JP5202716B2

JP5202716B2 - Mutant alkaline cellulase

Info

Publication number: JP5202716B2
Application number: JP2011253004A
Authority: JP
Inventors: 佳宏袴田; 和久澤田; 圭二遠藤; 裕司児玉; 恭尚和田; 資通四方; 徹小林
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2002-03-27
Filing date: 2011-11-18
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2023-01-22
Also published as: JP2012090631A

Description

本発明は、衣料用洗剤等に配合可能な変異アルカリセルラーゼに関する。 The present invention relates to a mutant alkaline cellulase that can be blended in a laundry detergent or the like.

セルロースは地球上で最も豊富に存在するバイオマス資源である。斯かるセルラーゼを利用した技術のうち、衣料用洗剤への配合は、洗浄力を向上させるばかりでなく、洗剤のコンパクト化にも貢献して広く定着している。 Cellulose is the most abundant biomass resource on earth. Of the technologies using such cellulases, the incorporation into detergents for clothing has not only improved the cleaning power but also contributed to the downsizing of the detergent and has become widely established.

セルラーゼは中酸性領域のみで作用する酵素であり、アルカリ性の衣料用洗剤液中で作用できるものではなかったが、掘越（特許文献１、非特許文献１等参照）によって好アルカリ性バチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼが見出され、衣料用重質洗剤への応用が可能となった。そして、これまでに好アルカリ性バチルス属細菌が生産するアルカリセルラーゼ（特許文献２、特許文献３、特許文献４等参照）が開発され、衣料用洗剤へ配合されるに至っている。 Cellulase is an enzyme that acts only in a medium acidic region and was not able to act in an alkaline clothing detergent solution, but derived from an alkalophilic Bacillus genus by Minegoshi (see Patent Document 1, Non-Patent Document 1, etc.). Of alkaline cellulase has been found, making it possible to apply to heavy laundry detergents. And so far, alkaline cellulase (see Patent Document 2, Patent Document 3, Patent Document 4 and the like) produced by alkalophilic Bacillus bacteria has been developed and has been incorporated into clothing detergents.

近年、遺伝子工学の発展に伴い洗剤用酵素の生産も遺伝子組換えにより大量生産されるようになっているが、アルカリセルラーゼについても例外ではなく、既に数多くの遺伝子についてクローニング、塩基配列の決定がなされ、更に生産菌の変異育種や酵素をコードする遺伝子を改良するという技術の導入が行われている。
しかしながら、工業的レベルでの生産を考えた場合、その生産性は必ずしも満足できるものではなく、培地中に効率良く生産されるアルカリセルラーゼが求められていた。 In recent years, with the development of genetic engineering, detergent enzymes have been mass-produced by gene recombination. Alkaline cellulase is no exception, and many genes have already been cloned and sequenced. In addition, mutation breeding of production bacteria and techniques for improving genes encoding enzymes have been introduced.
However, when considering production at an industrial level, the productivity is not always satisfactory, and an alkaline cellulase that is efficiently produced in a culture medium has been demanded.

特公昭５０−２８５１５号公報Japanese Patent Publication No. 50-28515 特公昭６０−２３１５８号公報Japanese Patent Publication No. 60-23158 特公平６−０３０５７８号公報Japanese Patent Publication No. 6-030578 米国特許第４９４５０５３号明細書US Pat. No. 4,945,053

Horikoshi & Akiba, Alkalophilic Microorganisms, Springer, Berlin, 1982Horikoshi & Akiba, Alkalophilic Microorganisms, Springer, Berlin, 1982

本発明は、アルカリ性領域で良好に作用し、且つ分泌能が高く、または比活性が向上することで容易に大量生産が可能なアルカリセルラーゼを提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide an alkaline cellulase that works well in an alkaline region, has high secretion ability, and can be easily mass-produced by improving specific activity.

本発明者らは、アルカリセルラーゼの特性を保持しつつ、効率良く培地中に生産できる新たな酵素の探索を行ったところ、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列中の特定位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異アルカリセルラーゼが高い分泌能を有する、あるいは比活性が向上することにより大量生産が可能であることを見出した。 The present inventors have searched for a new enzyme that can be efficiently produced in a culture medium while retaining the characteristics of alkaline cellulase. As a result, the amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 It has been found that a mutant alkaline cellulase in which an amino acid residue at a specific position in the sequence is substituted with another amino acid residue has high secretory capacity or can be mass-produced by improving specific activity.

すなわち本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼについて、配列番号１の（ａ）１０位、（ｂ）１６位、（ｃ）２２位、（ｄ）３３位、（ｅ）３９位、（ｆ）７６位、（ｇ）１０９位、（ｈ）２４２位、（ｉ）２６３位、（ｊ）３０８位、（ｋ）４６２位、（ｌ）４６６位、（ｍ）４６８位、（ｎ）５５２位、（ｏ）５６４位又は（ｐ）６０８位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異アルカリセルラーゼ、及びそれをコードする遺伝子を提供するものである。 That is, the present invention relates to a cellulase comprising an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, (a) at position 10, (b) at position 16, and (c) at position 22 in SEQ ID NO: 1. (D) 33rd, (e) 39th, (f) 76th, (g) 109th, (h) 242nd, (i) 263th, (j) 308th, (k) 462th, ( l) Mutant alkaline cellulase in which the amino acid residue at position 466, (m) position 468, (n) position 552, (o) position 564 or (p) position 608 or a corresponding position is substituted with another amino acid residue And a gene encoding the same.

また本発明は、該遺伝子を含有するベクター、該ベクターを含有する形質転換体を提供するものである。 The present invention also provides a vector containing the gene and a transformant containing the vector.

更に本発明は、上記変異アルカリセルラーゼを配合する洗浄剤組成物を提供するものである。 Furthermore, this invention provides the cleaning composition which mix | blends the said variation | mutation alkaline cellulase.

本発明の変異アルカリセルラーゼを用いれば、これまでに比べ高活性の培養液を得ることができるため、洗剤等工業用用途に必要なアルカリセルラーゼを大量に供給可能である。また、一定の酵素量を生産する場合においては培養回数を減少させることで、培養に要するエネルギー、培地成分量、培養中に生成される二酸化炭素量、並びに排水量を減少させることが可能となる。 When the mutant alkaline cellulase of the present invention is used, a culture solution having a higher activity than before can be obtained, so that a large amount of alkaline cellulase necessary for industrial use such as a detergent can be supplied. In the case of producing a certain amount of enzyme, it is possible to reduce the energy required for cultivation, the amount of medium components, the amount of carbon dioxide generated during cultivation, and the amount of waste water by reducing the number of times of cultivation.

配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するセルラーゼのアミノ酸配列を整列させた図である。It is the figure which arranged the amino acid sequence of the cellulase which has 90% or more of homology with the amino acid sequence shown by sequence number 1.

本発明の変異アルカリセルラーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼを変異の対象となるセルラーゼ（以下、「親アルカリセルラーゼ」ともいう）とし、当該配列番号１の上記（ａ）〜（ｐ）位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換してなるものであり、これらは野生型の変異体或いは人為的に変異を施した変異体であってもよい。 The mutant alkaline cellulase of the present invention is a cellulase comprising an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 as a cellulase to be mutated (hereinafter also referred to as “parent alkaline cellulase”), The amino acid residues at the positions (a) to (p) of SEQ ID NO: 1 or the positions corresponding thereto are substituted with other amino acid residues, and these are wild-type mutants or artificially Mutants that have been mutated may also be used.

親アルカリセルラーゼである配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼには、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼ及び当該アミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼが包含され、これらは野生型又は野生型の変異体であってもよく、その性質としては、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法あるいはゲル濾過法により得られる分子量が８６,０００±２，０００であることが好ましく、カルボキシメチルセルロースを基質とした場合の最適反応pHは７．５〜９．５の間にあることが好ましく、最適反応温度が４０〜５０℃の範囲にあることが好ましい。また、カルボキシメチルセルロースのほかにリケナンを良好に分解することが好ましく、pH９で５０℃、１０分間の処理においても充分に安定であることが好ましい。特に好ましくは、分子量が８６，０００±２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥあるいはSephacryl Ｓ２００カラムによるゲル濾過法）、最適反応pHはpH８．６〜９．０、最適反応温度が５０℃、カルボキシメチルセルロースのほかにリケナンを良好に分解し、pH９、５mM塩化カルシウム存在下で５０℃、１０分間の処理を行った場合９５％以上（３０℃、１０分間処理時の残存活性を１００％とする）の残存活性を認めるようなセルラーゼである。 The alkaline cellulase consisting of an amino acid sequence having a homology of 90% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 which is a parent alkaline cellulase includes an alkaline cellulase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and 90% of the amino acid sequence. Alkaline cellulases comprising the above homologous amino acid sequences are included, and these may be wild-type or wild-type mutants, which are characterized by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The molecular weight obtained by the method or gel filtration method is preferably 86,000 ± 2,000, and the optimum reaction pH when carboxymethyl cellulose is used as a substrate is preferably between 7.5 and 9.5, The optimum reaction temperature is preferably in the range of 40-50 ° C. In addition to carboxymethylcellulose, it is preferable to decompose lichenan satisfactorily, and it is preferable that it is sufficiently stable even at treatment at pH 9 at 50 ° C. for 10 minutes. Particularly preferably, the molecular weight is 86,000 ± 2,000 (gel filtration using SDS-PAGE or Sephacryl S200 column), the optimum reaction pH is pH 8.6 to 9.0, the optimum reaction temperature is 50 ° C., in addition to carboxymethylcellulose. When lichenan is decomposed well and treated at 50 ° C. for 10 minutes in the presence of pH 9, 5 mM calcium chloride, the residual activity is 95% or more (remaining activity at 30 ° C. for 10 minutes is defined as 100%). Is a cellulase that recognizes

「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼ」としては、例えばＥｇｌ−２３７［バチルスエスピーＫＳＭ−Ｓ２３７（ＦＥＲＭＢＰ−７８７５）由来、Hakamadaら，Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 2281-2289, 2000］が挙げられる。また、「配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼ」としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列と好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼが挙げられ、例えば、バチルスエスピー１１３９株由来のアルカリセルラーゼ（Ｅｇｌ−１１３９）（Fukumori ら，J. Gen. Microbiol., 132, 2329-2335）（相同性９１．４％）、バチルスエスピーＫＳＭ−６４株由来のアルカリセルラーゼ（Ｅｇｌ−６４）（Sumitomo ら，Biosci. Biotechnol. Biochem., 56, 872-877, 1992）（相同性９１．９％）、バチルスエスピーＫＳＭ−Ｎ１３１株由来のセルラーゼ（Ｅｇｌ−Ｎ１３１ｂ）（特願２０００−４７２３７号）（相同性９５．０％）が挙げられる。
尚、アミノ酸配列の相同性はＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮのマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム（ソフトウェア開発）を用いて計算することができる。 Examples of the “alkaline cellulase comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1” include, for example, Egl-237 [Bacillus sp. KSM-S237 (FERM BP-7875), Hakamada et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 2281-2289 , 2000]. The “alkaline cellulase comprising an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1” is preferably 95% or more, more preferably 98% with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Alkaline cellulase consisting of the amino acid sequence having the above homology is exemplified, for example, alkaline cellulase (Egl-1139) derived from Bacillus sp. 1139 strain (Fukumori et al., J. Gen. Microbiol., 132, 2329-2335) (homology 91.4%), alkaline cellulase (Egl-64) derived from Bacillus sp. KSM-64 (Sumitomo et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 56, 872-877, 1992) (homology 91.9%), Cellulase derived from Bacillus sp. KSM-N131 strain (Egl-N131b) (Japanese Patent Application No. 2000-47237) (homology 95.0%) It is below.
The homology of amino acid sequences can be calculated using programs (software development) such as GENETYX-WIN maximum matching and search homology.

上記配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる親アルカリセルラーゼの（ａ）〜（ｐ）位置におけるアミノ酸残基は、（ａ）１０位：ロイシン、（ｂ）１６位：イソロイシン、（ｃ）２２位：セリン、（ｄ）３３位：アスパラギン、（ｅ）３９位：フェニルアラニン、（ｆ）７６位：イソロイシン、（ｇ）１０９位：メチオニン、（ｈ）２４２位：グルタミン、（ｉ）２６３位：フェニルアラニン、（ｊ）３０８位：スレオニン、（ｋ）４６２位：アスパラギン、（ｌ）４６６位：リジン、（ｍ）４６８位：バリン、（ｎ）５５２位：イソロイシン、（ｏ）５６４位：イソロイシン、（ｐ）６０８位：セリンである。 The amino acid residues at positions (a) to (p) of the parent alkaline cellulase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are (a) 10th position: leucine, (b) 16th position: isoleucine, (c) 22nd position. : Serine, (d) 33rd position: asparagine, (e) 39th position: phenylalanine, (f) 76th position: isoleucine, (g) 109th position: methionine, (h) 242nd position: glutamine, (i) 263rd position: phenylalanine (J) 308 position: threonine, (k) 462 position: asparagine, (l) 466 position: lysine, (m) 468 position: valine, (n) 552 position: isoleucine, (o) 564 position: isoleucine, p) Position 608: Serine.

また、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる親アルカリセルラーゼにおいては、配列番号１の上記（ａ）〜（ｐ）位に相当する位置のアミノ酸残基は、それぞれ（ａ）位：ロイシン、（ｅ）位：フェニルアラニン、（ｆ）位：イソロイシン、（ｈ）位：グルタミン、（ｉ）位：フェニルアラニン、（ｋ）位：アスパラギン、（ｌ）位：リジン、（ｍ）位：バリン、（ｎ）位：イソロイシンであるものが好ましく、更にこれに加えて（ｂ）位：イソロイシン、（ｃ）位：セリンであるものが好ましく、更にこれに加えて（ｄ）位：アスパラギン、（ｇ）位：メチオニン、（ｊ）位：スレオニン、（ｏ）位：イソロイシン、（ｐ）位：セリンであるものが好ましい。 In the parent alkaline cellulase comprising an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, the amino acid residues at positions corresponding to the positions (a) to (p) of SEQ ID NO: 1 (A) position: leucine, (e) position: phenylalanine, (f) position: isoleucine, (h) position: glutamine, (i) position: phenylalanine, (k) position: asparagine, (l) position: Lysine, (m) position: valine, (n) position: isoleucine are preferred, and in addition, (b) position: isoleucine and (c) position: serine are preferred, and in addition to this (D) position: asparagine, (g) position: methionine, (j) position: threonine, (o) position: isoleucine, (p) position: serine are preferred.

従って、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる親アルカリセルラーゼの中で好ましいものとしては、上述した酵素学的性質を有するもの（段落〔００１２〕）及び／又は配列番号１で示されるアミノ酸配列と好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるものであって、更に配列番号１の（ａ）〜（ｐ）位に相当する位置のアミノ酸残基が上記（段落〔００１５〕）のものであるセルラーゼが挙げられ、特に当該酵素学的性質を有し（段落〔００１２〕）、配列番号１に示すアミノ酸配列と好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ配列番号１の（ａ）〜（ｐ）位に相当する位置のアミノ酸残基が上記（段落〔００１５〕）のものであるセルラーゼが好ましい。 Therefore, among the parent alkaline cellulases consisting of an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, those having the enzymatic properties described above (paragraph [0012]) and / Or consisting of an amino acid sequence having preferably 95% or more, more preferably 98% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, further comprising positions (a) to (p) of SEQ ID NO: 1. A cellulase having the amino acid residue at the position corresponding to the above (paragraph [0015]), particularly having the enzymatic properties (paragraph [0012]), preferably the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Consists of an amino acid sequence having a homology of 95% or more, more preferably 98% or more, and an amino acid at a position corresponding to positions (a) to (p) of SEQ ID NO: 1 Cellulase group is of the (paragraph [0015]) are preferred.

そして、本発明の変異アルカリセルラーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるセルラーゼを親アルカリセルラーゼとする場合には、当該（ａ）〜（ｐ）位置のいずれかのアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したものであり、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼ（配列番号１で示されるアルカリセルラーゼを除く）を親アルカリセルラーゼとする場合には、配列番号１の上記（ａ）〜（ｐ）位に相当する位置のいずれかのアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したものである。 And when the cellulase which consists of an amino acid sequence shown by sequence number 1 is used as a parent alkali cellulase, the variation | mutation alkaline cellulase of this invention changes any other amino acid residue of the said (a)-(p) position to another. When a cellulase substituted with an amino acid and comprising an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (excluding the alkaline cellulase represented by SEQ ID NO: 1) is used as a parent alkaline cellulase Is one in which any amino acid residue at a position corresponding to positions (a) to (p) of SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid.

斯かる他のアミノ酸残基としては、（ａ）位置については、グルタミン、アラニン、プロリン又はメチオニン、特にグルタミンであるのが好ましく、（ｂ）位置については、アスパラギン又はアルギニン、特にアスパラギンであるのが好ましく、（ｃ）位置についてはプロリンであるのが好ましく、（ｄ）位置についてはヒスチジンであるのが好ましく、（ｅ）位置については、アラニン、スレオニン又はチロシン、特にアラニンであるのが好ましく、（ｆ）位置については、ヒスチジン、メチオニン、バリン、スレオニン又はアラニン、特にヒスチジンであるのが好ましく、（ｇ）位置については、イソロイシン、ロイシン、セリン又はバリン、特にイソロイシンであるのが好ましく、（ｈ）位置についてアラニン、フェニルアラニン、バリン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、イソロイシン、チロシン、スレオニン、メチオニン又はグリシン、特にアラニン、フェニルアラニン、セリンであるのが好ましく、（ｉ）位置についてはイソロイシン、ロイシン、プロリン又はバリン、特にイソロイシンであるのが好ましく、（ｊ）位置については、アラニン、セリン、グリシン又はバリン、特にアラニンであるのが好ましく、（ｋ）位置については、スレオニン、ロイシン、フェニルアラニン又はアルギニン、特にスレオニンであるのが好ましく、（ｌ）位置については、ロイシン、アラニン又はセリン、特にロイシンであるのが好ましく、（ｍ）位置については、アラニン、アスパラギン酸、グリシン又はリジン、特にアラニンであるのが好ましく、（ｎ）位置については、メチオニンであるのが好ましく、（ｏ）位置については、バリン、スレオニン又はロイシン、特にバリンであるのが好ましく、（ｐ）位置については、イソロイシン又はアルギニン、特にイソロイシンであるのが好ましい。 Such other amino acid residues are preferably glutamine, alanine, proline or methionine, especially glutamine, for position (a), and asparagine or arginine, particularly asparagine, for position (b). Preferably, (c) position is preferably proline, (d) position is preferably histidine, (e) position is preferably alanine, threonine or tyrosine, especially alanine, ( f) for position is preferably histidine, methionine, valine, threonine or alanine, especially histidine, and for position (g) it is preferably isoleucine, leucine, serine or valine, especially isoleucine, (h) Alanine, phenylalanine, va , Serine, aspartic acid, glutamic acid, leucine, isoleucine, tyrosine, threonine, methionine or glycine, particularly alanine, phenylalanine, serine. (I) The position is isoleucine, leucine, proline or valine, especially isoleucine. Preferably for (j) position it is alanine, serine, glycine or valine, especially alanine, and for (k) position is preferably threonine, leucine, phenylalanine or arginine, especially threonine. , (L) position is preferably leucine, alanine or serine, especially leucine, and (m) position is preferably alanine, aspartic acid, glycine or lysine, especially alanine, (n) position. For is preferably methionine, for (o) position, valine, threonine or leucine, preferably from particularly valine, for (p) position, isoleucine or arginine, particularly preferably isoleucine.

また、「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アルカリセルラーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えることにより行うことができる。セルラーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各セルラーゼにおける配列中の位置を決めることが可能である（図１）。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象のセルラーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。 In addition, as a method of specifying “corresponding amino acid residue”, for example, amino acid sequences are compared using a known algorithm such as the Lippmann-Person method, and conserved amino acid residues present in the amino acid sequences of the respective alkaline cellulases. This can be done by giving the group maximum homology. By aligning the amino acid sequences of cellulases in this way, it is possible to determine the positions of homologous amino acid residues in each cellulase sequence regardless of insertions or deletions in the amino acid sequences (FIG. 1). ). The homologous position is considered to exist at the same position in the three-dimensional structure, and it can be presumed that the homologous position has a similar effect on the specific function of the subject cellulase.

配列番号１に示すアルカリセルラーゼ（Ｅｇｌ−２３７）の（ａ）１０位、（ｂ）１６位、（ｃ）２２位、（ｄ）３３位、（ｅ）３９位、（ｆ）７６位、（ｇ）１０９位、（ｈ）２４２位、（ｉ）２６３位、（ｊ）３０８位、（ｋ）４６２位、（ｌ）４６６位、（ｍ）４６８位、（ｎ）５５２位、（ｏ）５６４位、（ｐ）６０８位に相当する位置及びアミノ酸番号の具体例を配列番号１と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる他のアルカリセルラーゼについて示す。 (A) position 10, (b) position 16, (c) position 22, (d) position 33, (e) position 39, (f) position 76, (f) position 76 of the alkaline cellulase (Egl-237) shown in SEQ ID NO: 1 g) 109th, (h) 242, (i) 263, (j) 308, (k) 462, (l) 466, (m) 468, (n) 552, (o) Specific examples of the position corresponding to position 564 and (p) position 608 and the amino acid number are shown for another alkaline cellulase comprising an amino acid sequence having 90% or more homology with SEQ ID NO: 1.

斯かるアミノ酸残基の置換は、酵素活性及び酵素特性が変化しない限り２個所以上が同時になされていてもよい。２個所以上が同時になされた場合の好ましい具体例を以下に示す。尚、以下の表記ではアミノ酸を３文字表記とし、「＋」は一ヶ所の置換に対し付加された置換を表し、「／」については表記したいずれのアミノ酸を使用しても良いことを示している。 Such amino acid residue substitutions may be made at two or more sites at the same time as long as the enzyme activity and the enzyme properties do not change. Preferred specific examples in the case where two or more places are made simultaneously are shown below. In the following notation, amino acids are represented by three letters, “+” indicates a substitution added to one substitution, and “/” indicates that any amino acid described may be used. Yes.

例えば、２重置換体の例としては、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）、Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ、Ａｓｎ３３Ｈｉｓ＋Ｐｈｅ３９（Ｔｈｒ／Ｔｙｒ／Ａｌａ）、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｇｌｎ２４２（Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ａｓｐ／Ｇｌｕ／Ｇｌｙ）、Ｉｌｅ１６（Ａｒｇ／Ａｓｎ）＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｇｌｕ／Ａｓｐ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｙｒ）、Ｇｌｎ２４２（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｇｌｕ／Ａｓｐ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｙｒ）＋Ｐｈｅ２６３（Ｉｌｅ／Ｌｅｕ／Ｐｒｏ／Ｖａｌ）、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｔｈｒ３０８（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｇｌｙ／Ｖａｌ）、Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ａｓｎ４６２（Ｔｈｒ／Ｌｅｕ／Ｐｈｅ／Ａｒｇ）、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｖａｌ４６８（Ａｌａ／Ａｓｐ／Ｇｌｙ／Ｌｙｓ）、Ａｓｎ３３Ｈｉｓ＋Ｉｌｅ５５２Ｍｅｔ、Ａｓｎ３３ＨｉｓＩｌｅ５６４（Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ）、Ｇｌｎ２４２（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｇｌｕ／Ａｓｐ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｙｒ）＋Ｓｅｒ６０８（Ｉｌｅ／Ａｒｇ）等が好ましく、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ、Ａｓｎ３３Ｈｉｓ＋Ｐｈｅ３９Ａｌａ、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ａｌａ、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｐｈｅ、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒが特に好ましい。 For example, examples of the double substitution include Leu10 (Gln / Ala / Pro / Met) + Ile16 (Asn / Arg), Ile16 (Asn / Arg) + Ser22Pro, Leu10 (Gln / Ala / Pro / Met) + Ser22Pro, Asn33His + Phe39 ( Thr / Tyr / Ala), Leu10 (Gln / Ala / Pro / Met) + Gln242 (Ser / Ala / Phe / Val / Asp / Glu / Gly), Ile16 (Arg / Asn) + Ser22Pro, Ser22Pro + Gln242 (Ala / Ser / Phe / Val / Ile / Gly / Glu / Asp / Thr / Leu / Met / Tyr), Gln242 (Ala / Ser / Phe / Val / Ile / Gly / Glu / Asp / Thr / Leu / M et / Tyr) + Phe263 (Ile / Leu / Pro / Val), Leu10 (Gln / Ala / Pro / Met) + Thr308 (Ala / Ser / Gly / Val), Ile16 (Asn / Arg) + Asn462 (Thr / Leu / Phe / Arg), Ser22Pro + Val468 (Ala / Asp / Gly / Lys), Asn33His + Ile552Met, Asn33HisIle564 (Val / Thr / Leu), Gln242 (Ala / Ser / Phe / Val / Ile / Tlu / Glu / Tlu / Glu / Tlu / Glu / Tlu / Glu / Tlu / Gr / T / A ) + Ser608 (Ile / Arg) and the like, Leu10Gln + Ser22Pro, Asn33His + Phe39Ala, Ser22Pro + Gln242Ala, Se 22Pro + Gln242Phe, Ser22Pro + Gln242Ser is particularly preferred.

３重置換体の例としては、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｇｌｕ／Ａｓｐ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｙｒ）、Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｇｌｕ／Ａｓｐ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｙｒ）、Ｉｌｅ７６（Ｈｉｓ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ａｌａ）＋Ｇｌｎ２４２（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｇｌｕ／Ａｓｐ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｙｒ）＋Ｌｙｓ４６６（Ｌｅｕ／Ａｌａ／Ｓｅｒ）等が好ましく、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ａｌａ、Ｉｌｅ１６Ａｓｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ、Ｉｌｅ１６Ａｓｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｐｈｅが特に好ましい。 Examples of triple substitutions include Leu10 (Gln / Ala / Pro / Met) + Ser22Pro + Gln242 (Ala / Ser / Phe / Val / Ile / Gly / Glu / Asp / Thr / Leu / Met / Tyr), Ile16 (Asn / Arg) + Ser22Pro + Gln242 (Ala / Ser / Phe / Val / Ile / Gly / Glu / Asp / Thr / Leu / Met / Tyr), Ile76 (His / Met / Val / Thr / Ala) + Gln242 (Ala / Ser / Phe / Val) / Ile / Gly / Glu / Asp / Thr / Leu / Met / Tyr) + Lys466 (Leu / Ala / Ser) and the like, Leu10Gln + Ser22Pro + Gln242Ala, Ile16Asn + Ser22Pr + Gln242Ser, is Ile16Asn + Ser22Pro + Gln242Phe particularly preferred.

４重置換体の例としては、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｉｌｅ７６（Ｈｉｓ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ａｌａ）＋Ｌｙｓ４６６（Ｌｅｕ／Ａｌａ／Ｓｅｒ）、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ｉｌｅ７６（Ｈｉｓ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ａｌａ）＋Ｌｙｓ４６６（Ｌｅｕ／Ａｌａ／Ｓｅｒ）、Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ｍｅｔ１０９（Ｉｌｅ／Ｌｅｕ／Ｓｅｒ／Ｖａｌ）＋Ｇｌｎ２４２（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｇｌｕ／Ａｓｐ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｙｒ）＋Ｉｌｅ５６４（Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ）等が好ましく、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ＋Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕ、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ａｌａ＋Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕ、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕが特に好ましい。 Examples of quadruple substitutes include Leu10 (Gln / Ala / Pro / Met) + Ser22Pro + Ile76 (His / Met / Val / Thr / Ala) + Lys466 (Leu / Ala / Ser), Leu10 (Gln / Ala / Pro / Met) + Ile16 (Asn / Arg) + Ile76 (His / Met / Val / Thr / Ala) + Lys466 (Leu / Ala / Ser), Ile16 (Asn / Arg) + Met109 (Ile / Leu / Ser / Val) + Gln242 (Ala / Ser / Phe) / Val / Ile / Gly / Glu / Asp / Thr / Leu / Met / Tyr) + Ile564 (Val / Thr / Leu) and the like are preferred, Leu10Gln + Ser22Pro + Ile76His + Lys466Leu Leu10Gln + Ser22Pro + Gln242Ala + Lys466Leu, Leu10Gln + Ser22Pro + Gln242Ser + Lys466Leu is particularly preferred.

５重置換体の例としては、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｉｌｅ７６（Ｈｉｓ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ａｌａ）＋Ｌｙｓ４６６（Ｌｅｕ／Ａｌａ／Ｓｅｒ）、Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ｇｌｎ２４２（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｇｌｙ／Ｇｌｕ／Ａｓｐ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｙｒ）＋Ｔｈｒ３０８（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｇｌｙ／Ｖａｌ）＋Ｉｌｅ５５２Ｍｅｔ＋Ｓｅｒ６０８（Ｉｌｅ／Ａｒｇ）等が好ましく、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｉｌｅ１６Ａｓｎ＋Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕ、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｉｌｅ１６Ａｓｎ＋Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ＋Ｇｌｎ２４２Ａｌａ＋Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕが特に好ましい。
また、更にそれ以上の多重置換、例えば６〜１６置換体でもよい。 Examples of quintuple substitutions include Leu10 (Gln / Ala / Pro / Met) + Ile16 (Asn / Arg) + Ser22Pro + Ile76 (His / Met / Val / Thr / Ala) + Lys466 (Leu / Ala / Ser), Ile16 (Asn / Arg) + Gln242 (Ala / Ser / Phe / Val / Ile / Gly / Glu / Asp / Thr / Leu / Met / Tyr) + Thr308 (Ala / Ser / Gly / Val) + Ile552Met + Ser608 (Ile / Sle), n + Iu16 + Ile552Met + Lu10G Leu10Gln + Ile16Asn + Ile76His + Gln242Ala + Lys466Leu is particularly preferred
Further, further multiple substitutions such as 6 to 16 substitutions may be used.

また、本発明の変異アルカリセルラーゼには、上記（ａ）〜（ｐ）位置に相当する位置のいずれかのアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したもののみならず、アルカリセルラーゼ活性を失わない限り、該アミノ酸配列中の他の位置において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたものも包含する。 The mutant alkaline cellulase of the present invention includes not only those obtained by substituting any of the amino acid residues at positions corresponding to the positions (a) to (p) with other amino acids, but also not losing alkaline cellulase activity. Also included are those in which one to several amino acid residues are deleted, substituted or added at other positions in the amino acid sequence.

本発明の変異アルカリセルラーゼは、例えば以下の方法により得ることができる。
すなわち、クローニングされた親アルカリセルラーゼ（例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリセルラーゼ）をコードする遺伝子（配列番号２）に対して置換（以下、「変異」ともいう）を施し、得られた変異遺伝子を用いて適当な宿主を形質転換し、当該組換え宿主を培養し、培養物から採取することにより得られる。 The mutant alkaline cellulase of the present invention can be obtained, for example, by the following method.
That is, it is obtained by performing substitution (hereinafter also referred to as “mutation”) on a gene (SEQ ID NO: 2) encoding a cloned parent alkaline cellulase (for example, alkaline cellulase having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1). It is obtained by transforming a suitable host using the mutated gene, culturing the recombinant host, and collecting from the culture.

親アルカリセルラーゼをコードする遺伝子のクローニングは、一般的な遺伝子組換え技術を用いればよく、例えばＢａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７の染色体より、ショットガン法やＰＣＲ法により取得できる。 The gene encoding the parent alkaline cellulase may be cloned by using a general gene recombination technique, for example, Bacillus sp. It can be obtained from the KSM-S237 chromosome by the shotgun method or PCR method.

親アルカリセルラーゼをコードする遺伝子の変異手段としては、一般的に行われているランダム変異や部異特異的変異の方法がいずれも採用できる。より具体的には、例えばのSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Kmキット(Ｔａｋａｒａ)等を用いて行うことができる。また、リコンビナントＰＣＲ（polymerase chain reaction）法（PCR protocols, Academic press, New York, 1990）を用いることによって、遺伝子の任意の配列を他の遺伝子の該任意の配列に相当する配列と置換することが可能である。 As a means for mutating a gene encoding a parent alkaline cellulase, any of the commonly used methods of random mutation and part-specific mutation can be employed. More specifically, it can be performed using, for example, the Site-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Km kit (Takara). In addition, by using a recombinant PCR (polymerase chain reaction) method (PCR protocols, Academic Press, New York, 1990), an arbitrary sequence of a gene can be replaced with a sequence corresponding to the arbitrary sequence of another gene. Is possible.

得られた変異遺伝子を用いた本発明変異アルカリセルラーゼの生産は、宿主菌体内で複製維持が可能であり、該酵素を安定に発現させることができ、該遺伝子を安定に保持できるベクターに当該遺伝子を組込み、得られた組換えベクターを用いて宿主菌を形質転換することにより行えばよい。 Production of the mutated alkaline cellulase of the present invention using the obtained mutant gene is capable of maintaining replication in the host cell body, can stably express the enzyme, and the gene can be stably stored in the vector. May be carried out by transforming a host bacterium using the obtained recombinant vector.

斯かるベクターとしては大腸菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト本社製）等が挙げられ、枯草菌を宿主にする場合、ｐＵＢ１１０、ｐＨＳＰ６４（Sumitomoら、 Biosci. Biotechnol,Biocem., 59, 2172-2175, 1995）あるいはｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。 Examples of such vectors include pUC18, pBR322, pHY300PLK (manufactured by Yakult Honsha), etc. when Escherichia coli is used as a host, and pUB110, pHSP64 (Sumitomo et al., Biosci. Biotechnol, Biocem., 59) when Bacillus subtilis is used as a host. , 2172-2175, 1995) or pHY300PLK.

宿主菌を形質転換するには、プロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等を用いればよく、宿主菌としては、例えばバチルス属（枯草菌）等のグラム陽性菌、大腸菌等のグラム陰性菌、ストレプトマイセス属等の放線菌、サッカロマイセス属等の酵母あるいはアスペルギルス属等のカビが挙げられる。 In order to transform a host bacterium, a protoplast method, a competent cell method, an electroporation method or the like may be used. Examples of the host bacterium include Gram-positive bacteria such as Bacillus (Bacillus subtilis), and Gram-negative such as Escherichia coli. Examples include fungi, actinomycetes such as Streptomyces, yeasts such as Saccharomyces, and molds such as Aspergillus.

得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよく、得られた培養液から、一般的な方法によって酵素の分取や精製を行い、凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化により必要な酵素形態を得ることができる。 The obtained transformant may be cultured under appropriate conditions using a medium containing an assimilating carbon source, nitrogen source, metal salt, vitamins, etc. The required enzyme form can be obtained by fractionating and purifying the enzyme and freeze-drying, spray-drying, and crystallization.

かくして得られる本発明の変異アルカリセルラーゼは、親アルカリセルラーゼの性質を保持しつつ、且つ形質転換体での酵素の分泌能が向上している、あるいは酵素自体の比活性の向上をもたらすものである。 The mutant alkaline cellulase of the present invention thus obtained retains the properties of the parent alkaline cellulase and improves the secretory ability of the enzyme in the transformant, or improves the specific activity of the enzyme itself. .

ここで酵素の「分泌の向上」とは、親アルカリセルラーゼと同一の条件下において（例えば３％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ（日本製薬製）、０．５％魚肉エキス（和光純薬製）、０．０５％酵母エキス、０．１％リン酸１カリウム、０．０２％硫酸マグネシウム７水塩、テトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ）及び５％マルトースを含んだ培地（ＰＳＭ培地）を用いて、３０℃で７２時間振とう培養する）生産した変異アルカリセルラーゼについて培養上清中の酵素活性量、タンパク質量を測定した場合、親アルカリセルラーゼのそれに対し、一定量以上の活性量、タンパク質量を示すこと、例えば親アルカリセルラーゼの５％以上、望ましくは１０％以上、さらに望ましくは２０％以上の活性量またはタンパク質量の増大が認められるものとすることができる。
特に、比活性などの変化が認められなければ活性量とタンパク量の比は親アルカリセルラーゼと変異アルカリセルラーゼでは一定の値をとると考えられることから、活性量またはタンパク質量のどちらか一方を測定しても構わない。 Here, “enhancement of secretion” of the enzyme means that under the same conditions as the parent alkaline cellulase (for example, 3% (w / v) polypeptone S (manufactured by Nippon Pharmaceutical), 0.5% fish meat extract (manufactured by Wako Pure Chemical Industries)) , 0.05% yeast extract, 0.1% monopotassium phosphate, 0.02% magnesium sulfate heptahydrate, tetracycline (15 μg / mL) and 5% maltose-containing medium (PSM medium), 30 Incubate with shaking at 72 ° C for 72 hours) When measuring the amount of enzyme activity and protein in the culture supernatant of the mutant alkaline cellulase produced, indicate the amount of activity and protein above a certain level compared to that of the parent alkaline cellulase. For example, an increase in the active amount or protein amount of 5% or more, desirably 10% or more, more desirably 20% or more of the parent alkaline cellulase is observed. Rukoto can.
In particular, if there is no change in specific activity, the ratio between the amount of activity and the amount of protein is considered to be a constant value for the parent alkali cellulase and the mutant alkali cellulase, so either the amount of activity or the amount of protein is measured. It doesn't matter.

従って、本発明の変異アルカリセルラーゼは、各種洗剤組成物配合用酵素として有用である。
洗浄剤組成物中への本発明変異アルカリセルラーゼの配合量は、当該セルラーゼが活性を示す量であれば特に制限されないが、洗浄剤組成物あたり、０．０００１〜５質量％であるのが好ましく、０．００００５〜２．５質量％がより好ましく、０．００１〜２質量％が更に好ましい。また、酵素造粒物として用いる場合の造粒物中での含有量は、０．０１〜５０質量％であるのが好ましく、０．０５〜２５質量％がより好ましく、０．１〜２０質量％が更に好ましい。 Therefore, the mutant alkaline cellulase of the present invention is useful as an enzyme for blending various detergent compositions.
The blending amount of the mutant alkaline cellulase of the present invention in the cleaning composition is not particularly limited as long as the cellulase exhibits an activity, but is preferably 0.0001 to 5% by mass per cleaning composition. 0.00005 to 2.5 mass% is more preferable, and 0.001 to 2 mass% is still more preferable. Further, the content in the granulated product when used as an enzyme granulated product is preferably 0.01 to 50% by mass, more preferably 0.05 to 25% by mass, and 0.1 to 20% by mass. % Is more preferable.

本発明の洗浄剤組成物は、上記アルカリセルラーゼ（造粒物）の他に、界面活性剤及びビルダーを含有するのが好ましい。界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤及び陽イオン性界面活性剤の１種又は組み合わせを挙げることができるが、好ましくは陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤である。 The cleaning composition of the present invention preferably contains a surfactant and a builder in addition to the alkali cellulase (granulated product). Examples of the surfactant include one or a combination of an anionic surfactant, a nonionic surfactant, an amphoteric surfactant and a cationic surfactant. Preferably, the anionic surfactant is used. Agent, nonionic surfactant.

陰イオン性界面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルコールの硫酸エステル塩、炭素数８〜２０のアルコールのアルコキシル化物の硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、パラフィンスルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩、α−スルホ脂肪酸アルキルエステル塩又は脂肪酸塩が好ましい。本発明では特に、アルキル鎖の炭素数が１０〜１４、より好ましくは１２〜１４の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩が好ましい。これらの塩の対イオンとしては、アルカリ金属塩やアミン類が好ましく、特にナトリウム及び／又はカリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。 Examples of the anionic surfactant include a sulfate ester salt of an alcohol having 10 to 18 carbon atoms, a sulfate ester salt of an alkoxylate of an alcohol having 8 to 20 carbon atoms, an alkylbenzene sulfonate, an alkyl sulfate ester salt, and a paraffin sulfonate. , Α-olefin sulfonate, α-sulfo fatty acid salt, α-sulfo fatty acid alkyl ester salt or fatty acid salt are preferred. In the present invention, a linear alkyl benzene sulfonate having an alkyl chain having 10 to 14 carbon atoms, more preferably 12 to 14 carbon atoms is particularly preferable. As a counter ion of these salts, alkali metal salts and amines are preferable, and sodium and / or potassium, monoethanolamine, and diethanolamine are particularly preferable.

非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）エーテル、アルキルポリグリコシド、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシアルキレングリコール脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマーが好ましい。特に、非イオン性界面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルコールにエチレンオキシドやプロピレンオキシド等のアルキレンオキシドを４〜２０モル付加した〔ＨＬＢ値（グリフィン法で算出）が１０．５〜１５．０、好ましくは１１．０〜１４．５であるような〕ポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。 Nonionic surfactants include polyoxyalkylene alkyl (carbon number 8-20) ether, alkyl polyglycoside, polyoxyalkylene alkyl (carbon number 8-20) phenyl ether, polyoxyalkylene sorbitan fatty acid (carbon number 8-8). 22) Ester, polyoxyalkylene glycol fatty acid (carbon number 8 to 22) ester, and polyoxyethylene polyoxypropylene block polymer are preferable. In particular, as a nonionic surfactant, 4 to 20 moles of alkylene oxide such as ethylene oxide or propylene oxide is added to an alcohol having 10 to 18 carbon atoms [HLB value (calculated by Griffin method) is 10.5 to 15. 0, preferably from 11.0 to 14.5] polyoxyalkylene alkyl ethers are preferred.

界面活性剤の合計量は、洗浄力及び溶解性の点から、洗浄剤組成物中１０〜６０質量％であるのが好ましく、１５〜５０質量％がより好ましく、２０〜４５質量％が更に好ましい。
陰イオン性界面活性剤は、特に粉末洗浄剤組成物中１〜６０質量％であるのが好ましく、１〜５０質量％がより好ましく、３〜４０質量％が特に好ましい。
非イオン性界面活性剤は、特に粉末洗浄剤組成物中０．５〜４５質量％であるのが好ましく、１〜３５質量％がより好ましく、３〜２５質量％が特に好ましい。 The total amount of the surfactant is preferably 10 to 60% by mass, more preferably 15 to 50% by mass, and still more preferably 20 to 45% by mass in the cleaning composition from the viewpoint of detergency and solubility. .
The anionic surfactant is particularly preferably 1 to 60% by mass, more preferably 1 to 50% by mass, and particularly preferably 3 to 40% by mass in the powder detergent composition.
The nonionic surfactant is particularly preferably 0.5 to 45% by mass in the powder detergent composition, more preferably 1 to 35% by mass, and particularly preferably 3 to 25% by mass.

陰イオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤は、単独で用いることもできるが、好ましくは混合して用いるのが良い。また、両性界面活性剤や陽イオン性界面活性剤を目的に合わせ併用することもできる。 The anionic surfactant and the nonionic surfactant can be used alone, but preferably mixed and used. Further, amphoteric surfactants and cationic surfactants can be used in combination for the purpose.

ビルダーとしては、そのもの自身では洗浄力がないか、又はあってもそれ程著しくないが、洗浄剤組成物に配合されると著しく洗浄性能を向上させ、特に洗浄剤の主要成分である界面活性剤の洗浄能力を向上させるものが挙げられ、作用として、多価金属陽イオンの捕捉作用、汚れ分散作用及びアルカリ緩衝作用の少なくとも１つの作用を有するものである。
斯かるビルダーとしては、例えば水溶性無機化合物、水不溶性無機化合物、有機化合物等が挙げられる。 As a builder, there is no detergency by itself, or it is not so remarkably present, but when it is incorporated into a detergent composition, it significantly improves the detergency, and especially the surfactant that is the main component of the detergent. What improves the cleaning ability is mentioned, and the action has at least one of the action of capturing a polyvalent metal cation, the action of dispersing dirt, and the action of alkaline buffering.
Examples of such a builder include a water-soluble inorganic compound, a water-insoluble inorganic compound, and an organic compound.

水溶性無機化合物としては、リン酸塩（トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、メタリン酸塩、リン酸三ナトリウム等）、ケイ酸塩、炭酸塩、硫酸塩等が挙げられる。中でも３つの作用を全て有する点でリン酸塩が好ましい。 Examples of the water-soluble inorganic compound include phosphates (tripolyphosphate, pyrophosphate, metaphosphate, trisodium phosphate, etc.), silicates, carbonates, sulfates, and the like. Among these, phosphate is preferable because it has all three functions.

水不溶性無機化合物としては、アルミノケイ酸塩（Ａ型ゼオライト、Ｐ型ゼオライト、Ｘ型ゼオライト、非晶質アルミノケイ酸塩等）、結晶性ケイ酸塩等が挙げられる。中でも粒子径３μｍ以下（より好ましくは１μｍ以下）のＡ型ゼオライトが好ましい。 Examples of the water-insoluble inorganic compound include aluminosilicate (A-type zeolite, P-type zeolite, X-type zeolite, amorphous aluminosilicate, etc.), crystalline silicate, and the like. Among these, A-type zeolite having a particle size of 3 μm or less (more preferably 1 μm or less) is preferable.

有機化合物としては、カルボン酸塩（アミノカルボン酸塩、ヒドロキシアミノカルボン酸塩、ヒドロキシカルボン酸塩、シクロカルボン酸塩、マレイン酸誘導体、シュウ酸塩等）、有機カルボン酸（塩）ポリマー（アクリル酸重合体及び共重合体、多価カルボン酸重合体及び共重合体、グリオキシル酸重合体、多糖類及びこれらの塩等）等が挙げられる。中でも有機カルボン酸（塩）ポリマーが好ましい。 Organic compounds include carboxylates (aminocarboxylates, hydroxyaminocarboxylates, hydroxycarboxylates, cyclocarboxylates, maleic acid derivatives, oxalates, etc.), organic carboxylic acid (salt) polymers (acrylic acid) Polymer and copolymer, polyvalent carboxylic acid polymer and copolymer, glyoxylic acid polymer, polysaccharides and salts thereof, and the like. Of these, organic carboxylic acid (salt) polymers are preferred.

前記ビルダーの塩において、対イオンとしては、アルカリ金属塩、アミン類が好ましく、特にナトリウム及び／又はカリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。 In the builder salt, the counter ion is preferably an alkali metal salt or an amine, and particularly preferably sodium and / or potassium, monoethanolamine, or diethanolamine.

これらのビルダーは、単独で又は２種以上を併用することができるが、水溶性無機化合物を含有するのが好ましく、水溶性無機化合物及び有機化合物を併用するのがより好ましく、水溶性無機化合物、有機化合物及び水不溶性無機化合物を併用するのが更に好ましい。 These builders can be used alone or in combination of two or more, but preferably contain a water-soluble inorganic compound, more preferably use a water-soluble inorganic compound and an organic compound in combination, a water-soluble inorganic compound, It is more preferable to use an organic compound and a water-insoluble inorganic compound in combination.

ビルダーの合計量は、洗浄性能の点から、洗浄剤組成物中２０〜８０質量％であるのが好ましく、３０〜７０質量％がより好ましく、３５〜６０質量％が更に好ましい。
また、水溶性無機化合物ビルダーは、特に粉末洗浄剤組成物中１０〜５０質量％であるのが好ましく、１５〜４５質量％がより好ましく、２０〜４０質量％が更に好ましい。
水不溶性無機化合物ビルダーは、特に粉末洗浄剤組成物中５〜５０質量％であるのが好ましく、１０〜４５質量％がより好ましく、１５〜４０質量％が更に好ましい。
有機化合物ビルダーは、特に粉末洗浄剤組成物中０．１〜２０質量％であるのが好ましく、０．３〜１５質量％がより好ましく、０．５〜１０質量％が更に好ましい。 The total amount of the builder is preferably 20 to 80% by mass, more preferably 30 to 70% by mass, and still more preferably 35 to 60% by mass in the cleaning composition from the viewpoint of cleaning performance.
The water-soluble inorganic compound builder is particularly preferably 10 to 50% by mass in the powder detergent composition, more preferably 15 to 45% by mass, and still more preferably 20 to 40% by mass.
The water-insoluble inorganic compound builder is preferably 5 to 50% by mass, more preferably 10 to 45% by mass, and still more preferably 15 to 40% by mass in the powder cleaning composition.
In particular, the organic compound builder is preferably 0.1 to 20% by mass, more preferably 0.3 to 15% by mass, and still more preferably 0.5 to 10% by mass in the powder detergent composition.

本発明の洗浄剤組成物には、上記成分の他に、漂白剤（過炭酸塩、過ホウ酸塩、漂白活性化剤等）、再汚染防止剤（カルボキシメチルセルロース等）、柔軟化剤（ジアルキル型第四級アンモニウム塩、粘土鉱物等）、還元剤（亜硫酸塩等）、蛍光増白剤（ビフェニル型、アミノスチルベン型等）、泡コントロール剤（シリコーン等）、香料等の添加剤を含有させることができる。 In addition to the above components, the cleaning composition of the present invention includes a bleaching agent (percarbonate, perborate, bleach activator, etc.), a recontamination inhibitor (carboxymethylcellulose, etc.), a softening agent (dialkyl). Type quaternary ammonium salts, clay minerals, etc.), reducing agents (sulfites, etc.), fluorescent brighteners (biphenyl type, aminostilbene type, etc.), foam control agents (silicone, etc.), and additives such as fragrances. be able to.

また、本発明の洗浄剤組成物には、本発明のアルカリセルラーゼ以外に様々な酵素を併用することもできる。例えば、加水分解酵素、酸化酵素、還元酵素、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、シンテターゼ等である。このうち、本発明以外のセルラーゼ、プロテアーゼ、ケラチナーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、グルコシダーゼ、グルカナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ等が好ましく、特にプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼが好ましい。 In addition to the alkaline cellulase of the present invention, various enzymes can be used in combination with the cleaning composition of the present invention. For example, hydrolase, oxidase, reductase, transferase, lyase, isomerase, ligase, synthetase and the like. Among these, cellulases other than the present invention, protease, keratinase, esterase, cutinase, amylase, lipase, pullulanase, pectinase, mannanase, glucosidase, glucanase, cholesterol oxidase, peroxidase, laccase, etc. are preferable, and protease, cellulase, amylase, lipase are particularly preferable. preferable.

本発明の洗浄剤組成物は、上記方法で得られた本発明変異アルカリセルラーゼ及び上記公知の洗浄成分を組み合わせて常法に従い製造することができる。洗剤の形態は用途に応じて選択することができ、例えば液体、粉体、顆粒、ペースト、固形等にすることができる。
かくして得られる本洗浄剤組成物は、衣料用粉末洗浄剤、衣料用液体洗浄剤、自動食器洗浄機用洗剤、木綿繊維改質用洗浄剤等として使用することができる。 The detergent composition of the present invention can be produced according to a conventional method by combining the mutant alkaline cellulase of the present invention obtained by the above method and the above-mentioned known cleaning components. The form of the detergent can be selected depending on the application, and for example, it can be liquid, powder, granule, paste, solid and the like.
The present detergent composition thus obtained can be used as a powder detergent for clothing, a liquid detergent for clothing, a detergent for automatic dishwashers, a detergent for modifying cotton fibers, and the like.

実施例１アルカリセルラーゼ遺伝子の変異体作製
アルカリセルラーゼの生産量を向上させる変異体取得のため、先ずアルカリセルラーゼ遺伝子領域内の変異ＰＣＲ法によるランダム変異を行い、変異体のライブラリーを構築した。得られた変異体の中からアルカリセルラーゼの生産量向上に有効な変異体を選別し、変異箇所を塩基配列解析で決定した後、混合プライマーを用いて変異箇所のランダム変異及び部位特異的変異により多重変異体を構築して生産量の向上を試みた。鋳型ＤＮＡとして大腸菌−枯草菌のシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ中に組換えられたＢａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子を用いた。 Example 1 Preparation of Mutants for Alkaline Cellulase Gene In order to obtain mutants that improve the yield of alkaline cellulase, random mutation was first carried out by mutation PCR in the alkaline cellulase gene region to construct a library of mutants. From the obtained mutants, mutants that are effective in improving the production of alkaline cellulase are selected and the mutation sites are determined by nucleotide sequence analysis, and then mixed mutations are used to perform random mutations and site-specific mutations. We attempted to improve the production by constructing multiple mutants. Bacillus sp. Recombined into E. coli-Bacillus subtilis shuttle vector pHY300PLK as template DNA. The alkaline cellulase gene derived from KSM-S237 strain was used.

ランダム変異の混合プライマーには、Ｉｌｅ１６Ｘ（プライマー１、配列番号３、Ｘは他のアミノ酸）、Ｐｈｅ３９Ｘ（プライマー２、配列番号４）、Ｉｌｅ７６Ｘ（プライマー３、配列番号５）、Ｍｅｔ１０９Ｘ（プライマー４、配列番号６）、Ｐｈｅ２６３Ｘ（プライマー５、配列番号７）、Ｔｈｒ３０８Ｘ（プライマー６、配列番号８）、Ａｓｎ４６２Ｘ（プライマー７、配列番号９）、Ｌｙｓ４６６Ｘ（プライマー８、配列番号１０）、Ｖａｌ４６８Ｘ（プライマー９、配列番号１１）、Ｉｌｅ５５２Ｘ（プライマー１０、配列番号１２）、Ｉｌｅ５６４Ｘ（プライマー１１、配列番号１３）及びＳｅｒ６０８Ｘ（プライマー１２、配列番号１４）を用いた。 For mixed primers of random mutation, Ile16X (primer 1, SEQ ID NO: 3, X is other amino acid), Phe39X (primer 2, SEQ ID NO: 4), Ile76X (primer 3, SEQ ID NO: 5), Met109X (primer 4, sequence) No. 6), Phe263X (primer 5, SEQ ID NO: 7), Thr308X (primer 6, SEQ ID NO: 8), Asn462X (primer 7, SEQ ID NO: 9), Lys466X (primer 8, SEQ ID NO: 10), Val468X (primer 9, sequence) No. 11), Ile552X (primer 10, SEQ ID NO: 12), Ile564X (primer 11, SEQ ID NO: 13) and Ser608X (primer 12, SEQ ID NO: 14) were used.

また、部位特異的変異Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ、Ａｓｎ３３Ｈｉｓ、Ｐｈｅ３９Ａｌａ、Ｍｅｔ１０９Ｉｌｅ、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２４２Ａｌａ、Ｇｌｎ２４２Ｐｈｅ、Ｇｌｎ２４２Ｖａｌ、Ｇｌｎ２４２Ａｓｐ、Ｇｌｎ２４２Ｇｌｕ、Ｇｌｎ２４２Ｇｌｙ、Ｇｌｎ２４２Ｉｌｅ、Ｇｌｎ２４２Ｌｅｕ、Ｇｌｎ２４２Ｍｅｔ、Ｇｌｎ２４２Ｔｙｒ、Ｐｈｅ２６３Ｉｌｅ、Ｔｈｒ３０８Ａｌａ及びＩｌｅ５５２Ｍｅｔを導入する為の変異導入用プライマーＬｅｕ１０Ｇｌｎ（プライマー１３、配列番号１５）、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ（プライマー１４、配列番号１６）、Ａｓｎ３３Ｈｉｓ（プライマー１５、配列番号１７）、Ｐｈｅ３９Ａｌａ（プライマー１６、配列番号１８）、Ｍｅｔ１０９Ｉｌｅ（プライマー１７、配列番号１９）、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ（プライマー１８、配列番号２０）、Ｇｌｎ２４２Ａｌａ（プライマー１９、配列番号２１）、Ｇｌｎ２４２Ｐｈｅ（プライマー２０、配列番号２２）、Ｇｌｎ２４２Ｖａｌ（プライマー２１、配列番号２３）、Ｇｌｎ２４２Ａｓｐ（プライマー２２、配列番号２４）又はＧｌｎ２４２Ｇｌｕ（プライマー２２、配列番号２４）、Ｇｌｎ２４２Ｇｌｙ（プライマー２３、配列番号２５）、Ｇｌｎ２４２Ｉｌｅ（プライマー２０、配列番号２２）、Ｇｌｎ２４２Ｔｈｒ（プライマー２４、配列番号２６）、Ｇｌｎ２４２Ｌｅｕ（プライマー２５、配列番号２７）、Ｇｌｎ２４２Ｍｅｔ（プライマー２６、配列番号２８）、Ｇｌｎ２４２Ｔｙｒ（プライマー２７、配列番号２９）、Ｐｈｅ２６３Ｉｌｅ（プライマー２８、配列番号３０）、Ｔｈｒ３０８Ａｌａ（プライマー２９、配列番号３１）及びＩｌｅ５５２Ｍｅｔ（プライマー３０、配列番号３２）を用い、アルカリセルラーゼ遺伝子内に存在する適当な対向プライマーを構築して鋳型ＤＮＡと共に変異導入を行なった。 Further, site-directed mutagenesis Leu10Gln, Ser22Pro, Asn33His, Phe39Ala, Met109Ile, Gln242Ser, Gln242Ala, Gln242Phe, Gln242Val, Gln242Asp, Gln242Glu, Gln242Gly, Gln242Ile, Gln242Leu, Gln242Met, Gln242Tyr, Phe263Ile, mutagenesis for introducing Thr308Ala and Ile552Met Primer Leu10Gln (primer 13, SEQ ID NO: 15), Ser22Pro (primer 14, SEQ ID NO: 16), Asn33His (primer 15, SEQ ID NO: 17), Phe39Ala (primer 16, SEQ ID NO: 18), Met109Ile (primer 17, sequence) 19), Gln242Ser (primer 18, SEQ ID NO: 20), Gln242Ala (primer 19, SEQ ID NO: 21), Gln242Phe (primer 20, SEQ ID NO: 22), Gln242Val (primer 21, SEQ ID NO: 23), Gln242Asp (primer 22, sequence) No. 24) or Gln242Glu (primer 22, SEQ ID NO: 24), Gln242Gly (primer 23, SEQ ID NO: 25), Gln242Ile (primer 20, SEQ ID NO: 22), Gln242Thr (primer 24, SEQ ID NO: 26), Gln242Leu (primer 25, sequence) No. 27), Gln242Met (primer 26, SEQ ID NO: 28), Gln242Tyr (primer 27, SEQ ID NO: 29), Phe263Ile (primer) 28, SEQ ID NO: 30), Thr308Ala (Primer 29, SEQ ID NO: 31) and Ile552Met (Primer 30, SEQ ID NO: 32) are used to construct an appropriate counter primer present in the alkaline cellulase gene and introduce mutations with the template DNA. I did it.

即ち、鋳型ＤＮＡプラスミド０．５μＬ(１０ｎｇ)、変異導入用プライマー２０μＬ（１μＭ）、対向プライマー２０μＬ（１μＭ）、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液１０μＬ、１０ｍＭデオキシヌクレオチド３リン酸(ｄＮＴＰ)混液８μＬ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ０．５μＬ(２．５ｕｎｉｔｓ、Ｔａｋａｒａ)及び脱イオン水３９．５μＬを混合した後、ｇｅｎｅａｍｐＰＣＲｓｙｓｔｅｍ９７００（Ａｍｅｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃２分間の熱変性後、９４℃１分間、５６℃１分間、７２℃３０秒間（３０サイクル）及び７２℃１分間で行った。得られたＰＣＲ産物をＧＦＸＰＣＲＤＮＡａｎｄｇｅｌｂａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ（Ａｍｅｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製後（４３．５μＬ）、５．５μＬの１０倍濃度のリン酸化用緩衝液及びポリヌクレオチドキナーゼ１μＬ(１０ｕｎｉｔｓ)を加え、３７℃で１時間リン酸化反応を行ない精製（５０μＬ）した。リン酸化されたＰＣＲ産物２５μＬに、鋳型プラスミドを２μＬ(２０ｎｇ)、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液１０μＬ、１０ｍＭｄＮＴＰ混液８μＬ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラー１μＬ (５ｕｎｉｔｓ)及び脱イオン水５４μＬを混合した後、ＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃、２分間の熱変性後、９４℃１分間、６０℃１分間、７２℃６分間（３０サイクル）及び７２℃１２分間で行った。
得られたＰＣＲ産物を精製後（４３．５μＬ）、５．５μＬの１０倍濃度のリン酸化用緩衝液及びポリヌクレオチドキナーゼ１μＬ (１０ｕｎｉｔｓ)を加え、３７℃で１時間リン酸化反応を行った後、エタノール沈澱（１０μＬ）した。回収された１０μＬのＤＮＡ溶液をｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ）を用いて１６℃、１８時間ライゲーション反応を行い、自己閉環した後、再度エタノール沈殿して、ＤＮＡ混液を回収した。 Namely, template DNA plasmid 0.5 μL (10 ng), mutagenesis primer 20 μL (1 μM), counter primer 20 μL (1 μM), 10-fold concentration of PCR buffer 10 μL, 10 mM deoxynucleotide triphosphate (dNTP) mixed solution 8 μL, After mixing 0.5 μL of Pyrobest DNA polymerase (2.5 units, Takara) and 39.5 μL of deionized water, PCR was performed with gene amp PCR system 9700 (Amesham-Pharmacia). Reaction conditions were 94 ° C for 1 minute, 94 ° C for 1 minute, 56 ° C for 1 minute, 72 ° C for 30 seconds (30 cycles) and 72 ° C for 1 minute after heat denaturation at 94 ° C for 2 minutes. The obtained PCR product was purified by GFX PCR DNA and gel band purification kit (Amesham-Pharmacia) (43.5 μL), 5.5 μL of 10 × phosphorylation buffer and 1 μL (10 units) of polynucleotide kinase. In addition, phosphorylation reaction was performed at 37 ° C. for 1 hour for purification (50 μL). 25 μL of the phosphorylated PCR product was mixed with 2 μL (20 ng) of the template plasmid, 10 μL of 10-fold concentration of PCR buffer, 8 μL of 10 mM dNTP mixture, 1 μL of Pyrobest DNA polymerer (5 units), and 54 μL of deionized water. Went. The reaction conditions were 94 ° C for 2 minutes, followed by heat denaturation at 94 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, 72 ° C for 6 minutes (30 cycles), and 72 ° C for 12 minutes.
After purification of the obtained PCR product (43.5 μL), 5.5 μL of 10-fold concentration phosphorylation buffer and 1 μL (10 units) of polynucleotide kinase were added, followed by phosphorylation at 37 ° C. for 1 hour. And ethanol precipitation (10 μL). The recovered 10 μL of DNA solution was ligated kit ver. Using 2 (Takara), a ligation reaction was performed at 16 ° C. for 18 hours. After self-cyclization, ethanol precipitation was performed again to collect a DNA mixture.

実施例２形質転換法
実施例１で得られたＤＮＡ混液５μＬを用いて（Chang and Cohen, Mol.Gen.Gent., 168, 111-115,1979）によりＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＩＳＷ１２１４株に導入して形質転換体を取得した。即ち、宿主菌Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＩＳＷ１２１４株を５０ｍＬのＬＢ培地中で３７℃で、約２時間振とう培養後(６００ｎｍにおける吸光度が０．４)、室温で遠心分離 (７０００ｒｐｍ、１５分間)により菌体を集め、５ｍＬのＳＭＭＰ[０．５Ｍシュークロース、２０ｍＭマレイン酸二ナトリウム、２０ｍＭ塩化マグネシウム６水塩、３５％（ｗ／ｖ）ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｍｅｄｉｕｍ３（Ｄｉｆｃｏ）］に懸濁後、ＳＭＭＰ溶液に溶解した５００μＬのリゾチーム溶液 (３０ｍｇ／ｍＬ)を加え、３７℃で１時間保温した。保温終了後、室温で遠心分離 (２８００ｒｐｍ、１５分間)によりプロトプラストを集め、５ｍＬのＳＭＭＰに懸濁しプロトプラスト溶液を調製した。０．５ｍＬのプロトプラスト溶液に１０μＬのプラスミド溶液と１．５ｍＬの４０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００、Ｓｉｇｍａ）を加え、緩やかに攪拌後、室温で２分間放置した後、直ちに５ｍＬのＳＭＭＰ溶液を混和し、室温で遠心分離 (２８００ｒｐｍ、１５分間)によりプロトプラストを集め、１ｍＬのＳＭＭＰ溶液に再懸濁した。プロトプラスト懸濁液を３７℃で９０分間振盪 (１２０ｒｐｍ)した後、テトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭ３再生寒天培地[０．８％（ｗ／ｖ）寒天（和光純薬）、０．５％コハク酸２ナトリウム６水塩、０．５％カザミノ酸テクニカル（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％酵母エキス、０．３５％リン酸１カリウム、０．１５％リン酸２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム６水塩、０．０１％牛血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、０．５％カルボキメチルセルロース、０．００５％トリパンブルー（Ｍｅｒｃｋ）及びアミノ酸混液(ロイシン、メチオニン１０μg／ｍＬ)]上に塗布し、３０℃で７２時間培養して形質転換体を得た。ＤＭ３再生寒天平板培地上で、ハローを形成した形質転換体をテトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ）を含んだポリペプトン培地で、３０℃で１５時間振とう培養を行い、集菌後、ｍｉｃｒｏｐｒｅｐｐｌａｓｍｉｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ（Ａｍｅｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によりプラスミドを回収、精製した。 Example 2 Transformation Method Using 5 μL of the DNA mixture obtained in Example 1 (Chang and Cohen, Mol. Gen. Gent., 168, 111-115, 1979), it was introduced into Bacillus subtilis ISW1214 strain and transformed. Acquired the body. That is, the host fungus B. After subtilis ISW1214 strain was shaken in 50 mL of LB medium at 37 ° C. for about 2 hours (absorbance at 600 nm was 0.4), the cells were collected by centrifugation (7000 rpm, 15 minutes) at room temperature. After suspension in SMMP [0.5 M sucrose, 20 mM disodium maleate, 20 mM magnesium chloride hexahydrate, 35% (w / v) antibiotic medium 3 (Difco)], 500 μL of lysozyme solution (30 mg) dissolved in SMMP solution / ML), and kept at 37 ° C. for 1 hour. After the incubation, the protoplasts were collected by centrifugation (2800 rpm, 15 minutes) at room temperature and suspended in 5 mL of SMMP to prepare a protoplast solution. Add 10 μL of the plasmid solution and 1.5 mL of 40% (w / v) polyethylene glycol (PEG 8000, Sigma) to 0.5 mL of the protoplast solution, gently agitate, let stand at room temperature for 2 minutes, and immediately add 5 mL of SMMP. The solution was mixed and the protoplasts were collected by centrifugation (2800 rpm, 15 minutes) at room temperature and resuspended in 1 mL SMMP solution. After shaking the protoplast suspension at 37 ° C. for 90 minutes (120 rpm), DM3 regeneration agar medium containing tetracycline (15 μg / mL, Sigma) [0.8% (w / v) agar (Wako Pure Chemical Industries), 0. 5% disodium succinate hexahydrate, 0.5% casamino acid technical (Difco), 0.5% yeast extract, 0.35% potassium phosphate, 0.15% dipotassium phosphate, 0.5% Glucose, 0.4% magnesium chloride hexahydrate, 0.01% bovine serum albumin (Sigma), 0.5% carboxymethyl cellulose, 0.005% trypan blue (Merck) and amino acid mixture (leucine, methionine 10 μg / mL) ] And then cultured at 30 ° C. for 72 hours to obtain a transformant. On a DM3 regenerated agar plate medium, halo-formed transformants were cultured in a polypeptone medium containing tetracycline (15 μg / mL) with shaking at 30 ° C. for 15 hours, and after collection, the micro prep plasmid purification kit ( The plasmid was recovered and purified by Amesham-Pharmacia).

実施例３塩基配列の決定
実施例２で取得したプラスミド中に挿入されたセルラーゼ遺伝子の塩基配列の確認は、３７７ＤＮＡシークエンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行なった。 Example 3 Determination of base sequence The base sequence of the cellulase gene inserted into the plasmid obtained in Example 2 was confirmed using a 377 DNA sequencer (Applied Biosystems).

実施例４セルラーゼ変異体の生産評価
宿主菌Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＩＳＷ１２１４株の培養は、３％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ（日本製薬）、０．５％魚肉エキス（和光純薬）、０．０５％酵母エキス、０．１％リン酸１カリウム、０．０２％硫酸マグネシウム７水塩、テトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ）及び５％マルトースを含んだ培地（ＰＳＭ培地）を用いて、３０℃で７２時間行った。 Production Evaluation host strain B of Example 4 cellulase variants. The culture of subtilis ISW1214 is 3% (w / v) polypeptone S (Nippon Pharmaceutical), 0.5% fish meat extract (Wako Pure Chemical Industries), 0.05% yeast extract, 0.1% monopotassium phosphate, 0 It was performed at 30 ° C. for 72 hours using a medium (PSM medium) containing 0.02% magnesium sulfate heptahydrate, tetracycline (15 μg / mL) and 5% maltose.

各セルラーゼ変異体の培養上清中の活性を測定し、組換え野性型セルラーゼの培養液あたりの生産量を１００％とした時、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎは１２０％、Ｉｌｅ１６Ａｓｎは１３９％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏは１４０％、Ａｓｎ３３Ｈｉｓは１０５％、Ｐｈｅ３９Ａｌａは１１３％、Ｉｌｅ７６Ｈｉｓは１１２％、Ｍｅｔ１０９Ｌｅｕは１１２％、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒは１２５％、Ｐｈｅ２６３Ｉｌｅは１３７％、Ｔｈｒ３０８Ａｌａは１０２％、Ａｓｎ４６２Ｔｈｒは１１６％、Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕは１１０％、Ｖａｌ４６８Ａｌａは１２２％、Ｉｌｅ５５２Ｍｅｔは１３２％、Ｉｌｅ５６４Ｖａｌは１１３％、Ｓｅｒ６０８Ｉｌｅは１１０％であった。２重変異体Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏは１１７％、Ａｓｎ３３Ｈｉｓ＋Ｐｈｅ３９Ａｌａは１１８％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ａｌａは２０７％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ｐｈｅは１９６％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ｖａｌは１８７％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒは１７５％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ｉｌｅは１７４％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ｇｌｙは１６０％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ｇｌｕは１５８％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ａｓｐは１４５％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ｔｈｒは１３４％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ｌｅｕは１２８％、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ｍｅｔは１２５％及び、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ+Ｇｌｎ２４２Ｔｙｒは１１５％であった。３重変異体Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒは１６２％、Ｉｌｅ１６Ａｓｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒは１０７％、４重変異体Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ＋Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕは１１３％、５重変異体Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｉｌｅ１６Ａｓｎ＋Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕは１６３％と生産向上が認められた。
解析の結果、殆どの変異体における生産向上はタンパク質の分泌量の増加であることが明かとなった。その中において２４２位の置換体については基質であるカルボキメチルセルロース（ＣＭＣ）の分解反応に対する比活性の向上が認められた。即ち、野生型酵素の比活性を１００％とした場合、Ｇｌｎ２４２Ａｌａは、１４７％、Ｇｌｎ２４２Ｖａｌは、１５０％、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒは、１２５％、Ｇｌｎ２４２Ｐｈｅは、１２８％、Ｇｌｎ２４２Ａｓｐは、１０７％、Ｇｌｎ２４２Ｇｌｕは、１０６％、Ｇｌｎ２４２Ｇｌｙは、１０５％とそれぞれ相対比活性の向上を認めた。さらに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８）中における比活性も向上しており、Ｇｌｎ２４２Ａｌａは、１５０％、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒは、１１０％、Ｇｌｎ２４２Ｖａｌは、１２３％、Ｇｌｎ２４２Ｐｈｅは、１１０％、Ｇｌｎ２４２Ａｓｐは１０８％、Ｇｌｎ２４２Ｇｌｕは１１４％と相対比活性の向上が認められた。尚、タンパク質量は、標準タンパク質として牛血清アルブミンを用い、プロテインアッセイキット（Ｂｉｏ―Ｒａｄ）にて定量した。 When the activity of each cellulase mutant in the culture supernatant was measured and the production amount of the recombinant wild type cellulase per culture medium was 100%, Leu10Gln was 120%, Ile16Asn was 139%, Ser22Pro was 140%, Asn33His 105%, Phe39Ala 113%, Ile76His 112%, Met109Leu 112%, Gln242Ser 125%, Phe263Ile 137%, Thr308Ala 102%, Asn462Thr 116%, Lys466Leu 110%, Val468Ala55 122% Was 132%, Ile564Val was 113%, and Ser608Ile was 110%. Double mutant Leu10Gln + Ser22Pro is 117%, Asn33His + Phe39Ala is 118%, Ser22Pro + Gln242Phe is 207%, Ser22Pro + Gln242Phe is 196%, Ser22Pro + Gln242Val is 187%, Ser22Pro + G17242G is 187%, Ser22Pro + G17242 is Ser24S 160%, Ser22Pro + Gln242Glu is 158%, Ser22Pro + Gln242Asp is 145%, Ser22Pro + Gln242Thr is 134%, Ser22Pro + Gln242Leu is 128%, Ser22Pro + Gln242Met is 125%, and Ser22Pro + Gln24M is 115% There was. Triple mutant Leu10Gln + Ser22Pro + Gln242Ser is 162%, Ile16Asn + Ser22Pro + Gln242Ser is 107%, Quadruple mutant Leu10Gln + Ser22Pro + Ile76His + Lys466Leu + Sle16GlS is increased by 113%
As a result of the analysis, it was revealed that the production improvement in most mutants was an increase in protein secretion. Among them, the substitution at position 242 was found to improve the specific activity against the decomposition reaction of the substrate, carboxymethyl cellulose (CMC). That is, assuming that the specific activity of the wild-type enzyme is 100%, Gln242Ala is 147%, Gln242Val is 150%, Gln242Ser is 125%, Gln242Phe is 128%, Gln242Asp is 107%, Gln242Glu is 106% , Gln242Gly showed an improvement in relative specific activity of 105%. Furthermore, the specific activity in 0.1 M phosphate buffer (pH 8) is also improved, Gln242Ala is 150%, Gln242Ser is 110%, Gln242Val is 123%, Gln242Phe is 110%, Gln242Asp is 108%, Gln242Glu showed an improvement in relative specific activity of 114%. The protein amount was quantified with a protein assay kit (Bio-Rad) using bovine serum albumin as a standard protein.

＜セルラーゼ活性測定法（３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法＞
０．２ｍＬの０．５Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）、０．４ｍＬの２．５％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロース（Ａ０１ＭＣ；日本製紙）、０．３ｍＬの脱イオン水から成る反応液に０．１ｍＬの適当に希釈した酵素液を加え４０℃で２０分間反応させた後、１ｍＬのジニトロサリチル酸試薬（０．５％ジニトロサリチル酸、３０％ロッシェル塩、１．６％水酸化ナトリウム水溶液）を添加し、沸水中で５分間還元糖の発色を行った。氷水中で急冷し、４ｍＬの脱イオン水を加え５３５ｎｍにおける吸光度を測定し還元糖の生成量を求めた。尚、ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液にジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、同様に発色させたものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する量とした。 <Cellulase activity measurement method (3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) method)>
From 0.2 mL of 0.5 M glycine-sodium hydroxide buffer (pH 9.0), 0.4 mL of 2.5% (w / v) carboxymethylcellulose (A01MC; Nippon Paper Industries), 0.3 mL of deionized water After adding 0.1 mL of an appropriately diluted enzyme solution to the reaction solution and reacting at 40 ° C. for 20 minutes, 1 mL of dinitrosalicylic acid reagent (0.5% dinitrosalicylic acid, 30% Rochelle salt, 1.6% hydroxylation) Sodium aqueous solution) was added and coloring of the reducing sugar was performed in boiling water for 5 minutes. After quenching in ice water, 4 mL of deionized water was added and the absorbance at 535 nm was measured to determine the amount of reducing sugar produced. In addition, after adding a dinitrosalicylic acid reagent to the reaction liquid processed without adding an enzyme liquid, the blank added the enzyme liquid and prepared the same color. One unit (1 U) of enzyme was defined as an amount that produces a reducing sugar equivalent to 1 μmol of glucose per minute under the above reaction conditions.

実施例５
特開２００２−２６５９９９号公報に記載のＡ−１粒子、Ｃ−１粒子、及び香料からなる下記組成の粉末洗剤を調製し、これに本発明の変異アルカリセルラーゼを１３５００００Ｕ／ｋｇとなるように配合して、その洗浄力を調べた。 Example 5
A powder detergent having the following composition consisting of A-1 particles, C-1 particles and a fragrance described in JP-A No. 2002-265999 is prepared, and the mutant alkaline cellulase of the present invention is blended in the powder detergent so as to be 1350000 U / kg. Then, the detergency was examined.

＜洗浄力測定方法＞
（人工汚染布）
特開２００２−２６５９９９号公報に記載の洗浄力評価用人工汚染布を用いた。
（洗浄条件、洗浄方法及び評価法）
３０℃の硬水（CaCl₂：55.42mg/L、MgCl₂・6H₂O：43.51mg/L）に洗剤を溶解し、０．０６６７質量％洗剤水溶液１Ｌを調製する。人工汚染布５枚を洗剤水溶液に添加し、３０℃にて１時間浸して置く。次いでターゴトメーターにて１００ｒｐｍ、３０℃で１０分間攪拌洗浄する。人工汚染布を流水下で濯いだ後、アイロンプレスし、反射率測定に供した。汚染前の原布及び洗浄前後の人工汚染布の５５０ｎｍにおける反射率を自記色彩計（島津製作所(株)製）にて測定し、次式によって洗浄率（％）を求め、５枚の測定平均値にて洗浄力を評価した。 <Detergency measurement method>
(Artificial contamination cloth)
An artificially contaminated cloth for evaluating detergency described in JP-A-2002-265999 was used.
(Cleaning conditions, cleaning methods and evaluation methods)
Detergent is dissolved in 30 ° C. hard water (CaCl ₂ : 55.42 mg / L, MgCl ₂ .6H ₂ O: 43.51 mg / L) to prepare 1 L of 0.0667 mass% aqueous detergent solution. Add 5 artificially contaminated cloths to the aqueous detergent solution and immerse for 1 hour at 30 ° C. Next, the mixture is stirred and washed at 100 rpm and 30 ° C. for 10 minutes with a targotometer. The artificially contaminated cloth was rinsed under running water, then iron-pressed, and subjected to reflectance measurement. Measure the reflectance at 550 nm of the raw cloth before contamination and the artificially contaminated cloth before and after washing with a self-recording color meter (manufactured by Shimadzu Corporation), and obtain the washing rate (%) by the following formula. Detergency was evaluated by the value.

（評価結果）
この結果、本発明の変異アルカリセルラーゼを配合した洗剤による洗浄率は７１％であり、セルラーゼ無添加の洗剤の６４％に比べて７ポイント向上した。 (Evaluation results)
As a result, the washing rate with the detergent containing the mutant alkaline cellulase of the present invention was 71%, which was 7 points higher than that of the detergent with no cellulase added.

Claims

For cellulase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, (a) 10th position, (b) 16th position, (c) 22nd position, (e) 39th position, (f) 76th position, (g) Amino acid residue at position 109, (i) position 263, (k) position 462, (l) position 466, (m) position 468, (n) position 552, (o) position 564 or (p) position 608 But,
(A) position: glutamine (b) position: asparagine (c) position: proline (e) position: alanine (f) position: histidine (g) position: leucine (i) position: isoleucine (k) position: threonine (l ) Position: leucine (m) position: alanine (n) position: methionine (o) position: valine (p) position: secretory amount compared to the parent alkaline cellulase substituted with an amino acid residue selected from isoleucine Improved mutant alkaline cellulase.

For cellulase having 98% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, (a) position 10, (b) position 16, (c) position 22, (e) position 39, (f) ) 76th, (g) 109th, (i) 263, (k) 462, (l) 466, (m) 468, (n) 552, (o) 564 or (p) 608 The amino acid residue at the position corresponding to the position
(A) position: glutamine (b) position: asparagine (c) position: proline (e) position: alanine (f) position: histidine (g) position: leucine (i) position: isoleucine (k) position: threonine (l ) Position: leucine (m) position: alanine (n) position: methionine (o) position: valine (p) position: secretory amount compared to the parent alkaline cellulase substituted with an amino acid residue selected from isoleucine Improved mutant alkaline cellulase.

Substitution of amino acid residues in SEQ ID NO: 1, Leu10Gln, Ile16Asn, Ser22Pro, Phe39Ala, Ile76His, Met109Leu, Phe263Ile, Asn462Thr, Lys466Leu, Val468Ala, Ile552Met, Ile564Val, Ser608Ile, Leu10Gln + Ser22Pro, Asn33His + Phe39Ala, Leu10Gln + Ser22Pro + Ile76His + Lys466Leu a is claim 1 or 2, wherein Mutant alkaline cellulase.

A gene encoding the mutant alkaline cellulase according to any one of claims 1 to 3.

A recombinant vector containing the gene according to claim 4.

A transformant containing the recombinant vector according to claim 5.

The transformant according to claim 6, wherein the host is a microorganism.

A detergent composition containing the mutant alkaline cellulase according to claim 1.