JP5836577B2 - Affinity carrier production method for purifying or removing a protein or peptide having a kringle sequence, its purification method, and removal method - Google Patents

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Description

本発明は、夾雑成分の混在するクリングル配列を有する蛋白質またはペプチドの溶液からクリングル配列を有する蛋白質またはペプチドを特異的に精製・除去するためのアフィニティ担体、及び、そのアフィニティ担体を用いたクリングル配列を有する蛋白質またはペプチドの精製方法・除去方法に関する。また本発明は高度に精製されたクリングル配列を有する蛋白質またはペプチドの製造技術にも関する。   The present invention relates to an affinity carrier for specifically purifying and removing a protein or peptide having a kringle sequence from a solution of a protein or peptide having a kringle sequence mixed with contaminating components, and a kringle sequence using the affinity carrier. The present invention relates to a method for purifying and removing a protein or peptide possessed. The present invention also relates to a technique for producing a protein or peptide having a highly purified kringle sequence.

クリングル配列とは3対のS−S架橋で形成される独特の折りたたみ構造を有するアミノ酸配列であり、その構造がデンマークの菓子パンと似ていたことから名付けられた構造ドメインである。クリングル配列は、血液凝固や線溶に関わる蛋白質において頻繁に見出されているドメインであり、クリングル配列を有する蛋白質やその蛋白質断片は血液の凝固、血液の線溶のみならず、血管新生の促進、血管新生の阻害、細胞増殖の促進、細胞増殖の不活性化、アポトーシスなど生体内において様々な生理活性を発揮している。   The kringle sequence is an amino acid sequence having a unique folding structure formed by three pairs of SS bridges, and is a structural domain named because the structure resembles Danish confectionery bread. Kringle sequences are frequently found in proteins involved in blood coagulation and fibrinolysis, and proteins and protein fragments containing kringle sequences promote not only blood coagulation and blood fibrinolysis but also angiogenesis. It exhibits various physiological activities in vivo, such as inhibiting angiogenesis, promoting cell proliferation, inactivating cell proliferation, and apoptosis.

プラスミノゲンは791アミノ酸残基から構成される分子量約92kDaの一本鎖糖蛋白質であり、分子内にセリンプロテアーゼと5つのクリングル配列を有する。プラスミノゲンは組織プラスミノゲン活性化因子やウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子により限定分解を受け、酵素活性を有する活性型のプラスミンへ変換される。プラスミンは血栓の主成分であるフィブリン線維を溶解する。このように、プラスミノゲンや活性型のプラスミンは血液の線溶系反応に関与するクリングル配列を有する生体内蛋白質である。   Plasminogen is a single-chain glycoprotein having a molecular weight of about 92 kDa composed of 791 amino acid residues, and has serine protease and five kringle sequences in the molecule. Plasminogen undergoes limited degradation by tissue plasminogen activator and urokinase plasminogen activator and is converted to an active plasmin having enzyme activity. Plasmin dissolves fibrin fibers, the main component of thrombi. Thus, plasminogen and active plasmin are in vivo proteins having a kringle sequence involved in the fibrinolytic reaction of blood.

組織プラスミノゲン活性化因子は血管内皮細胞で産生される527アミノ酸残基より成る分子量約70kDaの糖蛋白質であり、分子内にセリンプロテアーゼと2つのクリングル配列を有する。組織プラスミノゲン活性化因子はフィブリンに結合し、同じくフィブリンに結合しているプラスミノゲンを分解し、上記したように血液線溶を促進させる。また脳卒中や脳梗塞の治療薬としても用いられている。   Tissue plasminogen activator is a glycoprotein having a molecular weight of about 70 kDa consisting of 527 amino acid residues produced in vascular endothelial cells, and has serine protease and two kringle sequences in the molecule. Tissue plasminogen activator binds to fibrin, degrades plasminogen that is also bound to fibrin, and promotes blood fibrinolysis as described above. It is also used as a treatment for stroke and cerebral infarction.

ウロキナーゼは腎細胞で生産され尿中または血液中に存在するプロテアーゼであり、分子内に一つのクリングル配列を有する蛋白質であり、上記したようにプラスミノゲンを限定分解し、活性型のプラスミンに変換することで線溶系カスケードを促進させる。   Urokinase is a protease produced in kidney cells and present in urine or blood. It is a protein with a single kringle sequence in the molecule. As described above, plasminogen is limitedly decomposed and converted to active plasmin. Promotes the fibrinolytic cascade.

プロトロンビンは分子量約72kDaの糖蛋白質であり、分子内にセリンプロテアーゼと2つのクリングル配列を有する。セリンプロテアーゼトロンビンの前駆体である。プロトロンビンはプロトロンビナーゼ複合体を形成した第Xa因子によって分解され、αトロンビンになる。αトロンビンは、フィブリノーゲンを重合させフィブリンにする、また、第XIII因子を活性化してフィブリンを強固に架橋結合させる、血小板を活性化する、第VIII因子・第V因子を活性化して凝固を促進させる等の酵素作用を表わす。一方、トロンボモジュリンに補足されて、 プロテインCを活性化して凝固を抑制する作用を持つ。   Prothrombin is a glycoprotein having a molecular weight of about 72 kDa, and has serine protease and two kringle sequences in the molecule. It is a precursor of the serine protease thrombin. Prothrombin is degraded by factor Xa that forms a prothrombinase complex to α-thrombin. Alpha thrombin polymerizes fibrinogen into fibrin, activates factor XIII to strongly crosslink fibrin, activates platelets, activates factor VIII and factor V to promote coagulation Enzyme action such as. On the other hand, it is supplemented by thrombomodulin and activates protein C to suppress coagulation.

第XII因子は596個のアミノ酸から成る分子量約80kDaの一本鎖糖蛋白質であり、分子内に1つのクリングル配列を有する。第XII因子は、ガラス、カオリン、基底膜、コラーゲン等の異物面(陰性荷電膜面)と接触すると、その立体構造を変え、 N基末端近くで異物面と結合し、カリクレイン等に限定分解され活性化を受け二本鎖の第XII因子となる。第XII因子はプレカリクレインを活性化されカリクレインに変換し、カリクレインは第XII因子を活性化するという相互活性化作用を持っている。第XII因子は異物面上で第XI因子を活性化し、内因系の凝固反応をスタートさせる。第XIIa因子には凝固反応だけでなく、細胞分裂促進作用、 線溶系の活性化、補体の活性化、カリクレインを介しての高分子キニノーゲンからのキニンの産生と、多くの生体反応に関与していることが 報告されている。   Factor XII is a single-chain glycoprotein consisting of 596 amino acids and having a molecular weight of about 80 kDa, and has one kringle sequence in the molecule. When factor XII comes into contact with a foreign surface (negatively charged membrane surface) such as glass, kaolin, basement membrane, or collagen, it changes its steric structure, binds to the foreign surface near the end of the N group, and is limited to kallikrein. When activated, it becomes double-stranded factor XII. Factor XII has a reciprocal action of activating pre-kallikrein and converting it into kallikrein, which activates factor XII. Factor XII activates factor XI on the foreign body surface and initiates the intrinsic clotting reaction. Factor XIIa is involved not only in coagulation but also in many biological reactions, including mitogenic effects, fibrinolytic activation, complement activation, kinin production from high-molecular-weight kininogen via kallikrein. Has been reported.

アンジオスタチンは米国ハーバード大学のFolkman教授によって見出されたプラスミノゲンのN末端断片の蛋白質であり、分子内に複数のクリングル配列を有する。アンジオスタチンは血管新生阻害作用を有し、癌縮退効果や抗腫瘍転移効果があることが報告されている。   Angiostatin is a protein of an N-terminal fragment of plasminogen found by Professor Folkman of Harvard University in the United States, and has a plurality of kringle sequences in the molecule. Angiostatin has an angiogenesis inhibitory effect and has been reported to have a cancer regression effect and an antitumor metastasis effect.

肝細胞増殖因子は大阪大学中村敏一教授によって肝細胞の増殖因子として発見された蛋白質であり、4つのクリングル配列を有する分子量約60kDaの重鎖と分子量約35kDaの軽鎖がジスルフィド結合したヘテロダイマーである。肝細胞増殖因子は肝細胞のみならず肺、心・血管系、神経系など様々な細胞に対して、細胞増殖促進、細胞運動促進、抗アポトーシス、形態形成誘導、血管新生など組織・臓器の再生と保護を担う多才な生理活性を有することが報告されている。一方、肝硬変や慢性腎不全(腎硬化症)に代表される慢性線維性疾患においては、その発現低下状態をきたすことも報告されている。また肝細胞増殖因子の遺伝子治療により閉塞性動脈硬化症患者に対する治療効果も見出されている。   Hepatocyte growth factor is a protein discovered as a hepatocyte growth factor by Professor Toshikazu Nakamura, Osaka University. Heterodimer in which a heavy chain with a molecular weight of about 60 kDa and a light chain with a molecular weight of about 35 kDa having four kringle sequences are disulfide bonded. It is. Hepatocyte growth factor not only for hepatocytes but also for various cells such as lung, heart / vasculature, nervous system, cell proliferation promotion, cell movement promotion, anti-apoptosis, morphogenesis induction, angiogenesis, etc. It has been reported to have a versatile physiological activity responsible for protection. On the other hand, it has also been reported that in chronic fibrotic diseases represented by cirrhosis and chronic renal failure (renal sclerosis), its expression is reduced. In addition, therapeutic effects on patients with obstructive arteriosclerosis have been found by gene therapy of hepatocyte growth factor.

NK4は肝細胞増殖因子が切断された肝細胞増殖因子の部分蛋白質であり、同様に4つのクリングル配列を有する。NK4は肝細胞増殖因子のアンタゴニストとして働き、癌の浸潤転移を抑制する一方で、VEGFやbFGFなどの血管新生因子の働きを抑制できることから、強力な血管新生阻害活性を持っていることが知られている。   NK4 is a partial protein of hepatocyte growth factor cleaved from hepatocyte growth factor, and similarly has four kringle sequences. NK4 works as an antagonist of hepatocyte growth factor and suppresses the invasion and metastasis of cancer, while it can suppress the action of angiogenic factors such as VEGF and bFGF, so it has a strong angiogenesis inhibitory activity. ing.

アポリポプロテイン(a)はLDLコレステロールの構成蛋白質であり、個人差はあるが分子内に12から51個の複数個のクリングル配列の繰り返し構造を持つ。急性心筋梗塞や急性炎症の際に、血中濃度の増加が報告されている。   Apolipoprotein (a) is a constituent protein of LDL cholesterol and has a repeating structure of a plurality of 12 to 51 kringle sequences in the molecule, although there are individual differences. Increased blood levels have been reported during acute myocardial infarction and acute inflammation.

このようにプラスミノゲンをはじめクリングル配列を有する蛋白質やペプチドは生体内で種々の生理活性を発揮している。従ってクリングル配列を有する蛋白質やペプチドを除去すること、または、精製することは、体内濃度低下による治療効果、夾雑成分が混在する溶液からの精製など医療上の観点から非常に有用である。前記目的を達成する材料や方法としてアミノ酸であるリジンを固定化したアフィニティ担体がある。これはクリングル配列にリジン結合性があることを利用したものである。ところがリジンは反応点であるアミノ基を二つ有しており、非特許文献1によると、αアミノ基で固定化した場合でないとクリングル配列に親和性が低いことから、リジンを選択的に固定化する必要がある。しかしながら、リジンを選択的に固定化するためには反応を厳密にコントロールしなければならず、容易なことではない。リジンを選択的に固定化するためには、εアミノ基が保護されたリジンを担体に固定化した後、脱保護する方法があるが、保護されたリジンが高価であること、工程が増えることなど、種々の問題がある。   Thus, proteins and peptides having a kringle sequence, including plasminogen, exhibit various physiological activities in vivo. Therefore, removing or purifying a protein or peptide having a kringle sequence is very useful from a medical point of view, such as a therapeutic effect due to a decrease in the body concentration and purification from a solution containing contaminating components. There is an affinity carrier on which lysine, which is an amino acid, is immobilized as a material or method for achieving the object. This is based on the fact that the kringle sequence has lysine binding properties. However, lysine has two amino groups that are reactive sites. According to Non-Patent Document 1, lysine is selectively immobilized because it has a low affinity for the kringle sequence unless it is immobilized with an α-amino group. It is necessary to make it. However, in order to selectively immobilize lysine, the reaction must be strictly controlled, which is not easy. In order to selectively immobilize lysine, there is a method of deprotecting after immobilizing lysine protected with ε-amino group on a carrier, but the protected lysine is expensive and the process is increased. There are various problems.

Journal of Biomedical Materials Research Part A, Vol.49, Issue.3, 409-414(1999)Journal of Biomedical Materials Research Part A, Vol.49, Issue.3, 409-414 (1999)

本発明の目的はプラスミノゲンをはじめとするクリングル配列を有する蛋白質やペプチドを除去または精製するためのリジンが固定化されたアフィニティ担体において、保護基を用いることなく、簡便な工程によって、前記アフィニティ担体を提供すること、及び、そのアフィニティ担体を用いたクリングル配列を有する蛋白質やペプチドの除去方法または精製方法を提供することである。   An object of the present invention is to use an affinity carrier to which lysine for removing or purifying a protein or peptide having a kringle sequence such as plasminogen is immobilized, by using a simple process without using a protecting group. It is to provide a method for removing or purifying a protein or peptide having a kringle sequence using the affinity carrier.

本発明者は、元来容易に作製することが困難であった、プラスミノゲンをはじめとするクリングル配列を有する蛋白質やペプチドを除去または精製するためのアフィニティ担体の作成方法に関して鋭意検討を行った。その結果、pHが9以下の条件下で、活性化担体とリジンとを接触させて得た、リジンの固定化されたアフィニティ担体が効率良くクリングル配列を有する蛋白質やペプチドを除去・精製可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。   The present inventor has intensively studied a method for producing an affinity carrier for removing or purifying a protein or peptide having a kringle sequence such as plasminogen, which has been difficult to produce originally. As a result, the lysine-immobilized affinity carrier obtained by bringing the activated carrier and lysine into contact with each other under a pH of 9 or less can efficiently remove and purify proteins and peptides having a kringle sequence. As a result, the present invention has been completed.

即ち、本発明は第一にプラスミノゲンをはじめとするクリングル配列を有する蛋白質やペプチドを除去または精製するためのアフィニティ担体の作成方法に関する。第二に、アフィニティ担体を用いた、プラスミノゲンをはじめとするクリングル配列を有する蛋白質やペプチドの除去方法、精製方法に関する。   That is, the present invention first relates to a method for producing an affinity carrier for removing or purifying a protein or peptide having a kringle sequence including plasminogen. Second, the present invention relates to a method for removing and purifying proteins and peptides having a kringle sequence including plasminogen using an affinity carrier.

本発明は具体的には以下の発明を包含する。
(1)クリングル配列を有する蛋白質またはペプチドを精製または除去するためのアフィニティ担体であって、該担体の作製において活性化担体とリジンを接触させる際の溶液中pHが9以下であることを特徴とするリジンが固定化されたアフィニティ担体。
(2)リジンが共有結合で固定化された前記(1)記載のアフィニティ担体。
(3)活性化担体にN−ヒドロキシスクシンイミドが導入されていることを特徴とする前記(1)または(2)に記載のアフィニティ担体。
(4)N−ヒドロキシスクシンイミドがリンカーを介して導入されていることを特徴とする前記(3)記載のアフィニティ担体。
(5)アフィニティ担体がポリビニルアルコールからなることを特徴とする(1)から(4)いずれかに記載の担体。
(6)ポリビニルアルコールが架橋されていることを特徴とする前記(5)記載の担体。
(7)アフィニティ担体が多孔質の水不溶性担体であることを特徴とする前記(1)から(6)のいずれかに記載の担体。
(8)多孔質の水不溶性担体が粒子状であることを特徴とする前記(7)記載の担体。
(9)クリングル配列を有する蛋白質またはペプチドが、プラスミノゲン、プラスミン、アンジオスタチン、アポリポプロテイン(a)、組織プラスミノゲン活性化因子、ウロキナーゼ、肝細胞増殖因子、NK4、プロトロンビン、第XII因子またはこれらの部分ペプチドから選択される少なくとも一種以上の蛋白質またはペプチドであることを特徴とする前記(1)から(8)のいずれかに記載の担体。
(10)クリングル配列を有する蛋白質またはペプチドがプラスミノゲン、アンジオスタチンまたは、その部分ペプチドであることを特徴とする前記(9)記載の担体。
(11)クリングル配列を有する蛋白質またはペプチドがプラスミノゲンであることを特徴とする(10)記載の担体。
(12)前記(1)から(11)のいずれかに記載のアフィニティ担体を、夾雑成分の混在するクリングル配列を有する蛋白質溶液またはペプチド溶液と接触させることを特徴とする、該担体を用いたクリングル配列を有する蛋白質またはペプチドの精製方法、及びクリングル配列を有する蛋白質またはペプチドの除去方法。
(13)前記(1)から(11)のいずれかに記載のアフィニティ担体を夾雑成分の混在するクリングル配列を有する蛋白質溶液またはペプチド溶液と接触しクリングル配列を有する蛋白質を選択的に吸着させた後、吸着したクリングル配列を有する蛋白質またはペプチドを該担体から解離、回収することを特徴とするクリングル配列を有する蛋白質またはペプチドの精製方法。
(14)選択的に吸着したクリングル配列を有する蛋白質またはペプチドを、溶出液を用いて解離、回収することを特徴とする前記(13)記載の精製方法。
(15)溶出液がアミノカプロン酸を含む溶液、リジンを含む溶液、アルギニン酸を含む溶液、トラネキサム酸を含む溶液、p−アミノベンズアミジンを含む溶液から選ばれる少なくとも一種類以上の溶出液を用いた前記(14)記載の精製方法。
(16)夾雑成分の混在するクリングル配列を有する蛋白質溶液またはペプチドが、血液や血漿などの体液、動物組織抽出物、培養液、及びそれらを前処理した溶液であることを特徴とする前記(12)から(15)のいずれかに記載のクリングル配列を有する蛋白質またはペプチドの精製方法または除去方法。
(17)前記(13)から(16)のいずれかに記載の方法で精製されたクリングル配列を有する蛋白質またはペプチド。
The present invention specifically includes the following inventions.
(1) An affinity carrier for purifying or removing a protein or peptide having a kringle sequence, wherein the pH in the solution at the time of contacting the activated carrier and lysine in the production of the carrier is 9 or less An affinity carrier on which lysine is immobilized.
(2) The affinity carrier according to (1) above, wherein lysine is immobilized by a covalent bond.
(3) The affinity carrier according to (1) or (2) above, wherein N-hydroxysuccinimide is introduced into the activated carrier.
(4) The affinity carrier according to (3) above, wherein N-hydroxysuccinimide is introduced through a linker.
(5) The carrier according to any one of (1) to (4), wherein the affinity carrier comprises polyvinyl alcohol.
(6) The carrier according to (5), wherein polyvinyl alcohol is crosslinked.
(7) The carrier according to any one of (1) to (6), wherein the affinity carrier is a porous water-insoluble carrier.
(8) The carrier according to (7), wherein the porous water-insoluble carrier is in the form of particles.
(9) The protein or peptide having a kringle sequence is plasminogen, plasmin, angiostatin, apolipoprotein (a), tissue plasminogen activator, urokinase, hepatocyte growth factor, NK4, prothrombin, factor XII or a partial peptide thereof The carrier according to any one of (1) to (8) above, which is at least one protein or peptide selected from the group consisting of:
(10) The carrier according to (9), wherein the protein or peptide having a kringle sequence is plasminogen, angiostatin, or a partial peptide thereof.
(11) The carrier according to (10), wherein the protein or peptide having a kringle sequence is plasminogen.
(12) The kringle using the carrier, wherein the affinity carrier according to any one of (1) to (11) is brought into contact with a protein solution or a peptide solution having a kringle sequence in which contaminant components are mixed. A method for purifying a protein or peptide having a sequence, and a method for removing a protein or peptide having a kringle sequence.
(13) After the affinity carrier according to any one of (1) to (11) is brought into contact with a protein solution or peptide solution having a kringle sequence mixed with contaminating components and a protein having a kringle sequence is selectively adsorbed A method for purifying a protein or peptide having a kringle sequence, which comprises dissociating and recovering the adsorbed protein or peptide having a kringle sequence from the carrier.
(14) The purification method according to (13), wherein the protein or peptide having a selectively adsorbed kringle sequence is dissociated and recovered using an eluate.
(15) The eluent used was at least one eluent selected from a solution containing aminocaproic acid, a solution containing lysine, a solution containing arginic acid, a solution containing tranexamic acid, and a solution containing p-aminobenzamidine. The purification method according to the above (14).
(16) The protein solution or peptide having a kringle sequence mixed with contaminating components is a body fluid such as blood or plasma, an animal tissue extract, a culture solution, or a solution obtained by pretreating them (12) ) To (15). A method for purifying or removing a protein or peptide having the kringle sequence according to any one of (15) to (15).
(17) A protein or peptide having a kringle sequence purified by the method according to any one of (13) to (16).

本発明によれば、pH9以下で活性化担体とリジンを接触させることによって保護基を用いることなく、簡便な工程によって、リジンが固定化されたアフィニティ担体が提供される。本発明により得られたたリジン固定化アフィニティ担体は、効率良くクリングル配列を有する蛋白質やペプチドを除去・精製することが可能である。   According to the present invention, an affinity carrier on which lysine is immobilized is provided by a simple process without using a protecting group by contacting the activated carrier with lysine at pH 9 or less. The lysine-immobilized affinity carrier obtained by the present invention can efficiently remove and purify proteins and peptides having a kringle sequence.

以下に本発明の実施形態について詳細に説明するが、本発明は以下の説明に限定されるものではない。   Embodiments of the present invention will be described in detail below, but the present invention is not limited to the following descriptions.

本発明におけるクリングル配列を有する蛋白質またはペプチドとは、具体的にはプラスミノゲン、プラスミン、アンジオスタチン、アポリポプロテイン(a)、組織プラスミノゲン活性化因子、ウロキナーゼ、肝細胞増殖因子、NK4、プロトロンビン、第XII因子などの蛋白質、および上記蛋白質の部分ペプチドであり、クリングル配列を有するものであれば構わない。   The protein or peptide having a kringle sequence in the present invention specifically includes plasminogen, plasmin, angiostatin, apolipoprotein (a), tissue plasminogen activator, urokinase, hepatocyte growth factor, NK4, prothrombin, factor XII Any of the above proteins and partial peptides of the above-described proteins, which have a kringle sequence, may be used.

本発明における水不溶性担体とは、常温常圧で固体であり、水不溶性であることを意味する。本発明における水不溶性担体は、球状、粒状、糸状、中空状、平膜状等、形状は特に問わず、その大きさも特に限定されない。水不溶性担体は比表面積が大きいほど除去性能や精製効率が優れることから、球状または粒状が特に好ましく用いられる。球状または粒状の担体は適当な大きさの細孔を多数孔有する、すなわち、多孔構造を有する担体であることが好ましい。多孔構造を有する担体とは、基礎高分子母体が微小球の凝集により1個の球状粒子を形成する際に微小球の集塊によって形成される空間(マクロポアー)を有する担体のばあいは当然であるが、基礎高分子母体を構成する1個の微小球内の核と核との集塊の間に形成される細孔を有する担体の場合、あるいは三次元構造(高分子網目)を有する共重合体が親和性のある有機溶媒で膨潤された状態の時に存在する細孔(ミクロポアー)を有する担体の場合も含まれる。   The water-insoluble carrier in the present invention means a solid at room temperature and normal pressure and water-insoluble. The shape of the water-insoluble carrier in the present invention is not particularly limited, and the size thereof is not particularly limited, such as a spherical shape, a granular shape, a thread shape, a hollow shape, and a flat membrane shape. As the water-insoluble carrier, the larger the specific surface area, the better the removal performance and the purification efficiency. The spherical or granular carrier is preferably a carrier having a large number of pores of an appropriate size, that is, a porous structure. A carrier having a porous structure is naturally a carrier having a space (macropore) formed by agglomeration of microspheres when the base polymer matrix forms one spherical particle by agglomeration of microspheres. However, in the case of a carrier having pores formed between agglomerates of nuclei in one microsphere constituting the basic polymer matrix, or a carrier having a three-dimensional structure (polymer network). The case of a carrier having pores (micropores) existing when the polymer is swollen with an affinity organic solvent is also included.

また担体の単位体積あたりの除去性能や精製効率から考えて、多孔構造を有する水不溶性担体は、表面多孔性よりも全多孔性が好ましく、また空孔容積および比表面積は、吸着性が損なわれない程度に大きいことが好ましい。   In view of the removal performance per unit volume of the carrier and the purification efficiency, the water-insoluble carrier having a porous structure is preferably more porous than the surface porosity, and the pore volume and specific surface area impair the adsorptivity. It is preferably as large as possible.

球状や粒状の担体の平均粒径は、一般的には0.5μmから10mmのものが用いられるが、粒径が小さくなるほど比表面積が大きくなり、アフィニティ担体としての性能に優れるが、担体の物理的機械的強度が弱くなることから、10μmから3mmのものが好ましい。   The average particle size of the spherical or granular carrier is generally 0.5 μm to 10 mm, but the smaller the particle size, the larger the specific surface area and the better the performance as an affinity carrier. Since the mechanical strength is weakened, a thickness of 10 μm to 3 mm is preferable.

本発明における水不溶性担体としては、一般的なアフィニティ担体に求められる特性と医療材料として求められる特性、つまり、有機溶媒に対する耐性、pHや熱に対する耐性、物理的機械的強度、非特異吸着、血球成分との相互作用、血栓形成、血液凝固等の面から、デキストラン、アガロース、セルロース等の糖を含む天然高分子担体やポリビニルアルコール、ポリグリシジルメタクリレート、ポリヒドロキシメタクリレート等の合成高分子系担体が好ましい。また、これらの組み合わせによってえられる有機−有機、有機−無機などの複合担体等も好ましい。さらに、これらは担体架橋されているものであっても良い。架橋剤はトリアリルイソシアヌレート(TAIC)、エチレングリコールジメタクリレート(EGDMA)、グリセリンジメタクリレート(GDMA)などが挙げられるが、本発明はこれらに限定されない。そして、本担体は非特異的吸着が少なく親水性が高いこと、活性基を導入するための官能基が必要なことから水酸基を有していることが望ましい。ポリグリシジルメタクリレートはそのままでは水酸基を持っていないため親水性は低いが、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどのアルカリによる処理や、希硫酸、過塩素酸、ベンゼンスルホン酸、またはトルエンスルホン酸などのエポキシに反応しない酸による処理を施すと、エポキシ基は開環し、ジオールに変換、親水化されるため、アフィニティ担体に適切な材料になる。このように本発明における水不溶性担体としては種々の材料が考えられるが、ポリビニルアルコールを材料とした担体が除去性能や精製効率の点より好ましい。   As the water-insoluble carrier in the present invention, characteristics required for general affinity carriers and characteristics required for medical materials, that is, resistance to organic solvents, resistance to pH and heat, physical mechanical strength, non-specific adsorption, blood cells From the viewpoints of interaction with components, thrombus formation, blood coagulation, etc., natural polymer carriers containing sugars such as dextran, agarose and cellulose and synthetic polymer carriers such as polyvinyl alcohol, polyglycidyl methacrylate and polyhydroxy methacrylate are preferred. . Also preferred are organic-organic and organic-inorganic composite carriers obtained by these combinations. Further, they may be those that are carrier-crosslinked. Examples of the crosslinking agent include triallyl isocyanurate (TAIC), ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA), and glycerin dimethacrylate (GDMA), but the present invention is not limited thereto. The carrier preferably has a hydroxyl group because it has little nonspecific adsorption and high hydrophilicity, and a functional group for introducing an active group is necessary. Polyglycidyl methacrylate is low in hydrophilicity because it does not have a hydroxyl group as it is, but it is treated with an alkali such as sodium hydroxide or potassium hydroxide, or an epoxy such as dilute sulfuric acid, perchloric acid, benzenesulfonic acid, or toluenesulfonic acid. When treated with an acid that does not react with, the epoxy group is ring-opened, converted into a diol and hydrophilized, making it a suitable material for the affinity carrier. As described above, various materials can be considered as the water-insoluble carrier in the present invention, but a carrier made of polyvinyl alcohol is preferred from the viewpoint of removal performance and purification efficiency.

本発明に記載した水不溶性担体の重合法としては、懸濁重合や均一液滴化などが考えられるが、本発明はこれらに限定されない。   As the polymerization method of the water-insoluble carrier described in the present invention, suspension polymerization, uniform droplet formation, and the like can be considered, but the present invention is not limited to these.

本発明におけるリジンが固定化されたアフィニティ担体とは、好ましくはリジンが共有結合で結合された担体である。リジンはL体、D体、DL体、これらの混合物であってもよい。リジンを固定化するための方法としては、担体に活性基を導入し、活性基に対してリジンを反応させる方法が一般的である。よく用いられる活性基としては、エポキシ基、ハロゲン化シアン、ハロゲン化トリアジン、ブロモアセチルブロミド、アルデヒド、N−ヒドロキシスクシンイミド等で挙げられる。本発明において活性基の種類は限定されないが、容易にその活性基を導入できること、温和な条件下でリガンドまたはリンカーを固定化できること、活性が高いこと、固定化されたリガンドまたはリンカーが安定であり溶出しにくいこと、目的に応じて活性基導入量を調整できること、から活性基はN−ヒドロキシスクシンイミドが好ましい。N−ヒドロキシスクシンイミドはアミノ基やヒドロキシル基と容易に反応し、副反応は少なく、定量的にアミド結合、エステル結合を形成する。N−ヒドロキシスクシンイミドは水溶液中で分解させると、毒性が低くなることも利点である。   The affinity carrier on which lysine is immobilized in the present invention is preferably a carrier on which lysine is covalently bound. The lysine may be L, D, DL, or a mixture thereof. As a method for immobilizing lysine, a method in which an active group is introduced into a carrier and lysine is reacted with the active group is generally used. Examples of frequently used active groups include epoxy groups, cyanogen halides, halogenated triazines, bromoacetyl bromides, aldehydes, and N-hydroxysuccinimide. In the present invention, the type of the active group is not limited, but the active group can be easily introduced, the ligand or linker can be immobilized under mild conditions, the activity is high, and the immobilized ligand or linker is stable. The active group is preferably N-hydroxysuccinimide because it is difficult to elute and the amount of active group introduced can be adjusted according to the purpose. N-hydroxysuccinimide easily reacts with amino groups and hydroxyl groups, has few side reactions, and quantitatively forms amide bonds and ester bonds. N-hydroxysuccinimide also has the advantage of low toxicity when decomposed in aqueous solution.

N−ヒドロキシスクシンイミドを担体に導入する方法としては、カルボン酸を担体に導入した後、それを適当な縮合剤とN−ヒドロキシスクシンイミドとを混合することによりカルボン酸をN−ヒドロキシスクシンイミド活性化する方法が考えられる。縮合剤の種類は限定しないが、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、1−エチル―3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドなど様々な縮合剤が使用可能である。100%水溶液中では反応は進行しにくいため、溶媒としては有機溶媒、中でも非プロトン性の有機溶媒がより好ましい。   As a method of introducing N-hydroxysuccinimide into a carrier, a method of activating N-hydroxysuccinimide by introducing a carboxylic acid into the carrier and then mixing it with a suitable condensing agent and N-hydroxysuccinimide. Can be considered. Although the kind of condensing agent is not limited, various condensing agents such as dicyclohexylcarbodiimide, diisopropylcarbodiimide, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide can be used. Since the reaction does not easily proceed in a 100% aqueous solution, the solvent is preferably an organic solvent, and more preferably an aprotic organic solvent.

カルボン酸を導入する方法としてカルボン酸を有する分子を担体に固定化する方法やポリメチルメタクリレート(pMMA)を加水分解する方法が挙げられる。カルボン酸を有する分子を固定化するには、例えばエピクロロヒドリンやビスエポキシドを用いてエポキシ基を導入した活性化担体に分子内にアミノ基とカルボン酸を有する分子を、アミノ基を介して固定化することにより、カルボン酸を導入できる。アミノ基とカルボン酸を有する分子とはアミノ酸など様々な分子が考えられるが、分子内にアミノ基を2つ以上、カルボン酸を2つ以上有する分子は、N−ヒドロキシスクシンイミドを導入する反応時に担体同士のクロスリンクが生じる可能性があることから、望ましくない。担体表面から遠ざけるリンカーとしての役割もあることから、直鎖状の分子、例えばアミノカプロン酸が好ましい。またポリメチルメタクリレートは側鎖にカルボン酸エステルを有する重合体であるため、アルカリでカルボン酸メチルエステル加水分解すると担体側にはカルボン酸が提示された形となり、担体にカルボン酸を導入可能である。本発明においてカルボン酸を導入する方法は限定されず、どのような方法においてカルボン酸が導入された担体であっても、本発明に記載したエポキシ導入量は、N−ヒドロキシスクシンイミドを導入することは可能である。   Examples of a method for introducing a carboxylic acid include a method for immobilizing a molecule having a carboxylic acid on a carrier and a method for hydrolyzing polymethyl methacrylate (pMMA). In order to immobilize a molecule having a carboxylic acid, for example, an molecule having an amino group and a carboxylic acid in the molecule is introduced into an activated carrier into which an epoxy group has been introduced using epichlorohydrin or bisepoxide via the amino group. Carboxylic acid can be introduced by immobilization. A molecule having an amino group and a carboxylic acid may be various molecules such as amino acids, but a molecule having two or more amino groups and two or more carboxylic acids in the molecule is a carrier during the reaction for introducing N-hydroxysuccinimide. This is undesirable because there is a possibility of cross-linking between each other. A linear molecule such as aminocaproic acid is preferred because it also serves as a linker away from the carrier surface. Since polymethyl methacrylate is a polymer having a carboxylic acid ester in the side chain, hydrolysis of the carboxylic acid methyl ester with alkali results in a form in which the carboxylic acid is presented on the carrier side, and the carboxylic acid can be introduced into the carrier. . The method for introducing a carboxylic acid in the present invention is not limited, and the amount of epoxy introduced in the present invention is such that N-hydroxysuccinimide is introduced regardless of the method in which the carboxylic acid is introduced. Is possible.

本発明において活性基量は限定されないが、水に膨潤した担体1mLあたり1〜10,000μmol活性基量がアフィニティ担体の使用上好ましい。目的外の物質による非特異吸着の点から、水に膨潤した担体1mLあたり10〜5,000μmol活性基量が、より好ましい。活性基量は用途に応じ、活性基導入反応の諸条件(活性基導入剤の添加量・アルカリ量・反応温度・反応時間など)を最適化し、適宜調節することができる。   In the present invention, the amount of active groups is not limited, but an amount of active groups of 1 to 10,000 μmol per mL of carrier swollen in water is preferable for use of the affinity carrier. From the viewpoint of non-specific adsorption by a non-target substance, an amount of 10 to 5,000 μmol active groups per mL of carrier swollen in water is more preferable. The amount of the active group can be appropriately adjusted by optimizing various conditions of the active group introduction reaction (addition amount of active group introduction agent, alkali amount, reaction temperature, reaction time, etc.) according to the use.

本発明に記載したN−ヒドロキシスクシンイミド導入量は、次の方法によって求められる。N−ヒドロキシスクシンイミドを導入した担体をある一定量、例えば6mL測り取り、グラスフィルター上、減圧下で15分、水分除去する。適量を測り取り、そこにアンモニア水溶液を加え、上清の吸光度よりN−ヒドロキシスクシンイミドの量を求めることができる。   The amount of N-hydroxysuccinimide introduced in the present invention is determined by the following method. A fixed amount, for example, 6 mL of a carrier into which N-hydroxysuccinimide has been introduced is measured, and water is removed on a glass filter under reduced pressure for 15 minutes. An appropriate amount is measured, an aqueous ammonia solution is added thereto, and the amount of N-hydroxysuccinimide can be determined from the absorbance of the supernatant.

N−ヒドロキシスクシンイミドを導入した担体へのリジンの固定化条件は、例えば、水溶液中、pH9以下の条件下で反応させることが好ましい。pHが9より高いとリジンのεアミノ基を介して固定化される割合が高くなること、また、N−ヒドロキシスクシンイミドの失活速度が速くなることから、クリングル配列を有する蛋白質またはペプチドの除去性能や精製効率が大きく低下する。pHが9以下であれば、リジンのαアミノ基を介して固定化される割合が高くなること、また、N−ヒドロキシスクシンイミドの失活速度が遅くなり、クリングル配列を有する蛋白質またはペプチドの除去性能や精製効率が高くなることから、pHが9以下の条件下で、N−ヒドロキシスクシンイミドが導入された活性化担体とリジンを接触させることが好ましい。pHは炭酸、ホウ酸、リン酸などの緩衝液を用いてpH調整を行うとよい。反応温度は適宜選べばよいが、通常は0℃〜80℃程度であり、反応時間は1分以上から48時間が好ましい。   As conditions for immobilizing lysine on a carrier into which N-hydroxysuccinimide has been introduced, for example, it is preferable to carry out the reaction in an aqueous solution under a pH of 9 or less. When the pH is higher than 9, the rate of immobilization via the ε-amino group of lysine increases, and the deactivation rate of N-hydroxysuccinimide increases, so that the removal performance of a protein or peptide having a kringle sequence And purification efficiency is greatly reduced. If the pH is 9 or less, the rate of immobilization through the α-amino group of lysine is increased, the deactivation rate of N-hydroxysuccinimide is decreased, and the removal performance of a protein or peptide having a kringle sequence Since the purification efficiency becomes high, it is preferable to contact the lysine with the activated carrier into which N-hydroxysuccinimide is introduced under the condition of pH 9 or less. The pH may be adjusted using a buffer solution such as carbonic acid, boric acid, and phosphoric acid. The reaction temperature may be appropriately selected, but is usually about 0 ° C. to 80 ° C., and the reaction time is preferably 1 minute to 48 hours.

このようにして得られるリジンが固定化されたアフィニティ担体は、非常に安定な共有結合により結合されており、熱的にも安定である。高圧蒸気滅菌が可能であり、滅菌後のリガンド溶出やそれに伴う求める性能低下も生じない。熱滅菌以外の方法に関して、エチレンオキサイドガスによる滅菌も可能である。以上より、医療用途としても大変優れた性能を有している。   The thus obtained affinity carrier on which lysine is immobilized is bound by a very stable covalent bond and is also thermally stable. High-pressure steam sterilization is possible, and the ligand elution after sterilization and the required performance degradation associated therewith do not occur. For methods other than heat sterilization, sterilization with ethylene oxide gas is also possible. From the above, it has excellent performance for medical use.

本発明におけるプラスミノゲンをはじめとするクリングル配列を有する蛋白質やペプチドの除去方法、精製方法とは、目的外の夾雑成分が混在するクリングル配列を有する蛋白質溶液またはペプチド溶液から目的とするクリングル配列を有する蛋白質やペプチドを除去すること、または、精製することを言う。例えば、クリングル配列を有する蛋白質またはペプチドが病因関連物質であった場合、血液などの体液から除去することにより疾患を治療することが可能である。また、クリングル配列を有する蛋白質またはペプチドが薬剤として用いられる場合、ヒト体液から精製し高純度の天然型蛋白質製剤として用いたり、菌による蛋白質産生培養液から精製し高純度の蛋白質製剤として用いたりする際の精製工程で用いることも可能である。   The method for removing and purifying proteins and peptides having a kringle sequence such as plasminogen in the present invention is a protein having a kringle sequence from a protein solution or peptide solution having a kringle sequence mixed with undesired contaminant components. And removal or purification of peptides. For example, when a protein or peptide having a kringle sequence is a pathogenesis-related substance, the disease can be treated by removing it from a body fluid such as blood. In addition, when a protein or peptide having a kringle sequence is used as a drug, it is purified from a human body fluid and used as a high-purity natural protein preparation, or purified from a protein-producing culture medium using bacteria and used as a high-purity protein preparation. It can also be used in the purification step.

クリングル配列を有する蛋白質やペプチドの除去方法に関しては、夾雑成分が混在するクリングル配列を有する蛋白質溶液またはペプチド溶液を、本発明におけるアフィニティ担体と接触させることにより実現できる。接触させる方法は本発明のアフィニティ担体をカラムに充填して使用しても良く、バッチ接触させる方法でも良く、接触方法は問わない。カラムに充填して接触させる方法とは、液の入口・出口を有し、かつ担体の容器外への流出防止具を備えた容器内に、前記担体を充填した装置を作製し、装置の入口から夾雑成分が混在するクリングル配列を有する蛋白質溶液またはペプチド溶液を流し、出口から溶液を採取することによりクリングル配列を有する蛋白質またはペプチドが除去された溶液が得られる。バッチ接触とは前記カラムへ充填せず、容器中で前記アフィニティ担体と夾雑成分が混在するクリングル配列を有する蛋白質溶液またはペプチド溶液を混合した後、溶液成分のみを採取することによりクリングル配列を有する蛋白質またはペプチドが除去された溶液が得られる。   The method for removing a protein or peptide having a kringle sequence can be realized by bringing a protein solution or peptide solution having a kringle sequence mixed with contaminating components into contact with the affinity carrier in the present invention. The contacting method may be used by filling the column with the affinity carrier of the present invention, or may be a batch contacting method, and the contacting method is not limited. The method of packing and contacting the column is to prepare an apparatus filled with the carrier in a container having an inlet / outlet of liquid and a device for preventing the carrier from flowing out of the container, and the inlet of the apparatus A solution from which the protein or peptide having the kringle sequence is removed is obtained by flowing a protein solution or peptide solution having a kringle sequence mixed with contaminating components and collecting the solution from the outlet. Batch contact means that a protein having a kringle sequence is collected by mixing only a solution component after mixing a protein solution or peptide solution having a kringle sequence in which the affinity carrier and contaminant components are mixed in a container without filling the column. Alternatively, a solution from which the peptide has been removed is obtained.

クリングル配列を有する蛋白質やペプチドの精製方法に関しても、除去方法と同様に本発明におけるアフィニティ担体と夾雑成分が混在するクリングル配列を有する蛋白質溶液またはペプチド溶液とを接触させることにより実現できる。接触方法は前記と同じであるが、接触後に入口側または出口側から適当な溶液を用いてアフィニティ担体を洗浄した後に、溶出液を用いてアフィニティ担体に結合したクリングル配列を有する蛋白質やペプチドを溶出することにより精製可能である。溶出液はアミノカプロン酸を含む溶液、リジンを含む溶液、アルギニン酸を含む溶液、トラネキサム酸を含む溶液、p−アミノベンズアミジンを含む溶液であり、前記を混合して用いても良い。さらに溶出液の濃度も限定されるものではなく、目的に応じて選定すればよい。これは除去方法または精製方法の一例であり、使用方法は限定されない。   The method for purifying a protein or peptide having a kringle sequence can also be realized by bringing a protein solution or peptide solution having a kringle sequence mixed with an affinity carrier in the present invention and a contaminating component, in the same manner as the removing method. The contact method is the same as above, but after washing the affinity carrier with an appropriate solution from the inlet side or the outlet side after contact, the protein or peptide having a kringle sequence bound to the affinity carrier is eluted with the eluate. By doing so, it can be purified. The eluent is a solution containing aminocaproic acid, a solution containing lysine, a solution containing arginic acid, a solution containing tranexamic acid, or a solution containing p-aminobenzamidine, which may be used in combination. Further, the concentration of the eluate is not limited and may be selected according to the purpose. This is an example of a removal method or a purification method, and the method of use is not limited.

以下、実施例において本発明に関して詳細に述べるが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
(実施例1)
酢酸ビニル45g、トリアリルイシシアヌレート13.95g、ヘプタン23.85g、酢酸エチル38.79g、ポリ酢酸ビニル(重合度400)4.32g、および、重合開始剤2,2’−アゾビス(2,4−ジメチルバレロニトリル)(V−65)2.25gよりなる均一混合液を、ポリビニルアルコール4g、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウム0.9g、微粒子状の第三リン酸カルシウム62g、亜硝酸ナトリウム0.8gを溶解した水773mLを含む水相があらかじめ仕込まれた、平板状の撹拌翼と2枚の邪魔板を有する2Lセパラブルフラスコ中に添加し、65℃で5時間反応させた。
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates in detail regarding this invention, this invention is not limited only to a following example.
Example 1
45 g vinyl acetate, 13.95 g triallylic isocyanurate, 23.85 g heptane, 38.79 g ethyl acetate, 4.32 g polyvinyl acetate (degree of polymerization 400), and polymerization initiator 2,2′-azobis (2, 4-dimethylvaleronitrile) (V-65) 2.25 g of a homogeneous mixed solution dissolves 4 g of polyvinyl alcohol, 0.9 g of sodium alpha olefin sulfonate, 62 g of fine calcium triphosphate and 0.8 g of sodium nitrite. The mixture was added to a 2 L separable flask having a flat stirring blade and two baffle plates in which an aqueous phase containing 773 mL of water was charged in advance, and reacted at 65 ° C. for 5 hours.

次いでセパラブルフラスコの内容物に塩酸を加えてpHを2以下に調整し第三リン酸カルシウムを溶解させ、その後水で良く洗浄した。洗浄液のpHが中性付近になったことを確認した後、水をアセトンで置換し、重合物をアセトンで十分に洗浄した。次いでアセトンを水で置換した後、酢酸ビニル単位に対して過剰量となるよう下式の量の水酸化ナトリウム(NaOH)を水溶液として加えた。   Next, hydrochloric acid was added to the contents of the separable flask to adjust the pH to 2 or less to dissolve the tribasic calcium phosphate, and then washed well with water. After confirming that the pH of the cleaning liquid was close to neutral, water was replaced with acetone, and the polymer was thoroughly washed with acetone. Next, acetone was replaced with water, and then an amount of sodium hydroxide (NaOH) of the following formula was added as an aqueous solution so as to be an excess amount with respect to the vinyl acetate unit.

NaOH(固形分重量)=粒子乾燥重量/86.09×40×1.5
なお水に対するNaOH濃度が4重量%になるように水量は調整した。これを撹拌下、反応温度40℃で6時間保持して鹸化を行った。その後、洗浄液のpHが中性付近になるまで水洗し、さらに80℃の温水で十分に洗浄を行った。次いで121℃、20分間のオートクレーブ処理を行い、清浄な架橋ポリマー担体を得た。
NaOH (solid weight) = particle dry weight / 86.09 × 40 × 1.5
The amount of water was adjusted so that the NaOH concentration relative to water was 4% by weight. This was saponified with stirring at a reaction temperature of 40 ° C. for 6 hours. Then, it washed with water until pH of the washing | cleaning liquid became neutrality, and also wash | cleaned fully with 80 degreeC warm water. Next, autoclave treatment at 121 ° C. for 20 minutes was performed to obtain a clean crosslinked polymer carrier.

この架橋ポリマー担体151gに、ジメチルスルホキシド(DMSO)233mL、30%NaOH19.4mL、エピクロロヒドリン156mLを加えて、40℃で5時間反応させた。DMSO0.6L、水3.0Lで洗浄することで、エポキシ活性化担体を得た。このエポキシ活性化担体のエポキシ量を測定したところ32μmol/mLであった。   To 151 g of this crosslinked polymer carrier, 233 mL of dimethyl sulfoxide (DMSO), 19.4 mL of 30% NaOH, and 156 mL of epichlorohydrin were added and reacted at 40 ° C. for 5 hours. The epoxy activated carrier was obtained by washing with 0.6 L of DMSO and 3.0 L of water. The epoxy amount of this epoxy activated carrier was measured and found to be 32 μmol / mL.

上で得たエポキシ活性化担体160mLに水94mL、2M炭酸ナトリウム水溶液40.0mL、2Mアミノカプロン酸水溶液25.6mLを加え、50℃で5時間反応させた。このスラリーを水3.2Lで洗浄することでアミノカプロン酸固定化担体を得た。滴定によりアミノカプロン酸固定化担体のアミノカプロン酸固定化量を測定したところ42μmol/mLであった。   To 160 mL of the epoxy activated carrier obtained above, 94 mL of water, 40.0 mL of 2M aqueous sodium carbonate solution and 25.6 mL of 2M aqueous aminocaproic acid solution were added and reacted at 50 ° C. for 5 hours. The slurry was washed with 3.2 L of water to obtain an aminocaproic acid immobilized carrier. When the amount of aminocaproic acid immobilized on the aminocaproic acid-immobilized carrier was measured by titration, it was 42 μmol / mL.

このアミノカプロン酸固定化担体98mLをDMSO245mLで洗浄し、洗浄した担体にDMSO94mL、NHS12.6g、EDC21.0gを加え、40℃で10時間反応させた。このスラリーをDMSO2.0Lで、IPA0.3Lで洗浄することでNHS活性化担体を得た。このNHS活性化担体のNHS量は19μmol/mLであった。   98 mL of this aminocaproic acid-immobilized support was washed with 245 mL of DMSO, and 94 mL of DMSO, 12.6 g of NHS and 21.0 g of EDC were added to the washed support and reacted at 40 ° C. for 10 hours. This slurry was washed with 2.0 L of DMSO and 0.3 L of IPA to obtain an NHS activated carrier. The NHS amount of this NHS activated carrier was 19 μmol / mL.

上で得たNHS活性化担体4.0mLを氷冷1mM塩酸20mLで洗浄し、洗浄した担体に1mM塩酸3.6mL、IPA0.44mL、(0.4M炭酸水素ナトリウム+1M塩化ナトリウム)水溶液(pH7.5)4.0mL、2Mリジン水溶液0.1mL、水0.66mLを加え、5℃で3.5時間反応させた。このスラリーを水40mLで洗浄することでリジン固定化担体(担体A)を得た。固定化反応後の上清中のリジン濃度より、担体Aのリジン固定化量は17μmol/mLであった。   4.0 mL of the NHS-activated carrier obtained above was washed with 20 mL of ice-cold 1 mM hydrochloric acid, and 3.6 mL of 1 mM hydrochloric acid, 0.44 mL of IPA, (0.4 M sodium bicarbonate + 1 M sodium chloride) aqueous solution (pH 7. 5) 4.0 mL, 2 M lysine aqueous solution 0.1 mL, and water 0.66 mL were added, and it was made to react at 5 degreeC for 3.5 hours. The slurry was washed with 40 mL of water to obtain a lysine-immobilized carrier (Carrier A). Based on the lysine concentration in the supernatant after the immobilization reaction, the amount of carrier A immobilized on lysine was 17 μmol / mL.

上で得た担体Aの0.5mLを生理食塩水に置換した後、クエン酸で抗凝固した血漿を2.5mL添加し、室温で10分間攪拌した。次にアミノカプロン酸固定化担体が混入しないように攪拌の血漿2.5mLを採取した。処理前の血漿中のプラスミノゲン濃度、攪拌後の血漿中のプラスミノゲン濃度よりプラスミノゲンの除去率を算出したところ、攪拌前の76%が除去されていることが確認された。次に、リン酸緩衝液で担体を十分に洗浄した後、上清を出来るだけ除去し、0.01Mのアミノカプロン酸溶液を添加し、室温で6分間攪拌した。担体が混入しないように上清を回収した。   After substituting 0.5 mL of the carrier A obtained above with physiological saline, 2.5 mL of plasma coagulated with citric acid was added and stirred at room temperature for 10 minutes. Next, 2.5 mL of stirred plasma was collected so that the aminocaproic acid-immobilized carrier was not mixed. When the plasminogen removal rate was calculated from the plasminogen concentration in the plasma before treatment and the plasminogen concentration in the plasma after stirring, it was confirmed that 76% before the stirring was removed. Next, after thoroughly washing the carrier with a phosphate buffer, the supernatant was removed as much as possible, a 0.01 M aminocaproic acid solution was added, and the mixture was stirred at room temperature for 6 minutes. The supernatant was collected so as not to contaminate the carrier.

回収液を電気泳動した所、目的とする分子量領域に単一バンドが検出され、その純度はほぼ100%であることが確認された。また、処理前の血漿中のプラスミノゲン濃度、回収液中のプラスミノゲン濃度からプラスミノゲンの回収率を算出したところ、精製されたプラスミノゲンの回収率は29%であった。
(実施例2)
実施例1と同様にしてNHS活性化担体を得た後、同様の方法でpH8.0でリジンを固定化し、リジン固定化担体(担体B)を得た。同様の方法でプラスミノゲンを精製した。担体Bのリジン固定化量は14μmol/mLであった。同様に、回収液を電気泳動した所、目的とする分子量領域に単一バンドが検出され、その純度はほぼ100%であることが確認された。またプラスミノゲンの除去率は75%、回収率は31%であった。
(実施例3)
実施例1と同様にしてNHS活性化担体を得た後、同様の方法でpH8.5でリジンを固定化し、リジン固定化担体(担体C)を得た。同様の方法でプラスミノゲンを精製した。担体Cのリジン固定化量は17μmol/mLであった。同様に、回収液を電気泳動した所、目的とする分子量領域に単一バンドが検出され、その純度はほぼ100%であることが確認された。またプラスミノゲンの除去率は73%、回収率は27%であった。
(比較例1)
実施例1と同様にしてNHS活性化担体を得た後、同様の方法でpH9.5でリジンを固定化し、リジン固定化担体(担体D)を得た。同様の方法でプラスミノゲンを精製した。担体Dのリジン固定化量は16μmol/mLであった。同様に、回収液を電気泳動した所、目的とする分子量領域に単一バンドが検出され、その純度はほぼ100%であることが確認されたが、プラスミノゲンの除去率は61%、回収率は9%であった。
When the recovered solution was electrophoresed, a single band was detected in the target molecular weight region, and the purity was confirmed to be almost 100%. Further, when the recovery rate of plasminogen was calculated from the plasminogen concentration in plasma before treatment and the plasminogen concentration in the recovery solution, the recovery rate of purified plasminogen was 29%.
(Example 2)
After obtaining an NHS-activated carrier in the same manner as in Example 1, lysine was immobilized at pH 8.0 by the same method to obtain a lysine-immobilized carrier (carrier B). Plasminogen was purified by the same method. The amount of lysine immobilized on carrier B was 14 μmol / mL. Similarly, when the recovered solution was electrophoresed, a single band was detected in the target molecular weight region, and the purity was confirmed to be almost 100%. The plasminogen removal rate was 75%, and the recovery rate was 31%.
(Example 3)
After obtaining an NHS-activated carrier in the same manner as in Example 1, lysine was immobilized at pH 8.5 by the same method to obtain a lysine-immobilized carrier (carrier C). Plasminogen was purified by the same method. The amount of lysine immobilized on carrier C was 17 μmol / mL. Similarly, when the recovered solution was electrophoresed, a single band was detected in the target molecular weight region, and the purity was confirmed to be almost 100%. The plasminogen removal rate was 73%, and the recovery rate was 27%.
(Comparative Example 1)
After obtaining an NHS-activated carrier in the same manner as in Example 1, lysine was immobilized at pH 9.5 in the same manner to obtain a lysine-immobilized carrier (carrier D). Plasminogen was purified by the same method. The amount of lysine immobilized on carrier D was 16 μmol / mL. Similarly, when the recovered solution was electrophoresed, a single band was detected in the target molecular weight region, and it was confirmed that the purity was almost 100%, but the plasminogen removal rate was 61% and the recovery rate was It was 9%.

実施例および比較例におけるプラスミノゲンの精製結果を表1に示す。   Table 1 shows the results of purification of plasminogen in Examples and Comparative Examples.

Figure 0005836577
Figure 0005836577

Claims (16)

クリングル配列を有する蛋白質またはペプチドを精製または除去するためのアフィニティ担体を製造するための方法であって、該担体の作製においてN−ヒドロキシスクシンイミドの導入により活性化された活性化担体リジンを接触させてリジンを固定化する際の溶液中のpH9以下とすることを特徴とする方法A method for manufacturing an affinity carrier for purifying or removing protein or peptide having a kringle sequence, is contacted with lysine activated activated carrier with the introduction of N- hydroxysuccinimide in the preparation of the carrier method characterized by Te to the pH of the solution to 9 or less at the time of fixing the lysine. リジンが共有結合で固定化された請求項1記載の方法The method according to claim 1, wherein lysine is immobilized by a covalent bond. N−ヒドロキシスクシンイミドがリンカーを介して導入されていることを特徴とする請求項1または2に記載の方法The method according to claim 1 or 2, wherein N-hydroxysuccinimide is introduced via a linker. リンカーが、分子内にアミノ基とカルボン酸をそれぞれ1つ有する分子である請求項3に記載の方法The method according to claim 3, wherein the linker is a molecule having one amino group and one carboxylic acid in the molecule. アフィニティ担体がポリビニルアルコールからなることを特徴とする請求項1から4のいずれかに記載の方法The method according to claim 1, wherein the affinity carrier comprises polyvinyl alcohol. ポリビニルアルコールが架橋されていることを特徴とする請求項5記載の方法6. The method of claim 5, wherein the polyvinyl alcohol is cross-linked. アフィニティ担体が多孔質の水不溶性担体であることを特徴とする請求項1から6のいずれかに記載の方法The method according to claim 1, wherein the affinity carrier is a porous water-insoluble carrier. 多孔質の水不溶性担体が粒子状であることを特徴とする請求項7記載の方法8. The method according to claim 7, wherein the porous water-insoluble carrier is in the form of particles. クリングル配列を有する蛋白質またはペプチドが、プラスミノゲン、プラスミン、アンジオスタチン、アポリポプロテイン(a)、組織プラスミノゲン活性化因子、ウロキナーゼ、肝細胞増殖因子、NK4、プロトロンビン、第XII因子またはこれらの部分ペプチド
から選択される少なくとも一種以上の蛋白質またはペプチドであることを特徴とする請求項1から8のいずれかに記載の方法
The protein or peptide having a kringle sequence is selected from plasminogen, plasmin, angiostatin, apolipoprotein (a), tissue plasminogen activator, urokinase, hepatocyte growth factor, NK4, prothrombin, factor XII or partial peptides thereof The method according to claim 1, wherein the method is at least one protein or peptide.
クリングル配列を有する蛋白質またはペプチドがプラスミノゲン、アンジオスタチンまたは、その部分ペプチドであることを特徴とする請求項9記載の方法The method according to claim 9, wherein the protein or peptide having a kringle sequence is plasminogen, angiostatin, or a partial peptide thereof. クリングル配列を有する蛋白質またはペプチドがプラスミノゲンであることを特徴とする請求項10記載の方法The method according to claim 10, wherein the protein or peptide having a kringle sequence is plasminogen. 請求項1から11のいずれかに記載の方法で製造されたアフィニティ担体を、夾雑成分の混在するクリングル配列を有する蛋白質溶液またはペプチド溶液と接触させることを特徴とする、該担体を用いたクリングル配列を有する蛋白質またはペプチドの精製方法、及びクリングル配列を有する蛋白質またはペプチドの除去方法。 A kringle sequence using the carrier, wherein the affinity carrier produced by the method according to any one of claims 1 to 11 is brought into contact with a protein solution or a peptide solution having a kringle sequence mixed with contaminating components. And a method for removing a protein or peptide having a kringle sequence. 請求項1から11のいずれかに記載の方法で製造されたアフィニティ担体を夾雑成分の混在するクリングル配列を有する蛋白質溶液またはペプチド溶液と接触しクリングル配列を有する蛋白質を選択的に吸着させた後、吸着したクリングル配列を有する蛋白質またはペプチドを該担体から解離、回収することを特徴とするクリングル配列を有する蛋白質またはペプチドの精製方法。 After the affinity carrier produced by the method according to any one of claims 1 to 11 is brought into contact with a protein solution or peptide solution having a kringle sequence mixed with contaminating components and a protein having a kringle sequence is selectively adsorbed, A method for purifying a protein or peptide having a kringle sequence, which comprises dissociating and recovering the adsorbed protein or peptide having a kringle sequence from the carrier. 選択的に吸着したクリングル配列を有する蛋白質またはペプチドを、溶出液を用いて解離、回収することを特徴とする請求項13記載の精製方法。   14. The purification method according to claim 13, wherein the protein or peptide having a selectively adsorbed kringle sequence is dissociated and recovered using an eluate. 溶出液がアミノカプロン酸を含む溶液、リジンを含む溶液、アルギニン酸を含む溶液、トラネキサム酸を含む溶液、p−アミノベンズアミジンを含む溶液から選ばれる少なくとも一種類以上の溶出液を用いた請求項14記載の精製方法。   15. The eluent used is at least one eluent selected from a solution containing aminocaproic acid, a solution containing lysine, a solution containing arginic acid, a solution containing tranexamic acid, and a solution containing p-aminobenzamidine. The purification method as described. 夾雑成分の混在するクリングル配列を有する蛋白質溶液またはペプチドが、血液や血漿などの体液、動物組織抽出物、培養液、及びそれらを前処理した溶液であることを特徴とする請求項12から15のいずれかに記載のクリングル配列を有する蛋白質またはペプチドの精製方法または除去方法。   The protein solution or peptide having a kringle sequence mixed with contaminating components is a body fluid such as blood or plasma, an animal tissue extract, a culture solution, or a solution obtained by pretreating them. A method for purifying or removing a protein or peptide having any of the kringle sequences.
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