JP5446119B2 - Polyamidoamine dendron lipids containing lower acyl groups - Google Patents
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Description
本発明は、低級アシル基を有するポリアミドアミンデンドロン脂質に関する。 The present invention relates to a polyamidoamine dendron lipid having a lower acyl group.
疾患の原因となる標的細胞に遺伝子などの薬剤を直接送達するドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）において使用可能な薬剤運搬用担体として、カプセル状分子集合体（ベシクル）が知られている。ベシクルの代表的なものとしては、脂質二重膜を有し、その内部又は膜内に薬剤を保持できるリポソームが知られている。 As a drug delivery carrier that can be used in a drug delivery system (DDS) that directly delivers a drug such as a gene to a target cell causing a disease, a capsule-like molecular assembly (vesicle) is known. As a typical vesicle, a liposome having a lipid bilayer membrane and capable of retaining a drug inside or within the membrane is known.
近年、ベシクルの一種として、ポリアミドアミンデンドロン脂質を基本構造とするものが開発されている（特開２００４−１５９５０４；特許文献１）。
特許文献１には、このポリアミドデンドロン脂質をＤＮＡと組み合わせて得られる複合体を用いることにより、該ＤＮＡを細胞内により高い効率で導入できることが開示されている。
Patent Document 1 discloses that by using a complex obtained by combining this polyamide dendron lipid with DNA, the DNA can be introduced into cells more efficiently.
本発明者らは、特許文献１に開示されるポリアミドアミンデンドロン脂質の末端のアミノ基の水素を低級アシル基で置換することにより、得られる低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質が、あるｐＨ条件下で温度応答性を示すことを見出し、本発明を完成した。
このような低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質を用いれば、所定の条件で所望の温度において形状を変化させ得るベシクルを得ることができ、これを用いて温度によりベシクルの挙動を制御できると考えられる。
The present inventors have disclosed that a lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipid obtained by substituting the hydrogen of the terminal amino group of the polyamidoamine dendron lipid disclosed in Patent Document 1 with a lower acyl group under certain pH conditions. As a result, the present invention was completed.
If such a lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipid is used, a vesicle capable of changing its shape at a desired temperature under a predetermined condition can be obtained, and this can be used to control the behavior of the vesicle according to the temperature. .
よって、本発明は、炭素数３〜６の低級アシル基を有するポリアミドアミンデンドロン脂質である、低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質を提供する。
また、本発明は、ポリアミドアミンデンドロン脂質を、該脂質を溶解可能な溶媒中で、低級脂肪酸又はその反応性誘導体と反応させることを含む、上記の低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質の製造方法も提供する。
Therefore, the present invention provides a lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipid, which is a polyamidoamine dendron lipid having a lower acyl group having 3 to 6 carbon atoms.
The present invention also provides a method for producing the above-mentioned lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipid, which comprises reacting the polyamidoamine dendron lipid with a lower fatty acid or a reactive derivative thereof in a solvent capable of dissolving the lipid. provide.
本発明の低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質は、温度に応じてその性質、特に親水性を変化させる温度応答性を有する。このような低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質からなるベシクルは、ある特定の温度条件にすることにより、別のベシクル又は標的細胞と融合したり、凝集したりできると考えられる。よって、本発明の低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質からなるベシクルに遺伝子などの薬剤を含有させて、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）において用いることにより、細胞への薬剤の導入を温度により制御できると考えられる。 The lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipid of the present invention has temperature responsiveness that changes its properties, particularly hydrophilicity, according to temperature. It is considered that a vesicle composed of such a lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipid can be fused or aggregated with another vesicle or a target cell under certain specific temperature conditions. Therefore, by introducing a drug such as a gene into the vesicle comprising the lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipid of the present invention and using it in a drug delivery system (DDS), the introduction of the drug into cells can be controlled by temperature. It is done.
本発明の低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質は、炭素数３〜６の低級アシル基を含有するポリアミドアミンデンドロン脂質である。
本発明の低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質を構成する基本構造であるポリアミドアミンデンドロン脂質は、樹状（デンドロン）構造を有する化合物であり、以下の式に示される構造を有するものである。
ＤＬ−Ｇ１：Ｒ1Ｒ2ＮＸ（ＸＨ2）2
ＤＬ−Ｇ２：Ｒ1Ｒ2ＮＸ（Ｘ（ＸＨ2）2）2
ＤＬ−Ｇ３：Ｒ1Ｒ2ＮＸ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2
ＤＬ−Ｇ４：Ｒ1Ｒ2ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2）2
ＤＬ−Ｇ５：Ｒ1Ｒ2ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2）2）2
ＤＬ−Ｇ６：Ｒ1Ｒ2ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2）2）2）2
ＤＬ−Ｇ７：Ｒ1Ｒ2ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2）2）2）2）2
ＤＬ−Ｇ８：Ｒ1Ｒ2ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2）2）2）2）2）2
（式中、Ｒ1及びＲ2は同一又は異なって、Ｃ6〜Ｃ20アルキル基、Ｃ6〜Ｃ20アルコキシ基、アリール基又はアラルキル基を表し、Ｘは、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ＜を表す。）
The lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipid of the present invention is a polyamidoamine dendron lipid containing a lower acyl group having 3 to 6 carbon atoms.
The polyamidoamine dendron lipid, which is the basic structure constituting the lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipid of the present invention, is a compound having a dendritic structure and has a structure represented by the following formula.
DL-G1: R 1 R 2 NX (XH 2 ) 2
DL-G2: R 1 R 2 NX (X (XH 2 ) 2 ) 2
DL-G3: R 1 R 2 NX (X (X (XH 2 ) 2 ) 2 ) 2
DL-G4: R 1 R 2 NX (X (X (X (XH 2 ) 2 ) 2 ) 2 ) 2
DL-G5: R 1 R 2 NX (X (X (X (X (XH 2 ) 2 ) 2 ) 2 ) 2 ) 2
DL-G6: R 1 R 2 NX (X (X (X (X (X (XH 2) 2) 2) 2) 2) 2) 2
DL-G7: R 1 R 2 NX (X (X (X (X (X (X (XH 2 ) 2 ) 2 ) 2 ) 2 ) 2 ) 2 ) 2 ) 2
DL-G8: R 1 R 2 NX (X (X (X (X (X (X (X (XH 2 ) 2 ) 2 ) 2 ) 2 ) 2 ) 2 ) 2 ) 2
Wherein R 1 and R 2 are the same or different and each represents a C 6 to C 20 alkyl group, a C 6 to C 20 alkoxy group, an aryl group or an aralkyl group, and X represents —CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 represents N <)
上記の構造式において、「ＤＬ」は「デンドロン」の略称から命名したものである。また、末端に２つのアミノ基を有する構造のものを第１世代（Ｇ１）とし、以下、枝分かれの段階に応じて第２世代（Ｇ２）、第３世代（Ｇ３）・・・などと命名している。 In the above structural formula, “DL” is named after the abbreviation “Dendron”. In addition, the structure having two amino groups at the terminal is designated as the first generation (G1), and the second generation (G2), the third generation (G3), etc. are named according to the branching stage. ing.
上記のポリアミドアミンデンドロン脂質は、第８世代（ＤＬ−Ｇ８）のものよりも多い末端アミノ基を有するもの、すなわち第９世代、第１０世代・・・のものであることも理論的に可能である。 It is theoretically possible that the above polyamidoamine dendron lipids have more terminal amino groups than those of the eighth generation (DL-G8), that is, those of the ninth generation, the tenth generation, and so on. is there.
本発明において、上記のポリアミドアミンデンドロン脂質は、ＤＬ−Ｇ２以上かつＤＬ−Ｇ８までのものが好ましく、ＤＬ−Ｇ２又はＤＬ−Ｇ３がより好ましい。 In the present invention, the polyamidoamine dendron lipid is preferably DL-G2 or higher and DL-G8, more preferably DL-G2 or DL-G3.
上記のポリアミドデンドロン脂質の式において、Ｒ1及びＲ2は、Ｃ6〜Ｃ20アルキル基であることが好ましい。該アルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状の炭素数６〜２０のアルキル基であり、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、５−メチルヘキシル、オクチル、ビス（２−エチルヘキシル）、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、エイコシルなどを含む。なかでも、直鎖状の炭素数１２〜１８のアルキル基がより好ましい。 In the above polyamide dendron lipid formula, R 1 and R 2 are preferably C 6 -C 20 alkyl groups. The alkyl group is a linear or branched alkyl group having 6 to 20 carbon atoms, hexyl, isohexyl, heptyl, 5-methylhexyl, octyl, bis (2-ethylhexyl), nonyl, decyl, undecyl, Includes dodecyl, tridecyl, tetradecyl, hexadecyl, octadecyl, eicosyl and the like. Among these, a linear alkyl group having 12 to 18 carbon atoms is more preferable.
上記のＲ1及びＲ2としてのＣ6〜Ｃ20アルコキシ基としては、直鎖状又は分岐鎖状の炭素数６〜２０のアルコキシ基が挙げられ、例えばヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、トリデシルオキシ、テトラデシルオキシ、ヘキサデシルオキシ、オクタデシルオキシ、エイコシルオキシなどを含む。 Examples of the C 6 -C 20 alkoxy group as R 1 and R 2 include linear or branched alkoxy groups having 6 to 20 carbon atoms, such as hexyloxy, heptyloxy, octyloxy, nonyloxy. Decyloxy, undecyloxy, dodecyloxy, tridecyloxy, tetradecyloxy, hexadecyloxy, octadecyloxy, eicosyloxy and the like.
上記のＲ1及びＲ2としてのアリール基は、フェニル、ナフチル、ビフェニル、アントラニル、フェナントリルなどを含む。
上記のＲ1及びＲ2としてのアラルキル基は、ベンジル、フェネチルなどを含む。
The aryl groups as R 1 and R 2 include phenyl, naphthyl, biphenyl, anthranyl, phenanthryl and the like.
The above aralkyl groups as R 1 and R 2 include benzyl, phenethyl and the like.
上記のポリアミドアミンデンドロン脂質は、公知の方法により製造できる。公知の方法としては、原料である第２級アミンＲ1Ｒ2ＮＨに、アクリル酸エステルを反応させるマイケル付加反応と、ジアミノアルカンを用いるエステルアミド交換反応とにより第０世代のアミド化合物を得て、マイケル付加反応及びエステルアミド交換反応を繰り返す方法が挙げられる（Tomalia, D.ら、Polym. J. 17、117〜132 (1985)；Frechet, J. M. J., Tomalia, D. A.編、(2001) Dendrimers and other dendritic polymers, J. Wiley & Sons, West Sussexを参照）。原料となる第２級アミンは、市販で入手可能である。
該ポリアミドアミンデンドロン脂質の製造方法の例を、以下のスキームに示す。
Said polyamidoamine dendron lipid can be manufactured by a well-known method. As a known method, a 0th generation amide compound is obtained by a Michael addition reaction in which an acrylic ester is reacted with a secondary amine R 1 R 2 NH as a raw material and an ester amide exchange reaction using a diaminoalkane. And Michael addition reaction and ester amide exchange reaction (Tomalia, D. et al., Polym. J. 17, 117-132 (1985); Frechet, JMJ, Tomalia, DA, (2001) Dendrimers and other). dendritic polymers, see J. Wiley & Sons, West Sussex). The secondary amine used as a raw material is commercially available.
An example of a method for producing the polyamide amine dendron lipid is shown in the following scheme.
本発明の低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質は、上記のポリアミドアミンデンドロン脂質の末端のアミノ基の水素を低級アシル基で置換したものである。末端のアミノ基は２個の水素原子を有するが、２個ともに低級アシル基で置換したものであってもよいし、いずれか一方の水素原子を低級アシル基で置換したものであってもよい。好ましくは、いずれか一方の水素原子を低級アシル基で置換したものである。
また、低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質１分子中の複数の低級アシル基は、２種以上であってもよいが、製造工程の簡便さの点から、１種（同一種）であることが好ましい。
２種以上の低級アシル基を有するポリアミドアミンデンドロン脂質を得るためには、それぞれの低級アシル基を有するポリアミドアミンデンドロン脂質を別々に製造して、これらを混合することが、製造が簡便であることから好ましい。
The lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipid of the present invention is obtained by substituting the hydrogen of the amino group at the terminal of the polyamidoamine dendron lipid with a lower acyl group. The terminal amino group has two hydrogen atoms, but both may be substituted with a lower acyl group, or one of the hydrogen atoms may be substituted with a lower acyl group. . Preferably, one of the hydrogen atoms is substituted with a lower acyl group.
In addition, the lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipid may have two or more lower acyl groups in one molecule, but from the viewpoint of simplicity of the production process, it may be one (same type). preferable.
In order to obtain a polyamidoamine dendron lipid having two or more kinds of lower acyl groups, it is easy to produce the polyamidoamine dendron lipids each having a lower acyl group separately and mix them. To preferred.
上記の低級アシル基は、炭素数が３〜６の直鎖又は分枝鎖状の脂肪酸から誘導されたものを意味する。本明細書において、低級アシル基についての炭素数は、カルボニル基の炭素原子をも含む。よって、本発明において、低級アシル基は、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、２−メチルブチリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、４−メチルバレリル基、３−メチルバレリル基、２−メチルバレリル基、２，３−ジメチルブチリル基及び３，３−ジメチルブチリル基を含む。
好ましくは、上記の低級アシル基は、ブチリル基又はイソブチリル基である。
The above-mentioned lower acyl group means a derivative derived from a linear or branched fatty acid having 3 to 6 carbon atoms. In the present specification, the carbon number for the lower acyl group also includes the carbon atom of the carbonyl group. Therefore, in the present invention, the lower acyl group includes propionyl group, butyryl group, isobutyryl group, valeryl group, isovaleryl group, 2-methylbutyryl group, pivaloyl group, hexanoyl group, 4-methylvaleryl group, 3-methylvaleryl group, 2-methylvaleryl group. Group, 2,3-dimethylbutyryl group and 3,3-dimethylbutyryl group.
Preferably, the lower acyl group is a butyryl group or an isobutyryl group.
本発明の低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質は、上記のようにして製造したポリアミドアミンデンドロン脂質を、該脂質を溶解可能な溶媒中で、低級脂肪酸又はその反応性誘導体と反応させることにより製造できる。 The lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipid of the present invention can be produced by reacting the polyamidoamine dendron lipid produced as described above with a lower fatty acid or a reactive derivative thereof in a solvent capable of dissolving the lipid. .
上記の低級脂肪酸又はその反応性誘導体は、上記の低級アシル基を与えることとなる低級脂肪酸又はその反応性誘導体であればよい。上記の低級脂肪酸の反応性誘導体は、当該技術において公知であり、例えばＲ3（Ｃ＝Ｏ）Ｘ（式中、Ｒ3は炭素数３〜６の低級アルキル基であり、Ｘはハロゲン原子、−ＯＲ4（Ｒ4は、低級アルキル基、ペンタクロロフェニル基、パラニトロフェニル基またはスクシミジル基である）、−ＯＣＯＲ5（Ｒ5は、低級アルキル基である）で表される化合物が挙げられる。上記の低級脂肪酸の反応性誘導体は、例えばハロゲン化低級アルカノイル、脂肪酸無水物を含み、例えば塩化ブチリル、塩化イソブチリル、塩化プロピオニル、塩化ヘプタノイルなどを含む。
上記の低級脂肪酸を用いる場合、従来公知の縮合剤、例えばＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）などの存在下で行うことが好ましい。
The lower fatty acid or reactive derivative thereof may be any lower fatty acid or reactive derivative thereof that will give the lower acyl group. The above-mentioned reactive derivatives of lower fatty acids are known in the art, for example, R 3 (C═O) X (wherein R 3 is a lower alkyl group having 3 to 6 carbon atoms, X is a halogen atom, -OR 4 (R 4 is a lower alkyl group, pentachlorophenyl group, a para-nitrophenyl group or a succimidyl group), - OCOR 5 (R 5 is a lower alkyl group) is a compound represented by like. The reactive derivative of the lower fatty acid includes, for example, a halogenated lower alkanoyl and a fatty acid anhydride, and includes, for example, butyryl chloride, isobutyryl chloride, propionyl chloride, heptanoyl chloride and the like.
When the above lower fatty acid is used, it is carried out in the presence of a conventionally known condensing agent such as N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), N, N′-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and the like. It is preferable.
上記のポリアミドアミンデンドロン脂質を溶解可能な溶媒は、非プロトン性極性溶媒が好ましい。非プロトン性極性溶媒は、クロロホルム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などを含む。 The solvent capable of dissolving the polyamidoamine dendron lipid is preferably an aprotic polar solvent. Aprotic polar solvents include chloroform, dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethylformamide (DMF) and the like.
低級脂肪酸又はその反応性誘導体は、用いるポリアミドデンドロン脂質の末端アミノ基のモル量に対して１モル等量より多く用いることが好ましく、より好ましくは１モル等量より多く、２モル等量未満である。このような範囲の低級脂肪酸又はその反応性誘導体を用いることにより、ポリアミドアミンデンドロン脂質の全ての末端アミノ基に対して１つずつ低級アシル基を導入することができる。２モル等量以上の低級脂肪酸又はその反応性誘導体を用いてもよいが、経済的な観点から、２モル等量未満がより好ましい。 The lower fatty acid or its reactive derivative is preferably used in an amount of more than 1 molar equivalent, more preferably more than 1 molar equivalent and less than 2 molar equivalents relative to the molar amount of the terminal amino group of the polyamide dendron lipid used. is there. By using a lower fatty acid or a reactive derivative thereof in such a range, one lower acyl group can be introduced to every terminal amino group of the polyamide amine dendron lipid. Although 2 mol equivalent or more lower fatty acid or its reactive derivative may be used, less than 2 mol equivalent is more preferable from an economical viewpoint.
上記の反応は、−１０〜４０℃の温度において行うことが好ましく、より好ましくは０〜３０℃の温度である。また、反応時間は、１２〜７２時間が好ましく、より好ましくは２４〜４８時間である。 The above reaction is preferably performed at a temperature of −10 to 40 ° C., more preferably a temperature of 0 to 30 ° C. The reaction time is preferably 12 to 72 hours, more preferably 24 to 48 hours.
本発明の低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質の特に好ましい例は、以下に示すものである。 Particularly preferred examples of the lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipid of the present invention are shown below.
本発明の低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質は、低級アシル基を含有することにより、ある条件下で温度応答性を有する。本明細書において「温度応答性」とは、ある特定の温度において該脂質の親水性が変化することをいう。温度応答性は、具体的には、以下の実施例に示すように、本発明の低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質分散液の光学密度の変化を測定することにより検出することができる。
本発明において、このような温度応答性が得られる原因は明らかではないが、おそらく、低級アシル基が温度の変化に応じて疎水性を増し、低級アシル基同士が凝集することにより、低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質自体の疎水性も変化することによると考えられる。
The lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipid of the present invention has temperature responsiveness under certain conditions by containing the lower acyl group. In this specification, “temperature responsiveness” means that the hydrophilicity of the lipid changes at a specific temperature. Specifically, the temperature responsiveness can be detected by measuring the change in optical density of the lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipid dispersion of the present invention, as shown in the following examples.
In the present invention, the reason why such temperature responsiveness is obtained is not clear, but the lower acyl group probably increases in hydrophobicity in response to a change in temperature, and the lower acyl groups aggregate to each other. It is considered that the hydrophobicity of the contained polyamidoamine dendron lipid itself is also changed.
本発明の低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質は、一定のｐＨ条件下である特定の温度においてその親水性が変化するので、例えばドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）などにおいて遺伝子などの薬剤を保持させるベシクルとして用いれば、薬剤の送達を温度により制御することができる。具体的には、本発明の脂質からなるベシクルに薬剤を保持させ、該ベシクルを対象に投与した後に、治療すべき患部の温度を所定の温度に上昇させて患部でのベシクルをある特定の温度にすることにより、ベシクルの親水性が変化してその形態を変化させるか、或いは患部の標的細胞と融合及び／又は凝集できるので、薬剤を放出するか又は標的細胞の内部に薬剤を効率よく送達できると考えられる。
また、本発明の低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質は、ｐＨの変化に応じてその温度応答性が変化するので、同じ温度であっても、上記のようなベシクルが存在する環境のｐＨを変化させることにより、親水性が変化してその形態を変化させることができると考えられる。このようなｐＨの変化は、例えば細胞の周囲と細胞の内部とで観察される。
Since the hydrophilicity of the lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipid of the present invention changes at a specific temperature under a certain pH condition, for example, as a vesicle for retaining a drug such as a gene in a drug delivery system (DDS) or the like. If used, drug delivery can be controlled by temperature. Specifically, the drug is held in the vesicle comprising the lipid of the present invention, and after the vesicle is administered to the subject, the temperature of the affected area to be treated is increased to a predetermined temperature so that the vesicle in the affected area is at a certain temperature. By changing the hydrophilicity of the vesicle and changing its form, it can be fused and / or aggregated with the target cell in the affected area, so that the drug is released or the drug is efficiently delivered to the inside of the target cell. It is considered possible.
Moreover, since the temperature responsiveness of the lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipid of the present invention changes according to the change in pH, the pH of the environment in which the above vesicles exist changes even at the same temperature. It is considered that the hydrophilicity is changed and the form can be changed. Such a change in pH is observed, for example, around the cell and inside the cell.
本発明の低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質は、２種以上を混合することによっても温度応答性を変化させることができる。例えば、低級アシル基が異なり、基本のポリアミドアミンデンドロン脂質の構造が同じである２種以上の低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質を混合してもよいし、低級アシル基が同じであり、基本のポリアミドアミンデンドロン脂質の構造又は世代数が異なる２種以上の低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質を混合してもよい。
これらの２種以上の低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質の混合比は、所望の温度応答性が得られるように適宜調節すればよい。
The temperature responsiveness of the lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipid of the present invention can be changed by mixing two or more kinds. For example, two or more lower acyl group-containing polyamide amine dendron lipids having different lower acyl groups and the same basic polyamide amine dendron lipid structure may be mixed, or the lower acyl groups may be the same, Two or more lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipids having different structures or generation numbers of polyamidoamine dendron lipids may be mixed.
The mixing ratio of these two or more lower acyl group-containing polyamide amine dendron lipids may be appropriately adjusted so as to obtain a desired temperature responsiveness.
本発明の低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質は、該低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質以外のポリアミドアミンデンドロン脂質と混合することによって温度応答性を変化させることもできる。
低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質以外のポリアミドアミンデンドロン脂質とは、ポリアミドアミンデンドロン脂質中のアミノ基が置換されていないか又は低級アシル基以外の基で置換されてなるポリアミドアミンデンドロン脂質を含む。
上記の低級アシル基以外の基としては、ホルミル基、アセチル基などが挙げられる。
本発明の低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質と、それ以外のポリアミドアミンデンドロン脂質との混合比は、所望の温度応答性が得られるように適宜調節すればよい。
The temperature responsiveness of the lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipid of the present invention can be changed by mixing with the polyamidoamine dendron lipid other than the lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipid.
Polyamidoamine dendron lipids other than lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipids include polyamidoamine dendron lipids in which the amino groups in the polyamidoamine dendron lipids are not substituted or substituted with groups other than lower acyl groups.
Examples of the group other than the lower acyl group include a formyl group and an acetyl group.
The mixing ratio of the lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipid of the present invention and the other polyamidoamine dendron lipid may be appropriately adjusted so that a desired temperature responsiveness can be obtained.
本発明の低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質を用いて薬剤を保持するベシクルを作製する方法は、例えば特開２００４−１５９５０４号公報に記載された方法を用いることができる。
該薬剤としては、遺伝子、抗癌剤、あるいはアンチセンス核酸、siRNA、リボザイムなどの核酸医薬、タンパク質などが挙げられる。
As a method for producing a vesicle for holding a drug using the lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipid of the present invention, for example, a method described in JP-A No. 2004-159504 can be used.
Examples of the drug include genes, anticancer agents, nucleic acid drugs such as antisense nucleic acids, siRNA, and ribozymes, proteins, and the like.
本発明の実施形態を、以下の実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
以下の実施例において、プロトン核磁気共鳴（1H NMR）は、JEOL JNM-LA 400を用いて
測定した。また、シリカゲルクロマトグラフィーは、Merck Kieselgel 60 (230-400 mesh)を用いて行った。
Embodiments of the present invention will be described in more detail based on the following examples, but the present invention is not limited to the following examples.
In the following examples, proton nuclear magnetic resonance ( 1 H NMR) was measured using JEOL JNM-LA 400. Silica gel chromatography was performed using Merck Kieselgel 60 (230-400 mesh).
製造例１ Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第２世代）の製造
製造例１．１
アクリル酸メチル(53 ml, 0.59 mmol、キシダ化学社製)に、ジ−ｎ−オクタデシルアミン(3.0 g, 5.7 mmol、Fluka社製)を溶解し、窒素雰囲気において80℃で18時間還流した。その後、未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒 石油エーテル：ジエチルエーテル＝2：1, v/v）で精製した（収率：74.2%）。
1H NMR (CDCl3): δ 0.88 (m, CH 3(CH2)9-), δ 1.23 (s, CH3(CH 2)9-), δ 1.41 (m, -CH 2CH2N-), δ 2.38 (t, -CH 2COOCH3), δ 2.44 (t, -CH 2N-), δ 2.77 (t, -CH 2CH2COOCH3), δ 3.67 (s, -OCH 3).
Di-n-octadecylamine (3.0 g, 5.7 mmol, manufactured by Fluka) was dissolved in methyl acrylate (53 ml, 0.59 mmol, manufactured by Kishida Chemical Co., Ltd.) and refluxed at 80 ° C. for 18 hours in a nitrogen atmosphere. Thereafter, unreacted methyl acrylate was distilled off under reduced pressure and purified by silica gel chromatography (developing solvent: petroleum ether: diethyl ether = 2: 1, v / v) (yield: 74.2%).
1 H NMR (CDCl 3): δ 0.88 (m, C H 3 (CH 2) 9 -), δ 1.23 (s, CH 3 (C H 2) 9 -), δ 1.41 (m, -C H 2 CH 2 N-), δ 2.38 (t, -C H 2 COOCH 3 ), δ 2.44 (t, -C H 2 N-), δ 2.77 (t, -C H 2 CH 2 COOCH 3 ), δ 3.67 (s , -OC H 3 ).
製造例１．２
1H NMR (CDCl3): δ 0.88 (m, CH 3(CH2)9-), δ 1.26 (s, CH3(CH 2)9-), δ 1.44 (m, -CH 2CH2N-), δ 2.36 (t, -CH 2CONH-), δ 2.42 (t, -CH 2N-), δ 2.65 (t, -CH 2CH2CONH-), δ 2.79 (t, -CH 2NH2), δ 3.28 (m, -CH 2CH2NH2), δ 8.67 (m, -CONH-).
Production Example 1.2
1 H NMR (CDCl 3): δ 0.88 (m, C H 3 (CH 2) 9 -), δ 1.26 (s, CH 3 (C H 2) 9 -), δ 1.44 (m, -C H 2 CH 2 N-), δ 2.36 (t, -C H 2 CONH-), δ 2.42 (t, -C H 2 N-), δ 2.65 (t, -C H 2 CH 2 CONH-), δ 2.79 (t , -C H 2 NH 2 ), δ 3.28 (m, -C H 2 CH 2 NH 2 ), δ 8.67 (m, -CON H- ).
製造例１．３
シリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒 石油エーテル：ジエチルエーテル＝2：1, v/v、のちクロロホルム：メタノール＝95：5, v/v）で精製した（収率87.3%）。
1H NMR (CDCl3): δ 0.88 (m, CH 3(CH2)9-), δ 1.26 (s, CH3(CH 2)9-), δ 1.43 (m, -CH 2CH2N-), δ 2.34 (t, -CH 2CONH-), δ 2.42 (m, -CH 2COOCH3), δ 2.44 (m, -CH 2N-), δ 2.54 (t, -CONHCH2CH 2-), δ 2.71 (t, -CH 2CH2CONH-), δ 2.78 (t, -CH 2CH2COOCH3), δ 3.29 (m, -CONHCH 2-), δ 3.67 (s, -OCH 3), δ 7.79 (m, -CONH-).
Production Example 1.3
The product was purified by silica gel chromatography (developing solvent: petroleum ether: diethyl ether = 2: 1, v / v, then chloroform: methanol = 95: 5, v / v) (yield 87.3%).
1 H NMR (CDCl 3): δ 0.88 (m, C H 3 (CH 2) 9 -), δ 1.26 (s, CH 3 (C H 2) 9 -), δ 1.43 (m, -C H 2 CH 2 N-), δ 2.34 (t, -C H 2 CONH-), δ 2.42 (m, -C H 2 COOCH 3 ), δ 2.44 (m, -C H 2 N-), δ 2.54 (t,- CONHCH 2 C H 2- ), δ 2.71 (t, -C H 2 CH 2 CONH-), δ 2.78 (t, -C H 2 CH 2 COOCH 3 ), δ 3.29 (m, -CONHC H 2- ), δ 3.67 (s, -OC H 3 ), δ 7.79 (m, -CON H- ).
製造例１．４
1H NMR (CDCl3): δ 0.88 (m, CH 3(CH2)9-), δ 1.26 (s, CH3(CH 2)9-), δ 1.42 (m, -CH 2CH2N-), δ 2.17 (m, -NH 2), δ 2.32 (m, -CH 2CONHCH2CH2NH2), δ 2.36 (m, -CH 2CONH-), δ 2.42 (m, -CH 2N-), δ 2.50 (t, -CONHCH2CH 2-), δ 2.67 (t, -CH 2CH2CONH-), δ 2.74 (t, -CH 2CH2CONHCH2CH2NH2), δ 2.83 (t, -CH 2NH2), δ 3.22 (m, -CONHCH 2-), δ 3.29 (m, -CH 2CH2NH2), δ 7.35 and 8.64 (m, -CONH-).
Production Example 1.4
1 H NMR (CDCl 3): δ 0.88 (m, C H 3 (CH 2) 9 -), δ 1.26 (s, CH 3 (C H 2) 9 -), δ 1.42 (m, -C H 2 CH 2 N-), δ 2.17 (m, -N H 2 ), δ 2.32 (m, -C H 2 CONHCH 2 CH 2 NH 2 ), δ 2.36 (m, -C H 2 CONH-), δ 2.42 (m , -C H 2 N-), δ 2.50 (t, -CONHCH 2 C H 2- ), δ 2.67 (t, -C H 2 CH 2 CONH-), δ 2.74 (t, -C H 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 NH 2 ), δ 2.83 (t, -C H 2 NH 2 ), δ 3.22 (m, -CONHC H 2- ), δ 3.29 (m, -C H 2 CH 2 NH 2 ), δ 7.35 and 8.64 (m, -CON H- ).
製造例１．５
製造例１．４で得られた化合物(1.7 g, 2.0 mmol)を、メタノール(78 ml)に溶解した。この溶液を、アクリル酸メチル(145 ml, 1.6 mol)に徐々に加え、窒素雰囲気において35℃で50時間撹拌した。その後、未反応のアクリル酸メチルとメタノールを減圧留去し、シリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒 クロロホルム、のちクロロホルム：メタノール＝9：1, v/v）で精製した（収率：86.9%）。
1H NMR (CDCl3): δ 0.88 (m, CH 3(CH2)9-), δ 1.25 (s, CH3(CH 2)9-), δ 1.43 (m, -CH 2CH2N-), δ 2.37 (m, -CH 2COOCH3), δ 2.43 (m, -CH 2N-), δ 2.54 (m, -CONHCH2CH 2-), δ 2.75 (m, -CH 2CH2COOCH3), δ 3.29 (m, -CONHCH 2-), δ 3.67 (s, -OCH 3), δ 7.00 and 8.04 (m, -CONH-).
The compound (1.7 g, 2.0 mmol) obtained in Production Example 1.4 was dissolved in methanol (78 ml). This solution was gradually added to methyl acrylate (145 ml, 1.6 mol) and stirred at 35 ° C. for 50 hours in a nitrogen atmosphere. Thereafter, unreacted methyl acrylate and methanol were distilled off under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel chromatography (developing solvent chloroform, then chloroform: methanol = 9: 1, v / v) (yield: 86.9%).
1 H NMR (CDCl 3): δ 0.88 (m, C H 3 (CH 2) 9 -), δ 1.25 (s, CH 3 (C H 2) 9 -), δ 1.43 (m, -C H 2 CH 2 N-), δ 2.37 (m, -C H 2 COOCH 3 ), δ 2.43 (m, -C H 2 N-), δ 2.54 (m, -CONHCH 2 C H 2- ), δ 2.75 (m, -C H 2 CH 2 COOCH 3 ), δ 3.29 (m, -CONHC H 2- ), δ 3.67 (s, -OC H 3 ), δ 7.00 and 8.04 (m, -CON H- ).
製造例１．６
製造例１．５で得られた化合物(2.1 g, 1.7 mmol)を、メタノール(47 ml)に溶解した。この溶液を、シアン化ナトリウム(33 mg, 0.68 mmol)を含むエチレンジアミン(148 ml, 2.2 mol)に徐々に加え、窒素雰囲気において45℃で52時間撹拌した。その後、未反応のエチレンジアミンとメタノールを減圧留去し、Sephadex LH-20カラム（溶離液：メタノール）を用いて精製した（収率：82.6%）。
1H NMR (CDCl3): δ 0.88 (m, CH 3(CH2)9-), δ 1.26 (s, CH3(CH 2)9-), δ 1.42 (m, -CH 2CH2N-), δ 2.09 (m,-NH 2), δ 2.32 (m, -CH 2CONHCH2CH2NH2), δ 2.37 (m, -CH 2N-), δ 2.53 (m, -CONHCH2CH 2-), δ 2.73 (m, -CH 2CH2CONHCH2CH2NH2), δ 2.82 (m, -CH 2NH2), δ 3.24 (m, -CONHCH 2-), δ 3.28 (m, -CH 2CH2NH2), δ 7.64, 7.87 and 8.58 (m, -CONH-).
The compound (2.1 g, 1.7 mmol) obtained in Production Example 1.5 was dissolved in methanol (47 ml). The solution was gradually added to ethylenediamine (148 ml, 2.2 mol) containing sodium cyanide (33 mg, 0.68 mmol) and stirred at 45 ° C. for 52 hours in a nitrogen atmosphere. Thereafter, unreacted ethylenediamine and methanol were distilled off under reduced pressure and purified using a Sephadex LH-20 column (eluent: methanol) (yield: 82.6%).
1 H NMR (CDCl 3): δ 0.88 (m, C H 3 (CH 2) 9 -), δ 1.26 (s, CH 3 (C H 2) 9 -), δ 1.42 (m, -C H 2 CH 2 N-), δ 2.09 (m, -N H 2 ), δ 2.32 (m, -C H 2 CONHCH 2 CH 2 NH 2 ), δ 2.37 (m, -C H 2 N-), δ 2.53 (m , -CONHCH 2 C H 2- ), δ 2.73 (m, -C H 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 NH 2 ), δ 2.82 (m, -C H 2 NH 2 ), δ 3.24 (m, -CONHC H 2- ), δ 3.28 (m, -C H 2 CH 2 NH 2 ), δ 7.64, 7.87 and 8.58 (m, -CON H- ).
製造例２ Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第３世代）の製造
製造例２．１
製造例１．６で得られた化合物(0.77 g, 0.59 mmol)を、メタノール(50 ml)に溶解した。この溶液を、アクリル酸メチル(45 ml, 0.50 mol)に徐々に加え、窒素雰囲気において30℃で50時間撹拌した。その後、未反応のアクリル酸メチルとメタノールを減圧留去し、シリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒 クロロホルム：メタノール＝95：5, v/v、のち80：20, v/v）で精製した（収率：56.4%）。
1H NMR (CDCl3): δ 0.88 (m, CH 3(CH2)9-), δ 1.26 (s, CH3(CH 2)9-), δ 1.45 (m, -CH 2CH2N-), δ 2.37 (m, -CH 2COOCH3), δ 2.45 (m, -CH 2N-), δ 2.56 (m, -CONHCH2CH 2-), δ 2.76 (m, -CH 2CH2COOCH3), δ 3.28 (m, -CONHCH 2-), δ 3.67 (s, -OCH 3), δ 7.07, 7.63 and 8.08 (m, -CONH-).
The compound (0.77 g, 0.59 mmol) obtained in Production Example 1.6 was dissolved in methanol (50 ml). The solution was gradually added to methyl acrylate (45 ml, 0.50 mol) and stirred at 30 ° C. for 50 hours in a nitrogen atmosphere. Thereafter, unreacted methyl acrylate and methanol were distilled off under reduced pressure and purified by silica gel chromatography (developing solvent: chloroform: methanol = 95: 5, v / v, then 80:20, v / v) (yield: 56.4%).
1 H NMR (CDCl 3): δ 0.88 (m, C H 3 (CH 2) 9 -), δ 1.26 (s, CH 3 (C H 2) 9 -), δ 1.45 (m, -C H 2 CH 2 N-), δ 2.37 (m, -C H 2 COOCH 3 ), δ 2.45 (m, -C H 2 N-), δ 2.56 (m, -CONHCH 2 C H 2- ), δ 2.76 (m, -C H 2 CH 2 COOCH 3 ), δ 3.28 (m, -CONHC H 2- ), δ 3.67 (s, -OC H 3 ), δ 7.07, 7.63 and 8.08 (m, -CON H- ).
製造例２．２
製造例２．１で得られた化合物(0.63 g, 0.31 mmol)を、メタノール(27 ml)に溶解した。この溶液を、シアン化ナトリウム(6.1 mg, 0.12 mmol)を含むエチレンジアミン(41 ml, 0.61 mol)に徐々に加え、窒素雰囲気において45℃で55時間撹拌した。その後、未反応のエチレンジアミンとメタノールを減圧留去し、Sephadex LH-20カラム（溶離液：メタノール）を用いて精製した（収率：85.3%）。
1H NMR (CDCl3): δ 0.88 (m, CH 3(CH2)9-), δ 1.25 (s, CH3(CH 2)9-), δ 1.42 (m, -CH 2CH2N-), δ 2.36 (br, -CH 2CONHCH2CH2NH2), δ 2.54 (br, -CONHCH2CH 2-), δ 2.74 (br, -CH 2CH2CONHCH2CH2NH2), δ 2.83 (br, -CH 2NH2), δ 3.26 (br, -CONHCH 2-), δ 3.29 (br, -CH 2CH2NH2), δ 7.75, 7.97 and 8.55 (br, -CONH-).
The compound (0.63 g, 0.31 mmol) obtained in Production Example 2.1 was dissolved in methanol (27 ml). The solution was gradually added to ethylenediamine (41 ml, 0.61 mol) containing sodium cyanide (6.1 mg, 0.12 mmol) and stirred at 45 ° C. for 55 hours in a nitrogen atmosphere. Thereafter, unreacted ethylenediamine and methanol were distilled off under reduced pressure and purified using a Sephadex LH-20 column (eluent: methanol) (yield: 85.3%).
1 H NMR (CDCl 3): δ 0.88 (m, C H 3 (CH 2) 9 -), δ 1.25 (s, CH 3 (C H 2) 9 -), δ 1.42 (m, -C H 2 CH 2 N-), δ 2.36 (br, -C H 2 CONHCH 2 CH 2 NH 2 ), δ 2.54 (br, -CONHCH 2 C H 2- ), δ 2.74 (br, -C H 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 NH 2 ), δ 2.83 (br, -C H 2 NH 2 ), δ 3.26 (br, -CONHC H 2- ), δ 3.29 (br, -C H 2 CH 2 NH 2 ), δ 7.75, 7.97 and 8.55 (br, -CON H- ).
製造例３ Ｃ12ポリアミドアミンデンドロン脂質（第２世代）の製造
上記の製造例１．１において、ジ−ｎ−オクタデシルアミンの代わりにジ−ｎ−ドデシルアミンを用いた以外は、製造例１と同様にして、Ｃ12ポリアミドアミンデンドロン脂質（第２世代）を製造した。
Production Example 3 C 12 polyamidoamine dendron lipid (second generation) Production of Preparation 1.1, except for using di -n- dodecylamine in place of di -n- octadecylamine, as in Preparation Example 1 Similarly, to produce a C 12 polyamidoamine dendron lipid (second generation).
製造例４ Ｃ12ポリアミドアミンデンドロン脂質（第３世代）の製造
製造例２において、製造例１で得られた化合物の代わりに製造例３で得られた化合物を用いた以外は、製造例２と同様にして、Ｃ12ポリアミドアミンデンドロン脂質（第３世代）を製造した。
In Production Example 2 Production Example 4 C 12 polyamidoamine dendron lipids (third generation), except for using the compound obtained in Production Example 3 in place of the compound obtained in Production Example 1, Production Example 2 Similarly, to produce a C 12 polyamidoamine dendron lipids (third generation).
実施例１ イソブチリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第２世代）の合成
製造例１で製造した化合物(83 mg, 63μmol)を、トリエチルアミン(TEA) (139μl, 1.0 mmol)を含むクロロホルム(3.8 ml)に溶解した。この溶液に、氷冷下にて塩化イソブチリル(52μl, 0.50 mmol、キシダ化学社製)を徐々に加え、窒素雰囲気において27時間撹拌した。その後、未反応の塩化イソブチリル、及びTEAとクロロホルムを減圧留去し、Sephadex LH-20カラム（溶離液：メタノール）を用いて精製した（収率：79.7%）。
1H NMR (CDCl3): δ 0.88 (m, CH 3(CH2)9-), δ 1.14 (s, -CH(CH 3)2), δ 1.25 (s, CH3(CH 2)9-), δ 1.32 (m, -CH 2CH2N-), δ 2.32 (m, -CH 2CONHCH2CH2NHCO-), δ 2.35 (m, -CH 2N-), δ 2.43 (m, -CH(CH3)2), δ 2.53 (m, -CONHCH2CH 2-), δ 2.72 (m, -CH 2CH2CONHCH2CH2NHCO-), δ 3.24 (m, -CONHCH 2-), δ 3.34 (m, -CH 2CH2NHCO-), δ 7.26, 7.30 and 8.00 (m, -CONH-).
The compound produced in Production Example 1 (83 mg, 63 μmol) was dissolved in chloroform (3.8 ml) containing triethylamine (TEA) (139 μl, 1.0 mmol). To this solution, isobutyryl chloride (52 μl, 0.50 mmol, manufactured by Kishida Chemical Co., Ltd.) was gradually added under ice cooling, and the mixture was stirred for 27 hours in a nitrogen atmosphere. Thereafter, unreacted isobutyryl chloride, TEA and chloroform were distilled off under reduced pressure and purified using a Sephadex LH-20 column (eluent: methanol) (yield: 79.7%).
1 H NMR (CDCl 3): δ 0.88 (m, C H 3 (CH 2) 9 -), δ 1.14 (s, -CH (C H 3) 2), δ 1.25 (s, CH 3 (C H 2 ) 9 -), δ 1.32 ( m, -C H 2 CH 2 N-), δ 2.32 (m, -C H 2 CONHCH 2 CH 2 NHCO-), δ 2.35 (m, -C H 2 N-), δ 2.43 (m, -C H (CH 3 ) 2 ), δ 2.53 (m, -CONHCH 2 C H 2- ), δ 2.72 (m, -C H 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 NHCO-), δ 3.24 (m, -CONHC H 2- ), δ 3.34 (m, -C H 2 CH 2 NHCO-), δ 7.26, 7.30 and 8.00 (m, -CON H- ).
実施例１で得られた化合物について、1H NMRにおけるオクタデシル基末端のメチル基に由来する0.88ppm付近のピークの積分比と、導入されたイソブチリル基のメチル基に由来する1.14ppm付近のピークの積分比から、１分子当たりに導入されたイソブチリル基の数を求めたところ、４．１であった。 For the compound obtained in Example 1, the integration ratio of the peak around 0.88 ppm derived from the methyl group at the end of the octadecyl group in 1 H NMR and the peak around 1.14 ppm derived from the methyl group of the introduced isobutyryl group The number of isobutyryl groups introduced per molecule was determined from the integration ratio and found to be 4.1.
実施例２ イソブチリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第３世代）の合成
製造例２で得られた化合物(110 mg, 49μmol)を、TEA(219μl, 1.6 mmol)を含むクロロホルム(3.7 ml)に溶解した。この溶液に、氷冷下にて塩化イソブチリル(83μl, 0.79 mmol)を徐々に加え、窒素雰囲気において3日間撹拌した。その後、未反応の塩化イソブチリル、およびTEAとクロロホルムを減圧留去し、pH 8.0に調製したリン酸緩衝液中で透析した後、更に蒸留水中で透析することによって精製した（収率：81.3%）。
1H NMR (CDCl3): δ 0.88 (m, CH 3(CH2)9-), δ 1.14 (s, -CH(CH 3)2), δ 1.25 (s, CH3(CH 2)9-), δ 1.42 (m, -CH 2CH2N-), δ 2.36 (br, -CH 2CONHCH2CH2NHCO-), δ 2.41 (m, -CH(CH3)2), δ 2.53 (br, -CONHCH2CH 2-), δ 2.72 (br, -CH 2CH2CONHCH2CH2NHCO-), δ 3.25 (br, -CONHCH 2-), δ 3.35 (br, -CH 2CH2NHCO-), δ 7.24, 7.72, 7.82 and 8.02 (br, -CONH-).
The compound (110 mg, 49 μmol) obtained in Production Example 2 was dissolved in chloroform (3.7 ml) containing TEA (219 μl, 1.6 mmol). To this solution, isobutyryl chloride (83 μl, 0.79 mmol) was gradually added under ice-cooling, and the mixture was stirred in a nitrogen atmosphere for 3 days. Thereafter, unreacted isobutyryl chloride, TEA and chloroform were distilled off under reduced pressure, dialyzed in a phosphate buffer adjusted to pH 8.0, and further purified by dialyzing in distilled water (yield: 81.3%). .
1 H NMR (CDCl 3): δ 0.88 (m, C H 3 (CH 2) 9 -), δ 1.14 (s, -CH (C H 3) 2), δ 1.25 (s, CH 3 (C H 2 ) 9 -), δ 1.42 ( m, -C H 2 CH 2 N-), δ 2.36 (br, -C H 2 CONHCH 2 CH 2 NHCO-), δ 2.41 (m, -C H (CH 3) 2 ), δ 2.53 (br, -CONHCH 2 C H 2- ), δ 2.72 (br, -C H 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 NHCO-), δ 3.25 (br, -CONHC H 2- ), δ 3.35 ( br, -C H 2 CH 2 NHCO-), δ 7.24, 7.72, 7.82 and 8.02 (br, -CON H- ).
実施例２で得られた化合物について、1H NMRにおけるオクタデシル基末端のメチル基に由来する0.88ppm付近のピークの積分比と、導入されたイソブチリル基のメチル基に由来する1.14ppm付近のピークの積分比から、１分子当たりに導入されたイソブチリル基の数を求めたところ、７．７であった。 For the compound obtained in Example 2, the integration ratio of the peak around 0.88 ppm derived from the methyl group at the end of the octadecyl group in 1 H NMR and the peak around 1.14 ppm derived from the methyl group of the introduced isobutyryl group The number of isobutyryl groups introduced per molecule was determined from the integration ratio and found to be 7.7.
実施例３ ブチリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第２世代）の合成
製造例１で製造した化合物(0.19 g, 0.14 mmol)を、トリエチルアミン(TEA) (0.31 ml, 2.2 mmol)を含むクロロホルム(3.7 ml)に溶解した。この溶液に、氷冷下にて塩化ブチリル(0.12 ml, 1.12 mmol、キシダ化学社製)を徐々に加え、窒素雰囲気において20時間撹拌した。その後、未反応の塩化ブチリル、及びTEAとクロロホルムを減圧留去し、Sephadex LH-20カラム（溶離液：メタノール）を用いて精製した（収率：57.8%）。
1H NMR (CDCl3): δ0.88 (m, CH 3(CH2)9-),δ0.95 (m, CH 3(CH2)2CO-),δ1.26 (s, CH3(CH 2)9-),δ1.42 (m, -CH 2CH2N-),δ1.65 (m, CH3CH 2CH2CO-),δ2.17 (t, CH3CH2CH 2CO-),δ2.36 (br, -CH 2CONHCH2CH2NHCO-),δ2.53 (br, -CONHCH2CH 2-),δ2.73 (br, -CH 2CH2CONHCH2CH2NHCO-),δ3.24 (m, -CONHCH 2-),δ3.35 (m, -NHCH 2CH2NH-),δ3.35 (m, -NHCH2CH 2NH-),δ7.18, 7.64, 7.87 and 8.58 (m, -CONH-).
The compound (0.19 g, 0.14 mmol) produced in Production Example 1 was dissolved in chloroform (3.7 ml) containing triethylamine (TEA) (0.31 ml, 2.2 mmol). To this solution, butyryl chloride (0.12 ml, 1.12 mmol, manufactured by Kishida Chemical Co., Ltd.) was gradually added under ice cooling, followed by stirring for 20 hours in a nitrogen atmosphere. Thereafter, unreacted butyryl chloride, TEA and chloroform were distilled off under reduced pressure, and the residue was purified using a Sephadex LH-20 column (eluent: methanol) (yield: 57.8%).
1 H NMR (CDCl 3): δ0.88 (m, C H 3 (CH 2) 9 -), δ0.95 (m, C H 3 (CH 2) 2 CO -), δ1.26 (s, CH 3 (C H 2) 9 - ), δ1.42 (m, -C H 2 CH 2 N -), δ1.65 (m, CH 3 C H 2 CH 2 CO -), δ2.17 (t, CH 3 CH 2 C H 2 CO-), δ2.36 (br, -C H 2 CONHCH 2 CH 2 NHCO-), δ2.53 (br, -CONHCH 2 C H 2- ), δ2.73 (br,- C H 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 NHCO -), δ3.24 (m, -CONHC H 2 -), δ3.35 (m, -NHC H 2 CH 2 NH -), δ3.35 (m, -NHCH 2 C H 2 NH-), δ 7.18, 7.64, 7.87 and 8.58 (m, -CON H- ).
実施例４ ブチリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第３世代）の合成
実施例２において、塩化イソブチリルの代わりに塩化ｎ−ブチリルを用いることにより、ブチリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第３世代）を合成できる。
Synthesis Example 2 Example 4 butyryl group containing C 18 polyamidoamine dendron lipids (third generation), the use of chloride n- butyryl instead of isobutyryl chloride, butyryl group containing C 18 polyamidoamine dendron lipids (Third Generation).
実施例５ バレリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第２世代）の合成
実施例１において、塩化イソブチリルの代わりに塩化バレロイルを用いることにより、バレリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第２世代）を合成できる。
Example 5 Synthesis of valeryl group-containing C18 polyamidoamine dendron lipid (second generation) In Example 1, valeroyl chloride was used in place of isobutyryl chloride to obtain valeryl group-containing C18 polyamidoamine dendron lipid (second generation). Can be synthesized.
実施例６ バレリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第３世代）の合成
実施例２において、塩化イソブチリルの代わりに塩化バレロイルを用いることにより、バレリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第３世代）を合成できる。
Example 6 Synthesis of valeryl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipid (third generation) In Example 2, by using valeroyl chloride instead of isobutyryl chloride, valeryl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipid (third generation) Can be synthesized.
実施例７ ヘキサノイル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第２世代）の合成
実施例１において、塩化イソブチリルの代わりに塩化ヘキサノイルを用いることにより、ヘキサノイル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第２世代）を合成できる。
Example 7 Synthesis of hexanoyl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipid (second generation) In Example 1, hexanoyl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipid (second generation) was used instead of isobutyryl chloride. Can be synthesized.
実施例８ ヘキサノイル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第３世代）の合成
実施例２において、塩化イソブチリルの代わりに塩化ヘキサノイルを用いることにより、ヘキサノイル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第３世代）を合成できる。
Example 8 hexanoyl containing C 18 polyamidoamine dendron lipid Synthesis Example 2 (third generation), by using hexanoyl chloride instead of isobutyryl chloride, hexanoyl group containing C 18 polyamidoamine dendron lipids (third generation) Can be synthesized.
実施例９ イソブチリル基含有Ｃ12ポリアミドアミンデンドロン脂質（第２世代）の合成
実施例１において、製造例１で得られた化合物の代わりに、製造例３で得られた化合物を用いる以外は実施例１と同様にして、イソブチリル基含有Ｃ12ポリアミドアミンデンドロン脂質（第２世代）を合成できる。
Example 9 Synthesis of isobutyryl group-containing C 12 polyamidoamine dendron lipid (second generation) In Example 1, instead of the compound obtained in Production Example 1, the compound obtained in Production Example 3 was used. In the same manner as in 1, an isobutyryl group-containing C 12 polyamidoamine dendron lipid (second generation) can be synthesized.
実施例１０ イソブチリル基含有Ｃ12ポリアミドアミンデンドロン脂質（第３世代）の合成
実施例２において、製造例２で得られた化合物の代わりに、製造例４で得られた化合物を用いる以外は実施例２と同様にして、イソブチリル基含有Ｃ12ポリアミドアミンデンドロン脂質（第３世代）を合成できる。
Example 10 Synthesis of isobutyryl group-containing C 12 polyamidoamine dendron lipid (3rd generation) In Example 2, instead of the compound obtained in Production Example 2, the compound obtained in Production Example 4 was used. In the same manner as in 2, an isobutyryl group-containing C 12 polyamidoamine dendron lipid (third generation) can be synthesized.
比較例１ アセチル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第２世代）の合成
実施例１において、塩化イソブチリルの代わりに無水酢酸（和光純薬工業）を用いた以外は、実施例１と同様にして、アセチル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第２世代）を得た（収率：87.7%）。
1H NMR (CDCl3): δ 0.88 (m, CH 3(CH2)9-), δ 1.25 (s, CH3(CH 2)9-), δ 1.46 (m, -CH 2CH2N-), δ 1.98 (m, -COCH 3), δ 2.34 (m, -CH 2CONHCH2CH2NHCO-),δ 2.53 (m, -CONHCH2CH 2-), δ 2.72 (m, -CH 2CH2CONHCH2CH2NHCO-), δ 3.25 (m, -CONHCH 2-), δ 3.34 (m, -CH 2CH2NHCO-), δ 7.30, 7.37, 7.69 and 8.62 (m, -CONH-).
Comparative Example 1 Synthesis of acetyl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipid (second generation) In Example 1, except that acetic anhydride (Wako Pure Chemical Industries) was used instead of isobutyryl chloride, the same procedure as in Example 1 was performed. Thus, an acetyl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipid (second generation) was obtained (yield: 87.7%).
1 H NMR (CDCl 3): δ 0.88 (m, C H 3 (CH 2) 9 -), δ 1.25 (s, CH 3 (C H 2) 9 -), δ 1.46 (m, -C H 2 CH 2 N-), δ 1.98 (m, -COC H 3 ), δ 2.34 (m, -C H 2 CONHCH 2 CH 2 NHCO-), δ 2.53 (m, -CONHCH 2 C H 2- ), δ 2.72 ( m, -C H 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 NHCO-), δ 3.25 (m, -CONHC H 2- ), δ 3.34 (m, -C H 2 CH 2 NHCO-), δ 7.30, 7.37, 7.69 and 8.62 (m, -CON H- ).
比較例２ アセチル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第３世代）の合成
実施例２において、塩化イソブチリルの代わりに無水酢酸を用いた以外は、実施例２と同様にして、アセチル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第３世代）を得た（収率：77.3%）。
1H NMR (CDCl3): δ 0.88 (m, CH 3(CH2)9-), δ 1.25 (s, CH3(CH 2)9-), δ 1.46 (m, -CH 2CH2N-), δ 1.98 (m, -COCH 3) δ 2.36 (br, -CH 2CONHCH2CH2NHCO-), δ 2.53 (br, -CONHCH2CH 2-), δ 2.73 (br, -CH 2CH2CONHCH2CH2NHCO-), δ 3.25 (br, -CONHCH 2-), δ 3.33 (br, -CH 2CH2NHCO-), δ 7.58, 7.72, 7.84,7.95 and 8.60 (br, -CONH-).
Comparative Example 2 Synthesis of acetyl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipid (3rd generation) In Example 2, except that acetic anhydride was used in place of isobutyryl chloride, acetyl group-containing C 18 was used. Polyamide amine dendron lipid (3rd generation) was obtained (yield: 77.3%).
1 H NMR (CDCl 3): δ 0.88 (m, C H 3 (CH 2) 9 -), δ 1.25 (s, CH 3 (C H 2) 9 -), δ 1.46 (m, -C H 2 CH 2 N-), δ 1.98 (m, -COC H 3 ) δ 2.36 (br, -C H 2 CONHCH 2 CH 2 NHCO-), δ 2.53 (br, -CONHCH 2 C H 2- ), δ 2.73 (br , -C H 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 NHCO-), δ 3.25 (br, -CONHC H 2- ), δ 3.33 (br, -C H 2 CH 2 NHCO-), δ 7.58, 7.72, 7.84,7.95 and 8.60 (br, -CON H- ).
実験例１ イソブチリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質の温度応答性の分析１−１）試料の調製
実施例１で得られたイソブチリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第２世代）のクロロホルム溶液からロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去することにより、脂質薄膜を形成させた。これに10 mMリン酸緩衝溶液を加えて、pH 3.0、上記の脂質の濃度2 mg／ml (1.25 mM)に調整した。これにバス型超音波照射装置を用いて超音波を45℃で10分間照射した後、45℃で20分間静置した。その後、氷冷下において10分以上静置したのち、10M及び1MのNaOH水溶液を用いてpHを6.0、6.3、6.5、7.0、7.2にそれぞれ調整して、イソブチリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第２世代）分散液を得た。
Experimental Example 1 Analysis of temperature responsiveness of isobutyryl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipid 1-1) Preparation of sample From chloroform solution of isobutyryl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipid (second generation) obtained in Example 1 A lipid thin film was formed by removing the solvent using a rotary evaporator. A 10 mM phosphate buffer solution was added thereto to adjust the pH to 3.0 and the concentration of the above lipid to 2 mg / ml (1.25 mM). This was irradiated with ultrasonic waves at 45 ° C. for 10 minutes using a bath-type ultrasonic irradiation apparatus, and then allowed to stand at 45 ° C. for 20 minutes. Then, after standing for 10 minutes or more under ice cooling, the pH was adjusted to 6.0, 6.3, 6.5, 7.0, 7.2 using 10M and 1M NaOH aqueous solutions, respectively, and an isobutyryl group-containing C18 polyamidoamine dendron lipid ( A second generation) dispersion was obtained.
また、上記と同様にして、実施例２で得られたイソブチリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第３世代）の分散液を得た。この分散液のpHは、6.0、6.3、7.0、7.5、8.0、9.0に調整した。
さらに、上記と同様にして、比較例１及び２で得られたアセチル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質の分散液もそれぞれ作製した。これらの分散液のpHは、7.0とした。
Further, in the same manner as described above, a dispersion of isobutyryl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipid (third generation) obtained in Example 2 was obtained. The pH of this dispersion was adjusted to 6.0, 6.3, 7.0, 7.5, 8.0, 9.0.
Furthermore, in the same manner as described above, dispersions of acetyl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipids obtained in Comparative Examples 1 and 2 were also prepared. The pH of these dispersions was 7.0.
１−２）光学密度の測定
１−１）で得られたそれぞれのイソブチリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質分散液を、4℃から80℃まで温度変化させたときの光学密度の変化を、V-560型 紫外・可視分光光度計（日本分光社製）を用いて測定した（昇温速度1.0℃／分）。温度制御は、ETC-505Tを用いて行った。この実験において、温度の上昇に対して光学密度が急激に上昇し始める点を曇点とした。
1-2) Measurement of optical density The change in optical density when the temperature of each isobutyryl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipid dispersion obtained in 1-1) was changed from 4 ° C. to 80 ° C. -560 type ultraviolet / visible spectrophotometer (manufactured by JASCO Corporation) was used for measurement (temperature increase rate: 1.0 ° C./min). Temperature control was performed using ETC-505T. In this experiment, the cloud point was defined as the point where the optical density started to increase rapidly as the temperature increased.
pHが7.0の場合の実施例１及び２並びに比較例１及び２のポリアミドアミンデンドロン脂質分散液について、温度変化に対する光学密度の変化を示す結果を、図１及び２に示す。
図１及び２の結果から、pHが7.0の場合に、第２世代のイソブチリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質の曇点は、35℃、第３世代のイソブチリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質の曇点は、53℃であることがわかった。また、アセチル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質は、温度を変えても親水性が変化せず、温度応答性を示さないこともわかる。
For the polyamidoamine dendron lipid dispersions of Examples 1 and 2 and Comparative Examples 1 and 2 where the pH is 7.0, the results showing the change in optical density with respect to temperature change are shown in FIGS.
From the results of FIGS. 1 and 2, when the pH is 7.0, the cloud point of the second generation isobutyryl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipid is 35 ° C., and the third generation isobutyryl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipid has a cloud point. The cloud point was found to be 53 ° C. It can also be seen that the acetyl group-containing polyamidoamine dendron lipid does not change its hydrophilicity even when the temperature is changed and does not show temperature responsiveness.
実施例１及び２のイソブチリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質の温度変化に対する光学密度の変化におけるpHの影響を示すデータを、図３及び４に示す。
図３及び４の結果から、本発明の低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質の曇点は、pHによって変化することがわかる。
図４において、pH 8以上の領域では、曇点がほぼ一定となっている。これは、pH 8以上では全ての二級アミノ基が脱プロトン化しているためと考えられる。
また、第２世代のイソブチリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質はpH=6.0において、第３世代のイソブチリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質はpH=6.5において、それぞれ、温度の変化によらずに安定にベシクルの形態を保ち得ることもわかる。
Data showing the effect of pH on the change in optical density with respect to temperature change of the isobutyryl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipids of Examples 1 and 2 are shown in FIGS.
3 and 4, it can be seen that the cloud point of the lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipid of the present invention varies depending on the pH.
In FIG. 4, the cloud point is almost constant in the region of pH 8 or higher. This is probably because all secondary amino groups are deprotonated at pH 8 or higher.
The second-generation isobutyryl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipid is stable at pH = 6.0, and the third-generation isobutyryl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipid is stable at pH = 6.5, regardless of temperature change. It can also be seen that the shape of the vesicle can be maintained.
１−３）透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による粒子観測
上記の１−１）で調製したpH 7.0のイソブチリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第２世代）分散液を、4℃から25℃まで昇温させた試料と、4℃から50℃まで昇温させた試料とについて、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ；JEOL 2000、日本電子株式会社）を用いて、該分散液中の該脂質の集合体の形状を観測した。温度制御は、ETC-505Tを用いて行った（昇温速度1.0℃／分）。
また、pH 7.0のイソブチリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第３世代）分散液については、4℃から15℃まで昇温させた試料と、4℃から65℃まで昇温させた試料とについて、上記と同様にしてＴＥＭを用いて観察した。
1-3) Particle Observation by Transmission Electron Microscope (TEM) The pH 7.0 isobutyryl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipid (second generation) dispersion prepared in 1-1) above was transferred from 4 ° C. to 25 ° C. Aggregation of the lipids in the dispersion liquid using a transmission electron microscope (TEM; JEOL 2000, JEOL Ltd.) with respect to a sample heated to 4 ° C. to 50 ° C. The shape of was observed. Temperature control was performed using ETC-505T (temperature increase rate: 1.0 ° C./min).
In addition, with respect to the isobutyryl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipid (third generation) dispersion of pH 7.0, a sample heated from 4 ° C. to 15 ° C. and a sample heated from 4 ° C. to 65 ° C. The TEM was observed in the same manner as described above.
イソブチリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第２世代）分散液について、ＴＥＭの写真を図５に示す。図５において、（Ａ）は、4℃から25℃まで昇温させた試料、（Ｂ）及び（Ｃ）は、4℃から50℃まで昇温させた試料の結果を示す。
また、イソブチリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第３世代）分散液について、ＴＥＭの写真を図６に示す。図６において、（Ａ）は4℃から15℃まで昇温させた試料、（Ｂ）は4℃から65℃まで昇温させた試料の結果を示す。
A TEM photograph of the isobutyryl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipid (second generation) dispersion is shown in FIG. In FIG. 5, (A) shows the result of the sample heated from 4 ° C. to 25 ° C., and (B) and (C) show the result of the sample heated from 4 ° C. to 50 ° C.
FIG. 6 shows a TEM photograph of the isobutyryl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipid (third generation) dispersion. In FIG. 6, (A) shows the result of the sample heated from 4 ° C. to 15 ° C., and (B) shows the result of the sample heated from 4 ° C. to 65 ° C.
イソブチリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第２世代）は、曇点以下の２５℃においては、粒径が８０〜２００ｎｍのベシクルの形態であることが観察された（図５（Ａ））。しかし、同じ脂質を曇点以上の５０℃にした場合、球状の集合体は観察されず、５〜８ｎｍの幅の繊維状の構造が観察された（図５（Ｂ）及び（Ｃ））。この結果から、曇点を超える温度においては、イソブチリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第２世代）は逆ヘキサゴナル構造をとっているものと考えられる。これは、曇点以上でイソブチルアミド基が脱水和し、分子における親水性が変化したため、ベシクルから逆ヘキサゴナル構造に転移したと考えられる。 It was observed that the isobutyryl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipid (second generation) was in the form of vesicles having a particle size of 80 to 200 nm at 25 ° C. below the cloud point (FIG. 5A). However, when the same lipid was heated to 50 ° C. above the cloud point, a spherical aggregate was not observed, and a fibrous structure having a width of 5 to 8 nm was observed (FIGS. 5B and 5C). From this result, it is considered that the isobutyryl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipid (second generation) has an inverted hexagonal structure at a temperature exceeding the cloud point. This is considered to be because the isobutylamide group was dehydrated above the cloud point and the hydrophilicity in the molecule was changed, so that the vesicle was transferred to an inverted hexagonal structure.
また、イソブチリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第３世代）は、曇点以下の１５℃においては、粒径が１５〜３０ｎｍのベシクル状の集合体の形態であることが観察された（図６（Ａ））。第３世代のイソブチリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質は、より多くのイソブチリル基を有するので、第２世代のものに比べてベシクル径が小さいと考えられる。
また、曇点を超える６５℃の温度にした場合、２００〜５００ｎｍのベシクルが観察された（図６（Ｂ））。これは、温度を上昇させると、曇点以上の温度でイソブチルアミド基の脱水和が起こり、分子形状がより円筒状に近づき歪が小さな二重層をつくるため、小さな粒経のベシクルが融合し、大きな粒経のベシクルを形成したと考えられる。
Further, it was observed that the isobutyryl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipid (third generation) was in the form of a vesicle-like aggregate having a particle size of 15 to 30 nm at 15 ° C. below the cloud point (FIG. 6 (A)). The third-generation isobutyryl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipid has more isobutyryl groups and is therefore considered to have a smaller vesicle diameter than the second-generation one.
When the temperature was 65 ° C. exceeding the cloud point, vesicles of 200 to 500 nm were observed (FIG. 6B). This is because isobutylamide group dehydration occurs at a temperature higher than the cloud point when the temperature is raised, the molecular shape approaches a cylindrical shape, and a bilayer with a small strain is formed. It is thought that a large grain vesicle was formed.
実験例２
実施例１のイソブチリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第２世代）と、実施例３のブチリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第２世代）とを用いて、実験例１と同様にして、種々のpHでの曇点を調べた。
Experimental example 2
Using the isobutyryl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipid (second generation) of Example 1 and the butyryl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipid (second generation) of Example 3, the same manner as in Experimental Example 1 was carried out. The cloud point at various pH values was examined.
結果を、図７に示す。図７では、実施例１（◆）及び実施例３（▲）の低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質のpH 6.3、6.5、6.8（実施例３のみ）、7.0及び7.2（実施例１のみ）での曇点を示す。
この結果から、低級アシル基の構造を変化させることにより、低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質の温度応答性を変化させ得ることがわかる。
The results are shown in FIG. In FIG. 7, the lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipids of Examples 1 (♦) and 3 (▲) at pH 6.3, 6.5, 6.8 (Example 3 only), 7.0 and 7.2 (Example 1 only). The cloud point is shown.
From this result, it is understood that the temperature responsiveness of the lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipid can be changed by changing the structure of the lower acyl group.
実験例３
実施例１のイソブチリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第２世代）（以下、Ｇ２という）のクロロホルム溶液と、実施例２のイソブチリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第３世代）（以下、Ｇ３という）のクロロホルム溶液とを、Ｇ２のモル分率（Ｇ２のモル数／全脂質モル数）がそれぞれ１．０、０．７５、０．５及び０となるように混合して、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去して脂質薄膜を形成させた。これを、10 mMリン酸緩衝溶液に溶解し、全脂質濃度を1.25μmol/mlとした。この溶液を、塩酸及び水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH 3.0に調整した。これにバス型超音波照射装置を用いて超音波を45℃で10分間照射した後、45℃で20分間静置した。その後、氷冷下において10分以上静置したのち、氷冷下でpH 7.0に調整して、Ｇ２／Ｇ３混合系の分散液を得た。
Experimental example 3
Isobutyryl-containing C 18 polyamidoamine dendron lipids in Example 1 (second generation) (hereinafter, G2 hereinafter) and a chloroform solution of isobutyryl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipid of Example 2 (third generation) (hereinafter, G3) is mixed with a chloroform solution so that the molar fraction of G2 (number of moles of G2 / number of moles of total lipids) is 1.0, 0.75, 0.5, and 0, respectively. Was used to remove the solvent to form a lipid film. This was dissolved in a 10 mM phosphate buffer solution to a total lipid concentration of 1.25 μmol / ml. This solution was adjusted to pH 3.0 using hydrochloric acid and aqueous sodium hydroxide. This was irradiated with ultrasonic waves at 45 ° C. for 10 minutes using a bath-type ultrasonic irradiation apparatus, and then allowed to stand at 45 ° C. for 20 minutes. Thereafter, the mixture was allowed to stand for 10 minutes or more under ice cooling, and then adjusted to pH 7.0 under ice cooling to obtain a dispersion of G2 / G3 mixed system.
得られたＧ２／Ｇ３混合系の温度変化に対する光学密度の変化を、実験例１−２）と同様にして測定した。
結果を、図８に示す。図８Ａでは、Ｇ２のモル分率が(a) 1.0、(b) 0.75、(c) 0.5及び(d) 0の場合の温度に対する光学密度の変化を示す。図８Ｂでは、図８Ａに基づいて得られた曇点と、Ｇ２のモル分率との関係を示す。
The change of the optical density with respect to the temperature change of the obtained G2 / G3 mixed system was measured in the same manner as in Experimental Example 1-2).
The results are shown in FIG. FIG. 8A shows the change in optical density with respect to temperature when the molar fraction of G2 is (a) 1.0, (b) 0.75, (c) 0.5, and (d) 0. FIG. 8B shows the relationship between the cloud point obtained based on FIG. 8A and the molar fraction of G2.
これらの結果から、２種以上の本発明の低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質を混合し、その混合比を変化させることにより、低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質の温度応答性を変化させ得ることがわかる。 From these results, it is possible to change the temperature responsiveness of the lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipid by mixing two or more kinds of the lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipid of the present invention and changing the mixing ratio thereof. I understand.
実験例４
実施例１のイソブチリル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第２世代）（以下、ＩＢＡＭ−Ｇ２という）のクロロホルム溶液と、比較例１のアセチル基含有Ｃ18ポリアミドアミンデンドロン脂質（第２世代）（以下、ＡＣＡＭ−Ｇ２という）のクロロホルム溶液とを、ＩＢＡＭ−Ｇ２のモル分率（ＩＢＡＭ−Ｇ２のモル数／全脂質モル数）がそれぞれ１．０、０．７５及び０．５となるように混合した以外は、実験例３と同様にして、ＩＢＡＭ−Ｇ２／ＡＣＡＭ−Ｇ３混合系の分散液を得た。
Experimental Example 4
A chloroform solution of the isobutyryl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipid (second generation) (hereinafter referred to as IBAM-G2) of Example 1 and the acetyl group-containing C 18 polyamidoamine dendron lipid (second generation) of Comparative Example 1 (second generation) ( Hereinafter, a chloroform solution of ACAM-G2) is adjusted so that the molar fraction of IBAM-G2 (number of moles of IBAM-G2 / number of moles of total lipids) is 1.0, 0.75, and 0.5, respectively. Except for mixing, an IBAM-G2 / ACAM-G3 mixed dispersion was obtained in the same manner as in Experimental Example 3.
得られたＩＢＡＭ−Ｇ２／ＡＣＡＭ−Ｇ３混合系の温度変化に対する光学密度の変化を、実験例１−２）と同様にして測定した。
結果を、図９に示す。図９Ａでは、ＩＢＡＭ−Ｇ２のモル分率が(a) 1.0、(b) 0.75及び(c) 0.5の場合の温度に対する光学密度の変化を示す。図９Ｂでは、図９Ａに基づいて得られた曇点と、ＩＢＡＭ−Ｇ２のモル分率との関係を示す。
The change of the optical density with respect to the temperature change of the obtained IBAM-G2 / ACAM-G3 mixed system was measured in the same manner as in Experimental Example 1-2).
The results are shown in FIG. FIG. 9A shows the change in optical density with respect to temperature when the mole fraction of IBAM-G2 is (a) 1.0, (b) 0.75, and (c) 0.5. FIG. 9B shows the relationship between the cloud point obtained based on FIG. 9A and the mole fraction of IBAM-G2.
これらの結果から、本発明の低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質を、それ以外のポリアミドアミンデンドロン脂質と混合し、その混合比を変化させることにより、低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質の温度応答性を変化させ得ることがわかる。 From these results, the lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipid of the present invention was mixed with other polyamidoamine dendron lipids, and the mixing ratio was changed to change the temperature responsiveness of the lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipids. It can be seen that can be changed.
Claims (5)
ＤＬ−Ｇ２：Ｒ1Ｒ2ＮＸ(Ｘ(ＸＨ2)2)2
ＤＬ−Ｇ３：Ｒ1Ｒ2ＮＸ(Ｘ(Ｘ(ＸＨ2)2)2)2
ＤＬ−Ｇ４：Ｒ1Ｒ2ＮＸ(Ｘ(Ｘ(Ｘ(ＸＨ2)2)2)2)2
ＤＬ−Ｇ５：Ｒ1Ｒ2ＮＸ(Ｘ(Ｘ(Ｘ(Ｘ(ＸＨ2)2)2)2)2)2
ＤＬ−Ｇ６：Ｒ1Ｒ2ＮＸ(Ｘ(Ｘ(Ｘ(Ｘ(Ｘ(ＸＨ2)2)2)2)2)2)2
ＤＬ−Ｇ７：Ｒ1Ｒ2ＮＸ(Ｘ(Ｘ(Ｘ(Ｘ(Ｘ(Ｘ(ＸＨ2)2)2)2)2)2)2)2
ＤＬ−Ｇ８：Ｒ1Ｒ2ＮＸ(Ｘ(Ｘ(Ｘ(Ｘ(Ｘ(Ｘ(Ｘ(ＸＨ2)2)2)2)2)2)2)2)2
(式中、Ｒ1及びＲ2は同一又は異なって、Ｃ6〜Ｃ20アルキル基、Ｃ6〜Ｃ20アルコキシ基、フェニル、ナフチル、ビフェニル、アントラニル及びフェナントリルから選択されるアリール基又はベンジル及びフェネチルから選択されるアラルキル基を表し、Ｘは、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ＜を表す。)
のいずれかで表されるポリアミドアミンデンドロン脂質中の１以上の末端アミノ基が、炭素数３〜６の低級アシル基で置換されてなる低級アシル基含有ポリアミドアミンデンドロン脂質を含んでなり、別のベシクル又は細胞との温度依存性の融合能を有するベシクル。 Following formula:
DL-G2: R 1 R 2 NX (X (XH 2 ) 2 ) 2
DL-G3: R 1 R 2 NX (X (X (XH 2 ) 2 ) 2 ) 2
DL-G4: R 1 R 2 NX (X (X (X (XH 2 ) 2 ) 2 ) 2 ) 2
DL-G5: R 1 R 2 NX (X (X (X (X (XH 2 ) 2 ) 2 ) 2 ) 2 ) 2
DL-G6: R 1 R 2 NX (X (X (X (X (X (XH 2 ) 2 ) 2 ) 2 ) 2 ) 2 ) 2
DL-G7: R 1 R 2 NX (X (X (X (X (X (X (XH 2 ) 2 ) 2 ) 2 ) 2 ) 2 ) 2 ) 2
DL-G8: R 1 R 2 NX (X (X (X (X (X (X (X (XH 2 ) 2 ) 2 ) 2 ) 2 ) 2 ) 2 ) 2 ) 2
Wherein R 1 and R 2 are the same or different and are an aryl group selected from a C 6 to C 20 alkyl group, a C 6 to C 20 alkoxy group, phenyl, naphthyl, biphenyl, anthranyl and phenanthryl, or benzyl and phenethyl. Represents an aralkyl group selected from: X represents —CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 N <).
Comprising one or more terminal amino groups in the polyamidoamine dendron lipid represented by any one of the following: a lower acyl group-containing polyamidoamine dendron lipid substituted with a lower acyl group having 3 to 6 carbon atoms , temperature dependence of the vesicles with fusion Gono with vesicles or cells.
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