JP5208650B2 - 顕微鏡システム - Google Patents

Description

本発明は、顕微鏡システムに関するものである。

従来、複数の隣接する部分画像を組み合わせてより広い視野の画像、いわゆるマップ画像を生成する方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。この特許文献１においては、より高い倍率で取得した他の部分画像群を前記マップ画像に対応づけることで、マップ画像から、高い倍率の画像の位置を突き止めるようにしている。

特表２００１−５１９９４４号公報

しかしながら、特許文献１に開示された方法では、マップ画像を生成するために観察可能な全範囲にわたって部分画像を取得する必要があり、試料が存在しない範囲についても部分画像を取得するため、マップ画像の生成に時間がかかり、多大な記憶容量が必要になるという不都合がある。特に、レーザ光を走査させて画像を取得する方式のレーザ走査型顕微鏡においては、試料の像を撮影するＣＣＤ等の撮像素子を用いる場合と比較して、画像取得に時間がかかるため、迅速にマップ画像を生成することができないという不都合がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、多数の部分画像を組み合わせてなるマップ画像を短時間で生成することを可能とする顕微鏡システムを提供することを目的としている。

上記目的を達成するために本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、試料を収容した１以上の容器を搭載し該容器の位置を調節可能な電動ステージと、該電動ステージ上に搭載された前記容器内の前記試料に照射するレーザ光を走査するスキャナと、該スキャナにより走査されたレーザ光を前記試料に集光する対物レンズと、該対物レンズによるレーザ光の照射により試料において発生した蛍光を検出して試料の画像を取得する画像取得部と、これらを収容する暗箱とを備える顕微鏡と、前記電動ステージに対する前記容器の搭載位置を記憶する記憶部と、該記憶部に記憶された前記容器の搭載位置に基づいて、前記画像取得部により取得する容器内の部分画像の取得位置を設定する画像取得位置設定部と、該画像取得位置設定部により設定された取得位置に基づいて、前記容器毎に複数枚の部分画像を取得するように前記顕微鏡を制御する制御部と、前記容器毎に取得された複数枚の部分画像を配列しマップ画像を生成するマップ画像生成部とを備える顕微鏡システムを提供する。

本発明によれば、電動ステージ上に試料を収容した１以上の容器を搭載すると、記憶部に記憶されている容器の搭載位置に応じて、画像取得位置設定部が部分画像の取得位置を設定する。制御部は、設定された取得位置に基づいて顕微鏡を制御し、容器内の複数枚の部分画像を容器毎に取得させる。顕微鏡においては、スキャナにより走査されたレーザ光が対物レンズによって試料に集光され、試料において発生した蛍光が画像取得部により検出されることにより部分画像が取得される。そして、マップ画像生成部が、取得された複数枚の部分画像を配列することにより、部分画像より広い視野範囲にわたるマップ画像が生成される。

この場合において、本発明によれば、画像取得位置設定部が、記憶部に記憶されている容器の搭載位置に応じて部分画像の取得位置を設定するので、搭載位置の近傍における容器内の必要な範囲にわたる部分画像のみを取得することが可能となる。その結果、容器外の部分画像を取得してしまう無駄を省いて、短時間に、かつ、少ない記憶容量でマップ画像を生成することができる。

上記発明においては、前記制御部が、前記画像取得部により取得される前記部分画像の取得に際して、前記容器毎に少なくとも１回合焦動作を行うよう前記顕微鏡を制御することとしてもよい。
このようにすることで、容器毎に少なくとも１回試料に合焦されるので、試料が存在しない焦点面のみにおいて部分画像が取得されてしまう無駄を省くことができる。

また、上記発明においては、前記画像取得位置設定部が、前記容器のほぼ中央から一方向に回転する順序で、隣接する前記部分画像を取得するように取得位置を設定することとしてもよい。
このようにすることで、試料の存在している可能性が高い容器のほぼ中央部から広がるように部分画像が取得されるので、容器内の全範囲にわたって部分画像を取得しなくても試料が存在するマップ画像を短時間で取得することができる。

また、上記発明においては、前記電動ステージが相互に交差する複数の移動軸を備え、前記画像取得位置設定部が、前記複数の移動軸に交差する方向に隣接する部分画像を取得するように取得位置を設定してもよい。
このようにすることで、隣接する部分画像を取得するために電動ステージを作動させる場合に、複数の移動軸を同時に移動させることができ、各移動軸による移動距離を短縮して、移動時間を短縮し、短時間の内にマップ画像を生成することができる。例えば、直交する２方向に移動軸を有する場合、移動軸方向に隣接する部分画像を取得する場合には、１つの移動軸のみを距離Ｘだけ移動させる必要がある。しかし、２つの移動軸に対して４５°の角度をなす方向に隣接する部分画像を取得する場合には、２つの移動軸をそれぞれＸ／√２ずつ同時に移動させれば足り、所要時間を約３０％短縮することができる。

また、上記発明においては、前記制御部が、多重染色された試料のマップ画像を生成する場合に、一部の蛍光色について容器毎に複数の部分画像を取得した後、取得された部分画像中で蛍光の存在する部分画像の取得位置において、他の蛍光色についても部分画像を取得するよう前記顕微鏡を制御し、前記マップ画像生成部は、複数の蛍光色について取得された部分画像を合成してマップ画像を生成することとしてもよい。
このようにすることで、多重染色画像が得られない領域について部分画像を取得してしまう無駄を省き、マップ画像を短時間で生成することができる。

また、上記発明においては、前記制御部が、前記対物レンズの焦点位置を光軸方向に異ならせて複数組の部分画像群を取得するよう前記顕微鏡を制御し、前記マップ画像生成部は、取得された複数組の部分画像群を合成してマップ画像を生成することとしてもよい。
このようにすることで、異なる焦点面に存在する試料の位置を一目で確認することができるマップ画像を生成することができる。

また、上記発明においては、前記制御部が、マップ画像を生成するための部分画像の取得に際して、被写界深度を増大させるよう前記顕微鏡を制御することとしてもよい。
このようにすることで、異なる焦点面に存在する試料の位置を一目で確認することができるマップ画像を生成することができる。

本発明によれば、多数の部分画像を組み合わせてなるマップ画像を短時間で生成することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡システムについて、図１〜図８を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１は、図１に示されるように、レーザ走査型顕微鏡２と、該レーザ走査型顕微鏡２を制御する制御装置３とを備えている。

レーザ走査型顕微鏡２は、試料を収容した複数の容器４（図２参照。）を搭載して移動させる電動ステージ５と、レーザ光を出射するレーザ光源部６と、レーザ光源部６からのレーザ光を２次元的に走査するスキャナ７と、該スキャナ７により走査されたレーザ光を試料に集光する対物レンズ８と、該対物レンズ８によるレーザ光の照射により試料において発生した蛍光を検出して試料の画像を取得する画像取得部９と、これらを収容する暗箱１０とを備えている。

暗箱１０内は、電動ステージ５を含んだ上方の第１の領域１１と、それより下方の第２の領域１２とに区画されている。第１の領域１１には、ヒータ１３が配置され、領域１１内の温度が所定の培養条件（例えば、２７℃±０．５℃）となるように調整されている。

第１の領域１１内には、電動ステージ５に位置決め状態に搭載されるサンプルホルダ１４が配置されている。
電動ステージ５は、図示しない３個のモータを備えていて、相互に直交するＸ，Ｙ，Ｚ方向の移動軸に沿って独立して移動することができ、搭載した容器４を３次元方向に移動させることができるようになっている。

サンプルホルダ１４は、図２に示されるように、貫通穴１５ａを有する平板状のプレート部１５と、該プレート部１５の貫通穴１５ａに一致する位置に配置されたシャーレ等の透明な容器４をプレート部１５との間に挟んで位置決め状態に固定するホルダ部１６とを備えている。サンプルホルダ１４は電動ステージ５に設けられた図示しないセンサによってその種別が検出されるようになっている。

また、サンプルホルダ１４に搭載された複数の容器４は、簡易型インキュベータ１７内に収容されてその培養条件（例えば、湿度１００％およびＣＯ_２濃度０．５％）が維持されるようになっている。図中符号１８は、位相差観察用の位相差コンデンサである。

レーザ光源部６は、異なる波長のレーザ光を出射する複数のレーザダイオード１９と、これら複数のレーザダイオード１９から発せられたレーザ光を単一の光路に合流させるミラー２０およびダイクロイックミラー２１とを備えている。
スキャナ７は、例えば、相互に直交する軸線回りに揺動させられる２枚のガルバノミラーを対向させて構成された、いわゆる近接ガルバノミラーである。

対物レンズ８は、ドライ観察用の対物レンズ８ａと、油浸または水浸観察用の対物レンズ８ｂとがレボルバ８ｃによって切り替え可能に設けられている。また、対物レンズ８にはオートフォーカス機能が備えられていて、定期的にまたは必要に応じて合焦位置を検出し、光軸に沿う方向に移動させられることにより、対物レンズ８の焦点位置を試料の表面に一致させることができるようになっている。
図中符号２２は、対物レンズ８ｂと容器４底面との間に油浸用のエマージョンオイルまたは水浸用の水を供給するポンプ、符号２３は、水またはエマージョンオイルを除去するためのエアブラシである。

スキャナ７と対物レンズ８との間には、スキャナ７により走査されたレーザ光を集光する瞳投影レンズ２４および結像レンズ２５が配置されている。
画像取得部９は、レーザ光源部６とスキャナ７との間に挿入されて、試料から発せられ、対物レンズ８、結像レンズ２５、瞳投影レンズ２４およびスキャナ７を介して戻る蛍光をレーザ光の光路から分岐するビームスプリッタ２６と、該ビームスプリッタ２６により分岐された蛍光を集光するコンフォーカルレンズ２７と、可変ピンホール２８と、コリメートレンズ２９と、該コリメートレンズ２９により略平行光とされた蛍光を回折させて波長ごとに分離するグレーティング３０と、該グレーティング３０により分離された蛍光を集光する集光レンズ３１と、集光された蛍光を波長ごとに分岐するビームスプリッタ３２と、分岐された蛍光をそれぞれ検出する光検出器３３とを備えている。可変ピンホール２８は、対物レンズ８の焦点位置と光学的に共役な位置関係に配置されている。符号３４はピンホールである。

制御装置３は、図３に示されるように、サンプルホルダ１４上における容器４の搭載位置をサンプルホルダ１４の種別に対応づけて記憶する記憶部３５と、センサによって検出されたサンプルホルダ１４の種別に対応づけて該記憶部３５に記憶されている容器４の搭載位置に基づいて、画像を取得する取得位置を設定する画像取得位置設定部３６と、設定された取得位置において各容器４毎内の領域を複数に分割した部分領域の複数枚の部分画像Ｇａを取得するようにレーザ走査型顕微鏡２を制御する制御部３７と、取得された複数枚の部分画像を配列してマップ画像Ｇを生成するマップ画像生成部３８とを備えている。

記憶部３５に記憶する搭載位置としては、例えば、サンプルホルダ１４のプレート部１５に設けられた貫通穴１５ａの中心位置Ｐ等を挙げることができる。図４に示される例では、画像取得位置設定部３６は、各容器４を搭載するサンプルホルダ１４のプレート部１５の各貫通穴１５ａの中心位置Ｐを中心として、相互に隣接する５×５＝２５枚の部分画像Ｇａの取得位置を設定するようになっている。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡システム１の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１によれば、サンプルホルダ１４に複数の容器４を設置して、電動ステージ５上に搭載すると、電動ステージ５に設けられたセンサによりサンプルホルダ１４の種別が検出され、検出されたサンプルホルダ１４の種別に基づいて記憶部３５内に記憶されている容器４の位置情報が読み出される。

画像取得位置設定部３６は、読み出された容器４の位置情報に基づいて、部分画像Ｇａを取得する画像取得位置を設定し、設定された取得位置に基づいて制御部３７がレーザ走査型顕微鏡２を制御する。
レーザ走査型顕微鏡２においては、レーザ光源部６から出射されたレーザ光が、スキャナ７によって２次元的に走査される。制御部３７は、レーザ光の走査位置および範囲が、各部分画像Ｇａの取得位置に一致するようにスキャナ７を制御する。

スキャナ７により２次元的に走査されたレーザ光は瞳投影レンズ２４、結像レンズ２５および対物レンズ８を介して容器４内の試料に集光されるので、レーザ光の照射位置においては、試料内に存在している蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。発生した蛍光は、対物レンズ８、結像レンズ２５、瞳投影レンズ２４およびスキャナ７を介して戻り、ビームスプリッタ２６によって分岐されて画像取得部９に入射する。

画像取得部９に入射した蛍光は、コンフォーカルレンズ２７によって集光され、可変ピンホール２８を通過した蛍光のみがコリメートレンズ２９によって略平行光とされた後、グレーティング３０によって分光されて集光レンズ３１およびビームスプリッタ３２を介して波長毎に異なる光検出器３３により検出される。可変ピンホール２８を十分に絞っておくことにより、対物レンズ８の焦点位置から発生した蛍光のみを通過させて光検出器３３により検出させることができる。これにより、ブレのない鮮明な共焦点蛍光画像を取得することができる。

画像取得位置設定部３６は、サンプルホルダ１４のプレート部１５の貫通穴１５ａの中心位置Ｐを中心として、相互に隣接する５×５枚の部分画像Ｇａを取得するようにその取得位置を設定するので、画像取得部９により２５枚の部分画像Ｇａが取得される。そして、マップ画像生成部３８の作動により、取得された２５枚の部分画像Ｇａが並べられて、容器４のほぼ全体領域を覆うマップ画像Ｇが生成される。

さらに、画像取得位置設定部３８は、複数の容器４に対して容器４毎に部分画像Ｇａの取得位置を設定するので、容器４外の余分な画像を取得することなく、容器４内の必要な範囲にわたる部分画像Ｇａのみを取得し、無駄を省いて、短時間に、かつ、少ない記憶容量でマップ画像Ｇを生成することができるという利点がある。

なお、本実施形態においては、制御部３７が、レーザ走査型顕微鏡２によって各容器４の部分画像Ｇａを取得させる際に、容器４毎に少なくとも１回、オートフォーカス機能によって合焦動作を行わせることが好ましい。このようにすることで、試料が存在しない焦点面のみにおいて部分画像Ｇａが取得されてしまう無駄を省くことができる。

また、画像取得位置設定部３８が、複数の部分画像Ｇａの取得順序を設定することにしてもよい。すなわち、図５に矢印で示されるように、容器４のほぼ中央から一方向に回転する順序で、隣接する部分画像Ｇａを取得するように取得順序を設定することにすれば、試料の存在している可能性が高い容器４のほぼ中央部から広がるように部分画像Ｇａが取得される。これにより、容器４内の全範囲にわたって部分画像Ｇａを取得しなくても試料が存在するマップ画像Ｇを早期に取得することができ、取得する部分画像Ｇａ数を少なくして短時間で有効なマップ画像Ｇを取得することができる。

また、画像取得位置設定部３８が、電動ステージ５の複数の移動軸に交差する方向に隣接する部分画像Ｇａを取得するように取得順序を設定することにしてもよい。すなわち、例えば、図６に矢印示されるように、直交するＸ，Ｙ２方向に同時に同一速度で電動ステージ５を移動させることにより、試料は２つの移動軸に対して４５°の角度をなす方向に移動させられる。したがって、各移動軸は距離Ａ／√２ずつ移動するだけで、移動軸に対して４５°の角度をなす方向に距離Ａだけ移動することができ、単一の移動軸で同じ距離Ａだけ移動する場合と比較して移動に要する時間を約３０％短縮できる。

すなわち、隣接する部分画像Ｇａを取得するために電動ステージ５を作動させる場合に、複数の移動軸を同時に移動させることができ、各移動軸による移動距離を短縮して、移動時間を短縮し、短時間の内にマップ画像Ｇを生成することができるという利点がある。

また、本実施形態においては、多重染色された試料のマップ画像Ｇを生成する場合に、図７（ａ）に示されるように、一部の蛍光色について容器４毎に複数の部分画像Ｇａを取得した後、制御部３７が取得された部分画像Ｇａ中で蛍光の存在する部分画像Ｇａの取得位置（図７（ｂ）の斜線部）のみにおいて、他の蛍光色についても部分画像Ｇａを取得するようレーザ走査型顕微鏡２を制御してもよい。このようにすることで、一律に複数の蛍光色についてすべての領域の部分画像Ｇａを取得する場合と比較して、短時間で、所望の場所の多重染色されたマップ画像Ｇを得ることができるという利点がある。

また、本実施形態においては、図８（ａ）に示されるように、制御部３７が、対物レンズ８の焦点位置を光軸方向に異ならせて複数組の部分画像群Ｇｂを取得するようレーザ走査型顕微鏡２を制御し、図８（ｂ）に示されるように、マップ画像生成部３８が、取得された複数組の部分画像群Ｇｂを合成してマップ画像Ｇを生成することとしてもよい。
このようにすることで、電動ステージ５が傾いていたり、試料の存在位置が対物レンズ８の光軸方向に分布している場合であっても、合成されたマップ画像Ｇから試料の存在の有無を簡易に判定することができる。

また、本実施形態においては、制御部３７が、マップ画像Ｇを生成するための部分画像Ｇａの取得に際して、被写界深度を増大させるようレーザ走査型顕微鏡２を制御することとしてもよい。具体的には可変ピンホール２８の口径を増加させることとしてもよい。
このようにすることで、対物レンズ８の光軸方向に分布する試料の位置にかかわらず、試料の存在する部分画像Ｇａを簡易に取得することができ、上記よりもさらに短時間に、試料の存在の有無を簡易に判定可能なマップ画像Ｇを生成することができる。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡システムを示すブロック図である。 図１の顕微鏡システムにおけるサンプルホルダと、該サンプルホルダに搭載された容器の一例を示す斜視図である。 図１の顕微鏡システムの制御装置を示すブロック図である。 図２のサンプルホルダに保持された容器内に取得される部分画像およびマップ画像の一例を示す平面図である。 図１の顕微鏡システムによる部分画像の取得順序の一例を示す平面図である。 図１の顕微鏡システムによる部分画像の取得順序の他の例を示す平面図である。 図１の顕微鏡システムによる部分画像の取得方法の一例を示す平面図である。 図１の顕微鏡システムによる部分画像の取得方法の他の例を示す平面図である。

符号の説明

Ｇ マップ画像
Ｇａ 部分画像
１ 顕微鏡システム
２ 顕微鏡
３ 制御装置（制御部）
４ 容器
５ 電動ステージ
７ スキャナ
８ 対物レンズ
９ 画像取得部
１０ 暗箱
３５ 記憶部
３６ 画像取得位置設定部
３８ マップ画像生成部

Claims (10)

1. 試料を収容した１以上の容器を搭載し該容器の位置を調節可能な電動ステージと、該電動ステージ上に搭載された前記容器内の前記試料に照射するレーザ光を走査するスキャナと、該スキャナにより走査されたレーザ光を前記試料に集光する対物レンズと、該対物レンズによるレーザ光の照射により試料において発生した蛍光を検出して試料の画像を取得する画像取得部と、これらを収容する暗箱とを備える顕微鏡と、
   前記電動ステージに対する前記容器の搭載位置を記憶する記憶部と、
   該記憶部に記憶された前記容器の搭載位置に基づいて、前記画像取得部により取得する容器内の部分画像の取得位置を設定する画像取得位置設定部と、
   該画像取得位置設定部により設定された取得位置に基づいて、前記容器毎に複数枚の部分画像を取得するように前記顕微鏡を制御する制御部と、
   前記容器毎に取得された複数枚の部分画像を配列しマップ画像を生成するマップ画像生成部とを備え、
   前記容器を保持するホルダ部を有し、前記電動ステージへ搭載される試料ホルダと、
   前記試料ホルダの種類を検出するセンサとをさらに備え、
   前記記憶部は、前記試料ホルダの前記ホルダ部に関する位置情報を記憶し、
   前記画像取得位置設定部は、前記センサにより検出された前記試料ホルダの種類に対応する前記位置情報を用いて前記部分画像の前記取得位置を設定する顕微鏡システム。
2. 試料を収容した１以上の容器を搭載し該容器の位置を調節可能な電動ステージと、該電動ステージ上に搭載された前記容器内の前記試料に照射するレーザ光を走査するスキャナと、該スキャナにより走査されたレーザ光を前記試料に集光する対物レンズと、該対物レンズによるレーザ光の照射により試料において発生した蛍光を検出して試料の画像を取得する画像取得部と、これらを収容する暗箱とを備える顕微鏡と、
   前記電動ステージに対する前記容器の搭載位置を記憶する記憶部と、
   該記憶部に記憶された前記容器の搭載位置に基づいて、前記画像取得部により取得する容器内の部分画像の取得位置を設定する画像取得位置設定部と、
   該画像取得位置設定部により設定された取得位置に基づいて、前記容器毎に複数枚の部分画像を取得するように前記顕微鏡を制御する制御部と、
   前記容器毎に取得された複数枚の部分画像を配列しマップ画像を生成するマップ画像生成部とを備え、
   前記制御部が、多重染色された試料のマップ画像を生成する場合に、一部の蛍光色について容器毎に複数の部分画像を取得した後、取得された部分画像中で蛍光の存在する部分画像の取得位置において、他の蛍光色についても部分画像を取得するよう前記顕微鏡を制御し、
   前記マップ画像生成部は、複数の蛍光色について取得された部分画像を合成してマップ画像を生成する顕微鏡システム。
3. 試料を収容した１以上の容器を搭載し該容器の位置を調節可能な電動ステージと、該電動ステージ上に搭載された前記容器内の前記試料に照射するレーザ光を走査するスキャナと、該スキャナにより走査されたレーザ光を前記試料に集光する対物レンズと、該対物レンズによるレーザ光の照射により試料において発生した蛍光を検出して試料の画像を取得する画像取得部と、これらを収容する暗箱とを備える顕微鏡と、
   前記電動ステージに対する前記容器の搭載位置を記憶する記憶部と、
   該記憶部に記憶された前記容器の搭載位置に基づいて、前記画像取得部により取得する容器内の部分画像の取得位置を設定する画像取得位置設定部と、
   該画像取得位置設定部により設定された取得位置に基づいて、前記容器毎に複数枚の部分画像を取得するように前記顕微鏡を制御する制御部と、
   前記容器毎に取得された複数枚の部分画像を配列しマップ画像を生成するマップ画像生成部とを備え、
   前記制御部が、マップ画像を生成するための部分画像の取得に際して、被写界深度を増大させるよう前記顕微鏡を制御する顕微鏡システム。
4. 前記容器を保持するホルダ部を有し、前記電動ステージへ搭載される試料ホルダをさらに備え、
   前記記憶部は、前記試料ホルダの前記ホルダ部に関する位置情報を記憶し、
   前記画像取得位置設定部は、前記記憶部に記憶された前記位置情報を用いて前記部分画像の前記取得位置を設定する請求項２または請求項３に記載の顕微鏡システム。
5. 前記位置情報は、前記ホルダ部に保持される前記容器の略中心を示す情報を含み、
   前記画像取得位置設定部は、前記容器の略中心から一方向へ回転する順序で隣接する部分画像を取得するように前記取得位置および取得順序を設定する請求項１または請求項４に記載の顕微鏡システム。
6. 前記制御部が、前記画像取得部により取得される前記部分画像の取得に際して、前記容器毎に少なくとも１回合焦動作を行うよう前記顕微鏡を制御する請求項１から請求項５のいずれかに記載の顕微鏡システム。
7. 前記画像取得位置設定部が、前記容器のほぼ中央から一方向に回転する順序で、隣接する前記部分画像を取得するように取得位置を設定する請求項１から請求項６のいずれかに記載の顕微鏡システム。
8. 前記電動ステージが相互に交差する複数の移動軸を備え、
   前記画像取得位置設定部が、前記複数の移動軸に交差する方向に隣接する部分画像を取得するように取得位置を設定する請求項１から請求項７のいずれかに記載の顕微鏡システム。
9. 前記制御部が、前記対物レンズの焦点位置を光軸方向に異ならせて複数組の部分画像群を取得するよう前記顕微鏡を制御し、
   前記マップ画像生成部は、取得された複数組の部分画像群を合成してマップ画像を生成する請求項１から請求項８のいずれかに記載の顕微鏡システム。
10. 前記画像取得部が、前記対物レンズの焦点位置と光学的に共役な位置に配置された、口径を変更可能な可変ピンホールを有する請求項１から請求項９のいずれかに記載の顕微鏡システム。

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