JP5635512B2 - 遺伝子調節化合物の改良された送達のための化学的に修飾された細胞透過性ペプチド - Google Patents
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Description
成分Aは、少なくとも4個の炭素を有する1つ若しくはいくつかの直鎖若しくは分岐鎖脂肪族部分並びに/又はN、S、O及びPから選択されるいくつかのヘテロ原子を含有しうる2〜4個の環を含む環系であってもよく、成分Aは、細胞透過性ペプチドB及び/又はその非ペプチドアナログに結合している。
成分Cは、既知又は未知の受容体についてのリガンドなどのターゲティング部分である。基質はアプタマー及び/又はターゲティングペプチドであってもよい。
スペーサーは、成分A、C及びカーゴを成分Bに結合するために使用されうる。
カーゴは、オリゴヌクレオチド又はプラスミドなどの遺伝子調節化合物から選択されうる。それらの遺伝子調節化合物は、共有結合又は複合体形成により送達システムに結合されうる。
本発明を、異なるPepeFectシステム、及びさらに、インビトロでのトランスフェクションに関して、今日、市場で主流であるLipofectamine 2000を用いて、実施例、及びそれらの比較によって以下に説明する。まず、送達システムの改良及びリモデリングを記載する。次いで、どのようにして多用なPepFectが、スプライシング修正ON、プラスミド並びにmiRNA及びsiRNAを送達するかを例示するための様々な方法の試験を記載する。加えて、製造業者の指示書に従って適用されるLipofectamine 2000と比較したPepFectの全体の改良を、低い毒性、同種のトランスフェクション及び「トランスフェクトすることが難しい細胞」における高収率のトランスフェクションにより示す。全ての実験は、複数の細胞型において、及び多くの場合、提示する血清を用いて実施した。
ペプチド及びオリゴヌクレオチドの合成
PepFect1、PepFect2、PepFect3、PepFect4、ペネトラチン[10]、TP10[11]、M918[12]、Arg9[13]、及びステアリル-Arg9におけるペプチドを、Applied Biosystemsの段階的合成装置モデル433Aで合成した。ペプチドを、4-メチルベンズヒドリルアミン-ポリステレン樹脂(MBHA)を用いてt-Boc化学種により構築して、アミド化したC末端を生成した。固相ペプチド合成(SPPS)もまた、当業者に周知の標準的なFmoc SPPS条件を用いて合成されうる。本発明に使用されるペプチドは、SYRO複数ペプチド合成装置(MultiSynTechGmbH)により標準的なプロトコルを用いて得られる。この方法は、基本成分としてHBTU活性化試薬及びDIEAにより補助される、ペプチドのカルボキシ末端からN末端までのFmoc保護アミノ酸の反復結合を含む。利用されるポリスチレン樹脂固体支持体は、Rinkアミド樹脂(1グラムの樹脂当たりの好ましい置換レベルは0.4〜0.6ミリグラム当量)である。アミノ酸は、Neosystem、フランスから購入し、ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)エステルとして結合した。HFを用いて樹脂からペプチドを切断した後、合成産物を、逆相HPLC lomega C18カラムにより精製し、Perkin Elmer prOTOF(商標)2000 MALDI O-TOF質量分析計を用いて分析した。ペプチドの質量は、理論値と十分に相関した。ペプチドの配列をTable 1(表2)に示す。
2.ステアリン酸を結合する(好ましい方法は、溶媒としてDCM並びに1時間の活性化及び結合のためのBOP/DIEAの使用である)。
3.Mtt除去のために、1% TFA、3〜4% TISにより繰り返し洗浄し、DCMを利用する(全処理について1〜1.5時間)。除去の完全性を確保するために、TISを添加していないDCM中の1% TFAを離脱しているトリチル基の黄色をモニターするために加える。
4.3〜5当量のFmoc-Lys(Fmoc)-OHを45分間、結合させる。好ましい結合試薬はBOP(さらにより好ましくは、その非発癌性アナログであるPyBOP)又はDIPCDI/HOAtである。
5.段階1に従ってFmocを除去する。
6.段階4及び5を繰り返す。
7.10分間、3当量のDIEAの存在下でDMF中の1.5当量の無水コハク酸を結合する。
R.Kole及びB.Leblueにより親切にも提供されたHeLa pLuc 705細胞、及びhek 293細胞を、0.1%mMの非必須アミノ酸、1.0mMのピルビン酸ナトリウム、10%のFBS、100U/mlのペニシリン、100mg/mlのストレプトマイシン及び200μg/mlのハイグロマイシンを補足したグルタマックスを有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で増殖させた。CHO細胞を、0.1mMの非必須アミノ酸、1.0nMのピルビン酸ナトリウム、10%のFBS、100U/mlのペニシリン、及び100mg/mlのストレプトマイシンを補足したグルタマックスを有するDMEM-F12培地中で増殖させた。BHK21細胞を、GMEM+2mMのグルタミン+5%のトリプトースリン酸ブロス+5〜10%のウシ胎仔血清中で増殖させた。細胞を、5%のCO2雰囲気下中で37℃にて増殖させた。全ての培地及び化学薬品はInvitrogen(スウェーデン)から購入した。
ON/CPP複合体の形成:ホスホロチオエート2'OメチルRNA(SCO)又は抗miR212'OMe RNA(33%のLNA置換を有する)を、1/10の最終処理体積(すなわち50μl)においてMQ水中で異なるモル比(1:0〜1:20)にてCPPと混合した。複合体をRTで30分間形成させ、その間に培地を24ウェルプレート中で新鮮な無血清DMEM(450μl)に置き換えた。その後、複合体を各ウェルに加えた。SCOの最終濃度を200nMにて一定に維持し、ペプチド濃度を変化させたか、又は複合体を400nMのSCOを用いて所与のモル比で形成させ、次いで水中で連続希釈した。市販のトランスフェクション試薬であるLipofectamine 2000(Promega、USA)を用いる場合、複合体を製造業者のプロトコルに従って調製した。出発濃度として100nMのsiRNA及び20〜40の範囲のモル比を用いることを除いて同様の方法で、PepFect/siRNA複合体を実質的に生成した。より低い濃度を、連続希釈を行うことにより生成した。
以前に記載したように、ペプチドをSCOと混合した。0.5μgのSCOを増加させた濃度のペプチドと混合して、5〜20の範囲のペプチド/SCOモル比を生じた。複合体を、エチジウムブロマイド(Sigma、スウェーデン)を含有する、TBE緩衝液中で1時間、150Vにて20%のポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により分析した。写真を、IR LAS-1000 Lite v1.2ソフトウェアを用いて、富士フィルムLAS-1000Intelligent Dark box IIで撮った。
実験前に24時間播種した100000個のHeLa pLuc 705細胞を、1時間、複数のモル比にてペプチドと複合体化した200nMのCy5で標識したSCOで処理した。処理後、細胞を、トリプシン処理(trypsination)前にHKR中で2回洗浄した。細胞を、4℃にて5分間、1000gで遠心分離し、細胞ペレットを、30分間、250μlの0.1M NaOHで溶解し、その後、200μlの溶解物をブラック96ウェルプレートに移した。蛍光を、Spectra Max Gemeni XS蛍光光度計(Molecular devices、USA)で643/670nmにて測定し、フルオロセインの線形性を用い、タンパク質の量に正規化することにより内在化化合物の量に再計算した(Lowry BioRad、USA)。
スプライシング修正実験:100000個のHeLa pLuc 705細胞を、全ての実験において、実験の24時間前に24ウェルプレート中に播種した。細胞を、無血清培地中の複合体で4時間処理し、続いてさらに20時間、血清培地に置き換えた。その後、細胞を、Hepes Krebs Ringer(HKR)緩衝液を用いて2回洗浄し、室温にて15分間、HKR中の100μlの0.1%トリトンX100を使用して溶解した。ルシフェラーゼ活性を、Promegaルシフェラーゼアッセイシステムを使用してFlexstation II(Molecular devices、USA)で測定した。RLU値をタンパク質含有量に正規化し、結果をRLU/mgとして、又は未処理の細胞上のスプライシングの増加倍数として表示する。エンドソーム脱出を促進する薬剤を用いる実験において、クロロキン、複合体を、無血清DMEM中で75μMのクロロキンと、2時間、共インキュベートし、続いて細胞を、完全DMEM中で20時間増殖させた。
膜統合性を、Promega Cytox-ONE(商標)アッセイを使用して測定した。手短に述べると、104細胞を、無血清DMEM中のペプチドでの処理の2日前に96ウェルプレート中に播種した。30分後、培地をブラック蛍光プレートに移し、10分間、CytoTox-ONE(商標)試薬、続いて停止溶液とインキュベートした。蛍光を560/590nmにて測定した。未処理の細胞をゼロと定義し、100%の漏出としてHKR中の0.18%のトリトン中で溶解することによりLDHを放出した。
ペプチドの長期間の毒性効果を、Wst-1増殖アッセイを用いて評価した。HeLa pLuc 705細胞を、処理の2日前に、96ウェルプレート上に104細胞/ウェルで播種した。細胞を、24時間、100μlの血清又は無血清DMEM中の複合体で処理した。次いで、製造業者のプロトコル(Sigma、スウェーデン)に従って、細胞をWst-1に曝露した。吸光度(450〜690nm)を、吸光度リーダーDigiscan(Labvision、スウェーデン)で測定した。未処理の細胞を100%生存と定義した。
EGFP安定CHO細胞を含む24ウェルプレートを、トランスフェクションの1日前に播種した。トランスフェクションの1日目に、以下のsiRNA:PF6の間のモル比で、細胞をPF6-siRNA複合体でトランスフェクトする、a)無血清培地のインキュベーションについて:50nM、25nM及び12.5nMのsiRNA濃度で1:20及び1:40;20nM、10nM及び5nMのsiRNAの濃度でnd 1:80。b)完全培地のインキュベーションについて:100nM、50nM及び25nmのsiRNA濃度で1:20及び1:40。対照実験のために、細胞を、Lipofectamine(100nMのsiRNA及び2.8μlのLipofectamine)を使用してEGFP siRNAでトランスフェクトしたか、又は複合体を用いずに、若しくは(生来のEGFPレベルを得るために)siRNAのみで偽トランスフェクトした。トランスフェクションの間のインキュベーション体積は500μlであった。必要に応じて、無血清培地又は完全培地中で4時間、細胞を複合体とインキュベートする。次いで各ウェルに1mlの完全培地を加え、24時間(又は、代替として48時間)細胞を増殖させる。
細胞内へオリゴヌクレオチドを輸送するための異なる未修飾CPPの効力を評価するために、我々は、いわゆるスプライシング修正アッセイを使用した[14]。このアッセイは、安定にトランスフェクトしたHeLa細胞株である、HeLa pLuc 705細胞に基づく。この細胞は、潜在性のスプライス部位を保有するβ-グロブリンプレmRNAに由来するイントロン2の挿入により遮断される、ルシフェラーゼコード配列を保有するプラスミドの安定なトランスフェクションを有する(図1)。正常な条件下で、潜在性のスプライス部位は、イントロンを含んでいる成熟mRNA、及びそれによる、非機能的ルシフェラーゼタンパク質を生じる異常スプライス部位を活性化する。しかしながら、異常スプライス部位がSCOにより遮蔽される場合、ルシフェラーゼのプレmRNAは適切に処理され、機能的ルシフェラーゼが産生される。HeLa pLuc 705細胞を使用することにより、核送達における様々なベクターの効果を、ルシフェラーゼ活性を測定することにより評価できる。
次に、CPPの効果を増加させようとする試みにおいて、修飾をそれらのCPPに導入した。脂肪酸部分(すなわちステアリン酸)を、既存のCPP及びさらに新規に設計された配列に導入した(図5を参照されたい)。その後者の新規に設計された配列のペプチドである、PepFect1の設計の意図は、エンドソーム脱出を促進するための1つの部分(すなわち(RHbutRH)4)及び核への送達をもたらす1つの部分(RKKRKKK)を有する二機能性ペプチドを作製することであった。そのペプチドは、共有結合性コンジュゲートとしてペプチド核酸でのトランスフェクションに非常に有効であったが、そのペプチドは、非共有結合性環境でSCOを輸送できなかった(データは示さず)。したがって、そのペプチドをN末端でステアリル化した。並行して、他の4つの以前に試験したCPPもまたステアリル化し、M918[12]及びTP10[11]をそれぞれ、PepFect2及びPepFect3と新たに命名した。興味深いことに、ステアリル化したArg9又はペネトラチンのいずれも、試験したいずれのモル比でもスプライシング修正を促進できなかった。しかしながら、PepFect3は、SCOについて10:1までのモル比で非常に有効であり、Lipofectamine 2000を使用する場合とほとんど同じレベルのルシフェラーゼ発現に到達した(図4)。PepFect3の場合において、取込みとスプライシング修正との間に直接的な相関関係があったが、他のペプチドに関しては、そのような相関はなかった。実際に、スプライシング修正は、クロロキンと一緒にTP10を使用する場合と、PepFect3を使用する場合とでほとんど同じぐらい高かった(図6)。定量的取込みの相違は、SCOとの複合体においてTP10とPepFect3との間でほとんどなかった(図2a及び図4a)ため、増加した活性が増加したエンドソーム放出の結果であることが結論付けられた。驚くべきことに、PepFect3のみがスプライシング修正アッセイにおいて活性であり、PepFect2のみが少ない活性を有した(図4b)。
脂肪酸修飾の位置を評価及び特徴付けるために、PepFect3(N末端でステアリル修飾)及びPepFect4(Lys7でステアリル化した側鎖)を、SCOを送達する効力において比較した。図7は、PepFect4が、より低いモル比でさえもスプライシング修正を促進するのにPepFect3より有効であることを示す。同様に、Lipofecatmine 2000との比較において、PepFect4はより有効である。興味深いことに、PepFectの両方は、25倍低いSCO濃度において、前臨床に使用される共有結合性のCPP-モルホリノコンジュゲートである、RXR4-PMOより著しく活性である(図8)。
次のセットの実験において、4.7kbpのルシフェラーゼを発現するpGL3プラスミドの取込み及び発現を促進する上述のPepFectペプチドの能力を評価した。驚くべきことに、全てのPepFectペプチドは、遺伝子送達を著しく増加できた(図9)。再び、PepFect3は、1:1〜1:1.5の電荷比にて最も効果的なペプチドであった。この結果により、そのペプチドが、より生物学的に関連するプラスミド及びONの遺伝子送達にもまた、効果的に利用できることが示唆される。PF3及びプラスミドの複合体を、CR 0.5〜2の範囲の異なる電荷比にて調製し、製造業者のプロトコルに従って適用されるLipofectamine 2000のトランスフェクション効果と比較した。結果を、プラスミドのみで処理した細胞と比較した遺伝子発現の増加倍数として表す。図10のグラフは、1以上のCRにおいて、PF3がLipofectamine 2000より活性であることを示す。さらなる利点は、図11に見られるように同種のトランスフェクションである。従来のトランスフェクション試薬は、最適に機能するために特定の細胞密集度を必要とするが、図12は、PF4が、播種される細胞数と関係なく、等しく十分にトランスフェクトすることを示す。
生きている組織で作業する場合に重要なことは、できる限り低い毒性作用を維持することである。図11に見られるように、同じ数の細胞を、トランスフェクションの前に異なるサンプル中に播種したが、処理後、細胞の数は、lipofectamineで処理した細胞において低くなる。PepFect3は、Lipofectamine 2000より低い細胞毒性であり(図13)、したがって、遺伝子治療のための新規の非ウイルス手段を与えることができる。
マイクロRNA(miRNA)は、植物、無脊椎動物、及び脊椎動物のゲノム中でコードされる非コードRNAの新規の種類を示す。マイクロRNAは、(部分的)配列相補性に基づく標的mRNAの翻訳及び安定性を調節する。miRNAの変化は、ヒト癌の開始及び進行に関与する。miR-21が、癌遺伝子として機能し、bcl-2などの遺伝子の調節を介して腫瘍形成を調節するので、新規の治療標的として役立ちうることが示されている[19]。
この実施例において、ステアリン酸部分で修飾する代わりに、又はそれに加えて、CPPをまた、小胞区画からのペプチドの放出を促進する4種のクロロキンアナログを保持するリシンツリー(図5)にコンジュゲートする。この構築物は、細胞の核において作用するON化合物の輸送に活性なだけでなく、siRNAなどの細胞質によって活性なONの送達にさらに効果的に利用されうる(図16及び17)。実際に、PepFect5及びPepFect6の両方、及び特に後者のPepFect6のペプチドは、種々の細胞種類におけるsiRNAの送達に関してLipofectamine 2000より著しく活性である(図16〜18)。Lipofectamine/siRNA複合体は、任意の所与のsiRNA濃度にて、遺伝子発現の80%を超えるダウンレギュレーションをほとんど生じないが、siRNAと複合体化したPepFectの両方は、低いsiRNA濃度においてほとんど完全なRNAiを与える。加えて、Pepfect6は、血清を含有する完全な増殖培地においても同様に効果的である(図19)。この理由は、そのPepfect6は、ステアリル部分を欠くPepFect5と比べて、ステアリン酸部分とフルオロキンツリーの両方で二重に修飾したからであろう(図5)。
使用者に使いやすい試薬は、例えば複合体形成のモル比において、わずかな変化は許容すべきである。PF6は、異なるモル比においてほとんど同等に十分作用する(図20):50nMのsiRNAと複合体化したPF6での24時間処理後のBHK21細胞中のRNAi。10のような低いMRでさえも、ルシフェラーゼ安定性BHK21細胞中で80%を超えるルシフェラーゼのダウンレギュレーションを得ることは可能である。これは、典型的に、Lipofectamine 2000又は任意の他のリポソームに基づく送達システムで得ることが可能であるものより強力なRNAi効果である。興味深いことに、MR20とMR40との間で、反応の相違はむしろ低い。これにより、トランスフェクションを行う量の少しの変化がトランスフェクション有効性に多大な影響を与える、Lipofectamine 2000と比較して、より使用者に使いやすい送達システムになる。血清含有培地中の高い有効性(図21〜27)に加えて、PepFect6構築物は、全細胞集団をトランスフェクトし、それだけでなく分裂細胞もトランスフェクトする(図21)。これはさらに、図22において蛍光顕微鏡により可視化される。さらに、より長いsiRNA、いわゆるダイサー基質もまた、PF6により効果的に送達されうる(図24)。図23は、EGFP-CHO細胞における単一のsiRNA処理後のRNAi消失動態の分析を示す。PF6/siRNA粒子を所与の濃度のsiRNAで構築し、処理を血清又は無血清培地中で実施した。次いで、その効果を、Lipofectamine 2000又はOligofectamineと複合体化した100nMのsiRNAにより誘発されるRNAiと比較した。その結果により、siRNA濃度と関係なく、PR6が、24時間後にすでにほとんど完全なRNAiを誘発することが明らかに示される。これは、Oligofectamine及びLipofectamine 2000でそれぞれ観測された20%及び55%のノックダウンと対照的である。さらに、最適条件において、PF6を使用する場合、RNAi反応は4〜5日間持続する。最終的に、PepFect6は、SHSY-5Y(図25)、N2a、ラット一次グリア細胞(図26)及びJurkat浮遊細胞(図28)を含む、多くの非常に「トランスフェクトするのが難しい」細胞をトランスフェクトできる。Lipofectamine 2000又はOligofectamineと比べて、より低い毒性と組み合わせた上記の特性が、この特徴的なベクターを非常にユニークなものとしている。
図29において、我々は、部分Aがキノリンアナログでなくてもよいことを実証する。ナフタレン誘導体及び類似の環構造が同様の機能を達成する。SCOと複合体化したPF5アナログでの処理後のHeLa細胞におけるスプライシング修正。この場合において、1-ナフトキシプロパン酸の4コピーと直交してリシン分岐を有するTP10を、融合特性の重要性を評価するために、キノリンアナログの代わりに使用した。この結果により、12倍のスプライシング増加が示され、これは、以前にPF5について観測された100倍の増加と対照的である。
いくつかの異なる細胞透過性ペプチドをPepFect送達システムにおいて試験し、ここに、Pepfect14と呼ばれるステアリルの結合を有する新規配列の例がある。PepFect14は、図30に示すように、血清の存在下においても同様にsiRNA及びSCOの両方を効果的に送達できる。
加えて、PepFect送達システムは、図31に示すように、相乗的に作用する異なる比でPF3及びPF5と一緒に加えることができ、2つのPepFect自体より良くSCOを送達できる。加えて、2つ以上のPepFect送達システムの組成物を同様に、ターゲティング又は長期間の半減期などの付加的特性のために混合できる。
磁気攪拌器を備えた50mLの丸底フラスコ中の3.8g(16.3mmol)の4-クロロ-7-(トリフルオロメチル)キノリン及び12倍モル過剰のN-メチル-2,2'-ジアミノジエチルアミン(25ml)の混合物を、2.5時間にわたって攪拌しながら、室温から80℃までPEG 400槽を使用して加熱し、次いで温度を3時間にわたって130℃まで上昇させ、最終的に140℃にて2.5時間加熱する。その反応混合物を室温まで冷却し、冷DCMを加えると、すぐに沈殿物が生じ、それを濾過する。有機層を5%のNaHCO3で2回洗浄し、次いで水により2回洗浄する。有機層を無水MgSO4で乾燥させ、溶媒を減圧下(ロータベーパー(rotavapor))で除去し、残渣を凍結乾燥器中に置いておく。質量4.5g(MW 312.3)、14.4mmol、83%収率の粗生成物を、さらに精製せずにペプチドに対するコンジュゲーションに使用する。
Claims (22)
- 少なくとも1つのキノリン及び/又はキノリン誘導体を含み、且つ、少なくとも4個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖脂肪族部分を少なくとも1つ含んでいてもよい成分Aを少なくとも1つ含む、細胞内カーゴ送達のためのシステムであって、前記成分Aが細胞透過性ペプチドBに結合している、システム。
- 成分A及びBが、前記結合のために各々、少なくとも1つの官能基を有する、請求項1に記載のシステム。
- ターゲティング部分である少なくとも1つの成分Cをさらに含む、請求項1又は2に記載のシステム。
- カーゴをさらに含む、請求項1から3のいずれかに記載のシステム。
- 1つ又は複数の成分A、1つ又は複数の成分C及び1つ又は複数のカーゴが、ペプチドBの側鎖、並びに/又はN末端及び/若しくはC末端に結合している、請求項1から4のいずれかに記載のシステム。
- 複数のペプチドBを含む、請求項1から5のいずれかに記載のシステム。
- 少なくとも1つの直鎖又は分岐鎖脂肪部分が、10〜30個の炭素原子を有する脂肪酸又はその誘導体、好ましくはステアリン酸又はそのC18誘導体、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、アラキジン酸、及びベヘン酸から選択される、請求項1から6のいずれかに記載の送達システム。
- 前記成分A、C及び前記カーゴのうちの少なくとも1つがスペーサーアームと結合している、請求項1から7のいずれかに記載のシステム。
- 部分Bが以下の配列の1コピー又は数コピーから選択される、請求項1から8のいずれかに記載のシステム。
配列番号1. AGYLLGKINLKALAALAKKIL
配列番号2 AGYLLGKLLOOLAAAALOOLL
配列番号3 RKKRKKKRXRHXRHXRHXR
配列番号4 MVTVLFRRLRIRRACGPPRVRV
配列番号5 RKKRKKK(HXH)4
配列番号6 LLOOLAAAALOOLL
配列番号7 RQIKIWFQNRRMKWKK
配列番号8 RRRRRRRRR
配列番号9 MVTVLFRRLRIRRACGPPRVRV
配列番号10 GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV
配列番号11 FILFILFILGGKHKHKHKHKHK
配列番号12 FILFILFILGKGKHKHKHKHKHK
配列番号13 FILFILFILGKGKHRHKHRHKHR
配列番号15 GDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTL
配列番号16 PFLDRLRRDQKSLRGRGSTL
配列番号17 PFLNRLRRDQKSLRGRGSTL
配列番号18 PFLDRLRRNQKSLRGRGSTL
配列番号19 PFLNRLRRNQKSLRGRGSTL
配列番号20 PFLNRLRRNLKSLRGRLSTL
配列番号21 PFLDRKRRDQKSLRGRGSTL
配列番号22 RHRHRHHHGGPFLDRLRRDQKSLRGRGSTL
配列番号23 PNNVRRDLDNLHACLNKAKLTVSRMVTSLLEK
配列番号24 PNNVRRDLDNLHAMLNKAKLTVSRMVTSLLEK
配列番号25 PNNVRRDLNNLHAMLNKAKLTVSRMVTSLLQK
配列番号26 PFLNRLRRNLKSLRGRLSTL
配列番号27 PFLNRKRRNLKSLRGRLSTL
配列番号28 INLKALAALAKKIL - 部分Bが、式Ny1-Bx1-Ny2-Bx2-Ny3(式中、Bは塩基性アミノ酸であり、Nは中性アミノ酸であり、x1、x2、y1、y2及びy3は2〜8の整数である)の配列を含有するペプチドから選択される、請求項1から9のいずれかに記載のシステム。
- 部分Bが、LLOOLAAAALOOLL[配列番号6]及び特にAGYLLGKLLOOLAAAALOOLL[配列番号2]又はINLKALAALAKKIL[配列番号28]及び特にAGYLLGKINLKALAALAKKIL[配列番号1]並びにアミノ酸の欠失、付加挿入、及び置換から選択される、請求項1から10のいずれかに記載のシステム。
- 前記細胞透過性ペプチドBのC末端が修飾されている、請求項1から11のいずれかに記載のシステム。
- 前記カーゴが、一本鎖オリゴヌクレオチド(DNA、RNA、PNA、LNA及び全ての合成オリゴヌクレオチド)、二本鎖オリゴヌクレオチド(siRNA、shRNA、デコイdsDNAなど)を含む、オリゴヌクレオチド及びその修飾された形態、プラスミド及びその他の変種、合成ヌクレオチドアナログからなる群から選択される、請求項1から12のいずれかに記載のシステム。
- 前記カーゴが、蛍光マーカー、細胞又は腫瘍ホーミングペプチド、アプタマー、受容体リガンド、不活性化ペプチドに結合された切断部位を含むスペーサー、ペプチドリガンド、細胞障害性ペプチド、生物活性ペプチド、診断薬、タンパク質、薬剤、例えば抗癌剤又は抗生物質からなる群の1つ又は複数のメンバーに連結された群から選択される、請求項1から12のいずれかに記載のシステム。
- 少なくとも1つのイメージング剤及び/又は標識分子をさらに含む、請求項1から14のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記標識分子が、細胞内mRNAを標識又は定量化するための、消光した蛍光に基づくビーコン及びFRET技術に基づくビーコンを含む、分子ビーコンである、請求項15に記載のシステム。
- PEGのような循環クリアランス修飾因子を併せて含む、請求項1から6のいずれか一項に記載のシステム。
- 請求項1から17のいずれかに記載の複数の送達システムを含む組成物であって、前記送達システムは異なる成分A、及び/又は異なるペプチドB、及び/又は異なる成分C及び/又は異なるカーゴ及び場合によってはさらにPEGのような循環クリアランス修飾因子を含む、組成物。
- 前記送達システムが、少なくとも2つの異なるペプチドB及び場合によってはさらにPEGのような循環クリアランス修飾因子を含む、請求項18に記載の組成物。
- 請求項1から17のいずれかに記載の送達システム並びに/又は請求項18若しくは19に記載の組成物を含む、医薬組成物。
- 請求項1から17のいずれかに記載の送達システムの1つ又は複数で覆われた物質。
- 請求項1から17のいずれかに記載の送達システムの1つ又は複数が内部に組み込まれた物質。
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