JP5673348B2 - Mass spectrometry data analysis method and analysis apparatus - Google Patents

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Description

本発明は、試料の２次元領域内の複数の微小領域に対しそれぞれ質量分析を実行して収集される質量分析イメージジングデータを解析する質量分析データ解析方法及び解析装置に関する。   The present invention relates to a mass spectrometry data analysis method and an analysis apparatus for analyzing mass spectrometry imaging data collected by executing mass analysis on a plurality of microscopic areas in a two-dimensional area of a sample.

生体組織等の試料の形態観察を行うと同時に、その試料上の所定領域に存在する物質（分子）の分布を測定する装置として、顕微質量分析装置或いはイメージング質量分析装置などと呼ばれる装置が開発されている（非特許文献１など参照）。こうした装置によれば、試料をすり潰したり破砕したりすることなく試料の形態をほぼ維持したまま、顕微観察に基づいて指定された試料上の任意の領域に含まれる特定の質量電荷比m/zをもつイオンの分布画像（マッピング画像）を得ることが可能であり、特に、生化学分野、医療・薬学分野などにおいて、例えば生体内細胞に含まれる特定のタンパク質等の成分の分布情報を得るといった応用が期待されている。   A device called a microscopic mass spectrometer or an imaging mass spectrometer has been developed as a device for observing the morphology of a sample such as a biological tissue and simultaneously measuring the distribution of a substance (molecule) present in a predetermined region on the sample. (See Non-Patent Document 1, etc.). According to such an apparatus, a specific mass-to-charge ratio m / z included in an arbitrary region on a sample designated based on microscopic observation while maintaining the shape of the sample almost without crushing or crushing the sample. It is possible to obtain a distribution image (mapping image) of ions having, especially in the biochemistry field, the medical / pharmaceutical field, etc., for example, to obtain distribution information of components such as specific proteins contained in cells in vivo. Application is expected.

イメージング質量分析において試料に関する所望の情報、例えば試料を特徴付ける物質の種類やその濃度分布などを分析者が容易に把握できるようにするには、収集した質量分析イメージングデータに対して適切な解析処理を実行し、その結果を適切な態様で表示することが重要である。試料上の或る程度の面積の２次元領域に対する質量分析イメージングデータを取得した場合、このデータは多数の測定点（微小領域）のマススペクトルデータを含む。そのため、データの量は極めて膨大になる。このような膨大な量のデータから、人間が目で見て有意な情報を導出することは、多大な時間と労力とを要する。   In order to enable the analyst to easily grasp the desired information about the sample in imaging mass spectrometry, such as the type of substance that characterizes the sample and its concentration distribution, appropriate analysis processing must be performed on the collected mass spectrometry imaging data. It is important to run and display the results in an appropriate manner. When mass spectrometry imaging data for a two-dimensional region of a certain area on a sample is acquired, this data includes mass spectral data of a large number of measurement points (microregions). Therefore, the amount of data becomes extremely large. It takes a lot of time and labor to derive meaningful information from a huge amount of data.

或る測定領域において特異的分布を示す質量電荷比を把握するには、一般的に、まず質量分析スペクトルデータに対しピーク検出を実行することにより解析対象ピークの質量電荷比を選出する（非特許文献２参照）。ピーク検出手法の一例としては、マススペクトル上で信号強度が高い順に指定された個数のピークを抽出し、このピークの質量電荷比を解析対象とする方法が知られている。この方法では、信号強度のみに依存したピーク選出が行われるため、同一物質に由来するモノアイソトピックピークや同位体ピークが互いに識別されることなく信号強度が或る程度以上大きいピークは全て選出されてしまう。そのため、マススペクトルから所定個数のピークを選出しても、実際には同じ物質由来の同位体ピークが含まれている（つまり選出されるピークが実質的に重複したものとなる）ことがよくある。これを避けるには、マススペクトトル上で同一物質由来のモノアイソトピックピークと同位体ピークとを識別する、又は、同一物質由来の複数の同位体ピークが属する同位体ピーク群を識別することが必要である。   In order to grasp the mass-to-charge ratio showing a specific distribution in a certain measurement region, generally, the mass-to-charge ratio of the peak to be analyzed is selected by first performing peak detection on the mass spectrometry spectrum data (non-patented). Reference 2). As an example of the peak detection method, a method is known in which a specified number of peaks are extracted from a mass spectrum in descending order of signal intensity, and the mass-to-charge ratio of the peaks is an analysis target. In this method, peak selection that depends only on the signal intensity is performed, so that all peaks having a signal intensity of a certain level or higher are selected without distinguishing monoisotopic peaks or isotope peaks derived from the same substance. End up. Therefore, even if a predetermined number of peaks are selected from the mass spectrum, in fact, isotope peaks derived from the same substance are often included (that is, the selected peaks are substantially duplicated). . To avoid this, it is necessary to identify monoisotopic peaks and isotope peaks derived from the same substance on the mass spectrum, or to identify isotope peaks to which a plurality of isotope peaks derived from the same substance belong. is necessary.

同一物質由来のモノアイソトピックピークと同位体ピークとが共存するマススペクトルにおいて、両ピークを識別する方法として特許文献１に記載の方法がある。これは、実測のマススペクトル上で１つの同位体ピーク群に属すると推定される複数の同位体ピークの強度比と各元素の天然同位体比などに基づいて理論的に計算される同位体ピークの強度比とを比較し、強度比が一致すると判断される同位体ピーク群を選別した上で、該同位体ピーク群に含まれるピークの中からモノアイソトピックイオンピークを選別するという方法である。しかしながら、この方法は基本的に１つのマススペクトルを対象とした処理を行うものである。そのため、この方法を質量分析イメージジングデータの解析に用いる場合には、１つの微小領域に対して得られたマススペクトル毎に同様の処理を繰り返し行う必要があり、この処理自体に膨大な時間が掛かる。また、得られる結果（ピークのm/z値）は各微小領域で別個になされた処理によるものであるため、イメージングデータとして扱うためには各微小領域の結果（m/z値）間に対応付けを行う必要があり面倒である。さらに、測定条件によっては複数の同位体ピークの強度比が理論通りにならない場合があるが、そうした場合には本方法を適用することができない。   As a method for identifying both peaks in a mass spectrum in which a monoisotopic peak and an isotope peak derived from the same substance coexist, there is a method described in Patent Document 1. This is an isotope peak that is theoretically calculated based on the intensity ratio of multiple isotope peaks estimated to belong to one isotope peak group on the measured mass spectrum and the natural isotope ratio of each element. Isotope peak groups that are determined to match the intensity ratio, and then monoisotopic ion peaks are selected from the peaks included in the isotope peak groups. . However, this method basically performs processing for one mass spectrum. Therefore, when this method is used for analysis of mass spectrometry imaging data, it is necessary to repeat the same processing for each mass spectrum obtained for one minute region, and this processing itself takes a huge amount of time. It takes. In addition, since the results (peak m / z values) obtained are the result of processing performed separately for each minute region, it corresponds between the results (m / z values) for each minute region for handling as imaging data. It is necessary and troublesome. Furthermore, the intensity ratio of a plurality of isotope peaks may not be as theoretical depending on the measurement conditions, but in this case, this method cannot be applied.

質量分析イメージングデータに限定したモノアイソトピックピーク／同位体ピークの識別方法としては、特許文献２に記載の方法がある。この方法では、マススペクトル上のピークの強度比を基に選出した同位体ピーク候補のマッピング画像をそれぞれ作成し、そのマッピング画像の類似性を判断して同一物質由来の同位体ピークが属する同位体クラスタとそれに含まれるモノアイソトピックピークとを決定するようにしている。しかしながら、複数のマッピング画像の類似性を自動的に判断することは難しいため、分析担当者が画像の類似性を目視で判断する作業が必要となるが、そうした判断には個人差が伴うので、結果の安定性や客観性を保つのが困難である。   As a method for identifying monoisotopic peaks / isotope peaks limited to mass spectrometry imaging data, there is a method described in Patent Document 2. In this method, mapping images of isotope peak candidates selected based on the intensity ratio of the peaks on the mass spectrum are created, and the isotopes to which the isotopic peaks from the same substance belong are determined by judging the similarity of the mapping images. The cluster and the monoisotopic peak included in the cluster are determined. However, since it is difficult to automatically determine the similarity of multiple mapping images, it is necessary for the analyst to visually determine the similarity of images, but such determination involves individual differences. It is difficult to maintain the stability and objectivity of the results.

特開２００６−２８４３０５号公報JP 2006-284305 A 国際公開２００８／１２６１５１号パンフレットInternational Publication 2008/126151 Pamphlet

小河潔、ほか５名、「顕微質量分析装置の開発」、島津評論、株式会社島津製作所、平成18年3月31日発行、第62巻、第3・4号、p.125-135Kiyoshi Ogawa and five others, "Development of a microscopic mass spectrometer", Shimadzu review, Shimadzu Corporation, published on March 31, 2006, Volume 62, No. 3, p.125-135 リアム（Liam A. McDonnell）、ほか４名、「イメージング・マス・スペクトロメトリー・データ・リダクション：オートメイテッド・フューチャー・アイデンティフィケイション・アンド・イクストラクション（Imaging Mass Spectrometry Data Reduction : Automated Feature Identification and Extraction）」、アメリカン・ソサイエティ・フォー・マス・スペクトロメトリー（American Society for Mass Spectrometry）、2010年、21、p.1969-1978Liam A. McDonnell and four others, "Imaging Mass Spectrometry Data Reduction: Automated Feature Identification and Extraction), American Society for Mass Spectrometry, 2010, 21, p.1969-1978

本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、その目的とするところは、イメージング質量分析により収集されたデータに対しピーク検出を実行し解析対象ピークの質量電荷比を求める際に、測定条件とは無関係に且つ分析担当者等の判断に依らずに、高い精度で以て同一物質由来のモノアイソトピックピーク／同位体ピークを識別してピーク選出を行うことができる質量分析データ解析方法及び解析装置を提供することにある。   The present invention has been made in order to solve the above-described problems, and the object of the present invention is to perform peak detection on the data collected by imaging mass spectrometry and obtain the mass-to-charge ratio of the analysis target peak. Mass spectrometry data analysis that can identify monoisotopic peaks / isotope peaks derived from the same substance and perform peak selection with high accuracy regardless of measurement conditions and without the judgment of the analyst. It is to provide a method and an analysis apparatus.

上記課題を解決するために成された第１発明は、試料上の２次元領域内に設定された複数の微小領域に対してそれぞれ所定質量電荷比範囲に亘る質量分析を実行することにより収集されたデータを解析処理する質量分析データ解析方法であって、
a)前記微小領域毎に得られるマススペクトルデータに対しピーク検出処理を実行してピークの強度と質量電荷比とを含むピーク情報を収集するピーク検出ステップと、
b)前記ピーク検出ステップにより得られた各微小領域のピーク情報を集め、全てのピークについて質量電荷比毎に空間強度分布を比較可能とするべく、質量電荷比毎に、全ての微小領域における強度をそれぞれ異なる軸とする多次元空間での強度のノルムを１又は他の所定の値にするように、各微小領域における強度値を規格化する強度規格化ステップと、
c)前記強度規格化ステップによる規格化後の質量電荷比毎の空間強度分布に対してクラスタリングを用いることにより、前記ピーク情報に含まれる質量電荷比を所定数のクラスタに分類するクラスタリング実行ステップと、
d)同一クラスタに分類された複数の質量電荷比について、少なくともその質量電荷比の差を利用して同一物質由来のイオンの質量電荷比を識別する識別ステップと、
を有することを特徴としている。
The first invention made to solve the above problems is collected by executing mass analysis over a predetermined mass-to-charge ratio range for each of a plurality of minute regions set in a two-dimensional region on a sample. A mass spectrometry data analysis method for analyzing the collected data,
a) a peak detection step for collecting peak information including peak intensity and mass-to-charge ratio by performing a peak detection process on the mass spectrum data obtained for each micro area;
b) Collect the peak information of each micro area obtained by the peak detection step, and compare the intensity in all micro areas for each mass to charge ratio so that the spatial intensity distribution can be compared for each mass to charge ratio for all peaks. An intensity normalization step for normalizing the intensity value in each minute region so that the norm of the intensity in a multidimensional space having different axes as 1 or another predetermined value ;
c) a clustering execution step of classifying the mass-to-charge ratio included in the peak information into a predetermined number of clusters by using clustering for the spatial intensity distribution for each mass-to-charge ratio after normalization by the intensity normalization step; ,
d) an identification step for identifying a mass-to-charge ratio of ions derived from the same substance using at least a difference between the mass-to-charge ratios of a plurality of mass-to-charge ratios classified into the same cluster;
It is characterized by having.

また第２発明に係る質量分析データ解析装置は、第１発明に係る質量分析データ解析方法を実施するための装置であって、試料上の２次元領域内に設定された複数の微小領域に対してそれぞれ所定質量電荷比範囲に亘る質量分析を実行することにより収集されたデータを解析処理する質量分析データ解析装置において、
a)前記微小領域毎に得られるマススペクトルデータに対しピーク検出処理を実行してピークの強度と質量電荷比とを含むピーク情報を収集するピーク検出手段と、
b)前記ピーク検出手段により得られた各微小領域のピーク情報を集め、全てのピークについて質量電荷比毎に空間強度分布を比較可能とするべく、質量電荷比毎に、全ての微小領域における強度をそれぞれ異なる軸とする多次元空間での強度のノルムを１又は他の所定の値にするように、各微小領域における強度値を規格化する強度規格化手段と、
c)前記強度規格化手段による規格化後の質量電荷比毎の空間強度分布に対してクラスタリングを用いることにより、前記ピーク情報に含まれる質量電荷比を所定数のクラスタに分類するクラスタリング実行手段と、
d)同一クラスタに分類された複数の質量電荷比について、少なくともその質量電荷比の差を利用して同一物質由来のイオンの質量電荷比を識別する識別手段と、
を備えることを特徴としている。
A mass spectrometry data analysis apparatus according to the second invention is an apparatus for carrying out the mass spectrometry data analysis method according to the first invention, and for a plurality of minute regions set in a two-dimensional region on a sample. In a mass spectrometry data analysis apparatus for analyzing data collected by executing mass spectrometry over a predetermined mass-to-charge ratio range,
a) Peak detection means for collecting peak information including peak intensity and mass-to-charge ratio by performing peak detection processing on the mass spectrum data obtained for each minute region;
b) Collect the peak information of each micro area obtained by the peak detection means, and compare the intensity in all micro areas for each mass to charge ratio so that the spatial intensity distribution can be compared for each mass to charge ratio for all peaks. Intensity normalizing means for normalizing the intensity value in each minute region so that the norm of the intensity in a multidimensional space having different axes as 1 or another predetermined value ;
c) clustering execution means for classifying the mass-to-charge ratio included in the peak information into a predetermined number of clusters by using clustering for the spatial intensity distribution for each mass-to-charge ratio after normalization by the intensity normalization means; ,
d) for a plurality of mass-to-charge ratios classified into the same cluster, identification means for identifying the mass-to-charge ratio of ions derived from the same substance using at least the difference between the mass-to-charge ratios;
It is characterized by having.

第１発明に係る質量分析データ解析方法の具体的な一態様として、上記識別ステップでは、同一クラスタに分類された複数の質量電荷比について、質量電荷比の差と前記規格化がなされない強度情報とを用いて同一物質由来の同位体群に属する質量電荷比を識別し、同一同位体群に属する複数の質量電荷比の中でモノアイソトピックピークに対応する質量電荷比のみを選出するものとすることができる。即ち、質量電荷比毎の空間強度分布に対するクラスタリングを利用して、各元素の主同位体（最も存在比の大きな安定同位体）のみを含むモノアイソトピックイオンに対応したピークと、主同位体以外の同位体を少なくとも一部含む同位体イオンに対応したピークとを識別することができる。   As a specific aspect of the mass spectrometry data analysis method according to the first invention, in the identification step, with respect to a plurality of mass-to-charge ratios classified into the same cluster, the difference between the mass-to-charge ratios and the intensity information that is not normalized To identify the mass-to-charge ratio belonging to the same isotope group derived from the same substance, and to select only the mass-to-charge ratio corresponding to the monoisotopic peak among the plurality of mass-to-charge ratios belonging to the same isotope group can do. In other words, using clustering for the spatial intensity distribution for each mass-to-charge ratio, peaks corresponding to monoisotopic ions containing only the main isotopes of each element (stable isotopes with the highest abundance ratio) and other than main isotopes The peak corresponding to the isotope ion containing at least a part of the isotope can be discriminated.

また第１発明に係る質量分析データ解析方法の具体的な別の態様として、上記識別ステップではさらに、同一クラスタに分類された複数の質量電荷比について、質量電荷比の差を用いて同一物質由来の複数のアダクトイオンピークに対応する質量電荷比を識別し、同一物質由来の複数のアダクトイオンピークの中で１つのピークに対応する質量電荷比を選出するものとすることができる。なお、アダクトイオンとは目的とするイオンにＮａ、Ｋなどのアルカリ金属やアンモニア等の特定の成分が付加したイオンである。   Further, as another specific aspect of the mass spectrometry data analysis method according to the first invention, in the identification step, a plurality of mass-to-charge ratios classified into the same cluster are further derived from the same substance using a difference in mass-to-charge ratios. Mass-to-charge ratios corresponding to a plurality of adduct ion peaks, and a mass-to-charge ratio corresponding to one peak among a plurality of adduct ion peaks derived from the same substance can be selected. The adduct ion is an ion obtained by adding a specific component such as alkali metal such as Na or K or ammonia to the target ion.

元素毎に同位体の天然存在比は決まっているため、同一物質由来であって構成元素の同位体のみが相違する各種イオンは、絶対的な強度はそれぞれ異なるものの、類似した空間強度分布を示す。そのため、各微小領域における強度値を規格化すると、空間強度分布における強度の絶対値の影響はなくなるから、同一物質に由来し同位体のみが異なる或いは別の成分が付加して質量電荷比が相違する空間強度分布において、クラスタリング手法でいうところの距離は小さくなる。それにより、クラスタリング実行ステップにおいてクラスタリングが実行されたときに、同一物質に由来する異なる質量電荷比の空間強度分布が同一クラスタとして分類される確率が高くなり、識別ステップにおいて例えば同一物質由来のモノアイソトピックイオンと同位体イオンにそれぞれ対応したピークを識別することが可能となる。   Since the natural abundance of isotopes is determined for each element, various ions that are derived from the same substance and differ only in the isotopes of the constituent elements show similar spatial intensity distributions, although their absolute intensities differ. . Therefore, when the intensity value in each micro region is normalized, the influence of the absolute value of the intensity in the spatial intensity distribution is eliminated, so only the isotopes that are derived from the same substance or different components are added, resulting in different mass-to-charge ratios. In the spatial intensity distribution, the distance in the clustering method becomes small. As a result, when clustering is executed in the clustering execution step, the probability that spatial intensity distributions of different mass-to-charge ratios originating from the same substance are classified as the same cluster is increased. Peaks corresponding to topic ions and isotope ions can be identified.

なお、クラスタリング実行ステップにおいてクラスタリングを実行する際に、クラスタ数が少なすぎると１つのクラスタに入る質量電荷比の数が多すぎて同一物質由来イオンの識別精度の低下に繋がる。一方、クラスタ数が多すぎると同一物質に由来するイオンの空間強度分布が異なるクラスタに入ってしまう可能性が高まり、やはり識別精度の低下に繋がる。こうした問題に対しては、クラスタ数を予め指定するのではなく、クラスタリング実行ステップにおいてクラスタリングを実行する際に例えば分散分析法を用いて最適又はそれに近いクラスタ数を自動的に決定するようにするとよい。   When performing clustering in the clustering execution step, if the number of clusters is too small, the number of mass-to-charge ratios entering one cluster is too large, leading to a reduction in identification accuracy of ions from the same substance. On the other hand, if the number of clusters is too large, there is a high possibility that the spatial intensity distribution of ions derived from the same substance will enter different clusters, which also leads to a decrease in identification accuracy. For such a problem, it is better not to specify the number of clusters in advance, but to automatically determine the optimum or close number of clusters using, for example, analysis of variance when performing clustering in the clustering execution step. .

本発明に係る質量分析データ解析方法及び解析装置によれば、上述したように質量電荷比毎の空間強度分布の絶対的な強度の影響は排除されるため、同位体イオンの強度比が理論通りにならないような測定条件の下で取得されたデータについても、高い精度で以て同一物質由来のモノアイソトピックイオンと同位体イオンとを識別して目的とするモノアイソトピックピークを選出したり、高い精度で以て同一物質由来の複数のアダクトピークの中から１つを選出したりすることができる。また、従来一般的に、生体試料の質量分析を行うに際し、不要なアダクトイオンの発生を防止するために特殊な前処理を行う場合もあるが、本発明によれば、こうした前処理を行わなくても不要なアダクトイオンピークを除去できるので、前処理の手間を省くことができる。   According to the mass spectrometry data analysis method and analysis apparatus according to the present invention, as described above, the influence of the absolute intensity of the spatial intensity distribution for each mass-to-charge ratio is eliminated, so that the intensity ratio of the isotope ions is as theoretical. Even for data acquired under measurement conditions that do not become uncertain, it is possible to identify monoisotopic ions and isotope ions derived from the same substance with high accuracy and select the desired monoisotopic peak, One of a plurality of adduct peaks derived from the same substance can be selected with high accuracy. Further, in general, when performing mass spectrometry of a biological sample, special pretreatment may be performed in order to prevent generation of unnecessary adduct ions, but according to the present invention, such pretreatment is not performed. However, since unnecessary adduct ion peaks can be removed, it is possible to save the time and effort of pretreatment.

さらにまた、本発明に係る質量分析データ解析方法及び解析装置によれば、質量電荷比毎の空間強度分布を分析担当者が目視で比較・判断する必要がないので、分析担当者の負担が軽減される、分析担当者の経験や技量に依存しない安定性・正確性の高いモノアイソトピックピーク／同位体ピーク識別が可能である、高いスループットを実現できる、といった利点もある。   Furthermore, according to the mass spectrometry data analysis method and the analysis device according to the present invention, it is not necessary for the analyst to visually compare and judge the spatial intensity distribution for each mass-to-charge ratio, thereby reducing the burden on the analyst. In addition, there are advantages in that monoisotopic peaks / isotope peaks can be identified with high stability and accuracy that do not depend on the experience and skill of the analyst, and that high throughput can be realized.

本発明に係る質量分析データ解析装置を利用したイメージング質量分析装置の一実施例の概略構成図。BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS The schematic block diagram of one Example of the imaging mass spectrometer using the mass spectrometry data analyzer which concerns on this invention. 本実施例のイメージング質量分析装置におけるマススペクトルデータ収集動作の概略説明図。Schematic explanatory drawing of mass spectrum data collection operation in the imaging mass spectrometer of the present embodiment. 本実施例のイメージング質量分析装置における特徴的なデータ解析動作のフローチャート。The flowchart of the characteristic data analysis operation | movement in the imaging mass spectrometer of a present Example. ピクセル空間におけるノルム規格化の説明図。Explanatory drawing of norm normalization in pixel space. m/z値毎のノルム規格化の説明図。Explanatory drawing of norm normalization for every m / z value. マウス網膜を試料として得られたマススペクトルデータから抽出されたリン脂質由来ピークの例。An example of a phospholipid-derived peak extracted from mass spectral data obtained using mouse retina as a sample. データの規格化を行わずにＨＣＡを試みた場合における各クラスタに分類された空間強度分布とクラスタ内平均空間強度分布を示す図。The figure which shows the spatial intensity distribution classified into each cluster at the time of trying HCA without normalizing data, and the average spatial intensity distribution in a cluster. データの規格化を行わずにＨＣＡを試みた場合における各クラスタに分類された空間強度分布とクラスタ内平均空間強度分布を示す図。The figure which shows the spatial intensity distribution classified into each cluster at the time of trying HCA without normalizing data, and the average spatial intensity distribution in a cluster. データの規格化を行わずにＨＣＡを試みた場合における各クラスタでのピーク選別結果を示す図。The figure which shows the peak selection result in each cluster at the time of trying HCA, without performing data normalization. データの規格化を実施した上でＨＣＡを試みた場合における各クラスタに分類された空間強度分布とクラスタ内平均空間強度分布を示す図。The figure which shows the spatial intensity distribution classified into each cluster at the time of trying HCA, after implementing data normalization, and the average spatial intensity distribution in a cluster. データの規格化を実施した上でＨＣＡを試みた場合における各クラスタに分類された空間強度分布とクラスタ内平均空間強度分布を示す図。The figure which shows the spatial intensity distribution classified into each cluster at the time of trying HCA, after implementing data normalization, and the average spatial intensity distribution in a cluster. データの規格化を実施した上でＨＣＡを試みた場合における各クラスタでのピーク選別結果を示す図。The figure which shows the peak selection result in each cluster at the time of trying HCA after implementing data normalization. 本発明によるピーク識別・除去処理適用前及び適用後の平均マススペクトルを示す図。The figure which shows the average mass spectrum before and after the peak identification and removal process application by this invention.

以下、本発明に係る質量分析データ解析装置を用いたイメージング質量分析装置の一実施例について、添付図面を参照して説明する。図１は本実施例によるイメージング質量分析装置の概略構成図である。   Hereinafter, an embodiment of an imaging mass spectrometer using the mass spectrometry data analysis apparatus according to the present invention will be described with reference to the accompanying drawings. FIG. 1 is a schematic configuration diagram of an imaging mass spectrometer according to the present embodiment.

このイメージング質量分析装置は、試料８上の２次元測定対象領域８ａの顕微観察を行うとともに該領域８ａ内のイメージング質量分析を実行するイメージング質量分析本体部１と、イメージング質量分析本体部１で収集された質量分析スペクトルデータを解析処理するデータ処理部２と、質量分析スペクトルデータを記憶しておくデータ記憶部３と、イメージング質量分析本体部１で撮影された画像信号を処理して顕微画像を構成する顕微画像処理部４と、それら各部を制御する制御部５と、制御部５に接続された操作部６及び表示部７と、を備える。   The imaging mass spectrometer collects the imaging mass spectrometry main body 1 that performs microscopic observation of the two-dimensional measurement target region 8a on the sample 8 and performs imaging mass analysis in the region 8a, and the imaging mass spectrometry main body 1 A data processing unit 2 for analyzing the mass spectrometry spectrum data, a data storage unit 3 for storing the mass spectrometry spectrum data, and an image signal captured by the imaging mass spectrometry main body unit 1 to process a microscopic image. A microscopic image processing unit 4 that is configured, a control unit 5 that controls these units, and an operation unit 6 and a display unit 7 that are connected to the control unit 5 are provided.

イメージング質量分析本体部１は例えば、非特許文献１などに記載のように、ＭＡＬＤＩイオン源、イオン輸送光学系、イオントラップ、飛行時間型質量分析器、などを含み、所定サイズの微小領域に対する所定質量電荷比範囲に亘る質量分析を実行する。図示しないが、イメージング質量分析本体部１は試料８が載置されたステージを互いに直交するｘ、ｙの２軸方向に高精度で移動させる駆動部を含み、試料８を所定ステップ幅で移動させる毎に所定質量電荷比範囲に亘る質量分析を実行することにより、任意の２次元測定対象領域８ａに対する質量分析スペクトルデータの収集が可能である。なお、データ処理部２、データ記憶部３、顕微画像処理部４、制御部５、などの機能の少なくとも一部は、パーソナルコンピュータに搭載された専用の処理・制御ソフトウエアを実行することにより達成される。   The imaging mass spectrometry main body 1 includes, for example, a MALDI ion source, an ion transport optical system, an ion trap, a time-of-flight mass analyzer, and the like as described in Non-Patent Document 1 and the like. Perform mass analysis over the mass to charge ratio range. Although not shown, the imaging mass spectrometry main body 1 includes a drive unit that moves the stage on which the sample 8 is placed with high accuracy in the two axes x and y orthogonal to each other, and moves the sample 8 with a predetermined step width. By performing mass analysis over a predetermined mass-to-charge ratio range every time, it is possible to collect mass analysis spectrum data for any two-dimensional measurement target region 8a. Note that at least some of the functions of the data processing unit 2, the data storage unit 3, the microscopic image processing unit 4, the control unit 5, and the like are achieved by executing dedicated processing / control software installed in a personal computer. Is done.

本実施例のイメージング質量分析装置は、イメージング質量分析本体部１により収集された膨大な量の質量分析スペクトルデータを解析処理して表示部７の画面上に表示するデータ処理部２におけるデータ解析処理にその特徴を有する。この特徴的なデータ解析処理の一例について、図２及び図３により詳細に説明する。図２は本実施例のイメージング質量分析装置におけるマススペクトルデータ収集動作の概略説明図、図３は本実施例のイメージング質量分析装置における特徴的なデータ解析手順を示すフローチャートである。   The imaging mass spectrometer of the present embodiment is a data analysis process in the data processing unit 2 that analyzes and displays a huge amount of mass spectrometry spectrum data collected by the imaging mass spectrometry main body unit 1 on the screen of the display unit 7. Has the characteristics. An example of this characteristic data analysis processing will be described in detail with reference to FIGS. FIG. 2 is a schematic explanatory diagram of mass spectrum data collection operation in the imaging mass spectrometer of the present embodiment, and FIG. 3 is a flowchart showing a characteristic data analysis procedure in the imaging mass spectrometer of the present embodiment.

イメージング質量分析本体部１では、図２に示すように、試料８上に設定された所定の２次元測定対象領域８ａ内をｘ方向、ｙ方向にそれぞれ細かく区分した微小領域８ｂ毎にマススペクトルデータが得られる。このマススペクトルデータは所定の質量電荷比範囲に亘る強度信号を示すマススペクトルを構成するデータである。なお、微小領域８ｂは図２に示すように２次元測定対象領域８ａ内全体に密に設けられていなくてもよく、例えば疎らに存在していてもよい。   In the imaging mass spectrometry main body 1, as shown in FIG. 2, the mass spectrum data for each minute region 8b obtained by finely dividing the predetermined two-dimensional measurement target region 8a set on the sample 8 in the x and y directions, respectively. Is obtained. This mass spectrum data is data constituting a mass spectrum indicating an intensity signal over a predetermined mass-to-charge ratio range. As shown in FIG. 2, the minute regions 8b do not have to be densely provided throughout the two-dimensional measurement target region 8a, and may exist sparsely, for example.

通常、微小領域８ｂの１辺の長さは試料８が載置されたステージの移動ステップ幅により決まる。後述する或る質量電荷比における空間強度分布を示すマッピング画像では、１個の微小領域８ｂ毎にカラー２次元表示画像上の表示色が定められる。したがって、色付けなどの画像処理上ではこの微小領域が最小単位となるので、画像処理上のピクセルと微小領域とは同義であり、以下の説明では微小領域をピクセルと呼ぶ。即ち、図２に示すように、ここでは２次元測定対象領域８ａ内に格子状にピクセルが配列されている。   Usually, the length of one side of the minute region 8b is determined by the moving step width of the stage on which the sample 8 is placed. In a mapping image showing a spatial intensity distribution at a certain mass-to-charge ratio described later, the display color on the color two-dimensional display image is determined for each minute region 8b. Therefore, since this minute area is the smallest unit in image processing such as coloring, the pixel in the image processing and the minute area are synonymous. In the following description, the minute area is referred to as a pixel. That is, as shown in FIG. 2, here, pixels are arranged in a grid pattern in the two-dimensional measurement target region 8a.

２次元測定対象領域８ａに対する質量分析イメージングデータ（以下の説明ではピクセル毎のマススペクトルデータであるが、これはＭＳ2スペクトルデータ等のＭＳnスペクトルデータでもよい）がデータ記憶部３に格納されている状態でデータ解析処理の開始が指示されると、まずデータ処理部２はデータ記憶部３から処理対象である質量分析イメージングデータを読み込み（ステップＳ１）、マススペクトル毎に、つまり各ピクセルに対するデータ毎に、ピークピッキング処理を実行して有意なピークを抽出する（ステップＳ２）。具体的には、マススペクトル毎に、例えば信号強度が高いピークから順に所定個数のピークを選別する。これにより、信号強度の小さなノイズピークは除去される。なお、ピークピッキングの手法はこれに限るものでなく、例えば、信号強度が高くても予め指定された特定のm/zやm/z範囲のピークは選出から除外する、逆に、信号強度が低くても予め指定された特定のm/zやm/z範囲のピークは優先的に選出する、といった処理を加えることも考えられる。 Mass spectrometry imaging data for the two-dimensional measurement target region 8a (in the following description, it is mass spectral data for each pixel, but this may be MS n spectral data such as MS 2 spectral data) is stored in the data storage unit 3. When the start of the data analysis process is instructed in the state, the data processing unit 2 first reads the mass analysis imaging data to be processed from the data storage unit 3 (step S1), and for each mass spectrum, that is, data for each pixel. Every time, a peak picking process is executed to extract a significant peak (step S2). Specifically, for each mass spectrum, for example, a predetermined number of peaks are selected in order from the peak with the highest signal intensity. Thereby, a noise peak with a small signal intensity is removed. Note that the method of peak picking is not limited to this. For example, even if the signal strength is high, a peak in a specific m / z or m / z range specified in advance is excluded from the selection. It is conceivable to add processing such as preferentially selecting a peak in a specific m / z or m / z range specified in advance even if it is low.

上述のようにピクセル毎にピークピッキングを行って得られるデータ、つまりピーク情報は、ピークのm/z値と強度値とである。そこで、このデータを、縦方向にピクセル番号、横方向にm/z値をとり、各要素をピークの強度値とするデータマトリクスの形式に整理する（ステップＳ３）。もちろん、行と列とは入れ替え可能である。図５（ａ）はデータマトリクスの一例であり、この図ではＭ1、Ｍ2、…がm/z値であり、Ｐ11、Ｐ12、…がピークの強度値である。 As described above, data obtained by performing peak picking for each pixel, that is, peak information is a peak m / z value and an intensity value. Therefore, this data is arranged in a data matrix format in which the pixel number is taken in the vertical direction, the m / z value is taken in the horizontal direction, and each element has a peak intensity value (step S3). Of course, rows and columns can be interchanged. FIG. 5A shows an example of a data matrix. In this figure, M 1 , M 2 ,... Are m / z values, and P 11 , P 12 ,.

次に、データマトリクス上のデータについて必要に応じてスケーリングを実行する（ステップＳ４）。スケーリングは、例えば極端に強度の大きなデータがあった場合に、解析がそれに支配されすぎないようにするために行われる。具体的なスケーリングの手法としては、平均値や標準偏差がデータに反映されるようにするために、まず全ての強度値の平均を計算してこれを各強度値から減算し（つまり平均中心化が行われ）、次いで強度値の分散（標準偏差）で除するような手法が挙げられる。しかしながら一般に、マススペクトルピークのようなデータに対してはパレートスケーリングがより有利である。パレートスケーリングでは、平均中心化が行われた後、その値は分散の平方根で除される。   Next, scaling is performed on the data on the data matrix as necessary (step S4). Scaling is performed to prevent the analysis from being dominated by, for example, extremely strong data. As a specific scaling method, in order to reflect the average value and standard deviation in the data, first calculate the average of all intensity values and subtract it from each intensity value (that is, average centering). And then dividing by intensity variance (standard deviation). In general, however, Pareto scaling is more advantageous for data such as mass spectral peaks. In Pareto scaling, after average centering is performed, the value is divided by the square root of the variance.

次に、スケーリングのなされた又はなされていないデータマトリクス中のデータに対し、各m/z値についてのピクセル空間における強度のノルム（つまりデータマトリクスの各行のノルム）を１にするように強度値を規格化する（ステップＳ５）。
Then, to made the or made that is not data in the data matrix of scaling, the m / z of intensity in pixel space for norm (i.e. data matrix each row of the norm) to be that by Uni intensity values 1 Is normalized (step S5).

図４はピクセル空間における強度のノルム規格化の概念を示す図である。図４はＸ１、Ｘ２、Ｘ３の３個のピクセルにおける強度を３軸とするピクセル空間において、ピクセルＸ２に存在するm/z700,m/z701,m/z702の３つの同位体イオンのプロット点を示すもので、（ａ）は規格化前、（ｂ）は規格化後である。規格化前の状態では、図４（ａ）に示すように、強度の相違する３つの同位体イオンm/z700,m/z701,m/z702に対応するプロット点はＸ２軸上の異なる位置に存在する。ピクセル空間における強度のノルムを１にすることは、各プロット点における強度をそれ自身で除することを意味する。そのため、規格化後には、図４（ｂ）に示すように、３つの同位体イオンm/z700,m/z701,m/z702に対応するプロット点はＸ２軸上の同一点に重なる。ピクセル空間内の任意のプロット点は全て半径が１である球面状に位置するようになる。   FIG. 4 is a diagram illustrating the concept of norm normalization of intensity in the pixel space. FIG. 4 shows plot points of three isotope ions of m / z 700, m / z 701, and m / z 702 existing in the pixel X2 in a pixel space having three axes of intensities at three pixels X1, X2, and X3. As shown, (a) is before normalization and (b) is after normalization. In the state before normalization, as shown in FIG. 4A, plot points corresponding to three isotope ions m / z700, m / z701, and m / z702 having different intensities are located at different positions on the X2 axis. Exists. Setting the norm of intensity in pixel space to 1 means dividing the intensity at each plot point by itself. Therefore, after normalization, as shown in FIG. 4B, plot points corresponding to the three isotope ions m / z 700, m / z 701, and m / z 702 overlap with the same point on the X2 axis. All plot points in the pixel space are located in a spherical shape with a radius of 1.

具体的には、図５（ａ）に示すデータマトリクスでは、縦方向の１列が或る特定のm/z値に対するピクセル空間上の強度値であるから、この縦方向のノルムをそれぞれ求め（この例ではＱ1、Ｑ2、…）、各m/z値毎に上記の求めたノルムで各強度値を除する（図５（ｂ）参照）。これによってm/z値毎にノルムが１であるように全ての強度値が規格化される。 Specifically, in the data matrix shown in FIG. 5A, since one column in the vertical direction is an intensity value in the pixel space with respect to a specific m / z value, this vertical norm is obtained ( In this example, Q 1 , Q 2 ,...), And each intensity value is divided by the obtained norm for each m / z value (see FIG. 5B). As a result, all intensity values are normalized so that the norm is 1 for each m / z value.

次に、上記のようにm/z値毎にノルムが１になるように規格化されたデータマトリクスに対し、m/z方向に階層的クラスタリング（ＨＣＡ）を行うことにより、m/z値又はm/z値毎の空間強度分布（つまりはデータマトリクスの１列毎のデータ集合）を複数のクラスタに分類する（ステップＳ６）。このときに、クラスタの数は予め設定せずに、例えば分散分析法などの既知の様々な手法のいずれかにより自動的に決定するようにし、分析担当者等による外部からの入力設定は不要とする。
Then, the norm for each m / z value as described above with respect to standardized Detamato Rikusu to be 1, by performing a hierarchical clustering (HCA) to m / z-direction, the m / z value or The spatial intensity distribution for each m / z value (that is, a data set for each column of the data matrix) is classified into a plurality of clusters (step S6). At this time, the number of clusters is not set in advance, but is automatically determined by any of various known methods such as analysis of variance. To do.

同位体ピーク群（同一物質から発生し構成元素の同位体のみが相違するイオンに由来する複数のピーク）に属するピークのm/z値の空間強度分布は、それぞれ絶対的な強度は異なるものの、いずれも類似した空間分布を示す。データマトリクスにおいてノルムを１（又は他の所定値）にするように各強度値を規格化することは、強度の絶対値の影響を排除して空間強度分布を比較可能とする意味を持つ。そのため、ステップＳ５の規格化処理により、規格化前と比較して同位体ピーク間の距離（例えばユークリッド距離などの階層的クラスタリングに使用される距離）が小さくなるから、階層的クラスタリングにおいて同一クラスタにまとめられる可能性が高くなる。その結果、同位体ピーク群を含む類似した空間強度分布をもつピークのm/z値が同一クラスタにまとめられることになる。   Although the spatial intensity distribution of the m / z values of the peaks belonging to the isotope peak group (multiple peaks derived from ions that are generated from the same substance and differ only in the isotopes of the constituent elements), the absolute intensity differs, Both show similar spatial distributions. Normalizing each intensity value so that the norm is set to 1 (or another predetermined value) in the data matrix has the meaning of making it possible to compare the spatial intensity distributions by eliminating the influence of the absolute value of the intensity. Therefore, the distance between isotope peaks (for example, the distance used for hierarchical clustering such as the Euclidean distance) is reduced by the normalization process in step S5, so that the same cluster is obtained in the hierarchical clustering. There is a high possibility of being put together. As a result, m / z values of peaks having similar spatial intensity distributions including isotope peak groups are grouped into the same cluster.

また、質量分析では、目的分子のイオン化の過程で該イオンに様々な成分が付加したアダクトイオンが生成されることがあるが、こうしたアダクトイオンピークのm/z値の空間強度分布も、それぞれ絶対的な強度は異なるものの、いずれも類似した空間分布を示す。したがって、上記のような規格化後に階層的クラスタリングを実行することにより、同一物質由来で異なるm/zを持つアダクトイオンピークのm/z値も高い確率で同一クラスタにまとめられることになる。   Also, in mass spectrometry, adduct ions in which various components are added to the ions during the ionization process of the target molecule may be generated. The spatial intensity distribution of the m / z value of these adduct ion peaks is also absolute. Although the intensities are different, they all show similar spatial distributions. Therefore, by executing hierarchical clustering after normalization as described above, m / z values of adduct ion peaks derived from the same substance and having different m / z are also grouped into the same cluster with a high probability.

ここで、図３に示すデータ処理をマウス網膜切片を試料として収集された質量分析イメージングデータに対して適用した場合の実例を挙げる。この質量分析イメージングデータから測定対象の全領域に対するm/z値毎の最大強度を求めて最大強度マススペクトルを作成し、該マススペクトルから強度が上位である１００個のピークをピッキングしたところ、図６に示す５種類のリン脂質とみられるピークが選出された。また、図６に示すように、それら５種類のプロトン付加イオン（［Ｍ＋Ｈ］+）のほか、質量電荷比差からみてナトリウム付加イオン、カリウム付加イオンとみられるイオンもそれぞれ観測された。 Here, an example in which the data processing shown in FIG. 3 is applied to mass spectrometry imaging data collected using a mouse retinal section as a sample will be given. From this mass spectrometry imaging data, the maximum intensity for each m / z value for the entire region to be measured was determined to create a maximum intensity mass spectrum, and 100 peaks with the highest intensity were picked from the mass spectrum. Peaks considered to be 5 types of phospholipids shown in 6 were selected. Further, as shown in FIG. 6, in addition to these five types of proton-added ions ([M + H] + ), ions that are considered to be sodium-added ions and potassium-added ions from the viewpoint of the mass-to-charge ratio difference were also observed.

上記のように選出したピークのm/z値を図５（ａ）に示すm/z値、Ｍ1、Ｍ2、…としてデータマトリクスを作成し、ステップＳ５の規格化の処理を行わずにステップＳ６の階層的クラスタリングを実行した。階層的クラスタリングでは、個体間距離を標準化ユークリッド距離とし、クラスタ間距離をウォード法による定義によるものとした。この場合、不整合係数により判断した最適クラスタ数は４となり、全てのm/z値が４つのクラスタのいずれかに分類された。図７及び図８は、このときの[１]〜[４]の各クラスタに分類されたm/z値に対応する空間強度分布画像（マッピング画像）及びクラスタ内平均空間強度分布画像を示す図である。図７から分かるように、クラスタ[１]と[２]とに含まれる空間強度分布画像はかなり類似しているにも拘わらず２つのクラスタに分けられてしまっている。逆に、クラスタ[３]や[４]では、かなり異なる傾向の空間強度分布画像が同一クラスタ内に分類されてしまっている。 A data matrix is created with the m / z values of the peaks selected as described above as m / z values, M 1 , M 2 ,... Shown in FIG. 5A, and the normalization process in step S5 is not performed. The hierarchical clustering of step S6 was executed. In hierarchical clustering, the distance between individuals is defined as the standardized Euclidean distance, and the distance between clusters is defined by the Ward method. In this case, the optimal number of clusters determined by the inconsistency coefficient was 4, and all m / z values were classified into one of the four clusters. 7 and 8 are diagrams showing a spatial intensity distribution image (mapping image) and an intra-cluster average spatial intensity distribution image corresponding to the m / z values classified into the clusters [1] to [4] at this time. It is. As can be seen from FIG. 7, the spatial intensity distribution images included in the clusters [1] and [2] are divided into two clusters although they are quite similar. On the other hand, in the clusters [3] and [4], spatial intensity distribution images having considerably different tendencies are classified in the same cluster.

図９は図７及び図８に示したクラスタリング結果に基づくピーク識別結果を示す図である。図９において○印等の記号で示したm/z値は図６に示したリン脂質由来のイオンピークに対応したものである。この５種類のリン脂質由来のイオンピークに着目すると、同一物質由来であるにも拘わらず異なるクラスタに分類されてしまっている。こうしたことから、ステップＳ５の処理を省略した階層的クラスタリングでは、同一物質由来の同位体ピーク群やアダクトイオンピークが同一クラスタに集約されず、このクラスタリング結果から以降の同位体イオン・アダクトイオン識別処理を実行しても正しい結果が得られないことが分かる。   FIG. 9 is a diagram illustrating a peak identification result based on the clustering result illustrated in FIGS. 7 and 8. In FIG. 9, the m / z value indicated by a symbol such as a circle corresponds to the phospholipid-derived ion peak shown in FIG. Focusing on these five types of phospholipid-derived ion peaks, they are classified into different clusters despite being derived from the same substance. For this reason, in the hierarchical clustering in which the process of step S5 is omitted, isotope peak groups and adduct ion peaks derived from the same substance are not aggregated into the same cluster. It turns out that the correct result is not obtained even if is executed.

一方、図１０及び図１１は、ステップＳ５の規格化の処理を行った上でステップＳ６の階層的クラスタリングを実行した場合における、[１]〜[４]の各クラスタに分類されたm/z値に対応する空間強度分布画像及びクラスタ内平均空間強度分布画像を示す図である。図１０及び図１１から、類似した空間強度分布を示すm/z値は同じクラスタに集約されており、クラスタ毎に空間強度分布の傾向の相違が顕著であることが分かる。この結果からだけでも、同一物質由来の同位体イオンやアダクトイオンピークが同一クラスタに含まれている可能性が高いことが見てとれる。   On the other hand, FIGS. 10 and 11 show the m / z classified into the clusters [1] to [4] when the normalization process of step S5 is performed and the hierarchical clustering of step S6 is executed. It is a figure which shows the spatial intensity distribution image and the average spatial intensity distribution image in a cluster corresponding to a value. 10 and 11, it can be seen that m / z values indicating similar spatial intensity distributions are aggregated in the same cluster, and the difference in the tendency of the spatial intensity distribution is remarkable for each cluster. From this result alone, it can be seen that there is a high possibility that isotope ions and adduct ion peaks derived from the same substance are included in the same cluster.

図３に戻り説明を続けると、上述のようにデータマトリクス上の全てのm/z値を複数のクラスタに分類した後、各クラスタ内で同位体ピーク群を見つける。具体的には、イオンの価数が１である場合には同位体イオン同士の質量電荷比差は１Daであるから、同一クラスタ内で約１Da差であるm/z値が存在するか否かを調べ、存在したならばそれらを同位体ピーク群候補とであるとみなし、その中で最小のm/z値をモノアイソトピックピーク候補とみなす。ただし、全く異なる物質由来のイオン同士のm/z値差が偶然に１Da程度になることはあり得るから、上記候補が実際に同位体ピーク群であるか否かを確認するために、強度比の情報を利用する。具体的には、同位体ピーク群に含まれるピークの中のモノアイソトピック候補のピーク強度から、同位体の天然存在比に基づいて理論的な同位体ピーク強度比を算出し、この理論比と実際の同位体ピーク群候補の強度比とを比較することにより、真の同位体ピーク群とみなせるか否かを判定する。そして、実際の同位体ピーク群であると判定された場合には、モノアイソトピックピークに対応するm/z値のみを残し他の同位体ピーク情報を消去する。一方、約１Daのm/z値のピーク群でありながら同位体ピーク群でない場合には、いずれのピーク情報も消去せずに残す（ステップＳ７）。   Returning to FIG. 3 and continuing the explanation, after all the m / z values on the data matrix are classified into a plurality of clusters as described above, an isotope peak group is found in each cluster. Specifically, when the valence of an ion is 1, the mass-to-charge ratio difference between isotope ions is 1 Da, so whether there is an m / z value that is about 1 Da difference within the same cluster. If they exist, they are regarded as isotope peak group candidates, and the minimum m / z value among them is regarded as a monoisotopic peak candidate. However, since the m / z difference between ions from completely different substances can happen to be about 1 Da by chance, the intensity ratio is used to confirm whether the above candidate is actually an isotope peak group. Use the information. Specifically, a theoretical isotope peak intensity ratio is calculated based on the natural abundance ratio of isotopes from the peak intensities of monoisotopic candidates in the peaks included in the isotope peak group. It is determined whether or not it can be regarded as a true isotope peak group by comparing the intensity ratios of actual isotope peak group candidates. If it is determined that the group is an actual isotope peak group, only the m / z value corresponding to the monoisotopic peak is left, and the other isotope peak information is deleted. On the other hand, if it is a peak group having an m / z value of about 1 Da but not an isotope peak group, any peak information is left without being erased (step S7).

図１２は図１０及び図１１に示したクラスタリング結果に基づくピーク識別結果を示す図である。図１２において背景を塗り潰したセル内のm/z値は上記処理により除去されたピークを表す。○印等の記号で示したm/z値は図６に示したリン脂質由来のイオンピークに対応したものである。また、同位体ピークであると判定された場合には'isotope'、アダクトイオンピークであるとあると判定された場合には'M+H'、'M+Na'、'M+K' を、各m/z値の下に記載している。この図１２を見れば、同位体イオンが存在する場合にはモノアイソトピックピークを残し、それ以外のピークが消去されたことが分かる。なお、同位体ピーク群を構成しない単独ピークの情報については、消去せずにそのまま残す。
FIG. 12 is a diagram showing peak identification results based on the clustering results shown in FIGS. 10 and 11. In FIG. 12, the m / z value in the cell with the background filled in represents the peak removed by the above processing. The m / z value indicated by a symbol such as a circle corresponds to the phospholipid-derived ion peak shown in FIG. If it is determined to be an isotope peak, it is 'isotop e '. If it is determined to be an adduct ion peak, it is 'M + H', 'M + Na', 'M + K'. Are listed under each m / z value. As can be seen from FIG. 12, when isotopic ions are present, a monoisotopic peak is left and the other peaks are erased. Note that information on single peaks that do not constitute an isotope peak group is left as it is without being erased.

なお、同位体ピークの強度算出手法の一例としては、従来、アミノ酸配列の元素組成を算出するために用いられているアベレージネ（Averagine）モデルを用いてもよい。アベレージネモデルの詳細は、センコ（Michel W. Senko）ほか、「デターミネイション・オブ・モノアイソトピック・マシズ・アンド・イオン・ポピュレイションズ・フォー・ラージ・バイオモレキュルズ・フロム・リゾルブド・アイソトピック・ディストリビューションズ (Determination of monoisotopic masses and ion populations for large biomolecules from resolved isotopic distributions）」、ジャーナル・オブ・アメリカン・ソサイエティ・マス・スペクトロメトリー（Journal of American Soc. Mass Spectom.）、6、1995年、pp.229-233等の文献に開示されている。   As an example of a method for calculating the intensity of the isotope peak, an average model (Averagine) model that has been conventionally used for calculating the elemental composition of the amino acid sequence may be used. For more information on average models, see Senko (Michel W. Senko) and "Determination of Monoisotopic Mathis and Ion Populations for Large Biomolecules From Resolved. Isotopic distributions (Determination of monoisotopic masses and ion populations for large biomolecules from resolved isotopic distributions), Journal of American Soc. Mass Spectom., 6, 1995 , Pp.229-233.

次に、ステップＳ７の処理により残された各クラスタ内のピークにおいて、既知のアダクトイオンの質量電荷比差に相当するピーク対を見つけ、これを同一物質由来のアダクトイオンピーク群候補とみなす。そして、このうち全測定領域での平均強度が最も大きいピークを代表の単一ピークとして残し、他のアダクトイオンピーク情報を消去する（ステップＳ８）。図１２の結果を見れば、階層的クラスタリングにより図６に示した５種類のリン脂質アダクトイオンピークは同一のクラスタに集約されていたため、質量電荷比差によるアダクトイオンピークが的確に識別できていることが分かる。   Next, a peak pair corresponding to a known mass-to-charge difference of adduct ions is found from the peaks in each cluster left by the processing in step S7, and this is regarded as an adduct ion peak group candidate derived from the same substance. Then, the peak having the highest average intensity in all the measurement regions is left as a representative single peak, and other adduct ion peak information is deleted (step S8). If the result of FIG. 12 is seen, since the five types of phospholipid adduct ion peaks shown in FIG. 6 were aggregated in the same cluster by hierarchical clustering, the adduct ion peaks due to the mass-to-charge ratio difference could be accurately identified. I understand that.

ステップＳ７、Ｓ８により、同一物質由来であって重複しているとみなせるピーク（m/z値）が除去されたならば、残された各クラスタのピークを集約し、このピーク情報からステップＳ３で作成したものと同様の形式のデータマトリクスを再構成する（ステップＳ９）。これにより、同位体ピークやアダクトイオンピークなど、解析に有用でないピーク情報を削除して情報量を減らしたデータマトリクスを得ることができるから、再構成されたデータマトリクスに基づいて例えば特異的分布を示すm/z値のマッピング画像を精度よく取得することが可能となる。   If peaks (m / z values) that are considered to be duplicated from the same substance are removed in steps S7 and S8, the remaining peaks of each cluster are aggregated, and the peak information is obtained in step S3. A data matrix having the same format as the created one is reconstructed (step S9). This makes it possible to obtain a data matrix in which the amount of information is reduced by deleting peak information that is not useful for analysis, such as isotope peaks and adduct ion peaks. For example, a specific distribution can be obtained based on the reconstructed data matrix. It becomes possible to acquire a mapping image of the indicated m / z value with high accuracy.

図１３は上記例の平均マススペクトルであり、（ａ）は上述した同位体イオン・アダクトイオンピーク除去処理実行前の状態、（ｂ）は同位体イオン・アダクトイオンピーク除去処理実行後の状態である。なお、図中に○印等の記号で示したm/z値は図６に示したリン脂質由来のイオンピークに対応したものである。図１３から、図６中の５種類のリン脂質由来アダクトイオンピークそれぞれにおいて、平均強度が最も大きいピーク以外を消去できたことが確認できる。なお、この例では、上述した同位体イオン・アダクトイオンピーク除去処理によって、１００個のピークのうち３５個のピークが消去されている。   FIG. 13 is an average mass spectrum of the above example, where (a) is the state before execution of the isotope ion / adduct ion peak removal process, and (b) is the state after execution of the isotope ion / adduct ion peak removal process. is there. The m / z values indicated by symbols such as ◯ in the figure correspond to the phospholipid-derived ion peaks shown in FIG. From FIG. 13, it can be confirmed that, in each of the five types of phospholipid-derived adduct ion peaks in FIG. In this example, 35 of the 100 peaks are erased by the above-described isotope ion / adduct ion peak removal processing.

上記実施例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。例えば、上記実施例では、クラスタリングとして階層的クラスタリングを実行していたが、非階層的クラスタリングを利用してもよい。 The above-described embodiment is merely an example of the present invention, and it is a matter of course that modifications, corrections, and additions may be appropriately made within the scope of the present invention, and included in the scope of claims of the present application. For example, in the above embodiment, although running the hierarchical clustering as the cluster ring, it may be used a non-hierarchical clustering.

１…イメージング質量分析本体部
２…データ処理部
３…データ記憶部
４…顕微画像処理部
５…制御部
６…操作部
７…表示部
８…試料
８ａ…２次元測定対象領域
８ｂ…微小領域（ピクセル） DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Imaging mass spectrometry main-body part 2 ... Data processing part 3 ... Data storage part 4 ... Microscopic image processing part 5 ... Control part 6 ... Operation part 7 ... Display part 8 ... Sample 8a ... Two-dimensional measuring object area | region 8b ... Micro area | region ( pixel)

Claims (6)

試料上の２次元領域内に設定された複数の微小領域に対してそれぞれ質量分析を実行することにより収集されたデータを解析処理する質量分析データ解析方法であって、
a)前記微小領域毎に得られるマススペクトルデータに対しピーク検出処理を実行してピークの強度と質量電荷比とを含むピーク情報を収集するピーク検出ステップと、
b)前記ピーク検出ステップにより得られた各微小領域のピーク情報を集め、全てのピークについて質量電荷比毎に空間強度分布を比較可能とするべく、質量電荷比毎に、全ての微小領域における強度をそれぞれ異なる軸とする多次元空間での強度のノルムを１又は他の所定の値にするように、各微小領域における強度値を規格化する強度規格化ステップと、
c)前記強度規格化ステップによる規格化後の質量電荷比毎の空間強度分布に対しクラスタリングを用いることにより、空間強度分布に対応付けられた質量電荷比を所定数のクラスタに分類するクラスタリング実行ステップと、
d)同一クラスタに分類された複数の質量電荷比について、少なくとも質量電荷比の差を利用して同一物質由来のイオンに対するピークを識別する識別ステップと、
を有することを特徴とする質量分析データ解析方法。
A mass spectrometry data analysis method for performing analysis processing on data collected by performing mass spectrometry on each of a plurality of minute regions set in a two-dimensional region on a sample,
a) a peak detection step for collecting peak information including peak intensity and mass-to-charge ratio by performing a peak detection process on the mass spectrum data obtained for each micro area;
b) Collect the peak information of each micro area obtained by the peak detection step, and compare the intensity in all micro areas for each mass to charge ratio so that the spatial intensity distribution can be compared for each mass to charge ratio for all peaks. An intensity normalization step for normalizing the intensity value in each minute region so that the norm of the intensity in a multidimensional space having different axes as 1 or another predetermined value ;
c) Clustering execution step of classifying the mass-to-charge ratios associated with the spatial intensity distribution into a predetermined number of clusters by using clustering for the spatial intensity distribution for each mass-to-charge ratio after normalization in the intensity normalizing step. When,
d) identifying a plurality of mass-to-charge ratios classified into the same cluster by identifying peaks for ions derived from the same substance using at least a difference in mass-to-charge ratio;
A method for analyzing mass spectrometry data, comprising:
請求項１に記載の質量分析データ解析方法であって、
前記識別ステップでは、同一クラスタに分類された複数の質量電荷比について、質量電荷比の差と前記規格化がなされない強度情報とを用いて同一物質由来の同位体群に属するピークを識別し、同一同位体群に属するピークの中でモノアイソトピックピークのみを選出することを特徴とする質量分析データ解析方法。 The mass spectrometry data analysis method according to claim 1,
In the identification step, for a plurality of mass-to-charge ratios classified into the same cluster, a peak belonging to an isotope group derived from the same substance is identified using a difference in mass-to-charge ratio and intensity information that is not normalized. A method for analyzing mass spectrometry data, wherein only monoisotopic peaks are selected from peaks belonging to the same isotope group. 請求項２に記載の質量分析データ解析方法であって、
前記識別ステップではさらに、同一クラスタに分類された複数の質量電荷比について、質量電荷比の差を用いて同一物質由来の複数のアダクトイオンピークを識別し、同一物質由来の複数のアダクトイオンピークの中で１つのピークを選出することを特徴とする質量分析データ解析方法。 The mass spectrometry data analysis method according to claim 2,
In the identifying step, for a plurality of mass-to-charge ratios classified into the same cluster, a plurality of adduct ion peaks derived from the same substance are identified using a difference in mass-to-charge ratio, and a plurality of adduct ion peaks derived from the same substance are identified. A method for analyzing mass spectrometry data, wherein one peak is selected. 試料上の２次元領域内に設定された複数の微小領域に対してそれぞれ質量分析を実行することにより収集されたデータを解析処理する質量分析データ解析装置であって、
a)前記微小領域毎に得られるマススペクトルデータに対しピーク検出処理を実行してピークの強度と質量電荷比とを含むピーク情報を収集するピーク検出手段と、
b)前記ピーク検出手段により得られた各微小領域のピーク情報を集め、全てのピークについて質量電荷比毎に空間強度分布を比較可能とするべく、質量電荷比毎に、全ての微小領域における強度をそれぞれ異なる軸とする多次元空間での強度のノルムを１又は他の所定の値にするように、各微小領域における強度値を規格化する強度規格化手段と、
c)前記強度規格化手段による規格化後の質量電荷比毎の空間強度分布に対しクラスタリングを用いることにより、空間強度分布に対応付けられた質量電荷比を所定数のクラスタに分類するクラスタリング実行手段と、
d)同一クラスタに分類された複数の質量電荷比について、少なくとも質量電荷比の差を利用して同一物質由来のイオンに対するピークを識別する識別手段と、
を備えることを特徴とする質量分析データ解析装置。
A mass spectrometry data analysis device for analyzing data collected by performing mass spectrometry on each of a plurality of minute regions set in a two-dimensional region on a sample,
a) Peak detection means for collecting peak information including peak intensity and mass-to-charge ratio by performing peak detection processing on the mass spectrum data obtained for each minute region;
b) Collect the peak information of each micro area obtained by the peak detection means, and compare the intensity in all micro areas for each mass to charge ratio so that the spatial intensity distribution can be compared for each mass to charge ratio for all peaks. Intensity normalizing means for normalizing the intensity value in each minute region so that the norm of the intensity in a multidimensional space having different axes as 1 or another predetermined value ;
c) Clustering execution means for classifying the mass-to-charge ratio associated with the spatial intensity distribution into a predetermined number of clusters by using clustering for the spatial intensity distribution for each mass-to-charge ratio after normalization by the intensity normalizing means. When,
d) for a plurality of mass-to-charge ratios classified into the same cluster, identification means for identifying peaks for ions derived from the same substance using at least a difference in mass-to-charge ratio;
A mass spectrometry data analysis device comprising:
請求項４に記載の質量分析データ解析装置であって、
前記識別手段は、同一クラスタに分類された複数の空間強度分布について、質量電荷比の差と前記規格化がなされない強度情報とを用いて同一物質由来で質量電荷比が相違する同位体群に属するものを識別し、同一同位体群の中でモノアイソトピックピークのみを選出することを特徴とする質量分析データ解析装置。 The mass spectrometry data analysis device according to claim 4,
The identification means uses a mass-to-charge ratio difference and a non-normalized intensity information for a plurality of spatial intensity distributions classified into the same cluster to separate isotope groups originating from the same substance and having different mass-to-charge ratios. A mass spectrometric data analysis apparatus characterized by identifying belonging and selecting only monoisotopic peaks from the same isotope group. 請求項５に記載の質量分析データ解析装置であって、
前記識別手段はさらに、同一クラスタに分類された複数の空間強度分布について、質量電荷比の差を用いて同一物質由来の複数のアダクトイオンピークを識別し、同一物質由来の複数のアダクトイオンピークの中で１つのみを選出することを特徴とする質量分析データ解析装置。 The mass spectrometry data analysis apparatus according to claim 5,
The identifying means further identifies a plurality of adduct ion peaks derived from the same substance using a difference in mass-to-charge ratio for a plurality of spatial intensity distributions classified into the same cluster, and detects a plurality of adduct ion peaks derived from the same substance. A mass spectrometry data analysis device, wherein only one of them is selected.
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