JP5731748B2 - 卵割球の分裂および運動に基づく胚品質の評価 - Google Patents
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Description
本発明は、観察した細胞分裂ならびに関連する細胞運動および細胞小器官運動の時期、継続期間、空間的分布および程度を基に、体外受精後の移植に最適な胚の選択を容易にする方法およびシステムに関する。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する:
(項目1)
胚品質を判定するための方法であって、一定期間にわたってこの胚をモニタリングする工程であって、この一定期間が少なくとも1つの細胞分裂期と分裂間期の少なくとも一部とを含むのに十分な長さを有する、工程と、i)この少なくとも1つの細胞分裂期の長さを判定する工程、および/またはii)この細胞分裂期の間の細胞運動または細胞小器官運動の程度および/または空間的分布を判定する工程、および/またはiii)分裂間期の継続期間を判定する工程、および/またはiv)この分裂間期の間の細胞運動または細胞小器官運動の程度および/または空間的分布を判定する工程とを含み、それによって胚品質の指標を得る、方法。
(項目2)
上記胚が、少なくとも2つの細胞分裂期を含む一定期間にわたってモニタリングされる、項目1に記載の方法。
(項目3)
上記胚が、少なくとも3つの細胞分裂期を含む一定期間にわたってモニタリングされる、項目1に記載の方法。
(項目4)
各細胞分裂期の長さが判定される、項目1〜3のいずれか一項に記載の方法。
(項目5)
各分裂間期の長さが判定される、項目1〜4のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
少なくとも2つの分裂間期における細胞運動の期間が判定される、項目1〜5のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
少なくとも2つの分裂間期における細胞運動の程度が判定される、項目1〜6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
上記少なくとも2つの分裂間期が、連続した分裂間期である、項目6または7に記載の方法。
(項目9)
上記少なくとも1つの細胞分裂期の長さの判定と、上記分裂間期の間の細胞運動の判定とが実施される、項目1〜8のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
上記少なくとも1つの細胞分裂期の長さの判定と、上記分裂間期の間の細胞運動の期間の判定とが実施される、項目1〜9のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
上記少なくとも1つの細胞分裂期の長さの判定と、上記分裂間期の間の細胞運動の判定と、この分裂間期の間の細胞運動の期間の判定とが実施される、項目1〜10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
移植に好適な胚を選択するための方法であって、項目1〜11のいずれか一項に記載の胚をモニタリングする工程と、胚品質の指標を得る工程と、最高胚品質の指標を有する胚を選択する工程とを含む、方法。
(項目13)
一定期間にわたって胚をモニタリングするための手段を含む胚品質を判定するためのシステムであって、この一定期間が少なくとも1つの細胞分裂期と分裂間期の少なくとも一部とを含むのに十分な長さを有し、このシステムは、さらに、この少なくとも1つの細胞分裂期の長さを判定する、および/またはこの分裂間期の間の細胞運動を判定する、および/または分裂間期の間の細胞運動の期間の長さを判定するための手段と、この細胞分裂期およびこの分裂間期におけるこの判定を基に胚品質の指標を判定するための手段とを有する、システム。
(項目14)
項目1〜11のいずれか一項に記載の特徴の1つ以上を判定するための手段を含む、項目13に記載のシステム。
細胞分裂期:(細胞質分裂の開始を示す)細胞膜のへこみが最初に観察されてから、細胞質の細胞分裂が完了して、その後の娘細胞の細胞質が2つの別個の細胞に分離するまでの期間。
胚はほぼ球形をしており、透明帯として知られる無細胞マトリックスであるゼラチン状の外皮で覆われた1つ以上の細胞(卵割球)で構成される。透明帯は、胚が孵化するまで種々の機能を発揮し、胚評価に好適な指標である。透明帯は球形で半透明をしており、細胞残屑と明確に区別できなければならない。
本発明は、i)少なくとも1つの細胞分裂期の継続期間、および/またはii)細胞分裂期の間の細胞運動または細胞小器官運動の程度および/または空間的分布、および/またはiii)分裂間期の継続期間、および/またはiv)分裂間期の間の細胞運動または細胞小器官運動の程度および/または空間的分布を判定して、それにより胚品質の指標を得る工程など、1つ以上の胚の判定に基づく胚品質の測定値[上記の胚品質の測定値の定義を参照]を提供する。
a)実際の細胞質分裂が急速に進行し、他の卵割球位置のその後の再配置が急速に起こる急激な細胞分裂(例えば、卵割球活性のピークの幅が狭い場合)は、高品質の胚であることを示し、細胞質分裂の継続期間が長期にわたり、他の卵割球のその後の空間的再配置(すなわち、細胞運動)が広範囲に及ぶ場合は、低品質の胚であることを示す(例えば、卵割球活性のピークの幅が広い場合)。(実施例1)
b)細胞分裂間の卵割球位置の再配置がほとんど見られない場合は、高品質の胚であることを示すのに対し、可視できる細胞分裂間に運動が見られる場合は、低品質の胚であることを示すことが多い。(実施例1)
c)細胞分裂間の細胞位置の再配置が長期にわたる場合(例えば、卵割球活性のピークの幅が広い場合)は、低い胚品質、非同期の細胞分裂、および広範な断片化を伴うことが多い。(実施例1)
d)胚ゲノムが活性化され、タンパク質の合成が母性転写から胚性転写に切り換わる際には、細胞運動がほとんど見られない静止期間がほとんどの哺乳類で認められる。この期間において、i)開始が早く、ii)活性がきわめて低く(=細胞運動がほとんど見られない=静止している)、およびiii)終了が早い場合には、高品質の胚であることを強く示す。低品質の胚では、静止期間の開始が遅れることが多く、その期間が細胞運動により中断されることがある。低品質の胚はまた、検出可能な細胞分裂が見られない「静止」期間に細胞運動の基線レベルの上昇を示す場合もある。(実施例2)
e)それ以降の発育が止まる低品質の胚では、常に静止した特定の領域が認められることが多く、この状態が続くと最終的には発育の停止につながる。このような静止領域には、広範な断片化や卵割球の死亡および溶解を伴う場合がある。これらの領域が所定の発育段階で所定の割合よりも大きいと、胚が生存する可能性がきわめて低くなる。高品質の胚では、各細胞質分裂事象の後にしばらく生じる細胞運動性が、最初に胚表面全体に広がり(すなわち、すべての卵割球がわずかに動く)、桑実期の緊密化後にのみ局所的な運動が見られる(実施例3)。
f)発育可能な高品質の胚では、細胞小器官運動の均一な空間的分布が一般的に見られるのに対して、低品質の胚では、運動性が見られない「死亡」区域が見られることが多い。類似の観察が細胞運動についても行われているが、細胞運動の空間的な均一性を判定するには、より長い時間枠での観察が必要となる(実施例3)。
g)種々の時間間隔における細胞運動量は、胚品質を示す良い指標である。品質に関連するパラメータは、種々の時間区分における平均運動の比率から、および/または種々の時間区分における標準偏差の比率から計算することができる。これらのパラメータの値に基づき、胚の選択工程を確立することができる(実施例4)。
h)細胞運動性および細胞小器官運動性の基線レベルの緩徐なまたは急激な低下は、低い胚品質や、発育停止の高い可能性を伴うことが多い。基線レベルの変化は、不活性区域/領域の出現を伴う場合がある(上記の(e)および(f)を参照)。(実施例6)
i)最初の細胞分裂の開始が早い場合は、胚品質が高いことを示す。最初(およびそれ以降)の細胞分裂の開始が遅い場合は、低品質の胚であることを示す。しかし、ほとんどの胚の場合、最初の細胞分裂の正確な開始だけでは、胚品質の明確な指標とはならない(実施例4)。
j)細胞運動および細胞小器官運動を説明する得られたパラメータのほとんどでは、正常範囲から外れる値(例えば、異常に高い値や異常に低い値)がいずれも胚品質が低いことを示すように、正常範囲を定義することができる。(実施例6)
k)連続する細胞分裂の間の間隔は、胚の発育能力を示す重要な(および種特異的な)指標である。例としては、1細胞から2細胞への分裂と2細胞から4細胞への分裂の間の間隔と、2細胞から4細胞への分裂と2細胞から8細胞への分裂の間の間隔とを比べた比率が考えられる。これらの間隔の比率は、発育可能な胚では所定の範囲内になければならない。
l)後期の同期細胞分裂(例えば、2細胞→4細胞、4細胞→8細胞)は、主に高品質の胚に見られるのに対して、非同期細胞分裂(例えば、2細胞→3細胞→4細胞→5細胞→6細胞→7細胞→8細胞)は、低品質の胚に見られることが多い(実施例1)。
・細胞分裂期が短い(ここで「短い」とは、2時間未満として定義される)。
・分裂間期に細胞運動がほとんど見られない(ここで「ほとんど見られない」とは、常に差分画像に寄与する通常の周期的変動や細胞小器官運動以外に、細胞位置の変化がほとんど見られないこととして定義される)。細胞運動がほとんど見られないということは、細胞の重心が静止しており(運動量が3μm未満)、細胞質膜がほとんど動かない(運動量が3μm未満)ことを示す。
・最初の細胞分裂期の開始が早い(すなわち、ヒト胚の場合は受精後25時間以前(ウシ胚の場合は受精後30時間以前))。
・分裂間期の間の細胞運動の期間が短い(ここで「短い」とは、3時間未満として定義される)。
・一定期間にわたる透明帯内の細胞運動の均一な分布。すなわち、より長期間(すなわち、24時間超)にわたり細胞運動が見られない、胚の不活性面積/区域/容積の不在。このような静止区域は、卵割球や断片が死亡しているか、死亡しつつあることが原因である可能性があり、これによってさらなる発育が妨げられる場合がある。
・細胞運動性のベースライン値が一定してまたはわずかに上昇している。
・得られたパラメータすべてが、特定の胚の正常範囲内にある。
最終分析工程には、得られた所見と、品質や発育能力の異なる胚の類似の所見とを比較する工程、ならびに所定の胚のパラメータ値と、同じ胚で得た他の定量的測定値とを比較する工程が含まれると考えられる。これには、卵割球運動性、呼吸数、アミノ酸摂取などのオンライン測定値との比較が含まれる場合がある。卵割球運動性分析、呼吸数および他の定量パラメータを組み合わせたデータセットにより、胚の選択が改善され、発生学者が移植に最適な胚を確実に選択できるようになる可能性がある。
好ましい実施形態において、観察は、細胞集団を培地に入れた時など、細胞集団の培養時に行われる。細胞集団を培養する手段は、当該技術分野で既知である。胚培養の例は、PCT公開第2004/056265号に記載されている。
本発明はさらに、デジタル処理装置のメモリに直接ロードすることができるコンピュータプログラムを含み、上述の通りに本発明の方法を実行する手段を構成するコンピュータコード部分を含むデータ媒体に関する。
本発明はさらに、移植用の胚を選択する方法も提供する。本方法は、細胞分裂が発生した時期や、場合によっては細胞死の発生の有無、ならびに細胞分裂の品質や胚の全体的な品質を判定する目的で、上述のように胚の変化を判定するために、胚がモニタリングされていることを示す。実質的に同期の細胞分裂によってはっきりとした差分画像のパラメータが得られる胚を選択するのが好ましく、細胞死を生じない胚を選択するのがより好ましい。
材料および方法:ウシ未熟卵丘卵母細胞複合体(COC)を、屠殺場から入手した卵巣から吸引して、選択し、4ウェルプレート(Nunc、デンマーク ロスキレ)で24時間成熟させた。各ウェルは、15%のウシ血清(CS;Danish Veterinary Institute、デンマーク フレゼリクスベア)、10IU/mLのeCG、および5IU/mLのhCG(Suigonan Vet;Intervet Scandinavia、デンマーク スコルンデ)を補充した、400μLの炭酸水素緩衝TCM‐199培地(Gibco BRL、英国ペイズリー)を含有した。胚は、5%CO2の加湿空気中で、38.5℃にて、鉱油下で成熟させた。受精は、修正タイロード培地中で、凍結融解させてパーコール法で選択した精子を使用して実施した。22時間後、卵丘細胞をボルテックス攪拌により除去した後、抗生物質(硫酸ゲンタマイシン、10mg/mL)と5%のCSを補充したアミノ酸、クエン酸塩およびイノシトールを含む合成卵管液培地(SOFaaci)で構成される400μLの培地に、予定接合子を移し、5%CO2、5%O2、90%N2雰囲気中で、38.5℃にてインキュベートした。
1)画像を取得する(上記の説明を参照)。
2)系列中の全画像から焦点のぼけたアーチファクトの基準画像を差し引くことにより、固定位置のアーチファクト(カメラの埃)を除去する。
3)不正確なステージ移動を補正するために転置する。画像のアラインメントを行うきわめて簡単な方法としては、元の差分画像と、元の差分画像の1つを所定の方向に1ピクセルずらしてから計算した差分画像とを比較する方法がある。転置後に計算した差分画像の分散が元の差分画像の分散よりも低い場合は、転置によってアラインメントが向上したことになる。すべての可能な転置方向とすべての関連する転置規模を系統立てて試みることによって、アラインメントを行った時間系列を得ることが可能となるが、本願の場合は、Thevenaz等が1998年に開発した画像アラインメント用の高度なImageJマクロを使用した。
4)対象領域(ROI)および外部基準区域を特定する。胚内部の細胞運動と、胚外部の「運動」とを比較することは、ブラウン運動のアラインメントの問題などから有利である。これは、胚の輪郭を描画し、胚内部の差分画像と胚外部の類似区域の計算した差分とを比較することにより行われる。胚の輪郭の描画は手動で行った。本発明者等が選択した標準区域は、胚のない画像領域であった。
5)強度差を計算する。
6)各差分画像で得たパラメータを計算する。いくつかの差分パラメータを計算したが、最も有益であることが判明したパラメータは、差分画像の全ピクセルにおける強度の標準偏差であった。このパラメータを以下では「卵割球活性」と呼ぶ。
7)卵割球活性のピークの形状を特定および判定する。
8)診断に適切な時間間隔で卵割球活性の標準偏差および平均値を計算する。実施例4を参照されたい。
発育する胚の微速度画像系列の定性的評価により(基本的には、これらの画像系列を動画として何度も再生して観察し、変化に着目することにより)、本発明者等は以下のことを観察した。まず、高品質の胚の指標は、急激な細胞分裂であり、この分裂では、実際の細胞質分裂が急速に進行して、他の卵割球の位置のその後の再配置が急速に生じ、その後、次の細胞質分裂が急激に始まるまでは細胞位置の再配置がほとんど見られない「静止」期間が続く。それに対し、低品質の胚は、細胞質分裂後や細胞質の細胞分裂間に卵割球位置の長期にわたる再配置を示すことが多い。これらの所見を定量化し、証拠を得るため、本発明者等は、上述のPCT出願に記載の通りに微速度画像系列から卵割球活性を計算した。代表的な卵割球活性を図2に示す。
材料および方法:実施例1と同じ。
哺乳類の胚の最初のタンパク質合成では、卵母細胞に由来する母系mRNAを使用するが、数回の細胞分裂後は胚ゲノムが活性化、転写および翻訳される。母系ゲノムから胚ゲノムへの切り換えは、胚の発育の重要な段階である。ウシの場合は8細胞期にこの期間があり、継続期間が比較的長いが、ヒト胚の場合はこの切り換えがより早期の4〜8細胞期にあり、継続期間もより短い。
材料および方法:実施例1と同じ。
材料および方法:実施例1と同じ。
・R1=所定の胚の胚盤胞活性パターンの部分1および部分3における平均胚盤胞活性間の比率
・R2=所定の胚の胚盤胞活性パターンの部分2および部分3における胚盤胞活性の標準偏差間の比率
計算値を以下の表1に示す。
材料および方法:実施例1と同じ。
材料および方法:実施例1と同じ。
材料および方法:実施例1と同じ。
1 ピーク1の値
2 ピーク1の時間
3 ピーク1の平均値
4 バレー1の値
5 バレー1の時間
6 バレー1の平均値
7 ピーク2の値
8 ピーク2の時間
9 ピーク2の平均値
10 バレー2の値
11 バレー2の時間
12 バレー2の平均値
13 ピーク3の値
14 ピーク3の時間
15 ピーク3の平均値。
16 平均値
17 標準偏差。
18 (ピーク1の平均値−平均値)/(ピーク1の値−平均値)=(P1−P16)/(P3−P16)
19 (ピーク2の平均値−平均値)/(ピーク2の値−平均値)=(P7−P16)/(P9−P16)
20 (ピーク3の平均値−平均値)/(ピーク3の値−平均値)=(P13−P16)/(P15−P16)。
21 (ピーク2の時間−ピーク1の時間)/(ピーク3の時間−ピーク2の時間)=(P8−P2)/(P14−P8)。
全体の平均値
卵割球活性の全体の標準偏差
卵割球活性の全体の最小値
卵割球活性の全体の最大値
区分1の平均値
区分1の標準偏差
区分1のピーク1の値
区分1のピーク1の位置
区分1のピーク1の平均値
区分1のバレー1の値
区分1のバレー1の位置
区分1のバレー1の平均値
区分1のピーク2の値
区分1のピーク2の位置
区分1のピーク2の平均値
区分1のバレー2の値
区分1のバレー2の位置
区分1のバレー2の平均値
区分1のピーク3の値
区分1のピーク3の位置
区分1のピーク3の平均値
区分2の平均値
区分2の標準偏差
区分2のピーク1の値
区分2のピーク1の位置
区分2のピーク1の平均値
区分2のバレー1の値
区分2のバレー1の位置
区分2のバレー1の平均値
区分2のピーク2の値
区分2のピーク2の位置
区分2のピーク2の平均値
区分2のバレー2の値
区分2のバレー2の位置
区分2のバレー2の平均値
区分2のピーク3の値
区分2のピーク3の位置
区分2のピーク3の平均値
区分3の平均値
区分3の標準偏差
区分3のピーク1の値
区分3のピーク1の位置
区分3のピーク1の平均値
区分3のバレー1の値
区分3のバレー1の位置
区分3のバレー1の平均値
区分3のピーク2の値
区分3のピーク2の位置
区分3のピーク2の平均値
区分3のバレー2の値
区分3のバレー2の位置
区分3のバレー2の平均値
区分3のピーク3の値
区分3のピーク3の位置
区分3のピーク3の平均値
区分1のピーク1の比率
区分1のピーク2の比率
区分1のピーク3の比率
区分1の値1と値2の比率。
設計:95個のウシ胚を、7日間一定の温度、湿度およびCO2の下で微速度顕微鏡に設置した。受精後24時間から96時間まで毎時2回ずつ画像を取得した。その後(すなわち7日後)増殖した卵割球に発育した38個の胚を正確に特定する画像分析工程の能力を評価し、各胚の同じ145枚の画像を基に訓練を受けた発育学者が行った品質評価と比較した。
Claims (10)
- 胚品質を決定するための方法であって、該方法は、一定期間にわたって該胚をモニタリングする工程であって、該一定期間が少なくとも3つの細胞分裂期および分裂間期の少なくとも一部を含むのに十分な長さを有する、工程と、該分裂間期の少なくとも一部の間の細胞運動の程度を測定する工程と、該分裂間期の少なくとも一部の間に決定された細胞運動の程度に基づいて胚品質の指標を得る工程とを包含する、方法。
- 少なくとも1つの細胞分裂期の長さが測定される、請求項1に記載の方法。
- 1つの分裂間期の継続期間が測定される、請求項1〜2のいずれか一項に記載の方法。
- 複数の細胞分裂期の間の細胞運動の程度が測定される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 各細胞分裂期の長さが測定される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 各分裂間期の長さが測定される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも2つの分裂間期における細胞運動の期間が測定される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞運動の程度は、少なくとも2つの分裂間期において測定される、請求項4に記載の方法。
- 前記少なくとも2つの分裂間期が、連続した分裂間期である、請求項7または8に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの細胞分裂期の長さの測定と、前記分裂間期の間の細胞運動の期間の測定とが実施される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
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