JP5555940B2

JP5555940B2 - Method for detecting proliferative diabetic retinopathy and screening method for prophylactic / therapeutic agent

Info

Publication number: JP5555940B2
Application number: JP2010093240A
Authority: JP
Inventors: 賢治出原; 昭一郎太田; 和彦有馬; 裕士白石; 章一鈴木; 利寛向野; 茂生吉田; 達朗石橋
Original assignee: NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION SAGA UNIVERSITY; Fukuoka University
Current assignee: NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION SAGA UNIVERSITY; Fukuoka University
Priority date: 2010-04-14
Filing date: 2010-04-14
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2030-04-14
Also published as: JP2011220969A

Description

本発明は、増殖糖尿病網膜症の検出方法および予防・治療剤のスクリーニング方法などに関する。 The present invention relates to a method for detecting proliferative diabetic retinopathy and a method for screening a prophylactic / therapeutic agent.

日本人の生活様式の欧米化や高齢化社会の進展により、近年糖尿病患者は増加の一途をたどっている。それに伴い糖尿病三大合併症の一つである糖尿病網膜症の患者数も増加し、年間約3000人が失明している。今後も糖尿病網膜症の患者数は増加するといわれており、よりよい診断や治療法の確立が社会的急務である。 In recent years, the number of diabetic patients has been increasing due to the westernization of Japanese lifestyles and the progress of an aging society. As a result, the number of patients with diabetic retinopathy, one of the three major complications of diabetes, has increased, and about 3,000 people are blind each year. It is said that the number of patients with diabetic retinopathy will continue to increase, and the establishment of better diagnosis and treatment is an urgent social need.

糖尿病網膜症は大きく単純・増殖前・増殖糖尿病網膜症に分類される。増殖前網膜症に対しては網膜光凝固術の有効性が確立されてはいる。しかし、網膜光凝固術にもかかわらず病状が進行する例や、眼科受診時にすでに進行した増殖網膜症の段階で失明の危機に瀕していることもある。増殖糖尿病網膜症では網膜上に増殖組織を生じ、その収縮に伴う牽引性網膜剥離が失明の原因となる。増殖糖尿病網膜症患者の眼底写真を図１に示す。図１に示すように、増殖糖尿病網膜症患者では網膜前線維血管増殖組織による牽引性網膜剥離が認められる。現在のところ、増殖組織生成の分子機序は不明で、近年の安全な硝子体手術の進歩に伴い治療成績は向上してきているが、視機能を保持できない場合も少なくない。 Diabetic retinopathy is broadly classified into simple, preproliferative, and proliferative diabetic retinopathy. Effectiveness of retinal photocoagulation has been established for preproliferative retinopathy. However, there are cases where the disease progresses in spite of retinal photocoagulation, or at the stage of proliferative retinopathy that has already progressed at the time of ophthalmology, and is at risk of blindness. In proliferative diabetic retinopathy, proliferative tissue is formed on the retina, and tractional retinal detachment accompanying the contraction causes blindness. A fundus photograph of a patient with proliferative diabetic retinopathy is shown in FIG. As shown in FIG. 1, in patients with proliferative diabetic retinopathy, traction retinal detachment due to preretinal fibrovascular proliferating tissue is observed. At present, the molecular mechanism of proliferating tissue generation is unknown, and the results of treatment have improved with the progress of safe vitrectomy in recent years, but there are many cases where visual function cannot be maintained.

増殖糖尿病網膜症については、通常は糖尿病の既往と眼底検査で診断を確定するが、眼科初診で糖尿病が初めて明らかになる症例や、硝子体出血を合併しているなど非定型的な病像を呈することもあり、迅速かつ非侵襲的に増殖糖尿病網膜症を診断しうる診断方法が望まれる。現在、増殖糖尿病網膜症の非侵襲的診断法として、臨床上有用な血清マーカーは存在しない。 For proliferative diabetic retinopathy, the diagnosis is usually confirmed by a history of diabetes and fundus examination. However, there are cases in which diabetes is revealed for the first time at the first ophthalmologic examination, and there are atypical symptoms such as vitreous hemorrhage. Therefore, a diagnostic method that can rapidly and noninvasively diagnose proliferative diabetic retinopathy is desired. Currently, there is no clinically useful serum marker as a noninvasive diagnostic method for proliferative diabetic retinopathy.

以上の事より、眼科的診断をより確実にし、被検者にとって侵襲の少ない検査方法が提供されれば有用となる。 From the above, it would be useful if an ophthalmic diagnosis was made more reliable and a test method with less invasiveness was provided to the subject.

ここで、ペリオスチン(骨芽細胞特異因子２)遺伝子の発現レベルの測定がアレルギー性疾患の検査方法として有用であること（特許文献1：WO2002／052006、非特許文献1：G. Takayama et al., J Allergy Clin Immunol, vol.118, 98−104, 2006）、また、特発性間質性肺炎の検査方法においてペリオスチンの発現レベルの測定が有用であること（特許文献２：WO2009／148184）などが知られている。しかしながら、ペリオスチン遺伝子の発現レベルおよびペリオスチンタンパク質量と増殖糖尿病網膜症との関係は明らかでない。 Here, measurement of the expression level of the periostin (osteoblast-specific factor 2) gene is useful as a test method for allergic diseases (Patent Document 1: WO2002 / 052006, Non-Patent Document 1: G. Takayama et al. , J Allergy Clin Immunol, vol. 118, 98-104, 2006), and the measurement of the expression level of periostin is useful in a test method for idiopathic interstitial pneumonia (Patent Document 2: WO2009 / 148184). It has been known. However, the relationship between the expression level of periostin gene and the amount of periostin protein and proliferative diabetic retinopathy is not clear.

WO2002／052006WO2002 / 052006 WO2009／148184WO2009 / 148184

G. Takayama et al., J Allergy Clin Immunol, vol.118, 98−104, 2006G. Takayama et al., J Allergy Clin Immunol, vol.118, 98-104, 2006

このような状況の下、マーカーを利用した増殖糖尿病網膜症の検出方法、および増殖糖尿病網膜症の予防・治療剤のスクリーニング方法などが求められていた。 Under such circumstances, a method for detecting proliferative diabetic retinopathy using a marker and a screening method for a prophylactic / therapeutic agent for proliferative diabetic retinopathy have been demanded.

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、増殖糖尿病網膜症患者由来の生体試料においてペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量が高いこと、ペリオスチンをマーカーとして利用することで増殖糖尿病網膜症を検出できること、また、増殖糖尿病網膜症の予防・治療剤のスクリーニングができること等の知見に基づき本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下の増殖糖尿病網膜症の検出方法または診断方法、および増殖糖尿病網膜症の予防・治療剤のスクリーニング方法などを提供する。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that periostin gene expression levels or periostin protein levels are high in biological samples derived from proliferative diabetic retinopathy patients, and that periostin is used as a marker. The present invention has been completed based on the knowledge that proliferative diabetic retinopathy can be detected and that prophylactic / therapeutic agents for proliferative diabetic retinopathy can be screened.
That is, the present invention provides the following method for detecting or diagnosing proliferative diabetic retinopathy, and a method for screening a prophylactic / therapeutic agent for proliferative diabetic retinopathy.

［1］被験者由来の生体試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定することを含む、増殖糖尿病網膜症の検出方法。
［2］測定した遺伝子の発現レベルまたはタンパク質量を、増殖糖尿病網膜症の発症の有無と関連付ける、上記[1]に記載の方法。
［3］（i）被験者由来の生体試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量と、（ii）対照試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量との比較を行うことを含む、上記[1]又は[2]に記載の方法。
［4］（i）被験者由来の生体試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量が（ii）対照試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量よりも高いときに、増殖糖尿病網膜症である、または増殖糖尿病網膜症であると疑われると判断することを含む、上記[3]に記載の方法。
［5］生体試料が硝子体または血液である、上記[1]〜[4]のいずれか1項に記載の方法。
［6］ペリオスチンを産生することができる細胞を候補物質の存在下で培養し、培養物中のペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定することを含む、増殖糖尿病網膜症の予防・治療剤のスクリーニング方法。
［7］測定した遺伝子の発現レベルまたはタンパク質量を、候補物質による増殖糖尿病網膜症の予防・治療効果と関連付ける、上記[6]に記載の方法。
［8］（i）ペリオスチンを産生することができる細胞を候補物質の存在下で培養した場合におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量と、（ii）ペリオスチンを産生することができる細胞を候補物質の非存在下で培養した場合におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量との比較を行うことを含む、上記[7]に記載の方法。
［9］（i）ペリオスチンを産生することができる細胞を候補物質の存在下で培養した場合におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量が（ii）ペリオスチンを産生することができる細胞を候補物質の非存在下で培養した場合におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量よりも低いときに、候補物質を選択することを含む、上記[8]に記載の方法。
［10］測定が免疫測定法によるものである、上記[1]〜[9]のいずれか1項に記載の方法。
［11］（i）ペリオスチンを認識する抗体、（ii）ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計された、連続する少なくとも15塩基のポリヌクレオチドからなるプライマー、および（iii）ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計された、連続する少なくとも15塩基のポリヌクレオチドからなるプローブからなる群から選択される少なくとも1つを含有する、増殖糖尿病網膜症の検出薬。
［12］（i）ペリオスチンを認識する抗体、（ii）ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計された、連続する少なくとも15塩基のポリヌクレオチドからなるプライマー、および（iii）ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計された、連続する少なくとも15塩基のポリヌクレオチドからなるプローブからなる群から選択される少なくとも1つを含有する、増殖糖尿病網膜症の検出用キット。
［13］ペリオスチンを産生することができる細胞を含む、増殖糖尿病網膜症の予防・治療剤のスクリーニング用キット。 [1] A method for detecting proliferative diabetic retinopathy, comprising measuring the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein in a biological sample derived from a subject.
[2] The method according to [1] above, wherein the measured gene expression level or protein amount is associated with the presence or absence of development of proliferative diabetic retinopathy.
[3] The above [1], comprising comparing (i) the expression level or periostin protein level of a periostin gene in a biological sample derived from a subject with (ii) the expression level or periostin protein level of a periostin gene in a control sample ] Or the method according to [2].
[4] (i) Periostin gene expression level in a subject-derived biological sample or periostin protein amount is higher than (ii) periostin gene expression level or periostin protein amount in a control sample; Or determining the suspected proliferative diabetic retinopathy as described in [3] above.
[5] The method according to any one of [1] to [4] above, wherein the biological sample is vitreous or blood.
[6] A prophylactic / therapeutic agent for proliferative diabetic retinopathy, comprising culturing cells capable of producing periostin in the presence of a candidate substance and measuring the expression level of the periostin gene or the amount of periostin protein in the culture. Screening method.
[7] The method according to [6] above, wherein the measured gene expression level or protein amount is associated with a prophylactic / therapeutic effect of proliferative diabetic retinopathy by a candidate substance.
[8] (i) Periostin gene expression level or periostin protein amount when cells capable of producing periostin are cultured in the presence of a candidate substance, and (ii) cells capable of producing periostin as a candidate substance The method according to [7] above, comprising comparing the expression level of the periostin gene or the amount of periostin protein when cultured in the absence of.
[9] (i) When the cell capable of producing periostin is cultured in the presence of the candidate substance, the expression level of the periostin gene or the amount of periostin protein is (ii) the cell capable of producing periostin as the candidate substance. The method according to [8] above, comprising selecting a candidate substance when the expression level of the periostin gene or the amount of periostin protein is lower when cultured in the absence.
[10] The method according to any one of [1] to [9] above, wherein the measurement is based on an immunoassay.
[11] (i) an antibody that recognizes periostin, (ii) a primer comprising at least 15 consecutive nucleotides designed based on the base sequence of a gene encoding periostin, and (iii) encoding periostin An agent for detecting proliferative diabetic retinopathy, comprising at least one selected from the group consisting of probes consisting of at least 15 consecutive nucleotides designed based on the nucleotide sequence of a gene.
[12] (i) an antibody recognizing periostin, (ii) a primer comprising at least 15 consecutive polynucleotides designed based on the base sequence of the gene encoding periostin, and (iii) encoding periostin A kit for the detection of proliferative diabetic retinopathy, comprising at least one selected from the group consisting of probes consisting of at least 15 consecutive nucleotides designed based on the nucleotide sequence of a gene.
[13] A screening kit for a prophylactic / therapeutic agent for proliferative diabetic retinopathy, comprising cells capable of producing periostin.

本発明は、新規マーカーを利用した増殖糖尿病網膜症の検出方法を提供する。本発明の好ましい態様によれば、検出結果を、増殖糖尿病網膜症の確定診断の補助にできる等の利点がある。また。本発明は、増殖糖尿病網膜症の予防・治療剤のスクリーニング方法を提供する。 The present invention provides a method for detecting proliferative diabetic retinopathy using a novel marker. According to a preferred embodiment of the present invention, there is an advantage that the detection result can be used for assisting a definitive diagnosis of proliferative diabetic retinopathy. Also. The present invention provides a screening method for a prophylactic / therapeutic agent for proliferative diabetic retinopathy.

増殖糖尿病網膜症患者の眼底写真である。It is a fundus photograph of a patient with proliferative diabetic retinopathy. 正常網膜、網膜上線維血管増殖組織におけるペリオスチンの組織染色の結果を示す写真である。(a)正常網膜、(b) 線維血管増殖組織。It is a photograph which shows the result of the tissue dyeing | staining of periostin in a normal retina and a retinal fibrovascular proliferating tissue. (a) Normal retina, (b) Fibrovascular proliferating tissue. 各疾患群の硝子体ペリオスチン濃度と群間比較を示すグラフである。Kruskal−Wallis test: P< 0.001。Bonferroni correction after Mann−Whitney test:： * P < 0.001。It is a graph which shows the vitreous periostin density | concentration of each disease group, and comparison between groups. Kruskal-Wallis test: P <0.001. Bonferroni correction after Mann-Whitney test :: * P <0.001. 各疾患群の血清ペリオスチン濃度と群間比較を示すグラフである。Kruskal−Wallis test: P< 0.001。Bonferroni correction after Mann−Whitney test:：* P < 0.01。It is a graph which shows the serum periostin density | concentration of each disease group, and comparison between groups. Kruskal-Wallis test: P <0.001. Bonferroni correction after Mann-Whitney test :: * P <0.01.

以下、本発明を詳細に説明する。
なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
It should be noted that all publications cited in the present specification, for example, prior art documents, publications, patent publications and other patent documents are incorporated herein by reference.

1．本発明の概要
本発明は、被験者由来の生体試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定することを含む、増殖糖尿病網膜症の検出方法または診断方法であり、当該測定結果を指標として用い、増殖糖尿病網膜症と関連付けることを特徴とするものである。
本発明者らは、増殖糖尿病網膜症に関連する分子を探索すべく鋭意検討を重ねた。その結果、増殖糖尿病網膜症の患者由来の生体試料において、ペリオスチンレベルが高いことなどを見出した。 1． SUMMARY OF THE INVENTION The present invention is a method for detecting or diagnosing proliferative diabetic retinopathy, comprising measuring the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein in a biological sample derived from a subject, and using the measurement result as an index. , Characterized by association with proliferative diabetic retinopathy.
The present inventors have conducted intensive studies to search for molecules related to proliferative diabetic retinopathy. As a result, it has been found that periostin levels are high in biological samples derived from patients with proliferative diabetic retinopathy.

具体的には、47000遺伝子のマイクロアレイ解析を行い、正常網膜と有意に発現レベルが上昇する遺伝子として、ペリオスチンを同定した。さらに、増殖糖尿病網膜症患者由来の網膜上線維血管増殖組織を用いて免疫化学組織染色法によりペリオスチンタンパク質の発現性を検討した。その結果、増殖糖尿病網膜症由来の網膜上線維血管増殖組織においてペリオスチンタンパク質が高濃度に染色されたことから、増殖糖尿病網膜症患者由来の網膜上線維血管増殖組織においてペリオスチン遺伝子の発現レベルおよびペリオスチンタンパク質量が高いことが分かった(図2(b))。一方、対照群として用いた正常網膜では、ペリオスチン遺伝子の発現レベルおよびペリオスチンタンパク質量が、増殖糖尿病網膜症患者由来の網膜と比較して低かった(図2(a))。 Specifically, microarray analysis of 47000 genes was performed, and periostin was identified as a gene whose expression level significantly increased from that of normal retina. Furthermore, we examined the expression of periostin protein by immunochemical tissue staining using epiretinal fibrovascular proliferating tissue from proliferative diabetic retinopathy patients. As a result, the periostin protein was stained at a high concentration in the retinal fibrovascular proliferative tissue derived from proliferative diabetic retinopathy. The amount was found to be high (Figure 2 (b)). On the other hand, in the normal retina used as a control group, the expression level of periostin gene and the amount of periostin protein were lower than that of the retina derived from patients with proliferative diabetic retinopathy (FIG. 2 (a)).

次に、硝子体中や血中のペリオスチン濃度の測定が増殖糖尿病網膜症の検出に有用である可能性を考え、検討を行った。
増殖糖尿病網膜症患者群の硝子体中のペリオスチンタンパク質の濃度を測定した。その結果、増殖糖尿病網膜症（PDR）患者由来の硝子体において、ペリオスチンタンパク質濃度が高かった（図3）。一方、対照群として用いた特発性黄斑上膜(ERM)患者群および黄斑円孔(MH)患者群由来のそれぞれの硝子体では、硝子体中のペリオスチンタンパク質濃度が低く、増殖糖尿病網膜症患者由来の硝子体中のペリオスチンタンパク質濃度と比較して低く、有意な差が認められた（図3）。 Next, we considered the possibility that the measurement of periostin concentration in the vitreous body and blood would be useful for the detection of proliferative diabetic retinopathy.
The concentration of periostin protein in the vitreous of proliferative diabetic retinopathy patient group was measured. As a result, the periostin protein concentration was high in the vitreous from patients with proliferative diabetic retinopathy (PDR) (Figure 3). On the other hand, each vitreous derived from the idiopathic epimacular membrane (ERM) patient group and macular hole (MH) patient group used as a control group has a low periostin protein concentration in the vitreous and is derived from a patient with proliferative diabetic retinopathy Compared to the periostin protein concentration in the vitreous, there was a significant difference (Fig. 3).

また、増殖糖尿病網膜症患者群よりそれぞれ採取した血液を用いて血清中のペリオスチンタンパク質の濃度を測定した。その結果、増殖糖尿病網膜症（PDR）患者由来の血液において、ペリオスチンタンパク質濃度が高かった（図4）。一方、対照群として用いた特発性黄斑上膜(ERM)患者群および黄斑円孔(MH)患者群由来のそれぞれの血液では、血清中のペリオスチンタンパク質濃度が低く、増殖糖尿病網膜症患者由来の血液中のペリオスチンタンパク質濃度と比較して明らかに低く、有意な差が認められた(図4)。 Moreover, the density | concentration of the periostin protein in serum was measured using the blood each extract | collected from the proliferative diabetic retinopathy patient group. As a result, periostin protein concentration was high in blood from proliferative diabetic retinopathy (PDR) patients (Fig. 4). On the other hand, each blood from the idiopathic epimacular membrane (ERM) patient group and macular hole (MH) patient group used as a control group has a low serum periostin protein concentration, and blood from patients with proliferative diabetic retinopathy It was clearly lower than the concentration of periostin protein in the medium, and a significant difference was observed (FIG. 4).

以上のように、増殖糖尿病網膜症患者より採取した生体試料においては、ペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量が高いことから、本発明者らは、ペリオスチン遺伝子またはペリオスチンタンパク質が、増殖糖尿病網膜症を検出するためのマーカーとして有用であることを見出した。 As described above, in biological samples collected from patients with proliferative diabetic retinopathy, the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein is high, and therefore, the present inventors have demonstrated that periostin gene or periostin protein has proliferative diabetic retinopathy. It was found useful as a marker for detection.

また、本発明は、ペリオスチン（遺伝子（RNA）、タンパク質）を産生することができる細胞を候補物質の存在下で培養した場合におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定することを含む、増殖糖尿病網膜症の予防・治療剤のスクリーニング方法も提供する。 The present invention also includes measuring the expression level of the periostin gene or the amount of periostin protein when cells capable of producing periostin (gene (RNA), protein) are cultured in the presence of a candidate substance. A screening method for a prophylactic / therapeutic agent for diabetic retinopathy is also provided.

上記のようにペリオスチン遺伝子は、増殖糖尿病網膜症患者由来の組織で発現レベルが増加し、患者由来の組織中のペリオスチンタンパク質レベルを増大させるので、患者に投与することにより組織でのペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を減少させる化合物またはその塩、例えば、発現を阻害する化合物またはその塩（ペプチド、タンパク質、合成化合物、もしくは抗ペリオスチン抗体、またはそれらの塩など、更にはペリオスチン遺伝子（RNA）の活性を阻害させる、オリゴ核酸である、siRNA、その基となる、shRNAやshRNAを産生するベクター等）は、増殖糖尿病網膜症の予防・治療剤として使用し得る。 As described above, the expression level of periostin gene increases in tissues derived from patients with proliferative diabetic retinopathy, and increases the level of periostin protein in the tissues derived from patients. A compound or a salt thereof that decreases the level or the amount of periostin protein, for example, a compound that inhibits expression or a salt thereof (such as a peptide, protein, synthetic compound, or anti-periostin antibody, or a salt thereof, and further a periostin gene (RNA) Oligonucleic acid, siRNA that inhibits the activity, and vectors that produce shRNA and shRNA, which are the basis thereof, can be used as prophylactic / therapeutic agents for proliferative diabetic retinopathy.

さらに、ペリオスチンタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩も、増殖糖尿病網膜症の予防・治療剤として使用し得る。よって、本発明は、ペリオスチンタンパク質と候補物質を接触させて、ペリオスチンの活性の変化を検出することを含む、増殖糖尿病網膜症の予防・治療剤のスクリーニング方法を提供する。 Furthermore, a compound that inhibits the activity of periostin protein or a salt thereof can also be used as a prophylactic / therapeutic agent for proliferative diabetic retinopathy. Therefore, the present invention provides a screening method for a prophylactic / therapeutic agent for proliferative diabetic retinopathy, which comprises detecting a change in periostin activity by bringing a periostin protein into contact with a candidate substance.

2．ペリオスチン
ペリオスチン（periostin）は、骨芽細胞特異因子2とも呼ばれる、約90kDaのタンパク質である（OSF2;Horiuchi K,Amizuka N, Takeshita S,Takamatsu H, Katsuura M, Ozawa H, Toyama Y,Bonewald LF, Kudo A.;Identification and characterization of a novel protein, periostin, with restricted expression to periosteum and periodontal ligament and increased expression by transforming growth factor beta.J Bone Miner Res.1999 Jul;14(7):1239−49.）。ペリオスチンには、alternative splicingによるC末側の長さの違いで区別できるいくつかの転写物が存在することが知られている。ここで、配列番号1に、ヒトのペリオスチン遺伝子の全てのエクソンによる転写産物のDNA配列を示す（Accession No. D13666）。また、ヒトのペリオスチンのその他のsplicing variantのDNA配列の例を、配列番号3、5に示す（それぞれ、Accession Nos. AY918092、AY140646）。また、配列番号2、4、6に、それぞれ、配列番号1、3、5のポリヌクレオチドによってコードされるペリオスチンのアミノ酸配列を示す。 2． Periostin Periostin is a protein of about 90 kDa, also called osteoblast-specific factor 2 (OSF2; Horiuchi K, Amizuka N, Takeshita S, Takamatsu H, Katsuura M, Ozawa H, Toyama Y, Bonnewald LF, Kudo A .; Identification and characterization of a novel protein, periostin, with restricted expression to periosteum and periodontal ligament and increased expression by transforming growth factor beta. J Bone Miner Res. 1999 Jul; 14 (7): 1239-49.). It is known that periostin has several transcripts that can be distinguished by alternative splicing length differences on the C-terminal side. Here, SEQ ID NO: 1 shows the DNA sequence of transcripts of all exons of the human periostin gene (Accession No. D13666). Examples of DNA sequences of other splicing variants of human periostin are shown in SEQ ID NOs: 3 and 5 (Accession Nos. AY918092 and AY140646, respectively). SEQ ID NOs: 2, 4, and 6 show the amino acid sequences of periostin encoded by the polynucleotides of SEQ ID NOs: 1, 3, and 5, respectively.

本発明の好ましい態様では、配列番号2で表されるアミノ酸配列又はその配列から派生するvariant（例えば、配列番号2、4または6で表されるアミノ酸配列からなるペリオスチン）を含むペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定する。 In a preferred embodiment of the present invention, the expression level of a periostin gene comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a variant derived from the sequence (for example, periostin comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6) Alternatively, the amount of periostin protein is measured.

3．本発明の増殖糖尿病網膜症の検出方法または診断方法
ペリオスチン遺伝子またはペリオスチンタンパク質量は、増殖糖尿病網膜症の患者由来の組織で発現が増加しているので、被験者由来の生体試料におけるペリオスチンは、増殖糖尿病網膜症を検出または診断するためのマーカーとして利用し得る。すなわち、本発明は、被験者由来の生体試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定することを含む、増殖糖尿病網膜症の検出方法を提供する。この場合、測定した遺伝子の発現レベルまたはタンパク質量を、増殖糖尿病網膜症と関連付けるのが好ましい。 3． The method for detecting or diagnosing proliferative diabetic retinopathy of the present invention Since the expression of periostin gene or periostin protein is increased in tissues derived from patients with proliferative diabetic retinopathy, periostin in a biological sample derived from a subject is proliferative diabetic. It can be used as a marker for detecting or diagnosing retinopathy. That is, the present invention provides a method for detecting proliferative diabetic retinopathy, which comprises measuring the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein in a biological sample derived from a subject. In this case, the measured gene expression level or protein amount is preferably associated with proliferative diabetic retinopathy.

本発明の別のいくつかの態様によれば、例えば、（i）被験者由来の生体試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量と、（ii）対照試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量との比較を行う。さらに具体的には、ペリオスチンタンパク質量またはペリオスチンをコードするmRNA量を測定して比較する。 According to some other embodiments of the present invention, for example, (i) expression level or periostin protein level of periostin gene in a biological sample derived from a subject, and (ii) expression level or periostin protein level of periostin gene in a control sample Compare with. More specifically, the amount of periostin protein or the amount of mRNA encoding periostin is measured and compared.

発現レベルまたはタンパク質量の測定に用いる生体試料としては、例えば、被験者由来の網膜上線維血管増殖組織、硝子体、血液等を用いることができる。好ましくは、簡便性や非侵襲であるという観点から、被験者由来の血液等を用いることが推奨される。網膜上線維血管増殖組織、硝子体または血液等を採取する方法は、公知である。網膜上線維血管増殖組織や硝子体は、例えば、硝子体手術時に本来除去する試料を活用するにしても良い。対照試料は、例えば、増殖糖尿病網膜症を患っていない者由来の生体試料（例、網膜組織、硝子体、血液等）である。ここで、増殖糖尿病網膜症を患っていない者は、例えば、健常者である。本発明のいくつかの態様では、増殖糖尿病網膜症を患っていない者とは、健常者の他に、増殖糖尿病網膜症以外の病態に罹患した患者が含まれる。従って、特発性黄斑上膜患者、黄斑円孔患者などの増殖糖尿病網膜症以外の患者が含まれる。 As the biological sample used for measuring the expression level or the protein amount, for example, a subject-derived epiretinal fibrovascular proliferating tissue, vitreous, blood, or the like can be used. Preferably, from the viewpoint of simplicity and non-invasiveness, it is recommended to use blood derived from a subject. Methods for collecting epiretinal fibrovascular proliferating tissue, vitreous or blood, etc. are known. For the retinal fibrovascular proliferating tissue and the vitreous body, for example, a sample originally removed at the time of vitreous surgery may be used. The control sample is, for example, a biological sample (eg, retinal tissue, vitreous, blood, etc.) derived from a person who does not suffer from proliferative diabetic retinopathy. Here, the person who does not suffer from proliferative diabetic retinopathy is, for example, a healthy person. In some embodiments of the present invention, the person who does not have proliferative diabetic retinopathy includes a patient suffering from a condition other than proliferative diabetic retinopathy in addition to a healthy person. Therefore, patients other than proliferative diabetic retinopathy such as idiopathic epimacular patients and macular hole patients are included.

生体試料が網膜上線維血管増殖組織等である場合には、遺伝子の発現レベルまたはタンパク質量の測定に利用するために、例えば、そのライセートを調製すること、またはmRNAを抽出することが好ましい。ライセートの調製およびmRNAの抽出は、公知の方法で行うことができ、例えば市販のキットを使用して行う。また、生体試料が、血液等の液状のもの、あるいは硝子体等のゲル状のものである場合には、例えば、緩衝液等で希釈して遺伝子の発現レベルまたはタンパク質量の測定に利用するのが好ましい。 When the biological sample is an epiretinal fibrovascular proliferating tissue or the like, for example, it is preferable to prepare a lysate or extract mRNA in order to use it for measurement of gene expression level or protein amount. Lysate preparation and mRNA extraction can be performed by a known method, for example, using a commercially available kit. In addition, when the biological sample is a liquid such as blood or a gel such as a vitreous body, for example, it is diluted with a buffer or the like and used for measuring the expression level of the gene or the amount of protein. Is preferred.

生体試料中のペリオスチンタンパク質量の測定は、例えば、免疫測定法などにより行うことができる。免疫測定法としては、放射免疫測定法（RIA）、免疫蛍光測定法（FIA）、免疫発光測定法、酵素免疫測定法（例えば、Enzyme Immunoassay(EIA)、Enzyme−linked Immunosorbent assay (ELISA)）、またはWestern blot法などが挙げられる。 The amount of periostin protein in the biological sample can be measured by, for example, an immunoassay method. Examples of immunoassay include radioimmunoassay (RIA), immunofluorescence assay (FIA), immunoluminescence assay, enzyme immunoassay (eg, Enzyme Immunoassay (EIA), Enzyme-linked Immunosorbent assay (ELISA)), Or Western blot method etc. are mentioned.

RIAで標識に用いる放射性物質としては、例えば、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁴C、³H、³⁵S、または³²Pを利用することができる。 As a radioactive substance used for labeling by RIA, for example, ¹²⁵ I, ¹³¹ I, ¹⁴ C, ³ H, ³⁵ S, or ³² P can be used.

FIAで標識に用いる蛍光物質としては、例えば、Eu（ユーロピウム）、FITC、TMRITC、Cy3、PE、またはTexas−Redなどの蛍光物質を利用することができる。 As a fluorescent substance used for labeling by FIA, for example, a fluorescent substance such as Eu (europium), FITC, TMRITC, Cy3, PE, or Texas-Red can be used.

免疫発光測定法で標識に用いる発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等を用いることができる。 As the luminescent substance used for labeling in the immunoluminescence measurement method, for example, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like can be used.

酵素免疫測定法で標識に用いる酵素としては、例えば西洋わさびペルオキシターゼ（HRP）、アルカリホファターゼ（ALP）、グルコースオキシターゼ（GO）等を用いることができる。 Examples of enzymes used for labeling in enzyme immunoassay include horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (ALP), glucose oxidase (GO), and the like.

さらに、抗体または抗原と、これらの標識物質との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。 Furthermore, a biotin-avidin system can also be used for the binding between an antibody or an antigen and these labeling substances.

生体試料中のmRNA量の測定は、公知の方法、例えば、プローブとしてペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計されたプローブを用いるノーザンハイブリダイゼーション、あるいはプライマーとしてペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計されたプライマーを用いるPCR法を用いて行うことができる。「ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計されたプローブ」および「ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計されたプライマー」は、後述の「増殖糖尿病網膜症の検出薬または診断薬」の項で説明するものと同様である。 The amount of mRNA in a biological sample can be measured by a known method, for example, Northern hybridization using a probe designed based on the base sequence of a gene encoding periostin as a probe, or the base sequence of a gene encoding periostin as a primer The PCR method using primers designed based on the above can be used. “Probes designed based on the base sequence of the gene encoding periostin” and “primers designed based on the base sequence of the gene encoding periostin” are described below as “detection or diagnostic agents for proliferative diabetic retinopathy” Is the same as that described in the section.

また、免疫組織化学により、ペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定するようにしても良い。この場合、免疫組織化学によりペリオスチンまたはペリオスチンをコードするmRNAを可視化し、ペリオスチンタンパク質量またはmRNA量を比較する。生体試料としては、網膜上線維血管増殖組織などが挙げられる。免疫組織化学としては、具体的には、酵素標識抗体法、または蛍光抗体法などが挙げられる。酵素標識抗体法としては、例えば、直接法、間接法、アビジン・ビオチン化ペリオキシダーゼ複合体法（ABC法）、もしくはストレプトアビジン・ビオチン化抗体法（SAB）法などの標識抗体法、またはペルオキシダーゼ・抗ペルオキシダーゼ法（PAP法）などの非標識抗体法が挙げられる。蛍光抗体法としては、直接法、または間接法が挙げられる。
標識に用いる酵素または蛍光物質としては、前記と同様のものが挙げられる。 Alternatively, the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein may be measured by immunohistochemistry. In this case, periostin or mRNA encoding periostin is visualized by immunohistochemistry, and the amount of periostin protein or mRNA is compared. Examples of biological samples include retinal fibrovascular tissue. Specific examples of immunohistochemistry include enzyme-labeled antibody method or fluorescent antibody method. Examples of the enzyme-labeled antibody method include a direct antibody method, an indirect method, a labeled antibody method such as an avidin / biotinylated peroxidase complex method (ABC method), a streptavidin / biotinylated antibody method (SAB) method, or a peroxidase / Examples include an unlabeled antibody method such as an anti-peroxidase method (PAP method). Examples of the fluorescent antibody method include a direct method and an indirect method.
Examples of the enzyme or fluorescent substance used for labeling include those described above.

そして、例えば、前記（i）の場合のペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量が、前記（ii）の場合のペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量と比較して高い場合、例えば、約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約70％以上、約80％以上、約90％以上、約95％以上、または約100％以上高い場合に増殖糖尿病網膜症である、あるいは増殖糖尿病網膜症であると疑われると判断できる。 For example, when the expression level of the periostin gene or the amount of periostin protein in the case of (i) is higher than the expression level of the periostin gene or the amount of periostin protein in the case of (ii), for example, about 20% More than about 30%, about 40%, about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, about 95%, or about 100% or more It can be determined that the patient has proliferative diabetic retinopathy or is suspected of having proliferative diabetic retinopathy.

ここで、（i）被験者由来の生体試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量と（ii）対照試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量の差は、増殖糖尿病網膜症の検出または診断の臨界値となるものであり、例えば次のように設定しても良い。 Here, (i) the difference between the expression level or periostin protein level of the periostin gene in the biological sample derived from the subject and the difference between the expression level or periostin protein level of the periostin gene in the control sample and (ii) the detection level or the diagnosis of proliferative diabetic retinopathy For example, the threshold value may be set as follows.

先ず、2例以上の増殖糖尿病網膜症患者由来の生体試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定し、その平均値（A）を求める。このとき、対象となる患者の例数は2例以上であり、例えば、5例以上、10例以上、50例以上、または100例以上である。一方、2例以上の対照試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定し、その平均値（B）を求める。このとき、対象となる対照試料の例数は2例以上であり、例えば、5例以上、10例以上、50例以上、または100例以上である。そして、求めた平均値AおよびBから［（A−B）／B］×100（％）を計算して、増殖糖尿病網膜症由来の生体試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量の平均値が対照試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量の平均値と比較して何％高いかを求める。このようにして求めた値を、（i）被験者由来の生体試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量と（ii）対照試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量の差（臨界値）として設定する。すなわち、（i）の場合のペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量が、（ii）の場合のペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量と比較して求めた差以上に高い場合（例えば、統計的に有意に高い場合）に、増殖糖尿病網膜症である、または増殖糖尿病網膜症であると疑われると判断できる。 First, the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein in a biological sample derived from two or more patients with proliferative diabetic retinopathy is measured, and the average value (A) is obtained. At this time, the number of target patients is 2 or more, for example, 5 or more, 10 or more, 50 or more, or 100 or more. On the other hand, the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein in two or more control samples is measured, and the average value (B) is obtained. At this time, the number of examples of the target control sample is 2 or more, for example, 5 or more, 10 or more, 50 or more, or 100 or more. Then, [(A−B) / B] × 100 (%) is calculated from the obtained average values A and B, and the expression level of the periostin gene or the average value of the periostin protein amount in the biological sample derived from proliferative diabetic retinopathy Is determined as a percentage of the expression level of the periostin gene or the average amount of periostin protein in the control sample. The value thus determined is (i) the difference (critical value) between the expression level or periostin protein level of the periostin gene in the biological sample derived from the subject and (ii) the expression level or periostin protein level of the periostin gene in the control sample. Set. That is, when the periostin gene expression level or periostin protein amount in (i) is higher than the difference obtained by comparison with the periostin gene expression level or periostin protein amount in (ii) (for example, statistical Can be determined to be proliferative diabetic retinopathy or suspected proliferative diabetic retinopathy.

尚、本発明の増殖糖尿病網膜症の検出方法または診断方法では、生体試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定するので、測定値を平均値（A）および（B）に組み入れて、対象となる患者の例数および対象となる健常者の例数を増やすのが好ましい。例数を増やすことにより、増殖糖尿病網膜症の検出または診断の精度を高めることができる。また、求めた対照試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量の平均値（B）を、「（ii）対照試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量」としても良い。 In the method for detecting or diagnosing proliferative diabetic retinopathy of the present invention, since the expression level of the periostin gene or the amount of periostin protein in a biological sample is measured, the measurement value is incorporated into the average values (A) and (B), It is preferable to increase the number of target patients and the number of healthy subjects. By increasing the number of cases, the accuracy of detection or diagnosis of proliferative diabetic retinopathy can be increased. In addition, the average value (B) of the expression level or periostin protein amount of the periostin gene in the obtained control sample may be set as “(ii) expression level or periostin protein amount of the periostin gene in the control sample”.

本発明の別のいくつかの態様によれば、測定した被験者由来の生体試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量が、所定発現レベルまたは所定タンパク質量以上であるときに、増殖糖尿病網膜症である、または増殖糖尿病網膜症であると疑われると判断するようにしてもよい。 According to some other embodiments of the present invention, when the measured periostin gene expression level or periostin protein amount in a biological sample derived from a subject is equal to or higher than a predetermined expression level or a predetermined protein amount, It may be determined that there is or is suspected to be proliferative diabetic retinopathy.

そして、増殖糖尿病網膜症である、または増殖糖尿病網膜症であると疑われると判断するための「所定発現レベルまたは所定タンパク質量」は、例えば、次のように求めることができる。先ず、2例以上の増殖糖尿病網膜症患者由来の生体試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定する。このとき、対象となる患者の例数は2例以上であり、例えば、5例以上、10例以上、50例以上、または100例以上である。一方、2例以上の対照試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量も測定する。このとき、対象となる対照試料の例数は2例以上であり、例えば、5例以上、10例以上、50例以上、または100例以上である。そして、増殖糖尿病網膜症患者由来の生体試料群と対照試料群の両方を含む全体から、増殖糖尿病網膜症患者由来の生体試料群を抽出しうる、ペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量の至適閾値（cut−off値）を、統計処理により求める。統計処理としては、例えば、Receiver−Operating−Characteristics（ROC）曲線を用いた解析等が挙げられる。 Then, the “predetermined expression level or the predetermined protein amount” for determining that it is proliferative diabetic retinopathy or suspected to be proliferative diabetic retinopathy can be obtained as follows, for example. First, the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein in a biological sample derived from two or more patients with proliferative diabetic retinopathy is measured. At this time, the number of target patients is 2 or more, for example, 5 or more, 10 or more, 50 or more, or 100 or more. On the other hand, the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein in two or more control samples is also measured. At this time, the number of examples of the target control sample is 2 or more, for example, 5 or more, 10 or more, 50 or more, or 100 or more. The optimal expression level of the periostin gene or the amount of periostin protein that can extract the biological sample group derived from the patient with proliferative diabetic retinopathy from the whole including both the biological sample group derived from the proliferative diabetic retinopathy patient and the control sample group. A threshold value (cut-off value) is obtained by statistical processing. Examples of the statistical processing include analysis using a Receiver-Operating-Characteristics (ROC) curve.

本発明の好ましい態様では、高感度で増殖糖尿病網膜症を検出できるので、増殖糖尿病網膜症を、他の病態、例えば、特発性黄斑上膜や黄斑円孔から鑑別することが容易になる。 In a preferred embodiment of the present invention, proliferative diabetic retinopathy can be detected with high sensitivity, so that proliferative diabetic retinopathy can be easily differentiated from other pathological conditions such as idiopathic epithelium and macular hole.

上記増殖糖尿病網膜症の検出結果または診断結果は、例えば増殖糖尿病網膜症の確定診断を行う場合の補助とすることができる。増殖糖尿病網膜症の確定診断を行う場合には、上記検出結果に加えて、理学所見の結果、血清学的検査の結果、および組織学的検査などからなる群から選択される少なくとも1つと組み合わせて、総合的に判断するようにしても良い。 The detection result or diagnosis result of proliferative diabetic retinopathy can be used, for example, as an aid in performing a definitive diagnosis of proliferative diabetic retinopathy. When making a definitive diagnosis of proliferative diabetic retinopathy, in addition to the above detection results, in combination with at least one selected from the group consisting of physical findings, serological results, histological results, etc. , You may make it judge comprehensively.

4．増殖糖尿病網膜症の検出薬または診断薬
本発明は増殖糖尿病網膜症の検出薬または診断薬（以下、検出薬等とする。）を提供する。本発明の検出薬等は、（i）ペリオスチンを認識する抗体、（ii）ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計されたプライマー、および（iii）ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計されたプローブからなる群から選択される少なくとも1つを含有する。 Four. The present invention provides a detection agent or diagnostic agent for proliferative diabetic retinopathy (hereinafter referred to as a detection agent or the like). The detection agent of the present invention is based on (i) an antibody that recognizes periostin, (ii) a primer designed based on the base sequence of a gene encoding periostin, and (iii) a base sequence of a gene encoding periostin. At least one selected from the group consisting of probes designed in this manner.

本発明のある態様の増殖糖尿病網膜症の検出薬等は、ペリオスチンを認識する抗体を含有する。抗体は、好ましくは、ペリオスチンを特異的に認識する抗体である。ペリオスチンを認識する抗体は、当業者に周知の技法を用いて得ることができる。ペリオスチンを認識する抗体は、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体（Milstein C, et al., 1983, Nature 305(5934): 537−40）である。例えば、ペリオスチンに対するポリクローナル抗体は、抗原（ペリオスチンまたはその部分ペプチド）を感作した哺乳動物の血液を取り出し、この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用することができる。あるいは必要に応じてこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離することもできる。また、モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞などと細胞融合させる。こうして得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から抗体を回収しモノクローナル抗体とすることができる。 The detection agent for proliferative diabetic retinopathy of an aspect of the present invention contains an antibody that recognizes periostin. The antibody is preferably an antibody that specifically recognizes periostin. Antibodies that recognize periostin can be obtained using techniques well known to those skilled in the art. The antibody that recognizes periostin is a polyclonal antibody or a monoclonal antibody (Milstein C, et al., 1983, Nature 305 (5934): 537-40). For example, in the case of a polyclonal antibody against periostin, blood of a mammal sensitized with an antigen (periostin or a partial peptide thereof) is taken out, and serum is separated from this blood by a known method. As the polyclonal antibody, serum containing the polyclonal antibody can be used. Alternatively, a fraction containing a polyclonal antibody can be further isolated from this serum as necessary. In order to obtain a monoclonal antibody, immune cells are removed from a mammal sensitized with the antigen and fused with myeloma cells or the like. The thus obtained hybridoma can be cloned, and the antibody can be recovered from the culture to obtain a monoclonal antibody.

本発明の別の態様の増殖糖尿病網膜症の検出薬等は、ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計されたプライマーを含有する。プライマーとして、ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号1，3，または5で表わされる塩基配列）に基づいて設計された、連続する少なくとも15塩基（例えば、15塩基以上、16塩基以上、17塩基以上、18塩基以上、19塩基以上、もしくは20塩基以上）、および／または連続する100塩基以下（例えば、100塩基以下、70塩基以下、60塩基以下、もしくは50塩基以下）、例えば、20塩基以上50塩基以下のポリヌクレオチドからなるプライマーを用いることができる。プライマーセットとして、フォワードプライマーとリバースプライマーの間の距離が、例えば、2500塩基以下、1500塩基以下、または500塩基以下となるように設計することができる。プライマーは、例えば、RT−PCR法などでペリオスチン遺伝子の発現レベルが検出できるように設計する。プライマーの設計は、公知の手法を用いて行なうことができる。このように設計したプライマーは、例えば、配列番号1，3，もしくは5またはその一部（例えば、配列番号1，3，または5のうちの連続する少なくとも15塩基）を含有するヌクレオチドである。必要に応じて、プライマーには、追加の配列を含めることも可能であり、例えば、タグ配列を付加することもできる。 The detection agent for proliferative diabetic retinopathy according to another aspect of the present invention contains a primer designed based on the base sequence of the gene encoding periostin. As a primer, at least 15 bases (for example, 15 bases or more, 16 bases or more) designed based on the base sequence of the gene encoding periostin (for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, or 5) , 17 bases or more, 18 bases or more, 19 bases or more, or 20 bases or more) and / or 100 bases or less (for example, 100 bases or less, 70 bases or less, 60 bases or less, or 50 bases or less), for example, Primers comprising a polynucleotide of 20 to 50 bases can be used. The primer set can be designed such that the distance between the forward primer and the reverse primer is, for example, 2500 bases or less, 1500 bases or less, or 500 bases or less. The primer is designed so that the expression level of the periostin gene can be detected by, for example, RT-PCR. Primer design can be performed using a known method. The primer thus designed is a nucleotide containing, for example, SEQ ID NO: 1, 3, or 5 or a part thereof (for example, at least 15 consecutive bases of SEQ ID NO: 1, 3, or 5). If desired, the primer can include additional sequences, for example, tag sequences can be added.

本発明のさらに別の態様の増殖糖尿病網膜症の検出薬等は、ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計されたプローブを含有する。プローブとして、ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号1，3，または5で表わされる塩基配列）に基づいて設計された、連続する少なくとも15塩基（例えば、15塩基以上、16塩基以上、17塩基以上、18塩基以上、19塩基以上、20塩基以上、21塩基以上、22塩基以上、23塩基以上、24塩基以上、25塩基以上、26塩基以上、27塩基以上、28塩基以上、29塩基以上、30塩基以上、35塩基以上、40塩基以上、45塩基以上、もしくは50塩基以上）、および／または、連続する2500塩基以下（例えば、2500塩基以下、1000塩基以下、500塩基以下、もしくは150塩基以下）、例えば、塩基長50〜150bpのポリヌクレオチドからなるプローブを用いることができる。プローブは、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法などでペリオスチン遺伝子の発現レベルが検出できるように設計する。プローブの設計は、公知の手法を用いて行うことができる。このように設計したプローブは、例えば、配列番号1，3，もしくは5またはその一部（例えば、配列番号1，3，または5のうちの連続する少なくとも15塩基）を含有するヌクレオチドである。また、プローブは、例えば、放射性標識として³²Pなどで標識することができる。また、必要に応じ、プローブを蛍光標識、発光標識または酵素標識などで標識することもできる。当業者であれば、用いた標識物質に適切な検出方法で、ペリオスチン遺伝子の発現レベルを検出することができる。更に、プローブをビオチン化したものを用いることもでき、これをアビジン蛍光色素で処理し蛍光検出することも可能である。 The detection agent for proliferative diabetic retinopathy of still another embodiment of the present invention contains a probe designed based on the base sequence of the gene encoding periostin. At least 15 consecutive bases (for example, 15 bases or more, 16 bases or more) designed based on the base sequence of the gene encoding periostin (for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, or 5) as a probe 17 bases or more, 18 bases or more, 19 bases or more, 20 bases or more, 21 bases or more, 22 bases or more, 23 bases or more, 24 bases or more, 25 bases or more, 26 bases or more, 27 bases or more, 28 bases or more, 29 Bases or more, 30 bases or more, 35 bases or more, 40 bases or more, 45 bases or more, or 50 bases or more) and / or continuous 2500 bases or less (for example, 2500 bases or less, 1000 bases or less, 500 bases or less, or 150 bases or less), for example, a probe comprising a polynucleotide having a base length of 50 to 150 bp can be used. The probe is designed so that the expression level of the periostin gene can be detected by, for example, Northern hybridization. The design of the probe can be performed using a known method. The probe designed in this way is, for example, a nucleotide containing SEQ ID NO: 1, 3, or 5 or a part thereof (for example, at least 15 consecutive bases of SEQ ID NO: 1, 3, or 5). The probe can be labeled with, for example, ³² P as a radioactive label. If necessary, the probe can be labeled with a fluorescent label, a luminescent label, an enzyme label, or the like. A person skilled in the art can detect the expression level of the periostin gene by a detection method suitable for the labeling substance used. Furthermore, a biotinylated probe can be used, and this can be treated with an avidin fluorescent dye to detect fluorescence.

本発明の検出薬等は、上記本発明の増殖糖尿病網膜症の検出方法または診断方法において使用することができる。 The detection agent and the like of the present invention can be used in the method for detecting or diagnosing proliferative diabetic retinopathy of the present invention.

5．本発明の増殖糖尿病網膜症の検出用キットまたは診断用キット
本発明は、前記増殖糖尿病網膜症の検出方法または診断方法に使用することができるキットを提供する。
本発明のキットは、ペリオスチンを認識する抗体、ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計されたプライマー、およびペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計されたプローブからなる群から選択される少なくとも1つを含有する。本発明のいくつかの態様のキットは、ペリオスチンを認識する抗体、ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計されたプライマー、またはペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計されたプローブを含有する。「ペリオスチンを認識する抗体」、「ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計されたプライマー」、および「ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計されたプローブ」は、前記説明したのと同様である。 Five. The kit for detecting or diagnosing proliferative diabetic retinopathy of the present invention The present invention provides a kit that can be used in the method for detecting or diagnosing proliferative diabetic retinopathy.
The kit of the present invention is selected from the group consisting of an antibody recognizing periostin, a primer designed based on the base sequence of the gene encoding periostin, and a probe designed based on the base sequence of the gene encoding periostin. Contains at least one. The kit of some embodiments of the present invention comprises an antibody that recognizes periostin, a primer designed based on the base sequence of a gene encoding periostin, or a probe designed based on the base sequence of a gene encoding periostin. contains. "An antibody recognizing periostin", "a primer designed based on the base sequence of a gene encoding periostin", and "a probe designed based on the base sequence of a gene encoding periostin" are described above. It is the same.

本発明のキットは、上記の他に、容器およびラベルを含んでいてもよい。容器上のまたは容器に伴うラベルには、キットが増殖糖尿病網膜症の検出または診断に使用されることが示されていてもよい。また、他のアイテム、例えば、使用説明書等がさらに含まれていてもよい。 In addition to the above, the kit of the present invention may contain a container and a label. The label on or associated with the container may indicate that the kit is used for detection or diagnosis of proliferative diabetic retinopathy. In addition, other items such as instructions for use may be further included.

6．本発明のスクリーニング方法
ペリオスチン遺伝子は、増殖糖尿病網膜症の患者由来の組織で発現が増加しているので、当該患者の組織でペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を減少させる化合物またはその塩、例えば、発現を阻害する化合物またはその塩は、増殖糖尿病網膜症の予防・治療剤として使用し得る。また、ペリオスチンタンパク質をコードする遺伝子（ｍRNA）を阻害する物質も、増殖糖尿病網膜症の予防・治療剤となり得る。このような物質としては、いわゆる、RNAi作用を応用した物質であり、上記のペリオスチンmRNAに作用して、mRNAを不活性化（ペリオスチンタンパク質の生成を阻害）する、siRNAや、siRNAを産生する、shRNA更にはｓｈRNAを産生させる遺伝子を組み込んだベクター等も、増殖糖尿病網膜症の予防・治療剤となり得る。 6． Since the expression of periostin gene is increased in tissue derived from a patient with proliferative diabetic retinopathy, a compound or a salt thereof that decreases the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein in the tissue of the patient, for example, The compound that inhibits expression or a salt thereof can be used as a prophylactic / therapeutic agent for proliferative diabetic retinopathy. In addition, substances that inhibit the gene (mRNA) encoding periostin protein can also serve as prophylactic / therapeutic agents for proliferative diabetic retinopathy. As such a substance, so-called RNAi action applied substance, acting on the above periostin mRNA, inactivating the mRNA (inhibiting the production of periostin protein), producing siRNA and siRNA, A vector incorporating a gene that produces shRNA or shRNA can also serve as a prophylactic / therapeutic agent for proliferative diabetic retinopathy.

すなわち、本発明は、ペリオスチンを産生することができる細胞を候補物質の存在下で培養した培養物中におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定することを含む、ペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を減少させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。この場合、測定した遺伝子の発現レベルまたはタンパク質量を、候補物質による増殖糖尿病網膜症の予防・治療効果と関連付けるのが好ましい。 That is, the present invention relates to measuring the expression level of periostin gene or periostin, comprising measuring the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein in a culture in which cells capable of producing periostin are cultured in the presence of a candidate substance. Provided is a screening method for a compound or a salt thereof that reduces the amount of protein. In this case, it is preferable to associate the measured gene expression level or protein amount with the prophylactic / therapeutic effect of proliferative diabetic retinopathy by the candidate substance.

本発明のいくつかの態様によれば、例えば、（i）ペリオスチンを産生することができる細胞を候補物質の存在下で培養した場合と、（ii）ペリオスチンを産生することができる細胞を候補物質の非存在下で培養した場合との間でペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量の比較を行う。比較は、例えば、（i）と（ii）の場合における、ペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定して、比較する。 According to some embodiments of the present invention, for example, (i) when a cell capable of producing periostin is cultured in the presence of a candidate substance, and (ii) a cell capable of producing periostin is designated as a candidate substance. The expression level of periostin gene or the amount of periostin protein is compared with the case of culturing in the absence of. In the comparison, for example, the expression level of the periostin gene or the amount of periostin protein in the cases (i) and (ii) is measured and compared.

具体的には、（i）と（ii）の場合における、ペリオスチンタンパク質量またはペリオスチンをコードするmRNA量を測定して比較する。ペリオスチンを産生することができる細胞としては、例えば、HuCCT1（登録番号:JCRB0425）、HuH28（登録番号:JCRB0426）、OZ（登録番号：JCRB1032）など、あるいはペリオスチンをコードするDNAを含有するベクターで形質転換された細胞などが挙げられる。 Specifically, the amount of periostin protein or the amount of mRNA encoding periostin in the cases (i) and (ii) is measured and compared. As a cell capable of producing periostin, for example, HuCCT1 (registration number: JCRB0425), HuH28 (registration number: JCRB0426), OZ (registration number: JCRB1032), etc. or a vector containing DNA encoding periostin Examples include transformed cells.

形質転換する細胞としては、例えば、CHO細胞、およびHEK293細胞などが挙げられる。形質転換された細胞の培養は、公知の方法で行うことができる。 Examples of cells to be transformed include CHO cells and HEK293 cells. Culture of the transformed cells can be performed by a known method.

候補物質としては、例えば、抗体、ペプチド、タンパク質、合成化合物、またはそれらの塩などや、mRNAを不活性化させるsiRNAおよびshRNAや、shRNAを産生させるDNAを組み込んだベクター等が挙げられる。 Candidate substances include, for example, antibodies, peptides, proteins, synthetic compounds, or salts thereof, siRNA and shRNA that inactivate mRNA, and vectors that incorporate DNA that produces shRNA.

ペリオスチンタンパク質量の測定は、例えば、前記した免疫測定法またはプロテインチップ法により行うことができる。 The amount of periostin protein can be measured, for example, by the above-described immunoassay or protein chip method.

mRNA量の測定は、公知の方法、例えば、プローブとして配列番号1，3，もしくは5またはその一部を含有するヌクレオチドを用いるノーザンハイブリダイゼーション、あるいはプライマーとして配列番号1，3，もしくは5またはそれらの一部を含有するヌクレオチドを用いるPCR法を用いて行うことができる。 The amount of mRNA is measured by a known method, for example, Northern hybridization using a nucleotide containing SEQ ID NO: 1, 3, or 5 or a part thereof as a probe, or SEQ ID NO: 1, 3, or 5 or a primer thereof. It can be performed using a PCR method using nucleotides containing a part.

そして、例えば、（i）の場合のペリオスチンの発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を、（ii）の場合のペリオスチンの発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量と比較して減少させる、例えば、約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約70％以上、約80％以上、約90％以上、約95％以上、または約100％以上減少させる候補物質を、ペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を減少させる化合物またはその塩、すなわち、増殖糖尿病網膜症の予防・治療剤として選択することができる。 Then, for example, the periostin expression level or periostin protein amount in (i) is decreased as compared to the periostin expression level or periostin protein amount in (ii), for example, about 20% or more, about 30 % Or more, about 40% or more, about 50% or more, about 60% or more, about 70% or more, about 80% or more, about 90% or more, about 95% or more, or a candidate substance that reduces about 100% or more, periostin It can be selected as a compound or a salt thereof that decreases the gene expression level or periostin protein amount, that is, a prophylactic / therapeutic agent for proliferative diabetic retinopathy.

また、ペリオスチンタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩も、増殖糖尿病網膜症の予防・治療剤として使用し得る。よって、本発明は、ペリオスチンと候補物質を接触させて、ペリオスチンの活性の変化を検出することを含む、増殖糖尿病網膜症の予防・治療剤のスクリーニング方法を提供する。 In addition, a compound that inhibits the activity of periostin protein or a salt thereof can also be used as a prophylactic / therapeutic agent for proliferative diabetic retinopathy. Therefore, the present invention provides a screening method for a prophylactic / therapeutic agent for proliferative diabetic retinopathy, which comprises detecting periostin activity change by bringing periostin into contact with a candidate substance.

候補物質としては、例えば、抗体（例えば、抗ペリオスチン抗体）、ペプチド、タンパク質、合成化合物、またはそれらの塩などが挙げられる。 Examples of candidate substances include antibodies (for example, anti-periostin antibodies), peptides, proteins, synthetic compounds, or salts thereof.

「接触」とは、例えば、ペリオスチン遺伝子を発現する細胞またはその細胞抽出液と候補物質とを同一の反応系または培養系に存在させること、精製したペリオスチンと候補物質とを同一の反応系に存在させることなどが挙げられる。さらに具体的には、細胞培養器に候補物質を添加すること、細胞と候補物質とを混合すること、細胞を候補物質の存在下で培養すること、細胞抽出液と候補物質とを混合すること、精製したペリオスチンと候補物質とを混合することなどが挙げられる。 “Contact” means, for example, that a cell expressing periostin gene or a cell extract thereof and a candidate substance are present in the same reaction system or culture system, or purified periostin and a candidate substance are present in the same reaction system. For example. More specifically, adding a candidate substance to the cell incubator, mixing the cell and the candidate substance, culturing the cell in the presence of the candidate substance, and mixing the cell extract and the candidate substance And a mixture of purified periostin and a candidate substance.

「ペリオスチンの活性」とは、例えば、ペリオスチンタンパク質と他のマトリックスタンパク質との結合などが挙げられる。ペリオスチンの活性は、公知の方法を用いて検出することができる。具体的には、例えば、ペリオスチンタンパク質と他のマトリックスタンパク質との結合を測定する場合には、ペリオスチンタンパク質と、テネイシン−C、フィブロネクチン、コラーゲンVなどの他のマトリックスタンパク質との結合を測定することがあげられる。これらの結合は、Journal of Allergy Clinical Immunology, vol.118, 98−104, 2006記載の方法又はそれに準ずる方法によって測定することができる。 Examples of “periostin activity” include binding of periostin protein to other matrix proteins. The activity of periostin can be detected using a known method. Specifically, for example, when measuring the binding between periostin protein and other matrix proteins, the binding between periostin protein and other matrix proteins such as tenascin-C, fibronectin, collagen V, etc. can be measured. can give. These bindings can be measured by the method described in Journal of Allergy Clinical Immunology, vol. 118, 98-104, 2006 or a method analogous thereto.

そして、ペリオスチンの活性を変化させる候補物質、例えば、ペリオスチンの活性を対照と比較して減少させる、例えば、約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約70％以上、約80％以上、約90％以上、約95％以上、または約100％以上減少させる候補物質を、ペリオスチンタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。ここで、対照は、例えば、候補物質の非存在下でのペリオスチンの活性である。 And a candidate substance that alters the activity of periostin, for example, reduces the activity of periostin compared to the control, eg, about 20% or more, about 30% or more, about 40% or more, about 50% or more, about 60% A candidate substance that decreases by about 70% or more, about 80% or more, about 90% or more, about 95% or more, or about 100% or more can be selected as a compound or a salt thereof that inhibits the activity of periostin protein. . Here, the control is, for example, the activity of periostin in the absence of the candidate substance.

本発明の別のいくつかの態様によれば、ペリオスチンを産生することができる細胞を候補物質の存在下で培養した場合におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量が、所定発現レベルまたは所定タンパク質量以下であるときに、当該候補物質を、ペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を減少させる化合物またはその塩として選択することもできる。 According to some other aspects of the present invention, when a cell capable of producing periostin is cultured in the presence of a candidate substance, the expression level of the periostin gene or the amount of periostin protein is the predetermined expression level or the predetermined protein amount. The candidate substance can also be selected as a compound or a salt thereof that decreases the expression level of the periostin gene or the amount of periostin protein when:

所定発現レベルまたは所定タンパク質量は、例えば、次のように求めることができる。先ず、ペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはタンパク質量を低下させ、かつ、増殖糖尿病網膜症の予防・治療効果があると判明した物質について、ペリオスチンを産生することができる細胞を当該物質の存在下で培養した培養物中におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定する。一方、ペリオスチンを産生することができる細胞を当該物質の非存在下で培養した培養物中におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定する。そして、前記物質の存在下での測定結果群と前記物質の非存在下での測定結果群との両方を含む全体から、前記物質の存在下での測定結果群を抽出しうる、ペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量の至適閾値（cut−off値）を、統計処理により求める。統計処理としては、例えば、Receiver−Operating−Characteristics（ROC）曲線を用いた解析等が挙げられる。このcut−off値を上限値として、測定した被験者由来の生体試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を、cut−off値以下にすることができる候補物質を、ペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を減少させる化合物またはその塩、すなわち、増殖糖尿病網膜症の予防・治療剤として選択することもできる。 The predetermined expression level or the predetermined protein amount can be determined, for example, as follows. First, cells that can produce periostin were cultivated in the presence of a substance that has been found to reduce the expression level of the periostin gene or the amount of protein, and that has been found to have a prophylactic / therapeutic effect on proliferative diabetic retinopathy The expression level of periostin gene or the amount of periostin protein in the culture is measured. On the other hand, the expression level of the periostin gene or the amount of periostin protein is measured in a culture in which cells capable of producing periostin are cultured in the absence of the substance. Then, from the whole including both the measurement result group in the presence of the substance and the measurement result group in the absence of the substance, the periostin gene can be extracted from the measurement result group in the presence of the substance. The optimal threshold (cut-off value) for the expression level or periostin protein amount is determined by statistical processing. Examples of the statistical processing include analysis using a Receiver-Operating-Characteristics (ROC) curve. With this cut-off value as the upper limit, a candidate substance capable of setting the periostin gene expression level or periostin protein amount in the measured biological sample derived from the subject to be equal to or lower than the cut-off value is the periostin gene expression level or periostin. It can also be selected as a compound that reduces the amount of protein or a salt thereof, that is, a prophylactic / therapeutic agent for proliferative diabetic retinopathy.

ここで、「ペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはタンパク質量を低下させ、かつ、増殖糖尿病網膜症の予防・治療効果があると判明した物質」としては、例えば、前記本発明の増殖糖尿病網膜症の予防・治療剤のスクリーニング方法により得られた物質等を挙げることができる。 Here, as the “substance that decreases the expression level or protein amount of the periostin gene and has been found to have a prophylactic / therapeutic effect on proliferative diabetic retinopathy”, for example, Examples thereof include substances obtained by screening methods for therapeutic agents.

特に好ましくは、前記本発明の増殖糖尿病網膜症の予防・治療剤のスクリーニング方法は、スクリーニングで得られた候補物質に増殖糖尿病網膜症の予防・治療効果があるか評価する工程をさらに含む。 Particularly preferably, the method for screening a prophylactic / therapeutic agent for proliferative diabetic retinopathy of the present invention further comprises a step of evaluating whether the candidate substance obtained by screening has a prophylactic / therapeutic effect on proliferative diabetic retinopathy.

7．本発明のスクリーニング用キット
本発明は、上記増殖糖尿病網膜症の予防・治療剤のスクリーニング方法に使用することができるキットを提供する。具体的には、前記キットは、ペリオスチンを産生することができる細胞を含む。「ペリオスチンを産生することができる細胞」は、前記本発明のスクリーニング方法で説明した通りである。前記キットは、さらに、細胞培養用培地、培地に添加する抗生物質、血清（ウシ胎児血清等）などを含んでいても良い。 7． Screening Kit of the Present Invention The present invention provides a kit that can be used in the screening method for the prophylactic / therapeutic agent for proliferative diabetic retinopathy. Specifically, the kit includes cells capable of producing periostin. The “cell capable of producing periostin” is as described in the screening method of the present invention. The kit may further contain a cell culture medium, antibiotics added to the medium, serum (fetal bovine serum, etc.) and the like.

また、前記キットは、ペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定するための成分を含んでいても良い。そのような成分として、例えば、ペリオスチン遺伝子の塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド、ペリオスチンタンパク質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体などが挙げられる。これらのポリヌクレオチドおよび抗体は、前記と同様である。 Further, the kit may contain a component for measuring the expression level of the periostin gene or the amount of periostin protein. Examples of such components include a polynucleotide containing the base sequence of the periostin gene or a part thereof, and an antibody that recognizes a peptide containing the amino acid sequence of periostin protein. These polynucleotides and antibodies are the same as described above.

前記キットは、上記の他に、容器およびラベルを含んでいてもよい。容器上のまたは容器に伴うラベルには、キットが増殖糖尿病網膜症の予防・治療剤のスクリーニングに使用されることが示されていてもよい。また、他のアイテム、例えば、使用説明書等がさらに含まれていてもよい。 In addition to the above, the kit may include a container and a label. The label on or accompanying the container may indicate that the kit is used for screening for a prophylactic / therapeutic agent for proliferative diabetic retinopathy. In addition, other items such as instructions for use may be further included.

8．本発明の医薬組成物
本発明は、上記本発明のスクリーニング方法により得られた化合物またはその塩を含む、増殖糖尿病網膜症の予防・治療用医薬組成物を提供する。
本発明の医薬組成物は、本発明のスクリーニング方法により得られた化合物またはその塩、siRNAおよびshRNA、それらを細胞組織内にて産生可能なベクター類等を有効成分として含み、さらに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の形態で提供することが好ましい。 8． Pharmaceutical composition of the present invention The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing / treating proliferative diabetic retinopathy, comprising a compound obtained by the screening method of the present invention or a salt thereof.
The pharmaceutical composition of the present invention contains a compound obtained by the screening method of the present invention or a salt thereof, siRNA and shRNA, vectors capable of producing them in a cell tissue as active ingredients, and further pharmaceutically acceptable. Preferably, it is provided in the form of a pharmaceutical composition comprising a carrier to be prepared.

本発明の医薬組成物の適用の対象となる疾患は、増殖糖尿病網膜症である。
「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の一つ以上を用いることにより、注射剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、1つ以上の活性物質を含み、常法により処方される注射剤などが含まれる。注射剤の場合には、生理食塩水又は市販の注射用蒸留水等の薬学的に許容される担体中に溶解または懸濁することにより製造することができる。 The disease to which the pharmaceutical composition of the present invention is applied is proliferative diabetic retinopathy.
"Pharmaceutically acceptable carrier" refers to excipients, diluents, extenders, disintegrants, stabilizers, preservatives, buffers, emulsifiers, fragrances, colorants, sweeteners, thickeners, taste masking Agents, solubilizers or other additives. By using one or more of such carriers, pharmaceutical compositions in the form of injections, solutions, capsules, suspensions, emulsions or syrups can be prepared. These pharmaceutical compositions can be administered orally or parenterally. Other forms for parenteral administration include injections that contain one or more active substances and are prescribed by conventional methods. In the case of an injection, it can be produced by dissolving or suspending it in a pharmaceutically acceptable carrier such as physiological saline or commercially available distilled water for injection.

本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは医薬組成物に含有される活性成分である化合物またはその塩の種類などにより異なるが、例えば、活性成分である化合物またはその塩を、通常成人一人（体重60kg）当たり、一回につき100μgから1000mgの範囲で投与することができるが、この範囲に限定されるものではない。 The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention depends on the patient's age, sex, weight and symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, or the type of compound or salt thereof which is an active ingredient contained in the pharmaceutical composition. Although different, for example, the compound which is the active ingredient or a salt thereof can be usually administered in the range of 100 μg to 1000 mg per adult per person (body weight 60 kg), but is not limited to this range.

9. 本発明の増殖糖尿病網膜症の発症リスク予測方法、または予後予測方法もしくは予後診断方法
ペリオスチン遺伝子またはペリオスチンタンパク質量は、増殖糖尿病網膜症の患者由来の組織で発現が増加しているので、被験者由来の生体試料におけるペリオスチンは、増殖糖尿病網膜症の発症リスクを予測、または予後を予測もしくは診断するためのマーカーとして利用し得る。すなわち、本発明は、被験者由来の生体試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を測定することを含む、増殖糖尿病網膜症の発症リスク予測方法または予後予測方法を提供する。この場合、測定した遺伝子の発現レベルまたはタンパク質量を、増殖糖尿病網膜症の発症リスクの高低または予後の良否と関連付けるのが好ましい。 9. Onset risk prediction method, prognosis prediction method or prognosis diagnosis method of proliferative diabetic retinopathy of the present invention The expression of periostin gene or periostin protein amount is increased in tissues derived from proliferative diabetic retinopathy patients. Periostin in a biological sample derived therefrom can be used as a marker for predicting the risk of developing diabetic retinopathy, or predicting or diagnosing prognosis. That is, the present invention provides a method for predicting the onset risk or prognosis of proliferative diabetic retinopathy, which comprises measuring the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein in a biological sample derived from a subject. In this case, it is preferable to relate the measured gene expression level or protein amount to the high or low risk of proliferative diabetic retinopathy or the prognosis.

本発明のいくつかの態様によれば、測定した被験者由来の生体試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量が、所定発現レベルまたは所定タンパク質量以上であるときに、増殖糖尿病網膜症の発症リスクが高い、または予後が不良であると予測できる。「所定発現レベルまたは所定タンパク質量」は、上記「本発明の増殖糖尿病網膜症の検出方法または診断方法」に記載した方法と同様にして、求めることができる。 According to some embodiments of the present invention, when the measured periostin gene expression level or periostin protein amount in a biological sample derived from a subject is equal to or higher than a predetermined expression level or a predetermined protein amount, the risk of developing proliferative diabetic retinopathy Can be predicted to be high or have a poor prognosis. The “predetermined expression level or predetermined protein amount” can be determined in the same manner as the method described in the “method for detecting or diagnosing proliferative diabetic retinopathy of the present invention” above.

本発明の別のいくつかの態様によれば、例えば、（i）被験者由来の生体試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量と、（ii）対照試料におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量との比較を行う。そして、例えば、前記（i）の場合のペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量が、前記（ii）の場合のペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量と比較して高い場合、例えば、約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約70％以上、約80％以上、約90％以上、約95％以上、または約100％以上高い場合に増殖糖尿病網膜症の発症リスクが高い、または予後が不良であると予測できる。 According to some other embodiments of the present invention, for example, (i) expression level or periostin protein level of periostin gene in a biological sample derived from a subject, and (ii) expression level or periostin protein level of periostin gene in a control sample Compare with. For example, when the expression level of the periostin gene or the amount of periostin protein in the case of (i) is higher than the expression level of the periostin gene or the amount of periostin protein in the case of (ii), for example, about 20% More than about 30%, about 40%, about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, about 95%, or about 100% or more It can be predicted that the risk of developing diabetic retinopathy is high or the prognosis is poor.

尚、「生体試料」、「ペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量」等は、前記で説明したものと同様である。 The “biological sample”, “expression level of periostin gene or periostin protein amount” and the like are the same as those described above.

上記増殖糖尿病網膜症の発症リスクの予測結果、または予後の予測もしくは診断結果は、例えば増殖糖尿病網膜症の発症リスクの予測、または予後予測もしくは予後診断を行う場合の補助とすることができる。この場合、上記検出結果に加えて、理学所見の結果、血清学的検査の結果、および組織学的検査などからなる群から選択される少なくとも1つと組み合わせて、総合的に判断するようにしても良い。 The prediction result of the onset risk of proliferative diabetic retinopathy, or the prediction or diagnosis result of prognosis can be used as an aid when, for example, predicting the risk of onset of proliferative diabetic retinopathy, or prognosis prediction or prognosis. In this case, in addition to the above detection results, a comprehensive judgment may be made in combination with at least one selected from the group consisting of the results of physical findings, the results of serological tests, and histological tests. good.

10．増殖糖尿病網膜症の発症リスク予測試薬、または予後予測試薬もしくは予後診断薬
本発明は増殖糖尿病網膜症の発症リスク予測試薬、または予後予測試薬もしくは予後診断薬（以下、本発明の予測試薬等とする。）を提供する。本発明の予測試薬等は、（i）ペリオスチンを認識する抗体、（ii）ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計されたプライマー、および（iii）ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計されたプローブからなる群から選択される少なくとも1つを含有する。「ペリオスチンを認識する抗体」、「ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計されたプライマー」、および「ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計されたプローブ」は、前記説明したのと同様である。 Ten. Reagents for predicting the onset risk of proliferative diabetic retinopathy, prognostic reagents or prognostic reagents The present invention is a reagent for predicting the risk of proliferative diabetic retinopathy, prognostic reagents or prognostic reagents (hereinafter referred to as the predictive reagent of the present invention, etc.) .)I will provide a. The prediction reagent of the present invention is based on (i) an antibody recognizing periostin, (ii) a primer designed based on the base sequence of a gene encoding periostin, and (iii) a base sequence of a gene encoding periostin. At least one selected from the group consisting of probes designed in this manner. "An antibody recognizing periostin", "a primer designed based on the base sequence of a gene encoding periostin", and "a probe designed based on the base sequence of a gene encoding periostin" are described above. It is the same.

本発明の検出薬等は、上記本発明の増殖糖尿病網膜症の発症リスク予測方法、または予後予測方法もしくは予後診断方法において使用することができる。 The detection agent and the like of the present invention can be used in the above-described method for predicting the risk of developing diabetic retinopathy, the method for predicting prognosis, or the method for prognosis diagnosis.

11．本発明の増殖糖尿病網膜症の発症リスク予測用キット、または予後予測用もしくは予後診断用キット
本発明は、前記増殖糖尿病網膜症の発症リスク予測方法、または予後予測方法もしくは予後診断方法に使用することができるキットを提供する。 11． The kit for predicting the onset risk of proliferative diabetic retinopathy of the present invention, or the kit for prognosis prediction or prognosis diagnosis Provide kits that can

本発明のキットは、ペリオスチンを認識する抗体、ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計されたプライマー、およびペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計されたプローブからなる群から選択される少なくとも1つを含有する。本発明のいくつかの態様のキットは、ペリオスチンを認識する抗体、ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計されたプライマー、またはペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計されたプローブを含有する。「ペリオスチンを認識する抗体」、「ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計されたプライマー」、および「ペリオスチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計されたプローブ」は、前記説明したのと同様である。 The kit of the present invention is selected from the group consisting of an antibody recognizing periostin, a primer designed based on the base sequence of the gene encoding periostin, and a probe designed based on the base sequence of the gene encoding periostin. Contains at least one. The kit of some embodiments of the present invention comprises an antibody that recognizes periostin, a primer designed based on the base sequence of a gene encoding periostin, or a probe designed based on the base sequence of a gene encoding periostin. contains. "An antibody recognizing periostin", "a primer designed based on the base sequence of a gene encoding periostin", and "a probe designed based on the base sequence of a gene encoding periostin" are described above. It is the same.

本発明のキットは、上記の他に、容器およびラベルを含んでいてもよい。容器上のまたは容器に伴うラベルには、キットが増殖糖尿病網膜症の発症リスクの予測、または予後予測もしくは予後診断に使用されることが示されていてもよい。また、他のアイテム、例えば、使用説明書等がさらに含まれていてもよい。 In addition to the above, the kit of the present invention may contain a container and a label. The label on or associated with the container may indicate that the kit is used for predicting the risk of developing diabetic retinopathy or for prognosis or prognosis. In addition, other items such as instructions for use may be further included.

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.

1．組織染色
増殖糖尿病網膜症患者由来の生体試料におけるペリオスチンの発現レベルを確認するため、正常網膜、及び増殖糖尿病網膜症患者の網膜上線維血管増殖組織におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルを、組織染色により確認した。組織染色は、具体的には次のようにして行った。 1． Tissue staining In order to confirm the expression level of periostin in biological samples from patients with proliferative diabetic retinopathy, the expression level of periostin gene in normal retina and retinal fibrovascular tissue of proliferative diabetic retinopathy patients was confirmed by tissue staining . Specifically, tissue staining was performed as follows.

外科的に切除した線維血管増殖組織と正常網膜を、生理緩衝食塩水(PBS)[137 mM 塩化ナトリウム、2.68 mM 塩化カリウム、1.47 mM リン酸二水素カリウム及び8.04 mM リン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液(pH 7.5)]に溶かした4% パラホルムアルデヒドに浸し、パラフィン包埋した。組織切片(3 μm) を作成し、パラフィン除去、再水和後に、PBS に溶かした5%スキムミルクでブロッキングし、ラットモノクローナル抗ペリオスチン抗体 (SS5D, 4 μg/ml)を用いて1 時間室温で静置した。PBSで3回洗浄後、抗ラットイムノグロブリン・ウサギポリクローナル抗体(DAKO社 E0468)を加え、30分間室温で静置した。PBSで3回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン (ニチレイ社 415171) を加え、30分間室温で静置した。PBSで3回洗浄後、基質溶液[3,3’ジアミノベンジジン・4HCl、トリス塩酸緩衝液、0.6%過酸化水素水を各1滴ずつ混和]を滴下し、室温で5−20分静置後、精製水でよくすすいだ。ヘマトキシリン溶液に30秒間浸し、対比染色(核染色)を行った。 Surgically excised fibrovascular proliferating tissue and normal retina containing physiological buffered saline (PBS) [137 mM sodium chloride, 2.68 mM potassium chloride, 1.47 mM potassium dihydrogen phosphate and 8.04 mM disodium hydrogen phosphate It was immersed in 4% paraformaldehyde dissolved in an aqueous solution (pH 7.5)] and embedded in paraffin. Create Tissue sections (3 [mu] m), deparaffinized, after rehydration, blocked with 5% skim milk dissolved into PBS, for 1 hour at room temperature with rat monoclonal anti-periostin antibody (SS5D, 4 μ g / ml ) Left to stand. After washing 3 times with PBS, anti-rat immunoglobulin rabbit polyclonal antibody (DAKO E0468) was added and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. After washing 3 times with PBS, peroxidase-labeled streptavidin (Nichirei 415171) was added and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. After washing 3 times with PBS, add the substrate solution [3,3 'diaminobenzidine / 4HCl, Tris-HCl buffer solution, 0.6% hydrogen peroxide solution, 1 drop each] and let stand at room temperature for 5-20 minutes Rinse well with purified water. It was immersed in a hematoxylin solution for 30 seconds, and counterstained (nuclear staining).

上記SS5Dは、次のように作製した。ペリオスチンタンパク質のアミノ末端から数えて4番目のFAS1ドメインに相当するリコンビナントタンパク質を、Journal of Allergy Clinical Immunology, vol.118, 98−104, 2006に記載の方法に従って調製した。このリコンビナントタンパク質とTiterMax Goldアジュバント（TiterMax USA社）とを混合乳化したものをWistarラット（日本チャールスリバー株式会社）の足蹠に注入し、３日後、膝窩、鼠径、腸骨リンパ節から調製したリンパ球を、Sp2/Oミエローマ細胞と融合した。生育した融合細胞株の中から確立したクローンの一つを、SS5Dと命名した。 The SS5D was produced as follows. A recombinant protein corresponding to the fourth FAS1 domain counted from the amino terminus of the periostin protein was prepared according to the method described in Journal of Allergy Clinical Immunology, vol. 118, 98-104, 2006. A mixture of this recombinant protein and TiterMax Gold adjuvant (TiterMax USA) was mixed and emulsified into the footpads of Wistar rats (Nippon Charles River Co., Ltd.). Three days later, prepared from popliteal, inguinal and iliac lymph nodes Lymphocytes were fused with Sp2 / O myeloma cells. One of the clones established from the grown fusion cell line was named SS5D.

上記組織免疫染色により、ペリオスチンの発現部位が茶色に染まる。染色の結果、増殖糖尿病網膜症患者由来の網膜上線維血管増殖組織においてペリオスチンタンパク質量が高いことが分かった。例えば、図2（b）の写真を見ると、増殖組織中の線維芽細胞や血管周囲組織にペリオスチンの強い沈着が認められる。一方、図2(a)の写真を見ると、正常網膜ではペリオスチンの発現はほとんどみられない。 The tissue immunostaining stains the periostin expression site in brown. As a result of staining, it was found that the amount of periostin protein was high in the retinal fibrovascular proliferating tissue derived from a patient with proliferative diabetic retinopathy. For example, in the photograph of FIG. 2 (b), strong periostin deposition is observed in fibroblasts in the proliferating tissue and tissue surrounding the blood vessel. On the other hand, in the photograph of FIG. 2 (a), expression of periostin is hardly observed in the normal retina.

2．硝子体中および血清中ペリオスチン濃度
事前にインフォームド・コンセントを得た患者より採取した硝子体および血液を用いて硝子体中および血清中ペリオスチン濃度を測定した。
患者の内訳は以下の表の通りである。 2． Vitreous and Serum Periostin Concentrations The vitreous and serum periostin concentrations were measured using vitreous and blood collected from patients who had obtained informed consent in advance.
The breakdown of patients is shown in the table below.

2.1.硝子体中ペリオスチン濃度
硝子体中ペリオスチン濃度は抗ペリオスチン抗体を用いたELISA法で測定した。まず、ELISA用96穴プレートのウェルに、リン酸緩衝生理食塩水(PBS) [137 mM 塩化ナトリウム、2.68 mM 塩化カリウム、1.47 mM リン酸二水素カリウム及び8.04 mM リン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液(pH 7.4)]で2 μg/mlに希釈したSS18A（ラットモノクローナル抗ペリオスチン抗体）を100 μl注入し、25℃で12時間以上静置して、SS18Aをウェル底に吸着させた。ウェルの液を除いた後、ブロッキング液[0.5% カゼイン、100 mM 塩化ナトリウム及び0.1% アジ化ナトリウムを含有する50 mM Tris緩衝液（pH8.0）]を250 μl注入し、4℃で12時間以上静置した。ウェルを洗浄液[0.05 % Tween−20を含有するPBS]で3回洗浄した後、ブロッキング液と同一組成の検体希釈溶液で100倍に希釈した硝子体を100 μl注入し、25℃で12時間以上静置して、硝子体中のペリオスチンをウェルに吸着しているSS18Aに補足させた。ウェルを洗浄液で5回洗浄した後、ブロッキング液と同一組成の緩衝液で50 ng/mlに希釈したビオチンで標識されたSS17B（ラットモノクローナル抗ペリオスチン抗体）を100 μl注入し、25℃で90分静置して、SS18Aに補足されたペリオスチンにビオチン標識SS17Bを結合させた。ウェルを洗浄液で5回洗浄した後、15000倍に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）で標識されたストレプトアビジン[streptavidin−PolyHRP40 (Stereospecific Detection Technologies社)]を100 μl注入し、25℃で60分静置して、ビオチン標識SS17Bと結合させた。ウェルを洗浄液で5回洗浄した後、HRPの基質液[0.8 mM TMBZ、2.5 mM 過酸化水素、30 mM リン酸水素二ナトリウム及び 20 mM クエン酸緩衝液]を100 μl注入し、25℃で10分間反応させた後、0.7 N 硫酸により反応を停止させた。その後、吸光度計を用いて450 nmの吸光度を測定した。また、大腸菌で発現させた精製ペリオスチンタンパク質の希釈系列を同様に測定して、このELISA法におけるペリオスチン濃度−吸光度標準曲線を作成した。
上記SS18AおよびSS17Bは次のように作製した。リコンビナントペリオスチンタンパク質を、Journal of Allergy Clinical Immunology, vol.118, 98−104, 2006に記載の方法に従って調製し、TiterMax Goldアジュバント（TiterMax USA社）と混合乳化したものをWistarラット（日本チャールスリバー株式会社）の足蹠に注入した。３日後、膝窩、鼠径、腸骨リンパ節より調製したリンパ球をSp2/Oミエローマ細胞と融合し、生育した融合細胞株の中から確立したクローンを、SS18AおよびSS17Bと命名した。
硝子体を測定した吸光度を、作成した標準曲線に当てはめ、硝子体中のペリオスチン濃度を算出した。 2.1. Periostin concentration in vitreous body Periostin concentration in vitreous body was measured by ELISA using an anti-periostin antibody. First, a well of an ELISA 96-well plate is mixed with phosphate buffered saline (PBS) [137 mM sodium chloride, 2.68 mM potassium chloride, 1.47 mM potassium dihydrogen phosphate and 8.04 mM disodium hydrogen phosphate. (pH 7.4)] was injected with 100 μl of SS18A (rat monoclonal anti-periostin antibody) diluted to 2 μg / ml, and allowed to stand at 25 ° C. for 12 hours or more to adsorb SS18A to the well bottom. After removing the well solution, inject 250 μl of blocking solution [50 mM Tris buffer (pH 8.0) containing 0.5% casein, 100 mM sodium chloride and 0.1% sodium azide] at 4 ° C for 12 hours. It was left above. The wells were washed three times with a washing solution [PBS containing 0.05% Tween-20], and then 100 μl of a vitreous diluted 100-fold with a specimen dilution solution having the same composition as the blocking solution was injected, and the mixture was incubated at 25 ° C. for 12 hours or more. After standing, the periostin in the vitreous body was supplemented by SS18A adsorbed to the well. The wells were washed 5 times with a washing solution, and then 100 μl of biotinylated SS17B (rat monoclonal anti-periostin antibody) diluted to 50 ng / ml with a buffer of the same composition as the blocking solution was injected, and then at 90 ° C. for 90 minutes. After standing, biotin-labeled SS17B was bound to periostin supplemented with SS18A. After the wells were washed 5 times with a washing solution, 100 μl of streptavidin labeled with 15,000-fold horseradish peroxidase (HRP) [streptavidin-PolyHRP40 (Stereospecific Detection Technologies)] was injected, and the plate was allowed to stand at 25 ° C. for 60 minutes. And bound to biotin-labeled SS17B. After washing the wells with the washing solution 5 times, inject 100 μl of HRP substrate solution [0.8 mM TMBZ, 2.5 mM hydrogen peroxide, 30 mM disodium hydrogen phosphate and 20 mM citrate buffer], and inject at 10 ° C. at 25 ° C. After reacting for 1 minute, the reaction was stopped with 0.7 N sulfuric acid. Thereafter, the absorbance at 450 nm was measured using an absorptiometer. Further, a dilution series of purified periostin protein expressed in Escherichia coli was measured in the same manner to prepare a periostin concentration-absorbance standard curve in this ELISA method.
The SS18A and SS17B were produced as follows. Recombinant periostin protein was prepared according to the method described in Journal of Allergy Clinical Immunology, vol. 118, 98-104, 2006, and mixed and emulsified with TiterMax Gold adjuvant (TiterMax USA). Wistar rat (Nippon Charles River Co., Ltd.) ). Three days later, lymphocytes prepared from popliteal, inguinal and iliac lymph nodes were fused with Sp2 / O myeloma cells, and clones established from among the fused cell lines grown were named SS18A and SS17B.
The absorbance obtained by measuring the vitreous body was applied to the prepared standard curve, and the periostin concentration in the vitreous body was calculated.

測定した硝子体ペリオスチン濃度（ng/ml）は以下の通りであった。 The measured vitreous periostin concentrations (ng / ml) were as follows.

各群間比較を行うため、特発性黄斑上膜(ERM)、黄斑円孔(MH) 、増殖糖尿病網膜症(PDR)の3グループでKruskal−Wallis検定を行ったところP< 0.001で有意差を認めた。そこで各2群間比較をまずMann−Whitney U testで行い、P値をBonferroni補正（₅C₂=10で乗ずる）し、有意差を検定した。 In order to compare each group, the Kruskal-Wallis test was performed in 3 groups of idiopathic epimacular membrane (ERM), macular hole (MH) and proliferative diabetic retinopathy (PDR). recognized. Therefore, comparison between each two groups was first performed by Mann-Whitney U test, P value was Bonferroni corrected (multiplied by ₅ C ₂ = 10), and the significant difference was tested.

その結果、特発性黄斑上膜−増殖糖尿病網膜症（ P<0.0001）、黄斑円孔−増殖糖尿病網膜症（P<0.0001）で有意差を認めた。特発性黄斑上膜−黄斑円孔では有意差を認めなかった（すべてP> 0.05）。したがって、増殖糖尿病網膜症が、他群と比較して有意に高い値を示すといえる（図3参照）。 As a result, a significant difference was observed between idiopathic macular membrane-proliferative diabetic retinopathy (P <0.0001) and macular hole-proliferative diabetic retinopathy (P <0.0001). There was no significant difference in the idiopathic supramacular-macular hole (all P> 0.05). Therefore, it can be said that proliferative diabetic retinopathy shows a significantly higher value than the other groups (see FIG. 3).

2.2.血清中ペリオスチン濃度
血清中ペリオスチン濃度は抗ペリオスチン抗体を用いたELISA法で測定した。まず、ELISA用96穴プレートのウェルに、リン酸緩衝生理食塩水(PBS) [137 mM 塩化ナトリウム、2.68 mM 塩化カリウム、1.47 mM リン酸二水素カリウム及び8.04 mM リン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液(pH 7.4)]で2 μg/mlに希釈したSS18A（ラットモノクローナル抗ペリオスチン抗体）を100 μl注入し、25℃で12時間以上静置して、SS18Aをウェル底に吸着させた。ウェルの液を除いた後、ブロッキング液[0.5% カゼイン、100 mM 塩化ナトリウム及び0.1% アジ化ナトリウムを含有する50 mM Tris緩衝液（pH8.0）]を250 μl注入し、4℃で12時間以上静置した。ウェルを洗浄液[0.05% Tween−20を含有するPBS]で3回洗浄した後、ブロッキング液と同一組成の検体希釈溶液で200倍に希釈した血清を100 μl注入し、25℃で12時間以上静置して、血清中のペリオスチンをウェルに吸着しているSS18Aに補足させた。ウェルを洗浄液で5回洗浄した後、ブロッキング液と同一組成(アジ化ナトリウム含有なし)の緩衝液で50 ng/mlに希釈したPODで標識されたSS17B（ラットモノクローナル抗ペリオスチン抗体）を100 μl注入し、25℃で90分静置して、SS18Aに補足されたペリオスチンにPOD標識SS17Bを結合させた。ウェルを洗浄液で5回洗浄した後、HRPの基質液[0.8 mM TMBZ、2.5 mM 過酸化水素、30 mM リン酸水素二ナトリウム及び 20 mM クエン酸緩衝液]を100 μl注入し、25℃で10分間反応させた後、0.7N 硫酸により反応を停止させた。その後、吸光度計を用いて450 nmの吸光度を測定した。
また、大腸菌で発現させた精製ペリオスチンタンパク質の希釈系列を同様に測定して、このELISA法におけるペリオスチン濃度−吸光度標準曲線を作成した。
血清を測定した吸光度を、作成した標準曲線に当てはめ、血清中のペリオスチン濃度を算出した。 2.2. Periostin concentration in serum Serum periostin concentration was measured by ELISA using an anti-periostin antibody. First, a well of an ELISA 96-well plate is mixed with phosphate buffered saline (PBS) [137 mM sodium chloride, 2.68 mM potassium chloride, 1.47 mM potassium dihydrogen phosphate and 8.04 mM disodium hydrogen phosphate. (pH 7.4)] was injected with 100 μl of SS18A (rat monoclonal anti-periostin antibody) diluted to 2 μg / ml, and allowed to stand at 25 ° C. for 12 hours or more to adsorb SS18A to the well bottom. After removing the well solution, inject 250 μl of blocking solution [50 mM Tris buffer (pH 8.0) containing 0.5% casein, 100 mM sodium chloride and 0.1% sodium azide] at 4 ° C for 12 hours. It was left above. The wells were washed 3 times with a washing solution [PBS containing 0.05% Tween-20], and then 100 μl of serum diluted 200-fold with a sample dilution solution having the same composition as the blocking solution was injected, and the wells were allowed to stand at 25 ° C. for 12 hours or more. The serum periostin was supplemented by SS18A adsorbed to the wells. Wash wells 5 times with wash solution, then inject 100 μl of POD-labeled SS17B (rat monoclonal anti-periostin antibody) diluted to 50 ng / ml with the same buffer composition (without sodium azide) as the blocking solution The mixture was allowed to stand at 25 ° C. for 90 minutes to bind POD-labeled SS17B to periostin supplemented with SS18A. After washing the wells with the washing solution 5 times, inject 100 μl of HRP substrate solution [0.8 mM TMBZ, 2.5 mM hydrogen peroxide, 30 mM disodium hydrogen phosphate and 20 mM citrate buffer], and inject at 10 ° C. at 25 ° C. After reacting for 1 minute, the reaction was stopped with 0.7N sulfuric acid. Thereafter, the absorbance at 450 nm was measured using an absorptiometer.
Further, a dilution series of purified periostin protein expressed in Escherichia coli was measured in the same manner to prepare a periostin concentration-absorbance standard curve in this ELISA method.
The absorbance measured for the serum was applied to the prepared standard curve, and the periostin concentration in the serum was calculated.

その結果、測定した血清ペリオスチン濃度（ng／ml）は以下の通りであった。 As a result, the measured serum periostin concentration (ng / ml) was as follows.

その結果、特発性黄斑上膜−増殖糖尿病網膜症（ P<0.0001）、黄斑円孔−増殖糖尿病網膜症（P<0.0001）で有意差を認めた。特発性黄斑上膜−黄斑円孔では有意差を認めなかった（すべてP> 0.05）。したがって、増殖糖尿病網膜症が、他群と比較して有意に高い値を示すといえる（図4参照）。 As a result, a significant difference was observed between idiopathic macular membrane-proliferative diabetic retinopathy (P <0.0001) and macular hole-proliferative diabetic retinopathy (P <0.0001). There was no significant difference in the idiopathic supramacular-macular hole (all P> 0.05). Therefore, it can be said that proliferative diabetic retinopathy shows a significantly higher value than the other groups (see FIG. 4).

以上、実施例に示した通り、ペリオスチン遺伝子は、増殖糖尿病網膜症患者由来の組織で発現が増加しているので、被験者由来の生体試料におけるペリオスチンは、増殖糖尿病網膜症を検出または診断するためのマーカーとして利用し得る。特に、増殖糖尿病網膜症患者では、血清中ペリオスチン濃度が他疾患群に比して有意に高値であり、血清中ペリオスチンタンパク質量が増殖糖尿病網膜症の検出に有用であることが示された。よって、血清中、硝子体中等のペリオスチンレベルを測定し、それが対照 (特発性網膜上膜、黄斑円孔、健常者)よりも高くなっていることを観察することにより、その患者が増殖糖尿病網膜症であることの検出または診断を行うことができる。あるいは増殖糖尿病網膜症が疑われた場合にその診断の補助となることができる。さらに、硝子体や増殖組織におけるペリオスチン発現を解析して、その発現の多寡により、増殖糖尿病網膜症の病勢や硝子体手術などの治療効果を定量化できることが期待される。 As described above, since the expression of periostin gene is increased in tissues derived from patients with proliferative diabetic retinopathy, periostin in a biological sample derived from a subject is used for detecting or diagnosing proliferative diabetic retinopathy. Can be used as a marker. In particular, in patients with proliferative diabetic retinopathy, the serum periostin concentration was significantly higher than in other disease groups, indicating that the amount of serum periostin protein is useful in detecting proliferative diabetic retinopathy. Therefore, by measuring periostin levels in serum, vitreous, etc. and observing that it is higher than controls (idiopathic epiretinal membrane, macular hole, healthy subjects), the patient has proliferative diabetes Detection or diagnosis of retinopathy can be performed. Alternatively, when proliferative diabetic retinopathy is suspected, the diagnosis can be aided. Furthermore, by analyzing the expression of periostin in the vitreous body and proliferating tissue, it is expected that the therapeutic effect of proliferative diabetic retinopathy and vitreous surgery can be quantified by the level of expression.

また、ペリオスチン遺伝子は、増殖糖尿病網膜症患者由来の組織で発現が増加しているので、ペリオスチン遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩は、増殖糖尿病網膜症の予防・治療剤として使用し得る。 In addition, since the expression of periostin gene is increased in tissues derived from patients with proliferative diabetic retinopathy, a compound that inhibits the expression of periostin gene or a salt thereof can be used as a prophylactic / therapeutic agent for proliferative diabetic retinopathy.

さらに、これらのことから、ペリオスチン遺伝子の発現レベルまたはペリオスチンタンパク質量を指標として、増殖糖尿病網膜症の予防・治療薬をスクリーニングできることも分かる。 Furthermore, these facts also indicate that prophylactic / therapeutic agents for proliferative diabetic retinopathy can be screened using the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein as an index.

Claims

A method for measuring periostin gene expression level or periostin protein amount in a biological sample derived from a subject in order to detect proliferative diabetic retinopathy.

2. The method according to claim 1, wherein the measured gene expression level or protein amount is correlated with the onset of proliferative diabetic retinopathy.

The method according to claim 1 or 2, comprising comparing (i) a periostin gene expression level or periostin protein amount in a subject-derived biological sample and (ii) a periostin gene expression level or periostin protein amount in a control sample. The method described .

Measure the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein in a biological sample derived from a subject,
(I) Periostin gene expression level or periostin protein amount in a biological sample derived from a subject is (ii) periostin gene expression level or periostin protein amount in a control sample, or proliferative diabetic retinopathy or proliferative diabetes A method of detecting proliferative diabetic retinopathy, comprising determining that it is suspected of having retinopathy .

The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the biological sample is vitreous or blood.

A method for screening a prophylactic / therapeutic agent for proliferative diabetic retinopathy, comprising culturing cells capable of producing periostin in the presence of a candidate substance and measuring the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein in the culture. .

7. The method according to claim 6, wherein the measured gene expression level or protein amount is associated with a prophylactic / therapeutic effect of proliferative diabetic retinopathy by a candidate substance.

(I) expression level of periostin gene or periostin protein level when cells capable of producing periostin are cultured in the presence of a candidate substance, and (ii) absence of candidate substance in a cell capable of producing periostin 8. The method according to claim 7, comprising comparing the expression level of periostin gene or the amount of periostin protein when cultured under the condition.

(I) When the cell capable of producing periostin is cultured in the presence of a candidate substance, the expression level of the periostin gene or the amount of periostin protein is (ii) the cell capable of producing periostin in the absence of the candidate substance 9. The method according to claim 8, comprising selecting a candidate substance when the expression level of the periostin gene or the amount of periostin protein is lower when cultured in

The method according to any one of claims 1 to 9, wherein the measurement is performed by an immunoassay.

(I) an antibody recognizing periostin, (ii) a primer comprising at least 15 consecutive nucleotides designed based on the base sequence of the gene encoding periostin, and (iii) the base of the gene encoding periostin An agent for detecting proliferative diabetic retinopathy, comprising at least one selected from the group consisting of probes consisting of polynucleotides of at least 15 consecutive nucleotides designed based on a sequence.

(I) an antibody recognizing periostin, (ii) a primer comprising at least 15 consecutive nucleotides designed based on the base sequence of the gene encoding periostin, and (iii) the base of the gene encoding periostin A kit for the detection of proliferative diabetic retinopathy, comprising at least one selected from the group consisting of probes consisting of at least 15 consecutive nucleotides designed based on a sequence.

A kit for screening for a prophylactic / therapeutic agent for proliferative diabetic retinopathy, comprising cells capable of producing periostin.