JP5264026B2 - 心疾患の早期発見のための方法 - Google Patents
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Description
関連する出願
本出願は、米国仮出願第60/049,274号（Sabbadini、“心筋虚血の早期発見のための方法（METHOD FOR EARLY DETECTION OF MYOCARDIAL ISCHEMIA）”、1997年6月10日出願）に関連し、またそれに対する優先権を主張するものである。
発明の分野
本発明は一般的に心疾患の診断の分野に関し、具体的には心不全、心臓性虚血、または低酸素を診断するために、非ポリペプチド心臓性マーカーのレベル（例えば濃度）を心臓障害（特に慢性冠動脈基礎疾患）の指標として検出し、そして心臓性虚血または低酸素を緩和するように設計した治療法のモニタリングの方法に関する。
発明の背景
虚血性心疾患は主要な型の心不全である。世界中で数百万人の人が心不全に冒されており、米国では主要な死因である。心臓性虚血の最も一般的な徴候は胸痛（狭心症）であり、これは心臓発作（急性心筋梗塞またはＡＭＩ）および突然死を引き起こす。虚血性心疾患の症状を示す個体に加え、高血圧状態、高レベルの血清コレステロール、および／または家族歴のような指標によれば、多くの他の個体が心疾患を発症する高リスクを負っている。
心筋虚血性障害が起こるのは、心血流が制限されて（虚血）、そして／または心筋への酸素の供給が損なわれて（低酸素）心臓の酸素必要量が満たされない場合である。冠動脈のアテローム硬化症は、狭心症のような虚血に伴う症状の最も一般的な原因である。虚血および低酸素は一過性および可逆性でありうるが、また、梗塞も引き起こしうる。梗塞の際、心組織が損傷し、心臓の細胞は透過性となり、その内容物の一部を周辺環境に放出するが、それには心酵素および他の生化学的マーカーがある。これらの細胞マーカーにはクレアチンキナーゼ（ＣＫ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の酵素活性、およびクレアチンキナーゼ−ＭＢ（ＣＫＭＢ）、およびトロポニン（ＩおよびＴ）、およびミオグロビンの質量レベルがあるが、その後それらを血清中で検出できる。
現在の診断法は一般に、兆候が現れた後で心組織の損傷の程度を評価する。しかしながらその時点では、疾患はＡＭＩが切迫しているか、または既に起こってしまっている程度にまで進行しているかもしれない。現在の方法で梗塞を発見および確認するためには、多くの場合に緊急の状態で得られる時間より長時間が必要であるが、そのような状態では迅速な評価が効果的な患者の治療および生存に重要である。更に、約２５％のＡＭＩ患者は不定型な症状を示し、多くの既知のテストは誤って陰性となり、結果としてＡＭＩを有する患者の約５％は故意にではなく除かれる（Mair J. ら,Clin.Chem.41：1266-1272,1995；Newby L.K.ら,Clin.Chem.41：1263-1265,1995）。救急医療施設では、ＡＭＩの疑いのある患者の心電図検査（ＥＣＧ）によるモニタリングは最も迅速なＡＭＩの発見方法であるが、ＡＭＩ患者の約半数しかうまく発見できない（Mairら,1995）。
心電図検査および現在可能な血液診断試験は一般に、ＡＭＩに関連する損傷に先立つ心筋虚血の早期発見には効果的でなく、それは試験が梗塞に関連する組織の損傷を検出するためである。それらは慢性冠動脈基礎疾患、および結果として起こる心筋虚血（ＡＭＩに関連する損傷に先立って起こる）の早期発見には効果的でない。現在、慢性冠動脈基礎疾患の診断のみが運動ストレスを負荷してＥＣＧでモニタリングされ（例えばトレッドミル運動負荷試験）、一般的に狭心症の症状の確認に使用される。そのようなストレス試験は、一般に、患者が症状を経験し、治療が求められた後（例えば救急医療施設で）行われる。ストレス試験は無症状の患者のスクリーニングに使用されることもあるが、試験は費用が高く、時間がかかり、そして一般的に多数の患者のルーチンのスクリーニングを行うことができない。更に、運動ストレス試験による評価は約１５％の誤った陰性結果を生じる。
診断試験が開発されてきており、心臓のタンパク質を使用して患者の胸痛の原因が心臓かどうか、もしそうであれば、患者が心筋梗塞に罹患したかどうか、または不安定狭心症に罹患しているかどうかの測定が行われてきた（例えば米国特許第5,290,678号、5,604,105号、および5,710,008号を参照）。これらの試験では、やがて起こる心筋梗塞がいつであるかを早期に予告することはできない。従って、非侵襲性で、感度が高く、そして確実な治療のポイントとなる‘ベッドサイド試験’が心臓性虚血の早期発見のために、特に心疾患のリスクを有する人に必要とされている。
無症状の心臓性虚血を発見するための（特に心疾患のリスクが高い人についてスクリーニングを行うための）迅速かつ確実な方法の必要性の観点から、本発明は心臓性虚血または低酸素のための初期検出アッセイである。
発明の概要
本発明は、哺乳類（特にヒト）における心疾患（例えば心不全、心臓性虚血、および心臓性低酸素）の早期発見のための、非ポリペプチド心臓性マーカー（例えばスフィンゴシンおよび／またはその代謝産物）の血清中もしくは全血中のレベルをモニタリングすることによる診断法を提供する。例えば、心臓性虚血（すなわち心臓への血液供給の不足）の過程における初期事象は、心筋によるある種の天然に存在する非ポリペプチド化合物、または心臓性マーカーの過剰生成であるが、それらは例えば（しかしそれに限定されるものではないが）、スフィンゴシン（ＳＰＨ；Ｄ（＋）−エリトロ−２−アミノ−４−トランス−オクタデセン−１，３−ジオールまたはスフィンゲニン）、その異性体、および代謝産物；セラミド（Ｃｅｒ、ｎ−アシルスフィンゴシン）、スフィンゴシン−１−ホスフェート（Ｓ１Ｐ）、スフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ、リソスフィンゴミエリン）、およびグリコスフィンゴ脂質、そしてリソホスファチジン酸（ＬＰＡ）のようなリソリン脂質、そして上記のいずれかの代謝物である。本発明は、ＳＰＨの血清中での増加の観察に基づくが、これは血中のスフィンゴ脂質レベルは心臓性虚血の新しい生化学マーカーとなることを示唆している。
証拠が示すところによれば、心臓を供給源とする腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）は、心臓性虚血によって起こる特徴的な血清スフィンゴ脂質の上昇の原因でありうる。従って、本発明の好ましい態様では、血清中のＳＰＨレベル、またはスフィンゴシン・バックボーンを有する他の関連脂質のレベルを、二次的マーカー（例えば血清ＴＮＦα）のレベルと組み合わせて、虚血の指標として使用する。もちろん、他の非ポリペプチド心臓性マーカーをＴＮＦαのような二次的マーカーと共に使用してそのような指標を計算してもよい。この２つの分析物による測定を心筋リスク因子（ＭＲＦ）と呼ぶ。
本発明にかかるキットは費用効果がある迅速な試験を提供し、これを使用して他の心臓の状態の中から急性心筋梗塞（ＡＭＩ）を同定および予言し、また狭心症が心臓性虚血によって起こることを確認できる。更に、本発明を使用して症状が現れる前の初期の虚血または低酸素事象の簡単なスクリーニングを、例えば心疾患のリスクが高い人、および他の型の心不全（心筋炎、心筋症、そして、うっ血性およびidopathic心不全を含む）を経験している人に行うことができる。更に、本発明にかかる方法および組成物を使用して、虚血および心不全を軽減するように設計した治療介在物の効果をモニタリングできる。
従って、ある観点では、本発明は哺乳類において心臓性虚血または低酸素を特徴とする心疾患を検出する方法を提供し、その方法は以下の段階を含む：（ａ）哺乳類由来の試験サンプル中の非ポリペプチド心臓性マーカーのレベルを測定し；そして（ｂ）試験サンプル中で測定された心臓性マーカーのレベルが心臓性虚血または低酸素と関係があるかどうかを確認する。
“虚血”は心筋に十分な血液供給がなされない状態を意味し、また“低酸素”は心筋に十分な酸素が供給されないことを意味する。
“哺乳類”とはマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ネコ、イヌ、ブタのような生物をいい、より好ましくはサルおよび類人猿、そして最も好ましくはヒトである。
好ましい態様では、本発明の方法の験体はヒトであり、使用される試験サンプルは好ましくは体液である。体液は好ましくは血液、尿、リンパ液、および唾液からなる群から選択されるが、他のいずれの体液（血清、胃液、および胆汁のような）を使用してもよい。最も好ましくは体液は血液である。
“非ポリペプチド心臓性マーカー”とは、当業者によってペプチドとみなされず（たとえペプチド結合またはアミド結合を含有したとしても）、心臓と独特の関係を有する化合物を意味し、そのため心臓および心臓機能が化合物のソースである。
非ポリペプチド心臓性マーカーは好ましくは脂質であり、更に好ましくはスフィンゴ脂質である。“脂質”とは、水に不溶で、低極性の有機溶媒によって細胞から抽出できる物質を示す。脂質にはテルペン、ステロイド、脂肪、および脂肪酸のような化合物がある。“スフィンゴ脂質”とは、スフィンゴシン・バックボーンを共有する化合物を意味し、これは一般式ＣＨ3（ＣＨ2）14ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＮＨ2）ＣＨ2−Ｒ（式中、Ｒはいずれの有機物質でもよい）の１８炭素鎖アミノアルコールを含有する。“スフィンゴシン”とは図−１に示す、式ＣＨ3（ＣＨ2）14ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＮＨ3 +）ＣＨ2ＯＨの化合物を示す。本発明の範囲はに、スフィンゴ脂質の炭素鎖が不飽和（すなわち二重結合または三重結合）中心を含有する化合物、またはヒドロキシドまたはアミン置換基が更に有機物質で置換された化合物が含まれる。また理解されるように、“スフィンゴ脂質”とは異性体、例えばトレオ−スフィンゴシン、エリトロ−スフィンゴシン、そしてスフィンゴ脂質のＬおよびＤ異性体、並びに上記の非ポリペプチド心臓性マーカーのいずれかの代謝物をいう。
非ポリペプチド心臓性マーカーは、より好ましくはスフィンゴシンまたはその代謝物の一つである。代謝物は好ましくはセラミド（Ｃｅｒ、ｎ−アシルスフィンゴシン）、スフィンゴシン−１−ホスフェート（Ｓ１Ｐ）、スフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）、およびジヒドロスフィンゴシン（ＤＨＳＰＨ）からなる群から選択される。これらの代謝物の構造を図−１に示す。
好ましい態様では、本発明の方法の測定段階は、クロマトグラフィー、イムノアッセイ、酵素アッセイ、および分光法からなる群から選択される方法によるマーカーのレベルの測定を含み、心臓性マーカーを直接または間接的に検出する。“マーカーのレベル”とはサンプルまたは哺乳類中のマーカーの量を意味し、濃度、質量、モル、容量（好ましくは濃度）の単位、またはサンプル中に存在するマーカーの量を示す他の基準をいう。
クロマトグラフィー法は好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）である。分光法は、好ましくは紫外分光法（ＵＶまたはＵＶ／ＶＩＳ分光法）、赤外分光法（ＩＲ）、および核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）からなる群から選択される。
イムノアッセイは好ましくはＣｅｒ、ＳＰＨ、Ｓ１Ｐ、ＤＨＳＰＨ、およびＳＰＣからなる群から選択される非ポリペプチド心臓性マーカーを検出する。好ましくは、イムノアッセイは試験サンプル中の非ポリペプチド心臓性マーカーを抗マーカー抗体を使用して検出する。
“抗体”とは、非ポリペプチド心臓性マーカーに対する特異的結合親和性を有するモノクローナルもしくはポリクローナルの抗体もしくは抗体フラグメントをいう。
“特異的結合親和性”とは、特定の条件下で、抗体または抗体フラグメントが、他の化合物に結合するより高い親和性で標的化合物に結合することを意味する。化合物に対する特異的結合親和性を有する抗体または抗体フラグメントをサンプル中の化合物の存在および／または量を検出する方法に使用してもよいが、これは免疫複合体が生成する条件下でサンプルを抗体もしくは抗体フラグメントと接触させ、抗体もしくは抗体フラグメントと結合した化合物の存在および／または量を検出することによる。
“ポリクローナル”とは、抗原またはその抗原機能性誘導体で免疫した動物の血清から得た抗体分子の不均質群である抗体をいう。ポリクローナル抗体を生成するために、種々のホスト動物に抗原を注射して免疫してもよい。ホストの種によって、種々のアジュバントを使用して免疫学的応答を向上してもよい。
“モノクローナル抗体”は、特定の抗原に対する抗体の実質的に均質な群である。それらは、培養液中で継代培養した細胞系によって抗体分子を生成する技術によって得てもよい。モノクローナル抗体は当業者に知られる方法で得てもよい。例えばKohlerら,Nature 256:495-497,1975および米国特許第4,376,110号を参照されたい。
“抗体フラグメント”とは抗体の一部いい、多くの場合、超可変領域と周囲のＨ鎖およびＬ鎖の部分であり、特定の分子に対して特異的結合親和性を示す。超可変領域は抗体の一部であり、標的化合物に物理的に結合する。“抗体フラグメント”という用語は１本鎖の（single change）抗体も含む。
好ましい態様では、本発明の測定段階は心臓性マーカーの濃度とマーカーに対する既定の値との比較である。好ましい態様では、既定値は正常な心臓の状態を示すものである。この既定値は、本発明の方法を使用して以下の本発明の詳細な説明に記載するように決定でき、特定の患者に特有なものであるか、または所定の個体群に一般的なものであってもよい。既定値は好ましくは試験サンプルを与える哺乳類と同一の種で、ほぼ同年齢の哺乳類から得る。ある態様では、既定値は患者が健康な時に、特定の患者のマーカーのレベルを事前に測定することによって確立しておいてもよい。
本発明の方法の実施では、試験サンプル中の非ポリペプチド心臓性マーカーのレベル（例えば濃度）は、好ましくはそのマーカーに対する既定値より高く、より高いレベルは虚血、低酸素、もしくは別の型の心不全と相互関係があるか、またはそれを示す。しかしながら、ある種の非ポリペプチド心臓性マーカーでは、試験サンプル中のマーカーのレベルは既定値より低いことが虚血、低酸素、または別の型の心不全を示してもよい。
更なる観点では、哺乳類における心不全（例えば心臓性虚血または低酸素）を検出する方法に関し、その方法は以下の段階を含む：（ａ）哺乳類由来の試験サンプル中の１種以上の非ポリペプチド心臓性マーカーのレベルを測定し；（ｂ）試験サンプル中の１種以上の二次的心臓性マーカーのレベルを測定し、そして（ｃ）試験サンプル中で測定された心臓性マーカーのレベルが心臓性虚血または低酸素と相互関係があるかどうかを確認する。二次的心臓性マーカーは、好ましくはインターロイキン（ＩＬ−１、２、または６）、インターフェロン・ガンマ（ＩＦＮγ）、および特定の腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）のような、プロ−炎症性サイトカインである。ＴＮＦαは虚血および低酸素の病態生理学と関係づけられている。当業者に認識されるように、即時的な方法および組成物は２種（またはそれ以上）の非ポリペプチド心臓性マーカーの単独での、または１種以上の二次的心臓性マーカーと合わせた測定を含んでもよい。本発明の目的では、“二次的”心臓性マーカーは心不全の根本的な原因を促進するか、またはそれに寄与する、細胞間または細胞内メッセンジャーである。本発明のこの観点の他の態様では、１種以上の“三次的”心臓性マーカーのレベルを測定し、非ポリペプチド心臓性マーカーについて測定したレベル、または非ポリペプチド心臓マーカーおよび二次的心臓性マーカーを試験したものと合わせて使用することができる。本発明の目的では、“三次的”マーカーは心臓細胞の破壊に関係するもので、一般に破裂または溶解した（lyzed）心臓細胞から放出されたタンパク質、ポリペプチド、および核酸に関する。そのようなマーカーの好ましい例にはＣＫ、ＬＤＨ、ＣＫＭＢ、およびトロポニンがある。そのような三次的心臓性マーカーの他の好ましい例には心臓細胞に特異的な核酸、特に（好ましくは心臓細胞のみで）優性に発現したｍＲＮＡがある。
別の観点では、本発明の方法は心筋リスク因子（ＭＲＦ）の推定に関する。ここで使用するように、ＭＲＦは、少なくとも１種の非ポリペプチド心臓性マーカーの測定レベル（好ましくは濃度）、および二次的心臓性マーカー（例えばＴＮＦα）の測定レベル（好ましくは濃度）と数学的関係がある。数学的関係は、好ましくは、少なくとも１種の非ポリペプチド心臓性マーカー（好ましくはスフィンゴ脂質）の測定レベル（例えば濃度）と二次的マーカー（好ましくはＴＮＦα）の測定レベル（例えば濃度）の積である。もちろん、種々のマーカー間の他の数学的関係もまた、本発明の範囲内である。例えば、そのような関係は２種の非ポリペプチド心臓性マーカー、非ポリペプチド心臓性マーカーと二次的心臓性マーカーと三次的心臓性マーカー、または非ポリペプチド心臓性マーカーと三次的マーカーを含んでもよい。
別の観点では、本発明は続いて起こる急性心筋梗塞（または他の型の心不全）を予防またはその重症度を低減する方法を提供するが、これは心臓性虚血または低酸素をここに記載するように検出し、予防策をとることによる。予防策は、好ましくは以下からなる群から選択される：冠状動脈バイパス術、予防的血管形成術、および／あるいは、治療的有効量の１種以上の抗凝固薬、血栓溶解薬、または虚血もしくは低酸素状態の緩和を意図する他の薬剤産物の投与。
更に、本発明の方法により、ヘルス・ケアの専門家は、心臓性虚血または低酸素の検出による心臓の処置後の患者の予後を決定することができる。心臓の処置は、好ましくは冠状動脈バイパス術、予防的血管形成術、および、１種以上の抗凝固薬の投与からなる群から選択されるが、他の心臓の処置も本発明の範囲内である。
別の観点では、本発明は、哺乳類において心臓性虚血または低酸素から生じうる心不全を検出するためのキットを提供する。好ましくは、そのようなキットは哺乳類から得た試験サンプル中の少なくとの１種の非ポリペプチド心臓性マーカーの異常なレベルを検出するための組成物を含む。好ましくは、組成物は定量的な異常レベルの測定を可能とするが、異常レベルの測定は半定量的に行うこともできる（例えば既定の閾値よりレベルが高いか低いか）。組成物は好ましくは基質を含み、これは好ましくはＣｅｒ、ＳＰＨ、Ｓ１Ｐ、ＤＨＳＰＨ、およびＳＰＣからなる群から選択された非ポリペプチド心臓性マーカーに結合する抗体である。組成物は、１種以上の他の基質（例えば抗ＴＮＦα抗体）を含有して他の心臓特異的マーカーを検出してもよい。基質を固相支持体に結合させて操作を容易にしてもよい。一般的な型の固相支持体にはプレート、チューブ、およびビーズがあり（しかしそれらに限定されるものではない）、それらは全てガラスまたは別の好適な物質、例えばポリスチレン、ナイロン、酢酸セルロース、ニトロセルロース、および他のポリマーで生成することができる。
“定量的”測定では、測定の段階により、試験サンプル中の心臓性マーカーのレベルを正確に示す値が得られる。“半定量的”測定では、測定の段階により、心臓性マーカーのレベルが特定の範囲内であるかどうかが示される。半定量的方法には、例えば（しかしそれらに限定されることはないが）色素指示薬または特定のシンボルの描写があるが、それぞれの色素またはシンボルは濃度範囲を表す。
好ましくは、本発明の実施において検出される心臓性マーカーのレベルは、正常な心臓の状態を示す標準的な、または参照となる基準とは異なる。より好ましくは、検出される心臓性マーカーのレベルは標準的な基準より大きい。
好ましい態様では、本発明に従って測定される心臓性マーカーのレベルは“非侵襲的な”方法、すなわち試験サンプルを採取するために被験哺乳類の皮膚に穴を開けることを必要としない方法を使用して検出する。非侵襲的方法には唾液、尿、および汗のような体液の検査、またはイメージング法の使用があるが、それらに限定されるものではない。
好ましくは、心臓性マーカーは本発明のキットを使用して、クロマトグラフィー、イムノアッセイ、酵素アッセイ、および分光法からなる群から選択される方法を用いて測定し、マーカーを直接または間接的に検出する。クロマトグラフィー法は、好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）である。分光法は、好ましくは紫外分光法、赤外分光法、および核磁気共鳴分光法からなる群から選択される。非ポリペプチド心臓性マーカーに関しては、イムノアッセイは、好ましくはＣｅｒ、ＳＰＨ、Ｓ１Ｐ、ＤＨＳＰＨ、またはＳＰＣを検出する。
別の観点では、本発明は哺乳類において心臓性虚血または低酸素を検出する装置を提供し、装置は使用者に哺乳類由来の試験サンプル中の少なくとも１種の非ポリペプチド心臓性マーカーの異常レベルの情報を提供する。
情報提供の段階は、好ましくは該心臓性マーカーを検出する段階を含み、同様に、非侵襲的方法によって実施されるのが好ましい。また情報提供の段階は、好ましくはマーカーのレベルを既定値と比較する段階を含む。最後に、情報提供の段階は好ましくは使用者（装置の着用者であってもなくてもよい）にマーカーのレベルについて警告を与える段階を含む。装置はマーカーのレベルを表示するか、マーカーのレベルが既定の閾値を上回ったときにアラームをならすか、または警察、救急車、もしくは消防署のような緊急隊員に知らせてもよい。
装置を使用する哺乳類は好ましくはヒトである。装置は、好ましくは体液について非ポリペプチド心臓性マーカーの存在を試験するものであり、マーカーは好ましくは、例えばスフィンゴシンまたはその代謝物のようなスフィンゴ脂質である。スフィンゴシン代謝物は好ましくはＣｅｒ、Ｓ１Ｐ、ＳＰＣ、およびＤＨＳＰＨからなる群から選択される。
本発明の更に別の観点は、哺乳類（特にヒト）から得た試験サンプル（好ましくは体液）中の少なくとも１種の非ポリペプチド心臓性マーカーの異常なレベル（例えば濃度）を検出するための組成物に関する。ある態様では、非ポリペプチドマーカーのレベルを定量的に測定する；他の態様では、測定は半定量的である。
この観点の好ましい態様では、組成物は抗体、抗体フラグメント、または抗体の抗原結合ドメインを含み、非ポリペプチド心臓性マーカーに特異的に結合する。抗体を使用する好ましい態様では、抗体はポリクローナルであってもよく、好ましくはモノクローナル抗体である。ある態様では、組成物によって検出される非ポリペプチド心臓性マーカーは脂質であり、好ましくはスフィンゴ脂質またはその代謝物、特にＣｅｒ、ＳＰＨ、Ｓ１Ｐ、ＤＨＳＰＨ、およびＳＰＣである。
本発明にかかる組成物は、非ポリペプチド心臓性マーカーを検出する能力のある部分に加えて、二次的心臓性マーカー（例えばＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−２，ＩＬ−６、およびＩＦＮγ）を検出する能力のある第二の部分、そして／または三次的心臓性マーカー（例えばＣＫ、ＣＫＭＢ、ＬＰＨ、トロポニン、および核酸、特に心臓細胞に特異的な核酸）を検出する能力のある第三の部分を有してもよい。三次的心臓性マーカーが核酸プローブを含む場合は、核酸のヌクレオチド配列の少なくとも十分な部分に実質的に相補的であり、ストリンジェントな条件下でプローブと核酸が選択的にハイブリダイゼーションできる。
好ましい態様では、本発明の組成物は、心臓性マーカーを検出する部分が結合している、または結合できる固相支持体を更に含有する。ある態様では、検出部分（例えば抗体または核酸プローブ）は共有結合を介して固相支持体と結合する。他の態様では、結合は非共有結合（例えば高親和性結合対のメンバー間の）であってもよい。高親和性結合対の多くの例が当該分野で知られており、ビオチン／アビジン、配位子／レセプター、および抗原／抗体のペアがある。
上記の本発明の概要は非限定的なものであり、本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な説明および請求項から明らかとなる。
図の簡単な説明
図−１に以下の化学構造を示す：スフィンゴシン（ＳＰＨ；Ｄ（＋）−エリトロ−２−アミノ−４−トランス−オクタデセン−１，３−ジオールまたはスフィンゲニン）、スフィンゴシン−１−ホスフェート（Ｓ１Ｐ）、スフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ、リソ−スフィンゴミエリン）、セラミド（Ｃｅｒ、ｎ−アシルスフィンゴシン）、およびジヒドロスフィンゴシン（ＤＨＳＰＨ；スフィンガニン）。これらの脂質は全てスフィンゴシン・バックボーンを共有し、長鎖１８−Ｃアミノアルコールを含有する。他のスフィンゴ脂質にはＮ，Ｎ−ジメチル−スフィンゴシン、スフィンゴミエリン（ｎ−アシルスフィンゴシン−１−ホスホコリン）、および種々のスフィンゴ糖脂質（セレブロシドおよびガングリオシド）がある。エリトロ、トレオ、Ｄ、Ｌ、および他のスフィンゴ脂質の異性体もまた、本発明の範囲内に含まれる。
本発明の詳細な説明
本発明は、虚血性心疾患または他の型の心不全の早期診断のための方法および組成物に関し、これはスフィンゴシン（ＳＰＨ）および／またはその代謝物のような非ポリペプチド心臓性マーカーのレベルを単独で、または１種以上の他の心臓性マーカーと合わせて、哺乳類由来の試験サンプルから検出することによる。本発明は以下のような発明者の発見に基づくものである：（例えば心臓性虚血によって起こる）心不全の経過の初期事象は心筋によるある種の非ポリペプチド心臓性マーカーの過剰生成であり、そのマーカーにはある種の脂質、中でもＳＰＨおよびその代謝物、Ｃｅｒ、Ｓ１Ｐ、ＤＨＳＰＨ、およびＳＰＣがある。
Ｉ．心筋梗塞におけるＳＰＨの役割
Ｃｅｒ、ＳＰＨ、Ｓ１Ｐ、およびＳＰＣの化学構造を図−１に示す。これらのスフィンゴ脂質は全て同一の化学バックボーンＣＨ3（ＣＨ2）12ＣＨ＝ＣＨＣ（ＯＨ）ＣＨ（ＮＨ2）ＣＨ2−を共有し、これにヒドロキシ、ホスフェート、またはホスホリルコリン部分のいずれかが結合する。図−１に示すように、バックボーンのアミノ基は正に帯電しているか、または置換されていてもよい。図−１には示していないが、ジヒドロスフィンゴシン（またはスフィンガニン）は当該分野で知られるＳＰＨの別の代謝物である（C.A.Grob,Record Chem.Progr.（Kresge-Hooker Sci.Lib.）18:55-66,1957；D.Shapiro, スフィンゴ脂質の化学（Chemistry of Sphingolipids）（Hermann,Paris,1969））。体液（例えば血液または血清）中のこれらの分子を検出する種々の方法を使用して、真性または切迫心不全（心筋虚血および低酸素状態に関連するような）を発見できる。ここに示す結果によれば、ＳＰＨおよび／またはその代謝物の体液中のレベルは心臓性虚血または低酸素に関する初期の生化学的マーカーとなる。
スフィンゴ脂質（例えばＳＰＨ、Ｓ１Ｐ、ＤＨＳＰＨ、またはＳＰＣ）を虚血性心疾患を有する患者、または心臓性虚血症状を有しないコントロールの血清から抽出し、蛍光マーカー（例えばｏ−フタルアルデヒド、ＯＰＡ）で誘導体化してクロマトグラフィーで検出してもよい。次いで、そのような誘導体化したスフィンゴ脂質を検出し、種々の方法論（ＨＰＬＣを含む）で定量することができる。
特定の理論に拘束されることは望ましくないが、データは炎症性サイトカイン、特にＴＮＦαがＳＰＨおよびその代謝物の生成を直接または間接的に増加させることを示唆している。例えば、ＴＮＦαは心臓性アシドーシスを起こし、それによってＳＭアーゼ活性が増大し、ＳＰＨの生成が増加すると考えられる。その後、ＳＰＨが心臓性カルシウムチャンネルに作用し、カルシウム放出が制御されなくなる。また、ＴＮＦαとＳＰＨの協同作用によりアポトーシスが促進され、細胞内ＳＰＨおよびその代謝物の血清中への放出が増加し、更に心筋梗塞が誘引される。発明者は、以下のことを示すデータを既に発表している：ＴＮＦαはＳＰＨの生成を活性化する（Krownら,J.Clin.Invest.98:2854-2865,1996）、そして、生成するＳＰＨおよびその代謝物は有害作用を心臓性カルシウムチャンネル（McDonoughら,Circ Res.75:981-989,1994；Dettbarnら,J.Mol.Cell.Cardiol.,26:229-242,1994；Krownら,FEBS Letters 376:24-30,1995；Sabbadiniら,J.Biol.Chem.267:15475-15484,1992；Websterら,J.Mol.Cell.Cardio.26:1273-1290,1994）および心臓性細胞死（Krownら,J.Clin.Invest.98:2854-2865,1996）に与える。
そのような心臓性低酸素および虚血は周期となり、虚血性心臓の酸性状態により過剰なＳＰＨの生成が刺激され、次いでプロトンを排出する細胞の能力が阻害される。細胞内の酸性状態の上昇により、正のフィードバックでＳＰＨの生成が更に刺激され、プロトンおよびＳＰＨの両方の細胞内レベルが更に上昇する。発明者の考えるところでは、細胞内ｐＨの低下は細胞の収縮性可動部分に対する重大な有害作用を有し、また、ＳＰＨレベルの上昇により筋小胞体膜およびＬ型カルシウムチャンネルからのカルシウムの放出が制御されなくなり、それによって細胞はビート・トゥ・ビートの収縮作用を調節できなくなる。スフィンゴ脂質介在型アシドーシスおよびカルシウムの脱調節によりアポトーシスが活性化され、細胞死およびその後の心機能の低下が起こる。ＳＰＨおよびその代謝物は心不全の早期の指標として有用であり、それはそれらの化合物が心臓性虚血および低酸素のような状態において早期に、心臓性細胞死に関係する生化学的化合物が放出される前に出現するからである。
本発明は、一部には、虚血患者ではスフィンゴ脂質の血清レベルが非虚血コントロールで検出されるより有意に高いという発見に基づいている。得られた結果によれば、心臓性虚血または低酸素に関係する心不全を診断するＳＰＨのレベルは一般に１００ｐｍｏｌ／ｍＬより高い。心臓性虚血または低酸素を診断するＳＰＨのレベルは好ましくは約２００ｐｍｏｌ／ｍＬ〜約２，５００ｐｍｏｌ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは約３００ｐｍｏｌ／ｍＬ〜約２，０００ｐｍｏｌ／ｍＬの範囲、そして最も好ましくは約４００ｐｍｏｌ／ｍＬ〜約１，５００ｐｍｏｌ／ｍＬの範囲である。
ＳＰＨの代謝物では、高い血清（または他の体液）レベルによって同様に心臓性虚血または低酸素が診断される。血清Ｓ１Ｐでは、診断レベルは一般に１００ｐｍｏｌ／ｍＬより高い。血清中の、心臓性虚血または低酸素を診断するＳ１Ｐレベルは、好ましくは約２００ｐｍｏｌ／ｍＬ〜約２，５００ｐｍｏｌ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは約３００ｐｍｏｌ／ｍＬ〜約２，０００ｐｍｏｌ／ｍＬの範囲、そして最も好ましくは約４００ｐｍｏｌ／ｍＬ〜約１，５００ｐｍｏｌ／ｍＬの範囲である。ＳＰＣでは、血清中の診断レベルは一般に１００ｐｍｏｌ／ｍＬより高い。心臓性虚血または低酸素を診断するＳＰＣレベルは、好ましくは約２００ｐｍｏｌ／ｍＬ〜約２，５００ｐｍｏｌ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは約３００ｐｍｏｌ／ｍＬ〜約２，０００ｐｍｏｌ／ｍＬの範囲、そして最も好ましくは約４００ｐｍｏｌ／ｍＬ〜約１，５００ｐｍｏｌ／ｍＬの範囲である。同様の血清レベルのＤＨＳＰＨで心臓性虚血が診断される。
ＨＰＬＣを使用して心臓性マーカー（血清のような体液中のＳＰＨのような非ポリペプチド心臓性マーカーを含む）を検出および定量できるが、そのようなマーカーを検出する他の方法も使用できる。例えば、酵素アッセイを使用して試験サンプル中のスフィンゴ脂質（または他の非ポリペプチド心臓性マーカー）を間接的に検出することができる。そのようなアッセイには、例えば、培養細胞からスフィンゴシンキナーゼを精製して共役アッセイに使用するものがあり、ピルビン酸キナーゼとその基質であるホスホエノールピルビン酸を使用して加水分解を検出する。共役反応の産物はピルビン酸であり、その後この産物によって起こるｐＨの降下を種々の既知の方法（インピーダンスに測定可能な変化を生じるｐＨ依存性ポリマーの破壊の検出のような）で検出する。同様に、血液または血清中のスフィンゴシンキナーゼは、ルシフェラーゼを使用してＡＴＰの加水分解を検出する共役アッセイで検出することができる。そのようなアッセイはＳＰＨ（Ｓ１ＰまたはＳＰＣではない）の血中レベルを間接的に検出するのに好適である。
種々の既知の方法を使用する免疫診断アッセイを使用して心臓性マーカー（スフィンゴ脂質およびその代謝物のような非ポリペプチド心臓性マーカーを含む）を体液（血液または血清を含む）中で検出することができる。Ｃｅｒ、ＳＰＨ、ＤＨＳＰＨ、Ｓ１Ｐ、およびＳＰＣに特異的な抗体および抗体フラグメント、そして他のそのようなマーカーを生成し、１種以上のそのようなマーカーの存在を、全血、血清または他の体液中で、標準的なイムノアッセイを使用して、定量的または半定量的に検出することができる。同様に、抗スフィンゴ脂質（または他の非ポリペプチド心臓性マーカー）抗体の存在を体液中で検出するイムノアッセイを使用して、心不全（慢性虚血および低酸素を含む）に関係する慢性症状を有する患者におけるそのようなマーカーのレベルの上昇を間接的に測定することができる。このアッセイは、そのような慢性症状を有する患者はそれらのマーカーの血中レベルの上昇の結果としてそれに対する抗体を生成するという仮説に基づいているが、これは結腸直腸癌の患者に観察される抗ラクトシルスフィンゴシン抗体（Jozwiak W.& J.Koscielak,Eur.J.Cancer Clin.Oncol.18:617-621,1982）およびライ病患者の血清に検出される抗ガラクトセレブロシド抗体（Vemuri N.ら,Leprosy Rev.67:95-103,1996）との類推による。
１種以上の二次的マーカー（ＴＮＦαのような）の検出をＳＰＨおよび／もしくはその代謝物のような１種以上の非ポリペプチド心臓性マーカーの検出と組み合わせて、心不全（心臓性虚血または低酸素によって起こりうるような）の早期の指標とすることができる。ＴＮＦαのような二次的心臓性マーカーの生成も心不全（心臓性虚血によって起こりうるような）に関係し、体液（例えば血液および血清）中のＳＰＨおよびその代謝物のような非ポリペプチド心臓性マーカーのレベルの上昇を誘引しうるので、１種以上の二次的マーカー（ＴＮＦαのような）のレベルと非ポリペプチド心臓性マーカー（スフィンゴ脂質のような）を組み合わせた診断はより感度の高い心不全の指標となる。従って、非ポリペプチド心臓性マーカーと二次的マーカーのレベルの積を使用して虚血または低酸素のリスクを定量的に測定することができ、これを“心筋リスク因子”（ＭＲＦ）と呼ぶ。
スフィンゴ脂質（ＳＰＨおよび／またはその代謝物を含む）のような非ポリペプチド心臓性マーカーの検出を、原因として心不全に関係する虚血、低酸素、または他の症状に特徴的なレベルでの（好ましくは試験キットを使用する）行うことは、狭心症の患者または虚血性心疾患のリスクのある個体においてこれらの症状を同定するのに有用である。またこのアッセイはＡＭＩおよび他の型の心不全の診断に有用である。本発明は、虚血または低酸素状態による心疾患のリスクのある人について、伝統的な症状が発見される前にシンプルなスクリーニングを行うのに有用である。本発明はまた、心筋虚血の治療を意図した治療法の経過の後に行うのにも有用であり、従って重要な予後徴候となる（have important prognostic value）。また、本発明の方法および組成物を使用してＡＭＩの発症を予防することができ、これは、患者またはヘルス・ケアの専門家が本発明の方法を使用してＡＭＩとなるであろう症状を発見し、血管形成のような予防処置を施せることによる。
II． 実験動物の心臓細胞によって生成されたスフィンゴシンは心不全に類似した病態生理学的効果を有する
スフィンゴシン（ＳＰＨ；Ｄ（＋）−エリトロ−２−アミノ−４−トランス−オクタデセン−１，３−ジオールまたはスフィンゲニン）は、発明者が心筋組織に内在することを発見した脂質第２メッセンジャーである（Dettbarnら,J.Mol.Cell.Biol.26:229-242,1994；Sabbadiniら,Biochem.Biophys.Res.Comm.193:752-758,1993）。発明者が発表した研究は、ＳＰＨがカルシウムを調節する筋細胞の能力に対して劇的な効果を有することを示唆している（Dettbarnら,1994;Krownら,FEBS Letters 376:24-30,1995;Sabbadiniら,J.Biol.Chem.267:15475-15484,1992；Websterら,J.Mol.Cell.Cardio.26:1273-1290,1994）。低レベルのＳＰＨはカルシウムの移動を妨害するのに対し、非常に高レベルでは、制御されないカルシウムの放出および過負荷の開始の逆の効果を有する（Sabbadiniら,1992）。ＳＰＨの急性作用は特異的であり、心臓における作用部位は筋小胞体のカルシウム放出チャンネル（Dettbarnら,1994；Sabbadiniら,1992）および表面膜のＬ−型カルシウムチャンネル（Krownら,1995；McDonoughら,Circ.Res.75:981-989,1994）である。スフィンゴシン誘導体であるセラミドは同様の作用をする。その結果として心臓細胞の収縮性が低下する（Kramerら,Circ.Res.68:269-279,1991；Websterら,1994）。従って、ＳＰＨはネガティブな変力剤であり、カルシウムチャンネル作動剤として作用する。実験動物モデルにおいてＳＰＨによって生じるカルシウムの脱制御、ネガティブな変力、およびその結果として起こるカルシウムの過負荷は、虚血または他の型の心不全の際に心臓に起こる病態生理学的変化に類似している。
発明者が証明したところによれば、新生児および成人の心臓細胞を培養液中で病態生理学的に適切なレベルのＳＰＨおよびその直後の代謝産物Ｓ１Ｐで慢性的に処理すると、心筋細胞のアポトーシスによる細胞死が活性化される（Krownら,J.Clin.Invest.98:2854-2865,1996）。アポトーシスはプログラムされた細胞死の一形態であり、心筋梗塞の大きさを決定する（Kajsturaら,Lab.Invest.74:86-107,1996）。スフィンゴシンの生成は、種々のタイプの細胞におけるアポトーシス型細胞死の初期のシグナリング事象として関係づけられている（Cuvlilierら,Nature 381:800-803,1996；Ohtaら,Cancer Res.55:691-697,1995；Ohtaら,FEBS Letters 355:267-270,1994）。スフィンゴミエリンのシグナル変換カスケードの活性化は、ＴＮＦαの細胞障害性（アポトーシス）作用における重要な初期事象であり（ZhangおよびKolesnick,Endo.136（10）:4157-4160,1995）、発明者はＴＮＦαが培養したラット心筋細胞アポトーシスにおいて有意なアポトーシスを誘引しうることを証明した（Krownら,J.Clin.Invest.98:2854-2865,1996）。
酵素スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭアーゼ）は心組織においてＴＮＦαによって活性化されると考えられる酵素であるが（Oralら,J.Biol.Chem.272:4836-4842,1997）、その活性は実験動物のアシドーシスに罹患した心臓において上昇している（Fransonら,Am.J.Physiol.251（5pt2）:H1017-H1023,1986）。ＳＭアーゼは細胞におけるＳＰＨの生成の原因となる酵素であり、発明者はこの酵素を筋組織に局在させた（Sabbadiniら,1992）。また、虚血の動物モデルから得た証拠があり、それによれば、ＳＰＨの直前の前駆体であるセラミドのレベルは虚血性脳組織において上昇し、セラミドのレベルはスフィンゴミエリンの破壊の増加の結果である（Kubotaら,Japan J.Exp.Med.59:59-64.1989）。
他の支持的なデータは、スフィンゴミエリン（セラミドおよびスフィンゴシンの前駆体）のレベルが低酸素の実験動物において上昇することを示しているが（SergeevおよびGribanov,Kosm.Biol.Aviakosm.Med.15:71-74,1981）、他方、スフィンゴミエリンのレベルが虚血ラットの大脳皮質において、セラミドのレベルの上昇に比例して低下していることも発見されている（Kubotaら,1996）。特定の理論に拘束されるのは望ましくないが、これらのデータは、低酸素および虚血の際に生じる症状がＳＭアーゼの活性化およびそれに続く心臓細胞のＳＰＨレベルの異常な上昇を誘引するという理解を支持する。リソソームイソ型ＳＭアーゼ（酸性またはａＳＭアーゼ）は低酸素の酸性条件によって活性化され、原形質膜イソ型ＳＭアーゼ（中性またはｎＳＭアーゼ）の活性化を補足する。心筋細胞のｎＳＭアーゼはＴＮＦαによって活性化すると考えられる。ＴＮＦαは虚血性心組織から放出され、ＴＮＦα誘導型のＳＰＨ生成は心臓性虚血の初期事象である。
本発明は、一部には以下の確信に基づく：心臓性虚血における初期事象はＴＮＦα誘導型のスフィンゴ脂質の生成であり、次いでスフィンゴ脂質依存型アシドーシスが起こり、それによって酸性型のＳＭアーゼ（その供給源はリソソームである）による更なるスフィンゴ脂質の合成が起こる。スフィンゴシンはプロテインキナーゼＣおよびＮａ／Ｈ交換系（キナーゼによって活性化され、不必要な酸を排出する）の周知の阻害剤であるLoweら,J.Biol.Chem.265:7188-7194,1990）。上記の第Ｉ節に記載したように、心臓性低酸素、虚血、および心不全の原因となる他の症状によってある周期が生成され、その周期では虚血、低酸素、または他の不全性の心臓の酸性状態がスフィンゴ脂質の過剰生成を刺激し、筋小胞体膜およびＬ−型カルシウムチャンネルからのカルシウムの放出が制御されなくなり、それによって細胞はそのビート・トゥ・ビートの収縮作用を調節できなくなる。
また、心臓のカルシウムレベルが調節されないことにより、Ｎａ／Ｃａ交換の促進のために、そして間接的にはＮａ／Ｈ交換体の刺激による細胞の酸性化のために、症状は悪化する（Gottliebら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:5965-68,1995）。スフィンゴ脂質介在型アシドーシスおよびそれに続くカルシウムの脱調節により細胞死のプログラムが活性化され、アポトーシスが起こる。最後には、心機能はアポトーシスによる細胞の喪失を起こし、また、残存する心筋細胞にはＳＰＨおよびｐＨのネガティブな変力作用を受ける。
発明者の実験室で行った細胞培養の研究により、心筋細胞はＳＰＨを（細胞の条件にした）培養液中に“分泌する”（ＳＰＨ ７００ｐｍｏｌ／ｍＬ）ことが証明された。この結果は、ＳＰＨおよびその代謝物が、虚血によって引き起こされた低酸素およびアシドーシスを有する心臓細胞から血液中に漏出しうることを示している。YatomiらはＳ１Ｐがヒト血漿および血清に存在することを報告した（Yatomiら,J.Biochem.121:969-973,1997）。他のスフィンゴ脂質（ＳＰＨを含む）は測定されておらず、これらの研究者は、Ｓ１Ｐは凝固の際に血小板から放出されると推測した。血漿を３Ｈ−スフィンゴシンと共に２時間インキュベートし、Ｓ１Ｐが血漿の他の成分から生成されるかどうかを確認した。ＳＰＨは血漿中で２時間の間安定であり、血小板を多量に含有する血漿のみがＳＰＨをＳ１Ｐに変換したが、これは血小板がＳ１Ｐの供給源であることを示唆する。意義深いことに、血小板によるＳ１Ｐの生成のためのＳＰＨの供給源、または、心臓性虚血におけるＳＰＨおよび／またはＳ１Ｐの考えられる役割については検討されていない。対照的に、特定の理論に拘束されることは望ましくないが、本発明は以下の理解に基づく：心臓性虚血による漏出の早期の段階に心臓細胞から放出されるＳＰＨは“分泌される”か、あるいは逆に、低酸素もしくは虚血状態によって損傷した細胞から血液中に漏出し、血小板に存在するスフィンゴシンキナーゼによって作動する。血小板から放出されたＳ１Ｐはその後、血栓形成を刺激する。従って、低酸素または虚血状態によって損傷した心臓細胞から放出されたＳＰＨは、最終的に心筋梗塞を引き起こす。
III． 腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）
分子レベルでは、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）のようなプロ−炎症性サイトカインは虚血および低酸素の病態生理学に関係づけられてきた。血清ＴＮＦαレベルの上昇は心臓性虚血および再灌流損傷（reperfusion injury）に関係する低酸素状態の際に起き、流血中のＴＮＦαのレベルは、急性心筋梗塞の後に著しく上昇する（Herskowitz A.ら,Am.J.Pathol.146:419-428,1995；Vaddi K.ら,Circ.90:694-699,1994；Lefer A.M.ら,Science 24:61-63,1990；Maury C.P.J.& A.-M.Teppo.J.Intern.Med.225:333-336,1989）。血清ＴＮＦαレベルの低下は虚血状態の改善に関係する（Hennein H.A.ら,Circ.88（4）:I-247,1993）。慢性心疾患に罹患したヒト患者においては、高レベルの血清ＴＮＦαが検出され、ＴＮＦαのレベルの上昇は冠状動脈バイパス術の直後に起こる（Levineら,New Eng.J.Med.323:236-241,1990；Deng M.C.ら,Eur.J.Cardiol.9:22-29,1995；Hennein H.A.ら,J.Thorac.Cardiovasc.Surg.108:626-35,1994）。
ＴＮＦα、インターロイキン１、２、および６（ＩＬ−１、ＩＬ−２、およびＩＬ−６）のようなプロ−炎症性サイトカインは一般に、マクロファージ、好中球、およびリンパ球のような骨髄由来細胞によって生成される（Kelker H.ら,Int.J.Cancer 36（1）:69-73,1985；Cuturi M.ら,J.Exp.Med.165:1581-1594,1987；Sung S.ら,J.Clin.Invest.84（1）:236-243,1989；Liebermann A.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6348-6352,1989；Lindemann A.ら,J.Clin.Invest.83（4）:1308-1312,1989）。平滑筋および内皮細胞はＴＮＦαの供給源であることが示唆されている（Warner,S.およびP.Libby,J.Immunol.142:100-109,1989；Libby,P.ら,Am.J.Pathol.124:179-185,1986）。また、心臓がＴＮＦαの供給源であることも前提とされている（Giroir B.ら,J.Clin.Invest.90:693-698,1992；Giroir P.B.ら,Am.J.Physiol.267:H118-H124,1994；Gurevitch J.ら,J.Am.Coll.Cardiol.28（1）:247-252,1996）。虚血のラット心臓をランゲンドルフ装置で灌流すると、再灌流の最初の瞬間の排出液にＴＮＦαが分泌されることが報告されている（Gurevitchら,1996）。
IV． 心臓細胞は血清ＴＮＦαおよびＳＰＨの供給源である
本発明の元となる実験に関連して収集されたデータが示すところによれば、培養液中の新生児および成体ラット心筋細胞はいずれも（線維芽細胞および内皮細胞を含まない）、最近の細胞内毒素、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）（周知のサイトカイン分泌促進物質である）に応じて多量のＴＮＦαを分泌する能力を有する。分泌されるＴＮＦαの量は１５００ｐｇ／ｍＬにのぼり、これは心筋において有意なアポトーシス性細胞死を起こす能力のあるＴＮＦαの範囲内である（Krownら,1996）。心臓細胞がＴＮＦαの重要な供給源であるという主張を更に支持するのは、バルーン血管形成術を受けているヒト験体の肺動脈のＴＮＦαレベルが同じ患者の大腿静脈に見られるＴＮＦαの血清レベルより高いことを示すデータであり、このデータは虚血（バルーンの膨張によって誘導する）際、虚血性心組織はＴＮＦαを生成し、次いでそれが冠状静脈洞および肺動脈から全身循環に放出されることを示唆する。冠動脈血管形成を行った患者の肺動脈におけるＴＮＦαは、肺動脈のＳＰＨレベルの変化と十分相関する。これらのデータによれば、ＴＮＦαの心臓性供給源は心臓細胞のＳＰＨ生成のための主要な刺激である。
要するに、上記のデータは、冠動脈血管形成術の際に起こるような種々の型の心筋虚血に見られる血清ＳＰＨおよびＴＮＦαの上昇は、虚血性心臓細胞によって循環に放出されるＳＰＨおよびＴＮＦαに由来する。
Ｖ． ＳＰＨまたはＴＮＦαはいずれも骨格筋性虚血の結果として血清中で上昇しない
ＳＰＨが骨格筋においてシグナリング分子として存在することが既に証明されているので（Sabbadiniら,1993）、骨格筋が血清ＳＰＨの供給源になりうるかどうかを確認することが重要である。骨格筋の質量は全体重の３０〜４０％であり、血清ＳＰＨの非常に大きな供給源となりうる。血清ＳＰＨの供給源が骨格筋ではなく心臓性虚血と特に関係することを確認するために、オリンピック選手および海軍の被験者の血清ＳＰＨを、重度の骨格筋性虚血の誘導の前後で試験した。骨格筋性虚血の誘導は、被験者に依頼して４９℃の室内においてトレッドミルで疲労しきるまで運動してもらって行い、血清中の乳酸を測定して確認した。運動の前は、血清ＳＰＨの平均は５．１８±４．５ｐｍｏｌ／ｍＬ（ｎ＝４）であり、徹底的な運動の後には４．０２±３ｐｍｏｌ／ｍＬのレベルまでわずかに減少した。更に、これらの血清中のＳＰＨ値は上記の虚血患者で観察されたものよりかなり低かった。重要なことには、血清中のＴＮＦαレベルは、重度の骨格筋性虚血にあるこれらの被験者では上昇しなかった。例えば、軍隊の兵員の血清ＴＮＦα値は、運動前には１．２２±０．４９ｐｇ／ｍＬであり、４９℃（１２０°Ｆ）の周囲温度で２０分間の運動後には１．３９±０．２３ｐｇ／ｍＬにわずかに上昇した。
VI． マーカーの既定値の決定
本発明のある態様では、非ポリペプチドおよび／もしくは二次的心臓性マーカーのレベル、または試験サンプルに対して算出したＭＲＦを、そのマーカーに対する既定値と比較して、心不全（心臓性虚血または低酸素によって誘導されうるような）の形跡が存在するかどうかを確認する。１種以上のそのようなマーカーに対する既定値を少なくとも２つの方法の１つで確立することができる。例えば、ＡＭＩのリスクのある哺乳類（例えばヒト）から心疾患の兆候が現れる前にデータを収集して確立するか、または他の正常な哺乳類（好ましくは験体と同じ種および年齢層）の試験によって確立することができる。
第一の方法では、患者を治療する医師が、統計学的、遺伝的、家族性、または医学分野で一般的に知られる因子に基づいて、患者がＡＭＩのリスクを有することを確認してもよい。その後、医師は患者に対する１種以上の非ポリペプチド心臓性マーカーのレベルまたはＭＲＦを測定してベースラインを確立できる。あるいは、または更に、医師は１種以上の二次的マーカー（例えばＴＮＦα、ＩＬ−１、２、６、または別のサイトカイン）のレベルを測定してベースラインを確立してもよい。本発明は、患者における非ポリペプチド心臓性マーカーおよび／または二次的マーカーのレベルをこのベースラインと比較し、切迫した心不全（心臓性低酸素または虚血によって起こり得るような）を検出する方法を提供する。
第二の方法では、医師または他のヘルスケアの専門家（医学統計学者を含む）が、医師によって健康であると確認された個体の心臓性マーカーのレベルまたはＭＲＦを測定できる。同じ年齢層の個体のレベルをグループ化し、その平均値および標準偏差を決定する。この値は既定値を表し、患者における心臓性マーカーのレベルをこれと比較して心臓性低酸素または虚血を検出する。
VII． 早期検出が急性心筋梗塞の予防を導くことが可能である
本発明の方法および組成物は、心臓虚血または低酸素症、すなわちAMIおよび心不全の他の型につながる状態の早期検出を可能にする。本方法を用い、ひとたび虚血または低酸素症が検出されていれば、患者は救急医療施設を訪れることが可能であり、該施設で心不全が起こるのを予防するための処置を取ることが可能である。これらの処置には、限定されるわけではないが、血管形成術、冠状動脈バイパス手術、または1つまたはそれ以上の抗凝血または血栓溶解剤の投与が含まれる。
こうした予防処置の目的は、AMIまたは他の種類の心不全の発症以前に虚血または低酸素症状態を緩和することである。対照的に、今日、上述の処置は、AMIが起きた後、または患者が心不全を経験している間に用いられている。しかし、本発明は、症状およびそれに関連する組織損傷が発症する前に心不全を引き起こす状態の早期検出を可能にする。
VIII． 心臓処置後の予後の決定
本発明の方法および組成物は、医師および他の医療専門家が、心臓処置直後に該処置が成功したか決定することを可能にする。例えば、血管形成術または心臓動脈内へのステント配置後、1つまたはそれ以上の心臓マーカーまたはMRFのレベルを本明細書に記載されるようにモニターし、虚血または低酸素症状態が緩和されているかどうかを決定してもよい。このように、手術の成功を直ちに決定することが可能である。測定された心臓マーカーまたはMRFレベルにより決定されるとき、処置が望ましい結果に終わっていなければ、その後、患者が完全なまたは部分的な心不全を起こす前に、さらなる処置を使用してもよい。
実施例
以下の実施例は限定するものでなく、そして単に本発明の多様な側面および特徴を代表するものである。
一般的な方法
他に定義されない限り、本明細書に用いられるすべての科学および技術用語は、当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。他に言及されない限り、本明細書に使用されるまたは考察される技術は、一般の当業者によく知られる標準的方法論である。以下の化学薬品、検定および方法は、本明細書に示される結果を得るために用いられた。当業者は、試薬の他の供給源およびよく知られる方法により、本発明の範囲を逸脱することなく、置換してもよいことを理解するであろう。
化学薬品
化学薬品は以下のように得た：D−スフィンゴシン［D（+）−エリスロ−2−アミノ−4−トランス−オクタデセン−1,3−ジオール］はMatreya,Inc（ペンシルバニア州プレザントギャップ）から；スフィンゴシン−1−リン酸はBiomol（ペンシルバニア州プリマスミーティング）から；o−フタルアルデヒドはICN Biochemicals（オハイオ州クリーブランド）から、そしてHPLC等級メタノールはFisher Scientific（カリフォルニア州ツースティン）から得た。スフィンゴシルホスホリルコリンおよびDL−エリスロ−ジヒドロスフィンゴシンを含む、他の化学薬品は、Sigma Chemical Co.（ミズーリ州セントルイス）から得た。
スフィンゴシンおよび他のスフィンゴ脂質の保存溶液は、脂肪酸不含ウシ血清アルブミン（BSA）との複合物として調製し、本質的にミセルまたは有機溶媒を含まない該化合物の溶液を提供した。
スフィンゴ脂質抽出およびクロマトグラフィー検出法
スフィンゴシンレベルは、本質的に以前記載された（Sabbadiniら, 1993）ように行われたHPLCにより測定した。簡潔には、新鮮な組織を動物から切除し、そして4体積の50mMリン酸カリウム緩衝液pH7.0の存在下に5℃でホモジェナイズした。同様に、SPHを全血または血清試料から抽出してもよい。未精製ホモジェネート、血液または血清試料（300μl）をクロロホルム：メタノール溶液（1：2）750μlに添加し、そして何回かボルテックスした。その後クロロホルム（約500μl）を添加し、その後1M NaClを500μl添加した。相分離を促進するため該抽出物を簡単に遠心分離し、そして上層の水相を吸引により除去した。その後、1M NaClを500μl添加し、そして遠心分離および吸引段階を繰り返した。残ったクロロホルムを真空遠心機（SpeedVac、Savant Instruments,Inc.、ニューヨーク州ファーミングデール）内で30分真空乾燥することにより除去した。残渣を750μlのクロロホルム：メタノール（1：2）中の0.1M KOHに懸濁した。懸濁物を槽超音波（bath-sonicated）し、そして37℃で1時間インキュベーションした。抽出物が室温まで冷えたとき、クロロホルム500μlおよび1M NaCl 500μlを添加し、試料を混合し、遠心分離し、そして上相を吸引により除去した。NaCl抽出段階を2回繰り返し、そして有機相を遠心分離と共に30分真空乾燥した。抽出物を0.5mg/ml o−フタルアルデヒド（OPA）、3%ホウ酸、pH10.5、および0.05%β−メルカプトエタノールの溶液50μlで10分誘導体化した。その後、メタノール50μlおよびHPLC流動緩衝液（90%メタノール中の5mMリン酸、pH7.0）350μlを各試料に添加し、そしてOPA誘導体化試料を、標準的な方法を用い、Waters 470スキャンニング蛍光検出器を含む、Waters HPLC Maxima 820クロマトグラフィー・ワークステーション（Millipore Corp.、カリフォルニア州ベンチュラ）上でHPLCにより解析した。蛍光は励起波長340nmおよび発光波長455nmで検出した。
スフィンゴ脂質は、Aquapor C18ガードカラムを備えた250H 7mm C18、300オングストローム孔Brownleeカラム（Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティー）上で逆相クロマトグラフィーにより分離した。試料は流動緩衝液を用い、1.25ml／分でイソクラティクに（isocratically）流動させ、SPH標準の回収に基づくと、約50%の抽出効率を生じた。標準の保持時間は：SPHは約15分；S1Pは約5分；そしてSPCは約20分だった。
実施例1： 心筋梗塞を経験しているヒト患者における血清SPHレベル
救急医療施設を訪れた患者から、厳密なヒト対象プロトコル下で血清試料を採取した。3つの患者群のSPHおよびTNFα両方の血清レベルを調べた：（1）AMIが疑われそして運動ストレス試験の対象とされる患者；（2）冠状動脈形成術を受けている患者；および（3）急性心筋梗塞の初期にある患者。
心筋虚血障害のいかなる臨床的症状も示さない3つの対照群の血清もまた試験した。これらの対照群は：（1）成人フィットネスプログラムに登録している年齢一致被験者（47から79歳）；（2）安静にしている、および49℃（127°F）の周囲温度でトレッドミルで消耗するまで運動している健康な軍人；および（3）オリンピックトレーニングセンターで、安静にしている、および49℃の周囲温度でトレッドミルで消耗するまで運動している運動選手であった。
確認された心筋虚血の患者は、いかなる対照群より有意に高いSPHレベルを有した。軍人およびオリンピック運動選手の血清SPHレベルを合わせ1つの対照群（n=6）とした結果、血清SPHレベルは4.18±1.8pmol/mlだった。年齢一致対照群（n=15）の血清SPHは、平均99.3±32.4pmol/mlだった。3つの虚血患者群を合わせ1つの群とすると、平均血清SPHレベル697±0.7pmol/mlが得られた。この値は、年齢一致対照群より約7倍高く、そして激しい運動ストレスを受けているよく鍛えられた軍人および運動選手より約160倍高かった。
検出されるSPHレベルと比較するため、心臓組織損傷と関連することが知られる生化学マーカーのレベルもまた測定した。18人の虚血患者のうち16人に関し、検出されるSPHレベルの増加は、CKの高レベル（17−810U/mlの範囲内）およびCKMBの高レベル（0.62−33.2mg/l）と一致していた。18人の虚血患者のうち、高いCKMB多量レベルを有した2人の患者（P2、P3）は、異常に高いレベルのSPHを持たなかった。1人の患者（P2）は、年齢一致対照群の平均より中程度にしか高くない血清SPHレベル（120pmol/ml）を有したが、高レベルのCKMB（33.2mg/l）およびCK（810U/l）を有し、AMIを暗示した。もう一方の患者（P3）は、無視できるレベルの血清SPH（18.1pmol/ml）、正常なCKレベル（161U/l）および高いCKMBレベル（18.4mg/l）を示した。これらの2人の患者で検出された中程度から低いSPHレベルは、どちらの患者も他の指標に基づくと虚血と見なされたため、11%の偽陰性率（18のうち2）に相当する。これらの2人の患者（P2およびP3）のSPHデータをAMI群に含むこともまた、冠状動脈形成術を受けている虚血患者のSPHレベル（885±123pmol/ml）と比較して、AMI群が幾分低いSPHレベル（587±7pmol SPH/ml）であることを説明する。
試験されたAMI患者で得られた結果に基づけば、比較的高い血清SPHレベルは有効な虚血の初期指標である。これはさらに以下の個々の研究で得られた結果により確認された。
3つの病歴
病歴その1
患者T2は、47歳の女性で、アンギナを訴え、病院の救急処置室を訪れた。血液試料を採取し、そして患者をその後、病院の運動ストレス試験施設に回した。患者はトレッドミル試験を通過し、ストレス試験中に行われたECGおよび病院での評価期間中に解析された血清酵素レベルにより検出されるところでは、心臓虚血またはAMIのいかなる徴候も見せなかった。患者は退院したが、3週間後、CKおよびCKMBの高血清レベルおよび他の症状により決定されるところでは、AMIの徴候があり、再来した。
本患者の血清SPHの解析により、最初に救急処置室を訪れたとき、非常に高いレベルのSPH（810pmol/ml）を有したことが立証された。AMIで病院を再度訪れたとき、そのSPHレベルはさらに高かった（1200pmol/mlより大）。このように、血清SPHレベルは虚血の初期指標であり、そして、患者が最初に救急処置室を訪れたとき、心臓虚血またはAMIの徴候をどちらもまったく示さなかった運動ストレス試験または血清CKおよびCKMB解析より、患者の心臓状態をよりよく予測した。
病歴その2
患者MI-12は男性で、混乱させられる臨床提示を示し入院した。入院時、患者のCKレベル（126U/l）は正常だったが、患者のCKMBレベル（3.8mg/l）は上昇していた。入院時の患者の血清SPHレベルもまた高く（732pmol/ml）、虚血が暗示された。入院の約5時間後、本患者はAMIを有した。この結果は、血清SPHレベルが正確にその虚血状態を検出し、CKパラメーターによっては検出されなかったことを示す。したがって、SPH試験の結果は、単独でまたはCKMBパラメーターと合わせ、切迫したAMIを予測した。
病歴その3
本患者は58歳の女性で、その心臓状態の最初の評価のため入院した。最初の評価中、血液を採取し、そして血清はCKMB（0.632mg/ml）は正常だが中程度に高いSPH（300pmol/ml）を示した。4日後、患者は冠状動脈バイパス術を受けた。バイパス処置の結果として虚血が緩和した後、患者の血清SPHレベルは7.31pmol/mlに有意に減少したが、患者の血清CK（934U/l）およびCKMB（88.9mg/l）レベルは高いままだった。これはSPHが虚血の正確な指標であり、そして酵素CKおよびCKMBが心筋損傷の指標である（すなわち壊死心筋細胞から放出される高分子量細胞質タンパク質）ことと一致している。このように、血清SPHの上昇したレベルの検出は、血清SPHが顕著な細胞壊死が起こる前に心筋細胞から産生されるため、虚血または低酸素症の早期診断に役立つ。
これらの結果は、血清SPHが、診断に一般的に用いられる現在の方法より、虚血の初期段階および切迫したAMIをよりよく予測することを示す。さらに、血清SPHは、細胞死後に放出される他の生化学マーカー（例えばCK、CKMBおよびトロポニン）と対照的に、心臓細胞死に先立つ初期事象に定量的に関連する。したがって、患者を血清SPHに関し日常的にスクリーニングすることにより、冠状動脈疾患の早期診断およびAMIを予防するため治療してもよい心臓疾患の危険性が高い患者の同定を補助することも可能である。しかし、SPHなど単一のスフィンゴ脂質の定量的検出は、変動しやすい可能性があり、これは血清TNFα検出測定と組み合わせ、心臓虚血および低酸素症の危険性のより一般的な指標を提供することにより、最小限にすることも可能である。
実施例2： 虚血状態下の心臓組織からのin vitroスフィンゴシン産生
心臓虚血が過剰なSPH産生を生じることを立証するため、低酸素状態（95% CO2；5% O2）で、または正常クレブス（Krebs）緩衝液（5% CO2；95% O2を含む）で逆方向冠状動脈灌流にさらした成熟ウサギ心臓におけるSPH組織レベルを調べた。心臓を除去し、迅速にホモジェナイズし、そしてスフィンゴ脂質を上述のように抽出し、そして検出した。
抽出物のHPLC解析により、95% CO2を含む緩衝液で灌流した心臓の組織SPHレベルは、対照条件に比較し、有意に増加している（20倍）ことが明らかになった。さらに、これらの増加は処置のわずか5分後に起こった。
SPHは陽イオン両親媒性脂質であり、全血および他の体液中に分配されることが可能である。したがって、SPHの相対量を、ヒト、ラットおよびウサギから得た全血および血清で測定した。SPHは、心臓虚血または低酸素症を検出するためにSPHレベルを測定するのに好ましい体液である、血清に顕著に見られる。
血清中のSPHの時間依存安定性を測定するため、ヒト血清試料を得て、そしてスフィンゴ脂質およびHPLC解析前に22℃で5時間置いた。血清試料にまた、商業的に入手可能なSPHを添加し、そして室温で同様に保存した。古い対照血清試料もSPH添加試料もどちらも、収集後すぐに検定された試料または添加試料の調製と比較して、SPHレベルの容易に判断される相違を示さず、SPHは、血清試料が収集後すぐに検定されなくても、分解を受けないことが示された。
実施例3： 心筋危険性因子（MRF）
TNFαの血清レベルもまた、心臓虚血で増加し、そして血管形成患者に検出される血清SPHレベルと相関している。これらの2つのパラメーター（例えば、非ポリペプチド心臓マーカーと二次（または三次）心臓マーカーのレベル）との積は「心筋危険性因子」（MRF）と称され、そして個人が心筋虚血により生じた損傷を持つ可能性の有用な定量的指標である。MRFは異なる心臓マーカーを用い計算することが可能であるため、特定のMRFに用いられるマーカーを明記するのが重要である。
ここでは、（Quantikine HSキット（カタログ番号HSTA50）、R+D Systems、ミネソタ州ミネアポリスを用い）亢進ELISA二重抗体捕捉検定で標準的方法を用いTNFαを測定した。製造者により提供される検定方法を用い、ヒト血清試料（200μl）を検定し、そして組換えヒトTNFα標準と比較した。
血清TNFαおよびSPHレベルを、周期的虚血（例えばバルーン膨張中）および成功した血管形成術中に起こる再灌流（例えば動脈の障害物が除かれたとき）を経験している患者（A5）の肺動脈から採取した試料から測定した。血清TNFαおよびSPHレベルはどちらも、血管形成処置開始前（−20分から0分）には上昇していた。TNFαもSPHもどちらも虚血期中に増加しなかった。これらは既に高く、そして再灌流後低下した。TNFαおよびSPHパラメーターはどちらも二相性反応を示し、血管形成術後まず減少し、その後、血管形成術前のレベルに規則的に再上昇した。時間経過は同様で、TNFαレベルがSPHよりわずかに早く低下した。これはTNFαがSPH産生を誘発することと一致している。
同様に、冠状動脈形成術を受けている19人の患者および7人のAMI患者に関し、血清TNFαレベルを評価した。比較のため、2つの対照群（年齢一致対照および健康な軍人）に関し、血清TNFαレベルを測定した。血清TNFαレベルはAMI患者で最も高く（5.2±0.6pg/ml）、そして処置を行う前に血管形成術群から採取した肺動脈血で幾分低かった（3.6±0.74pg/ml）。患者は、2.43±0.32pg/mlの年齢一致対照群（「対照」）、および1.22±0.29pg/mlの健康な軍人被験者（「運動選手」）のものと比べ、有意に高い血清TNFαレベル（4.04±0.57pg/ml）を有した。
結果を比較することにより、3群試験において、血清TNFαレベルが血清SPHレベルに関し見られたのと同じ傾向を示すことが理解可能である。すなわち、運動選手が最も低いレベルのSPHおよびTNFαを有し、年齢一致対照がより高いレベルのSPHおよびTNFαを有し、そして患者が最も高いレベルのSPHおよびTNFαを有した。したがって、進行している心筋虚血のより正確な測定は、MRFを計算するのに2つまたはそれ以上のパラメーター、例えば同じ傾向の非ポリペプチドおよび二次または三次心臓マーカーを組み合わせることにより得ることが可能である。SPHが非ポリペプチド心臓マーカーであり、そしてTNFαが二次心臓マーカーであるとき、MRFは、血清TNFαレベルの数値および血清SPHレベルの数値を乗じることにより得られる積である。
本実験におけるすべての虚血患者群を代表するMRFデータ（SPHおよびTNFαレベルを用いる）を合わせ、そして年齢一致および健康な軍人対照と比較した。虚血患者のMRF（2820）は、年齢一致対照群（238）より約12倍高く、そして健康な軍人群（6.3）より約440倍高かった。このように、MRF値は、血清SPHまたは血清TNFα測定どちらか一方よりも、より大きい度合いで虚血患者を対照群から区別した。さらに、MRF計算値は、パラメーターどちらか一方での偽陰性の発生を減少させた。
以下の表1は、7人の患者のSPH/TNFα MRF計算値を示す。該MRF値は、SPH値（最も近い自然数（whole integer）に概算した）およびTNFα値（最も近い小数点第一位に概算した）を乗じ、MRF値（最も近い自然数に概算した）を生じることにより、計算した。7人の血管形成患者のうち6人が約1,800から約3,000の範囲のMRFを有した。これらの6人の患者の平均MRF値は2,326だった。1人の患者のみがこの範囲外のMRFを有した（約16,000のMRFの患者A1）。7人の患者すべての平均MRFを表1に示している。計算された患者の大多数のMRF値に基づくと、患者A1はTNFαレベルが他の6人の患者より有意に高い、変則的な高レベルの虚血を有していたようであった。患者A1のSPHレベルを他の6人の患者のTNFα平均値（2.9）で乗じると、MRF値は、他の6人の患者に見られる範囲に近い3,254であったであろう。
血管形成術群に検出されるSPH値に関し、偽陰性はなく、上昇した血清SPHレベルは虚血の正確な予測因子であることを示した。血清SPHは、2、3のAMI患者では偽陰性結果が検出されたが、現在用いられている他の方法よりしばしば虚血初期および切迫したAMIをよりよく予測した。さらに、検出されたSPHレベルは、心臓細胞死に先立つ初期事象の定量的測定値を提供する。対照的に、他の生化学マーカー（例えばCKおよびCKMB）は、心臓細胞死に続く後期事象をより示すようである。血清SPHの測定により、他の臨床指標がなくても心臓虚血レベルに関する情報が提供されるため、該検定はまた、心臓治療（例えばバイパス手術または血管形成術）の有効性をモニターするのにも有用である。血清SPH試験は心臓虚血および低酸素症の日常的な診断として有用であり、心臓疾患の危険性がある患者を同定し、そして治療することを可能にする。該方法はまた、心臓異常の治療中または治療後の患者をモニターし、治療の成功の指標として心臓虚血または低酸素症のレベルを検出するのにも有用である。
上述のMRFを計算するのに用いられた結果は、SPHのHPLC検出およびTNFαのELISA検出に基づいていたが、当業者には、診断に役立つスフィンゴ脂質およびTNFαのいずれを検出するのにも多様な検定を用いてもよいことが理解されるであろう。好ましくは、TNFαおよびスフィンゴ脂質に対する検定を含むキットが、MRFの測定を提供するのに用いられる。例えば、抗TNFαおよび抗SPH抗体／またはスフィンゴ脂質に対する酵素検定を組み合わせキットとし、MRF値を評価する。例えば、血液または血清中の2つまたはそれ以上の解析物の測定に、既知のバイオセンサー技術を用いてもよい。キット中にアルゴリズムを用い、MRF値を計算してもよく、これはTNFαと共に3つの重要なスフィンゴ脂質、SPH、S1PおよびSPCをすべて検出し、そしてスフィンゴ脂質およびTNFαのすべての組み合わせに関する一連のMRF値を決定するのに、または測定されたすべてのスフィンゴ脂質レベルとTNFαレベルの積である単一のMRF値を決定するのに、特に好都合である可能性がある。
実施例4： 虚血に関連するTNFαは、心臓細胞により産生される
TNFαが心筋細胞起源であることを立証するため、繊維芽細胞および内皮細胞を除いた、培養中の新生および成熟ラット心筋細胞両方を、TNFα産生に関し試験した。
新生心室筋細胞を1から4日齢のスプレーグ・ドーリー（Sprague-Dawley）ラットから得た心臓から、本質的に以前記載された（Shieldsら,J.Biol.Chem.263: 12619-12618,1988）ように解離した。心室を細かく切り刻み、そしてカルシウム不含およびマグネシウム不含ハンクス緩衝塩溶液（Sigma、ミズーリ州セントルイス）中の0.5g/lトリプシン、0.2g/l EDTAで解離した。組織を攪拌し、遠心分離により穏やかに沈澱させ、そしてトリプシン消化を5回繰り返した。懸濁した細胞を含む上清をDMEM/F12培地と合わせ、125μmナイロンメッシュを通じて濾過し、そして濾過物を遠心分離した。沈澱した細胞をDMEM/F12培地に再懸濁し、そして10%ウシ胎児血清（FCS）を加えたDMEM/F12中のフィブロネクチン・コーティング・カバーガラス片上に蒔いた。
新鮮な解離成熟心室筋細胞を、ランゲンドルフ（Langendorff）逆方向大動脈灌流装置を用い、酵素解離により成熟（200から300g）スプレーグ・ドーリーラットの心臓から調製した。心臓をコラゲナーゼ（Type II、Worthington Biochemicals、ニュージャージー州フリーホールド）で灌流した後、ラット心室をさいの目に切り、そして酸素添加したタイロード溶液（Tyrode’s solution）（140mM NaCl、5.4mM KCl、5.0mM MgCl2、1.0mM CaCl2、10mM HEPES、0.25mM NaH2PO4、pH7.3）中の0.58mg/mlコラゲナーゼ10から15ml中で37℃で30分インキュベーションした。解離した筋細胞をラミニン・コーティング（50μg/ml）培養プレートに蒔き、そして10% FCSを加えたDMEM/F12中で、試験剤（例えばLPSまたは対照緩衝液）の存在または非存在下で、18時間培養した。
結果は、これらの細胞が、サイトカインのよく知られる分泌促進剤である、細菌エンドトキシン、LPSに反応し、多量のTNFαを分泌することが可能であることを示した。分泌されるTNFαの量は、約1500pg/mlに達することが可能であり、これは心筋細胞で有意なアポトーシス細胞死を生じることが可能なTNFαの範囲内である。さらに、LPSにより刺激された培養ラット心筋細胞のin vitro実験により、有意な量のSPH（700pmol/ml）もまた該細胞から分泌されることが示される。これらの結果は、心臓細胞がTNFαと共に分泌SPHの供給源であることを立証する。さらに、これらのin vitro結果は、バルーン血管形成術を受けているヒト患者の肺動脈におけるTNFαおよびSPHレベルが、同一患者の大腿静脈で見られるTNFαの血清レベルより大きいというin vivo結果と一致する。該データにより、冠状動脈形成術患者の肺動脈TNFαレベルが、同処置中の肺動脈SPHレベルの変化とよく相関したことが示される。in vitroおよびin vivo両方のデータにより、心筋虚血（例えば冠状動脈形成術中）に見られる上昇した血清TNFαおよびSPHレベルは、循環へ虚血心臓細胞から放出されたTNFαから生じるらしいことが示される。
虚血患者に検出される上昇した血清SPHレベルは、激しい骨格筋虚血を誘導する前および誘導した後に、健康な運動選手および軍人から得た血清試料の検定により立証されるように、骨格筋虚血により産生されるのではなかった。被験者は、周囲の温度が49℃である部屋に置かれたトレッドミルで消耗するまで運動し、骨格筋虚血を誘導し、これは血清乳酸塩を測定することにより確認された。運動養生法前、血清SPHは平均4.18±4.5pmol/mlであり、これは運動後わずかに減少し、4.02±3pmol/mlとなった。これらの血清SPH値は、虚血患者に検出されるものより実質的に低かった。重要なことに、これらの激しい骨格筋虚血を経験している被験者で血清TNFαレベルは増加しなかった（例えば、運動前の軍人の血清TNFα値は1.22±0.49pg/mlであり、そして運動後1.39±0.23pg/mlに上昇したが有意でなかった）。
実施例5： 全血または血清のスフィンゴ脂質を検出するための抗スフィンゴ脂質抗体の使用
抗スフィンゴ脂質（または他の非ポリペプチド心臓マーカー）モノクローナル抗体（mAb）、例えば、SPH、S1P、SPC、およびDHSPHに対して反応するmAbを、抗リン脂質抗体の調製に用いられるものと同様の方法により調製する。簡潔には、mAb産生の1つの方法は、抗リン脂質mAbを作成するのに用いられる既知の方法（Rezaら,FEBS Lett.339:229-233,1994；Umedaら,J.Immunol.143:2273-2279, 1989）を用い、スフィンゴ脂質でコーティングした酸処理サルモネラ・ミネソタ（Salmonella minnesota）を直接マウス脾臓に注入する直接免疫を伴う。抗SPH抗体の産生には、酸処理S.ミネソタを望ましいスフィンゴ脂質、例えばSPHでコーティングし、そして抗SPH mAbを分泌するハイブリドーマを産生するための細胞融合前に、マウス脾臓に注入する。同様の方法を用い、抗S1P mAbおよび抗SPC mAbを産生する。また別に、動物に特有のエピトープを提示するため、脂肪酸不含BSA−スフィンゴ脂質結合体を免疫原として用いてもよい。mAbが酸化脂質またはタンパク質脂質付加体（adduct）に対して産生されないことを確実にするよう注意しなければならない（Witztumらによる論議を参考文献中に参照されたい（Horkkoら,J.Clin.Invest.98:815-825,1996；Palinskiら,J.Clin.Invest.98:800-814,1996））。
mAbはまず、多様な標準的免疫検定、例えば酵素結合免疫吸着検定（ELISA）、放射免疫検定（RIA）のいずれにおいても、熱量測定標識（例えば金コロイドまたはラテックスビーズ）でのmAbの直接標識により、またはサンドイッチ免疫検定におけるようなmAbの間接標識により、特異的なリガンドを検出するのに用いる。これらの検定はすべて、当業によく知られ、そして当業者により、特異的なリガンドを検出するのに最適な条件を決定するため、最小限の日常的試験を用い、実施されることが可能である。好ましくは、免疫検定は標準的な横方向フロースルー（lateral flow-through）形式またはバイオセンサー技術を使用するであろう。
横方向フロー形式には、二重捕捉抗体技術が含まれ、ここで血液試料中の解析物は、まず支持体に束縛される第一の抗体により捕捉される。その後、ストレプト・アビジン系を用い、第二の抗体の結合を検出する。
バイオセンサー技術は、典型的には、表面プラスモン共鳴を用い、抗原（例えばスフィンゴ脂質）が束縛された抗体（例えば抗SPH）に結合する際の、金／ガラスマトリックスの表面上の屈折指標変化を検出する（例えば、ラクトシルセラミドを含むガングリオシドへのコレラ毒素結合を研究した、Kuziemkoら,Biochem.35:6375-6384,1996を参照されたい）。バイオセンサーは、これらが非常に迅速（数分で明らかになる）で、定量的で、そして多数のリガンドに用いるのに扱いやすいため、好ましい。バイオセンサーにはアルゴリズムおよびデジタル読み出しを含むことが可能である。SPH、S1P、およびSPCを検出するためのバイオセンサー形式に基づく免疫検定を個別に行い、虚血心臓状態の指標として各スフィンゴ脂質の独立した測定値を提供してもよい。また別に、単一の検定に複数のmAbを含み、いかなる組み合わせのスフィンゴ脂質（例えばSPHおよびS1P；SPHおよびSPC；S1PおよびSPC；またはSPH、S1PおよびSPC）であっても単独でまたは1つまたはそれ以上のマーカー、例えばTNFαと組み合わせて、単一の測定値を提供してもよい。
実施例6： 血清または全血スフィンゴシンの酵素検定
本方法は、スフィンゴシンキナーゼの精製、およびATP加水分解を検出するためのピルビン酸キナーゼおよびその基質ホスホエノールピルビン酸を使用する共役検定におけるその使用を伴う。共役反応の産物はピルビン酸であり、そして生じるpH変化を、（Serres,A.ら,Pharmaceutical Res.13（2）:196-201.1996に記載されるような）pH依存ポリマー分解技術およびそれに続く測定されるインピーダンス変化を利用するキットで用いる。スフィンゴシンキナーゼは以前記載された（Olivera A.ら,Anal.Biochem.223（2）:306-312,1994）ようにスイス3T3細胞または他の細胞から単離される。
該検定は以下の特徴を含む：試験片上の基質はpH感受性直鎖ターポリマー（例えば、ポリ（N−イソプロピルアクリルアミド−コ−ブリルメタクリレート−コ−アクリル酸）の誘導体）でコーティングされる。血液または血清試料を試験片上に滴下し、そして共役反応を進行させる。共役酵素検定によりpHが低下する（pHの減少は血液中のSPH量に比例する）につれ、ポリマーが分解され、そして試験片上の伝導体をさらす。その後、インピーダンスを測定し、これは片上に滴下された血液または血清試料中のSPH量と比例する。
実施例7： スフィンゴ脂質受容体単離のためのファージディスプレー検定
本技術を用い、本発明のマーカー、特に非ポリペプチド心臓マーカーに高い親和性で結合する受容体をコードし、そして表面にそれらを発現するファージをスクリーニングする。ファージディスプレー技術の詳細な説明に関しては、米国特許第5,223,409号および第5,403,484号を参照されたい。受容体を発現する細菌をその後クローンし、そしてバイオセンサーに基づくキットに用いる。本技術を用い、SPH、S1P、DHSPH、およびSPCを含む、すべての重要なスフィンゴ脂質を含む、本発明の実施に用いられるマーカーを検出してもよい。いかなるマーカーに対する受容体を単離するのに用いられる技術も実質的に同一であるため、該技術を本明細書に一般的に記載する。本方法は、McGregor,D.,Mol.Biotech.6（2）:155-162,1996中に、より詳細に記載されている。
典型的には、cDNAライブラリーを提供し（例えば、Clontech、カリフォルニア州サンディエゴを含む、多くの商業的供給源から入手可能であるcDNAライブラリー）、そしてその後M13などの繊維状雄性ファージの膜タンパク質との融合タンパク質を生成するのに用いる。望ましいマーカー、例えばSPHの受容体を含む融合タンパク質を発現するファージクローンを検出し、そして標準的リガンド結合検定を用い単離する。その後、受容体の遺伝子を、標準的エンドヌクレアーゼ制限酵素およびクローニング法を用い、陽性クローンから切除する（例えば、J.Sambrook,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Ed.,CSH Lab.Press,1989を参照されたい）。該遺伝子はまた、標準的方法を用い、細菌系で発現させ、制限されない量の受容体を産生してもよい。該受容体を標準的方法を用い精製し、そしてその後、受容体が特異性を示すマーカーを検出するのに用いる。例えば、精製受容体をELISAプレート、Biacoreデキストラン表面、いかなる多くの検出キットの試験片、バイオセンサー検出器およびそれらに匹敵するものに束縛し、そして血液または血清中のスフィンゴ脂質の量を測定するのに用いる。膜受容体へのマーカー結合を利用する他の適用もまた、予見される。
実施例8： ヒト血液中の抗スフィンゴシン抗体の測定
本方法は、虚血を経験している患者は、スフィンゴシンなどスフィンゴ脂質の血液レベルが上昇する結果として、抗スフィンゴ脂質抗体を産生するという仮定に基づく。本方法はまた、抗ラクトシルスフィンゴシン抗体が結腸直腸癌患者に観察されており（Jozwiak W.およびJ.Koscielak,1982）、そして抗ガラクトセレブロシドがらい患者の血清に検出された（Vemuri N.ら, 1996）という知見に基づく。
スフィンゴシンおよびその代謝産物の潜在的な抗原性は、これらの陽イオン両親媒性物質としての構造（例えば図1を参照されたい）により、そして抗体をリン脂質（Umeda M.ら,1989）およびスフィンゴ糖脂質（Vemuri N.ら,1996）に対し生成することが可能であるという知見により示唆される。例えば、抗スフィンゴ糖脂質抗体は、実験的にT.サギナタ（T.saginata）に感染させた子ウシ血清において検出された（Baumeister S.ら,Parasitol.Res.81:18-25,1995）。本技術を、SPH、DHSPH、S1P、およびSPCを含むいかなるスフィンゴ脂質またはスフィンゴ脂質代謝産物と共に、本発明を実施するのに用いられる他の非ポリペプチド心臓マーカーを検出するのに適用してもよい。
非ポリペプチド心臓マーカー、例えばSPHに対する抗体を、虚血患者の血清から単離するため、検出されるべきマーカーが結合しているSepharoseなどのマトリックスを用いる、血清からの抗体のアフィニティー精製を使用してもよい。これらの抗体は、行うのが簡単で、そして多数の患者スクリーニングを行うのに安価であるであろう、いかなる多様な周知の免疫スクリーニング方法も用いる、免疫試験の基礎を形成する。
実施例9： 心臓マーカーの家庭モニタリング
医療専門家の助けを借りず心臓マーカーレベルをモニターしたいと希望する個人は、家庭モニタリング装置を用いてもよい。指刺ディップスティック技術（finger stab dipstick technology）は、血液グルコースモニタリングに広く用いられ、そして本方法を、本明細書の開示を考慮し、血液滴中の血液に含まれる心臓マーカー（例えば、非ポリペプチド、二次、および三次マーカー）の測定に適合させてもよい。スフィンゴシンおよびその誘導体を含む、本発明の実施に用いられる心臓マーカーをまた、多くの組織および唾液、汗、および尿を含む、血液以外の体液で測定してもよい。本発明の実施に有用な他の家庭モニタリング装置には、家庭内妊娠試験に類似のものが含まれ、これは尿中の特定のマーカーまたはマーカーの組のレベルを測定する。
携帯電子測定装置もまた、本発明の実施に適用してもよい。例えば、腕時計と同様の大きさおよび形の手首に着用する装置が糖尿病の血液糖レベルをモニターするため開発されている。例えば、Cygnus Gluco WatchTMプラットホームは、解析物を常時、より正確に評価するため、そして指刺技術の不快を伴わず、損なわれていない（intact）皮膚を通じて、個人が連続してグルコースをモニターすることを可能にする。同様に、本方法にしたがった1つまたはそれ以上の心臓マーカーの瞬時連続または周期的モニタリングを、腕時計プラットホームにより達成してもよい。こうした態様において、本発明にしたがった非ポリペプチド心臓マーカー（および、望ましい場合、二次および三次マーカー）の測定は、直接皮膚を通じて行われるであろうし、そして虚血、低酸素症、および心不全の多様な型に相関する他のものと関連する心臓状態を示すマーカーレベルと比較されるであろう。データ記録能力を有するこうした装置から保存されたデータをダウンロードすることもまた、予見され、そしてこれは、臨床家に、患者の最近のマーカーレベル変化の経歴記録を提供するであろう。
さらに、こうした装置、または本発明にしたがい心臓マーカーレベルをモニターするよう設計された他の家庭モニタリング装置を、1つまたはそれ以上の心臓マーカーレベル（またはMRFなどの計算指標）が、ある閾値を超えたとき活性化される警報装置と組み合わせて用いてもよい。該警報は、患者、すなわち使用者、または第三者、例えば友人または親戚、医療専門家、または緊急応答職員、例えば警察、医療補助者、または消防署に、モニターされているマーカーレベルの変化を通知してもよい。こうした警報はまた、伝達されるとき、遠隔測定法によるデータ（telemetry）も含んでもよい。
本発明にしたがった家庭モニタリング装置は、好ましくは、使用のための指示を伴うであろう。該装置はまた、医療装置の製造、使用または販売を規制する行政機関により規定される形式の通達を伴う可能性があり、該通達は該装置の型を家庭で使用することを行政機関が認可したことを反映する。こうした通達は、医療装置に対し、例えば米国食品医薬品局、または他の国の同等の行政機関による認可標識、または認可産物挿入物（insert）であってもよい。
実施例10： プロテインキナーゼCの阻害剤としてのスフィンゴ脂質
本発明の本態様は、共役検定を使用し、血液または他の組織または体液中のスフィンゴシンのレベルを、スフィンゴシンおよび他のリゾスフィンゴ脂質がプロテインキナーゼC（PKC）を阻害する能力を利用することにより評価する（HannunおよびBell,Science 234:670-674,1987；Hannunら,J.Biol.Chem.261:12604-12609, 1986）。血液試料中のスフィンゴ脂質量は、SabbadiniおよびOkamoto（SabbadiniおよびOkamoto,Arch.Biochem.Biophys.223:107-119,1983）に記載されるように、NADHの化学量的量が共役系により酸化されるのにしたがい、340nmの吸光度変化に定量的に関連する。
DAGがPKCに結合することを妨げることにより、スフィンゴシンが該酵素を阻害することが示されてきている（Faucherら.J.Biol.Chem.263:5319-5327,1988）。したがって、スフィンゴシンはDAG結合部位を介し、PKCに直接結合する可能性がある。PKCα配列およびそのコンセンサスDAG結合部位が知られている（Hurleyら,Protein Science（6）:477-80,1997）。SPHはまた、スフィンゴシンキナーゼおよびSPHが特異的に相互作用する他のタンパク質上の推定上の部位にも結合することが可能であるため、いくつかのタンパク質が特異的なSPH結合部位を持つ可能性が高い。したがって、スフィンゴ脂質認識部位を発現するコロニーに関し、ファージディスプレーライブラリー（上記を参照されたい）をスクリーニングした後、標準的技術を用い、推定上のスフィンゴ脂質結合部位をクローンすることが可能である。本タンパク質のcDNAの発現クローニングは、血液試料中のスフィンゴ脂質変化を検出する標準的ELISAで用いることが可能な試薬を産生するであろう。
当業者は、本発明が目的を達成し、そして言及された結果および利点を、本発明に固有のものと共に得るのに、よく適合していることを容易に認識するであろう。本明細書に記載される方法、処置、治療、装置、および組成物は、現在好ましい態様の代表であり、典型であり、そして本発明の範囲に対する限定として意図されない。本明細書を読み、本明細書の改変および他の用法が当業者に思い浮かぶであろうが、これは各々、付随する請求項により定義されるように本発明の精神に含まれる。
上記に引用されるすべての特許および刊行物は、個々の刊行物が各々、明確にそして個別に援用されると示されたのと同じ程度に、本明細書に援用される。
本明細書に例示的に記載される発明は、本発明に特に開示されていない、いかなる要素または複数の要素、または制限または複数の制限なしに、適切に実施してもよい。したがって、例えば、本明細書の各例において、「含む」「実質的に、からなる」および「からなる」という用語のいずれも、他の2つの用語のいずれにより置き換えてもよい。使用されている用語および表現は、説明する用語として用いられ、限定する用語でなく、そしてこうした用語および表現を、示されそして記載される特徴またはその一部の、いかなる同等物を排除するよう使用する意図はなく、請求される発明の範囲内で、多様な修飾が可能であると認識される。したがって、本発明は好ましい態様および所望による特徴により具体的に開示されているが、本明細書に開示される概念の修飾および変動が当業者により行われてもよく、そしてこうした修飾および変動は、付随する請求項により定義されるように本発明の範囲内であると見なされることが理解されなくてはならない。他の態様が以下の請求項の範囲内である。
本出願は、米国仮出願第60/049,274号（Sabbadini、“心筋虚血の早期発見のための方法（METHOD FOR EARLY DETECTION OF MYOCARDIAL ISCHEMIA）”、1997年6月10日出願）に関連し、またそれに対する優先権を主張するものである。
発明の分野
本発明は一般的に心疾患の診断の分野に関し、具体的には心不全、心臓性虚血、または低酸素を診断するために、非ポリペプチド心臓性マーカーのレベル（例えば濃度）を心臓障害（特に慢性冠動脈基礎疾患）の指標として検出し、そして心臓性虚血または低酸素を緩和するように設計した治療法のモニタリングの方法に関する。
発明の背景
虚血性心疾患は主要な型の心不全である。世界中で数百万人の人が心不全に冒されており、米国では主要な死因である。心臓性虚血の最も一般的な徴候は胸痛（狭心症）であり、これは心臓発作（急性心筋梗塞またはＡＭＩ）および突然死を引き起こす。虚血性心疾患の症状を示す個体に加え、高血圧状態、高レベルの血清コレステロール、および／または家族歴のような指標によれば、多くの他の個体が心疾患を発症する高リスクを負っている。
心筋虚血性障害が起こるのは、心血流が制限されて（虚血）、そして／または心筋への酸素の供給が損なわれて（低酸素）心臓の酸素必要量が満たされない場合である。冠動脈のアテローム硬化症は、狭心症のような虚血に伴う症状の最も一般的な原因である。虚血および低酸素は一過性および可逆性でありうるが、また、梗塞も引き起こしうる。梗塞の際、心組織が損傷し、心臓の細胞は透過性となり、その内容物の一部を周辺環境に放出するが、それには心酵素および他の生化学的マーカーがある。これらの細胞マーカーにはクレアチンキナーゼ（ＣＫ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の酵素活性、およびクレアチンキナーゼ−ＭＢ（ＣＫＭＢ）、およびトロポニン（ＩおよびＴ）、およびミオグロビンの質量レベルがあるが、その後それらを血清中で検出できる。
現在の診断法は一般に、兆候が現れた後で心組織の損傷の程度を評価する。しかしながらその時点では、疾患はＡＭＩが切迫しているか、または既に起こってしまっている程度にまで進行しているかもしれない。現在の方法で梗塞を発見および確認するためには、多くの場合に緊急の状態で得られる時間より長時間が必要であるが、そのような状態では迅速な評価が効果的な患者の治療および生存に重要である。更に、約２５％のＡＭＩ患者は不定型な症状を示し、多くの既知のテストは誤って陰性となり、結果としてＡＭＩを有する患者の約５％は故意にではなく除かれる（Mair J. ら,Clin.Chem.41：1266-1272,1995；Newby L.K.ら,Clin.Chem.41：1263-1265,1995）。救急医療施設では、ＡＭＩの疑いのある患者の心電図検査（ＥＣＧ）によるモニタリングは最も迅速なＡＭＩの発見方法であるが、ＡＭＩ患者の約半数しかうまく発見できない（Mairら,1995）。
心電図検査および現在可能な血液診断試験は一般に、ＡＭＩに関連する損傷に先立つ心筋虚血の早期発見には効果的でなく、それは試験が梗塞に関連する組織の損傷を検出するためである。それらは慢性冠動脈基礎疾患、および結果として起こる心筋虚血（ＡＭＩに関連する損傷に先立って起こる）の早期発見には効果的でない。現在、慢性冠動脈基礎疾患の診断のみが運動ストレスを負荷してＥＣＧでモニタリングされ（例えばトレッドミル運動負荷試験）、一般的に狭心症の症状の確認に使用される。そのようなストレス試験は、一般に、患者が症状を経験し、治療が求められた後（例えば救急医療施設で）行われる。ストレス試験は無症状の患者のスクリーニングに使用されることもあるが、試験は費用が高く、時間がかかり、そして一般的に多数の患者のルーチンのスクリーニングを行うことができない。更に、運動ストレス試験による評価は約１５％の誤った陰性結果を生じる。
診断試験が開発されてきており、心臓のタンパク質を使用して患者の胸痛の原因が心臓かどうか、もしそうであれば、患者が心筋梗塞に罹患したかどうか、または不安定狭心症に罹患しているかどうかの測定が行われてきた（例えば米国特許第5,290,678号、5,604,105号、および5,710,008号を参照）。これらの試験では、やがて起こる心筋梗塞がいつであるかを早期に予告することはできない。従って、非侵襲性で、感度が高く、そして確実な治療のポイントとなる‘ベッドサイド試験’が心臓性虚血の早期発見のために、特に心疾患のリスクを有する人に必要とされている。
無症状の心臓性虚血を発見するための（特に心疾患のリスクが高い人についてスクリーニングを行うための）迅速かつ確実な方法の必要性の観点から、本発明は心臓性虚血または低酸素のための初期検出アッセイである。
発明の概要
本発明は、哺乳類（特にヒト）における心疾患（例えば心不全、心臓性虚血、および心臓性低酸素）の早期発見のための、非ポリペプチド心臓性マーカー（例えばスフィンゴシンおよび／またはその代謝産物）の血清中もしくは全血中のレベルをモニタリングすることによる診断法を提供する。例えば、心臓性虚血（すなわち心臓への血液供給の不足）の過程における初期事象は、心筋によるある種の天然に存在する非ポリペプチド化合物、または心臓性マーカーの過剰生成であるが、それらは例えば（しかしそれに限定されるものではないが）、スフィンゴシン（ＳＰＨ；Ｄ（＋）−エリトロ−２−アミノ−４−トランス−オクタデセン−１，３−ジオールまたはスフィンゲニン）、その異性体、および代謝産物；セラミド（Ｃｅｒ、ｎ−アシルスフィンゴシン）、スフィンゴシン−１−ホスフェート（Ｓ１Ｐ）、スフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ、リソスフィンゴミエリン）、およびグリコスフィンゴ脂質、そしてリソホスファチジン酸（ＬＰＡ）のようなリソリン脂質、そして上記のいずれかの代謝物である。本発明は、ＳＰＨの血清中での増加の観察に基づくが、これは血中のスフィンゴ脂質レベルは心臓性虚血の新しい生化学マーカーとなることを示唆している。
証拠が示すところによれば、心臓を供給源とする腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）は、心臓性虚血によって起こる特徴的な血清スフィンゴ脂質の上昇の原因でありうる。従って、本発明の好ましい態様では、血清中のＳＰＨレベル、またはスフィンゴシン・バックボーンを有する他の関連脂質のレベルを、二次的マーカー（例えば血清ＴＮＦα）のレベルと組み合わせて、虚血の指標として使用する。もちろん、他の非ポリペプチド心臓性マーカーをＴＮＦαのような二次的マーカーと共に使用してそのような指標を計算してもよい。この２つの分析物による測定を心筋リスク因子（ＭＲＦ）と呼ぶ。
本発明にかかるキットは費用効果がある迅速な試験を提供し、これを使用して他の心臓の状態の中から急性心筋梗塞（ＡＭＩ）を同定および予言し、また狭心症が心臓性虚血によって起こることを確認できる。更に、本発明を使用して症状が現れる前の初期の虚血または低酸素事象の簡単なスクリーニングを、例えば心疾患のリスクが高い人、および他の型の心不全（心筋炎、心筋症、そして、うっ血性およびidopathic心不全を含む）を経験している人に行うことができる。更に、本発明にかかる方法および組成物を使用して、虚血および心不全を軽減するように設計した治療介在物の効果をモニタリングできる。
従って、ある観点では、本発明は哺乳類において心臓性虚血または低酸素を特徴とする心疾患を検出する方法を提供し、その方法は以下の段階を含む：（ａ）哺乳類由来の試験サンプル中の非ポリペプチド心臓性マーカーのレベルを測定し；そして（ｂ）試験サンプル中で測定された心臓性マーカーのレベルが心臓性虚血または低酸素と関係があるかどうかを確認する。
“虚血”は心筋に十分な血液供給がなされない状態を意味し、また“低酸素”は心筋に十分な酸素が供給されないことを意味する。
“哺乳類”とはマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ネコ、イヌ、ブタのような生物をいい、より好ましくはサルおよび類人猿、そして最も好ましくはヒトである。
好ましい態様では、本発明の方法の験体はヒトであり、使用される試験サンプルは好ましくは体液である。体液は好ましくは血液、尿、リンパ液、および唾液からなる群から選択されるが、他のいずれの体液（血清、胃液、および胆汁のような）を使用してもよい。最も好ましくは体液は血液である。
“非ポリペプチド心臓性マーカー”とは、当業者によってペプチドとみなされず（たとえペプチド結合またはアミド結合を含有したとしても）、心臓と独特の関係を有する化合物を意味し、そのため心臓および心臓機能が化合物のソースである。
非ポリペプチド心臓性マーカーは好ましくは脂質であり、更に好ましくはスフィンゴ脂質である。“脂質”とは、水に不溶で、低極性の有機溶媒によって細胞から抽出できる物質を示す。脂質にはテルペン、ステロイド、脂肪、および脂肪酸のような化合物がある。“スフィンゴ脂質”とは、スフィンゴシン・バックボーンを共有する化合物を意味し、これは一般式ＣＨ3（ＣＨ2）14ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＮＨ2）ＣＨ2−Ｒ（式中、Ｒはいずれの有機物質でもよい）の１８炭素鎖アミノアルコールを含有する。“スフィンゴシン”とは図−１に示す、式ＣＨ3（ＣＨ2）14ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＮＨ3 +）ＣＨ2ＯＨの化合物を示す。本発明の範囲はに、スフィンゴ脂質の炭素鎖が不飽和（すなわち二重結合または三重結合）中心を含有する化合物、またはヒドロキシドまたはアミン置換基が更に有機物質で置換された化合物が含まれる。また理解されるように、“スフィンゴ脂質”とは異性体、例えばトレオ−スフィンゴシン、エリトロ−スフィンゴシン、そしてスフィンゴ脂質のＬおよびＤ異性体、並びに上記の非ポリペプチド心臓性マーカーのいずれかの代謝物をいう。
非ポリペプチド心臓性マーカーは、より好ましくはスフィンゴシンまたはその代謝物の一つである。代謝物は好ましくはセラミド（Ｃｅｒ、ｎ−アシルスフィンゴシン）、スフィンゴシン−１−ホスフェート（Ｓ１Ｐ）、スフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）、およびジヒドロスフィンゴシン（ＤＨＳＰＨ）からなる群から選択される。これらの代謝物の構造を図−１に示す。
好ましい態様では、本発明の方法の測定段階は、クロマトグラフィー、イムノアッセイ、酵素アッセイ、および分光法からなる群から選択される方法によるマーカーのレベルの測定を含み、心臓性マーカーを直接または間接的に検出する。“マーカーのレベル”とはサンプルまたは哺乳類中のマーカーの量を意味し、濃度、質量、モル、容量（好ましくは濃度）の単位、またはサンプル中に存在するマーカーの量を示す他の基準をいう。
クロマトグラフィー法は好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）である。分光法は、好ましくは紫外分光法（ＵＶまたはＵＶ／ＶＩＳ分光法）、赤外分光法（ＩＲ）、および核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）からなる群から選択される。
イムノアッセイは好ましくはＣｅｒ、ＳＰＨ、Ｓ１Ｐ、ＤＨＳＰＨ、およびＳＰＣからなる群から選択される非ポリペプチド心臓性マーカーを検出する。好ましくは、イムノアッセイは試験サンプル中の非ポリペプチド心臓性マーカーを抗マーカー抗体を使用して検出する。
“抗体”とは、非ポリペプチド心臓性マーカーに対する特異的結合親和性を有するモノクローナルもしくはポリクローナルの抗体もしくは抗体フラグメントをいう。
“特異的結合親和性”とは、特定の条件下で、抗体または抗体フラグメントが、他の化合物に結合するより高い親和性で標的化合物に結合することを意味する。化合物に対する特異的結合親和性を有する抗体または抗体フラグメントをサンプル中の化合物の存在および／または量を検出する方法に使用してもよいが、これは免疫複合体が生成する条件下でサンプルを抗体もしくは抗体フラグメントと接触させ、抗体もしくは抗体フラグメントと結合した化合物の存在および／または量を検出することによる。
“ポリクローナル”とは、抗原またはその抗原機能性誘導体で免疫した動物の血清から得た抗体分子の不均質群である抗体をいう。ポリクローナル抗体を生成するために、種々のホスト動物に抗原を注射して免疫してもよい。ホストの種によって、種々のアジュバントを使用して免疫学的応答を向上してもよい。
“モノクローナル抗体”は、特定の抗原に対する抗体の実質的に均質な群である。それらは、培養液中で継代培養した細胞系によって抗体分子を生成する技術によって得てもよい。モノクローナル抗体は当業者に知られる方法で得てもよい。例えばKohlerら,Nature 256:495-497,1975および米国特許第4,376,110号を参照されたい。
“抗体フラグメント”とは抗体の一部いい、多くの場合、超可変領域と周囲のＨ鎖およびＬ鎖の部分であり、特定の分子に対して特異的結合親和性を示す。超可変領域は抗体の一部であり、標的化合物に物理的に結合する。“抗体フラグメント”という用語は１本鎖の（single change）抗体も含む。
好ましい態様では、本発明の測定段階は心臓性マーカーの濃度とマーカーに対する既定の値との比較である。好ましい態様では、既定値は正常な心臓の状態を示すものである。この既定値は、本発明の方法を使用して以下の本発明の詳細な説明に記載するように決定でき、特定の患者に特有なものであるか、または所定の個体群に一般的なものであってもよい。既定値は好ましくは試験サンプルを与える哺乳類と同一の種で、ほぼ同年齢の哺乳類から得る。ある態様では、既定値は患者が健康な時に、特定の患者のマーカーのレベルを事前に測定することによって確立しておいてもよい。
本発明の方法の実施では、試験サンプル中の非ポリペプチド心臓性マーカーのレベル（例えば濃度）は、好ましくはそのマーカーに対する既定値より高く、より高いレベルは虚血、低酸素、もしくは別の型の心不全と相互関係があるか、またはそれを示す。しかしながら、ある種の非ポリペプチド心臓性マーカーでは、試験サンプル中のマーカーのレベルは既定値より低いことが虚血、低酸素、または別の型の心不全を示してもよい。
更なる観点では、哺乳類における心不全（例えば心臓性虚血または低酸素）を検出する方法に関し、その方法は以下の段階を含む：（ａ）哺乳類由来の試験サンプル中の１種以上の非ポリペプチド心臓性マーカーのレベルを測定し；（ｂ）試験サンプル中の１種以上の二次的心臓性マーカーのレベルを測定し、そして（ｃ）試験サンプル中で測定された心臓性マーカーのレベルが心臓性虚血または低酸素と相互関係があるかどうかを確認する。二次的心臓性マーカーは、好ましくはインターロイキン（ＩＬ−１、２、または６）、インターフェロン・ガンマ（ＩＦＮγ）、および特定の腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）のような、プロ−炎症性サイトカインである。ＴＮＦαは虚血および低酸素の病態生理学と関係づけられている。当業者に認識されるように、即時的な方法および組成物は２種（またはそれ以上）の非ポリペプチド心臓性マーカーの単独での、または１種以上の二次的心臓性マーカーと合わせた測定を含んでもよい。本発明の目的では、“二次的”心臓性マーカーは心不全の根本的な原因を促進するか、またはそれに寄与する、細胞間または細胞内メッセンジャーである。本発明のこの観点の他の態様では、１種以上の“三次的”心臓性マーカーのレベルを測定し、非ポリペプチド心臓性マーカーについて測定したレベル、または非ポリペプチド心臓マーカーおよび二次的心臓性マーカーを試験したものと合わせて使用することができる。本発明の目的では、“三次的”マーカーは心臓細胞の破壊に関係するもので、一般に破裂または溶解した（lyzed）心臓細胞から放出されたタンパク質、ポリペプチド、および核酸に関する。そのようなマーカーの好ましい例にはＣＫ、ＬＤＨ、ＣＫＭＢ、およびトロポニンがある。そのような三次的心臓性マーカーの他の好ましい例には心臓細胞に特異的な核酸、特に（好ましくは心臓細胞のみで）優性に発現したｍＲＮＡがある。
別の観点では、本発明の方法は心筋リスク因子（ＭＲＦ）の推定に関する。ここで使用するように、ＭＲＦは、少なくとも１種の非ポリペプチド心臓性マーカーの測定レベル（好ましくは濃度）、および二次的心臓性マーカー（例えばＴＮＦα）の測定レベル（好ましくは濃度）と数学的関係がある。数学的関係は、好ましくは、少なくとも１種の非ポリペプチド心臓性マーカー（好ましくはスフィンゴ脂質）の測定レベル（例えば濃度）と二次的マーカー（好ましくはＴＮＦα）の測定レベル（例えば濃度）の積である。もちろん、種々のマーカー間の他の数学的関係もまた、本発明の範囲内である。例えば、そのような関係は２種の非ポリペプチド心臓性マーカー、非ポリペプチド心臓性マーカーと二次的心臓性マーカーと三次的心臓性マーカー、または非ポリペプチド心臓性マーカーと三次的マーカーを含んでもよい。
別の観点では、本発明は続いて起こる急性心筋梗塞（または他の型の心不全）を予防またはその重症度を低減する方法を提供するが、これは心臓性虚血または低酸素をここに記載するように検出し、予防策をとることによる。予防策は、好ましくは以下からなる群から選択される：冠状動脈バイパス術、予防的血管形成術、および／あるいは、治療的有効量の１種以上の抗凝固薬、血栓溶解薬、または虚血もしくは低酸素状態の緩和を意図する他の薬剤産物の投与。
更に、本発明の方法により、ヘルス・ケアの専門家は、心臓性虚血または低酸素の検出による心臓の処置後の患者の予後を決定することができる。心臓の処置は、好ましくは冠状動脈バイパス術、予防的血管形成術、および、１種以上の抗凝固薬の投与からなる群から選択されるが、他の心臓の処置も本発明の範囲内である。
別の観点では、本発明は、哺乳類において心臓性虚血または低酸素から生じうる心不全を検出するためのキットを提供する。好ましくは、そのようなキットは哺乳類から得た試験サンプル中の少なくとの１種の非ポリペプチド心臓性マーカーの異常なレベルを検出するための組成物を含む。好ましくは、組成物は定量的な異常レベルの測定を可能とするが、異常レベルの測定は半定量的に行うこともできる（例えば既定の閾値よりレベルが高いか低いか）。組成物は好ましくは基質を含み、これは好ましくはＣｅｒ、ＳＰＨ、Ｓ１Ｐ、ＤＨＳＰＨ、およびＳＰＣからなる群から選択された非ポリペプチド心臓性マーカーに結合する抗体である。組成物は、１種以上の他の基質（例えば抗ＴＮＦα抗体）を含有して他の心臓特異的マーカーを検出してもよい。基質を固相支持体に結合させて操作を容易にしてもよい。一般的な型の固相支持体にはプレート、チューブ、およびビーズがあり（しかしそれらに限定されるものではない）、それらは全てガラスまたは別の好適な物質、例えばポリスチレン、ナイロン、酢酸セルロース、ニトロセルロース、および他のポリマーで生成することができる。
“定量的”測定では、測定の段階により、試験サンプル中の心臓性マーカーのレベルを正確に示す値が得られる。“半定量的”測定では、測定の段階により、心臓性マーカーのレベルが特定の範囲内であるかどうかが示される。半定量的方法には、例えば（しかしそれらに限定されることはないが）色素指示薬または特定のシンボルの描写があるが、それぞれの色素またはシンボルは濃度範囲を表す。
好ましくは、本発明の実施において検出される心臓性マーカーのレベルは、正常な心臓の状態を示す標準的な、または参照となる基準とは異なる。より好ましくは、検出される心臓性マーカーのレベルは標準的な基準より大きい。
好ましい態様では、本発明に従って測定される心臓性マーカーのレベルは“非侵襲的な”方法、すなわち試験サンプルを採取するために被験哺乳類の皮膚に穴を開けることを必要としない方法を使用して検出する。非侵襲的方法には唾液、尿、および汗のような体液の検査、またはイメージング法の使用があるが、それらに限定されるものではない。
好ましくは、心臓性マーカーは本発明のキットを使用して、クロマトグラフィー、イムノアッセイ、酵素アッセイ、および分光法からなる群から選択される方法を用いて測定し、マーカーを直接または間接的に検出する。クロマトグラフィー法は、好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）である。分光法は、好ましくは紫外分光法、赤外分光法、および核磁気共鳴分光法からなる群から選択される。非ポリペプチド心臓性マーカーに関しては、イムノアッセイは、好ましくはＣｅｒ、ＳＰＨ、Ｓ１Ｐ、ＤＨＳＰＨ、またはＳＰＣを検出する。
別の観点では、本発明は哺乳類において心臓性虚血または低酸素を検出する装置を提供し、装置は使用者に哺乳類由来の試験サンプル中の少なくとも１種の非ポリペプチド心臓性マーカーの異常レベルの情報を提供する。
情報提供の段階は、好ましくは該心臓性マーカーを検出する段階を含み、同様に、非侵襲的方法によって実施されるのが好ましい。また情報提供の段階は、好ましくはマーカーのレベルを既定値と比較する段階を含む。最後に、情報提供の段階は好ましくは使用者（装置の着用者であってもなくてもよい）にマーカーのレベルについて警告を与える段階を含む。装置はマーカーのレベルを表示するか、マーカーのレベルが既定の閾値を上回ったときにアラームをならすか、または警察、救急車、もしくは消防署のような緊急隊員に知らせてもよい。
装置を使用する哺乳類は好ましくはヒトである。装置は、好ましくは体液について非ポリペプチド心臓性マーカーの存在を試験するものであり、マーカーは好ましくは、例えばスフィンゴシンまたはその代謝物のようなスフィンゴ脂質である。スフィンゴシン代謝物は好ましくはＣｅｒ、Ｓ１Ｐ、ＳＰＣ、およびＤＨＳＰＨからなる群から選択される。
本発明の更に別の観点は、哺乳類（特にヒト）から得た試験サンプル（好ましくは体液）中の少なくとも１種の非ポリペプチド心臓性マーカーの異常なレベル（例えば濃度）を検出するための組成物に関する。ある態様では、非ポリペプチドマーカーのレベルを定量的に測定する；他の態様では、測定は半定量的である。
この観点の好ましい態様では、組成物は抗体、抗体フラグメント、または抗体の抗原結合ドメインを含み、非ポリペプチド心臓性マーカーに特異的に結合する。抗体を使用する好ましい態様では、抗体はポリクローナルであってもよく、好ましくはモノクローナル抗体である。ある態様では、組成物によって検出される非ポリペプチド心臓性マーカーは脂質であり、好ましくはスフィンゴ脂質またはその代謝物、特にＣｅｒ、ＳＰＨ、Ｓ１Ｐ、ＤＨＳＰＨ、およびＳＰＣである。
本発明にかかる組成物は、非ポリペプチド心臓性マーカーを検出する能力のある部分に加えて、二次的心臓性マーカー（例えばＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−２，ＩＬ−６、およびＩＦＮγ）を検出する能力のある第二の部分、そして／または三次的心臓性マーカー（例えばＣＫ、ＣＫＭＢ、ＬＰＨ、トロポニン、および核酸、特に心臓細胞に特異的な核酸）を検出する能力のある第三の部分を有してもよい。三次的心臓性マーカーが核酸プローブを含む場合は、核酸のヌクレオチド配列の少なくとも十分な部分に実質的に相補的であり、ストリンジェントな条件下でプローブと核酸が選択的にハイブリダイゼーションできる。
好ましい態様では、本発明の組成物は、心臓性マーカーを検出する部分が結合している、または結合できる固相支持体を更に含有する。ある態様では、検出部分（例えば抗体または核酸プローブ）は共有結合を介して固相支持体と結合する。他の態様では、結合は非共有結合（例えば高親和性結合対のメンバー間の）であってもよい。高親和性結合対の多くの例が当該分野で知られており、ビオチン／アビジン、配位子／レセプター、および抗原／抗体のペアがある。
上記の本発明の概要は非限定的なものであり、本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な説明および請求項から明らかとなる。
図の簡単な説明
図−１に以下の化学構造を示す：スフィンゴシン（ＳＰＨ；Ｄ（＋）−エリトロ−２−アミノ−４−トランス−オクタデセン−１，３−ジオールまたはスフィンゲニン）、スフィンゴシン−１−ホスフェート（Ｓ１Ｐ）、スフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ、リソ−スフィンゴミエリン）、セラミド（Ｃｅｒ、ｎ−アシルスフィンゴシン）、およびジヒドロスフィンゴシン（ＤＨＳＰＨ；スフィンガニン）。これらの脂質は全てスフィンゴシン・バックボーンを共有し、長鎖１８−Ｃアミノアルコールを含有する。他のスフィンゴ脂質にはＮ，Ｎ−ジメチル−スフィンゴシン、スフィンゴミエリン（ｎ−アシルスフィンゴシン−１−ホスホコリン）、および種々のスフィンゴ糖脂質（セレブロシドおよびガングリオシド）がある。エリトロ、トレオ、Ｄ、Ｌ、および他のスフィンゴ脂質の異性体もまた、本発明の範囲内に含まれる。
本発明の詳細な説明
本発明は、虚血性心疾患または他の型の心不全の早期診断のための方法および組成物に関し、これはスフィンゴシン（ＳＰＨ）および／またはその代謝物のような非ポリペプチド心臓性マーカーのレベルを単独で、または１種以上の他の心臓性マーカーと合わせて、哺乳類由来の試験サンプルから検出することによる。本発明は以下のような発明者の発見に基づくものである：（例えば心臓性虚血によって起こる）心不全の経過の初期事象は心筋によるある種の非ポリペプチド心臓性マーカーの過剰生成であり、そのマーカーにはある種の脂質、中でもＳＰＨおよびその代謝物、Ｃｅｒ、Ｓ１Ｐ、ＤＨＳＰＨ、およびＳＰＣがある。
Ｉ．心筋梗塞におけるＳＰＨの役割
Ｃｅｒ、ＳＰＨ、Ｓ１Ｐ、およびＳＰＣの化学構造を図−１に示す。これらのスフィンゴ脂質は全て同一の化学バックボーンＣＨ3（ＣＨ2）12ＣＨ＝ＣＨＣ（ＯＨ）ＣＨ（ＮＨ2）ＣＨ2−を共有し、これにヒドロキシ、ホスフェート、またはホスホリルコリン部分のいずれかが結合する。図−１に示すように、バックボーンのアミノ基は正に帯電しているか、または置換されていてもよい。図−１には示していないが、ジヒドロスフィンゴシン（またはスフィンガニン）は当該分野で知られるＳＰＨの別の代謝物である（C.A.Grob,Record Chem.Progr.（Kresge-Hooker Sci.Lib.）18:55-66,1957；D.Shapiro, スフィンゴ脂質の化学（Chemistry of Sphingolipids）（Hermann,Paris,1969））。体液（例えば血液または血清）中のこれらの分子を検出する種々の方法を使用して、真性または切迫心不全（心筋虚血および低酸素状態に関連するような）を発見できる。ここに示す結果によれば、ＳＰＨおよび／またはその代謝物の体液中のレベルは心臓性虚血または低酸素に関する初期の生化学的マーカーとなる。
スフィンゴ脂質（例えばＳＰＨ、Ｓ１Ｐ、ＤＨＳＰＨ、またはＳＰＣ）を虚血性心疾患を有する患者、または心臓性虚血症状を有しないコントロールの血清から抽出し、蛍光マーカー（例えばｏ−フタルアルデヒド、ＯＰＡ）で誘導体化してクロマトグラフィーで検出してもよい。次いで、そのような誘導体化したスフィンゴ脂質を検出し、種々の方法論（ＨＰＬＣを含む）で定量することができる。
特定の理論に拘束されることは望ましくないが、データは炎症性サイトカイン、特にＴＮＦαがＳＰＨおよびその代謝物の生成を直接または間接的に増加させることを示唆している。例えば、ＴＮＦαは心臓性アシドーシスを起こし、それによってＳＭアーゼ活性が増大し、ＳＰＨの生成が増加すると考えられる。その後、ＳＰＨが心臓性カルシウムチャンネルに作用し、カルシウム放出が制御されなくなる。また、ＴＮＦαとＳＰＨの協同作用によりアポトーシスが促進され、細胞内ＳＰＨおよびその代謝物の血清中への放出が増加し、更に心筋梗塞が誘引される。発明者は、以下のことを示すデータを既に発表している：ＴＮＦαはＳＰＨの生成を活性化する（Krownら,J.Clin.Invest.98:2854-2865,1996）、そして、生成するＳＰＨおよびその代謝物は有害作用を心臓性カルシウムチャンネル（McDonoughら,Circ Res.75:981-989,1994；Dettbarnら,J.Mol.Cell.Cardiol.,26:229-242,1994；Krownら,FEBS Letters 376:24-30,1995；Sabbadiniら,J.Biol.Chem.267:15475-15484,1992；Websterら,J.Mol.Cell.Cardio.26:1273-1290,1994）および心臓性細胞死（Krownら,J.Clin.Invest.98:2854-2865,1996）に与える。
そのような心臓性低酸素および虚血は周期となり、虚血性心臓の酸性状態により過剰なＳＰＨの生成が刺激され、次いでプロトンを排出する細胞の能力が阻害される。細胞内の酸性状態の上昇により、正のフィードバックでＳＰＨの生成が更に刺激され、プロトンおよびＳＰＨの両方の細胞内レベルが更に上昇する。発明者の考えるところでは、細胞内ｐＨの低下は細胞の収縮性可動部分に対する重大な有害作用を有し、また、ＳＰＨレベルの上昇により筋小胞体膜およびＬ型カルシウムチャンネルからのカルシウムの放出が制御されなくなり、それによって細胞はビート・トゥ・ビートの収縮作用を調節できなくなる。スフィンゴ脂質介在型アシドーシスおよびカルシウムの脱調節によりアポトーシスが活性化され、細胞死およびその後の心機能の低下が起こる。ＳＰＨおよびその代謝物は心不全の早期の指標として有用であり、それはそれらの化合物が心臓性虚血および低酸素のような状態において早期に、心臓性細胞死に関係する生化学的化合物が放出される前に出現するからである。
本発明は、一部には、虚血患者ではスフィンゴ脂質の血清レベルが非虚血コントロールで検出されるより有意に高いという発見に基づいている。得られた結果によれば、心臓性虚血または低酸素に関係する心不全を診断するＳＰＨのレベルは一般に１００ｐｍｏｌ／ｍＬより高い。心臓性虚血または低酸素を診断するＳＰＨのレベルは好ましくは約２００ｐｍｏｌ／ｍＬ〜約２，５００ｐｍｏｌ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは約３００ｐｍｏｌ／ｍＬ〜約２，０００ｐｍｏｌ／ｍＬの範囲、そして最も好ましくは約４００ｐｍｏｌ／ｍＬ〜約１，５００ｐｍｏｌ／ｍＬの範囲である。
ＳＰＨの代謝物では、高い血清（または他の体液）レベルによって同様に心臓性虚血または低酸素が診断される。血清Ｓ１Ｐでは、診断レベルは一般に１００ｐｍｏｌ／ｍＬより高い。血清中の、心臓性虚血または低酸素を診断するＳ１Ｐレベルは、好ましくは約２００ｐｍｏｌ／ｍＬ〜約２，５００ｐｍｏｌ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは約３００ｐｍｏｌ／ｍＬ〜約２，０００ｐｍｏｌ／ｍＬの範囲、そして最も好ましくは約４００ｐｍｏｌ／ｍＬ〜約１，５００ｐｍｏｌ／ｍＬの範囲である。ＳＰＣでは、血清中の診断レベルは一般に１００ｐｍｏｌ／ｍＬより高い。心臓性虚血または低酸素を診断するＳＰＣレベルは、好ましくは約２００ｐｍｏｌ／ｍＬ〜約２，５００ｐｍｏｌ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは約３００ｐｍｏｌ／ｍＬ〜約２，０００ｐｍｏｌ／ｍＬの範囲、そして最も好ましくは約４００ｐｍｏｌ／ｍＬ〜約１，５００ｐｍｏｌ／ｍＬの範囲である。同様の血清レベルのＤＨＳＰＨで心臓性虚血が診断される。
ＨＰＬＣを使用して心臓性マーカー（血清のような体液中のＳＰＨのような非ポリペプチド心臓性マーカーを含む）を検出および定量できるが、そのようなマーカーを検出する他の方法も使用できる。例えば、酵素アッセイを使用して試験サンプル中のスフィンゴ脂質（または他の非ポリペプチド心臓性マーカー）を間接的に検出することができる。そのようなアッセイには、例えば、培養細胞からスフィンゴシンキナーゼを精製して共役アッセイに使用するものがあり、ピルビン酸キナーゼとその基質であるホスホエノールピルビン酸を使用して加水分解を検出する。共役反応の産物はピルビン酸であり、その後この産物によって起こるｐＨの降下を種々の既知の方法（インピーダンスに測定可能な変化を生じるｐＨ依存性ポリマーの破壊の検出のような）で検出する。同様に、血液または血清中のスフィンゴシンキナーゼは、ルシフェラーゼを使用してＡＴＰの加水分解を検出する共役アッセイで検出することができる。そのようなアッセイはＳＰＨ（Ｓ１ＰまたはＳＰＣではない）の血中レベルを間接的に検出するのに好適である。
種々の既知の方法を使用する免疫診断アッセイを使用して心臓性マーカー（スフィンゴ脂質およびその代謝物のような非ポリペプチド心臓性マーカーを含む）を体液（血液または血清を含む）中で検出することができる。Ｃｅｒ、ＳＰＨ、ＤＨＳＰＨ、Ｓ１Ｐ、およびＳＰＣに特異的な抗体および抗体フラグメント、そして他のそのようなマーカーを生成し、１種以上のそのようなマーカーの存在を、全血、血清または他の体液中で、標準的なイムノアッセイを使用して、定量的または半定量的に検出することができる。同様に、抗スフィンゴ脂質（または他の非ポリペプチド心臓性マーカー）抗体の存在を体液中で検出するイムノアッセイを使用して、心不全（慢性虚血および低酸素を含む）に関係する慢性症状を有する患者におけるそのようなマーカーのレベルの上昇を間接的に測定することができる。このアッセイは、そのような慢性症状を有する患者はそれらのマーカーの血中レベルの上昇の結果としてそれに対する抗体を生成するという仮説に基づいているが、これは結腸直腸癌の患者に観察される抗ラクトシルスフィンゴシン抗体（Jozwiak W.& J.Koscielak,Eur.J.Cancer Clin.Oncol.18:617-621,1982）およびライ病患者の血清に検出される抗ガラクトセレブロシド抗体（Vemuri N.ら,Leprosy Rev.67:95-103,1996）との類推による。
１種以上の二次的マーカー（ＴＮＦαのような）の検出をＳＰＨおよび／もしくはその代謝物のような１種以上の非ポリペプチド心臓性マーカーの検出と組み合わせて、心不全（心臓性虚血または低酸素によって起こりうるような）の早期の指標とすることができる。ＴＮＦαのような二次的心臓性マーカーの生成も心不全（心臓性虚血によって起こりうるような）に関係し、体液（例えば血液および血清）中のＳＰＨおよびその代謝物のような非ポリペプチド心臓性マーカーのレベルの上昇を誘引しうるので、１種以上の二次的マーカー（ＴＮＦαのような）のレベルと非ポリペプチド心臓性マーカー（スフィンゴ脂質のような）を組み合わせた診断はより感度の高い心不全の指標となる。従って、非ポリペプチド心臓性マーカーと二次的マーカーのレベルの積を使用して虚血または低酸素のリスクを定量的に測定することができ、これを“心筋リスク因子”（ＭＲＦ）と呼ぶ。
スフィンゴ脂質（ＳＰＨおよび／またはその代謝物を含む）のような非ポリペプチド心臓性マーカーの検出を、原因として心不全に関係する虚血、低酸素、または他の症状に特徴的なレベルでの（好ましくは試験キットを使用する）行うことは、狭心症の患者または虚血性心疾患のリスクのある個体においてこれらの症状を同定するのに有用である。またこのアッセイはＡＭＩおよび他の型の心不全の診断に有用である。本発明は、虚血または低酸素状態による心疾患のリスクのある人について、伝統的な症状が発見される前にシンプルなスクリーニングを行うのに有用である。本発明はまた、心筋虚血の治療を意図した治療法の経過の後に行うのにも有用であり、従って重要な予後徴候となる（have important prognostic value）。また、本発明の方法および組成物を使用してＡＭＩの発症を予防することができ、これは、患者またはヘルス・ケアの専門家が本発明の方法を使用してＡＭＩとなるであろう症状を発見し、血管形成のような予防処置を施せることによる。
II． 実験動物の心臓細胞によって生成されたスフィンゴシンは心不全に類似した病態生理学的効果を有する
スフィンゴシン（ＳＰＨ；Ｄ（＋）−エリトロ−２−アミノ−４−トランス−オクタデセン−１，３−ジオールまたはスフィンゲニン）は、発明者が心筋組織に内在することを発見した脂質第２メッセンジャーである（Dettbarnら,J.Mol.Cell.Biol.26:229-242,1994；Sabbadiniら,Biochem.Biophys.Res.Comm.193:752-758,1993）。発明者が発表した研究は、ＳＰＨがカルシウムを調節する筋細胞の能力に対して劇的な効果を有することを示唆している（Dettbarnら,1994;Krownら,FEBS Letters 376:24-30,1995;Sabbadiniら,J.Biol.Chem.267:15475-15484,1992；Websterら,J.Mol.Cell.Cardio.26:1273-1290,1994）。低レベルのＳＰＨはカルシウムの移動を妨害するのに対し、非常に高レベルでは、制御されないカルシウムの放出および過負荷の開始の逆の効果を有する（Sabbadiniら,1992）。ＳＰＨの急性作用は特異的であり、心臓における作用部位は筋小胞体のカルシウム放出チャンネル（Dettbarnら,1994；Sabbadiniら,1992）および表面膜のＬ−型カルシウムチャンネル（Krownら,1995；McDonoughら,Circ.Res.75:981-989,1994）である。スフィンゴシン誘導体であるセラミドは同様の作用をする。その結果として心臓細胞の収縮性が低下する（Kramerら,Circ.Res.68:269-279,1991；Websterら,1994）。従って、ＳＰＨはネガティブな変力剤であり、カルシウムチャンネル作動剤として作用する。実験動物モデルにおいてＳＰＨによって生じるカルシウムの脱制御、ネガティブな変力、およびその結果として起こるカルシウムの過負荷は、虚血または他の型の心不全の際に心臓に起こる病態生理学的変化に類似している。
発明者が証明したところによれば、新生児および成人の心臓細胞を培養液中で病態生理学的に適切なレベルのＳＰＨおよびその直後の代謝産物Ｓ１Ｐで慢性的に処理すると、心筋細胞のアポトーシスによる細胞死が活性化される（Krownら,J.Clin.Invest.98:2854-2865,1996）。アポトーシスはプログラムされた細胞死の一形態であり、心筋梗塞の大きさを決定する（Kajsturaら,Lab.Invest.74:86-107,1996）。スフィンゴシンの生成は、種々のタイプの細胞におけるアポトーシス型細胞死の初期のシグナリング事象として関係づけられている（Cuvlilierら,Nature 381:800-803,1996；Ohtaら,Cancer Res.55:691-697,1995；Ohtaら,FEBS Letters 355:267-270,1994）。スフィンゴミエリンのシグナル変換カスケードの活性化は、ＴＮＦαの細胞障害性（アポトーシス）作用における重要な初期事象であり（ZhangおよびKolesnick,Endo.136（10）:4157-4160,1995）、発明者はＴＮＦαが培養したラット心筋細胞アポトーシスにおいて有意なアポトーシスを誘引しうることを証明した（Krownら,J.Clin.Invest.98:2854-2865,1996）。
酵素スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭアーゼ）は心組織においてＴＮＦαによって活性化されると考えられる酵素であるが（Oralら,J.Biol.Chem.272:4836-4842,1997）、その活性は実験動物のアシドーシスに罹患した心臓において上昇している（Fransonら,Am.J.Physiol.251（5pt2）:H1017-H1023,1986）。ＳＭアーゼは細胞におけるＳＰＨの生成の原因となる酵素であり、発明者はこの酵素を筋組織に局在させた（Sabbadiniら,1992）。また、虚血の動物モデルから得た証拠があり、それによれば、ＳＰＨの直前の前駆体であるセラミドのレベルは虚血性脳組織において上昇し、セラミドのレベルはスフィンゴミエリンの破壊の増加の結果である（Kubotaら,Japan J.Exp.Med.59:59-64.1989）。
他の支持的なデータは、スフィンゴミエリン（セラミドおよびスフィンゴシンの前駆体）のレベルが低酸素の実験動物において上昇することを示しているが（SergeevおよびGribanov,Kosm.Biol.Aviakosm.Med.15:71-74,1981）、他方、スフィンゴミエリンのレベルが虚血ラットの大脳皮質において、セラミドのレベルの上昇に比例して低下していることも発見されている（Kubotaら,1996）。特定の理論に拘束されるのは望ましくないが、これらのデータは、低酸素および虚血の際に生じる症状がＳＭアーゼの活性化およびそれに続く心臓細胞のＳＰＨレベルの異常な上昇を誘引するという理解を支持する。リソソームイソ型ＳＭアーゼ（酸性またはａＳＭアーゼ）は低酸素の酸性条件によって活性化され、原形質膜イソ型ＳＭアーゼ（中性またはｎＳＭアーゼ）の活性化を補足する。心筋細胞のｎＳＭアーゼはＴＮＦαによって活性化すると考えられる。ＴＮＦαは虚血性心組織から放出され、ＴＮＦα誘導型のＳＰＨ生成は心臓性虚血の初期事象である。
本発明は、一部には以下の確信に基づく：心臓性虚血における初期事象はＴＮＦα誘導型のスフィンゴ脂質の生成であり、次いでスフィンゴ脂質依存型アシドーシスが起こり、それによって酸性型のＳＭアーゼ（その供給源はリソソームである）による更なるスフィンゴ脂質の合成が起こる。スフィンゴシンはプロテインキナーゼＣおよびＮａ／Ｈ交換系（キナーゼによって活性化され、不必要な酸を排出する）の周知の阻害剤であるLoweら,J.Biol.Chem.265:7188-7194,1990）。上記の第Ｉ節に記載したように、心臓性低酸素、虚血、および心不全の原因となる他の症状によってある周期が生成され、その周期では虚血、低酸素、または他の不全性の心臓の酸性状態がスフィンゴ脂質の過剰生成を刺激し、筋小胞体膜およびＬ−型カルシウムチャンネルからのカルシウムの放出が制御されなくなり、それによって細胞はそのビート・トゥ・ビートの収縮作用を調節できなくなる。
また、心臓のカルシウムレベルが調節されないことにより、Ｎａ／Ｃａ交換の促進のために、そして間接的にはＮａ／Ｈ交換体の刺激による細胞の酸性化のために、症状は悪化する（Gottliebら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:5965-68,1995）。スフィンゴ脂質介在型アシドーシスおよびそれに続くカルシウムの脱調節により細胞死のプログラムが活性化され、アポトーシスが起こる。最後には、心機能はアポトーシスによる細胞の喪失を起こし、また、残存する心筋細胞にはＳＰＨおよびｐＨのネガティブな変力作用を受ける。
発明者の実験室で行った細胞培養の研究により、心筋細胞はＳＰＨを（細胞の条件にした）培養液中に“分泌する”（ＳＰＨ ７００ｐｍｏｌ／ｍＬ）ことが証明された。この結果は、ＳＰＨおよびその代謝物が、虚血によって引き起こされた低酸素およびアシドーシスを有する心臓細胞から血液中に漏出しうることを示している。YatomiらはＳ１Ｐがヒト血漿および血清に存在することを報告した（Yatomiら,J.Biochem.121:969-973,1997）。他のスフィンゴ脂質（ＳＰＨを含む）は測定されておらず、これらの研究者は、Ｓ１Ｐは凝固の際に血小板から放出されると推測した。血漿を３Ｈ−スフィンゴシンと共に２時間インキュベートし、Ｓ１Ｐが血漿の他の成分から生成されるかどうかを確認した。ＳＰＨは血漿中で２時間の間安定であり、血小板を多量に含有する血漿のみがＳＰＨをＳ１Ｐに変換したが、これは血小板がＳ１Ｐの供給源であることを示唆する。意義深いことに、血小板によるＳ１Ｐの生成のためのＳＰＨの供給源、または、心臓性虚血におけるＳＰＨおよび／またはＳ１Ｐの考えられる役割については検討されていない。対照的に、特定の理論に拘束されることは望ましくないが、本発明は以下の理解に基づく：心臓性虚血による漏出の早期の段階に心臓細胞から放出されるＳＰＨは“分泌される”か、あるいは逆に、低酸素もしくは虚血状態によって損傷した細胞から血液中に漏出し、血小板に存在するスフィンゴシンキナーゼによって作動する。血小板から放出されたＳ１Ｐはその後、血栓形成を刺激する。従って、低酸素または虚血状態によって損傷した心臓細胞から放出されたＳＰＨは、最終的に心筋梗塞を引き起こす。
III． 腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）
分子レベルでは、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）のようなプロ−炎症性サイトカインは虚血および低酸素の病態生理学に関係づけられてきた。血清ＴＮＦαレベルの上昇は心臓性虚血および再灌流損傷（reperfusion injury）に関係する低酸素状態の際に起き、流血中のＴＮＦαのレベルは、急性心筋梗塞の後に著しく上昇する（Herskowitz A.ら,Am.J.Pathol.146:419-428,1995；Vaddi K.ら,Circ.90:694-699,1994；Lefer A.M.ら,Science 24:61-63,1990；Maury C.P.J.& A.-M.Teppo.J.Intern.Med.225:333-336,1989）。血清ＴＮＦαレベルの低下は虚血状態の改善に関係する（Hennein H.A.ら,Circ.88（4）:I-247,1993）。慢性心疾患に罹患したヒト患者においては、高レベルの血清ＴＮＦαが検出され、ＴＮＦαのレベルの上昇は冠状動脈バイパス術の直後に起こる（Levineら,New Eng.J.Med.323:236-241,1990；Deng M.C.ら,Eur.J.Cardiol.9:22-29,1995；Hennein H.A.ら,J.Thorac.Cardiovasc.Surg.108:626-35,1994）。
ＴＮＦα、インターロイキン１、２、および６（ＩＬ−１、ＩＬ−２、およびＩＬ−６）のようなプロ−炎症性サイトカインは一般に、マクロファージ、好中球、およびリンパ球のような骨髄由来細胞によって生成される（Kelker H.ら,Int.J.Cancer 36（1）:69-73,1985；Cuturi M.ら,J.Exp.Med.165:1581-1594,1987；Sung S.ら,J.Clin.Invest.84（1）:236-243,1989；Liebermann A.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6348-6352,1989；Lindemann A.ら,J.Clin.Invest.83（4）:1308-1312,1989）。平滑筋および内皮細胞はＴＮＦαの供給源であることが示唆されている（Warner,S.およびP.Libby,J.Immunol.142:100-109,1989；Libby,P.ら,Am.J.Pathol.124:179-185,1986）。また、心臓がＴＮＦαの供給源であることも前提とされている（Giroir B.ら,J.Clin.Invest.90:693-698,1992；Giroir P.B.ら,Am.J.Physiol.267:H118-H124,1994；Gurevitch J.ら,J.Am.Coll.Cardiol.28（1）:247-252,1996）。虚血のラット心臓をランゲンドルフ装置で灌流すると、再灌流の最初の瞬間の排出液にＴＮＦαが分泌されることが報告されている（Gurevitchら,1996）。
IV． 心臓細胞は血清ＴＮＦαおよびＳＰＨの供給源である
本発明の元となる実験に関連して収集されたデータが示すところによれば、培養液中の新生児および成体ラット心筋細胞はいずれも（線維芽細胞および内皮細胞を含まない）、最近の細胞内毒素、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）（周知のサイトカイン分泌促進物質である）に応じて多量のＴＮＦαを分泌する能力を有する。分泌されるＴＮＦαの量は１５００ｐｇ／ｍＬにのぼり、これは心筋において有意なアポトーシス性細胞死を起こす能力のあるＴＮＦαの範囲内である（Krownら,1996）。心臓細胞がＴＮＦαの重要な供給源であるという主張を更に支持するのは、バルーン血管形成術を受けているヒト験体の肺動脈のＴＮＦαレベルが同じ患者の大腿静脈に見られるＴＮＦαの血清レベルより高いことを示すデータであり、このデータは虚血（バルーンの膨張によって誘導する）際、虚血性心組織はＴＮＦαを生成し、次いでそれが冠状静脈洞および肺動脈から全身循環に放出されることを示唆する。冠動脈血管形成を行った患者の肺動脈におけるＴＮＦαは、肺動脈のＳＰＨレベルの変化と十分相関する。これらのデータによれば、ＴＮＦαの心臓性供給源は心臓細胞のＳＰＨ生成のための主要な刺激である。
要するに、上記のデータは、冠動脈血管形成術の際に起こるような種々の型の心筋虚血に見られる血清ＳＰＨおよびＴＮＦαの上昇は、虚血性心臓細胞によって循環に放出されるＳＰＨおよびＴＮＦαに由来する。
Ｖ． ＳＰＨまたはＴＮＦαはいずれも骨格筋性虚血の結果として血清中で上昇しない
ＳＰＨが骨格筋においてシグナリング分子として存在することが既に証明されているので（Sabbadiniら,1993）、骨格筋が血清ＳＰＨの供給源になりうるかどうかを確認することが重要である。骨格筋の質量は全体重の３０〜４０％であり、血清ＳＰＨの非常に大きな供給源となりうる。血清ＳＰＨの供給源が骨格筋ではなく心臓性虚血と特に関係することを確認するために、オリンピック選手および海軍の被験者の血清ＳＰＨを、重度の骨格筋性虚血の誘導の前後で試験した。骨格筋性虚血の誘導は、被験者に依頼して４９℃の室内においてトレッドミルで疲労しきるまで運動してもらって行い、血清中の乳酸を測定して確認した。運動の前は、血清ＳＰＨの平均は５．１８±４．５ｐｍｏｌ／ｍＬ（ｎ＝４）であり、徹底的な運動の後には４．０２±３ｐｍｏｌ／ｍＬのレベルまでわずかに減少した。更に、これらの血清中のＳＰＨ値は上記の虚血患者で観察されたものよりかなり低かった。重要なことには、血清中のＴＮＦαレベルは、重度の骨格筋性虚血にあるこれらの被験者では上昇しなかった。例えば、軍隊の兵員の血清ＴＮＦα値は、運動前には１．２２±０．４９ｐｇ／ｍＬであり、４９℃（１２０°Ｆ）の周囲温度で２０分間の運動後には１．３９±０．２３ｐｇ／ｍＬにわずかに上昇した。
VI． マーカーの既定値の決定
本発明のある態様では、非ポリペプチドおよび／もしくは二次的心臓性マーカーのレベル、または試験サンプルに対して算出したＭＲＦを、そのマーカーに対する既定値と比較して、心不全（心臓性虚血または低酸素によって誘導されうるような）の形跡が存在するかどうかを確認する。１種以上のそのようなマーカーに対する既定値を少なくとも２つの方法の１つで確立することができる。例えば、ＡＭＩのリスクのある哺乳類（例えばヒト）から心疾患の兆候が現れる前にデータを収集して確立するか、または他の正常な哺乳類（好ましくは験体と同じ種および年齢層）の試験によって確立することができる。
第一の方法では、患者を治療する医師が、統計学的、遺伝的、家族性、または医学分野で一般的に知られる因子に基づいて、患者がＡＭＩのリスクを有することを確認してもよい。その後、医師は患者に対する１種以上の非ポリペプチド心臓性マーカーのレベルまたはＭＲＦを測定してベースラインを確立できる。あるいは、または更に、医師は１種以上の二次的マーカー（例えばＴＮＦα、ＩＬ−１、２、６、または別のサイトカイン）のレベルを測定してベースラインを確立してもよい。本発明は、患者における非ポリペプチド心臓性マーカーおよび／または二次的マーカーのレベルをこのベースラインと比較し、切迫した心不全（心臓性低酸素または虚血によって起こり得るような）を検出する方法を提供する。
第二の方法では、医師または他のヘルスケアの専門家（医学統計学者を含む）が、医師によって健康であると確認された個体の心臓性マーカーのレベルまたはＭＲＦを測定できる。同じ年齢層の個体のレベルをグループ化し、その平均値および標準偏差を決定する。この値は既定値を表し、患者における心臓性マーカーのレベルをこれと比較して心臓性低酸素または虚血を検出する。
VII． 早期検出が急性心筋梗塞の予防を導くことが可能である
本発明の方法および組成物は、心臓虚血または低酸素症、すなわちAMIおよび心不全の他の型につながる状態の早期検出を可能にする。本方法を用い、ひとたび虚血または低酸素症が検出されていれば、患者は救急医療施設を訪れることが可能であり、該施設で心不全が起こるのを予防するための処置を取ることが可能である。これらの処置には、限定されるわけではないが、血管形成術、冠状動脈バイパス手術、または1つまたはそれ以上の抗凝血または血栓溶解剤の投与が含まれる。
こうした予防処置の目的は、AMIまたは他の種類の心不全の発症以前に虚血または低酸素症状態を緩和することである。対照的に、今日、上述の処置は、AMIが起きた後、または患者が心不全を経験している間に用いられている。しかし、本発明は、症状およびそれに関連する組織損傷が発症する前に心不全を引き起こす状態の早期検出を可能にする。
VIII． 心臓処置後の予後の決定
本発明の方法および組成物は、医師および他の医療専門家が、心臓処置直後に該処置が成功したか決定することを可能にする。例えば、血管形成術または心臓動脈内へのステント配置後、1つまたはそれ以上の心臓マーカーまたはMRFのレベルを本明細書に記載されるようにモニターし、虚血または低酸素症状態が緩和されているかどうかを決定してもよい。このように、手術の成功を直ちに決定することが可能である。測定された心臓マーカーまたはMRFレベルにより決定されるとき、処置が望ましい結果に終わっていなければ、その後、患者が完全なまたは部分的な心不全を起こす前に、さらなる処置を使用してもよい。
実施例
以下の実施例は限定するものでなく、そして単に本発明の多様な側面および特徴を代表するものである。
一般的な方法
他に定義されない限り、本明細書に用いられるすべての科学および技術用語は、当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。他に言及されない限り、本明細書に使用されるまたは考察される技術は、一般の当業者によく知られる標準的方法論である。以下の化学薬品、検定および方法は、本明細書に示される結果を得るために用いられた。当業者は、試薬の他の供給源およびよく知られる方法により、本発明の範囲を逸脱することなく、置換してもよいことを理解するであろう。
化学薬品
化学薬品は以下のように得た：D−スフィンゴシン［D（+）−エリスロ−2−アミノ−4−トランス−オクタデセン−1,3−ジオール］はMatreya,Inc（ペンシルバニア州プレザントギャップ）から；スフィンゴシン−1−リン酸はBiomol（ペンシルバニア州プリマスミーティング）から；o−フタルアルデヒドはICN Biochemicals（オハイオ州クリーブランド）から、そしてHPLC等級メタノールはFisher Scientific（カリフォルニア州ツースティン）から得た。スフィンゴシルホスホリルコリンおよびDL−エリスロ−ジヒドロスフィンゴシンを含む、他の化学薬品は、Sigma Chemical Co.（ミズーリ州セントルイス）から得た。
スフィンゴシンおよび他のスフィンゴ脂質の保存溶液は、脂肪酸不含ウシ血清アルブミン（BSA）との複合物として調製し、本質的にミセルまたは有機溶媒を含まない該化合物の溶液を提供した。
スフィンゴ脂質抽出およびクロマトグラフィー検出法
スフィンゴシンレベルは、本質的に以前記載された（Sabbadiniら, 1993）ように行われたHPLCにより測定した。簡潔には、新鮮な組織を動物から切除し、そして4体積の50mMリン酸カリウム緩衝液pH7.0の存在下に5℃でホモジェナイズした。同様に、SPHを全血または血清試料から抽出してもよい。未精製ホモジェネート、血液または血清試料（300μl）をクロロホルム：メタノール溶液（1：2）750μlに添加し、そして何回かボルテックスした。その後クロロホルム（約500μl）を添加し、その後1M NaClを500μl添加した。相分離を促進するため該抽出物を簡単に遠心分離し、そして上層の水相を吸引により除去した。その後、1M NaClを500μl添加し、そして遠心分離および吸引段階を繰り返した。残ったクロロホルムを真空遠心機（SpeedVac、Savant Instruments,Inc.、ニューヨーク州ファーミングデール）内で30分真空乾燥することにより除去した。残渣を750μlのクロロホルム：メタノール（1：2）中の0.1M KOHに懸濁した。懸濁物を槽超音波（bath-sonicated）し、そして37℃で1時間インキュベーションした。抽出物が室温まで冷えたとき、クロロホルム500μlおよび1M NaCl 500μlを添加し、試料を混合し、遠心分離し、そして上相を吸引により除去した。NaCl抽出段階を2回繰り返し、そして有機相を遠心分離と共に30分真空乾燥した。抽出物を0.5mg/ml o−フタルアルデヒド（OPA）、3%ホウ酸、pH10.5、および0.05%β−メルカプトエタノールの溶液50μlで10分誘導体化した。その後、メタノール50μlおよびHPLC流動緩衝液（90%メタノール中の5mMリン酸、pH7.0）350μlを各試料に添加し、そしてOPA誘導体化試料を、標準的な方法を用い、Waters 470スキャンニング蛍光検出器を含む、Waters HPLC Maxima 820クロマトグラフィー・ワークステーション（Millipore Corp.、カリフォルニア州ベンチュラ）上でHPLCにより解析した。蛍光は励起波長340nmおよび発光波長455nmで検出した。
スフィンゴ脂質は、Aquapor C18ガードカラムを備えた250H 7mm C18、300オングストローム孔Brownleeカラム（Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティー）上で逆相クロマトグラフィーにより分離した。試料は流動緩衝液を用い、1.25ml／分でイソクラティクに（isocratically）流動させ、SPH標準の回収に基づくと、約50%の抽出効率を生じた。標準の保持時間は：SPHは約15分；S1Pは約5分；そしてSPCは約20分だった。
実施例1： 心筋梗塞を経験しているヒト患者における血清SPHレベル
救急医療施設を訪れた患者から、厳密なヒト対象プロトコル下で血清試料を採取した。3つの患者群のSPHおよびTNFα両方の血清レベルを調べた：（1）AMIが疑われそして運動ストレス試験の対象とされる患者；（2）冠状動脈形成術を受けている患者；および（3）急性心筋梗塞の初期にある患者。
心筋虚血障害のいかなる臨床的症状も示さない3つの対照群の血清もまた試験した。これらの対照群は：（1）成人フィットネスプログラムに登録している年齢一致被験者（47から79歳）；（2）安静にしている、および49℃（127°F）の周囲温度でトレッドミルで消耗するまで運動している健康な軍人；および（3）オリンピックトレーニングセンターで、安静にしている、および49℃の周囲温度でトレッドミルで消耗するまで運動している運動選手であった。
確認された心筋虚血の患者は、いかなる対照群より有意に高いSPHレベルを有した。軍人およびオリンピック運動選手の血清SPHレベルを合わせ1つの対照群（n=6）とした結果、血清SPHレベルは4.18±1.8pmol/mlだった。年齢一致対照群（n=15）の血清SPHは、平均99.3±32.4pmol/mlだった。3つの虚血患者群を合わせ1つの群とすると、平均血清SPHレベル697±0.7pmol/mlが得られた。この値は、年齢一致対照群より約7倍高く、そして激しい運動ストレスを受けているよく鍛えられた軍人および運動選手より約160倍高かった。
検出されるSPHレベルと比較するため、心臓組織損傷と関連することが知られる生化学マーカーのレベルもまた測定した。18人の虚血患者のうち16人に関し、検出されるSPHレベルの増加は、CKの高レベル（17−810U/mlの範囲内）およびCKMBの高レベル（0.62−33.2mg/l）と一致していた。18人の虚血患者のうち、高いCKMB多量レベルを有した2人の患者（P2、P3）は、異常に高いレベルのSPHを持たなかった。1人の患者（P2）は、年齢一致対照群の平均より中程度にしか高くない血清SPHレベル（120pmol/ml）を有したが、高レベルのCKMB（33.2mg/l）およびCK（810U/l）を有し、AMIを暗示した。もう一方の患者（P3）は、無視できるレベルの血清SPH（18.1pmol/ml）、正常なCKレベル（161U/l）および高いCKMBレベル（18.4mg/l）を示した。これらの2人の患者で検出された中程度から低いSPHレベルは、どちらの患者も他の指標に基づくと虚血と見なされたため、11%の偽陰性率（18のうち2）に相当する。これらの2人の患者（P2およびP3）のSPHデータをAMI群に含むこともまた、冠状動脈形成術を受けている虚血患者のSPHレベル（885±123pmol/ml）と比較して、AMI群が幾分低いSPHレベル（587±7pmol SPH/ml）であることを説明する。
試験されたAMI患者で得られた結果に基づけば、比較的高い血清SPHレベルは有効な虚血の初期指標である。これはさらに以下の個々の研究で得られた結果により確認された。
3つの病歴
病歴その1
患者T2は、47歳の女性で、アンギナを訴え、病院の救急処置室を訪れた。血液試料を採取し、そして患者をその後、病院の運動ストレス試験施設に回した。患者はトレッドミル試験を通過し、ストレス試験中に行われたECGおよび病院での評価期間中に解析された血清酵素レベルにより検出されるところでは、心臓虚血またはAMIのいかなる徴候も見せなかった。患者は退院したが、3週間後、CKおよびCKMBの高血清レベルおよび他の症状により決定されるところでは、AMIの徴候があり、再来した。
本患者の血清SPHの解析により、最初に救急処置室を訪れたとき、非常に高いレベルのSPH（810pmol/ml）を有したことが立証された。AMIで病院を再度訪れたとき、そのSPHレベルはさらに高かった（1200pmol/mlより大）。このように、血清SPHレベルは虚血の初期指標であり、そして、患者が最初に救急処置室を訪れたとき、心臓虚血またはAMIの徴候をどちらもまったく示さなかった運動ストレス試験または血清CKおよびCKMB解析より、患者の心臓状態をよりよく予測した。
病歴その2
患者MI-12は男性で、混乱させられる臨床提示を示し入院した。入院時、患者のCKレベル（126U/l）は正常だったが、患者のCKMBレベル（3.8mg/l）は上昇していた。入院時の患者の血清SPHレベルもまた高く（732pmol/ml）、虚血が暗示された。入院の約5時間後、本患者はAMIを有した。この結果は、血清SPHレベルが正確にその虚血状態を検出し、CKパラメーターによっては検出されなかったことを示す。したがって、SPH試験の結果は、単独でまたはCKMBパラメーターと合わせ、切迫したAMIを予測した。
病歴その3
本患者は58歳の女性で、その心臓状態の最初の評価のため入院した。最初の評価中、血液を採取し、そして血清はCKMB（0.632mg/ml）は正常だが中程度に高いSPH（300pmol/ml）を示した。4日後、患者は冠状動脈バイパス術を受けた。バイパス処置の結果として虚血が緩和した後、患者の血清SPHレベルは7.31pmol/mlに有意に減少したが、患者の血清CK（934U/l）およびCKMB（88.9mg/l）レベルは高いままだった。これはSPHが虚血の正確な指標であり、そして酵素CKおよびCKMBが心筋損傷の指標である（すなわち壊死心筋細胞から放出される高分子量細胞質タンパク質）ことと一致している。このように、血清SPHの上昇したレベルの検出は、血清SPHが顕著な細胞壊死が起こる前に心筋細胞から産生されるため、虚血または低酸素症の早期診断に役立つ。
これらの結果は、血清SPHが、診断に一般的に用いられる現在の方法より、虚血の初期段階および切迫したAMIをよりよく予測することを示す。さらに、血清SPHは、細胞死後に放出される他の生化学マーカー（例えばCK、CKMBおよびトロポニン）と対照的に、心臓細胞死に先立つ初期事象に定量的に関連する。したがって、患者を血清SPHに関し日常的にスクリーニングすることにより、冠状動脈疾患の早期診断およびAMIを予防するため治療してもよい心臓疾患の危険性が高い患者の同定を補助することも可能である。しかし、SPHなど単一のスフィンゴ脂質の定量的検出は、変動しやすい可能性があり、これは血清TNFα検出測定と組み合わせ、心臓虚血および低酸素症の危険性のより一般的な指標を提供することにより、最小限にすることも可能である。
実施例2： 虚血状態下の心臓組織からのin vitroスフィンゴシン産生
心臓虚血が過剰なSPH産生を生じることを立証するため、低酸素状態（95% CO2；5% O2）で、または正常クレブス（Krebs）緩衝液（5% CO2；95% O2を含む）で逆方向冠状動脈灌流にさらした成熟ウサギ心臓におけるSPH組織レベルを調べた。心臓を除去し、迅速にホモジェナイズし、そしてスフィンゴ脂質を上述のように抽出し、そして検出した。
抽出物のHPLC解析により、95% CO2を含む緩衝液で灌流した心臓の組織SPHレベルは、対照条件に比較し、有意に増加している（20倍）ことが明らかになった。さらに、これらの増加は処置のわずか5分後に起こった。
SPHは陽イオン両親媒性脂質であり、全血および他の体液中に分配されることが可能である。したがって、SPHの相対量を、ヒト、ラットおよびウサギから得た全血および血清で測定した。SPHは、心臓虚血または低酸素症を検出するためにSPHレベルを測定するのに好ましい体液である、血清に顕著に見られる。
血清中のSPHの時間依存安定性を測定するため、ヒト血清試料を得て、そしてスフィンゴ脂質およびHPLC解析前に22℃で5時間置いた。血清試料にまた、商業的に入手可能なSPHを添加し、そして室温で同様に保存した。古い対照血清試料もSPH添加試料もどちらも、収集後すぐに検定された試料または添加試料の調製と比較して、SPHレベルの容易に判断される相違を示さず、SPHは、血清試料が収集後すぐに検定されなくても、分解を受けないことが示された。
実施例3： 心筋危険性因子（MRF）
TNFαの血清レベルもまた、心臓虚血で増加し、そして血管形成患者に検出される血清SPHレベルと相関している。これらの2つのパラメーター（例えば、非ポリペプチド心臓マーカーと二次（または三次）心臓マーカーのレベル）との積は「心筋危険性因子」（MRF）と称され、そして個人が心筋虚血により生じた損傷を持つ可能性の有用な定量的指標である。MRFは異なる心臓マーカーを用い計算することが可能であるため、特定のMRFに用いられるマーカーを明記するのが重要である。
ここでは、（Quantikine HSキット（カタログ番号HSTA50）、R+D Systems、ミネソタ州ミネアポリスを用い）亢進ELISA二重抗体捕捉検定で標準的方法を用いTNFαを測定した。製造者により提供される検定方法を用い、ヒト血清試料（200μl）を検定し、そして組換えヒトTNFα標準と比較した。
血清TNFαおよびSPHレベルを、周期的虚血（例えばバルーン膨張中）および成功した血管形成術中に起こる再灌流（例えば動脈の障害物が除かれたとき）を経験している患者（A5）の肺動脈から採取した試料から測定した。血清TNFαおよびSPHレベルはどちらも、血管形成処置開始前（−20分から0分）には上昇していた。TNFαもSPHもどちらも虚血期中に増加しなかった。これらは既に高く、そして再灌流後低下した。TNFαおよびSPHパラメーターはどちらも二相性反応を示し、血管形成術後まず減少し、その後、血管形成術前のレベルに規則的に再上昇した。時間経過は同様で、TNFαレベルがSPHよりわずかに早く低下した。これはTNFαがSPH産生を誘発することと一致している。
同様に、冠状動脈形成術を受けている19人の患者および7人のAMI患者に関し、血清TNFαレベルを評価した。比較のため、2つの対照群（年齢一致対照および健康な軍人）に関し、血清TNFαレベルを測定した。血清TNFαレベルはAMI患者で最も高く（5.2±0.6pg/ml）、そして処置を行う前に血管形成術群から採取した肺動脈血で幾分低かった（3.6±0.74pg/ml）。患者は、2.43±0.32pg/mlの年齢一致対照群（「対照」）、および1.22±0.29pg/mlの健康な軍人被験者（「運動選手」）のものと比べ、有意に高い血清TNFαレベル（4.04±0.57pg/ml）を有した。
結果を比較することにより、3群試験において、血清TNFαレベルが血清SPHレベルに関し見られたのと同じ傾向を示すことが理解可能である。すなわち、運動選手が最も低いレベルのSPHおよびTNFαを有し、年齢一致対照がより高いレベルのSPHおよびTNFαを有し、そして患者が最も高いレベルのSPHおよびTNFαを有した。したがって、進行している心筋虚血のより正確な測定は、MRFを計算するのに2つまたはそれ以上のパラメーター、例えば同じ傾向の非ポリペプチドおよび二次または三次心臓マーカーを組み合わせることにより得ることが可能である。SPHが非ポリペプチド心臓マーカーであり、そしてTNFαが二次心臓マーカーであるとき、MRFは、血清TNFαレベルの数値および血清SPHレベルの数値を乗じることにより得られる積である。
本実験におけるすべての虚血患者群を代表するMRFデータ（SPHおよびTNFαレベルを用いる）を合わせ、そして年齢一致および健康な軍人対照と比較した。虚血患者のMRF（2820）は、年齢一致対照群（238）より約12倍高く、そして健康な軍人群（6.3）より約440倍高かった。このように、MRF値は、血清SPHまたは血清TNFα測定どちらか一方よりも、より大きい度合いで虚血患者を対照群から区別した。さらに、MRF計算値は、パラメーターどちらか一方での偽陰性の発生を減少させた。
以下の表1は、7人の患者のSPH/TNFα MRF計算値を示す。該MRF値は、SPH値（最も近い自然数（whole integer）に概算した）およびTNFα値（最も近い小数点第一位に概算した）を乗じ、MRF値（最も近い自然数に概算した）を生じることにより、計算した。7人の血管形成患者のうち6人が約1,800から約3,000の範囲のMRFを有した。これらの6人の患者の平均MRF値は2,326だった。1人の患者のみがこの範囲外のMRFを有した（約16,000のMRFの患者A1）。7人の患者すべての平均MRFを表1に示している。計算された患者の大多数のMRF値に基づくと、患者A1はTNFαレベルが他の6人の患者より有意に高い、変則的な高レベルの虚血を有していたようであった。患者A1のSPHレベルを他の6人の患者のTNFα平均値（2.9）で乗じると、MRF値は、他の6人の患者に見られる範囲に近い3,254であったであろう。
上述のMRFを計算するのに用いられた結果は、SPHのHPLC検出およびTNFαのELISA検出に基づいていたが、当業者には、診断に役立つスフィンゴ脂質およびTNFαのいずれを検出するのにも多様な検定を用いてもよいことが理解されるであろう。好ましくは、TNFαおよびスフィンゴ脂質に対する検定を含むキットが、MRFの測定を提供するのに用いられる。例えば、抗TNFαおよび抗SPH抗体／またはスフィンゴ脂質に対する酵素検定を組み合わせキットとし、MRF値を評価する。例えば、血液または血清中の2つまたはそれ以上の解析物の測定に、既知のバイオセンサー技術を用いてもよい。キット中にアルゴリズムを用い、MRF値を計算してもよく、これはTNFαと共に3つの重要なスフィンゴ脂質、SPH、S1PおよびSPCをすべて検出し、そしてスフィンゴ脂質およびTNFαのすべての組み合わせに関する一連のMRF値を決定するのに、または測定されたすべてのスフィンゴ脂質レベルとTNFαレベルの積である単一のMRF値を決定するのに、特に好都合である可能性がある。
実施例4： 虚血に関連するTNFαは、心臓細胞により産生される
TNFαが心筋細胞起源であることを立証するため、繊維芽細胞および内皮細胞を除いた、培養中の新生および成熟ラット心筋細胞両方を、TNFα産生に関し試験した。
新生心室筋細胞を1から4日齢のスプレーグ・ドーリー（Sprague-Dawley）ラットから得た心臓から、本質的に以前記載された（Shieldsら,J.Biol.Chem.263: 12619-12618,1988）ように解離した。心室を細かく切り刻み、そしてカルシウム不含およびマグネシウム不含ハンクス緩衝塩溶液（Sigma、ミズーリ州セントルイス）中の0.5g/lトリプシン、0.2g/l EDTAで解離した。組織を攪拌し、遠心分離により穏やかに沈澱させ、そしてトリプシン消化を5回繰り返した。懸濁した細胞を含む上清をDMEM/F12培地と合わせ、125μmナイロンメッシュを通じて濾過し、そして濾過物を遠心分離した。沈澱した細胞をDMEM/F12培地に再懸濁し、そして10%ウシ胎児血清（FCS）を加えたDMEM/F12中のフィブロネクチン・コーティング・カバーガラス片上に蒔いた。
新鮮な解離成熟心室筋細胞を、ランゲンドルフ（Langendorff）逆方向大動脈灌流装置を用い、酵素解離により成熟（200から300g）スプレーグ・ドーリーラットの心臓から調製した。心臓をコラゲナーゼ（Type II、Worthington Biochemicals、ニュージャージー州フリーホールド）で灌流した後、ラット心室をさいの目に切り、そして酸素添加したタイロード溶液（Tyrode’s solution）（140mM NaCl、5.4mM KCl、5.0mM MgCl2、1.0mM CaCl2、10mM HEPES、0.25mM NaH2PO4、pH7.3）中の0.58mg/mlコラゲナーゼ10から15ml中で37℃で30分インキュベーションした。解離した筋細胞をラミニン・コーティング（50μg/ml）培養プレートに蒔き、そして10% FCSを加えたDMEM/F12中で、試験剤（例えばLPSまたは対照緩衝液）の存在または非存在下で、18時間培養した。
結果は、これらの細胞が、サイトカインのよく知られる分泌促進剤である、細菌エンドトキシン、LPSに反応し、多量のTNFαを分泌することが可能であることを示した。分泌されるTNFαの量は、約1500pg/mlに達することが可能であり、これは心筋細胞で有意なアポトーシス細胞死を生じることが可能なTNFαの範囲内である。さらに、LPSにより刺激された培養ラット心筋細胞のin vitro実験により、有意な量のSPH（700pmol/ml）もまた該細胞から分泌されることが示される。これらの結果は、心臓細胞がTNFαと共に分泌SPHの供給源であることを立証する。さらに、これらのin vitro結果は、バルーン血管形成術を受けているヒト患者の肺動脈におけるTNFαおよびSPHレベルが、同一患者の大腿静脈で見られるTNFαの血清レベルより大きいというin vivo結果と一致する。該データにより、冠状動脈形成術患者の肺動脈TNFαレベルが、同処置中の肺動脈SPHレベルの変化とよく相関したことが示される。in vitroおよびin vivo両方のデータにより、心筋虚血（例えば冠状動脈形成術中）に見られる上昇した血清TNFαおよびSPHレベルは、循環へ虚血心臓細胞から放出されたTNFαから生じるらしいことが示される。
虚血患者に検出される上昇した血清SPHレベルは、激しい骨格筋虚血を誘導する前および誘導した後に、健康な運動選手および軍人から得た血清試料の検定により立証されるように、骨格筋虚血により産生されるのではなかった。被験者は、周囲の温度が49℃である部屋に置かれたトレッドミルで消耗するまで運動し、骨格筋虚血を誘導し、これは血清乳酸塩を測定することにより確認された。運動養生法前、血清SPHは平均4.18±4.5pmol/mlであり、これは運動後わずかに減少し、4.02±3pmol/mlとなった。これらの血清SPH値は、虚血患者に検出されるものより実質的に低かった。重要なことに、これらの激しい骨格筋虚血を経験している被験者で血清TNFαレベルは増加しなかった（例えば、運動前の軍人の血清TNFα値は1.22±0.49pg/mlであり、そして運動後1.39±0.23pg/mlに上昇したが有意でなかった）。
実施例5： 全血または血清のスフィンゴ脂質を検出するための抗スフィンゴ脂質抗体の使用
抗スフィンゴ脂質（または他の非ポリペプチド心臓マーカー）モノクローナル抗体（mAb）、例えば、SPH、S1P、SPC、およびDHSPHに対して反応するmAbを、抗リン脂質抗体の調製に用いられるものと同様の方法により調製する。簡潔には、mAb産生の1つの方法は、抗リン脂質mAbを作成するのに用いられる既知の方法（Rezaら,FEBS Lett.339:229-233,1994；Umedaら,J.Immunol.143:2273-2279, 1989）を用い、スフィンゴ脂質でコーティングした酸処理サルモネラ・ミネソタ（Salmonella minnesota）を直接マウス脾臓に注入する直接免疫を伴う。抗SPH抗体の産生には、酸処理S.ミネソタを望ましいスフィンゴ脂質、例えばSPHでコーティングし、そして抗SPH mAbを分泌するハイブリドーマを産生するための細胞融合前に、マウス脾臓に注入する。同様の方法を用い、抗S1P mAbおよび抗SPC mAbを産生する。また別に、動物に特有のエピトープを提示するため、脂肪酸不含BSA−スフィンゴ脂質結合体を免疫原として用いてもよい。mAbが酸化脂質またはタンパク質脂質付加体（adduct）に対して産生されないことを確実にするよう注意しなければならない（Witztumらによる論議を参考文献中に参照されたい（Horkkoら,J.Clin.Invest.98:815-825,1996；Palinskiら,J.Clin.Invest.98:800-814,1996））。
mAbはまず、多様な標準的免疫検定、例えば酵素結合免疫吸着検定（ELISA）、放射免疫検定（RIA）のいずれにおいても、熱量測定標識（例えば金コロイドまたはラテックスビーズ）でのmAbの直接標識により、またはサンドイッチ免疫検定におけるようなmAbの間接標識により、特異的なリガンドを検出するのに用いる。これらの検定はすべて、当業によく知られ、そして当業者により、特異的なリガンドを検出するのに最適な条件を決定するため、最小限の日常的試験を用い、実施されることが可能である。好ましくは、免疫検定は標準的な横方向フロースルー（lateral flow-through）形式またはバイオセンサー技術を使用するであろう。
横方向フロー形式には、二重捕捉抗体技術が含まれ、ここで血液試料中の解析物は、まず支持体に束縛される第一の抗体により捕捉される。その後、ストレプト・アビジン系を用い、第二の抗体の結合を検出する。
バイオセンサー技術は、典型的には、表面プラスモン共鳴を用い、抗原（例えばスフィンゴ脂質）が束縛された抗体（例えば抗SPH）に結合する際の、金／ガラスマトリックスの表面上の屈折指標変化を検出する（例えば、ラクトシルセラミドを含むガングリオシドへのコレラ毒素結合を研究した、Kuziemkoら,Biochem.35:6375-6384,1996を参照されたい）。バイオセンサーは、これらが非常に迅速（数分で明らかになる）で、定量的で、そして多数のリガンドに用いるのに扱いやすいため、好ましい。バイオセンサーにはアルゴリズムおよびデジタル読み出しを含むことが可能である。SPH、S1P、およびSPCを検出するためのバイオセンサー形式に基づく免疫検定を個別に行い、虚血心臓状態の指標として各スフィンゴ脂質の独立した測定値を提供してもよい。また別に、単一の検定に複数のmAbを含み、いかなる組み合わせのスフィンゴ脂質（例えばSPHおよびS1P；SPHおよびSPC；S1PおよびSPC；またはSPH、S1PおよびSPC）であっても単独でまたは1つまたはそれ以上のマーカー、例えばTNFαと組み合わせて、単一の測定値を提供してもよい。
実施例6： 血清または全血スフィンゴシンの酵素検定
本方法は、スフィンゴシンキナーゼの精製、およびATP加水分解を検出するためのピルビン酸キナーゼおよびその基質ホスホエノールピルビン酸を使用する共役検定におけるその使用を伴う。共役反応の産物はピルビン酸であり、そして生じるpH変化を、（Serres,A.ら,Pharmaceutical Res.13（2）:196-201.1996に記載されるような）pH依存ポリマー分解技術およびそれに続く測定されるインピーダンス変化を利用するキットで用いる。スフィンゴシンキナーゼは以前記載された（Olivera A.ら,Anal.Biochem.223（2）:306-312,1994）ようにスイス3T3細胞または他の細胞から単離される。
該検定は以下の特徴を含む：試験片上の基質はpH感受性直鎖ターポリマー（例えば、ポリ（N−イソプロピルアクリルアミド−コ−ブリルメタクリレート−コ−アクリル酸）の誘導体）でコーティングされる。血液または血清試料を試験片上に滴下し、そして共役反応を進行させる。共役酵素検定によりpHが低下する（pHの減少は血液中のSPH量に比例する）につれ、ポリマーが分解され、そして試験片上の伝導体をさらす。その後、インピーダンスを測定し、これは片上に滴下された血液または血清試料中のSPH量と比例する。
実施例7： スフィンゴ脂質受容体単離のためのファージディスプレー検定
本技術を用い、本発明のマーカー、特に非ポリペプチド心臓マーカーに高い親和性で結合する受容体をコードし、そして表面にそれらを発現するファージをスクリーニングする。ファージディスプレー技術の詳細な説明に関しては、米国特許第5,223,409号および第5,403,484号を参照されたい。受容体を発現する細菌をその後クローンし、そしてバイオセンサーに基づくキットに用いる。本技術を用い、SPH、S1P、DHSPH、およびSPCを含む、すべての重要なスフィンゴ脂質を含む、本発明の実施に用いられるマーカーを検出してもよい。いかなるマーカーに対する受容体を単離するのに用いられる技術も実質的に同一であるため、該技術を本明細書に一般的に記載する。本方法は、McGregor,D.,Mol.Biotech.6（2）:155-162,1996中に、より詳細に記載されている。
典型的には、cDNAライブラリーを提供し（例えば、Clontech、カリフォルニア州サンディエゴを含む、多くの商業的供給源から入手可能であるcDNAライブラリー）、そしてその後M13などの繊維状雄性ファージの膜タンパク質との融合タンパク質を生成するのに用いる。望ましいマーカー、例えばSPHの受容体を含む融合タンパク質を発現するファージクローンを検出し、そして標準的リガンド結合検定を用い単離する。その後、受容体の遺伝子を、標準的エンドヌクレアーゼ制限酵素およびクローニング法を用い、陽性クローンから切除する（例えば、J.Sambrook,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Ed.,CSH Lab.Press,1989を参照されたい）。該遺伝子はまた、標準的方法を用い、細菌系で発現させ、制限されない量の受容体を産生してもよい。該受容体を標準的方法を用い精製し、そしてその後、受容体が特異性を示すマーカーを検出するのに用いる。例えば、精製受容体をELISAプレート、Biacoreデキストラン表面、いかなる多くの検出キットの試験片、バイオセンサー検出器およびそれらに匹敵するものに束縛し、そして血液または血清中のスフィンゴ脂質の量を測定するのに用いる。膜受容体へのマーカー結合を利用する他の適用もまた、予見される。
実施例8： ヒト血液中の抗スフィンゴシン抗体の測定
本方法は、虚血を経験している患者は、スフィンゴシンなどスフィンゴ脂質の血液レベルが上昇する結果として、抗スフィンゴ脂質抗体を産生するという仮定に基づく。本方法はまた、抗ラクトシルスフィンゴシン抗体が結腸直腸癌患者に観察されており（Jozwiak W.およびJ.Koscielak,1982）、そして抗ガラクトセレブロシドがらい患者の血清に検出された（Vemuri N.ら, 1996）という知見に基づく。
スフィンゴシンおよびその代謝産物の潜在的な抗原性は、これらの陽イオン両親媒性物質としての構造（例えば図1を参照されたい）により、そして抗体をリン脂質（Umeda M.ら,1989）およびスフィンゴ糖脂質（Vemuri N.ら,1996）に対し生成することが可能であるという知見により示唆される。例えば、抗スフィンゴ糖脂質抗体は、実験的にT.サギナタ（T.saginata）に感染させた子ウシ血清において検出された（Baumeister S.ら,Parasitol.Res.81:18-25,1995）。本技術を、SPH、DHSPH、S1P、およびSPCを含むいかなるスフィンゴ脂質またはスフィンゴ脂質代謝産物と共に、本発明を実施するのに用いられる他の非ポリペプチド心臓マーカーを検出するのに適用してもよい。
非ポリペプチド心臓マーカー、例えばSPHに対する抗体を、虚血患者の血清から単離するため、検出されるべきマーカーが結合しているSepharoseなどのマトリックスを用いる、血清からの抗体のアフィニティー精製を使用してもよい。これらの抗体は、行うのが簡単で、そして多数の患者スクリーニングを行うのに安価であるであろう、いかなる多様な周知の免疫スクリーニング方法も用いる、免疫試験の基礎を形成する。
実施例9： 心臓マーカーの家庭モニタリング
医療専門家の助けを借りず心臓マーカーレベルをモニターしたいと希望する個人は、家庭モニタリング装置を用いてもよい。指刺ディップスティック技術（finger stab dipstick technology）は、血液グルコースモニタリングに広く用いられ、そして本方法を、本明細書の開示を考慮し、血液滴中の血液に含まれる心臓マーカー（例えば、非ポリペプチド、二次、および三次マーカー）の測定に適合させてもよい。スフィンゴシンおよびその誘導体を含む、本発明の実施に用いられる心臓マーカーをまた、多くの組織および唾液、汗、および尿を含む、血液以外の体液で測定してもよい。本発明の実施に有用な他の家庭モニタリング装置には、家庭内妊娠試験に類似のものが含まれ、これは尿中の特定のマーカーまたはマーカーの組のレベルを測定する。
携帯電子測定装置もまた、本発明の実施に適用してもよい。例えば、腕時計と同様の大きさおよび形の手首に着用する装置が糖尿病の血液糖レベルをモニターするため開発されている。例えば、Cygnus Gluco WatchTMプラットホームは、解析物を常時、より正確に評価するため、そして指刺技術の不快を伴わず、損なわれていない（intact）皮膚を通じて、個人が連続してグルコースをモニターすることを可能にする。同様に、本方法にしたがった1つまたはそれ以上の心臓マーカーの瞬時連続または周期的モニタリングを、腕時計プラットホームにより達成してもよい。こうした態様において、本発明にしたがった非ポリペプチド心臓マーカー（および、望ましい場合、二次および三次マーカー）の測定は、直接皮膚を通じて行われるであろうし、そして虚血、低酸素症、および心不全の多様な型に相関する他のものと関連する心臓状態を示すマーカーレベルと比較されるであろう。データ記録能力を有するこうした装置から保存されたデータをダウンロードすることもまた、予見され、そしてこれは、臨床家に、患者の最近のマーカーレベル変化の経歴記録を提供するであろう。
さらに、こうした装置、または本発明にしたがい心臓マーカーレベルをモニターするよう設計された他の家庭モニタリング装置を、1つまたはそれ以上の心臓マーカーレベル（またはMRFなどの計算指標）が、ある閾値を超えたとき活性化される警報装置と組み合わせて用いてもよい。該警報は、患者、すなわち使用者、または第三者、例えば友人または親戚、医療専門家、または緊急応答職員、例えば警察、医療補助者、または消防署に、モニターされているマーカーレベルの変化を通知してもよい。こうした警報はまた、伝達されるとき、遠隔測定法によるデータ（telemetry）も含んでもよい。
本発明にしたがった家庭モニタリング装置は、好ましくは、使用のための指示を伴うであろう。該装置はまた、医療装置の製造、使用または販売を規制する行政機関により規定される形式の通達を伴う可能性があり、該通達は該装置の型を家庭で使用することを行政機関が認可したことを反映する。こうした通達は、医療装置に対し、例えば米国食品医薬品局、または他の国の同等の行政機関による認可標識、または認可産物挿入物（insert）であってもよい。
実施例10： プロテインキナーゼCの阻害剤としてのスフィンゴ脂質
本発明の本態様は、共役検定を使用し、血液または他の組織または体液中のスフィンゴシンのレベルを、スフィンゴシンおよび他のリゾスフィンゴ脂質がプロテインキナーゼC（PKC）を阻害する能力を利用することにより評価する（HannunおよびBell,Science 234:670-674,1987；Hannunら,J.Biol.Chem.261:12604-12609, 1986）。血液試料中のスフィンゴ脂質量は、SabbadiniおよびOkamoto（SabbadiniおよびOkamoto,Arch.Biochem.Biophys.223:107-119,1983）に記載されるように、NADHの化学量的量が共役系により酸化されるのにしたがい、340nmの吸光度変化に定量的に関連する。
DAGがPKCに結合することを妨げることにより、スフィンゴシンが該酵素を阻害することが示されてきている（Faucherら.J.Biol.Chem.263:5319-5327,1988）。したがって、スフィンゴシンはDAG結合部位を介し、PKCに直接結合する可能性がある。PKCα配列およびそのコンセンサスDAG結合部位が知られている（Hurleyら,Protein Science（6）:477-80,1997）。SPHはまた、スフィンゴシンキナーゼおよびSPHが特異的に相互作用する他のタンパク質上の推定上の部位にも結合することが可能であるため、いくつかのタンパク質が特異的なSPH結合部位を持つ可能性が高い。したがって、スフィンゴ脂質認識部位を発現するコロニーに関し、ファージディスプレーライブラリー（上記を参照されたい）をスクリーニングした後、標準的技術を用い、推定上のスフィンゴ脂質結合部位をクローンすることが可能である。本タンパク質のcDNAの発現クローニングは、血液試料中のスフィンゴ脂質変化を検出する標準的ELISAで用いることが可能な試薬を産生するであろう。
当業者は、本発明が目的を達成し、そして言及された結果および利点を、本発明に固有のものと共に得るのに、よく適合していることを容易に認識するであろう。本明細書に記載される方法、処置、治療、装置、および組成物は、現在好ましい態様の代表であり、典型であり、そして本発明の範囲に対する限定として意図されない。本明細書を読み、本明細書の改変および他の用法が当業者に思い浮かぶであろうが、これは各々、付随する請求項により定義されるように本発明の精神に含まれる。
上記に引用されるすべての特許および刊行物は、個々の刊行物が各々、明確にそして個別に援用されると示されたのと同じ程度に、本明細書に援用される。
本明細書に例示的に記載される発明は、本発明に特に開示されていない、いかなる要素または複数の要素、または制限または複数の制限なしに、適切に実施してもよい。したがって、例えば、本明細書の各例において、「含む」「実質的に、からなる」および「からなる」という用語のいずれも、他の2つの用語のいずれにより置き換えてもよい。使用されている用語および表現は、説明する用語として用いられ、限定する用語でなく、そしてこうした用語および表現を、示されそして記載される特徴またはその一部の、いかなる同等物を排除するよう使用する意図はなく、請求される発明の範囲内で、多様な修飾が可能であると認識される。したがって、本発明は好ましい態様および所望による特徴により具体的に開示されているが、本明細書に開示される概念の修飾および変動が当業者により行われてもよく、そしてこうした修飾および変動は、付随する請求項により定義されるように本発明の範囲内であると見なされることが理解されなくてはならない。他の態様が以下の請求項の範囲内である。
Claims (47)
- 哺乳動物由来の血液又は血清中のスフィンゴシン又はその代謝産物のレベルを測定する心臓虚血及び／又は心臓低酸素症の検査装置を製造するための、スフィンゴシン又はその代謝産物に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントの使用。
- 前記哺乳動物がヒトである請求項１に記載の使用。
- 前記スフィンゴシン又はその代謝産物の前記レベルが前記スフィンゴシン又はその代謝産物の濃度である請求項１又は２に記載の使用。
- 前記代謝産物が、セラミド（Cer，n−アシルスフィンゴシン）、スフィンゴシン−1−リン酸（S1P）、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）、及びジヒドロスフィンゴシン（DHSPH）からなる群より選択される請求項１乃至３の何れか１項に記載の使用。
- 前記測定は、クロマトグラフィー、免疫検定、酵素検定、及び分光法からなる群より選択される方法によって前記レベルを測定することを含んでいる請求項１乃至４の何れか１項に記載の使用。
- 前記スフィンゴシン又はその代謝産物の前記レベルが直接検出される請求項５に記載の使用。
- 前記スフィンゴシン又はその代謝産物の前記レベルが間接的に検出される請求項５に記載の使用。
- 前記クロマトグラフィーが高性能液体クロマトグラフィー及びガスクロマトグラフィーからなる群より選択される請求項５に記載の使用。
- 前記分光法が、紫外分光法、赤外分光法、及び核磁気共鳴分光法からなる群より選択される請求項５に記載の使用。
- 前記免疫検定が、Cer、SPH、S1P、DHSPH、及びSPCからなる群より選択される心臓マーカーを検出する請求項５に記載の使用。
- 前記検査は、前記スフィンゴシン又はその代謝産物の前記レベルとあらかじめ決められた値との比較によって行われる請求項１に記載の使用。
- 前記あらかじめ決められた値が正常心臓状態の指標である請求項１１に記載の使用。
- 前記あらかじめ決められた値が前記血液又は血清を提供する前記哺乳動物と同一種及びおよそ同一年齢の哺乳動物から得られる請求項１１又は１２に記載の使用。
- 前記スフィンゴシン又はその代謝産物の前記レベルが前記あらかじめ決められた値と異なる請求項１１乃至１３何れか１項に記載の使用。
- 前記スフィンゴシン又はその代謝産物の前記レベルが前記あらかじめ決められた値より高い請求項１４記載の使用。
- 前記スフィンゴシン又はその代謝産物の前記レベルが前記あらかじめ決められた値より低い請求項１４に記載の使用。
- 哺乳動物において心臓虚血及び／又は心臓低酸素症を引き起こす状態を検出するキットであって、前記哺乳動物から得られた血液又は血清におけるスフィンゴシン又はその代謝産物の異常レベルを検出するための組成物を含んだキット。
- 前記組成物は前記スフィンゴシン又はその代謝産物の前記レベルを定量的な様式で測定することを可能にする請求項１７に記載のキット。
- 前記組成物は前記スフィンゴシン又はその代謝産物の前記レベルを半定量的な様式で測定することを可能にする請求項１７に記載のキット。
- 前記組成物は基質を含んでいる請求項１７乃至１９の何れか１項に記載のキット。
- 前記基質が、Cer、SPH、S1P、DHSPH、SPC、及びTNFαからなる群より選択される物質に特異的に結合する抗体である請求項２０に記載のキット。
- 前記レベルが正常心臓状態を示す標準的測定値と異なる１７乃至２１の何れか１項に記載のキット。
- 前記レベルが前記標準的測定値より大きい請求項２２に記載のキット。
- 前記レベルが、クロマトグラフィー、免疫検定、酵素検定、及び分光法からなる群より選択される方法を用いて測定される請求項１７乃至２３の何れか１項に記載のキット。
- 前記スフィンゴシン又はその代謝産物の前記レベルが直接検出される請求項２４に記載のキット。
- 前記スフィンゴシン又はその代謝産物の前記レベルが間接的に検出される請求項２４に記載のキット。
- 前記クロマトグラフィーが高性能液体クロマトグラフィー及びガスクロマトグラフィーからなる群より選択される請求項２４に記載のキット。
- 前記分光法が、紫外分光法、赤外分光法、及び核磁気共鳴分光法からなる群より選択される請求項２４に記載のキット。
- 前記免疫検定がCer、SPH、S1P、DHSPH、及びSPCからなる群より選択される物質を検出する請求項２４に記載のキット。
- 前記代謝産物がCer、SPH、S1P、DHSPH、及びSPCからなる群より選択される請求項１７乃至２９の何れか１項に記載のキット。
- 哺乳動物において心臓虚血及び／又は心臓低酸素症を引き起こす状態を検出する装置であって、前記哺乳動物から得られた血液又は血清におけるスフィンゴシン又はその代謝産物のレベルを検出することで前記心臓虚血及び／又は心臓低酸素症を引き起こす状態を検出し、使用者に、前記スフィンゴシン又はその代謝産物の異常レベルを通知することを特徴とする装置。
- 前記通知段階がさらに前記スフィンゴシン又はその代謝産物を検出する段階を含んでいる請求項３１に記載の装置。
- 前記通知段階がさらに前記スフィンゴシン又はその代謝産物の前記レベルをあらかじめ決められた値と比較する段階を含んでいる請求項３１又は３２に記載の装置。
- 前記通知段階がさらに前記スフィンゴシン又はその代謝産物の前記レベルを使用者に通知する段階を含んでいる請求項３１乃至３３の何れか１項に記載の装置。
- 前記哺乳動物がヒトである請求項３１乃至３４の何れか１項に記載の装置。
- 前記代謝産物がCer、S1P、SPC、及びDHSPHからなる群より選択される請求項３１乃至３５の何れか１項に記載の装置。
- 前記使用者が前記装置を着用する請求項３１乃至３６の何れか１項に記載の装置。
- スフィンゴシン又はその代謝産物に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントを含んだ心臓虚血及び／又は心臓低酸素症検査用組成物であって、哺乳動物から得られた血液又は血清においてスフィンゴシン又はその代謝産物の異常レベルを検出する組成物。
- 前記スフィンゴシン又はその代謝産物の前記レベルを定量的な様式で測定することを可能にする請求項３８に記載の組成物。
- 前記スフィンゴシン又はその代謝産物の前記レベルを半定量的な様式で測定することを可能にする請求項３８に記載の組成物。
- 前記スフィンゴシン又はその代謝産物に特異的に結合する抗体を含んだ請求項３８乃至４０の何れか１項に記載の組成物。
- 前記抗体がモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体からなる群より選択される請求項４１に記載の組成物。
- 前記抗体がCer、SPH、S1P、DHSPH、及びSPCからなる群より選択される物質に結合する請求項４１又は４２に記載の組成物。
- さらに、前記抗体が結合する固体支持体を含んでいる請求項４１乃至４３の何れか１項に記載の組成物。
- 前記結合が、前記抗体及び前記固体支持体の間の共有結合を介する請求項４４に記載の組成物。
- 前記結合が非共有結合を介する請求項４４に記載の組成物。
- 前記非共有結合が高親和性結合対の２つのメンバーの間で起こる請求項４６に記載の組成物。
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| US6949816B2 (en) | 2003-04-21 | 2005-09-27 | Motorola, Inc. | Semiconductor component having first surface area for electrically coupling to a semiconductor chip and second surface area for electrically coupling to a substrate, and method of manufacturing same |
| US8974386B2 (en) | 1998-04-30 | 2015-03-10 | Abbott Diabetes Care Inc. | Analyte monitoring device and methods of use |
| US8480580B2 (en) | 1998-04-30 | 2013-07-09 | Abbott Diabetes Care Inc. | Analyte monitoring device and methods of use |
| US8465425B2 (en) | 1998-04-30 | 2013-06-18 | Abbott Diabetes Care Inc. | Analyte monitoring device and methods of use |
| US6495538B2 (en) * | 1999-06-23 | 2002-12-17 | Zinc Therapeutics, Canada Inc. | Zinc ionophores as therapeutic agents |
| KR20020027463A (ko) * | 1999-07-12 | 2002-04-13 | 우에노 도시오 | 스핀고신-1-인산 수용체 아고니스트 또는스핀고신-1-인산을 유효 성분으로서 함유하는 선유화 억제제 |
| US7432060B2 (en) | 2000-11-09 | 2008-10-07 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods for diagnosis of cardiovascular disease |
| US20050154407A1 (en) * | 2000-12-20 | 2005-07-14 | Fox Hollow Technologies, Inc. | Method of evaluating drug efficacy for treating atherosclerosis |
| US20100121360A9 (en) * | 2000-12-20 | 2010-05-13 | Fox Hollow Technologies, Inc | Testing a patient population having a cardiovascular condition for drug efficacy |
| US7699790B2 (en) * | 2000-12-20 | 2010-04-20 | Ev3, Inc. | Debulking catheters and methods |
| CA2432978C (en) * | 2000-12-22 | 2012-08-28 | Medlyte, Inc. | Compositions and methods for the treatment and prevention of cardiovascular diseases and disorders, and for identifying agents therapeutic therefor |
| US6560471B1 (en) | 2001-01-02 | 2003-05-06 | Therasense, Inc. | Analyte monitoring device and methods of use |
| JP2002243737A (ja) * | 2001-02-09 | 2002-08-28 | Azwell Inc | 抗スフィンゴ脂質モノクローナル抗体 |
| WO2002078512A2 (en) | 2001-04-02 | 2002-10-10 | Therasense, Inc. | Blood glucose tracking apparatus and methods |
| US20050130321A1 (en) * | 2001-04-23 | 2005-06-16 | Nicholson Jeremy K. | Methods for analysis of spectral data and their applications |
| US7262017B2 (en) * | 2001-09-14 | 2007-08-28 | Torrey Pines Institute For Molecular Studies | Diagnostic markers for ischemia |
| US7202089B2 (en) * | 2001-09-14 | 2007-04-10 | Alan Kleinfeld | Early diagnosis of stroke |
| US7608258B2 (en) * | 2002-04-13 | 2009-10-27 | Allan Mishra | Method for treatment of tendinosis using platelet rich plasma |
| US6811777B2 (en) * | 2002-04-13 | 2004-11-02 | Allan Mishra | Compositions and minimally invasive methods for treating incomplete connective tissue repair |
| HUE027779T2 (en) | 2002-05-09 | 2016-11-28 | Brigham & Womens Hospital Inc | 1L1RL-1 is a marker of cardiovascular disease |
| MXPA03004105A (es) * | 2002-05-14 | 2004-10-15 | Hoffmann La Roche | Elaboracion de una prognosis en casos de enfermedad cardiaca usando una combinacion de marcadores. |
| GB0216191D0 (en) * | 2002-07-11 | 2002-08-21 | Univ Leicester | Plasma urotensin in human heart failure |
| US20050014198A1 (en) * | 2002-07-11 | 2005-01-20 | Leong Ng | Assays and kits for detecting and monitoring heart disease |
| EP2386864A1 (en) * | 2002-10-09 | 2011-11-16 | DMI Biosciences, Inc. | Diagnosis and monitoring of Ischemia |
| GB0224425D0 (en) * | 2002-10-21 | 2002-11-27 | Univ Leicester | Method for prediction of cardiac disease |
| WO2004046729A2 (en) * | 2002-11-21 | 2004-06-03 | The University Of Leicester | Bodily fluid markers of tissue hypoxia |
| MXPA05005921A (es) * | 2002-12-02 | 2005-10-19 | Abgenix Inc | Anticuerpos dirigidos a factor de necrosis tumoral y sus usos. |
| US7811231B2 (en) | 2002-12-31 | 2010-10-12 | Abbott Diabetes Care Inc. | Continuous glucose monitoring system and methods of use |
| WO2004063084A2 (en) * | 2003-01-06 | 2004-07-29 | Nutri-Check Technologies, Llc | Individual need-based system for providing supplements |
| US7074194B2 (en) * | 2003-05-19 | 2006-07-11 | Ischemia Technologies, Inc. | Apparatus and method for risk stratification of patients with chest pain of suspected cardiac origin |
| US20040244062A1 (en) * | 2003-06-02 | 2004-12-02 | Crittenden Jill R. | Use of protein inhibitors as antithrombotic agents |
| US8066639B2 (en) | 2003-06-10 | 2011-11-29 | Abbott Diabetes Care Inc. | Glucose measuring device for use in personal area network |
| EP1522857A1 (en) * | 2003-10-09 | 2005-04-13 | Universiteit Maastricht | Method for identifying a subject at risk of developing heart failure by determining the level of galectin-3 or thrombospondin-2 |
| DE10351238A1 (de) * | 2003-11-03 | 2005-06-02 | Roche Diagnostics Gmbh | Diagnosestellung von akuten myokardialen, ischämischen Erkrankungen durch Kombination von Markern |
| US20050100964A1 (en) * | 2003-11-11 | 2005-05-12 | George Jackowski | Diagnostic methods for congestive heart failure |
| US7608458B2 (en) * | 2004-02-05 | 2009-10-27 | Medtronic, Inc. | Identifying patients at risk for life threatening arrhythmias |
| JP2007523324A (ja) * | 2004-02-05 | 2007-08-16 | メドトロニック・インコーポレーテッド | 命にかかわる不整脈のリスク状態にある患者を識別する方法及び装置 |
| WO2005089103A2 (en) | 2004-02-17 | 2005-09-29 | Therasense, Inc. | Method and system for providing data communication in continuous glucose monitoring and management system |
| EP2821793B1 (en) * | 2004-03-22 | 2017-04-19 | FFA Sciences, LLP | Development and use of fluorescent probes of unbound analytes |
| US7794713B2 (en) * | 2004-04-07 | 2010-09-14 | Lpath, Inc. | Compositions and methods for the treatment and prevention of hyperproliferative diseases |
| US8335652B2 (en) * | 2004-06-23 | 2012-12-18 | Yougene Corp. | Self-improving identification method |
| US20050287574A1 (en) * | 2004-06-23 | 2005-12-29 | Medtronic, Inc. | Genetic diagnostic method for SCD risk stratification |
| US8027791B2 (en) * | 2004-06-23 | 2011-09-27 | Medtronic, Inc. | Self-improving classification system |
| US7462268B2 (en) * | 2004-08-20 | 2008-12-09 | Allan Mishra | Particle/cell separation device and compositions |
| EP1789806A2 (en) * | 2004-09-13 | 2007-05-30 | Lipomics Technologies, Inc. | Metabolite markers for weight management |
| WO2006094185A2 (en) * | 2005-03-03 | 2006-09-08 | Dmi Biosciences Inc. | Quantification of proteins |
| US7794413B2 (en) * | 2005-04-19 | 2010-09-14 | Ev3, Inc. | Libraries and data structures of materials removed by debulking catheters |
| US8112240B2 (en) | 2005-04-29 | 2012-02-07 | Abbott Diabetes Care Inc. | Method and apparatus for providing leak detection in data monitoring and management systems |
| US20060246574A1 (en) * | 2005-04-29 | 2006-11-02 | Sarah Rosenstein | Dispenser for making a lateral flow device |
| US20080254661A1 (en) * | 2005-04-29 | 2008-10-16 | Byrne Norman R | Center Connect Single-Sided Junction Block |
| US20060246599A1 (en) * | 2005-04-29 | 2006-11-02 | Sarah Rosenstein | Lateral flow device |
| US20060257938A1 (en) * | 2005-05-10 | 2006-11-16 | Kleinfeld Alan M | Method of screening for drugs that block ligand binding to a lipid binding protein |
| JP4850001B2 (ja) * | 2005-09-05 | 2012-01-11 | プリマハム株式会社 | 新規ストレスバイオマーカー及びその用途 |
| US20070065954A1 (en) * | 2005-09-15 | 2007-03-22 | Minoru Taya | Surface plasmon resonance biosensor system for detection of antigens and method for determining the presence of antigens |
| US20070077200A1 (en) * | 2005-09-30 | 2007-04-05 | Baker Clark R | Method and system for controlled maintenance of hypoxia for therapeutic or diagnostic purposes |
| US20080213274A1 (en) * | 2005-10-28 | 2008-09-04 | Sabbadini Roger A | Compositions and methods for the treatment and prevention of fibrotic, inflammatory, and neovascularization conditions of the eye |
| US20090074720A1 (en) * | 2005-10-28 | 2009-03-19 | Sabbadini Roger A | Methods for decreasing immune response and treating immune conditions |
| US7766829B2 (en) | 2005-11-04 | 2010-08-03 | Abbott Diabetes Care Inc. | Method and system for providing basal profile modification in analyte monitoring and management systems |
| US7878644B2 (en) | 2005-11-16 | 2011-02-01 | Gerber Scientific International, Inc. | Light cure of cationic ink on acidic substrates |
| US8226891B2 (en) | 2006-03-31 | 2012-07-24 | Abbott Diabetes Care Inc. | Analyte monitoring devices and methods therefor |
| US7620438B2 (en) | 2006-03-31 | 2009-11-17 | Abbott Diabetes Care Inc. | Method and system for powering an electronic device |
| DK2386860T3 (en) | 2006-04-24 | 2015-02-09 | Critical Care Diagnostics Inc | Prediction of mortality and detection of severe illness |
| US20090305265A1 (en) * | 2006-04-27 | 2009-12-10 | Critical Care Diagnostics, Inc. | Interleukin-33 (il-33) for the diagnosis and prognosis of cardiovascular disease |
| DK2482078T3 (en) * | 2006-05-01 | 2016-05-02 | Critical Care Diagnostics Inc | Cardiovascular disease diagnosis |
| HUE025058T2 (en) * | 2006-05-02 | 2016-01-28 | Critical Care Diagnostics Inc | Differential diagnosis of pulmonary and cardiovascular disease |
| US9274129B2 (en) * | 2006-05-31 | 2016-03-01 | Lpath, Inc. | Methods and reagents for detecting bioactive lipids |
| US7862812B2 (en) * | 2006-05-31 | 2011-01-04 | Lpath, Inc. | Methods for decreasing immune response and treating immune conditions |
| US20080138334A1 (en) * | 2006-05-31 | 2008-06-12 | Sabbadini Roger A | Immune-Derived Moieties Reactive Against Bioactive Lipids, and Methods of Making and Using Same |
| US8796429B2 (en) * | 2006-05-31 | 2014-08-05 | Lpath, Inc. | Bioactive lipid derivatives, and methods of making and using same |
| US9274130B2 (en) | 2006-05-31 | 2016-03-01 | Lpath, Inc. | Prevention and treatment of pain using antibodies to lysophosphatidic acid |
| WO2007143225A2 (en) | 2006-06-07 | 2007-12-13 | Abbott Diabetes Care, Inc. | Analyte monitoring system and method |
| US9164109B2 (en) | 2006-10-27 | 2015-10-20 | Alan Kleinfeld | Use of probes for unbound metabolites |
| AU2007329759B2 (en) * | 2006-10-27 | 2013-05-30 | Lpath, Inc. | Compositions and methods for binding sphingosine-1-phosphate |
| CN101687031B (zh) * | 2006-10-27 | 2014-05-14 | 勒帕斯公司 | 用于治疗眼疾和眼病的组合物及方法 |
| US8732188B2 (en) | 2007-02-18 | 2014-05-20 | Abbott Diabetes Care Inc. | Method and system for providing contextual based medication dosage determination |
| US8930203B2 (en) | 2007-02-18 | 2015-01-06 | Abbott Diabetes Care Inc. | Multi-function analyte test device and methods therefor |
| US8123686B2 (en) | 2007-03-01 | 2012-02-28 | Abbott Diabetes Care Inc. | Method and apparatus for providing rolling data in communication systems |
| JP5105583B2 (ja) * | 2007-03-14 | 2012-12-26 | 国立大学法人信州大学 | 心血管系疾患既往区別方法 |
| US8456301B2 (en) | 2007-05-08 | 2013-06-04 | Abbott Diabetes Care Inc. | Analyte monitoring system and methods |
| US8461985B2 (en) | 2007-05-08 | 2013-06-11 | Abbott Diabetes Care Inc. | Analyte monitoring system and methods |
| US7928850B2 (en) | 2007-05-08 | 2011-04-19 | Abbott Diabetes Care Inc. | Analyte monitoring system and methods |
| US8665091B2 (en) | 2007-05-08 | 2014-03-04 | Abbott Diabetes Care Inc. | Method and device for determining elapsed sensor life |
| US20100179066A1 (en) * | 2007-06-07 | 2010-07-15 | Inserm (Institut National De La Santé Et De La Rec | Method for Assessing the Risk of a Cardiovascular Disease and for Diagnosing Dyslipidemia |
| US8067730B2 (en) | 2007-07-20 | 2011-11-29 | The George Washington University | Laser ablation electrospray ionization (LAESI) for atmospheric pressure, In vivo, and imaging mass spectrometry |
| US20100285446A1 (en) * | 2007-07-20 | 2010-11-11 | Akos Vertes | Methods for Detecting Metabolic States by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry |
| DE102007042986A1 (de) * | 2007-09-10 | 2009-04-23 | Siemens Ag | Medizinisches Gerät und Verfahren zum Betreiben eines medizinischen Geräts |
| ATE534912T1 (de) * | 2007-09-17 | 2011-12-15 | Bg Medicine Inc | Beurteilung des risikos von kongestiver herzinsuffizienz bei patienten, die mit einem peroxisom-proliferator-aktivator-rezeptor-gamma agonisten oder einem thiazolidindion behandelt werden oder möglicherweise damit behandelt werden sollen |
| US8361465B2 (en) * | 2007-10-26 | 2013-01-29 | Lpath, Inc. | Use of anti-sphingosine-1-phosphate antibodies in combination with chemotherapeutic agents |
| US20110143956A1 (en) * | 2007-11-14 | 2011-06-16 | Medtronic, Inc. | Diagnostic Kits and Methods for SCD or SCA Therapy Selection |
| WO2009064970A1 (en) * | 2007-11-14 | 2009-05-22 | Medtronic, Inc. | Genetic markers for scd or sca therapy selection |
| WO2009070457A1 (en) * | 2007-11-30 | 2009-06-04 | Waters Technologies Corporation | Determining the presence or absence of mineralocorticoids in samples |
| PT2827152T (pt) | 2008-04-18 | 2016-09-13 | Critical Care Diagnostics Inc | Previsão do risco de eventos cardíacos adversos maiores |
| US7811749B2 (en) * | 2008-04-21 | 2010-10-12 | Abbott Laboratories | Measuring free choline to determine suitability of erythrocytes for transfusion |
| WO2010042658A1 (en) | 2008-10-07 | 2010-04-15 | Bioparadox, Llc | Use of platelet rich plasma composition in the treatment of cardiac conduction abnormalities |
| JP2012505239A (ja) * | 2008-10-09 | 2012-03-01 | バイオパラドックス，リミテッド ライアビリティー カンパニー | 心臓治療用の多血小板血漿製剤 |
| US8871202B2 (en) | 2008-10-24 | 2014-10-28 | Lpath, Inc. | Prevention and treatment of pain using antibodies to sphingosine-1-phosphate |
| CN104198712A (zh) * | 2008-10-29 | 2014-12-10 | Bg医药股份有限公司 | 半乳凝素-3免疫测定法 |
| US8103456B2 (en) | 2009-01-29 | 2012-01-24 | Abbott Diabetes Care Inc. | Method and device for early signal attenuation detection using blood glucose measurements |
| US20110076697A1 (en) * | 2009-04-28 | 2011-03-31 | Innovative Laboratory Technologies, Inc. | Lateral-flow immuno-chromatographic assay devices |
| US9226701B2 (en) | 2009-04-28 | 2016-01-05 | Abbott Diabetes Care Inc. | Error detection in critical repeating data in a wireless sensor system |
| WO2010132546A2 (en) * | 2009-05-12 | 2010-11-18 | Medtronic, Inc. | Sca risk stratification by predicting patient response to anti-arrhythmics |
| US9184490B2 (en) | 2009-05-29 | 2015-11-10 | Abbott Diabetes Care Inc. | Medical device antenna systems having external antenna configurations |
| EP2470911B1 (en) | 2009-08-25 | 2016-04-20 | BG Medicine, Inc. | Galectin-3 and cardiac resynchronization therapy |
| US8993331B2 (en) | 2009-08-31 | 2015-03-31 | Abbott Diabetes Care Inc. | Analyte monitoring system and methods for managing power and noise |
| WO2011026147A1 (en) | 2009-08-31 | 2011-03-03 | Abbott Diabetes Care Inc. | Analyte signal processing device and methods |
| WO2011041469A1 (en) | 2009-09-29 | 2011-04-07 | Abbott Diabetes Care Inc. | Method and apparatus for providing notification function in analyte monitoring systems |
| EP2526426A1 (en) | 2010-01-20 | 2012-11-28 | Universität Zürich | Method for assaying diseases characterised by dyslipidemia |
| US9285378B2 (en) | 2010-01-29 | 2016-03-15 | Metanomics Gmbh | Means and methods for diagnosing heart failure in a subject |
| DK2385374T4 (en) | 2010-05-05 | 2018-04-30 | Zora Biosciences Oy | LIPIDOMICS BIOMARKERS FOR ATHEROSCLEROSIS AND CARDIOVASCULAR DISEASE |
| US9201080B2 (en) | 2010-06-20 | 2015-12-01 | Zora Biosciences Oy | Lipidomic biomarkers for identification of high-risk coronary artery disease patients |
| US20120029003A1 (en) | 2010-07-02 | 2012-02-02 | Bg Medicine, Inc. | Galectin-3 and statin therapy |
| US20120220671A1 (en) | 2011-01-31 | 2012-08-30 | Bg Medicine, Inc. | Use of galectin-3 for detecting and prognosing heart failure after acute coronary syndrome |
| ES2897419T3 (es) | 2011-03-17 | 2022-03-01 | Critical Care Diagnostics Inc | Procedimientos de predicción del riesgo de un resultado clínico adverso |
| US8829426B2 (en) | 2011-07-14 | 2014-09-09 | The George Washington University | Plume collimation for laser ablation electrospray ionization mass spectrometry |
| EP2737321B1 (en) * | 2011-07-28 | 2017-03-01 | Metanomics GmbH | Means and methods for diagnosing and monitoring heart failure in a subject |
| JP6443802B2 (ja) | 2011-11-07 | 2018-12-26 | アボット ダイアベティス ケア インコーポレイテッドＡｂｂｏｔｔ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ Ｉｎｃ． | 分析物モニタリング装置および方法 |
| EP2592423A1 (en) * | 2011-11-08 | 2013-05-15 | Zora Biosciences OY | Lipidomic biomarkers for the prediction of cardiovascular outcomes in coronary artery disease patients not undergoing statin treatment |
| EP2592422A1 (en) * | 2011-11-08 | 2013-05-15 | Zora Biosciences OY | Lipidomic biomarkers for the prediction of cardiovascular outcomes in coronary artery disease patients undergoing statin treatment |
| JP2015505368A (ja) | 2012-01-06 | 2015-02-19 | ビージー メディシン， インコーポレイテッド | 妊娠高血圧腎症および関連状態のリスク評価および検出のためのガレクチン−３の使用 |
| EP2888687B1 (en) | 2012-08-21 | 2023-08-02 | Critical Care Diagnostics, Inc. | Multimarker risk stratification |
| US9968306B2 (en) | 2012-09-17 | 2018-05-15 | Abbott Diabetes Care Inc. | Methods and apparatuses for providing adverse condition notification with enhanced wireless communication range in analyte monitoring systems |
| US20140356893A1 (en) | 2013-06-04 | 2014-12-04 | Allan Mishra | Compositions and methods for using platelet-rich plasma for drug discovery, cell nuclear reprogramming, proliferation or differentiation |
| WO2015095882A1 (en) * | 2013-12-20 | 2015-06-25 | The Regents Of The University Of California | Biomimetic virus-based colorimetric sensors |
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| US5604105B1 (en) * | 1990-10-12 | 1999-08-24 | Spectral Diagnostics Inc | Method and device for diagnosingand distinguishing chest pain in early onset thereof |
| CA2027434C (en) | 1990-10-12 | 1999-01-05 | George Jackowski | Diagnostic kit for diagnosing and distinguishing chest pain in early onset thereof |
| US5710008B1 (en) | 1990-10-12 | 1999-09-07 | Spectral Diagnostics Inc | Method and device for diagnosing and distinguishing chest pain in early onset thereof |
| RU2003979C1 (ru) * | 1991-06-28 | 1993-11-30 | Московский областной научно-исследовательский клинический институт им.М.Ф.Владимирского | Способ прогнозировани течени послеоперационного периода у больных врожденными пороками сердца |
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