JP5722885B2 - ヒト多能性幹(hPS)細胞の成長および分化のための3D培養システム - Google Patents
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Description
i) バイオリアクター(Bioractors)におけるhPS細胞または肝前駆細胞の播種
ii) 当該バイオリアクターを1種類以上の培養培地で10日〜50日の期間にわたり灌流して、肝細胞様細胞を得ること、
を含む方法に関する。
i) バイオリアクターにおけるhPS細胞または肝前駆細胞の播種
ii) 当該バイオリアクターを1種類以上の培養培地で10日〜50日の期間にわたり灌流して、肝細胞様細胞を得ること、
を含む方法、により得られる肝細胞様細胞を含む肝組織様3D構造に関する。
i) バイオリアクターにおけるhPS細胞または肝前駆細胞の播種
ii) 当該バイオリアクターを1種類以上の培養培地で10日〜50日の期間にわたり灌流して、肝細胞様細胞を得ること、
を含む方法、により得られる細胞の、治療目的での、または、創薬、医薬製剤、毒性試験における、または、再生医療における、使用に関する。
凝集体またはマイクロキャリアを用いる、分化に対する現在の3D浮遊培養モデルアプローチは、中央物質交換(central mass exchange)が限られる。より大きな細胞量での、連続的な培地交換と、制御可能なガス圧での分散した酸素添加とを伴う、灌流を基本とした動的培養条件を提供することにより、3D灌流4区画キャピラリー膜バイオリアクター技術は、両方の培養の概念の利点を用いることを可能にする。加えて、医薬品の製造および品質管理に関する基準(good manufacturing practice;GMP)の条件に適した、分化レジームの、閉鎖系への適用が可能である。この技術は、例えば酸素圧、ガス因子適用(gas factor application)、培地因子勾配(medium factor gradients)、または、細胞に対する例えば流速および圧力などの物理的刺激の生成などの、変化するが制御可能な培地およびシステムのパラメータを可能にする。
再生医療および応用研究、例えば薬物スクリーニングまたは毒性学試験など、における、幹細胞ベースの用途の、開発および実施のためには、十分に定義された特徴を有する大量の細胞が必要である。したがって、高収率かつ高純度で、未分化のヒト胚性幹細胞の、成熟した肝細胞への、方向性のある再現性ある分化を可能にする培養システムが求められている。
Soto−GutierrezらによるhESC研究の肝分化が指し示しているのは、複雑なマトリックス構造を用いるかまたは非実質細胞との共培養を用いる、より複雑な環境が、hESCの肝分化を支援するとのことである(Soto−Gutierrez et al. 2006)。Levenbergらは、ES細胞またはEBを播いた、PLGA―ポリ(乳酸‐コ‐グリコール酸)およびPLLA―ポリ(L‐乳酸)の、生分解性の足場において、肝組織様構造の誘導は、アクチビンAおよびIGFでの処理により可能であったとのことを示した(Levenberg et al. 2003)。Baharvandらは、3Dのコラーゲン製の足場における、hESCの、亢進された肝分化について報告した(Baharvand et al. 2006)。したがって、3D培養環境を提供する灌流型バイオリアクターの使用により、胚性幹細胞分化のための、より効率的で、かつ、スケーラブルな方法がもたらされ得る。
肝臓は、胚中で発生する最初の器官の1つであり、また、それは、たちまち胎児(胎仔)の体内で最も大きい器官の1つになる。肝臓は、胚前腸の胚体内胚葉上皮(definitive endodermal epithelium)から発生する。肝臓発生の誘導には、最初に、前腸におけるWntおよび繊維芽細胞成長因子シグナル伝達(FGF4)の抑制が必要である。次いで、心臓中胚葉からのFGFと、横中隔間充織からの骨形成タンパク質(BMP)とが、空間的に限定された細胞増殖を誘導し、それにより内胚葉層の肥厚化が引き起こされる。次いで、細胞が上皮から現れて、横中隔中へと移動しはじめる。この内胚葉から現れて横中隔中に集まる細胞の塊は肝芽(liver bud)と称される。器官形成のこのステージにおける内皮細胞との相互作用は、この初期出芽段階に極めて重要である。肝内胚葉(hepatic endoderm)細胞は、この間、機能および形態に関してかなり未成熟であり、今度は肝芽細胞(hepatoblast)と称される。肝芽由来の肝芽細胞の索は、中胚葉に貫入し、卵黄静脈および臍静脈と混ざり合い、これらが肝芽付近で吻合して、毛細血管床を形成する。これらの変遷により肝臓の類洞構造が確立されるが、これは、器官機能に極めて重要なことであり、また、肝臓への土台作りをして胎児(胎仔)の造血を支援する。肝芽中へと移動する造血幹細胞は、グルココルチコイドと共に、さらなる肝成熟を誘導するオンコスタチンM(OsM)を分泌する。この胚の肝臓塊に寄与する他の細胞型は、肝類洞、クッパー細胞および肝星細胞を取り巻く内皮細胞である。これらの細胞により産生される肝細胞成長因子(hepatocyte growth factor;HGF)は、完全な機能的肝成熟に重要である。肝臓分化の、これら、より後期のステージにおいては、Wntシグナル伝達は、もはや成長および分化を阻害せず、促進する。原因肝臓療法がないこと、および、肝移植用のドナー臓器の入手可能性(availability)が不十分であることが、新しい細胞ベースの肝臓治療の開発に対する要求を生んでいる。損傷した組織と入れ換わるための、増殖および分化の能力を有する幹細胞の移植は、いくつかの臨床的徴候においては、全臓器移植(whole−organ transplantation)に取って代わることができ得るものである。
in vitroにおける、HPS細胞、および、特にhES/hBS細胞の、肝分化の方向についての戦略に関する研究の結果、肝分化に対する効果を有する、いくつかのサイトカイン、成長因子および非タンパク質化合物の同定に至った(Heng et al. 2005;Snykers et al. 2008において概説されている)。当該成長因子としては、アクチビンA、BMP2および4、上皮増殖因子(EGF)、FGF1、2および4、HGF、インスリンならびにOsMが挙げられる。当該非タンパク質因子としては、デキサメサゾン(DEX)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ニコチンアミドおよび酪酸ナトリウムが挙げられる。各分化因子の効果の鍵となるのは、タイミング、濃度および他の因子との組み合わせである。hPS由来肝細胞様細胞の特徴決定をするために、種々のマーカーおよび機能試験が利用されてきた(Snykers et al. 2008により概説されている)。免疫細胞化学、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または酵素結合免疫吸着測定法(enzyme−linked immunosorbent assay;ELISA)により調べられたマーカーには、アルファフェトプロテイン(AFP)、アルブミン(ALB)および尿素のような血漿タンパク質、サイトケラチン(CK8、CK18、CK7、CK19)、ならびに、アルファ‐1‐アンチトリプシン(α1AT)、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPPIV)およびシトクロムP450アイソエンザイムのような種々の肝細胞特異的酵素、の分泌物が含まれていた。肝細胞特異的機能の発現については、例えば、グリコーゲンの貯蔵の検出や、シトクロムP450アイソザイムに特異的な種々の試験基質の代謝などにより、調べられてきた。
hPS由来肝細胞の、将来の臨床上の用途は、例えば特定の遺伝的欠陥または急性もしくは慢性肝不全の場合などの肝機能不全を有する患者における、それらの、細胞移植への適用に見られる(Ito et al. 2009)。幹細胞由来肝細胞の移植は、いくつかの臨床的徴候においては、全臓器移植(whole−organ transplantation)に取って代わることができ得るものであり、また、―免疫適合性(immunocompatible)細胞を用いる場合には―免疫抑制療法の必要性を不要にし得るものである。さらなる治療上の1つの選択肢は、移植まで、または、患者の器官の再生までの肝機能の橋渡しをするための、対外肝臓補助のための信頼性の高いヒト細胞源の提供に見られ、これは、対外肝臓装置のための細胞の入手可能性(availability)という既存の課題をも解決するであろう。さらに、対外システムは、また、細胞移植後、その適用した細胞が、十分な肝臓特異的な代謝パフォーマンスを示すまでの、肝機能の橋渡しをするための、興味深い治療上の1つの選択肢をも提供し得る。薬学研究における、可能性のある用途としては、創薬のために必要な新規肝臓アッセイの開発のための、hPS細胞由来肝細胞の使用である。これにより、現存のin vitroツールによる乏しい予測力が克服される可能性があり、また、前臨床段階での、より信頼性が高く関連性のある試験を可能にし、かつ、弱いリード候補が臨床段階に入ってしまうのを妨げることとなるような、新たなヒト細胞ベースの試験システムがもたらされ得る(Jensen et al. 2009)。
i) バイオリアクターにおけるhPS細胞または肝前駆細胞の播種
ii) 当該バイオリアクターを1種類以上の培養培地で10日〜50日の期間にわたり灌流して、肝細胞様細胞を得ること、
を含む方法に関する。
CYP1A2: フェナセチン −> アセトアミノフェン
CYP2C9: ジクロフェナク −> 4’OH ジクロフェナク
CYP3A4: ミダゾラム −> 1’OH ミダゾラム
a) バイオリアクターにおけるフィーダー細胞の播種の工程
b) 当該フィーダー細胞を成長させる工程
を含む方法にも関する。
ベース ノックアウトDMEM
0.5〜2% グルタマックス‐I
0.5〜2% NEAA
10〜50% ノックアウト血清代替物(Knockout Serum Replacer)
20〜75μg/ml ゲンタマイシン
0.05〜1mM β‐メルカプトエタノール
1〜25ng/ml bFGF
ベース RPMIアドバンスト培地
0.5〜2% グルタマックス‐I
1〜10ng/ml bFGF
10〜200ng/ml アクチビンA
10〜200μg/ml ゲンタマイシン
ベース RPMIアドバンスト培地
0.5〜2% グルタマックス‐I
0.1〜1% FCS(熱非働化)
1〜10ng/ml bFGF
10〜200ng/ml アクチビンA
10〜200μg/ml ゲンタマイシン
ベース RPMIアドバンスト培地
0.5〜2% グルタマックス‐I
10〜250ng/ml aFGF
1〜50ng/ml bFGF
10〜200ng/ml BMP2
50〜500ng/ml BMP4
0.05〜1% FCS(熱非働化)
10〜200μg/ml ゲンタマイシン
ベース ウィリアムズE(フェノールレッド不含)
1〜2×/500ml SingleQuots(登録商標)
0.5〜2% グルタマックス
0.5〜5g/l D‐ガラクトース
0.5〜5g/l D‐ソルビトール
5〜50ng/ml HGF
0.5〜5ng/ml bFGF
10〜200μg/ml ゲンタマイシン
ベース ウィリアムズE(フェノールレッド不含)
1〜2×/500ml SingleQuots(登録商標)
0.5〜2% グルタマックス
0.5〜5g/l D‐ガラクトース
0.5〜5g/l D‐ソルビトール
1〜25ng/ml オンコスタチンM
0.5〜10ng/ml HGF
0.5〜10ng/ml bFGF
0.05〜2μM デキサメタゾン
10〜200μg/ml ゲンタマイシン
0.15〜5μM rhoキナーゼ阻害剤、例えばBIO
RPMI 1640(+0.01%〜5%PEST、+0.1〜10%グルタマックス)
0.5〜2× B27
10〜200ng/ml アクチビンA
0.1〜10mM NaB
RPMI 1640(+0.01%〜5%PEST、+0.1〜10%グルタマックス)
0.5〜2× B27
10〜200ng/ml アクチビンA
0.1〜8mM NaB
RPMI A(+0.01%〜5%PEST、+0.1〜10%グルタマックス)
10〜200ng/ml aFGF
0.5〜50ng/ml bFGF
5〜250ng/ml BMP2
20〜500ng/ml BMP4
0.02〜5% FBS
VitroHES
0.1〜10% DMSO
VitroHES
0.2〜20% DMSO
WME+SQ(−GA1000)(+1%グルタマックス+0.1%PEST)
1〜100ng/ml OsM
0.01〜15μM DexM
2〜50ng/ml HGF
0.1〜3% DMSO
0.15〜5μM rhoキナーゼ阻害剤、例えばBIO
AA;アクチビンA
アルブミン(ALB)
アルファ‐フェトプロテイン(AFP)
胚体内胚葉(Definitive endoderm;DE)
FBS;ウシ胎仔血清
FGF2;繊維芽細胞成長因子2
繊維芽細胞成長因子(FGF)
フォークヘッドボックスA2(Forkhead box A2;FOXA2)
肝細胞核因子4、アルファ(HNF4A)
hPS;ヒト多能性幹細胞
ヒト胚性幹細胞(hESC)
KO‐SR;ノックアウト血清代替物(knockout serum replacement)。
本明細書で用いられているように、「ヒト多能性幹細胞」(hPS)は、任意の源に由来していてもよい細胞であって、かつ、適切な条件下で、3胚葉(内胚葉、中胚葉、および外胚葉)すべての派生物である種々の細胞型のヒト子孫を産生することができる細胞を指す。hPS細胞は、8〜12週齡のSCIDマウスにおいて奇形腫を形成する能力および/または組織培養において三胚葉すべての識別可能な細胞を形成する能力を有していてもよい。ヒト多能性幹細胞の定義には、ヒト胚性幹(hES)細胞を含む様々な種類の胚細胞(例えば、Thomson, J.A. et al. (1998)、Heins, N. et.al. (2004)を参照のこと)、ヒト胚盤胞由来幹(human blastocyst derived stem;hBS)細胞、ならびに、人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell)[例えば、Yu, J. et al., (2007);Takahashi,K. et al. (2007)を参照のこと]が包含される。本明細書に記載の種々の方法および他の実施形態は、種々の源に由来するhPS細胞を必要とするものであってもよく、または様々な源に由来するhPS細胞を利用するものであってもよい。例えば、使用に適したhPS細胞は、発生中の胚から得てもよい。加えて、または、あるいは、適したhPS細胞は、樹立細胞株および/またはヒト人工多能性幹(human induced pluripotent stem;hiPS)細胞から得てもよい。
ヒト包皮繊維芽細胞(HFF)の培養
HFFは、Type Culture Collectionから購入し(CRL‐2429;米国バージニア州マナッサス)、44回以下の集団倍加の間、グルタマックス‐1(インビトロジェン社)、10% 子ウシ胎仔血清および10,000U/10,000μg/ml ペニシリン/ストレプトマイシン(すべてBiochrom社、ドイツ ベルリン)を含有するイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)中に広げた。その細胞を、3000ラドのガンマ線照射により不活性化し、10ng/ml ヒト組換え塩基性繊維芽細胞成長因子(hrbFGF)(PeproTec社)を添加したVitroHES培地(Vitrolife AB社、スウェーデン イェーテボリ)中、または、20% ノックアウト血清代替物(Knockout Serum Replacer)、2mM グルタマックス‐I(すべてインビトロジェン社)、0,1mM 非必須アミノ酸(NEAA)、50μg/ml ゲンタマイシン(すべてBiochrom社)、0.1mM β‐メルカプトエタノール(シグマ社)、10ng/ml hrbFGF(PeproTec社、英国ロンドン)を含有するノックアウトDMEM中、1cm2当たり30,000〜70,000個HFFの密度で、0.1% ゼラチン(シグマアルドリッチ社)でコートした培養ディッシュ上に蒔いた。すぐに使用しない照射細胞は、分注して、10% ジメチルスルホキシド(DMSO)(シグマアルドリッチ社)を含有する子ウシ胎仔血清(Biochrom社)中に凍結し、後で使用するために−152℃に保存した。
マウス胚繊維芽細胞(MEF)の培養
MEFを、2回〜最大4回までの継代の間、10% 子ウシ胎仔血清、2mM L‐グルタミン、0.1mM NEAAおよび10,000U/10,000μg/ml ペニシリン/ストレプトマイシン(すべてBiochrom社)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中に広げた。3000ラドのガンマ線照射により不活性化し、VitroHES培地(Vitrolife社)中、65,000細胞/cm2の密度で、0.1% ゼラチン(シグマアルドリッチ社)でコートした「体外受精(In Vitro Fertilization)」(IVF)ディッシュ(ファルコン、ベクトン・ディッキンソン社)に播くか、または、分注して、10% DMSO(シグマアルドリッチ社)を含有する子ウシ胎仔血清(Biochrom社)中に凍結し、後で使用するために−152℃に保存した。
バイオリアクター
本研究に用いた多区画バイオリアクターは、1つの二液型ポリウレタンハウジング(PUR、Morton社、ドイツ ブレーメン)中へと組み込まれる、3つの、独立しているが織り合わされている中空繊維キャピラリー膜システムで構成されている。培地灌流用の2つの親水性キャピラリーシステムは、およそMW500,000の分子量カットオフを有する微多孔性ポリエーテルスルホンキャピラリー膜(mPES、Membrana社、ドイツ ヴッパータール)でできている。3つ目のものは、ガス交換を可能にするために、疎水性マルチラミネート中空繊維膜キャピラリー(MHF、三菱、日本国東京)でできている。よって、キャピラリー外スペース内に位置する細胞は高物質交換率の分散培地供給と拡散による直接膜酸素添加とに暴露される。細胞の注入には、フローヘッドおよび開口端(open ending)シリコーンゴムキャピラリー(Silastic、ダウコーニング社、米国ニューヨーク州)を用いる(図1A、BおよびC)。バイオリアクターは、培地の再循環および置換のための交換可能なマルチチャンネルフローヘッドおよびギアを備えたモジュラーポンプに対する圧力および流速の制御を備えた、1つのプロセッサ制御式灌流装置中へと組み込まれる(図2AおよびC)。加熱ユニットにより、灌流回路内の一定温度がもたらされる。空気およびCO2の流速は、いずれも、組み込まれたロータメーターを用いて手動で制御するか、または、外部自動CO2制御式pH制御システムを用いることにより制御した(図2)。当該制御装置は、バイオリアクター灌流回路中に組み込まれた光学pHセンサー経由で、培養培地のpH値を連続的に測定し、また、空気/CO2混合物を調整して、予め設定したpHを維持する。バブルトラップを備えた灌流チューブ(図2Cに示されている)は、標準的な医療グレードの透析PVC(ビー・ブラウン社、ドイツ メルズンゲン)から作製された。滅菌は、エチレンオキシドまたはホルムアルデヒドガスを用いて行ない、その後、少なくとも7日間の脱気期間を設けた。この実験の間、灌流装置は、組み込まれたUSBポートを介してPCに接続し、また、LabVIEW(National Instruments社、ドイツ ミュンヘン)で作成されたスタンドアロンの測定プログラムを用いて、灌流パラメータ(圧力、温度、ポンプスピード)を、継続的に記録し、グラフでモニタリングした。このプログラムは、インターネット経由での遠隔モニタリングを可能にするウェブサーバーも提供する(図2C)。
バイオリアクター調整
最初の細胞播種の前に、バイオリアクターは、培地の再循環による24〜72時間の調整段階を経た。細胞播種後、培養物を、22〜30ml/分の流速で灌流した。このバイオリアクターを37℃で保った。ガス区画中の空気/CO2混合物の流速を40ml/分で維持した。pH、酸素の分圧(pO2)および二酸化炭素の分圧(pCO2)ならびに酸/塩基状態を定期的に測定した(ABL5、Radio Meter Copenhagen、デンマーク コペンハーゲン)。手動ガス制御の場合には、空気/CO2混合比を、7.2〜7.3の間の安定したpHを維持するために調整した。これら実験の全体を通じて生じた代謝および灌流のデータの、オンラインでの保存、アクセスおよび分析を可能にするために、データベースを開発した。
バイオリアクターHepDiff‐1およびHepDiff‐2におけるhESCの肝分化
方向性のある肝分化について調べるために、2つの最初のバイオリアクター作動を行なった。一方の実験においては、hESC播種の2日前に、バイオリアクターに不活性化MEFを播いたが、もう一方は、フィーダー細胞の添加をせずに行なった(表1および表2参照)。hESCの肝分化を誘導するために、バイオリアクターを、5種類の異なる培地(DiffMed1〜5、表2)で、出願人が開発した分化プロトコルに基づいて、連続的に灌流した。培地の順序、組成および灌流回路への新鮮培地添加速度についての概要を表2に示す。
灌流培地における代謝パラメータ
これらバイオリアクターの内側の細胞の代謝活性および分化は、培地アウトフロー中および再循環培地中の可溶性因子を測定することにより、毎日、特徴決定を行なった。自動臨床化学分析装置(ロシュ・ダイアグノスティックス社、ドイツ ハイデルベルク)を用いて、以下のパラメータを測定した:α‐フェトプロテイン(AFP)、アルカリホスファターゼ(AP)、アラニントランスアミナーゼ(ALT)、アスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)、ベータ‐ヒト絨毛性ゴナドトロピン(β‐hCG)、c‐ペプチド、胎児性癌抗原(CEA)、サイトケラチンフラグメント19(Cyfra21‐1)、エリスロポエチン、エストラジオール、卵胞刺激ホルモン(FSH)、第II‐V‐X‐XIII因子、フィブリノーゲン、ガンマ‐グルタミルトランスフェラーゼ(GGT)、グルコース、乳酸塩、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)、黄体形成ホルモン、神経特異的エノラーゼ(NSE)、重量オスモル濃度(osmolality)、オステオカルシン、偽コリンエステラーゼ(PCHE)、プレアルブミンプロゲステロン、プロラクチン、S‐100、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)、トランスフェリン(測定方法の詳細な説明については、添付文書中の表8を参照のこと)。加えて、グルタミン、グルタミン酸塩、グルコース、乳酸塩、アンモニウム、pH、ナトリウム(Na+)、カリウム(K+)を、BioProfile 100 Plus装置(ノバ・バイオメディカル社、米国マサチューセッツ州ウォルサム)を用いて測定した。アクチビンA、インスリンおよびアルブミンは、酵素結合免疫吸着測定法(enzyme−linked immunosorbent assay;ELISA)を用いて、メーカーの推奨に従って(アクチビンAは、ドイツ ヴィースバーデン‐ノルデンシュタットの、R&Dシステムズ社からの製品DY338、DY999、DY994、DY995を用いて、;インスリンは、インビトロジェン社からのELISAを用いて、;アルブミンは、米国ペンシルベニア州フィラデルフィアのエクソセル社、AlbuwellからのELISAを用いて)、測定した。尿素は、比色定量キット(QuantiChrom、バイオアッセイシステムス社、米国カリフォルニア州ヘイワード)を用いて測定した。ガラクトースおよびソルビトールの濃度は、酵素アッセイ(ロシュ・ダイアグノスティックス社)により測定した。
代謝活性
当該肝分化プロトコルで処理したバイオリアクター培養物を試験するか、または、その、フェナセチン、ジクロフェナクおよびミダゾラムを、それぞれ、第I相シトクロム(CYP)P450酵素CYP1A2、CYP2C9およびCYP3A4経由で代謝する能力を試験した。細胞の播種後の第40日目および第47日目に、以下のスキームに従って、CYP P450活性試験を行なった:
CYP1A2: フェナセチン −> アセトアミノフェン
CYP2C9: ジクロフェナク −> 4’OH ジクロフェナク
CYP3A4: ミダゾラム −> 1’OH ミダゾラム
バイオリアクターからの試料取得
予定された培養期間の終わりに、バイオリアクターをシャットダウンし、チューブを外した。低い方のバイオリアクターのフタを開け、キャピラリー層を含む細胞塊の試料を、滅菌したメスおよびピンセットを用いてさらなる分析用に切り出した。組織学的分析のために、試料は、すぐに、後述のように固定し、包埋した。奇形腫試験、FACSおよびRNA分析のために、細胞を、キャピラリーから分離し、CaMgを含有しないPBSでの洗浄、および、0.05%〜0.02%のトリプシン‐EDTA溶液(Biochrom社)中での3分間のインキュベーションによりバラバラにした。トリプシン処理(trypsination)は、10%子ウシ胎仔血清(Biochrom社)を含有するDMEMの添加により停止させた。細胞溶液からのキャピラリーの分離は、100μmセルストレーナー(ファルコン、ベクトン・ディッキンソン社、ハイデルベルク)を用いてふるい分けることにより達成した。
RNAの単離
バイオリアクター中で培養した細胞/組織からRNAを単離するために、切り出したキャピラリーは、CaMgを含有しないPBSで洗浄し、0.05%〜0.02のトリプシン‐EDTA溶液(Biochrom社)中で3分間インキュベートした。RNeasyキット(キアゲン社、ドイツ ヒルデン)を用いてメーカーのプロトコルに従い、全RNAを単離した。奇形腫は、TissueLyser IIを用い、その後、QIAshredderでホモジナイゼーションを行なうことにより、粉砕した(いずれもキアゲン社)。個々の細胞は、細胞ペレットへの溶解バッファー(lysis buffer)の直接の添加により溶解させた。この単離したRNAの濃度および品質は、ナノドロップ分光光度計(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を用いて、かつ、バイオアナライザ(アジレント2100バイオアナライザ)で、または、未変性(native)アガロースゲル電気泳動により、決定した。
アレイハイブリダイゼーション
ビオチン標識cRNAは、投入(input)として300ngの品質チェック済み全RNAを用い、イルミナ(登録商標)TotalPrep RNA Amplification Kit(Ambion社、米国テキサス州オースティン)を用いて作成した。チップハイブリダイゼーション、洗浄、Cy3‐ストレプトアビジン(アマシャム バイオサイエンス社)染色、およびスキャニングは、Bead Station 500(イルミナ社、サンディエゴ、米国)プラットホーム上で、メーカーにより供給されたプロトコルに従い、試薬を用いて行なった。cRNA試料は、およそ24,000種類のRefSeq転写産物を搭載したイルミナ ヒト‐8v2 BeadChip上にハイブリダイズさせた(Kuhn et al. 2004)。
データ解析
すべての試料に対する、分位(quantil)正規化および非正規化RAWデータファイルは、BeadStudio V3ソフトウェア(イルミナ社)を用いて作成した。BeadStudioソフトウェアで作成したデータを、マイクロアレイデータ解析ツールMultiExperiment Viewer(MeV)、マイクロアレイ分析ツールのTM4スイート(http://www.tm4.org)の一コンポーネント(Saeed et al. 2003)、または、Bioconductor(Gentleman et al. 2004)をその分析バックエンド(analysis backend)として用いるグラフィカル・インターフェースであるChipster(http://chipster.sourceforge.net/)、へとインポートすることにより、さらなるデータ解析を行なった。機能エンリッチメント解析(functional enrichment analysis)は、DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov)を用いて行なった(Dennis et al. 2003)。
組織化学
パラフィン包埋試料を、4%緩衝ホルムアルデヒド溶液中で固定し、パラフィン中に包埋し、切って、5μmの切片にした。切片を、キシレンで脱パラフィンし、段階的に減少するアルコール(decreasing alcohol series)を用いて再水和させ、その後、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を行なった。
免疫組織学
パラフィン包埋試料を、4%緩衝ホルムアルデヒド溶液中で固定し、パラフィン中に包埋し、切って、5μmの切片にした。切片を、キシレンで脱パラフィンし、段階的に減少するアルコール(decreasing alcohol series)を用いて再水和させた。抗原は、切片を圧力釜にてクエン酸緩衝液(0.01 クエン酸一水和物、pHは6.0まで;メルク社、ドイツ ダルムシュタット)中で25分間ボイルすることにより、賦活化(retrieve)し、その後、5%トリトン/PBS中で20分間のインキュベーションを行なった。切片を5%スキムミルクでブロッキングし、;それらを一次抗体と共に30分間インキュベートし、PBSで洗浄し、二次蛍光結合抗体と共にインキュベートした。以下の一次抗体を用いた:モノクローナルマウス抗ヒト平滑筋アクチンIgG2a(ASMA)、モノクローナルマウス抗ヒトデスミンIgG1(Dako社、デンマーク グロストルプ)、モノクローナルマウス抗ニューロン特異的β‐III‐チューブリンIgG2a(R&Dシステムズ社)、モノクローナルマウス抗ネスチンIgG1(ベクトン・ディッキンソン社)、ポリクローナルヤギ抗HNF‐3βIgG、モノクローナルマウス抗OCT‐4 IgG2bおよびポリクローナルウサギ抗ビメンチンIgG(Santa Cruz Biotechnology社)。二次抗体としては、以下のポリクローナル抗体を用いた:ヤギ抗マウスIgG‐Cy2、ヤギ抗ウサギIgG‐Cy3(Dianova社)、ヤギ抗マウスIgG2a‐TRICT、ヤギ抗マウスIgG‐FITC、ヤギ抗マウスIgG‐FITC、ヤギ抗マウスIgG‐Cy3、ヤギ抗マウスIgG‐FITC(ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社、ペンシルベニア州ウェストグローブ)およびロバ抗ヤギIgG‐Cy3(Santa Cruz Biotechnology社)。核の非特異的染色のために、切片を、4’,6‐ジアミジノ‐2‐フェニルインドール(DAPI、モレキュラープローブ社、ドイツ ライデン)と共にインキュベートした。
透過型電子顕微鏡法(TEM)
バイオリアクター細胞区画由来の物質を5%グルタルアルデヒド(Serva社、ドイツ ハイデルベルク)で固定した。60mmol/lのリン酸緩衝液、pH7.3中での30分間の浸漬後、細胞の凝集体を、2時間にわたり、2% OsO4(Paesel+Lorei社、ドイツ フランクフルト)中で後固定し、エタノール中で段階的に脱水し、次いで、アラルダイト(Serva社、ドイツ ハイデルベルク)中に包埋した。超薄切片は、電子顕微鏡検査前に、酢酸ウラニルおよびレイノルズ(Reynold’s)クエン酸鉛(Chroma社、ドイツ ミュンスター)を用いてコントラストをつけた。
バイオリアクターにおけるhESCの、改善された肝分化
実施例5に記載した最初の肝分化作動からの結果に基づき、さらなる作動を行なって、方向性のある肝分化についてさらに調べた。
未分化hESCの培養のための、当該バイオリアクターシステムを用いた、調整培地の製造
本明細書において検討したようなバイオリアクター実験は、不活性HFFの存在は、それらHFFがその活性を緩めるまで、hESC分化の開始を遅らせる、とのことも示す。この、HFFの、多能性を支援する活性は、そのアクチビンAの産生と相互に関係している可能性がある。HFFフィーダー細胞の挙動をさらに調べるために、HFFのみを用いたいくつかの実験を、2D培養において、および、2つのバイオリアクターにおいて、行なった。
誘導された肝細胞の成熟度は、遺伝子発現、タンパク質発現、の測定、および、同様に、シトクロムP450(CYP)活性の活性測定、により、分析した。
これらバイオリアクターにおいて分化した肝細胞様細胞、および、適切な対照(2D分化肝細胞様細胞、または、成人ヒト肝臓由来の初代肝細胞のいずれか)、の試料を、肝臓関連遺伝子の発現について、QPCRにより分析した。
肝分化
2D標準培養ディッシュ中で培養されるhESC用にCellartis社が確立した肝分化プロトコルに基づき、当該3Dバイオリアクターシステムにおける、hESCの、方向性のある肝分化に関する2つのパイロット実験を設計し、実施した。この2つのバイオリアクター実験は、不活性化MEFの、バイオリアクターのうちの1つの中へのさらなる播種についてのみ異なるものであった。
当該培地において測定された代謝パラメータに関する2つのバイオリアクターの比較が示すのは、追加のフィーダー細胞が播種されるバイオリアクター(HepDiff‐2)は、グルコースおよび乳酸塩の代謝の観点から、および、分化マーカーの産生に関して、よりずっと高い細胞活性を最初に有していた、ということである。しかしながら、バイオリアクターHepDiff‐2では、当該実験中のグルコース消費および乳酸塩産生の、安定した減少が観察された(図4)。第20日目にあるLDHのピークは、おそらく、灌流システムの加熱ユニットの技術的な機能不良に起因するものであった。第40日目以降のLDH放出ピークは、おそらく、当該バイオリアクター中の圧力上昇に関係するものであった。キャピラリー膜の凝固を引き起こし得る未同定培地成分の沈殿が観察されたため、これは、結果として、栄養素と共に、最適以下の(suboptimal)細胞供給をもたらしていたかもしれなかった。このバイオリアクター中のAFP産生は、第17日目と第24日目との間で指数関数的に増加し、その後、実験の終了まで減少した。AFP産生のダウンレギュレーションの始まりは、別の分化培地へと変えることと相関する。肝分化マーカーである尿素は、その産生において、第1日目と第20日目との間で小さなピークを示し、また、アルブミン産生は、実験の間中ずっと、約0.4μg/時間という比較的低いレベルにとどまった(図5)。
これらバイオリアクターにおける肝細胞特異的な細胞活性について試験するべく、フェナセチン、ジクロフェナクおよびミダゾラムを、それぞれ、第I相シトクロムP450酵素CYP1A2/1A2、CYP2C9およびCYP3A4経由で代謝する能力を試験した。
上記で述べられているように、両バイオリアクターとも、実験の終了時に、非常に低い代謝活性を呈した。この所見は、組織学的分析の際、バイオリアクターHepDiff‐2では、組織構造を含有する領域は非常にわずかしか見い出せず、また、バイオリアクターHepDiff‐1の試料においては構造は全く見いだせなかった、という事実と相関していた。バイオリアクターHepDiff‐2において観察された組織クラスターでは、はっきりした内胚葉分化を指し示す、様々な上皮形態を有するたくさんの構造を観察することができた。加えて、疎性結合組織を有する領域、および、核に対する細胞質の割合が低い細胞で構成される少数の細胞凝集体、が見い出された。
hESCの肝細胞への分化およびバイオリアクターにおける成熟
同時に作動させたバイオリアクターの第一巡目:BR2およびBR3
実施例18において詳述したプロトコルに加え、いくつかのさらなる実験を作動させて、バイオリアクター環境における、hESCの、肝細胞への、方向性のある分化のための手順を、これらの細胞型の成熟の改善にも焦点を当てながら、洗練されたものにした。これらの実験は表3および4(バイオリアクターBR2およびBR3)において詳述されており、そこでは、アクチビンAおよび高成長因子レベルを用いてhESCの、DE細胞への分化を開始させ、所定の時点で(表3に示されている実験については第12日目、表4に示されている実験については第7日目または第11日目に)細胞をバイオリアクター中へと播種し、さらなる分化および成熟が起こるようにしておくための全体的な手順が記載されている。この手順は2D非バイオリアクター制御と同時に作動させ、また、両方の実験について、CYP450のレベルを、第25日目または第26日目のバイオリアクターシャットダウンの前の複数の特定の時点において測定した。
続いて、一貫性および再現性を確実にするべく、2つの別々のバイオリアクターについて、結果を比較した。細胞を、バイオリアクター(Bioreactot)BR121またはBR168のいずれかの中に、異なる2つの時点で(第7日目および第12日目に)、播種し、以下の通りに、第26日目まで、成熟させておいた(図11、A〜D):
第7日目に、2千5百万個の細胞を、BR121の中へ、10uM Rock阻害剤を添加したP1中に播種し、上記スケジュールに従って実験第26日目の終了まで培養した。5百万個の細胞は、2D対照用にマトリゲルコート48ウェルに、1cm2当たり150000細胞で、10uM Rock阻害剤を添加したP1中に播き、上記スケジュールに従って、実験の終了である第26日目まで培養した。
第7日目に、3千万個の細胞を、2D培養フラスコ中に、10uM Rock阻害剤を添加したP1中に播き、上記スケジュールに従って培養した。5日後、第12日目に、細胞をトリプルセレクト(tryple select)し、数えたところ、全体で7千2百万個の細胞となった。
当該動的灌流技術のさらなる一局面は、細胞が区画化された状態のままでありながら、第一バイオリアクターの因子または可溶性メディエーターにより第二バイオリアクターが刺激され得る、1つの灌流回路における「ツインバイオリアクター」の組み合わせを、容易に行なうことが可能であるということである。これは、共培養物の未知の可溶性因子が用いられることとなる場合には興味深いものとなるであろうが、培養物間の細胞の移入は避けなければならない。
Claims (18)
- hPS細胞を肝細胞様細胞へ分化させるための方法であって、
i) 2D環境にてhPS細胞を肝前駆細胞の方向に向かって分化させること;
ii) その最初に分化させた細胞を、バイオリアクターに播くこと;および
iii) 前記バイオリアクターを1種類以上の培養培地で10日〜50日の期間にわたり灌流して、肝細胞様細胞を得ること、
を含む方法。 - 前記肝細胞様細胞が、肝細胞様細胞を含む肝組織様3D構造の形をしている、請求項1に記載の方法。
- 前記hPS細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記hPS細胞が人工多能性幹(iPS)細胞である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記肝前駆細胞が胚体内胚葉(definitive endoderm;DE)である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記肝前駆細胞が胚体内胚葉(DE)ではない、請求項1または2に記載の方法。
- 前記肝前駆細胞が、胎児(胎仔)内胚葉の特徴を有する、請求項1または2に記載の方法。
- 前記肝前駆細胞が、肝内胚葉(hepatic endoderm)の特徴を有する、請求項1または2に記載の方法。
- 前記バイオリアクターが中空繊維キャピラリーバイオリアクターである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バイオリアクターが、膜区画を備えている、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記膜区画が、2つ以上のキャピラリーシステムと1つ以上の中空繊維膜とを含む、請求項10に記載の方法。
- 前記バイオリアクターが、キャピラリーシステムを通っての培養培地の灌流のための手段と、前記キャピラリーシステム中のガス交換のための手段とを含む、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 増殖培地の灌流が、前記キャピラリーシステムを通って行なわれ、また、ガス交換が、中空繊維膜システム経由で行なわれる、請求項9〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記キャピラリーシステムと1つ以上の中空繊維膜とが、1つのハウジング中へと組み込まれる独立した織り合わされた(interwowen)繊維キャピラリー膜システムを形成するよう構成されている、請求項9〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 工程ii)の前に、前記バイオリアクターに、不活性化したフィーダー細胞を播種する、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フィーダー細胞が、hFF細胞またはMEF細胞である、請求項15に記載の方法。
- 前記バイオリアクターに、hBS細胞およびフィーダー細胞またはDE細胞およびフィーダー細胞、のいずれか関係する方を、共播種する、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養培地のうちの1つ以上が、例えばROCK Rhoキナーゼの阻害剤などの細胞生存因子を含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
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