JP5707344B2 - トランスアミナーゼ生体触媒 - Google Patents
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Description
本願は、米国特許法第119条(e)項の下、2009年2月26日に出願された米国仮特許出願第61/155,902号の利益を主張し、この米国仮特許出願の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
本開示は、トランスアミナーゼ生体触媒、およびこの生体触媒を使用する方法に関する。
配列表の公式の写しは、EFS−Webを介してASCII形式テキストファイルとして、明細書と同時に提出されており、ファイル名は376247−035.txtであり、作成日は2010年2月26日であり、ファイルサイズは367Kbytesである。EFS−Webを介して提出された配列表は、明細書の一部であり、参照により本明細書に組み込まれている。
食事を摂取した後に、グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)およびグルコース依存性インスリン分泌性ペプチド(GIP)を含む、インクレチンと呼ばれる一群のホルモンが放出される。インクレチンは、グルコース依存様式でインスリン放出を刺激し、グルカゴン放出を抑制し、胃内容排出を遅延させ、飽満を増大させる。インクレチンは、ジペプチジルペプチダーゼ−IV(DPP−4)によって急速に分解される。
ZはOR2またはNR2R3であり;
R1は、C1〜8アルキル、アリール、ヘテロアリール、アリール−C1〜2アルキル、またはヘテロアリール−C1〜2アルキルであり;
R2およびR3はそれぞれ独立に、水素、C1〜8アルキル、アリール、またはアリール−C1〜2アルキルであり;あるいは
R2およびR3は、これらが結合している窒素原子と一緒に、O、S、NH、およびNC1〜4アルキルから選択される追加のヘテロ原子を任意選択により含有する、4〜7員の複素環系を形成し、この複素環は、非置換であるか、またはオキソ、ヒドロキシ、ハロゲン、C1〜4アルコキシ、およびC1〜4アルキルから独立して選択される1〜3個の置換基で置換されており、アルキルおよびアルコキシは、非置換であるか、または1〜5個のフッ素で置換されており;この複素環系は、5〜6員の飽和もしくは芳香族炭素環系、またはO、S、およびNC0〜4アルキルから選択される1〜2個のヘテロ原子を含有する、5〜6員の飽和もしくは芳香族複素環系と任意選択により縮合されており、この縮合環系は、非置換であるか、またはヒドロキシ、アミノ、フッ素、C1〜4アルキル、C1〜4アルコキシ、およびトリフルオロメチルから選択される1〜2個の置換基で置換されており、この方法は、構造式(II)のプロキラルケトン:
Arは、非置換であるか、またはフッ素、トリフルオロメチル、およびトリフルオロメトキシからなる群から独立して選択される1〜5個の置換基で置換されているフェニルであり;
R4は、水素、または非置換であるか、もしくは1〜5個のフッ素で置換されたC1〜4アルキルであり、
この方法は、構造式(2)のプロキラルケトン:
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
4−オキソ−4−[3−(トリフルオロメチル)−5,6−ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル]−1−(2,4,5−トリフルオロフェニル)ブタン−2−オン(「ケトアミド基質」)を、(2R)−4−オキソ−4−[3−(トリフルオロメチル)−5,6−ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル]−1−(2,4,5−トリフルオロフェニル)ブタン−2−アミン(「生成物」)に、規定された反応条件下で、アミノ基ドナーであるイソプロピルアミンの存在下で、210nmでのΗPLC−UVによって検出可能な前記生成物のレベルまで変換することができるトランスアミナーゼポリペプチドであって、前記反応条件は、約2g/Lのケトアミド基質、約0.5Mのイソプロピルアミン、約22℃、約pΗ7.5、約5%のDMSO、約100μMのリン酸ピリドキサール、および約20mg/mLのトランスアミナーゼポリペプチドを含むトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目2)
前記ケトアミド基質を前記生成物に、前記規定された反応条件下で、配列番号4のポリペプチドの活性以上である活性を伴って変換することができる、項目1に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目3)
前記トランスアミナーゼが、前記ケトアミド基質を、少なくとも90%の鏡像異性体過剰率で生成物に変換することができる、項目1に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目4)
前記トランスアミナーゼが、前記ケトアミド基質を、少なくとも99%の鏡像異性体過剰率で生成物に変換することができる、項目1に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目5)
配列番号4と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む、項目1から4のいずれか一項に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目6)
前記アミノ酸配列が、X62、X69、X122、X136、X137、X195、X199、X208、X209、X223、X225、X282、およびX284から選択される1つまたは複数の残基位置で、配列番号2と比較した場合に残基差異を含む、項目5に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目7)
前記残基差異が、X69、X122、およびX284から選択される1つまたは複数の残基位置における残基差異と組み合わせて、X62、X136、X137、X195、X199、X208、X209、X223、X225、およびX282から選択される1つまたは複数の残基位置で発生する、項目5に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目8)
前記アミノ酸配列が、以下の特徴:
X69に対応する残基が、システイン(C)、または非極性残基、極性残基、もしくは脂肪族残基であり;
X122に対応する残基が、拘束性残基、非極性残基、または脂肪族残基であり;
X223に対応する残基が拘束性残基であり;
X284に対応する残基が非極性残基である;
の少なくとも1つまたはそれ以上を含む、項目6または7に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目9)
前記アミノ酸配列が、少なくとも以下の特徴:
(1)X69に対応する残基が、C、または非極性残基、極性残基、もしくは脂肪族残基であり、かつ/あるいはX284に対応する残基が非極性残基であり;
(2)X122に対応する残基が、拘束性残基、非極性残基、または脂肪族残基であり;
(3)X223に対応する残基が拘束性残基である;
を含む、項目8に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目10)
前記アミノ酸配列が、以下の特徴:
X69が、C、または非極性残基、極性残基、もしくは脂肪族残基であり;X122が、拘束性残基、非極性残基、または脂肪族残基であり;X223が拘束性残基である;
を含む、項目9に記載のトランスアミナーゼポリペプチド:
(項目11)
前記アミノ酸配列が、以下の特徴:
X69が、G、C、T、A、またはSであり;X122が、M、I、V、またはHであり、X223がPである;
を含む、項目10に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目12)
前記アミノ酸配列が、以下の特徴:
X122が、拘束性残基、非極性残基、または脂肪族残基であり;X223が拘束性残基であり;X284が非極性残基である;
を含む、項目9に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目13)
前記アミノ酸配列が、以下の特徴:
X122が、M、I、V、またはHであり;X223がPであり;X284がGである;を含む、項目12に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目14)
前記アミノ酸配列が、以下の特徴:
X69が、C、または非極性残基、極性残基、もしくは脂肪族残基であり;X122が、拘束性残基、非極性残基、または脂肪族残基であり;X223が拘束性残基であり;X284が非極性残基である;
を含む、項目8に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目15)
前記アミノ酸配列が、以下の特徴:
X69が、G、C、T、A、またはSであり;X122が、M、I、V、またはHであり;X223がPであり;X284がGである;
を含む、項目14に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目16)
前記アミノ酸配列が、以下の特徴:
X69がCまたはTであり;X122がMまたはIであり;X223がPであり;X284がGである;
を含む、項目9に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目17)
前記アミノ酸配列が、配列番号2と比較した場合に、以下の残基位置:X4;X5;X8;X18;X25;X26;X27;X28;X30;X41;X42;X48;X49;X50;X54;X55;X60;X61;X62;X65;X81;X94;X96;X102;X117;X120;X124;X126;X136;X137;X138;X146;X148;X150;X152;X155;X156;X160;X163;X164;X169;X174;X178;X195;X199;X204;X208;X209;X211;X215;X217;X225;X230;X252;X269;X273;X282、X292;X297;X302;X306;X321;およびX329の1つまたは複数で残基差異をさらに含む、項目8から16のいずれか一項に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目18)
前記残基位置における前記アミノ酸残基差異が、以下:
X4が芳香族残基であり;
X5が塩基性残基であり;
X8が拘束性残基であり;
X18が、システイン(C)または脂肪族残基であり;
X25が極性残基であり;
X26が、芳香族残基または拘束性残基であり;
X27が極性残基であり;
X28が拘束性残基であり;
X30が、極性残基または非極性残基であり;
X41が、拘束性残基または極性残基であり;
X42が非極性残基であり;
X48が、極性残基、酸性残基、脂肪族残基または非極性残基であり;
X49が極性残基であり;
X50が脂肪族残基であり;
X54が拘束性残基であり;
X55が脂肪族残基であり;
X60が芳香族残基であり;
X61が芳香族残基であり;
X62が、芳香族残基または極性残基であり;
X65が脂肪族残基であり;
X81が、非極性残基または小さい残基であり;
X94が脂肪族残基であり;
X96が脂肪族残基であり;
X102が、脂肪族残基または塩基性残基であり;
X117が非極性残基であり;
X120が芳香族残基であり;
X124が、極性残基または拘束性残基であり;
X126が極性残基であり;
X136が芳香族残基であり;
X137が、極性残基または脂肪族残基であり;
X138が、塩基性残基または拘束性残基であり;
X146が塩基性残基であり;
X148が、脂肪族残基または芳香族残基であり;
X150が、芳香族残基、拘束性残基または極性残基であり;
X152が、C、または非極性残基、脂肪族残基、もしくは極性残基であり;
X155が、非極性残基または極性残基であり;
X156が極性残基であり;
X160が脂肪族残基であり;
X163が、脂肪族残基または拘束性残基であり;
X164が、脂肪族残基または拘束性残基であり;
X169が脂肪族残基であり;
X174が脂肪族残基であり;
X178が極性残基であり;
X195が、芳香族残基または極性残基であり;
X199が、脂肪族残基または芳香族残基であり;
X204が脂肪族残基であり;
X208が、システイン(C)、または拘束性残基、非極性残基、芳香族残基、極性残基、もしくは塩基性残基であり;
X209が脂肪族残基であり;
X211が脂肪族残基であり;
X215がシステイン(C)であり;
X217が極性残基であり;
X225が芳香族残基であり;
X230が脂肪族残基であり;
X252が芳香族残基であり;
X269が拘束性残基であり;
X273が芳香族残基であり;
X282が極性残基であり;
X292が極性残基であり;
X297が極性残基であり;
X302が、脂肪族残基であり;
X306が、脂肪族残基であり;
X321が拘束性残基であり;
X329が、拘束性残基、または芳香族残基である;
から選択される、項目17に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目19)
前記残基位置における前記アミノ酸残基差異が、以下:
X4がYであり;
X5がKであり;
X8がPであり;
X18が、CまたはIであり;
X25がQであり;
X26がHであり;
X27がTであり;
X28がPであり;
X30が、QまたはMであり;
X41が、HまたはSであり;
X42がGであり;
X48が、Q、D、V、G、またはAであり;
X49がTであり;
X50がLであり;
X54が、PまたはHであり;
X55がVであり;
X60がFであり;
X61がYであり;
X62が、T、YまたはFであり;
X65がAであり;
X81がGであり;
X94が、IまたはLであり;
X96がLであり;
X102が、LまたはKであり;
X117がGであり;
X120がYであり;
X124が、T、HまたはNであり;
X126がTであり;
X136が、YまたはFであり;
X137が、TまたはIであり;
X138が、KまたはPであり;
X146がRであり;
X148が、AまたはFであり;
X150が、F、H、またはSであり;
X152が、G、I、L、SまたはCであり;
X155が、M、VまたはTであり;
X156がQであり;
X160がLであり;
X163が、HまたはVであり;
X164が、VまたはPであり;
X169がLであり;
X174がAであり;
X178がSであり;
X195が、FまたはQであり;
X199が、WまたはIであり;
X204がAであり;
X208が、H、C、G、K、N、Y、DまたはSであり;
X209がLであり;
X211がIであり;
X215がCであり;
X217がNであり;
X225がYであり;
X230がVであり;
X252がFであり;
X269がPであり;
X273がYであり;
X282がSであり;
X292がTであり;
X297がSであり;
X302がAであり;
X306がLであり;
X321がPであり;
X329がHである;
から選択される、項目18に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目20)
前記アミノ酸配列が、以下:
X26が、芳香族残基、または拘束性残基であり;
X61が芳香族残基であり;
X62が、芳香族残基、または極性残基であり;
X65が脂肪族残基であり;
X94が脂肪族残基であり;
X136が芳香族残基であり;
X137が、極性残基、または脂肪族残基であり;
X199が、脂肪族残基、または芳香族残基であり;
X209が脂肪族残基であり;
X215がCであり;
X282が極性残基である;
から選択される1つまたは複数の残基差異をさらに含む、項目18に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目21)
前記アミノ酸配列が、以下:
X8が拘束性残基であり;
X60が芳香族残基であり;
X81が、非極性残基または小さい残基であり;
X96が脂肪族残基であり;
X124が、極性残基または拘束性残基であり;
X169が脂肪族残基であり;
X217が極性残基であり;
X269が拘束性残基であり;
X273が芳香族残基であり;
X297が極性残基であり;
X321が拘束性残基である;
から選択される1つまたは複数の残基差異をさらに含む、項目20に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目22)
前記アミノ酸配列が、以下:
X4が芳香族残基であり;
X48が、極性残基、酸性残基、脂肪族残基、または非極性残基であり;
X102が、脂肪族残基または塩基性残基であり;
X150が、芳香族残基、拘束性残基、または極性残基であり;
X152が、C、または非極性残基、脂肪族残基、もしくは極性残基であり;
X160が脂肪族残基であり;
X163が、脂肪族残基、または拘束性残基であり;
X174が脂肪族残基であり;
X178が極性残基であり;
X195が、芳香族残基または極性残基であり;
X208が、システイン(C)、または拘束性残基、非極性残基、芳香族残基、極性残基、もしくは塩基性残基であり;
X211が脂肪族残基であり;
X225が芳香族残基であり;
X230が脂肪族残基であり;
X252が芳香族残基であり;
X292が極性残基であり;
X306が脂肪族残基であり;
X329が、拘束性残基または芳香族残基である;
から選択される1つまたは複数の残基差異をさらに含む、項目20または21に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目23)
前記アミノ酸配列が、少なくとも以下の特徴:
X26が、芳香族残基、もしくは拘束性残基であり、かつ/またはX62が、芳香族残基、もしくは極性残基であり;
X65が脂肪族残基であり;
X136が芳香族残基であり;
X199が、脂肪族残基、または芳香族残基であり;
X209が脂肪族残基である;
をさらに含む、項目18から22のいずれか一項に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目24)
前記アミノ酸配列が、少なくとも以下の特徴:
X61が芳香族残基であり;
X62が、芳香族残基または極性残基であり;
X65が脂肪族残基であり;
X94が脂肪族残基であり;
X136が芳香族残基であり;
X199が、脂肪族残基または芳香族残基であり;
X209が脂肪族残基であり;
X215がCであり;
X282が極性残基である;
をさらに含む、項目18から22のいずれか一項に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目25)
前記アミノ酸配列が、少なくとも以下の特徴:
X8が拘束性残基であり;
X61が芳香族残基であり;
X62が、芳香族残基または極性残基であり;
X65が脂肪族残基であり;
X81が、非極性残基または小さい残基であり;
X94が脂肪族残基であり;
X136が芳香族残基であり;
X199が、脂肪族残基または芳香族残基であり;
X209が脂肪族残基であり;
X215がCであり;
X217が極性残基であり;
X269が拘束性残基であり;
X282が極性残基であり;
X297が極性残基であり;
X321が拘束性残基である;
をさらに含む、項目18から22のいずれか一項に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目26)
前記アミノ酸配列が、少なくとも以下の特徴:
X8が拘束性残基であり;
X60が芳香族残基であり;
X61が芳香族残基であり;
X62が、芳香族残基または極性残基であり;
X65が脂肪族残基であり;
X81が、非極性残基または小さい残基であり;
X94が脂肪族残基であり;
X96が脂肪族残基であり;
X124が、極性残基または拘束性残基であり;
X136が芳香族残基であり;
X169が脂肪族残基であり;
X199が、脂肪族残基または芳香族残基であり;
X209が脂肪族残基であり;
X215がCであり;
X217が極性残基であり;
X269が拘束性残基であり;
X273が芳香族残基であり;
X282が極性残基であり;
X297が極性残基であり;
X321が拘束性残基である;
をさらに含む、項目18から22のいずれか一項に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目27)
前記アミノ酸配列が、少なくとも以下の特徴:
X8が拘束性残基であり;
X60が芳香族残基であり;
X61が芳香族残基であり;
X62が、芳香族残基または極性残基であり;
X65が脂肪族残基であり;
X81が非極性残基であり;
X94が脂肪族残基であり;
X96が脂肪族残基であり;
X124が、極性残基または拘束性残基であり;
X126が極性残基であり;
X136が芳香族残基であり;
X150が、芳香族残基、拘束性残基、または極性残基であり;
X152が、システイン(C)、非極性残基、脂肪族残基、または極性残基であり;
X169が脂肪族残基であり;X199が、脂肪族残基、または芳香族残基であり;
X209が脂肪族残基であり;
X215がCであり;
X217が極性残基であり;
X269が拘束性残基であり;
X273が芳香族残基であり;
X282が極性残基であり;
X297が極性残基であり;
X321が拘束性残基である;
をさらに含む、項目18から22のいずれか一項に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目28)
前記アミノ酸配列が、少なくとも以下の特徴:
X26がHであり、かつ/またはX62が、TもしくはFであり;
X65がAであり;
X136がYまたはFであり;
X199が、W、またはIであり;
X209がLである;
をさらに含む、項目18から22のいずれか一項に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目29)
前記アミノ酸配列が、少なくとも以下の特徴:
X61がYであり;
X62が、TまたはFであり;
X65がAであり;
X94が、IまたはLであり;
X136が、YまたはFであり;
X199が、WまたはIであり;
X209がLであり;
X215がCであり;
X282がSである;
をさらに含む、項目18から22のいずれか一項に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目30)
前記アミノ酸配列が、少なくとも以下の特徴:
X8がPであり;
X61がYであり;
X62が、TまたはFであり;
X65がAであり;
X81がGであり;
X94が、IまたはLであり;
X136が、YまたはFであり;
X199が、WまたはIであり;
X209がLであり;
X215がCであり;
X217がNであり;
X269がPであり;
X282がSであり;
X297がSであり;
X321がPである;
をさらに含む、項目18から22のいずれか一項に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目31)
前記アミノ酸配列が、少なくとも以下の特徴:
X8がPであり;
X60がFであり;
X61がYであり;
X62が、TまたはFであり;
X65がAであり;
X81がGであり;
X94が、IまたはLであり;
X96がLであり;
X124が、T、HまたはNであり;
X136が、YまたはFであり;
X169がLであり;
X199が、WまたはIであり;
X209がLであり;
X215がCであり;
X217がNであり;
X269がPであり;
X273がYであり;
X282がSであり;
X297がSであり;
X321がPである;
をさらに含む、項目18から22のいずれか一項に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目32)
前記アミノ酸配列が、少なくとも以下の特徴:
X8がPであり;
X60がFであり;
X61がYであり;
X62が、TまたはFであり;
X65がAであり;
X81がGであり;
X94が、IまたはLであり;
X96がLであり;
X124が、T、HまたはNであり;
X126がTであり;
X136が、YまたはFであり;
X150が、F、H、またはSであり;
X152が、G、I、L、SまたはCであり;
X169がLであり;
X199が、WまたはIであり;
X209がLであり;
X215がCであり;
X217がNであり;
X269がPであり;
X273がYであり;
X282がSであり;
X297がSであり;
X321がPである;
をさらに含む、項目18から22のいずれか一項に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目33)
前記アミノ酸配列が、配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、または168の配列に対応する、項目1に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目34)
前記トランスアミナーゼが、前記ケトアミド基質を生成物に、配列番号4のポリペプチドより少なくとも50〜100倍以上の活性を伴って変換することができる、項目1に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目35)
前記アミノ酸配列が、配列番号16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、または168の配列に対応する、項目34に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目36)
前記トランスアミナーゼが、前記ケトアミド基質を生成物に、配列番号22のポリペプチドより少なくとも1.1〜5倍以上の活性を伴って変換することができる、項目1に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目37)
前記アミノ酸配列が、配列番号28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、または168の配列に対応する、項目36に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目38)
前記トランスアミナーゼが、前記ケトアミド基質を生成物に、配列番号48のポリペプチドより少なくとも1.1〜5倍以上の活性を伴って変換することができる、項目1に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目39)
前記アミノ酸配列が、配列番号50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、または168の配列に対応する、項目38に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目40)
前記トランスアミナーゼが、前記ケトアミド基質を生成物に、配列番号58のポリペプチドより1.1〜5倍以上の活性を伴って変換することができる、項目1に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目41)
前記アミノ酸配列が、配列番号68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、または168の配列に対応する、項目40に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
(項目42)
項目1から41のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
(項目43)
1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、または167の配列に対応する、項目42に記載のポリヌクレオチド。
(項目44)
項目42または43に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
(項目45)
制御配列をさらに含む、項目44に記載の発現ベクター。
(項目46)
前記制御配列がプロモーターを含む、項目45に記載の発現ベクター。
(項目47)
前記制御配列が分泌シグナルを含む、項目45に記載の発現ベクター。
(項目48)
項目44から47のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
(項目49)
E.coliである、項目48に記載の宿主細胞。
(項目50)
* で印を付けられた立体中心で、示された立体化学配置を有する構造式(I)の化合物:
Zは、OR 2 またはNR 2 R 3 であり;
R 1 は、C 1〜8 アルキル、アリール、ヘテロアリール、アリール−C 1〜2 アルキル、またはヘテロアリール−C 1〜2 アルキルであり;
R 2 およびR 3 はそれぞれ独立に、水素、C 1〜8 アルキル、アリール、またはアリール−C 1〜2 アルキルであり;あるいは
R 2 およびR 3 は、これらが結合している窒素原子と一緒に、O、S、NH、およびNC 1〜4 アルキルから選択される追加のヘテロ原子を任意選択により含有する、4〜7員の複素環系を形成し、前記複素環は、非置換であるか、またはオキソ、ヒドロキシ、ハロゲン、C 1〜4 アルコキシ、およびC 1〜4 アルキルから独立して選択される1〜3個の置換基で置換されており、アルキルおよびアルコキシは、非置換であるか、または1〜5個のフッ素で置換されており;前記複素環系は、5〜6員の飽和もしくは芳香族炭素環系、またはO、S、およびNC 0〜4 アルキルから選択される1〜2個のヘテロ原子を含有する、5〜6員の飽和もしくは芳香族複素環系と任意選択により縮合されており、前記縮合環系は、非置換であるか、またはヒドロキシ、アミノ、フッ素、C 1〜4 アルキル、C 1〜4 アルコキシ、およびトリフルオロメチルから選択される1〜2個の置換基で置換されており;
前記方法は、構造式(II)のプロキラルケトン
(項目51)
R 1 がベンジルであり、ベンジルのフェニル基が、非置換であるか、またはフッ素、トリフルオロメチル、およびトリフルオロメトキシからなる群から選択される1〜3個の置換基で置換されている、項目50に記載の方法。
(項目52)
ZがNR 2 R 3 である、項目50に記載の方法。
(項目53)
NR 2 R 3 が構造式(VII)の複素環:
(項目54)
*** で印を付けられた立体中心で、(R)−配置を有する構造式(1)の化合物:
Arは、フェニルであり、前記フェニルは、非置換であるか、またはフッ素、トリフルオロメチル、およびトリフルオロメトキシからなる群から独立して選択される1〜5個の置換基で置換されており;
R 4 は、水素、またはC 1〜4 アルキルであり、前記C 1〜4 アルキルは、非置換であるか、もしくは1〜5個のフッ素で置換され;
前記方法は、構造式(2)のプロキラルケトン:
(項目55)
Arが、2,5−ジフルオロフェニルまたは2,4,5−トリフルオロフェニルであり、R 4 がトリフルオロメチルである、項目54に記載の方法。
(項目56)
Arが2,4,5−トリフルオロフェニルである、項目55に記載の方法。
(項目57)
式(1a)の化合物:
(項目58)
式(I)の前記化合物、式(1)の化合物、または式(1a)の前記化合物が、少なくとも90%の鏡像異性体過剰率で製造される、項目50、54、または57に記載の方法。
(項目59)
式(I)の前記化合物、式(1)の化合物、または式(1a)の前記化合物が、少なくとも99%の鏡像異性体過剰率で製造される、項目50、54、または57に記載の方法。
(項目60)
前記アミノ基ドナーが、イソプロピルアミン、アラニン、3−アミノ酪酸、またはメチルベンジルアミンから選択される、項目50、54、または57に記載の方法。
(項目61)
前記アミノ基ドナーがイソプロピルアミンである、項目60に記載の方法。
(項目62)
前記反応のカルボニル副生成物を除去する工程をさらに含む、項目50、54、または57に記載の方法。
(項目63)
前記アミノ基ドナーがアミノ酸であり、前記カルボニル副生成物がケト酸である、項目62に記載の方法。
(項目64)
前記カルボニル副生成物が、水より高い蒸気圧を有し、前記カルボニル副生成物の除去が、非反応性ガスを用いたスパージングによるもの、または真空を適用することによるものである、項目63に記載の方法。
(項目65)
前記非反応性ガスが窒素ガスである、項目64に記載の方法。
(項目66)
前記アミノ基ドナーがイソプロピルアミンであり、前記カルボニル副生成物がアセトンである、項目64に記載の方法。
(項目67)
前記反応条件が、約7.0のpH〜約9.0のpHの間である、項目50、54、または57に記載の方法。
(項目68)
前記反応条件が、約8.5のpHである、項目67に記載の方法。
(項目69)
前記pHが、イソプロピルアミンを添加することによって維持される、項目67に記載の方法。
(項目70)
前記反応条件が、約25℃〜約50℃の温度である、項目50、54、または57に記載の方法。
(項目71)
前記反応条件が、約45℃の温度である、項目70に記載の方法。
(項目72)
前記溶媒がジメチルスルホキシドを含む、項目50、54、または57に記載の方法。
(項目73)
前記DMSOが約10%〜約50%(v/v)の間である、項目72に記載の方法。
(項目74)
前記DMSOが、約30%v/vである、項目73に記載の方法。
(項目75)
前記反応から構造式(I)の前記化合物、構造式(1)の前記化合物、または構造式(1a)の前記化合物を単離する工程をさらに含む、項目50、54、または57に記載の方法。
(項目76)
構造式(1)の前記化合物、または構造式(1a)の前記化合物を、適切な反応溶媒中で、薬学的に許容される酸と前記化合物とを接触させることによって、薬学的に許容される塩に変換する工程をさらに含む、項目54または57に記載の方法。
(項目77)
前記薬学的に許容される酸がリン酸であり、前記薬学的に許容される塩がリン酸二水素塩である、項目76に記載の方法。
(項目78)
前記反応溶媒から前記薬学的に許容される塩を結晶化させる工程をさらに含む、項目76に記載の方法。
(項目79)
(2R)−4−オキソ−4−[3−(トリフルオロメチル)−5,6−ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル]−1−(2,4,5−トリフルオロフェニル)ブタン−2−アミンホスフェート(1:1)一水和物を調製するための方法において、適切な反応条件下で、適切な有機溶媒中で、アミノ基ドナーの存在下で、項目1から41のいずれか一項に記載のトランスアミナーゼポリペプチドを用いて、式(1a)の化合物を式(2a)の生成物に変換する工程を含む改善であって、式(1a)の前記化合物が、
である、改善。
(項目80)
前記アミノ基ドナーがイソプロピルアミンである、項目79に記載の方法。
略語および定義
本明細書における説明の目的に関して、遺伝的にコードされるアミノ酸について使用される略語は、慣例的なものであり、以下の通りである。
Natl. Acad. Sci. USA 85巻:2,444頁の類似法の探索、これらのアルゴリズムのコンピュータ制御による実行(GCG Wisconsin Software Package中のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)、または視覚的な検査によって行うことができる(一般に、Current Protocols in Molecular Biology、F. M. Ausubelら編、Current Protocols、Greene Publishing Associates, Inc.とJohn Wiley & Sons, Inc.のジョイントベンチャー(1995年補遺)(Ausubel)を参照)。さらに、配列アライメントおよびパーセント配列同一性の決定には、提供されたデフォルトのパラメータを使用して、GCG Wisconsin Softwareパッケージ(Accelrys、Madison WI)中のBESTFITまたはGAPプログラムを使用することができる。
Res 18巻:6409〜6412頁(訂正、1991年、Nucleic Acids Res 19巻:698頁);Sambrookら、上記を参照);Suggsら、1981年、In Developmental Biology Using Purified Genes(Brownら編)、683〜693頁、Academic Press;およびWetmur、1991年、Crit Rev Biochem Mol Biol 26巻:227〜259頁を参照。すべての刊行物は、参照により本明細書に組み込む)。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるポリペプチドをコードし、規定条件、例えば、適度にストリンジェントな条件または高度にストリンジェントな条件などの下で、本開示の操作されたトランスアミナーゼ酵素をコードする配列の補体にハイブリダイズする。
CodonPreference、Genetics Computer Group
Wisconsin Package;Codon W、John Peden、University of Nottingham;Mclnerney, J. O、1998年、Bioinformatics 14巻:372〜73頁;Stenicoら、1994年、Nucleic Acids Res. 222437〜46頁;Wright, F.、1990年、Gene 87巻:23〜29頁を参照)。コドン使用頻度表は、生物のますます増えているリストに利用可能である(例えば、Wadaら、1992年、Nucleic Acids Res. 20巻:2111〜2118頁;Nakamuraら、2000年、Nucl. Acids Res. 28巻:292頁;Duretら、上記を参照;HenautおよびDanchin、「Escherichia coli and Salmonella」、1996年、Neidhardtら編、ASM Press、Washington D.C.、2047〜2066頁を参照)。コドン使用頻度を得るためのデータ源は、タンパク質をコードすることができる任意の利用可能なヌクレオチド配列に依拠することができる。これらのデータセットは、発現タンパク質(例えば、完全なタンパク質コード配列−CDS)、発現配列タグ(EST)、またはゲノム配列の予測されるコード領域をコードすることが実際に公知である核酸配列を含む(例えば、Mount, D.、Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis、8章、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N. Y.、2001年;Uberbacher, E. C.、1996年、Methods Enzymol. 266巻:259〜281頁;Tiwariら、1997年、Comput. Appl. Biosci. 13巻:263〜270頁を参照)。
実施形態の詳細な説明
本明細書の実施形態では、操作されたトランスアミナーゼは、配列番号2のトランスアミナーゼと比較した場合、ケトアミド基質の4−オキソ−4−[3−(トリフルオロメチル)−5,6−ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル]−1−(2,4,5−トリフルオロフェニル)ブタン−2−オンを、生成物の(2R)−4−オキソ−4−[3−(トリフルオロメチル)−5,6−ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル]−1−(2,4,5−トリフルオロフェニル)ブタン−2−アミンに立体選択的に変換するその能力が改善されている。トランスアミナーゼは、本明細書に記載されるものを含めて、一般に、補酵素であるリン酸ピリドキサール(PLP)を含有し、これは、アミノ基転移反応に関与する。PLPは、ポリペプチドが合成される宿主細胞によって提供することができ、またはポリペプチドの溶液にPLPを添加することによって提供することができる。トランスアミナーゼは、アミノ酸配列に関して記述される一方で、活性ポリペプチドは、補酵素としてPLPまたは適切な類似体を含有することが当業者によって理解されるであろう。
いくつかの実施形態では、改善されたトランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166または168に基づく参照配列と少なくとも約80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含み、ただし、改善されたトランスアミナーゼアミノ酸配列は、配列番号2と比較した場合、表2に列挙されたポリペプチド配列のいずれか1つに含まれる一連の残基差異のいずれか1つを含む。いくつかの実施形態では、改善されたトランスアミナーゼポリペプチドは、参照配列と比較した場合、他のアミノ酸残基位置で、1〜2、1〜3、1〜4、1〜5、1〜6、1〜7、1〜8、1〜9、1〜10、1〜11、1〜12、1〜14、1〜15、1〜16、1〜18、1〜20、1〜22、1〜24、1〜26、1〜30、1〜35、1〜40、1〜45、1〜50、1〜55、または1〜60の残基差異をさらに有することができる。いくつかの実施形態では、差異の数は、他の残基位置で、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、15、16、18、20、22、24、26、30、35、40、45、50、55、または60の残基差異とすることができる。いくつかの実施形態では、他の残基位置での残基差異は、保存アミノ酸残基との置換を含む。
acid)(Afp);ペニシラミン(Pen);1,2,3,4−テトラヒドロイソキノリン−3−カルボン酸(Tic);β−2−チエニルアラニン(Thi);メチオニンスルホキシド(Mso);N(w)−ニトロアルギニン(nArg);ホモリシン(hLys);ホスホノメチルフェニルアラニン(pmPhe);ホスホセリン(pSer);ホスホトレオニン(pThr);ホモアスパラギン酸(hAsp);ホモグルタミン酸(hGlu);1−アミノシクロペンタ−(2または3)−エン−4カルボン酸;ピペコリン酸(PA)、アゼチジン−3−カルボン酸(ACA);1−アミノシクロペンタン−3−カルボン酸;アリルグリシン(aOly);プロパルギルグリシン(pgGly);ホモアラニン(hAla);ノルバリン(nVal);ホモロイシン(hLeu)、ホモバリン(hVal);ホモイソロイシン(hIle);ホモアルギニン(hArg);N−アセチルリシン(AcLys);2,4−ジアミノ酪酸(Dbu);2,3−ジアミノ酪酸(Dab);N−メチルバリン(MeVal);ホモシステイン(hCys);ホモセリン(hSer);ヒドロキシプロリン(Hyp)、およびホモプロリン(hPro)が挙げられる。本明細書に記載されるポリペプチドが構成され得る追加のコードされないアミノ酸は、当業者に明らかとなるであろう(例えば、Fasman、1989年、CRC Practical Handbook of Biochemistry and
Molecular Biology、CRC Press、Boca Raton、FL、3〜70頁、およびこれに引用されている参考文献に提供されている様々なアミノ酸を参照。これらの文献のすべてが参照により組み込まれている)。これらのアミノ酸は、L−配置であっても、D−配置であってもよい。
USA 75巻:3727〜3731頁)から得られるプロモーター、ならびにtacプロモーター(DeBoerら、1983年、Proc. Natl Acad. Sci. USA 80巻:21〜25頁)が挙げられる。
nidulansトリオースリン酸イソメラーゼについての遺伝子から得られる。酵母宿主細胞についての適切なリーダーは、Saccharomyces cerevisiaeエノラーゼ(ENO−1)、Saccharomyces cerevisiae 3−ホスホグリセリン酸キナーゼ、Saccharomyces cerevisiae
α−因子、およびSaccharomyces cerevisiaeアルコール脱水素酵素/グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素(ADH2/GAP)についての遺伝子から得られる。
Cell Bio 15巻:5983〜5990頁に記載されている。
overview」、Anal. Biochem. 254巻(2号):157〜78頁;Daleら、1996年、「Oligonucleotide−directed
random mutagenesis using the phosphorothioate method」、Methods Mol. Biol. 57巻:369〜74頁;Smith、1985年、「In vitro mutagenesis」、Ann. Rev. Genet. 19巻:423〜462頁;Botsteinら、1985年、「Strategies and applications of in vitro mutagenesis」、Science 229巻:1193〜1201頁;Carter、1986年、「Site−directed mutagenesis」、Biochem. J. 237巻:1〜7頁;Kramerら、1984年、「Point Mismatch Repair」、Cell 38巻:879〜887頁;Wellsら、1985年、「Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites」、Gene 34巻:315〜323頁;Minshullら、1999年、「Protein evolution by molecular breeding」、Curr Opin
Chem Biol 3巻:284〜290頁;Christiansら、1999年、「Directed evolution of thymidine kinase
for AZT phosphorylation using DNA family shuffling」、Nature Biotech 17巻:259〜264頁;Crameriら、1998年、「DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution」、Nature 391巻:288〜291頁;Crameriら、1997年、「Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling」、Nature Biotech 15巻:436〜438頁;Zhangら、1997年、「Directed evolution of an effective fructosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening」、Proc Natl Acad Sci USA 94巻:45−4〜4509頁;Crameriら、1996年、「Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling」、Nature Biotech 14巻:315〜319頁;およびStemmer、1994年、「Rapid evolution of a
protein in vitro by DNA shuffling」、Nature 370巻:389〜391頁。すべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれている。
ZはOR2またはNR2R3であり、
R1は、C1〜8アルキル、アリール、ヘテロアリール、アリール−C1〜2アルキル、またはヘテロアリール−C1〜2アルキルであり;
R2およびR3はそれぞれ独立に、水素、C1〜8アルキル、アリール、またはアリール−C1〜2アルキルであり;あるいは
R2およびR3は、これらが結合している窒素原子と一緒に、O、S、NH、およびNC0−4アルキルから選択される追加のヘテロ原子を任意選択により含有する、4〜7員の複素環系を形成し、この複素環は、非置換であるか、またはオキソ、ヒドロキシ、ハロゲン、C1〜4アルコキシ、およびC1〜4アルキルから独立して選択される1〜3個の置換基で置換されており、アルキルおよびアルコキシは、非置換であるか、または1〜5個のフッ素で置換されており;この複素環系は、5〜6員の飽和もしくは芳香族炭素環系、またはO、S、およびNC0〜4アルキルから選択される1〜2個のヘテロ原子を含有する、5〜6員の飽和もしくは芳香族複素環系と任意選択により縮合されており、この縮合環系は、非置換であるか、またはヒドロキシ、アミノ、フッ素、C1〜4アルキル、C1〜4アルコキシ、およびトリフルオロメチルから選択される1〜2個の置換基で置換されている。これらの実施形態では、この方法は、構造式(II)のプロキラルケトン:
この方法のいくつかの実施形態では、式(II)のNR2R3は、構造式(III)の複素環:
Arは、非置換であるか、またはフッ素、トリフルオロメチル、およびトリフルオロメトキシからなる群から独立して選択される1〜5個の置換基で置換されているフェニルであり;
R4は、水素、または非置換であるか、もしくは1〜5個のフッ素で置換されたC1〜4アルキルである。そのような実施形態では、この方法は、構造式(2)のプロキラルケトン:
野生型トランスアミナーゼ遺伝子の取得および発現ベクターの構築
トランスアミナーゼ(TA)をコードする遺伝子を、トランスアミナーゼの報告されたアミノ酸配列、および参照により本明細書に組み込まれている米国出願公開第20080248539号の実施例1に記載されたようなコドン最適化アルゴリズムに基づいて、E.coli.内で発現させるために設計した。遺伝子は、一般に42ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを使用して合成し、この遺伝子を、lacプロモーターの制御下で、発現ベクターpCK110700(参照により本明細書に組み込まれている、米国出願公開第20050153417号中で図1として表されている)、またはpCK110900(参照により本明細書に組み込まれている、米国出願公開第20060195947号中で図3として表されている)中にクローン化した。この発現ベクターは、P15a複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子も含有する。得られたプラスミドは、標準的な方法を使用してE.coli.W3110中に形質転換した。コドンが最適化された遺伝子、およびコードされたポリペプチドを、表2に列挙し、これらの配列を、配列番号1および2として提供する。
トランスアミナーゼ粉末の生成−振盪フラスコ手順。
トランスアミナーゼの生成−発酵手順。
culture)(上述したように振盪フラスコ内で増殖させた)を播種し、0.5〜1.0の開始OD600にした。250〜1250rpmで発酵槽をアジテートし、0.6〜25L/分で発酵容器に空気を供給することによって、50%の飽和またはそれ以上の溶解酵素レベルを維持した。培養液のpHは、20%v/vの水酸化アンモニウムを添加することによって、7.0に維持した。培養液の増殖は、500g/LのCereloseデキストロース、12g/Lの塩化アンモニウム、および5.1g/Lの硫酸マグネシウム七水和物を含有するフィード溶液を添加することによって維持した。培養液が70+−10のOD600に到達した後、イソプロピル−β−D−チオガラクトシド(IPTG)を1mMの最終濃度まで添加することによって、トランスアミナーゼの発現を誘発し、発酵をさらに18時間継続した。次いで培養液を4℃に冷却し、回収するまでその温度で維持した。4℃で、Sorval RC 12BP遠心分離機で、5000gで40分間遠心分離することによって細胞を収集した。回収した細胞は、以下の下流回収プロセスにおいて直接使用するか、またはそのように使用するまでこれらを4℃で貯蔵するか、もしくは−80℃で凍結することができる。
ケトアミド基質をシタグリプチンに立体選択的に変換することができるArthrobacter sp.KNK168トランスアミナーゼの変異体を識別するためのハイスループットスクリーニング。
ケトアミド基質のシタグリプチンへの変換を判定するためのアキラルなHPLC法:ケトアミド基質(米国特許第7,326,708号に記載されたように調製した)のシタグリプチンへの酵素的変換は、Agilent Eclipse XDB−C8カラム(4.6×150mm、5μm)を備えたAgilent 1200 HPLCを使用して、1.5ml/分の流量で、溶離液として45:55の10mMのNH4AcMeCN、およびカラム温度40℃を使用して判定した。保持時間:ケトアミド基質:1.7分;シタグリプチン:1.4分。溶離液中のケトアミド基質および生成物は、1cmの経路長を用いて、210nmまたは286nmでのピーク面積として求めた。これらの条件を使用して、シタグリプチンについての検出限界は、5μg/mLであった。一般に、210nmの入射波長を、配列番号4と同様または等しい活性を有するトランスアミナーゼについての活性を測定するために使用した。
シタグリプチンの立体純度(stereopurity)を求めるためのキラルなHPLC法:シタグリプチンの立体異性体純度は、Daicel Chiralpak AD−H カラム(4.6×150mm、5μm)を備えたAgilent 1200 HPLCを使用して、0.8ml/分の流量で、溶離液として60:40:0.1:0.1のEtOH/ヘプタン/ジエチルアミン/水、および35℃のカラム温度を使用して求めた。保持時間:ケトアミド基質:6.3分;(S)−鏡像異性体:8.4分;シタグリプチン:10.8分。ケトアミド基質および生成物は、1cmの経路長を用いて、210nmまたは268nmでのピーク面積として求めた。ケトアミド基質のシタグリプチンへの低レベル変換を検出するための液体クロマトグラフィー−質量分析(LC/MS)法:ケトアミド基質のシタグリプチンへの低レベル酵素的変換は、LC/MS/MS法を使用して判定した。5マイクロリットルの試料を、Eclipse XDB−C8 HPLCカラム(4.6×150mm)中に装填し、0.2%のギ酸アンモニウムおよびメタノールの40:60移動相を用いて、1.0mL/分でアイソクラチックに溶出した。シタグリプチンの保持時間は、35℃で1.5分であった。質量分析法を、Waters Quattroトリプル四重極で検出するのに使用した。Q1は、408.1AMUでM+Hイオンを通過させるように設定し、Q3は、235.1娘イオンを通過させるように設定した。衝突セル(Q2)は、17.0の衝突エネルギー、および0.3mL/分のアルゴンガス流量を有していた。イオン化は、5μAのコロナ放電、130℃のソース温度、および600℃のプローブ温度を有するAPCIによるものであった。脱溶媒和ガス流量は100L/分であり、コーンガスは、50L/分に設定した。これらの条件を使用して、シタグリプチンの検出限界は、71pg/mLであった。
ケトアミド基質をシタグリプチンに立体選択的に変換することができるArthrobacter sp.KNK168トランスアミナーゼの変異体を識別するためのハイスループットスクリーニング。
Arthrobacter sp.KNK168トランスアミナーゼに由来する、表2において「+」で示された操作されたトランスアミナーゼによる、ケトアミド基質のメタノール中の立体選択的アミノ基転移。
Arthrobacter sp.KNK168に由来する、表2において「++」で示された操作されたトランスアミナーゼによる、ケトアミド基質のメタノール中の立体選択的アミノ基転移。
Arthrobacter sp.KNK168に由来する、表2において「+++」で示された操作されたトランスアミナーゼによる、ケトアミド基質のメタノール中の立体選択的アミノ基転移。
Arthrobacter sp.KNK168に由来する、表2において「++++」で示された操作されたトランスアミナーゼによる、ケトアミド基質のメタノール中の立体選択的アミノ基転移。
Arthrobacter sp.KNK168に由来する、表2において「+++++」で示された操作されたトランスアミナーゼによる、ケトアミド基質のDMSO中の立体選択的アミノ基転移
Arthrobacter sp.KNK168変異体に由来する、表2において「+++++」で示された改善されたトランスアミナーゼを、以下のようにDMSO中で、分取スケールで評価した。250μMのピリドキサール5’−リン酸を含むpH8.5の100mMのトリエタノールアミン−クロリドバッファー中のトランスアミナーゼ変異体(20mg/mL)の溶液250μLを、撹拌子を備えた5mLの反応バイアルに添加した。引き続いて、2Mのイソプロピルアミン塩酸塩500μL、その後にDMSO中のケトアミド基質(200mg/mL)の溶液250μLを、トランスアミナーゼ溶液に添加した。反応物を45℃で撹拌し、反応混合物から定期的に採取した試料のHPLC分析によってモニターした(分析条件については実施例4を参照)。表2は、「+++++」で示されたトランスアミナーゼ変異体に対応する配列番号、野生型トランスアミナーゼからのアミノ酸残基差異の数、および配列番号58のアミノ酸配列を有する酵素の活性と比べた、ケトアミド基質に向けたそれぞれの活性を提供する。
Arthrobacter sp.KNK168に由来する、表2において「++++++」で示された操作されたトランスアミナーゼによる、ケトアミド基質のDMSO中の立体選択的アミノ基転移
Arthrobacter sp.KNK168変異体に由来する、表2において「++++++」で示された改善されたトランスアミナーゼを、以下のようにDMSO中で、分取スケールで評価した。4000μMのピリドキサール5’−リン酸を含むpH8.5の100mMのトリエタノールアミン−クロリドバッファー中のトランスアミナーゼ変異体(8mg/mL)の溶液250μLを、撹拌子を備えた5mLの反応バイアルに添加した。引き続いて、4Mのイソプロピルアミン塩酸塩250μL、その後にDMSO中のケトアミド基質(100mg/mL)の溶液500μLを、トランスアミナーゼ溶液に添加した。反応物を45℃で撹拌し、反応混合物から定期的に採取した試料のHPLC分析によってモニターした(分析条件については実施例4を参照)。表2は、「++++++」で示されたトランスアミナーゼ変異体に対応する配列番号、野生型トランスアミナーゼからのアミノ酸残基差異の数、および配列番号104のアミノ酸配列を有する酵素の活性と比べた、ケトアミド基質に向けたそれぞれの活性を提供する。
ケトアミド基質をシタグリプチンに変換するための方法I
以下の実施例は、基質の4−オキソ−4−[3−(トリフルオロメチル)−5,6−ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル]−1−(2,4,5−トリフルオロフェニル)ブタン−2−オンの、生成物の(2R)−4−オキソ−4−[3−(トリフルオロメチル)−5,6−ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル]−1−(2,4,5−トリフルオロフェニル)ブタン−2−アミンへの変換を増大させるために使用される大規模方法を例示する。この方法は、窒素スパージングを使用することによって、アセトン副産物を除去し、基質の生成物への変換を増大させる。水中のイソプロピルアミンの添加は、体積を一定に保ち、反応物のpHを維持するのに役立つ。
勾配:分 H2O(0.1%のH3PO4)/CH3CN
0 90/10
5 5/95
6 5/95
6.01 90/10
8 停止
流量:1.5mL/分
カラム温度:25℃
試料体積:5μL
検出器:210nmのUV
HPLC分析のための試料は、1/1のH2O(0.1%のH3PO4)/CH3CN中、0.2mg/mLで調製した。上記クロマトグラフィー条件下の保持時間は、以下の通りであった。
ケトアミド基質:3.2分
ケトアミド基質(エノール):3.9分
基質−生成物エネアミン:4.1分。
ケトアミド基質のシタグリプチンへの変換を増大させるための方法II
以下の実施例は、基質の4−オキソ−4−[3−(トリフルオロメチル)−5,6−ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル]−1−(2,4,5−トリフルオロフェニル)ブタン−2−オンの、生成物の(2R)−4−オキソ−4−[3−(トリフルオロメチル)−5,6−ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル]−1−(2,4,5−トリフルオロフェニル)ブタン−2−アミンへの変換を増大させるために使用される第2の大規模方法を例示する。この方法は、アセトン生成物を除去し、基質の生成物への変換を増大させるために真空を使用する。先の実施例と同様に、水中のイソプロピルアミンの添加は、体積を一定に保ち、反応のpHを維持するのに役立つ。
方法。22Lの機械で撹拌される丸底(RB)フラスコは、ReactIRプローブ、4Mの水性イソプロピルアミンのリザーバに接続された塩基供給ライン、ケトアミド基質のリザーバに接続されたケトアミド供給ライン、pΗプローブ、ならびに制御ボックスおよびトラップへの真空ラインが装備されていた。このフラスコにイソプロピルアミン塩酸塩900gを装填し、その後、脱イオン水6.4L、およびトリエタノールアミン93mL(2m/sの先端速度)、およびピリドキサール5’−リン酸(pΗ8.4)10gを添加した。この後に、配列番号102を有する、溶解したトランスアミナーゼポリペプチド50gをフラスコに装填した。RTで10分撹拌した後、DMSO 1.5Lを30分にわたって添加し、反応器を40℃に加温した。温度が安定した後、pΗプローブを温度プローブと交換し、pΗ制御装置および4Mのイソプロピルアミン溶液を用いて、pHをpH8.5に維持した。ケトアミド基質(1Kg)をDMSO 2L中に溶解させ、5Lの添加漏斗に入れた。真空(最初に約500トル、次いで添加後に一晩375トル)を反応器にかけ、ケトアミド溶液を反応器に4時間(667mL/時間)にわたって添加した。合計1.45当量のイソプロピルアミンを25時間後に添加した。基質の生成物への変換は、約94%であった。
3×2Lですすいだ(合計6.6kg)。残渣を酸性水溶液中に入れ、洗浄して(合計約18L)抽出器中に入れ、次いで酢酸イソプロピル9L中に入れた。5NのNaOH(1.4L)を用いてpHを10に調整し、50LのChemGlass容器#1内で、165RPMで溶液をアジテートし、層を約10分間静置させ、酢酸イソプロピルを分離して除いた。溶液を酢酸イソプロピル9Lで再び抽出し、抽出した酢酸イソプロピル層を合わせ、20時間静置させた。この酢酸イソプロピル層を、ブライン6L(5.9kg)で洗浄した。IPAc溶液をアッセイし、これは、シタグリプチン861gを含有していた。ロータリー真空蒸発器上で、溶媒をIPAc(IPAc 19L中861g、90%のアッセイ収率)からIPAに、30℃で1時間にわたって供給し、50%の体積に濃縮することによって替えた。この時点で、シタグリプチン遊離塩基が溶液から析出した。IPA中1%の水2Lを添加することによって析出物を溶解させた。IPA中1%の水8Lを1時間にわたって、35〜40℃の浴温度で添加した。追加の析出物が形成するので、追加の水400mLを添加することによって、この析出物を溶解させた。溶液を、ロータリー真空蒸発器上に一晩置いたままにし、次いで追加のIPA中1%の水2Lとともに別の丸底フラスコに移した。濃縮により、シタグリプチンのIPA/水の溶液2.5746kgを得た。
リン酸シタグリプチン一水和物の調製
リン酸シタグリプチン一水和物の調製を以下のように例示する。
ケトアミド基質のシタグリプチンへの変換を増大させるための方法III
以下の実施例は、基質の4−オキソ−4−[3−(トリフルオロメチル)−5,6−ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル]−1−(2,4,5−トリフルオロフェニル)ブタン−2−オンの、生成物の(2R)−4−オキソ−4−[3−(トリフルオロメチル)−5,6−ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル]−1−(2,4,5−トリフルオロフェニル)ブタン−2−アミンへの変換を増大させるのに使用される第3の大規模方法を例示する。一般に、この方法は、実施例12に記載したのと同じ装置および条件を使用するが、より高い濃度のDMSOおよび基質を用いる。
方法:反応は、機械撹拌機、温度プローブ、pΗプローブ、および塩基添加ラインを装備した容器内で行った。塩基添加ラインは、水中4Mのイソプロピルアミン遊離塩基の供給を使用して、pHを8.6から8.4の間に制御するのに使用した。容器に、水1.92L、その後にトリエタノールアミン109mL(0.82モル、0.33当量)、および4Mのイソプロピルアミン溶液1.64L(6.56モル、2.67当量)を添加した。次いで、12NのHCl(424mL)を使用して、pHを8.5に調整した。次いで反応器に、PLP 6.7g(0.027モル、0.011当量)、その後に、配列番号110を有するトランスアミナーゼポリペプチド40gを装填し、この混合物を、穏やかにアジテートしながら慎重に溶解させた。容器を、温度プローブ、塩基添加ライン、pΗプローブ、および400RPMに設定された撹拌機を有する反応器ブロック上に配置した(注:pΗ制御ループはこの時点でオフである)。次に、DMSO2.22Lを撹拌中の溶液中に添加し、反応器を45℃に加熱した。温度が安定化されたとき、pΗ制御ループをオンにし、pHを8.5に調整した(pΗは、水中4Mのイソプロピルアミンで制御した)。この時点で、撹拌を600RPMに上昇させたが、渦形成を回避するために、先端速度は、2m/s未満に保持した。次いで、ケトアミド1.0kg(受け入れられるケトアミドは、半水化物として一般に96〜98wt%であるので、補正重量は1kgである;2.46モル、1.00当量)を、DMSO 1.11L中に溶解させた。次いでこのDMSO/ケトアミド溶液を、反応器に2〜3時間にわたって添加した。次いで反応器を、45℃で、pHを8.6〜8.4の間に維持してさらに約13時間撹拌し、アセトン除去を、300トルの真空および2fpsの窒素スイープを用いて実現した。約15時間の合計反応時間の後(1.3〜2.0当量のイソプロピルアミン取込み)、反応は、逆相HPLC分析によって判断した場合、90〜95%の変換であった。
濾過後処理:pH制御ループをオフにし、solka−floc 13gを容器に添加し、その後、pH2〜3まで12MのHClを添加した。次いで反応物を、45℃および1000RPMで1〜2時間エージングした。次いでスラリーを、フィルター(例えば、1kgスケールでの、濾紙を有するフリット付きプラスチックブーフナー、またはパイロットプラントスケールでの、リサイクルループをまったく含まないスパークルフィルター(sparkle filter))に通過させた。容器およびフィルターを、0.01NのHCl 1Lですすいだ。次いでこの水性酸性濾液にIPAc 3Lを添加し、次いで、水相のpHを19NのNaOHを用いてpH11に調整した。層を撹拌しながらアジテートし、次いで静置させ、分離した(穏やかな加熱または真空は、相分別を加速する)。これを、IPAc 3Lを用いてさらに2回繰り返し、次いで合わせた有機物を、ブライン3Lで洗浄した(pH11で)。次いで、シタグリプチン遊離塩基の得られたIPAc溶液を、収率についてアッセイし(一般に88〜92%のアッセイ収率;882〜922g)、下流処理してリン酸シタグリプチン一水和物にするために、溶媒をIPAに替えた。
直接抽出後処理:pH制御ループをオフにし、pH2〜3まで12MのHClを添加した。次いで反応物を、45℃および1000RPMで1〜2時間エージングした。このバッチをRTに冷却し、次いでIPA 3Lを添加し、その後IPAc 3Lを添加した。次いで水層のpHを、19NのNaOHを用いて11に調整した。混合物を20〜45℃でアジテートし(エマルジョンを破壊するために、熱を使用することができる)、次いで静置および分離させた。IPAc/IPA層を確保し、水層を80/20(体積/体積)のIPAc/IPA 3Lで抽出した。次いで、合わせたIPAc/IPA抽出物を、ブライン3Lで洗浄した。次いで、シタグリプチン遊離塩基の得られたIPAc/IPA 溶液を、収率についてアッセイし(一般に87〜90%のアッセイ収率;872〜902g)、下流処理してリン酸シタグリプチン一水和物にするために、溶媒をIPAに替えた。
ケトアミド基質のシタグリプチンへの変換を増大させるための方法IV
以下の実施例は、ケトアミド基質のシタグリプチン遊離塩基生成物への変換を増大させるために使用される第4の大規模方法、および引き続くリン酸シタグリプチンの調製を例示する。一般に、この方法は、実施例12、14、および15において記載したのと同じ装置条件を使用するが、以下に詳述されるような変更を伴う。
ケトアミド基質のシタグリプチンへの変換を増大させるための方法V
以下の実施例は、ケトアミド基質のシタグリプチン遊離塩基生成物への変換を増大させるために使用される第5の大規模方法、および引き続くリン酸シタグリプチンの調製を例示する。一般に、この大規模方法は、実施例16において記載したのと同じ装置および条件を使用するが、以下に詳述するようないくつかの変更を伴う。
Claims (59)
- 4−オキソ−4−[3−(トリフルオロメチル)−5,6−ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル]−1−(2,4,5−トリフルオロフェニル)ブタン−2−オン(「ケトアミド基質」)を、(2R)−4−オキソ−4−[3−(トリフルオロメチル)−5,6−ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル]−1−(2,4,5−トリフルオロフェニル)ブタン−2−アミン(「生成物」)に、変換することができるトランスアミナーゼポリペプチドであって、該トランスアミナーゼポリペプチドが、配列番号4と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列が、少なくとも以下の特徴:
(1)配列番号2のX223に対応する残基がPである;
(2)配列番号2のX69に対応する残基がG、C、T、AまたはSであり、かつ、配列番号2のX284に対応する残基がGである;および
(3)配列番号2のX122に対応する残基がM、I、VまたはHである、
を含むトランスアミナーゼポリペプチド。 - 前記トランスアミナーゼポリペプチドが、配列番号4と少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一であるか、または、配列番号4と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
- 前記ケトアミド基質を前記生成物に、
i)規定された反応条件下で、アミノ基ドナーであるイソプロピルアミンの存在下で、210nmでのΗPLC−UVによって検出可能な前記生成物のレベルまで、かつ、該規定された反応条件下で、配列番号4のポリペプチドの活性以上である活性を伴って変換することができ、ここで、該反応条件は、2g/Lのケトアミド基質、0.5Mのイソプロピルアミン、22℃、pΗ7.5、5%のDMSO、100μMのリン酸ピリドキサール、および20mg/mLのトランスアミナーゼポリペプチドを含む;
ii)少なくとも90%の鏡像異性体過剰率で変換することができる;または
iii)少なくとも99%の鏡像異性体過剰率で変換することができる、請求項1に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。 - 前記アミノ酸配列が、以下の特徴:
i)X69が、G、C、T、A、またはSであり;X122が、M、I、V、またはHであり、X223がPである;
ii)X122が、M、I、V、またはHであり;X223がPであり;X284がGである;
iii)X69が、G、C、T、A、またはSであり;X122が、M、I、V、またはHであり;X223がPであり;X284がGである;あるいは
iv)X69がCまたはTであり;X122がMまたはIであり;X223がPであり;X284がGである;
を含む、請求項1に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。 - 前記アミノ酸配列が、配列番号2と比較した場合に、以下の残基位置:X4;X5;X8;X18;X25;X26;X27;X28;X30;X41;X42;X48;X49;X50;X54;X55;X60;X61;X62;X65;X81;X94;X96;X102;X117;X120;X124;X126;X136;X137;X138;X146;X148;X150;X152;X155;X156;X160;X163;X164;X169;X174;X178;X195;X199;X204;X208;X209;X211;X215;X217;X225;X230;X252;X269;X273;X282、X292;X297;X302;X306;X321;およびX329の1つまたは複数で残基差異をさらに含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
- 前記残基位置における前記アミノ酸残基差異が、以下:
X4がYであり;
X5がKであり;
X8がPであり;
X18が、CまたはIであり;
X25がQであり;
X26がHであり;
X27がTであり;
X28がPであり;
X30が、QまたはMであり;
X41が、HまたはSであり;
X42がGであり;
X48が、Q、D、V、G、またはAであり;
X49がTであり;
X50がLであり;
X54が、PまたはHであり;
X55がVであり;
X60がFであり;
X61がYであり;
X62が、T、YまたはFであり;
X65がAであり;
X81がGであり;
X94が、IまたはLであり;
X96がLであり;
X102が、LまたはKであり;
X117がGであり;
X120がYであり;
X124が、T、HまたはNであり;
X126がTであり;
X136が、YまたはFであり;
X137が、TまたはIであり;
X138が、KまたはPであり;
X146がRであり;
X148が、AまたはFであり;
X150が、F、H、またはSであり;
X152が、G、I、L、SまたはCであり;
X155が、M、VまたはTであり;
X156がQであり;
X160がLであり;
X163が、HまたはVであり;
X164が、VまたはPであり;
X169がLであり;
X174がAであり;
X178がSであり;
X195が、FまたはQであり;
X199が、WまたはIであり;
X204がAであり;
X208が、H、C、G、K、N、Y、DまたはSであり;
X209がLであり;
X211がIであり;
X215がCであり;
X217がNであり;
X225がYであり;
X230がVであり;
X252がFであり;
X269がPであり;
X273がYであり;
X282がSであり;
X292がTであり;
X297がSであり;
X302がAであり;
X306がLであり;
X321がPであり;
X329がHである;
から選択される、請求項5に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。 - 前記アミノ酸配列が、少なくとも以下の特徴:
X26がHであり、かつ/またはX62が、TもしくはFであり;
X65がAであり;
X136がYまたはFであり;
X199が、W、またはIであり;
X209がLである;
をさらに含む、請求項6に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。 - 前記アミノ酸配列が、少なくとも以下の特徴:
X61がYであり;
X62が、TまたはFであり;
X65がAであり;
X94が、IまたはLであり;
X136が、YまたはFであり;
X199が、WまたはIであり;
X209がLであり;
X215がCであり;
X282がSである;
をさらに含む、請求項6から7のいずれか一項に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。 - 前記アミノ酸配列が、少なくとも以下の特徴:
X8がPであり;
X61がYであり;
X62が、TまたはFであり;
X65がAであり;
X81がGであり;
X94が、IまたはLであり;
X136が、YまたはFであり;
X199が、WまたはIであり;
X209がLであり;
X215がCであり;
X217がNであり;
X269がPであり;
X282がSであり;
X297がSであり;
X321がPである;
をさらに含む、請求項6から8のいずれか一項に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。 - 前記アミノ酸配列が、少なくとも以下の特徴:
X8がPであり;
X60がFであり;
X61がYであり;
X62が、TまたはFであり;
X65がAであり;
X81がGであり;
X94が、IまたはLであり;
X96がLであり;
X124が、T、HまたはNであり;
X136が、YまたはFであり;
X169がLであり;
X199が、WまたはIであり;
X209がLであり;
X215がCであり;
X217がNであり;
X269がPであり;
X273がYであり;
X282がSであり;
X297がSであり;
X321がPである;
をさらに含む、請求項6から9のいずれか一項に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。 - 前記アミノ酸配列が、少なくとも以下の特徴:
X8がPであり;
X60がFであり;
X61がYであり;
X62が、TまたはFであり;
X65がAであり;
X81がGであり;
X94が、IまたはLであり;
X96がLであり;
X124が、T、HまたはNであり;
X126がTであり;
X136が、YまたはFであり;
X150が、F、H、またはSであり;
X152が、G、I、L、SまたはCであり;
X169がLであり;
X199が、WまたはIであり;
X209がLであり;
X215がCであり;
X217がNであり;
X269がPであり;
X273がYであり;
X282がSであり;
X297がSであり;
X321がPである;
をさらに含む、請求項6から10のいずれか一項に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。 - 前記アミノ酸配列が、配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、または168の配列に対応する、請求項1に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
- 前記トランスアミナーゼが、前記ケトアミド基質を生成物に、配列番号4のポリペプチドより少なくとも50〜100倍以上の活性を伴って変換することができる、請求項1に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
- 前記アミノ酸配列が、配列番号16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、または168の配列に対応する、請求項13に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
- 前記トランスアミナーゼが、前記ケトアミド基質を生成物に、配列番号22のポリペプチドより少なくとも1.1〜5倍以上の活性を伴って変換することができる、請求項1に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
- 前記アミノ酸配列が、配列番号28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、または168の配列に対応する、請求項15に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
- 前記トランスアミナーゼが、前記ケトアミド基質を生成物に、配列番号48のポリペプチドより少なくとも1.1〜5倍以上の活性を伴って変換することができる、請求項1に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
- 前記アミノ酸配列が、配列番号50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、または168の配列に対応する、請求項17に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
- 前記トランスアミナーゼが、前記ケトアミド基質を生成物に、配列番号58のポリペプチドより1.1〜5倍以上の活性を伴って変換することができる、請求項1に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
- 前記アミノ酸配列が、配列番号68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、または168の配列に対応する、請求項19に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
- 請求項1から20のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、または167の配列に対応する、請求項21に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項21または22に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 制御配列をさらに含む、請求項23に記載の発現ベクター。
- 前記制御配列がプロモーターを含む、請求項24に記載の発現ベクター。
- 前記制御配列が分泌シグナルを含む、請求項24に記載の発現ベクター。
- 請求項23から26のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- E.coliである、請求項27に記載の宿主細胞。
- *で印を付けられた立体中心で、示された立体化学配置を有する構造式(I)の化合物:
Zは、OR2またはNR2R3であり;
R1は、C1〜8アルキル、アリール、ヘテロアリール、アリール−C1〜2アルキル、またはヘテロアリール−C1〜2アルキルであり;
R2およびR3はそれぞれ独立に、水素、C1〜8アルキル、アリール、またはアリール−C1〜2アルキルであり;あるいは
R2およびR3は、これらが結合している窒素原子と一緒に、O、S、NH、およびNC1〜4アルキルから選択される追加のヘテロ原子を任意選択により含有する、4〜7員の複素環系を形成し、前記複素環は、非置換であるか、またはオキソ、ヒドロキシ、ハロゲン、C1〜4アルコキシ、およびC1〜4アルキルから独立して選択される1〜3個の置換基で置換されており、アルキルおよびアルコキシは、非置換であるか、または1〜5個のフッ素で置換されており;前記複素環系は、5〜6員の飽和もしくは芳香族炭素環系、またはO、S、およびNC0〜4アルキルから選択される1〜2個のヘテロ原子を含有する、5〜6員の飽和もしくは芳香族複素環系と任意選択により縮合されており、前記縮合環系は、非置換であるか、またはヒドロキシ、アミノ、フッ素、C1〜4アルキル、C1〜4アルコキシ、およびトリフルオロメチルから選択される1〜2個の置換基で置換されており;
前記方法は、構造式(II)のプロキラルケトン
- R1がベンジルであり、ベンジルのフェニル基が、非置換であるか、またはフッ素、トリフルオロメチル、およびトリフルオロメトキシからなる群から選択される1〜3個の置換基で置換されている、請求項29に記載の方法。
- ZがNR2R3である、請求項29に記載の方法。
- ***で印を付けられた立体中心で、(R)−配置を有する構造式(1)の化合物:
Arは、フェニルであり、前記フェニルは、非置換であるか、またはフッ素、トリフルオロメチル、およびトリフルオロメトキシからなる群から独立して選択される1〜5個の置換基で置換されており;
R4は、水素、またはC1〜4アルキルであり、前記C1〜4アルキルは、非置換であるか、もしくは1〜5個のフッ素で置換され;
前記方法は、構造式(2)のプロキラルケトン:
- Arが、2,5−ジフルオロフェニルまたは2,4,5−トリフルオロフェニルであり、R4がトリフルオロメチルである、請求項33に記載の方法。
- Arが2,4,5−トリフルオロフェニルである、請求項34に記載の方法。
- 式(I)の前記化合物、式(1)の化合物、または式(1a)の前記化合物が、少なくとも90%の鏡像異性体過剰率で製造される、請求項29、33、または36に記載の方法。
- 式(I)の前記化合物、式(1)の化合物、または式(1a)の前記化合物が、少なくとも99%の鏡像異性体過剰率で製造される、請求項29、33、または36に記載の方法。
- 前記アミノ基ドナーが、イソプロピルアミン、アラニン、3−アミノ酪酸、またはメチルベンジルアミンから選択される、請求項29、33、または36に記載の方法。
- 前記アミノ基ドナーがイソプロピルアミンである、請求項39に記載の方法。
- 前記反応のカルボニル副生成物を除去する工程をさらに含む、請求項29、33、または36に記載の方法。
- 前記アミノ基ドナーがアミノ酸であり、前記カルボニル副生成物がケト酸である、請求項41に記載の方法。
- 前記カルボニル副生成物が、水より高い蒸気圧を有し、前記カルボニル副生成物の除去が、非反応性ガスを用いたスパージングによるもの、または真空を適用することによるものである、請求項42に記載の方法。
- 前記非反応性ガスが窒素ガスである、請求項43に記載の方法。
- 前記アミノ基ドナーがイソプロピルアミンであり、前記カルボニル副生成物がアセトンである、請求項43に記載の方法。
- 前記反応条件が、7.0のpH〜9.0のpHの間である、請求項29、33、または36に記載の方法。
- 前記反応条件が、8.5のpHである、請求項46に記載の方法。
- 前記pHが、イソプロピルアミンを添加することによって維持される、請求項46に記載の方法。
- 前記反応条件が、25℃〜50℃の温度である、請求項29、33、または36に記載の方法。
- 前記反応条件が、45℃の温度である、請求項49に記載の方法。
- 前記溶媒がジメチルスルホキシドを含む、請求項29、33、または36に記載の方法。
- 前記DMSOが10%〜50%(v/v)の間である、請求項51に記載の方法。
- 前記DMSOが、30%v/vである、請求項52に記載の方法。
- 前記反応から構造式(I)の前記化合物、構造式(1)の前記化合物、または構造式(1a)の前記化合物を単離する工程をさらに含む、請求項29、33、または36に記載の方法。
- 構造式(1)の前記化合物、または構造式(1a)の前記化合物を、適切な反応溶媒中で、薬学的に許容される酸と前記化合物とを接触させることによって、薬学的に許容される塩に変換する工程をさらに含む、請求項33または36に記載の方法。
- 前記薬学的に許容される酸がリン酸であり、前記薬学的に許容される塩がリン酸二水素塩である、請求項55に記載の方法。
- 前記反応溶媒から前記薬学的に許容される塩を結晶化させる工程をさらに含む、請求項55に記載の方法。
- 前記アミノ基ドナーがイソプロピルアミンである、請求項58に記載の方法。
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