、赤血球に対する非共有結合バインダーとして使用してもよい。赤血球表面タンパク質に対して高親和性を示すＳｃＦｖは、実施例１３で考察したように最新のディスプレイプラットフォームを用いてｓｃＦｖライブラリーをスクリーニングすることにより単離することができる。新規な赤血球結合抗体フラグメントを発見したら、ＥＲＹ１ペプチドで行ったのと同様に結合の生化学的特徴付けを評価する。ｓｃＦｖは１本のポリペプチド鎖を有するため、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いた部位特異的組換え法で抗原に融合される。抗原融合パートナーの性質に応じて、ｓｃＦｖを抗原のＮまたはＣ末端に融合して二機能タンパク質種を作製する。抗原の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）ペプチド認識配列が分かっている場合には、ペプチドをさらにｓｃＦｖのリンカードメインに挿入して、ネイティブなｓｃＦｖの末端を含む新しい二機能性抗体／抗原コンストラクトを作製する。
ＯＶＡに対するトレランスの誘導を証明するには、ＯＶＡ−ｓｃＦｖまたはＯＶＡ−ナノ粒子−ｓｃＦｖコンジュゲートをマウスに静脈内投与または血管外投与することができる。投与後所定の日数で、マウスを屠殺し、解析のためリンパ節、脾臓および血液を採取する。脾細胞およびリンパ節由来細胞を蒔き、ＯＶＡおよび／またはＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（配列番号３）によりエキソビボで３日間再刺激し、トレランスの確認された証拠である、それらによるＩＦＮγ、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−２およびＩＬ−４の発現のダウンレギュレーションとＴＧＦ−β１のアップレギュレーションとを、たとえば、ＥＬＩＳＡにより測定する。ＩＦＮγ、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−２およびＩＬ−４の細胞内染色は、ＯＶＡおよび／またはＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（配列番号３）によるエキソビボでの再刺激から６時間後、脾細胞およびリンパ節由来細胞のフローサイトメトリーを用いて行う。さらに、フローサイトメトリーを用いて、リンパ節、脾臓および血液由来細胞のＣＤ４と、ＣＤ８と、制御性Ｔ細胞との発現プロファイルの発現プロファイルの特徴付けを行ってもよい。加えて、様々な時点でマウスから血液サンプルを採取してＯＶＡ抗原に対する液性抗体応答も測定する。エキソビボでの再刺激のバリアント実験を行って全身性免疫トレランスが確立しているかどうかを判定する。マウスに上記のようにＯＶＡ−ｓｃＦｖまたはＯＶＡ−ナノ粒子−ｓｃＦｖコンジュゲートを投与し、アジュバント（リポ多糖、完全フロイトアジュバント、ミョウバンまたはその他）と一緒に９日後にＯＶＡを再投与し、ＯＶＡ抗原に対する脾細胞の応答を上記のようにＥＬＩＳＡおよび／またはフローサイトメトリーにより評価する。ＯＶＡ−ｓｃＦｖおよび／またはＯＶＡ−ｓｃＦｖ−ナノ粒子製剤により、脾細胞はＯＶＡおよびアジュバントによる第２のチャレンジに応答しなくなり、それにより全身性免疫トレランスの効果的な確立が説明される。ＯＶＡ−ｓｃＦｖおよび／またはＯＶＡ−ｓｃＦｖ−ナノ粒子製剤による最初の投与後、トレランスを証明するため、実施例１４に詳細に記載した研究と同様にＯＴ−Ｉ Ｔ細胞の養子移入など、遺伝子導入細胞株を用いてインビボで同様のチャレンジ実験を行ってもよい。自己免疫マウスモデルの免疫トレランスまたは療法剤分子の脱免疫化を証明するため、本明細書に記載したようにＯＶＡと関連する抗原に対する類似のｓｃＦｖ融合体を作製してもよい。
標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて、マウス赤血球に結合し、かつＯＶＡの免疫優性ＭＨＣ−Ｉエピトープ（ＳＧＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬ）（配列番号８２）を提示する抗体コンストラクトを作製した。我々は最初に、オーバーラップエクステンションＰＣＲを用いて、ＴＥＲ１１９配列の３’末端に相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）な重複５’ドメインと共に、ＳＧＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号８２）ペプチドを含む末端３’ドメインをコードするＤＮＡフラグメントを作製した。このＤＮＡフラグメントをリバースプライマーとして、相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）なフォワード５’プライマーと共に使用して標準的なＰＣＲで、ＴＥＲ１１９−ＳＧＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号８２）をコードする下記全ＤＮＡフラグメント：
Figure 0006017422
 を作製した。下線で示した配列は、ＳＧＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬをコードする遺伝子セグメントを示す。このＤＮＡフラグメントを組換え発現させるため哺乳動物および原核生物発現ベクターに挿入した。
標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて、マウス赤血球に結合し、かつクロモグラニンＡミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）１０４０−ｐ３１（ＹＶＲＰＬＷＶＲＭＥ）（配列番号８４）を提示する抗体コンストラクトを作製した。オーバーラップエクステンションＰＣＲを用いて、ＴＥＲ１１９配列の３’末端に相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）な重複５’ドメインと共に、ＹＶＲＰＬＷＶＲＭＥ（配列番号８４）ペプチドを含む末端３’ドメインをコードするＤＮＡフラグメントを作製した。このＤＮＡフラグメントをプライマーとして、相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）なフォワード５’プライマーと共に使用して標準的なＰＣＲで、ＴＥＲ１１９−ＹＶＲＰＬＷＶＲＭＥをコードする下記全ＤＮＡフラグメント：
Figure 0006017422
 を作製した。下線で示した配列は、クロモグラニンＡ（１０４０−ｐ３１）ミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）（ＹＶＲＰＬＷＶＲＭＥ）（配列番号８４）をコードする遺伝子セグメントを示す。このＤＮＡフラグメントを組換え発現させるため哺乳動物および原核生物発現ベクターに挿入した。
標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて、マウス赤血球に結合し、かつＮＯＤマウスの糖尿病の主要自己抗原マウスプロインスリンを提示する抗体コンストラクトを作製した。我々は最初に、オーバーラップエクステンションＰＣＲを用いて、ＴＥＲ１１９配列の３’末端に相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）な重複５’ドメインと共に、全プロインスリンタンパク質を含む末端３’ドメインをコードするＤＮＡフラグメントを作製した。このＤＮＡフラグメントをプライマーとして、相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）フォワード５’プライマーと共に使用して標準的なＰＣＲで、ＴＥＲ１１９−プロインスリンをコードする下記全ＤＮＡフラグメント：
Figure 0006017422
 を作製した。下線で示した配列は、コンストラクトのプロインスリン遺伝子セグメントを示す。このＤＮＡフラグメントを組換え発現させるため哺乳動物および原核生物発現ベクターに挿入した。
実施例１８：赤血球結合リガンドおよび他の機能を含む分岐ポリマーの合成
８アームＰＥＧ−チオアセテートを合成するため、８アームＰＥＧ−ＯＨ（Ｎｅｋｔａｒ）をトルエンに溶解させ、１０当量のトリエチルアミン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ番号１２１−４４−８）および１０当量のメタンスルホニルクロリド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ番号１２４−６３−０）とアルゴン下、室温で１８時間反応させた。残渣を濾過し、濾液を減圧下で濃縮し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させ、１０当量のチオ酢酸カリウム（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ番号１０３８７−４０−３）を加えた。室温で１８時間後、残渣を濾過し、濾液を減圧下で濃縮し、ジエチルエーテルで沈殿させた。沈殿物を濾過し、減圧下で乾燥させて最終生成物を得た。
８アームＰＥＧ−ピリジルジスルフィドを合成するため、８アームＰＥＧ−チオアセテートをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させ、シュレンク管中、１．０５当量のナトリウムメトキシド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ番号１２４−４１−４）でアルゴン下、室温にて１時間脱保護した。脱保護したチオールをチオレートに還元するため、この溶液に２当量のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＡＳ番号５１８０５−４５−９）および２当量の蒸留水を加えた。室温で２時間後、１２当量の２，２’−ジチオジピリジン（アルドリチオール−２、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ番号２１２７−０３−９）を加え、溶液を室温で２４時間撹拌した。次いで反応混合物を、ＭＷＣＯ３，５００Ｄａの透析チューブで５Ｌの蒸留水に対して４８時間透析し、この間、蒸留水を４回交換した。２５ｍＭのＴＣＥＰを含む１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０で還元して、８アームＰＥＧにロードしたピリジルジスルフィドを定量し、３４３ｎｍのＵＶ−ｖｉｓスペクトルを測定してピリジン−２−チオン脱離基の存在をモニターした。
８アームＰＥＧ−ピリジルジスルフィド−ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ６４７の合成のため、８アームＰＥＧ−チオアセテートをＤＭＦに溶解させ、シュレンク管中、１．０５当量のナトリウムメトキシド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ番号１２４−４１−４）でアルゴン下、室温で１時間脱保護した。脱保護したチオールをチオレートに還元するため、この溶液に２当量のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＡＳ番号５１８０５−４５−９）および等量の１００ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０を加えた。室温で２時間後、０．１２５当量（８アームの１アームに相当）のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７−Ｃ２−マレイミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。室温で２時間後、１２当量の２，２’−ジチオジピリジン（アルドリチオール−２、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ番号２１２７−０３−９）を加え、溶液を室温で２４時間撹拌した。次いで反応混合物を、ＭＷＣＯ３，５００Ｄａの透析チューブで５Ｌの蒸留水に対して４８時間透析し、この間、蒸留水を４回交換した。２５ｍＭのＴＣＥＰを含む１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０で還元して、８アームＰＥＧにロードしたピリジルジスルフィドを定量し、３４３ｎｍのＵＶ−ｖｉｓスペクトルを測定してピリジン−２−チオン脱離基の存在をモニターした。
チオール含有ペプチドと８アームＰＥＧ−ピリジルジスルフィドとのコンジュゲートは、３Ｍの水性グアニジン−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ番号５０−０１−１０）に溶解させた化学量論的な量のペプチドを、８アームＰＥＧ−ピリジルジスルフィドの水溶液に室温で加えて行った。３４３ｎｍのＵＶ−ｖｉｓスペクトルを測定し、ピリジン−２−チオン脱離基の存在を定量して、反応変換をモニターした。８アームＰＥＧ−ピリジルジスルフィドに２つ以上の分子がコンジュゲートされた場合、この反応手順を同じポットで新しい分子と繰り返した。コンジュゲーションが終了したら、反応混合物をＺＥＢＡＳＰＩＮ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で脱塩し、精製された生成物を適切な滅菌条件下で保存した。
ＯＶＡに対するトレランスの誘導については、８アームＰＥＧ−ＥＲＹ１／ＭＩＳ−ＳＩＩＮＦＥＫＬコンジュゲート（ＳＩＩＮＦＥＫＬ：配列番号３）をマウスに静脈内投与あるいは血管外投与することにより証明することができる。この試験を用いれば、ヒト特異的リガンドを使用してヒトにおけるトレランスの誘導も明らかにされるであろう。こうした証明では、投与後所定の日数で、マウスを屠殺し、解析のためリンパ節、脾臓および血液を採取する。脾細胞およびリンパ節由来細胞を蒔き、ＯＶＡおよび／またはＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号３）ペプチドにてエキソビボで３日間再刺激し、トレランスの確認された証拠である、それらによるＩＦＮγ、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−２およびＩＬ−４の発現のダウンレギュレーション、ならびにＴＧＦ−β１のアップレギュレーションをＥＬＩＳＡにより測定する。ＩＦＮγ、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−２およびＩＬ−４の細胞内染色は、ＯＶＡおよび／またはＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号３）ペプチドによるエキソビボでの再刺激から６時間後、脾細胞およびリンパ節由来細胞のフローサイトメトリーを用いて行う。さらに、フローサイトメトリーを用いて、リンパ節、脾臓および血液由来細胞のＣＤ４と、ＣＤ８と、制御性Ｔ細胞との発現プロファイルの特徴付けを行う。加えて、様々な時点でマウスから血液サンプルを採取してＯＶＡ抗原に対する液性抗体応答も測定する。エキソビボでの再刺激のバリアント実験を行って全身性免疫トレランスが確立しているかどうかを判定する。上記のようにマウスに８アームＰＥＧ−ＥＲＹ１／ＭＩＳ−ＳＩＩＮＦＥＫＬコンジュゲート（ＳＩＩＮＦＥＫＬ：配列番号３）を投与し、アジュバント（リポ多糖、完全フロイトアジュバント、ミョウバンまたはその他）と一緒に９日後にＯＶＡを再投与し、ＯＶＡ抗原に対する脾細胞の応答を上記のようにＥＬＩＳＡおよび／またはフローサイトメトリーにより評価する。８アームＰＥＧ−ＥＲＹ１−ＳＩＩＮＦＥＫＬコンジュゲート（ＳＩＩＮＦＥＫＬ：配列番号３）製剤により、脾細胞はＯＶＡおよびアジュバントによる第２のチャレンジに応答しなくなり、これは全身性免疫トレランスの効果的な確立を証明する方法である。８アームＰＥＧ−ＥＲＹ１／ＭＩＳ−ＳＩＩＮＦＥＫＬコンジュゲート製剤（ＳＩＩＮＦＥＫＬ：配列番号３）による最初の投与後、トレランスをさらに証明するため、実施例１４に詳細に記載した研究と同様にＯＴ−Ｉ Ｔ細胞の養子移入など、遺伝子導入細胞株を用いてインビボで同様のチャレンジ実験を行ってもよい。自己免疫マウスモデルの免疫トレランスまたは療法剤分子の脱免疫化を証明するため、本明細書に記載したようにＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号３）と関連する抗原に対する類似の８アームＰＥＧコンストラクトを作製してもよい。
実施例１９：アプタマー−コンジュゲート抗原との非共有結合的赤血球結合による抗原特異的免疫学的トレランスの誘導
非共有結合的赤血球結合による免疫学的トレランスの誘導能力を測定するため、他の非抗体生体親和性試薬を用いた方法を行ってもよい。他のタンパク質ベースの親和性部分、たとえば、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）（Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｆｏｒｒｅｒら，２００８年）、設計されたアルマジロリピートタンパク質（Ｐａｒｍｅｇｇｉａｎｉ，Ｐｅｌｌａｒｉｎら，２００８年）、フィブロネクチンドメイン（Ｈａｃｋｅｌ，Ｋａｐｉｌａら，２００８年）およびシステイン−ノット（ｋｎｏｔｔｉｎ）親和性骨格（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｌｅｖｉｎら，２００９年）などを、赤血球に対する結合親和性を示す部分についてスクリーニングする。
赤血球に対する高親和性ＤＮＡ／ＲＮＡアプタマーを発見するライブラリースクリーニングは、十分に確立した試験管内進化法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎ：ＳＥＬＥＸ）法（Ａｒｃｈｅｍｉｘ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて行う（Ｓａｍｐｓｏｎ，２００３）。高親和性で赤血球に結合する新規なＤＮＡ／ＲＮＡ配列を発見したら、その３’または５’末端に追加の化学反応基を含むようにそれらを化学合成して、抗原および／またはポリマーミセル／ナノ粒子とコンジュゲートする。化学合成したアプタマーは、たとえば、ナノ粒子または抗原またはナノ粒子−抗原複合体のいずれかに存在するＣＯＯＨ基とのＥＤＣ／ＮＨＳコンジュゲーション化学によりコンジュゲートされる反応性ＮＨ２基を有しており、赤血球結合アプタマー、および抗原または抗原−ナノ粒子を含む単一のバイオコンジュゲートを形成する。アプタマー、抗原および／または抗原−ナノ粒子の直交反応基およびコンジュゲーションスキームの両方を変更させて、様々な化学的コンジュゲーション技術が試みられている。
ＯＶＡに対するトレランスの誘導を証明するには、ＯＶＡ−アプタマーまたはＯＶＡ−ナノ粒子−アプタマーコンジュゲートをマウスに静脈内投与あるいは血管外投与する。投与後所定の日数で、マウスを屠殺し、解析のためリンパ節、脾臓および血液を採取する。脾細胞およびリンパ節由来細胞を蒔き、ＯＶＡおよび／またはＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（配列番号３）によりエキソビボで３日間再刺激し、トレランスの確認された証拠である、それらによるＩＦＮγ、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−２およびＩＬ−４の発現のダウンレギュレーション、ならびにＴＧＦ−β１のアップレギュレーションをＥＬＩＳＡにより測定する。ＩＦＮγ、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−２およびＩＬ−４の細胞内染色は、ＯＶＡおよび／またはＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号３）ペプチドによるエキソビボでの再刺激から６時間後、脾細胞およびリンパ節由来細胞のフローサイトメトリーを用いて行う。さらに、フローサイトメトリーを用いて、リンパ節、脾臓および血液由来細胞のＣＤ４と、ＣＤ８と、制御性Ｔ細胞との発現プロファイルの特徴付けを行う。加えて、様々な時点でマウスから血液サンプルを採取してＯＶＡ抗原に対する液性抗体応答も測定する。エキソビボでの再刺激のバリアント実験を行って全身性免疫トレランスが確立しているかどうかを判定する。マウスに上記のようにＯＶＡ−抗体またはＯＶＡ−抗体−ナノ粒子コンジュゲートを投与し、アジュバント（リポ多糖、完全フロイトアジュバント、ミョウバンまたはその他）と一緒に９日後にＯＶＡを再投与し、ＯＶＡ抗原に対する脾細胞の応答を上記のようにＥＬＩＳＡおよび／またはフローサイトメトリーにより評価する。我々は、我々のＯＶＡ−抗体および／またはＯＶＡ−抗体−ナノ粒子製剤により、脾細胞がＯＶＡおよびアジュバントによる第２のチャレンジに応答しなくなり、それにより全身性免疫トレランスの効果的な確立が説明されると予想する。我々のＯＶＡ−アプタマーおよび／またはＯＶＡ−アプタマー−ナノ粒子製剤による最初の投与後、トレランスを証明するため、実施例１４に詳細に記載した研究と同様にＯＴ−Ｉ Ｔ細胞の養子移入など、遺伝子導入細胞株を用いてインビボで同様のチャレンジ実験を行う。自己免疫マウスモデルの免疫トレランスまたは療法剤分子の脱免疫化を証明するため、本明細書に記載したようにＯＶＡと関連する抗原に対する類似のアプタマーコンストラクトを作製する。
さらなる開示
本発明の種々の実施形態について記載する。実施形態は、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１およびそれらの保存的置換体からなる群から選択される配列の少なくとも５個の連続したアミノ酸残基を含む単離されたペプチドであり、前記配列は赤血球に特異的に結合する。実施形態は、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１からなる群から選択される配列の少なくとも１個および２個以下のアミノ酸のＤからＬへの置換を有する１つ以上の残基を含むペプチドであるか、または配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１からなる群から選択される配列の少なくとも１個および２個以下のアミノ酸の保存的置換を有する。実施形態は、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１およびそれらの保存的置換体からなる群から選択される配列の少なくとも５個の連続したアミノ酸残基を含むペプチドであり、前記配列は赤血球に特異的に結合する。ペプチドは、たとえば、約１０〜約８０個の多くの残基を有してもよい。ペプチドは、たとえば、インスリン、酢酸プラムリンチド、成長ホルモン、インスリン様成長因子−１、エリスロポエチン、１型インターフェロンα、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂ、インターフェロンβ１ａ、インターフェロンβ１ｂ、インターフェロンγ１ｂ、β−グルコセレブロシダーゼ、アデノシンデアミナーゼ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン１１、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、エクセナチド、Ｌ−アスパラギナーゼ、ラスブリカーゼ、腫瘍壊死因子受容体およびエンフビルチドからなる群から選択される治療薬をさらに含んでもよい。ペプチドは、抗体、抗体フラグメントおよび一本鎖抗原結合ドメイン（ＳｃＦｖ）からなる群のメンバーをさらに含んでいてもよい。ペプチドは、たとえば、遺伝性疾患により欠損しているタンパク質、非ヒト型グリコシル化タンパク質、非ヒトタンパク質、ヒトに天然には見出されない合成タンパク質、ヒト食物抗原、ヒト移植抗原およびヒト自己免疫抗原からなる群から選択される寛容誘導抗原をさらに含んでいてもよい。ペプチドは、赤血球に特異的に結合する１つ以上の配列を有してもよく、配列は、同じ配列の反復でも、または前記結合を行う様々な配列を混合したものでもよい。
一実施形態は、免疫寛容を引き起こす方法であって、寛容誘導抗原、および患者の赤血球に特異的に結合し、それにより抗原を赤血球に結合する赤血球結合部分を含む分子融合体を含む組成物を投与することを含み、分子融合体は、寛容誘導抗原を含む物質に免疫寛容を引き起こすのに効果的な量で投与する方法である。一実施形態は、分子融合体が、抗原に直接共有結合した少なくとも１つの赤血球結合部分からなる方法であり、たとえば、融合タンパク質は、その結合部分および抗原を含む。一実施形態は、分子融合体が、抗原に結合するまたは抗原を含む粒子に結合した少なくとも１つの赤血球結合部分を含み、たとえば、粒子はマイクロ粒子、ナノ粒子、リポソーム、ポリマーソームおよびミセルからなる群から選択される方法である。一実施形態は、寛容誘導抗原が治療用タンパク質の一部分を含む、たとえば、タンパク質は第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子を含む事例である。一実施形態は、寛容誘導抗原が非ヒトタンパク質の一部分を含む事例である。一実施形態は、タンパク質がアデノシンデアミナーゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ラスブリカーゼ、抗胸腺細胞グロブリン、Ｌ−アルギナーゼおよびＬ−メチオナーゼを含む事例である。一実施形態は、患者がヒトであり、寛容誘導抗原が自然界に見出されないタンパク質の一部分を含む方法である。一実施形態は、患者がヒトであり、寛容誘導抗原が、非ヒト型グリコシル化を含むタンパク質のグリカンを含む事例である。一実施形態は、寛容誘導抗原が、ヒト移植抗原の少なくとも一部分を含む事例である。一実施形態は、寛容誘導抗原が、たとえば、プレプロインスリン、プロインスリン、インスリン、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７、ＩＡ−２、ＩＡ−２β、チログロブリン、甲状腺ペルオキシダーゼ、サイロトロピン受容体、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、プロテオリピドタンパク質、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＶ、アセチルコリン受容体、マトリックスメタロプロテイン１および３、分子シャペロン熱ショックタンパク質４７、フィブリリン−１、ＰＤＧＦ受容体α、ＰＤＧＦ受容体βならびに核タンパク質ＳＳ−Ａからなる群から選択されるヒト自己免疫疾患タンパク質の一部分を含む事例である。一実施形態は、寛容誘導抗原が、たとえば、コンアラキン（Ａｒａ ｈ １）、アレルゲンＩＩ（Ａｒａ ｈ ２）、ピーナッツアグルチニン（Ａｒａ ｈ ６）、α−ラクトアルブミン（ＡＬＡ）、ラクトトランスフェリン、グルテイン、低分子量グルテイン、α−およびγ−グリアジン、ホルデイン、セカリンならびにアベニンからなる群から選択されるヒトの食品の一部分を含む事例である。一実施形態は、赤血球結合部分がペプチドリガンド、抗体、抗体フラグメントおよび一本鎖抗原結合ドメイン（ＳｃＦｖ）からなる群から選択される事例である。一実施形態は、ｓｃＦｖが１０Ｆ７の一部分または全部、たとえば、１０Ｆ７の軽鎖および／もしくは１０Ｆ７の重鎖の１つ以上、ならびに／または、１０Ｆ７の軽鎖および／もしくは１０Ｆ７の重鎖のより高い親和性のバリアントを含む事例である。一実施形態は、赤血球結合部分が、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１およびそれらの保存的置換体からなる群から選択される配列の少なくとも５個の連続したアミノ酸残基を含むペプチドリガンドを含み、前記配列は赤血球に特異的に結合する方法である。
一実施形態は、寛容誘導抗原、および患者の赤血球に特異的に結合し、それにより抗原を赤血球に結合する赤血球結合部分を含む分子融合体を含む組成物である。１つの例は、赤血球結合部分が抗原に共有結合する事例である。別の例は、分子融合体が、抗原に結合する粒子、たとえば、マイクロ粒子、ナノ粒子、リポソーム、ポリマーソームまたはミセルに結合した赤血球結合部分を含む事例である。寛容誘導抗原の例として、治療用タンパク質の一部分、非ヒトタンパク質の一部分、ヒトで天然には見出されないタンパク質の一部分（そのタンパク質の全部、すなわち、すべてのタンパク質）、非ヒト型グリコシル化を含むタンパク質のグリカン、ヒト自己免疫抗原の一部分、ヒトの食品の一部分が挙げられる。一実施形態は、赤血球結合部分がペプチドリガンド、抗体、抗体フラグメントおよび一本鎖抗原結合ドメイン（ＳｃＦｖ）、たとえば、１０Ｆ７の全部または一部分からなる群から選択される組成物である。赤血球結合部分は、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１およびそれらの保存的置換体からなる群から選択される配列の少なくとも５個の連続したアミノ酸残基を含むペプチドリガンドを含んでもよく、前記配列は赤血球に特異的に結合する。赤血球結合部分は、ペプチドと赤血球との平衡状態における結合の測定により判定した場合、約１０μＭ〜０．１ｎＭの解離定数を有するペプチドリガンドを含む部分であってもよい。
別の例は、合成ポリマー、分岐合成ポリマーおよび粒子からなる群から選択される実体に結合した、赤血球に特異的に結合する赤血球結合部分を含む組成物である。粒子は、たとえば、マイクロ粒子、ナノ粒子、リポソーム、ポリマーソームおよびミセルであってもよい。組成物は、寛容誘導抗原、治療薬または腫瘍ホーミングリガンドをさらに含んでもよい。
実施形態は、患者の腫瘍を塞栓する方法であって、赤血球結合部分および腫瘍ホーミングリガンドの分子融合体を含む組成物、または組成物を含む薬物を患者に投与することを含み、腫瘍ホーミングリガンドは、腫瘍および腫瘍血管系からなる群から選択される標的に特異的に結合するように調節された抗体、抗体フラグメント、一本鎖抗原結合ドメイン（ＳｃＦｖ）またはペプチドリガンドであり、かつ赤血球結合部分は、赤血球に特異的に結合するペプチドリガンド、抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、またはアプタマーである、方法を含む。腫瘍ホーミングリガンドの例として、アミノペプチダーゼＡ、アミノペプチダーゼＮ、エンドシアリン、細胞表面ヌクレオリン、細胞表面アネキシン−１、細胞表面ｐ３２／ｇＣ１ｑ受容体、細胞表面プレクチン−１、フィブロネクチンＥＤＡ、フィブロネクチンＥＤＢ、インターロイキン１１受容体α、テネイシン−Ｃ、エンドグリン／ＣＤ１０５、ＢＳＴ−２、ガレクチン−１、ＶＣＡＭ−１、フィブリンおよび組織因子受容体が挙げられる。赤血球部分は、たとえば、ペプチドリガンド、ｓｃＦｖまたは抗体もしくはフラグメントを含んでもよい。
一実施形態は、赤血球に特異的に結合するペプチドリガンドを含む一本鎖抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ）である。ペプチドは、ｓｃＦｖに結合していても、またはリンカー部分に配置されていてもよい。１つ以上のペプチドリガンドを含んでもよい。
本明細書に言及した特許出願、特許および刊行物はすべて、あらゆる目的のため本明細書に援用する。矛盾がある場合は、本明細書が優先する。
参考文献
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１６ Ｈｕａｎｇ Ｘ，Ｍｏｌｅｍａ Ｇ，Ｋｉｎｇ Ｓ，Ｗａｔｋｉｎｓ Ｌ，Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ ＴＳ，＆ Ｔｈｏｒｐｅ ＰＥ（１９９７年）「Ｔｕｍｏｒ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｏ ｔｕｍｏｒ ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ．」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５（５２９９）：５４７〜５５０頁．
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３３ Ｏ’Ｎｅｉｌ ＣＰ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｌｉｅｓ ＡＪ，Ｖｅｌｌｕｔｏ Ｄ，Ｗａｎｄｒｅｙ Ｃ，Ｄｅｍｕｒｔａｓ Ｄ，Ｄｕｂｏｃｈｅｔ Ｊ，＆ Ｈｕｂｂｅｌｌ ＪＡ（２００９）「Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｉｘｅｄ ｍｉｃｅｌｌｅｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．」Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ １３７（２）：１４６−１５１．
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３５ Ｒｅｄｄｙ ＳＴ，Ｒｅｈｏｒ Ａ，Ｓｃｈｍｏｅｋｅｌ ＨＧ，Ｈｕｂｂｅｌｌ ＪＡ，＆ Ｓｗａｒｔｚ ＭＡ（２００６年）「Ｉｎ ｖｉｖｏ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｓｕｌｆｉｄｅ）ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．」Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ １１２（１）：２６〜３４頁．
３６ Ｒｅｄｄｙ ＳＴ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｌｉｅｓ ＡＪ，Ｓｉｍｅｏｎｉ Ｅ，Ａｎｇｅｌｉ Ｖ，Ｒａｎｄｏｌｐｈ ＧＪ，Ｏ’Ｎｅｉｌ ＣＰ，Ｌｅｅ ＬＫ，Ｓｗａｒｔｚ ＭＡ，＆ Ｈｕｂｂｅｌｌ ＪＡ（２００７年）「Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ．」Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５（１０）：１１５９〜１１６４頁．
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４２ Ｉｃｈｉｋａｗａ Ｓ，Ｍｕｃｉｄａ Ｄ，Ｔｙｚｎｉｋ ＡＪ，Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ Ｍ，＆ Ｃｈｅｒｏｕｔｒｅ Ｈ（２０１１年）「Ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｓ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｂｙｓｔａｎｄｅｒｓ．」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ ：１９５０）１８６（１０）：５５４９〜５５５５頁．
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４７ Ｌｉｕ Ｋ，Ｉｙｏｄａ Ｔ，Ｓａｔｅｒｎｕｓ Ｍ，Ｋｉｍｕｒａ Ｙ，Ｉｎａｂａ Ｋ，＆ Ｓｔｅｉｎｍａｎ ＲＭ（２００２年）「Ｉｍｍｕｎｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ａｆｔｅｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｄｙｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｓｉｔｕ．」Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９６（８）：１０９１〜１０９７頁．
４８ Ｄａｒｒａｈ ＰＡ，Ｈｅｇｄｅ ＳＴ，Ｐａｔｅｌ ＤＴ，Ｌｉｎｄｓａｙ ＲＷＢ，Ｃｈｅｎ Ｌ，Ｒｏｅｄｅｒｅｒ Ｍ，＆ Ｓｅｄｅｒ ＲＡ（２０１０年）「ＩＬ−１０ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｔｈｅ ｍａｇｎｉｔｕｄｅ，ｑｕａｌｉｔｙ，ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ Ｔｈ１ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｄｅｐｅｎｄｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ．」Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０７（７）：１４２１〜１４３３頁．
４９ Ｌｅｅ ＭＳ ＆ Ｋｉｍ Ｙ−Ｊ（２００７年）「Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｏｆ ｐａｔｔｅｒｎ−ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｒｏｓｓ ｔａｌｋ．」Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７６：４４７〜４８０頁．
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Claims (8)

  1. 抗原特異的免疫トレランスを誘導するための薬学的に許容される組成物であって、該組成物は、赤血球結合部分と組換え的に融合された、または化学的にコンジュゲートされた、寛容誘導抗原を含み、
    ここで、該赤血球結合部分は、血液においてｉｎ ｓｉｔｕでヒト赤血球に非共有結合的に特異的に結合する能力を有し、さらに他の血液成分と比べ赤血球に対して高い親和性を有する、ペプチドリガンド、抗体、抗体フラグメント、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、またはアプタマーを含み、かつ
    該寛容誘導抗原が、外来抗原を含み、ここで該外来抗原は、食物抗原である、
    組成物。
  2. セリアック病を治療するための、請求項１に記載の組成物。
  3. 食物抗原が、ピーナッツ、リンゴ、乳、キウイ、カラシナ、セロリ、エビ、コムギおよび／もしくは他の穀類、イチゴ、ならびに／またはバナナ由来である、請求項１に記載の組成物。
  4. 食物抗原が、コンアラキン（Ａｒａ ｈ １）、アレルゲンＩＩ（Ａｒａ ｈ ２）、ピーナッツアグルチニン、コングルチン（Ａｒａ ｈ ６）、３１ｋｄａの主要アレルゲン／耐病性タンパク質ホモログ（Ｍａｌ ｄ ２）、脂質転移タンパク質前駆物質（Ｍａｌ ｄ ３）、主要アレルゲンＭａｌ ｄ １．０３Ｄ（Ｍａｌ ｄ １）、α−ラクトアルブミン（ＡＬＡ）、ラクトトランスフェリン、アクチニジン（Ａｃｔ ｃ １、Ａｃｔ ｄ １）、フィトシスタチン、タウマチン様タンパク質（Ａｃｔ ｄ ２）、キウェリン（Ａｃｔ ｄ ５）、２Ｓアルブミン（Ｓｉｎ ａ １）、１１Ｓグロブリン（Ｓｉｎ ａ ２）、脂質転移タンパク質（Ｓｉｎ ａ ３）、プロフィリン（Ｓｉｎ ａ ４）、プロフィリン（Ａｐｉ ｇ ４）、高分子量糖タンパク質（Ａｐｉ ｇ ５）、Ｐｅｎ ａ １アレルゲン（Ｐｅｎ ａ １）、アレルゲンＰｅｎ ｍ ２（Ｐｅｎ ｍ ２）、速筋トロポミオシンアイソフォーム、高分子量グルテニン、低分子量グルテニン、α−およびγ−グリアジン、ホルデイン、セカリン、アベニン、主要イチゴアレルギーＦｒａ ａ １−Ｅ（Ｆｒａ ａ １）、プロフィリン（Ｍｕｓ ｘｐ １）から選択される、請求項３に記載の組成物。
  5. 赤血球結合部分と組換え的に融合された、または化学的にコンジュゲートされた寛容誘導抗原を含む、セリアック病を予防または治療するための医薬組成物であって、
    ここで、該赤血球結合部分は、血液においてｉｎ ｓｉｔｕでヒトグリコホリンＡに結合する、抗体、抗体フラグメント、または一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含み、かつ
    該寛容誘導抗原が、セリアック病患者が望ましくない免疫応答を示す食物抗原を含む、
    組成物。
  6. セリアック病を予防または治療するための請求項５に記載の医薬組成物であって、該寛容誘導抗原が、組織トランスグルタミナーゼ、グリアジン、高分子量グルテニン、低分子量グルテニン、α−グリアジン、γ−グリアジン、ホルデイン、セカリン、もしくはアベニン、またはそれらの一部分を含む、組成物。
  7. 非経口投与用に製剤化される、請求項１から６のいずれかに記載の組成物。
  8. 該寛容誘導抗原が、共刺激分子の影響を受けることなくそれが特異的に結合する赤血球のアポトーシスの際に免疫系に提示される、請求項１から６のいずれかに記載の組成物。
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