JP5153613B2 - 抗体のフレームワーク・シャッフル - Google Patents
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Description
本発明は、抗体の抗原に対する免疫特異性を保持したまま、抗体の免疫原性を弱めるために、抗体を再設計または再構成する方法に関する。特に、本発明は、フレームワーク領域のサブバンクから得られるフレームワーク領域にインフレームで融合したドナー抗体由来の相補性決定領域(CDR)を含んでなるコンビナトリアルライブラリーを合成することによって、抗原に免疫特異的な抗体を作製する方法を提供する。本発明はまた、本発明の方法によって作製された抗体を提供する。
抗体は我々の免疫反応において極めて重要な役割を担っている。抗体はウイルスや細菌毒素を不活化することができ、また、補体系と様々なタイプの白血球を動員して、侵入してくる微生物や大型の寄生生物を死滅させるのに不可欠である。抗体はもっぱらBリンパ球によって数限りない形態で作られており、それぞれの形態が異なるアミノ酸配列を有し、異なる抗原結合部位をもっている。抗体は、まとめて免疫グロブリン(Ig)と呼ばれているが、血液中で最も豊富に存在するタンパク質成分の一つである。Albertsら, Molecular Biology of the Cell, 2nd ed., 1989, Garland Publishing, Inc.。
本発明は、一部には、(抗体の可変重鎖フレームワーク領域と可変軽鎖フレームワーク領域に対する)フレームワーク領域サブバンクの合成、ならびに、(ドナー抗体由来の相補性決定領域(CDR)とフレームワーク領域サブバンク由来のフレームワーク領域とを同時にインフレームで融合することにより作製された可変鎖領域をもつ)可変重鎖領域および/または可変軽鎖領域を含む抗体のコンビナトリアルライブラリーの合成に基づいている。フレームワーク領域サブバンクの作製によって、目的の抗原に対するそれらの免疫特異性だけでなく、目的の生物におけるそれらの免疫原性を容易にスクリーニングできる、迅速で手間のかからない抗体(定常領域を含むまたは含まない)のコンビナトリアルライブラリーの作製が可能になる。本発明で記載するライブラリー手法によって、アクセプターフレームワーク(例えば、ヒトフレームワーク)の効率的な選択および同定が可能である。フレームワーク領域サブバンクの作製に加えて、CDRのサブバンクを作製してフレームワーク領域サブバンクからのフレームワーク領域とランダムにインフレームで融合させることにより、抗体(定常領域を含むまたは含まない)のコンビナトリアルライブラリーを作製することができ、これらの抗体を、目的の抗原に対するそれらの免疫特異性、ならびに目的の生物におけるそれらの免疫原性をスクリーニングすることができる。本発明のコンビナトリアルライブラリー法は、本明細書では、ヒトで使用するヒト化抗体の作製について例証される。しかしながら、本発明のコンビナトリアルライブラリー法は、目的のいずれの生物で使用する抗体の作製にも容易に応用できる。
(a) 重鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製すること、
(b) ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし、前記ヌクレオチド配列は、重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製されるものであり、前記CDRはドナー抗体の重鎖可変領域(例えば、非ヒトドナー抗体の重鎖可変領域)に由来し、少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域は重鎖フレームワーク領域のサブバンク(例えば、ヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンク)から得られるものであること、
(c) 前記核酸配列を、軽鎖可変領域(例えば、ヒト化またはヒト軽鎖可変領域)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含有する細胞に導入すること、
(d) 重鎖可変領域(例えば、ヒト化重鎖可変領域)と軽鎖可変領域(例えば、ヒト化またはヒト軽鎖可変領域)をコードするヌクレオチド配列を発現させること、
を含んでなる。この実施形態によれば、前記方法は前記抗原と免疫特異的に結合する抗体(例えば、ヒト化抗体)をスクリーニングすることからなるステップ(e)をさらに含んでいてよい。
(a) 重鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製すること、
(b) 重鎖可変領域(例えば、ヒト化重鎖可変領域)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし、前記ヌクレオチド配列は、重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製されるものであり、少なくとも1つのCDRはドナー抗体(例えば、非ヒトドナー抗体)由来の重鎖CDRのサブバンクから得られ、少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域は重鎖フレームワーク領域のサブバンク(例えば、ヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンク)から得られるものであること、
(c) 前記核酸配列を、軽鎖可変領域(例えば、ヒト化またはヒト軽鎖可変領域)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含有する細胞に導入すること、
(d) 重鎖可変領域(例えば、ヒト化重鎖可変領域)と軽鎖可変領域(例えば、ヒト化またはヒト軽鎖可変領域)をコードするヌクレオチド配列を発現させること、
を含んでなる。この実施形態によれば、前記方法は前記抗原と免疫特異的に結合する抗体(例えば、ヒト化抗体)をスクリーニングすることからなるステップ(e)をさらに含んでいてよい。
(a) 軽鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製すること、
(b) 軽鎖可変領域(例えば、ヒト化軽鎖可変領域)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし、前記ヌクレオチド配列は、軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製されるものであり、前記CDRはドナー抗体の軽鎖可変領域(例えば、非ヒトドナー抗体の軽鎖可変領域)に由来し、少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域は軽鎖フレームワーク領域のサブバンク(例えば、ヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンク)から得られるものであること、
(c) 前記核酸配列を、重鎖可変領域(例えば、ヒト化またはヒト重鎖可変領域)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含有する細胞に導入すること、
(d) 重鎖可変領域(例えば、ヒト化重鎖可変領域)と軽鎖可変領域(例えば、ヒト化またはヒト軽鎖可変領域)をコードするヌクレオチド配列を発現させること、
を含んでなる。この実施形態によれば、前記方法は前記抗原と免疫特異的に結合する抗体(例えば、ヒト化抗体)をスクリーニングすることからなるステップ(e)をさらに含んでいてよい。
(a) 軽鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製すること、
(b) 軽鎖可変領域(例えば、ヒト化軽鎖可変領域)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし、前記ヌクレオチド配列は、軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製されるものであり、少なくとも1つのCDRはドナー抗体(例えば、非ヒトドナー抗体)由来の軽鎖CDRのサブバンクから得られ、少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域は軽鎖フレームワーク領域のサブバンク(例えば、ヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンク)から得られるものであること、
(c) 前記核酸配列を、重鎖可変領域(例えば、ヒト化またはヒト重鎖可変領域)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含有する細胞に導入すること、
(d) 重鎖可変領域(例えば、ヒト化重鎖可変領域)と軽鎖可変領域(例えば、ヒト化またはヒト軽鎖可変領域)をコードするヌクレオチド配列を発現させること、
を含んでなる。この実施形態によれば、前記方法は前記抗原と免疫特異的に結合する抗体(例えば、ヒト化抗体)をスクリーニングすることからなるステップ(e)をさらに含んでいてよい。
(a) 軽鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製すること、
(b) 重鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製すること、
(c) 重鎖可変領域(例えば、ヒト化重鎖可変領域)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし、前記ヌクレオチド配列は、重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製されるものであり、前記CDRはドナー抗体の重鎖可変領域(例えば、非ヒトドナー抗体の重鎖可変領域)に由来し、少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域は重鎖フレームワーク領域のサブバンク(例えば、ヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンク)から得られるものであること、
(d) 軽鎖可変領域(例えば、ヒト化軽鎖可変領域)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし、前記ヌクレオチド配列は、軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製されるものであり、前記CDRはドナー抗体の軽鎖可変領域(例えば、非ヒトドナー抗体の軽鎖可変領域)に由来し、少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域は軽鎖フレームワーク領域のサブバンク(例えば、ヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンク)から得られるものであること、
(e) 前記核酸配列を細胞に導入すること、
(f) 重鎖可変領域(例えば、ヒト化重鎖可変領域)と軽鎖可変領域(例えば、ヒト化軽鎖可変領域)をコードするヌクレオチド配列を発現させること、
を含んでなる。この実施形態によれば、前記方法は前記抗原と免疫特異的に結合する抗体(例えば、ヒト化抗体)をスクリーニングすることからなるステップ(g)をさらに含んでいてよい。
(a) 軽鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製すること、
(b) 重鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製すること、
(c) 重鎖可変領域(例えば、ヒト化重鎖可変領域)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし、前記ヌクレオチド配列は、重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製されるものであり、少なくとも1つのCDRはドナー抗体(例えば、非ヒトドナー抗体)由来の重鎖CDRのサブバンクから得られ、少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域は重鎖フレームワーク領域のサブバンク(例えば、ヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンク)から得られるものであること、
(d) 軽鎖可変領域(例えば、ヒト化軽鎖可変領域)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし、前記ヌクレオチド配列は、軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製されるものであり、前記CDRはドナー抗体の軽鎖可変領域に由来し、少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られるものであること、
(e) 前記核酸配列を細胞に導入すること、
(f) 重鎖可変領域(例えば、ヒト化重鎖可変領域)と軽鎖可変領域(例えば、ヒト化軽鎖可変領域)をコードするヌクレオチド配列を発現させること、
を含んでなる。この実施形態によれば、前記方法は前記抗原と免疫特異的に結合する抗体(例えば、ヒト化抗体)をスクリーニングすることからなるステップ(g)をさらに含んでいてよい。
(a) 軽鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製すること、
(b) 重鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製すること、
(c) ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし、前記ヌクレオチド配列は、重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製されるものであり、前記CDRはドナー抗体の重鎖可変領域(例えば、非ヒトドナー抗体の重鎖可変領域)に由来し、少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域は重鎖フレームワーク領域のサブバンク(例えば、ヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンク)から得られるものであること、
(d) 軽鎖可変領域(例えば、ヒト化軽鎖可変領域)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし、前記ヌクレオチド配列は、軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製されるものであり、少なくとも1つのCDRはドナー抗体(例えば、非ヒトドナー抗体)由来の軽鎖CDRのサブバンクから得られ、少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域は軽鎖フレームワーク領域のサブバンク(例えば、ヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンク)から得られるものであること、
(e) 前記核酸配列を細胞に導入すること、
(f) 重鎖可変領域(例えば、ヒト化重鎖可変領域)と軽鎖可変領域(例えば、ヒト化軽鎖可変領域)をコードするヌクレオチド配列を発現させること、
を含んでなる。この実施形態によれば、前記方法は前記抗原と免疫特異的に結合する抗体(例えば、ヒト化抗体)をスクリーニングすることからなるステップ(g)をさらに含んでいてよい。
(a) 軽鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製すること、
(b) 重鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製すること、
(c) 重鎖可変領域(例えば、ヒト化重鎖可変領域)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし、前記ヌクレオチド配列は、重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製されるものであり、少なくとも1つのCDRはドナー抗体(例えば、非ヒトドナー抗体)由来の重鎖CDRのサブバンクから得られ、少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域は重鎖フレームワーク領域のサブバンク(例えば、ヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンク)から得られるものであること、
(d) 軽鎖可変領域(例えば、ヒト化軽鎖可変領域)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成すること、ただし、前記ヌクレオチド配列は、軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製されるものであり、少なくとも1つのCDRはドナー抗体(例えば、非ヒトドナー抗体)由来の軽鎖CDRのサブバンクから得られ、少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域は軽鎖フレームワーク領域のサブバンク(例えば、ヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンク)から得られるものであること、
(e) 前記核酸配列を細胞に導入すること、
(f) 重鎖可変領域(例えば、ヒト化重鎖可変領域)と軽鎖可変領域(例えば、ヒト化軽鎖可変領域)をコードするヌクレオチド配列を発現させること、
を含んでなる。この実施形態によれば、前記方法は前記抗原と免疫特異的に結合する抗体(例えば、ヒト化抗体)をスクリーニングすることからなるステップ(g)をさらに含んでいてよい。
(a) 軽鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製すること、
(b) 重鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製すること、
(c) (i)重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製された、重鎖可変領域(例えば、ヒト化重鎖可変領域)をコードする第1のヌクレオチド配列、および(ii)軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製された、軽鎖可変領域(例えば、ヒト化軽鎖可変領域)をコードする第2のヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成することであり、重鎖可変領域のCDRはドナー抗体の重鎖可変領域(例えば、非ヒトドナー抗体の重鎖可変領域)に由来し、軽鎖可変領域のCDRはドナー抗体の軽鎖可変領域(例えば、非ヒトドナー抗体の軽鎖可変領域)に由来し、少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域は重鎖フレームワーク領域のサブバンク(例えば、ヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンク)から得られ、そして少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域は軽鎖フレームワーク領域のサブバンク(例えば、ヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンク)から得られたものであること、
(d) 前記核酸配列を細胞に導入すること、
(e) 重鎖可変領域(例えば、ヒト化重鎖可変領域)と軽鎖可変領域(例えば、ヒト化軽鎖可変領域)をコードするヌクレオチド配列を発現させること、
を含んでなる。この実施形態によれば、前記方法は前記抗原と免疫特異的に結合する抗体(例えば、ヒト化抗体)をスクリーニングすることからなるステップ(f)をさらに含んでいてよい。
(a) 軽鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製すること、
(b) 重鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製すること、
(c) (i)重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製された、ヒト化重鎖可変領域をコードする第1のヌクレオチド配列、および(ii)軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製された、ヒト化軽鎖可変領域をコードする第2のヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成することであり、少なくとも1つの重鎖可変領域CDRは抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体に由来の重鎖CDRのサブバンクから得られ、軽鎖可変領域CDRはドナー抗体の軽鎖可変領域に由来し、少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られ、そして少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られたものであること、
(d) 前記核酸配列を細胞に導入すること、
(e) ヒト化重鎖可変領域とヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させること、
を含んでなる。この実施形態によれば、前記方法は前記抗原と免疫特異的に結合する抗体(例えば、ヒト化抗体)をスクリーニングすることからなるステップ(f)をさらに含んでいてよい。
(a) 軽鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製すること、
(b) 重鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製すること、
(c) (i)重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製された、ヒト化重鎖可変領域をコードする第1のヌクレオチド配列、および(ii)軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製された、ヒト化軽鎖可変領域をコードする第2のヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成することであり、重鎖可変領域CDRはドナー抗体の重鎖可変領域に由来し、少なくとも1つの軽鎖可変領域CDRは抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体に由来の軽鎖CDRのサブバンクから得られ、少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られ、そして少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られたものであること、
(d) 前記核酸配列を細胞に導入すること、
(e) ヒト化重鎖可変領域とヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させること、
を含んでなる。この実施形態によれば、前記方法は前記抗原と免疫特異的に結合する抗体(例えば、ヒト化抗体)をスクリーニングすることからなるステップ(f)をさらに含んでいてよい。
(a) 軽鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製すること、
(b) 重鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製すること、
(c) (i)重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製された、重鎖可変領域(例えば、ヒト化重鎖可変領域)をコードする第1のヌクレオチド配列、および(ii)軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製された、軽鎖可変領域(例えば、ヒト化軽鎖可変領域)をコードする第2のヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成することであり、少なくとも1つの重鎖可変領域CDRはドナー抗体(例えば、非ヒトドナー抗体)由来の重鎖CDRのサブバンクから得られ、少なくとも1つの軽鎖可変領域CDRはドナー抗体(例えば、非ヒトドナー抗体)由来の軽鎖CDRのサブバンクから得られ、少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域は重鎖フレームワーク領域のサブバンク(例えば、ヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンク)から得られ、そして少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域は軽鎖フレームワーク領域のサブバンク(例えば、ヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンク)から得られたものであること、
(d) 前記核酸配列を細胞に導入すること、
(e) 重鎖可変領域(例えば、ヒト化重鎖可変領域)と軽鎖可変領域(例えば、ヒト化軽鎖可変領域)をコードするヌクレオチド配列を発現させること、
を含んでなる。この実施形態によれば、前記方法は前記抗原と免疫特異的に結合する抗体(例えば、ヒト化抗体)をスクリーニングすることからなるステップ(f)をさらに含んでいてよい。
本明細書で使用される「アクセプター」および「アクセプター抗体」という用語は、1以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列の、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%を与える、もしくはコードする、抗体または核酸配列を示す。いくつかの実施形態において、「アクセプター」という用語は、定常領域を与える、もしくはコードする、抗体または核酸配列を指す。特定の実施形態において、「アクセプター」という用語は、1以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列の、少なくとも80%、または少なくとも85%、または少なくとも90%、または少なくとも95%を与える、もしくはコードする、ヒト抗体または核酸配列を指す。アクセプターフレームワーク領域および/またはアクセプター定常領域は、例えば、生殖系列抗体遺伝子、成熟抗体遺伝子、機能性抗体(例:当技術分野で知られている抗体、開発中の抗体、もしくは市販の抗体)に由来し、あるいはそれらから得ることができる。
図面については後記する。
本発明は、CDRをコードする核酸配列を、フレームワーク領域をコードする核酸配列と同時にインフレームで融合することにより、抗体(すなわち、ドナー抗体)を再設計または再構成する方法であって、少なくとも1つのCDRはドナー抗体由来でありかつ少なくとも1つのフレームワーク領域はフレームワーク領域(例えば、いくつかのまたは全て公知のヒト生殖系列軽鎖FR1フレームワーク)のサブバンク由来である前記方法を提供する。再設計または再構成された抗体を作製する一方法を図13に詳しく示す。従って、本発明はまた、本発明の方法により作製された再設計または再構成された抗体も提供する。本発明の再設計または再構成された抗体はまた、本明細書において「改変された抗体」、「ヒト化抗体」、「フレームワークシャッフルした抗体」および単に「本発明の抗体」とも呼ばれる。本明細書で用いられるように、1以上のCDRが由来する抗体はドナー抗体である。いくつかの実施形態において、本発明の再設計または再構成された抗体は少なくとも1個、または少なくとも2個、または少なくとも3個、または少なくとも4個、または少なくとも5個、または少なくとも6個のドナー抗体由来のCDRを含む。いくつかの実施形態において、本発明の再設計または再構成された抗体は少なくとも1個、または少なくとも2個、または少なくとも3個、または少なくとも4個、または少なくとも5個、または少なくとも6個、または少なくとも7個、または少なくとも8個のフレームワーク領域のサブバンク由来のフレームワークを含む。
(i)アクセプターフレームワーク領域の包括的バンクの構築
(ii)CDRの選択
(iii)コンビナトリアルサブライブラリーの構築
(iv)コンビナトリアルライブラリーの構築
(v)コンビナトリアルライブラリの発現
(vi)再設計または再構成された抗体の選択
(vii)再設計または再構成された抗体の作製および特徴付け
(viii)抗体コンジュゲート
(ix)本発明の組成物の用途
(x)投与および製剤
(xi)投与量および投与回数
(xii)生物学的アッセイ
(xiii)キット
(xiv)製造物品
(xv)例示の実施形態
5.1 アクセプターフレームワーク領域の包括的バンクの構築
本発明にしたがって、1以上のアクセプター抗体(例えば、ヒト抗体)のフレームワーク領域(軽鎖のFR1、FR2、FR3、FR4、ならびに重鎖のFR1、FR2、FR3、FR4)をコードする核酸配列、およびドナー抗体の相補性決定領域(軽鎖のCDR1、CDR2、CDR3、ならびに重鎖のCDR1、CDR2、CDR3)をコードする核酸配列を同時に融合することによって、ドナー抗体(例えば、非ヒト抗体)の軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域を改変する(例えばヒト化する)ことができる。好ましくは、改変された(例えば、ヒト化された)抗体軽鎖は、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4を含んでなる。改変された(例えば、ヒト化された)抗体重鎖は、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4を含んでなる。おのおののアクセプター(例えばヒト)フレームワーク領域(軽鎖のFR1、2、3、4、ならびに重鎖のFR1、2、3、4)は、軽鎖のFRサブバンク、および重鎖のFRサブバンクからそれぞれ作製することができる。アクセプター(例えば、ヒト)フレームワーク領域の包括的バンクは2つ以上のFRサブバンクを含んでなる。軽鎖FRサブバンクを作製する1つの方法を図13Aにさらに詳しく示す。同様な方法を重鎖FRサブバンクを作製するのに利用することができる。
軽鎖サブバンク1、2、3および4を構築するが、このサブバンク1は、ヌクレオチド配列を含む複数の核酸配列を含んでなり、各ヌクレオチド配列は軽鎖FR1をコードする;サブバンク2はヌクレオチド配列を含む複数の核酸配列を含んでなり、各ヌクレオチド配列は軽鎖FR2をコードする;サブバンク3はヌクレオチド配列を含む複数の核酸配列を含んでなり、各ヌクレオチド配列は軽鎖FR3をコードする;ならびにサブバンク4はヌクレオチド配列を含む複数の核酸配列を含んでなり、各ヌクレオチド配列は軽鎖FR4をコードする。FR配列は、いずれの機能性ヒト抗体配列(例えば、当技術分野で知られている抗体、および/または市販の抗体)から得ても、もしくはそれに由来してもよい。いくつかの実施形態において、FR配列は機能性ヒト抗体配列(例えば、当技術分野で知られている抗体、および/または市販の抗体)から得るか、もしくはそれに由来する。いくつかの実施形態において、FR配列はヒト生殖系列軽鎖配列に由来する。ある実施形態において、サブバンクFR配列は、ヒト生殖系列κ鎖配列に由来する。別の実施形態において、サブバンクFR配列は、ヒト生殖系列λ鎖配列に由来する。サブバンクFR配列が非ヒト源(例えば、霊長類、げっ歯類)に由来しうることも予期する。
限定ではなく一例として、軽鎖FR1サブバンクの構築は、表12および表13(すべて5’から3’の方向で表示され、名称に続いて配列を示す)に記載のオリゴヌクレオチドを用いたオーバーラップ伸長法によるポリメラーゼ連鎖反応によって行う。
いくつかの実施形態において、重鎖FRサブバンク5、6、7および11が構築されるが、サブバンク5は、それぞれが重鎖FR1をコードするヌクレオチド配列を含む複数の核酸配列を含んでなり;サブバンク6は、それぞれが重鎖FR2をコードするヌクレオチド配列を含む複数の核酸配列を含んでなり;サブバンク7はそれぞれが重鎖FR3をコードするヌクレオチド配列を含む複数の核酸配列を含んでなり;ならびにサブバンク11はそれぞれが重鎖FR4をコードするヌクレオチド配列を含む複数の核酸配列を含んでなり;前記において、重鎖FR1、FR2およびFR3は、CDR H1およびH2に関するKabatの定義にしたがって定義される。いくつかの実施形態において、FR配列は機能性ヒト抗体配列に由来する。他の実施形態において、FR配列はヒト生殖系列重鎖配列に由来する。
フレームワーク領域サブバンクの合成に加えて、CDRのサブバンクを作製し、フレームワーク領域サブバンクからのフレームワーク領域とランダムにインフレームで融合させて、目的の抗原に対する免疫特異性ならびに目的の生物における免疫原性についてスクリーニング可能な抗体のコンビナトリアルライブラリー(定常領域を含むもの、または含まないもの)を作製することができる。その際は、本発明のコンビナトリアルライブラリー法を、ヒトにおいて使用するためのヒト化抗体の作製について例示する。しかし、本発明のコンビナトリアルライブラリー法は、あらゆる目的の生物において使用するための抗体の作製に容易に適用可能である。
コンビナトリアルサブライブラリーは、CDR(例えば非ヒトCDR)を、FRサブバンクの対応するヒトフレームワーク領域とインフレームで融合することにより構築される。例えば、限定されるものでないが、コンビナトリアルサブライブラリー1は、サブバンク1を用いて、非ヒトCDRを対応するκ軽鎖ヒトフレームワーク領域とインフレームで融合させることにより構築され;コンビナトリアルサブライブラリー2は、サブバンク2を用いて、非ヒトCDRを対応するκ軽鎖ヒトフレームワーク領域とインフレームで融合させることにより構築され;コンビナトリアルサブライブラリー3は、サブバンク3を用いて、非ヒトCDRを対応するκ軽鎖ヒトフレームワーク領域とインフレームで融合させることにより構築され;コンビナトリアルサブライブラリー4は、サブバンク4を用いて、非ヒトCDRを対応するκ軽鎖ヒトフレームワーク領域とインフレームで融合させることにより構築され;コンビナトリアルサブライブラリー5、6および7は、それぞれサブバンク5、6および7を用いて、非ヒトCDR(CDR H1およびH2についてのKabat定義)を対応する重鎖ヒトフレームワーク領域とインフレームで融合させることにより構築され;コンビナトリアルサブライブラリー8、9および10は、それぞれサブバンク8、9および10を用いて、非ヒトCDR(CDR H1およびH2についてのChothia定義)を対応する重鎖ヒトフレームワーク領域とインフレームで融合させることにより構築され;コンビナトリアルサブライブラリー11は、サブバンク11を用いて、非ヒトCDR H3(KabatおよびChothiaの定義)を対応するヒト重鎖フレームワーク領域とインフレームで融合させることにより構築される。いくつかの実施形態では、非ヒトCDRもまた、CDRライブラリーから選択することができる。CDRはまた、ヒトまたはヒト化抗体に由来してもよいしまたはいずれかの生物種に由来しないランダム配列であってもよいと考えている。さらに非ヒトフレームワークをサブライブラリーを構築するのに利用してもよいと考えている。
コンビナトリアルライブラリーは、対応する可変軽鎖領域または可変重鎖領域のコンビナトリアルサブライブラリーを同時にアセンブルすることにより構築される。軽鎖可変領域コンビナトリアルライブラリーを構築するのに有用な方法の例は図13C〜Dにさらに詳しく示されている。一実施形態において、コンビナトリアルライブラリーはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(例えば、オーバーラップ伸長により)を用いて構築される。別の実施形態において、コンビナトリアルライブラリーは直接ライゲーションにより構築される。さらに別の実施形態において、コンビナトリアルライブラリーは非確率的合成ライゲーション再アセンブリーを用いて構築されない。例えば、限定するものでないが、ヒトκ軽鎖生殖系列フレームワークのコンビナトリアルライブラリー(コンビネーションライブラリー1)は、後に記載するように、CDR中の重複領域を介してサブライブラリー1、2、3および4を同時にアセンブルすることにより構築できる(図13CおよびDも参照);ヒト重鎖生殖系列フレームワークの2つのコンビナトリアルライブラリー(1つはCDRのKabat定義についてのもの、コンビネーションライブラリー2;1つはCDRのChothia定義についてのもの、コンビネーションライブラリー3)は、後に記載するように、CDR中の重複領域を介してサブライブラリー5、6、7、11(Kabat定義)またはサブライブラリー8、9、10、11(Chothia定義)を同時にアセンブルすることにより構築できる。
本発明に従って構築されるコンビナトリアルライブラリーは、当業界で公知のいずれの方法によっても発現させることができ、そのような方法としては、限定するものではないが、細菌発現系、哺乳動物発現系およびin vitroリボソームディスプレイ系が挙げられる。
号を参照されたい。
発現されたコンビナトリアルライブラリーは、当業界で公知のいずれかの方法を用いて、ドナー抗体によって認識される抗原への結合についてスクリーニングすることができる。特定の実施形態において、それぞれ第5.4節および第5.7節に記載されるように構築され発現されたファージディスプレイライブラリーを、ドナー抗体によって認識される抗原への結合についてスクリーニングし、その抗原に対して有意な結合を示すVHおよび/またはVLドメインを発現するファージを、慣用のスクリーニング技法(例えば、Harlow, E., およびLane, D., 1988, 前掲、Gherardi, Eら 1990. J. Immunol. meth. 126 p61-68に記載されるもの)を用いてライブラリーから単離することができる。宿主細胞から脱離したファージ粒子を宿主細胞培地から収集(回収)し、望ましい抗体結合特性についてスクリーニングする。典型的には、収集した粒子を、予め選択した抗原との結合について「パンニング」する。次に、強く結合する粒子を回収し、個々の種の粒子をクローニングにより単離し、その抗原に対する結合についてさらにスクリーニングする。望ましい抗原結合特異性の結合部位を生じるファージを選択する。ある特定の実施形態において、本発明のヒト化抗体は、目的の抗原に対して少なくとも1×106 M-1、少なくとも1×107 M-1、少なくとも1×108 M-1または少なくとも1×109 M-1の親和性を有する。
所望の結合活性を有するヒト化抗体およびそのフラグメントをコードする1つ以上の核酸を選択したら、当業界で公知の標準的な技法によりその核酸を回収することができる。一実施形態においては、選択したファージ粒子を回収してそれを新たな細菌に感染させ、その後に目的の核酸を回収する。
本発明は、1つ以上の成分(限定するものではないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、ミメティック物質、合成薬物、無機分子および有機分子を含む)にコンジュゲートまたは融合させた抗体またはそのフラグメントを包含する。
本発明は、目的の抗体を効率的にヒト化するための方法を提供する。本発明のヒト化抗体は、疾患またはその1つ以上の症状を治療、管理、予防または改善するために、単独で、または他の予防剤もしくは治療剤と組み合わせて使用することができる。
本発明は、疾患の診断、検出、またはモニタリングにおいて、疾患もしくはその1つ以上の症状の予防、治療、管理、または改善において、および/または研究において使用するための本発明の抗体を含む組成物を提供する。特定の実施形態では、組成物は本発明の抗体を1種以上含んでなる。別の実施形態では、組成物は1種以上の本発明の抗体および本発明の抗体以外の1種以上の予防薬または治療薬を含んでなる。好ましくは、予防薬または治療薬は、疾患もしくはその1つ以上の症状の予防、治療、管理または改善において有用であることが知られているか、それらに用いられてきたかあるいは現在用いられているものである。これらの実施形態によれば、該組成物は担体、希釈剤または賦形剤をさらに含んでもよい。
特定の実施形態では、本発明の抗体または本発明の別の予防薬もしくは治療薬をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を、遺伝子治療によって疾患もしくはその1以上の症状を治療、予防、管理、または改善するために投与する。遺伝子治療とは、発現されるかまたは発現されうる核酸の、被験者への投与により行われる治療を指す。本発明のこの実施形態では、核酸は、それがコードする本発明の抗体または予防薬もしくは治療薬(予防効果もしくは治療効果を媒介する)を産生する。
疾患もしくはその1以上の症状の治療、管理、予防または改善に有効でありうる本発明の予防薬もしくは治療薬または組成物の量は、標準的な臨床実務により決定することができる。投与回数および投与量は、投与する具体的な治療剤または治療剤群(例えば具体的な治療薬または予防薬)、障害、疾患もしくは病状の重症度、投与経路、同様に年齢、体重、応答、患者の免疫状態、および患者の過去の医療履歴に依存する、各患者に特異的な因子に応じて変わるであろう。例えば、疾患もしくはその1以上の症状の治療、予防、管理、または改善に有効でありうる本発明の予防薬もしくは治療薬または組成物の投与量は、動物モデル(例えば本明細書中に開示されているかまたは当業者に公知の動物モデル)に対して組成物を投与することにより決定することができる。さらに、場合によっては適正な投与量の範囲の特定を助けるためにin vitroアッセイを用いてもよい。好適な処方は、そのような因子を考慮することにより、また例えば文献に報告され、Physician’s Desk Reference(第57版、2003)において推奨されている投与量に従って、当業者が選択することができる。
本発明の抗体またはそのフラグメントは、当業者に周知の種々の方法で特徴付けることができる。特に、本発明の抗体またはそのフラグメントは、抗原に免疫特異的に結合する能力についてアッセイする。そのようなアッセイは、溶液中で(例えば、Houghten, 1992, Bio/Techniques 13:412 421)、ビーズ上で(Lam, 1991, Nature 354:82 84)、チップ上で(Fodor, 1993, Nature 364:555 556)、細菌上で(米国特許第5,223,409号)、胞子上で(米国特許第5,571,698号;第5,403,484号;および第5,223,409号)、プラスミド上で(Cull ら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865 1869)、またはファージ上で(Scott および Smith, 1990, Science 249:386 390;Cwirla ら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378 6382;および Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301 310)行うことができる。特定された抗体またはそのフラグメントは、その後、特異性および親和性についてアッセイすることができる。
本発明は、目的の生物種の抗体フレームワーク領域のサブバンクを含んでなるキットを提供する。本発明はまた、目的の生物種のCDRのサブバンクを含んでなるキットを提供する。本発明はまた、ヌクレオチド配列を包含する複数の核酸配列を含むコンビナトリアルサブライブラリーを含んでなるキットであって、各ヌクレオチド配列が1つの対応するCDR(例えばCDR1)とインフレームで融合された1つのフレームワーク領域(例えばFR1)をコードする、前記キットを提供する。本発明はさらに、ヌクレオチド配列を包含する複数の核酸配列を含むコンビナトリアルライブラリーを含んでなるキットであって、各ヌクレオチド配列がインフレームで融合されたフレームワーク領域とCDR(例えばFR1+CDR1+FR2+CDR2+FR3+CDR3+FR4)をコードする、前記キットを提供する。
5.14 製造物品
本発明はまた、梱包済みの、ラベルされた医薬品を包含する。本製品は、ガラスバイアルもしくは他の密閉容器のような所定の容器中の所定の単位剤形を含む。非経口投与に好適な投与剤形の場合、有効成分は無菌状態で、微粒子を含まない溶液としての投与に好適なものである。言い換えれば、本発明は、非経口投与用溶液および凍結乾燥粉末剤(いずれも無菌)の両者を包含し、後者は注入前の再調製に好適なものである。あるいはまた、単位剤形は、経口、経皮、局所または粘膜送達に好適な固体であってもよい。
1. ヒト化重鎖可変領域をコードする第1のヌクレオチド配列を含む核酸配列であって、前記ヒト化重鎖可変領域をコードする第1のヌクレオチド配列は、重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖相補性決定領域(CDR)1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製されたものであり、前記CDRはドナー抗体の重鎖可変領域に由来し、各重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られるものである、前記核酸配列。
(a)ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入するステップであって、前記第1のヌクレオチド配列は、重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖相補性決定領域(CDR)1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより合成されたものであり、前記CDRはドナー抗体の重鎖可変領域に由来し、少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られたものであるステップ、
(b)ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入するステップであって、前記ヌクレオチド配列は、軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖相補性決定領域(CDR)1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより合成されたものであり、前記CDRはドナー抗体の軽鎖可変領域に由来し、少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られたものであるステップ、
を含む方法により作製される、前記細胞。
(a)重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入するステップであって、前記ヌクレオチド配列は、重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより合成されたものであり、少なくとも1つのCDRは抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体由来の重鎖CDRのサブバンクから得られたものであり、少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られたものであるステップ、
(b)ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入するステップであって、前記ヌクレオチド配列は、軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより合成されたものであり、前記CDRはドナー抗体の軽鎖可変領域に由来し、少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られたものであるステップ、
を含む方法により作製される、前記細胞。
(a)重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入するステップであって、前記ヌクレオチド配列は、重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより合成されたものであり、少なくとも1つのCDRは抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体由来の重鎖CDRのサブバンクから得られたものであり、また、少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られたものであるステップ、
(b)ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入するステップであって、前記ヌクレオチド配列は、軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより合成されたものであり、少なくとも1つのCDRは抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体由来の軽鎖CDRのサブバンクから得られたものであり、また、少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られたものであるステップ、
を含む方法により作製される、前記細胞。
(a)重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入するステップであって、前記ヌクレオチド配列は、重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖相補性決定領域(CDR)1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより合成されたものであり、前記CDRはドナー抗体の重鎖可変領域に由来し、少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られたものであるステップ、
(b)ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を細胞に導入するステップであって、前記ヌクレオチド配列は、軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより合成されたものであり、少なくとも1つのCDRは抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体由来の軽鎖CDRのサブバンクから得られたものであり、また、少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られたものであるステップ、
を含む方法により作製される、前記細胞。
(a)重鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製するステップ、
(b)ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップであって、ただし、前記ヌクレオチド配列は、重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより合成され、前記CDRはドナー抗体の重鎖可変領域に由来し、少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られたものであるステップ、
(c)前記核酸配列を、ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含有する細胞に導入するステップ、
(d)ヒト化重鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ、
を含んでなる前記方法。
(a)重鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製するステップ、
(b)ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップであって、ただし、前記ヌクレオチド配列は、重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより合成され、少なくとも1つのCDRは抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体由来の重鎖CDRのサブバンクから得られたものであり、また、少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られたものであるステップ、
(c)前記核酸配列を、ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含有する細胞に導入するステップ、
(d)ヒト化重鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ、
を含んでなる前記方法。
(a)軽鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製するステップ、
(b)ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップであって、ただし、前記ヌクレオチド配列は、軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより合成され、前記CDRはドナー抗体の軽鎖可変領域に由来し、少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られたものであるステップ、
(c)前記核酸配列を、ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含有する細胞に導入するステップ、
(d)ヒト化重鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ、
を含んでなる前記方法。
(a)軽鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製するステップ、
(b)ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップであって、ただし、前記ヌクレオチド配列は、軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより合成され、少なくとも1つのCDRは抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体由来の軽鎖CDRのサブバンクから得られたものであり、また、少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られたものであるステップ、
(c)前記核酸配列を、ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含有する細胞に導入するステップ、
(d)ヒト化重鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ、を含んでなる前記方法。
(a)軽鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製するステップ、
(b)重鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製するステップ、
(c)ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップであって、ただし、前記ヌクレオチド配列は、重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより合成され、前記CDRはドナー抗体の重鎖可変領域に由来し、少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られたものであるステップ、
(d)ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップであって、ただし、前記ヌクレオチド配列は、軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより合成され、前記CDRはドナー抗体の軽鎖可変領域に由来し、少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られたものであるステップ、
(e)前記核酸配列を細胞に導入するステップ、
(f)ヒト化重鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ、を含んでなる前記方法。
(a)軽鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製するステップ、
(b)重鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製するステップ、
(c)ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップであって、ただし、前記ヌクレオチド配列は、重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより合成され、少なくとも1つのCDRは抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体由来の重鎖CDRのサブバンクから得られたものであり、また、少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られたものであるステップ、
(d)ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップであって、ただし、前記ヌクレオチド配列は、軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより合成され、前記CDRはドナー抗体の軽鎖可変領域に由来し、少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られたものであるステップ、
(e)前記核酸配列を細胞に導入するステップ、
(f)ヒト化重鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ、
を含んでなる前記方法。
(a)軽鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製するステップ、
(b)重鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製するステップ、
(c)ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップであって、ただし、前記ヌクレオチド配列は、重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより合成され、前記CDRはドナー抗体の重鎖可変領域に由来し、少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られたものであるステップ、
(d)ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップであって、ただし、前記ヌクレオチド配列は、軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより合成され、少なくとも1つのCDRは抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体由来の軽鎖CDRのサブバンクから得られたものであり、また、少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られたものであるステップ、
(e)前記核酸配列を細胞に導入するステップ、
(f)ヒト化重鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ、
を含んでなる前記方法。
(a)軽鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製するステップ、
(b)重鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製するステップ、
(c)ヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップであって、ただし、前記ヌクレオチド配列は、重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより合成され、少なくとも1つのCDRは抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体由来の重鎖CDRのサブバンクから得られたものであり、また、少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られたものであるステップ、
(d)ヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップであって、ただし、前記ヌクレオチド配列は、軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより合成され、少なくとも1つのCDRは抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体由来の軽鎖CDRのサブバンクから得られたものであり、また、少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られたものであるステップ、
(e)前記核酸配列を細胞に導入するステップ、
(f)ヒト化重鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ、
を含んでなる前記方法。
(a)軽鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製するステップ、
(b)重鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製するステップ、
(c)(i)重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより合成された、ヒト化重鎖可変領域をコードする第1のヌクレオチド配列、および(ii)軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより合成された、ヒト化軽鎖可変領域をコードする第2のヌクレオチド配列、を含む核酸配列を合成するステップであって、重鎖可変領域のCDRはドナー抗体の重鎖可変領域に由来し、軽鎖可変領域のCDRはドナー抗体の軽鎖可変領域に由来し、少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られ、そして少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られるものであるステップ、
(d)前記核酸配列を細胞に導入するステップ、
(e)ヒト化重鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ、
を含んでなる前記方法。
(a)軽鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製するステップ、
(b)重鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製するステップ、
(c)(i)重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより合成された、ヒト化重鎖可変領域をコードする第1のヌクレオチド配列、および(ii)軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより合成された、ヒト化軽鎖可変領域をコードする第2のヌクレオチド配列、を含む核酸配列を合成するステップであって、少なくとも1つの重鎖可変領域CDRは抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体由来の重鎖CDRのサブバンクから得られ、軽鎖可変領域CDRはドナー抗体の軽鎖可変領域に由来し、少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られ、そして少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られるものであるステップ、
(d)前記核酸配列を細胞に導入するステップ、
(e)ヒト化重鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ、
を含んでなる前記方法。
(a)軽鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製するステップ、
(b)重鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製するステップ、
(c)(i)重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより合成された、ヒト化重鎖可変領域をコードする第1のヌクレオチド配列、および(ii)軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより合成された、ヒト化軽鎖可変領域をコードする第2のヌクレオチド配列、を含む核酸配列を合成するステップであって、重鎖可変領域CDRはドナー抗体の重鎖可変領域に由来し、少なくとも1つの軽鎖可変領域CDRは抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体由来の軽鎖CDRのサブバンクから得られ、少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られ、そして少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られるものであるステップ、
(d)前記核酸配列を細胞に導入するステップ、
(e)ヒト化重鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ、
を含んでなる前記方法。
(a)軽鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製するステップ、
(b)重鎖フレームワーク領域のサブバンクを作製するステップ、
(c)(i)重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより合成された、ヒト化重鎖可変領域をコードする第1のヌクレオチド配列、および(ii)軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより合成された、ヒト化軽鎖可変領域をコードする第2のヌクレオチド配列、を含む核酸配列を合成するステップであって、少なくとも1つの重鎖可変領域CDRは抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体由来の重鎖CDRのサブバンクから得られ、少なくとも1つの軽鎖可変領域CDRは抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体由来の軽鎖CDRのサブバンクから得られ、少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られ、そして少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンクから得られるものであるステップ、
(d)前記核酸配列を細胞に導入するステップ、
(e)ヒト化重鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ、
を含んでなる前記方法。
88. さらに、(g) 前記抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体についてスクリーニングするステップを含んでなる、実施形態79、80、81または82の方法。
(i) 実施形態126、127、128、129、130、131、132または133の細胞において核酸配列を発現させるステップ、
(ii) 前記抗原に対して1 x 106 M-1以上の親和性を有するヒト化抗体をスクリーニングするステップ、
(iii) ドナー抗体と比較して所望の改善された特性を有するヒト化抗体についてスクリーニングするステップ
を含んでなる前記方法。
(a)改変された重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第1の核酸配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合する前記ドナー抗体重鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ;
(b)前記第1の核酸配列を細胞中に導入しかつドナー軽鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域からなる群より選択される軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第2の核酸配列を該細胞中に導入するステップ;
(c)改変された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ;
(d)抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ; および
(e)平衡解離定数(KD);安定性;融点(Tm);pI;溶解度;産生レベル;およびエフェクター機能からなる群より選択される1以上の改善された特性を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、改善がドナー抗体と比較して約1%〜500%であるかまたはドナー抗体と比較して2倍〜1000倍であるステップ
を含んでなる前記方法。
(a)改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第1の核酸配列を合成するステップであって、前記第1のヌクレオチド配列は軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合する前記ドナー抗体軽鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ;
(b)前記第1の核酸配列を細胞中に導入しかつドナー重鎖可変領域およびヒト化重鎖可変領域からなる群より選択される重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第2の核酸配列を該細胞中に導入するステップ;
(c)改変された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ;
(d)抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ; および
(e)平衡解離定数(KD);安定性;融点(Tm);pI;溶解度;産生レベル;およびエフェクター機能からなる群より選択される1以上の改善された特性を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、前記改善がドナー抗体と比較して約1%〜500%であるかまたはドナー抗体と比較して2倍〜1000倍であるステップ
を含んでなる前記方法。
(a)改変された重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合する前記ドナー抗体重鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ;
(b)改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、およびa軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体軽鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ
(c)ステップ(a)および(b)で作製した核酸配列を細胞中に導入するステップ;
(d)改変された重鎖可変領域および改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ;
(e)抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ; および
(f)平衡解離定数(KD);安定性;融点(Tm);pI;溶解度;産生レベル;およびエフェクター機能からなる群より選択される1以上の改善された特性を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、改善がドナー抗体と比較して約1%〜500%であるかまたはドナー抗体と比較して2倍〜1000倍であるステップ
を含んでなる前記方法。
(a)改変された重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第1の核酸配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合する前記ドナー抗体重鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ;
(b)前記第1の核酸配列を細胞中に導入しかつドナー軽鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域からなる群より選択される軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第2の核酸配列を該細胞中に導入するステップ;
(c)改変された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ;
(d)抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ; および
(e)改善された結合特性を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、改善がドナー抗体と比較して約1%〜500%であるかまたはドナー抗体と比較して2倍〜1000倍であるステップ
を含んでなる前記方法。
(a)改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第1の核酸配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合する前記ドナー抗体軽鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ;
(b)前記第1の核酸配列を細胞中に導入しかつ前記ドナー重鎖可変領域およびヒト化重鎖可変領域からなる群より選択される重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第2の核酸配列を該細胞中に導入するステップ;
(c)改変された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ;
(d)抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ; および
(e)改善された結合特性を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、改善がドナー抗体と比較して約1%〜500%であるかまたはドナー抗体と比較して2倍〜1000倍であるステップ
を含んでなる前記方法。
(a)改変された重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体重鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ;
(b)改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、およびa軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合する前記ドナー抗体軽鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ
(c)ステップ(a)および(b)で作製した核酸配列を細胞中に導入するステップ;
(d)改変された重鎖可変領域および改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ;
(e)抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ; および
(f)改善された結合特性を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、改善がドナー抗体と比較して約1%〜500%であるかまたはドナー抗体と比較して2倍〜1000倍であるステップ
を含んでなる前記方法。
(a) 改変された重鎖可変領域をコードする第1のヌクレオチド配列(重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは免疫特異的に前記抗原と結合するドナー抗体重鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である);および
(b) 改変された軽鎖可変領域をコードする第2のヌクレオチド配列(軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは免疫特異的に前記抗原と結合するドナー抗体軽鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である)を含んでなるヌクレオチド配列によりコードされ、改善がドナー抗体と比較して約1%〜500%であるかまたはドナー抗体と比較して2倍〜1000倍である前記抗体。
試薬
全ての化学薬品は分析グレードのものを使用した。制限酵素とDNA改変酵素はNew England Biolabs, Inc.(Beverly, MA)から購入した。pfu DNAポリメラーゼとオリゴヌクレオチドはInvitrogen(Carlsbad, CA)から購入した。ヒトEphA2-Fc融合タンパク質(ヒトIgG1のFc部分と融合されたヒトEphA2からなる;Carles-Kinchら Cancer Res. 62: 2840-2847 (2002))はヒト胚性腎(HEK)293細胞において発現させ、標準的なプロトコルを用いてプロテインGアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。ストレプトアビジン磁性ビーズはDynal(Lake Success, NY)から購入した。ヒトEphA2-Fcのビオチン化は、EZ-Link Sulfo-NHS-LC-ビオチン化キット(Pierce, Rockford, IL)を用いて製造業者の使用説明書に従って実施した。
ヒト受容体チロシンキナーゼEphA2に対するモノクローナル抗体(mAb)を分泌するマウスハイブリドーマ細胞株(B233)をMedImmune, Inc.から取得した(Kinchら Clin. Exp. Metastasis. 20:59-68 (2003))。このマウスmAbを以後mAb B233という。mAb B233の可変重鎖(VH)および軽鎖(VL)遺伝子のクローニングおよび配列決定は、B233由来のメッセンジャーRNAをStraight A’s mRNA精製キット(Novagen, Madison, WI)を用いて製造業者の使用説明書に従って単離・精製した後で実施した。cDNAは第1鎖cDNA合成キット(Novagen, Madison, WI)を用いて製造業者が推奨するとおりに合成した。VHおよびVL遺伝子の増幅は、マウスIg-プライマーセット(Novagen, Madison, WI)からのIgG VHおよびIgκ VLオリゴヌクレオチドを用いて製造業者が提案するとおりに実施した。産生増幅より得られるDNA断片は、Perfectly Bluntクローニングキット(Novagen, Madison, WI)を用いてpSTBlue-1にクローニングした。その後、ジデオキシチェーンターミネーション法(Sangerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74: 5463-5467 (1977))により、ABI3000シークエンサー(Applied Biosystems, Foster City, CA)を使って、多数のVHおよびVLクローンの配列決定を行った。mAb B233 VL(VL-233)およびVH(VH-233)遺伝子のコンセンサス配列を図1に示す。
ヒトフレームワーク遺伝子は公的に利用可能な抗体生殖系列遺伝子のプールから選択した。さらに詳しく述べると、これは、第1、第2および第3フレームワークについては46のヒト生殖系列κ鎖遺伝子(A1、A10、A11、A14、A17、A18、A19、A2、A20、A23、A26、A27、A3、A30、A5、A7、B2、B3、L1、L10、L11、L12、L14、L15、L16、L18、L19、L2、L20、L22、L23、L24、L25、L4/18a、L5、L6、L8、L9、O1、O11、O12、O14、O18、O2、O4およびO8;K.F. Schableら, Biol. Chem. Hoppe Seyler 374:1001-1022, (1993);J. Brensing-Kuppersら, Gene 191:173-181 (1997))を含み、第4フレームワークについては5つのヒト生殖系列J配列(Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4およびJκ5; P.A. Hieterら, J. Biol. Chem. 257:1516-1522 (1982))を含んでいた。このライブラリーの重鎖部分は、第1、第2および第3フレームワークについては44のヒト生殖系列重鎖配列(VH1-18、VH1-2、VH1-24、VH1-3、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH1-8、VH2-26、VH2-5、VH2-70、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-7、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH3-9、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-4、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1およびVH7-8;F. Matsudaら, J. Exp. Med. 188:1973-1975 (1998))を含み、第4フレームワークについては6つのヒト生殖系列J配列(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5およびJH6; J.V. Ravetchら, Cell 27(3 Pt 2): 583-591 (1981))を含んでいた。
6.3.1 ライブラリーの説明
3つの主なフレームワークシャッフルしたライブラリー(ライブラリーA、BおよびC)を構築した。ライブラリーAは、mAb B233の重鎖(VH-233)と対合させた軽鎖フレームワークシャッフルしたサブライブラリー(VL sub1)を含んでいた。ライブラリーBは、固定化したフレームワークシャッフルした軽鎖VL-12C8およびVL-8G7と対合させた重鎖フレームワークシャッフルしたサブライブラリー(VH sub1)を含んでいた(6.4.1.1節、6.4.1.2節および6.4.1.3節を参照のこと)。ライブラリーCは、重鎖フレームワークシャッフルしたサブライブラリー(VH sub2)と対合させた軽鎖フレームワークシャッフルしたサブライブラリー(VL sub2)を含んでいた。
VL sub1サブライブラリーは、オーバーラップ伸長によるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて順次アセンブルした。Hoら, Gene 77:51-59 (1989)。さらに詳しく述べると、対応するドナーCDRの部分とインフレームで融合された個々のヒト生殖系列フレームワークを合成するために、次のオリゴヌクレオチドの組合せを用いて、いわゆる「中間体」PCRを行った:第1、第2、第3および第4フレームワークについて、それぞれAL1〜13/AL1U〜10U/1〜46、BL1〜10/BL1U〜16U/47〜92、CL1〜11/CL1U〜12U/93〜138およびDL1〜4/DL1U〜4U/139〜143。これは100μl容量中のpfu DNAポリメラーゼ(PCR SuperMix, Invitrogen)および約5 pmolのオリゴヌクレオチドAL1〜13、AL1U〜10U、BL1〜10、BL1U〜16U、CL1〜11、CL1U〜12U、DL1〜4およびDL1U〜4U、ならびに約100 pmolのオリゴヌクレオチド1〜143を用いて実施した。PCRプログラムは、95℃で5分;94℃で1分、45℃で1分、72℃で1分を30サイクル、その後72℃で8分とした。次に、2回目のPCR(「アセンブリPCR」)を実施するために、100μl反応容量中のpfu DNAポリメラーゼ(PCR SuperMix, Invitrogen)、0.5〜2μlずつの「中間体」PCR、25 pmolずつのオリゴヌクレオチドDL1U、DL2U、DL3U、DL4U (表64参照)および100 pmolのビオチン化オリゴヌクレオチド5’-GGTCGTTCCATTTTACTCCCAC-3’(配列番号1734)を使用した。アセンブリPCR プログラムは、95℃で5分;94℃で30秒、50℃で30秒、72℃で45秒を30サイクル、その後72℃で8分とした。
ライブラリーB(VL-12C8+VL-8G7+VH sub1)に関連して用いられる、VL-12C8およびVL-8G7軽鎖遺伝子は、それぞれ12C8for/12C8backおよび8G7for/8G7backのオリゴヌクレオチド組合せを用いて対応するV領域コード化M13ファージベクター(6.4.1.1節、6.4.1.2節、6.4.1.3節参照)からPCRにより合成した(下記参照)。
5’-GGTCGTTCCATTTTACTCCCACTCCGCCATCCAGTTGACTCAGTCTCC-3’(ビオチン化)(配列番号1736)
12C8back
5’-GATGAAGACAGATGGTGCAGCCACAGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCTCC-3’(配列番号1737)
8G7for
5’-GGTCGTTCCATTTTACTCCCACTCCGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAG-3’(ビオチン化)(配列番号1738)
8G7back
5’-GATGAAGACAGATGGTGCAGCCACAGTACGTTTGATATCCACTTTGGTCCCTC-3’(配列番号1739)。
オリゴヌクレオチド12C8forおよび8G7forはM13遺伝子3リーダー重複配列(太字)を含む。オリゴヌクレオチド8G7backおよび12C8backはCκ重複配列(下線)を含む。
キメラFab陽性対照(VH-233+VL-233)またはライブラリーA(VL sub1+VH-233)との関連で用いられるVH-233およびVL-233重鎖および軽鎖遺伝子は、PCRでそれぞれ233Hfor/233Hbackおよび233Lfor/233Lbackオリゴヌクレオチド組合せを用いて、対応するpSTBlue-1 (6.1節参照)ベクターから合成した(下記参照)。
5’-gctggtggtgccgttctatagccatagcGAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAG-3’ (ビオチン化) (配列番号1740)
233Hback
5’-ggaagaccgatgggcccttggtggaggcTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCCTTG-3’ (配列番号1741)
233Lfor
5’-ggtcgttccattttactcccactccGATATTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCCACCCTG-3’ (ビオチン化) (配列番号1742)
233Lback
5’-gatgaagacagatggtgcagccacagtacgTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCAGCACCGAACG-3’ (配列番号1743)
オリゴヌクレオチド233Hforおよび233LforはM13遺伝子3リーダー重複配列(太字)を含む。オリゴヌクレオチド233HbackはCκ1重複配列(下線)を含む。オリゴヌクレオチド233LbackはCκ重複配列(下線)を含む。
ライブラリーA、BおよびC、ならびにmAb B233のキメラFabバージョンを、M13系ファージ発現ベクターにクローニングした。このベクターは、lacZプロモーターの制御下でヒトγ1重鎖の第1定常ドメインとヒトκ軽鎖の定常ドメインを含むFabフラグメントの発現を可能にする(図2)。クローニングは、ハイブリダイゼーション変異誘発(Kunkelら, Methods Enzymol. 154:367-382 (1987))を用いて、Wuら, Methods Mol. Biol. 207: 213-233 (2003)に記載されるように行った。簡単に述べると、二本鎖PCR産物を水酸化ナトリウムにより解離させ、ストレプトアビジンコーティング磁性ビーズによりビオチン化鎖を除去した後に、目的の各種V領域に対応するマイナス一本鎖DNA(6.3.2節、6.3.3節および6.3.4節参照)を最終PCR産物からエタノール沈殿により精製した(H. Wuら, Methods Mol. Biol. 207: 213-233(2003); H. Wu, Methods Mol. Biol. 207: 197-212 (2003))。等モル量の異なる次のマイナス鎖:VH-233/VL sub1、VH sub1/VL-8G7/VL-12C8、VH sub2/VL sub2、およびVH-233/VL-233を混合して、それぞれライブラリーA、ライブラリーB、ライブラリーC、およびキメラFab 233を構築した。その後、これらの異なる混合物を、それぞれ1つのパリンドロームループを含む前記ベクターの2つの領域に個別にアニールさせた。これらのループはユニークなXbaI部位を含み、これにより、ヒトκ定常領域および第1ヒトγ定常領域とそれぞれインフレームで融合されたVL鎖とVH鎖の両方を含むベクターの選択が可能となる。次に、合成されたDNAを、Wuら, Methods Mol. Biol. 207: 213-233 (2003)に記載されるように、XL1-Blue菌叢上でのプラーク形成またはFabフラグメントの作製のためにXL1-Blueにエレクトロポレーションした。
6.4.1 一次スクリーニング
6.4.1.1 説明
一次スクリーニングはシングルポイントELISA(SPE)からなり、これは、本質的にWuら, Methods Mol. Biol. 207: 213-233 (2003)に記載されるように、96深底ウェルプレートで増殖させて個々の組換えM13クローン(6.3.5節参照)を感染させた、1mLの細菌培養物から調製したペリプラズム(周辺細胞質)抽出物を用いて行った。簡単に述べると、96ウェルMaxisorp Immunoplateの各ウェルに20〜500ngのヤギ抗ヒトFab抗体をコーティングし、3% BSA/PBSを用いて37℃で2時間ブロックし、その後サンプル(ペリプラズムに発現されたFab)と共に室温で1時間インキュベートした。次に、300ng/ウェルのビオチン化ヒトEphA2-Fcを室温で1時間添加した。続いて、ニュートラビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートと共に室温で40分間インキュベートした。HRP活性をテトラメチルベンジジン(TMB)基質により検出し、この反応を0.2M H2SO4で停止させた。プレートを450nmで読み取った。
100ngのヤギ抗ヒトFab捕捉試薬を用いてスクリーニングしたライブラリーAからの約500個のクローンのうち、14個が有意なシグナル(OD450が0.2〜0.6)を示した。これは、典型的には、無関係な抗体(MEDI-493; S. Johnsonら, J. Infect. Dis. 176: 1215-1224 (1997))の対応するバックグラウンドシグナル(OD450が0.1〜0.4)を少なくとも1.3倍上回るシグナルに相当した。こうした条件下で、Fab 233は0.4〜0.6のOD450を示した。
まとめて、ライブラリーAからの9個のクローン、ライブラリーBからの7個のクローン、そしてライブラリーCからの0個のクローンが、第2の独立したシングルポイントELISAで、15mLの細菌培養物から調製したペリプラズム抽出物と500ngのヤギ抗ヒトFab捕捉試薬を用いて再確認された。詳細には、中でも最も高い[特異的OD450/バックグラウンドOD450]比(約15〜50の範囲)を示した、ライブラリーAからの2個のクローン(VH-233/VL-12C8およびVH-233/VL-8G7)を、ABI3000ゲノムアナライザを使ってジデオキシ塩基配列決定によりさらに特徴づけた。クローンVH-233/VL-12C8のDNA配列解析は、その重鎖が塩基104に単一塩基置換を含み、その結果として位置H35(Kabatナンバリング)に置換(NからS)が生じていることを明らかにした。この変異を、QuickChange XL部位特異的変異誘発キット(Stratagene, La Jolla, CA)を用いて製造業者の使用説明書に従って是正した。この是正クローンVH-233/VL-12C8は、最大で約50(変異型VH-233/VL-12C8と類似)の[特異的OD450/バックグラウンドOD450]比を示し、EphA2-Fcとの結合を保持していた。部分的にヒト化されたクローンVH-233/VL-12C8およびVH-233/VL-8G7はその後、二次スクリーニングによるさらなる特徴付けのために選択した(6.4.2節参照)。VL-12C8およびVL-8G7の配列を図3に示す。上述したように、これら2つのヒト化軽鎖をその後、ライブラリーBの設計に加えた。中でも最も高い[特異的OD450/バックグラウンドOD450]比(約40)を示した、このライブラリーからの3個のクローンを、ジデオキシ塩基配列決定によりさらに特徴付けた。これは、3つの異なるヒト化重鎖(VH-2G6、VH-6H11およびVH-7E8; 図3参照)の同定をもたらした。VH-2G6、VH-6H11およびVH-7E8は、それぞれVL-12C8、VL-8G7およびVL-8G7と対を形成することが分かった。次いでこれら3個の、十分にヒト化されたクローンを選択して、二次スクリーニングによるさらなる特徴付けを行った(6.4.2節参照)。
6.4.2.1 説明
先に同定したヒト化クローン(6.4.1.3節参照)をさらに特徴付けるために、15 mLの細菌培養物から調製したペリプラズム抽出物中の発現されたFabフラグメントを用いて二次スクリーニングを実施した。さらに詳しく述べると、2つのELISAを使用した: (i) 機能的ELISA、ここで、96ウェルMaxisorp Immunoplateの各ウェルに500ngのヒトEphA2-Fcをコーティングして、3% BSA/PBSを用いて37℃で2時間ブロックした。次に、2倍連続希釈したサンプルを加え、室温で1時間インキュベートした。その後、ヤギ抗ヒトκホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートとのインキュベーションを行った。HRP活性をTMB基質により検出し、0.2M H2SO4で反応を停止させた。プレートを450nmで読み取った; (ii) 抗ヒトFab定量ELISA、これは本質的にWuら, Methods Mol. Biol. 207: 213-233 (2003)に記載されるとおりに実施した。簡単に説明すると、96ウェルImmulon Immunoplateの各ウェルに100ngのヤギ抗ヒトFab抗体をコーティングし、次に2倍連続希釈したサンプル(1/25希釈で開始)または標品(ヒトIgG Fab、500〜3.91ng/ml)と共にインキュベートした。その後、ヤギ抗ヒトκホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートとのインキュベーションを行った。HRP活性をTMB基質により検出し、0.2M H2SO4で反応を停止させた。プレートを450nmで読み取った。
2部の二次ELISAスクリーニングにより、ヒトEphA2との結合に関してFabクローンVH-233/VL-12C8、VH-233/VL-8G7、VH-2G6/VL-12C8、VH-6H11/VL-8G7およびVH-7E8/VL-8G7を互いに比較し、さらにmAb B233のキメラFab(VH-233/VL-233)と比較することができた。図4に示すように、全てのフレームワークシャッフルしたFabは、mAb B233のキメラFabと比較して、ヒトEphA2との結合を保持している。興味深いことに、重鎖と軽鎖が両方ともヒト化されている一部のクローン(VH-2G6/VL-12C8およびVH-7E8/VL-8G7)は、同じ軽鎖のみがヒト化されているクローン(VH-233/VL-12C8およびVH-233/VL-8G7)よりも良好なヒトEphA2-Fcへの見かけの結合を示す。このことは、最適な抗原結合のために、所与のヒト化軽鎖との関係でヒト化重鎖を特異的に選択する方法が存在することを示している。十分にヒト化された分子をさらに特徴付けるために、クローンVH-2G6/VL-12C8、VH-6H11/VL-8G7およびVH-7E8/VL-8G7、ならびにmAb B233のキメラ体(VH-233/VL-233)をその後クローニングして、全長ヒトIgG1として発現させた(6.5節参照)。
フレームワークシャッフルしたクローンVH-2G6、VH-6H11、VH-7E8、VL-12C8およびVL-8G7の可変領域、ならびにVH-233およびVL-233の可変領域を、対応するV領域コード化M13ファージベクターから、pfu DNAポリメラーゼを用いてPCR増幅した。次いでそれらを、ヒトサイトメガロウイルス主要前初期(hCMVie)エンハンサー、プロモーターおよび5'-非翻訳領域をコードする哺乳動物発現ベクターに個々にクローニングした。M. Boshartら, Cell 41:521-530 (1985)。この系では、ヒトγ鎖がヒトκ鎖と共に分泌される。S. Johnsonら, Infect. Dis. 176:1215-1224 (1997)。別個の構築物をヒト胚性腎(HEK)293細胞において一過性に発現させ、トランスフェクションの72時間後に回収した。分泌された可溶性ヒトIgG1は、直接1mLのHiTrapプロテインAまたはプロテインGカラムで製造業者の使用説明書(APBiotech, Inc., Piscataway, NJ)に従って、馴らし培地から精製した。精製済みのヒトIgG1(典型的には、SDS-PAGEで判定して>95%の均一性)を2〜13μg/ml(馴らし培地)の収量で回収し、リン酸緩衝溶液(PBS)に対して透析し、瞬間凍結して-70℃で貯蔵した。
可溶性VH-2G6/VL-12C8、VH-6H11/VL-8G7、VH-7E8/VL-8G7およびVH-233/VL-233 IgGと、ならびにmAb B233と、固定化EphA2-Fcとの相互作用は、表面プラズモン共鳴検出によりBIAcore 3000装置(Pharmacia Biosensor, Uppsala, Sweden)を使ってモニタリングした。EphA2-Fcは、CM5センサーチップ(Pharmacia Biosensor)のデキストランマトリックスに、Amine Coupling Kitを用いて、記載される(B. Johnssonら, Anal. Biochem. 198: 268-277 (1991))ように105〜160 RUの表面密度でカップリングさせた。IgGは、0.15M NaCl、3mM EDTAおよび0.005% P20を含有する0.01M HEPES pH 7.4中に希釈した。その後の希釈はすべて、同一のバッファーで行った。全ての結合実験は、一般的に100nMから0.2nMまでのIgG濃度を用いて75μL/minの流速で25℃にて行った。データを約25分間収集し、1MNaCl、50mM NaOHの1分パルスを1回用いて表面を再生させた。また、IgGを非コーティングセル上にも流し、これらのブランク実験からのセンサーグラムを、EphA2-Fcをカップリングさせたチップを用いて得られたセンサーグラムから差し引いた。データは1:1 Langmuir結合モデルに適合させた。このアルゴリズムはkonとkoffの両方を計算し、そこから見かけの平衡解離定数KDを2つの速度定数の比(koff / kon)として推論する。得られた値を表66に示す。
ヒト化抗体の発現レベルをキメラ抗体の発現レベルと次のように比較した。ヒト胚性腎(HEK)293細胞を、一過的に様々な抗体構築物により35mm、6ウエルディッシュ内でリポフェクタミンと標準プロトコルを用いてトランスフェクトした。上清を2回、トランスフェクション後72および144時間に収穫した(それぞれ第1収穫物、第2収穫物と呼ぶ)。分泌された可溶性ヒトIgGIを次いでELISAにより産生収率について試験した。具体的には、2回、3日間隔で採集したトランスフェクション上清(前記参照)を、抗ヒトIgG ELISAを用いて抗体産生について試験した。ヤギ抗ヒトIgGをコートした96ウエルBiocoatプレート(BD Biosciences, San Jose, CA)の個々のウエルを、サンプル(上清)または標準(ヒトIgG、0.5-100 ng/ml)と共にインキュベートし、次いでヤギ抗ヒトIgG抗体のホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートと共にインキュベートした。ペルオキシダーゼ活性を、3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジンにより検出し、反応を0.2M H2SO4で停止した。プレートを450nmにて読み取り、濃度を決定した。いくつかのトランスフェクションと収穫物に対する収率(μg/ml)を表67に示した。ヒト化抗体の精製後の平均回収率も示した。
6.8.1 配列解析
全体で、ヒトEphA2-Fcへの効率的な結合を支援する2つのユニークなヒト化軽鎖(VL-12C8およびVL-8G7)と3つのユニークなヒト化重鎖(VH-2G6、VH-6H11およびVH-7E8)が見いだされた。ヒト化軽鎖VL-8G7の無差別な性質は、2つの異なる重鎖(VH-7E8およびVH-6H11)との関係で作製結合を媒介するその能力によって強調される。これらのヒト化変異体は全て、対応するフレームワーク領域において高レベルのmAb B233に対する全体的なアミノ酸同一性を示し、重鎖について76〜83%、軽鎖について64〜69%であった(図5)。このことは、高相同性のヒトフレームワークが親のキー残基を保持しているらしい、ということで説明できる。個々のフレームワークの解析は広範囲の相違を明らかにし、その相違は、VL-12C8の第1フレームワークについての48%からVH-2G6、VH-6H11およびVH-7E8の第4フレームワークについての91%までの範囲にわたる。
mAb B233の軽鎖および重鎖のヒト化に成功した2段階ヒト化方法(ライブラリーAおよびB)によって本発明者らがヒトEphA2-Fcとの結合を保持するヒト化クローンを単離できたということだけでは価値のないことである。実際、軽鎖と重鎖の両方を同時にヒト化したライブラリー(ライブラリーC)のスクリーニングによって、本発明者らは、この抗原と検出可能な結合を示す分子を回収できなかった。これはおそらく、最適状態に及ばないライブラリーの質、不完全なライブラリーのサンプリングおよび/またはライブラリーのタンパク質の非効率的な原核生物発現といった要因を反映している。本発明者らは、より多数のクローンをスクリーニングすれば、ヒトEphA2への結合を保持するヒト化抗体フラグメントが同定したであろうと予想する。
試薬
全ての化学薬品は分析グレードのものを使用した。制限酵素とDNA改変酵素はNew England Biolabs, Inc.(Beverly, MA)から購入した。SuperMix pfu DNAポリメラーゼとオリゴヌクレオチドはInvitrogen(Carlsbad, CA)から購入した。pfu ultra DNA ポリメラーゼはStratagene(La Jolla, CA)から購入した。ヒトEphA2-Fc融合タンパク質(ヒトIgG1のFc部分と融合されたヒトEphA2からなる;Carles-Kinchら, Cancer Res. 62: 2840-2847 (2002))はヒト胚性腎(HEK)293細胞において発現させ、標準的なプロトコルを用いてプロテインGアフィニティクロマトグラフィにより精製した。ストレプトアビジン磁性ビーズはDynal(Lake Success, NY)から購入した。ヒトEphA2-Fcのビオチン化は、EZ-Link Sulfo-NHS-LC-ビオチン化キット(Pierce, Rockford, IL)を用いて製造業者の使用説明書に従って実施した。
ヒト受容体チロシンキナーゼEphA2に対するモノクローナル抗体(mAb)を分泌するマウスハイブリドーマ細胞株(Coffmanら, Cancer Res. 63:7907-7912 (2003))をMedImmune, Inc.で作製した。このマウスmAbを以後EA2と呼ぶ(Coffmanら, Cancer Res. 63:7907-7912 (2003))。mAb EA2の可変重鎖(VH)および軽鎖(VL)遺伝子のクローニングおよび配列決定は、EA2分泌細胞株由来のメッセンジャーRNAをStraight AのmRNA精製キット(Novagen, Madison, WI)を用いて製造業者の使用説明書に従って単離・精製した後で実施した。cDNAは第1鎖cDNA合成キット(Novagen, Madison, WI)を用いて製造業者が推奨するとおりに合成した。VHおよびVL遺伝子の両方の増幅は、マウスIg-プライマーセット(Novagen, Madison, WI)からのIgGVHおよびIgκVLオリゴヌクレオチドを用いて製造業者が提案するとおりに実施した。産生増幅より得られるDNA断片は、Perfectly Bluntクローニングキット(Novagen, Madison, WI)を用いてpSTBlue-1にクローニングした。その後、ジデオキシチェーンターミネーション法(Sangerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74: 5463-5467 (1977))により、ABI3000シークエンサー(Applied Biosystems, Foster City, CA)を使って、多数のVHおよびVLクローンの配列決定を行った。mAb EA2 VL(VL-EA2)およびVH(VH-EA2)遺伝子の配列を図6に示す。
ヒトフレームワーク遺伝子を公的に利用できる抗体生殖系列遺伝子のプールから選択した。さらに詳しく述べると、これには、次が含まれた:
第1、第2および第3フレームワークについては46のヒト生殖系列κ鎖遺伝子:A1、A10、A11、A14、A17、A18、A19、A2、A20、A23、A26、A27、A3、A30、A5、A7、B2、B3、L1、L10、L11、L12、L14、L15、L16、L18、L19、L2、L20、L22、L23、L24、L25、L4/18a、L5、L6、L8、L9、O1、O11、O12、O14、O18、O2、O4およびO8(Schableら, Biol. Chem. Hoppe Seyler 374: 1001-1022 (1993);Brensig-Kuppers ら, Gene 191: 173-181 (1997));
第4フレームワークについては5つのヒト 生殖系列 Jκ配列:Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4 および Jκ5(Hieterら, J. Biol. Chem. 257: 1516-1522 (1982);
第1、第2および第3フレームワークについては44のヒト生殖系列重鎖遺伝子:VH1-18、VH1-2、VH1-24、VH1-3、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH1-8、VH2-26、VH2-5、VH2-70、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-7、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH3-9、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-4、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1およびVH7-81(Matsuda ら, J. Exp. Med. 188: 1973-1975 (1998));
第4フレームワークについては6つのヒト生殖系列JH配列: JH1、JH2、JH3、JH4、JH5およびJH6(Ravetch ら, Cell 27: 583-591 (1981))。
7.3.1 ライブラリーの説明
1つの主フレームワークシャッフルしたライブラリー(ライブラリーD)を構築した。ライブラリーDは、軽鎖フレームワークシャッフルしたサブライブラリー(VL sub3)と対合させた重鎖フレームワークシャッフルしたサブライブラリー(VH sub3)を含んだ。フレームワークシャッフルしたVHおよびVLサブライブラリーの構築は、表1〜7、11、68および69に示したオリゴヌクレオチドを用いて行った。さらに詳しく述べると、表1-7および11に記載のオリゴヌクレオチドは、それぞれKabat定義の軽鎖(κ)および重鎖に対する全ての公知のヒトフレームワーク生殖系列遺伝子の完全配列をコードする。これらのオリゴヌクレオチドは「普遍的」であっていずれの目的の遺伝子のヒト化にも用いることができる。表68および69に記載のプライマーはmAb EA2のCDRの部分をコードし、対応するヒト生殖系列フレームワークと重複する。表68については、AL1EA2〜13EA2およびDL1UEA2〜4UEA2を除いて、それぞれのオリゴヌクレオチドはmAb EA2の1つのCDRの部分(太字)と1つのヒト生殖系列軽鎖フレームワークの部分をコードする(Kabat定義;Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、U.S. Public Health Service、National Institutes of Health、Washington、DC、1991)。CDRL1、L2およびL3は、それぞれ、AL1UEA2〜10UEA2/BL1EA2〜10EA2、BL1UEA2〜16UEA2/CL1EA2〜11EA2、およびCL1UEA2〜12UEA2/DL1EA2〜4EA2によりコードされる。オリゴヌクレオチドAL1EA2〜13EA2はM13遺伝子3リーダー重複配列(下線部)を含有しそしてオリゴヌクレオチドDL1UEA2〜4UEA2はCκ重複配列(下線部)を含有する。K=GまたはT、M=AまたはC、R=AまたはG、S=CまたはG、W=AまたはTおよびY=CまたはTである。表69については、AH1EA2〜10EA2およびDH1UEA2〜3UEA2を除いて、それぞれのオリゴヌクレオチドはmAb EA2の1つのCDRの部分(太字)と1つのヒト生殖系列重鎖フレームワークの部分をコードする(Kabat定義)。CDRH1、H2およびH3は、それぞれAH1UEA2〜17UEA2/BH1EA2〜17EA2、BH1UEA2〜16UEA2/CH1EA2〜15EA2およびCH1UEA2〜13UEA2/DH1EA2〜3EA2によりコードされる。オリゴヌクレオチドAH1EA2〜10EA2はM13遺伝子3リーダー重複配列(下線部)を含有するが、オリゴヌクレオチドDH1UEA2〜3UEA2はCγ1重複配列(下線部)を含有する。K=GまたはT、M=AまたはC、R=AまたはG、S=CまたはG、W=AまたはTおよびY=CまたはTである。
フレームワークシャッフルしたVH sub3サブライブラリーをPCRを用いて重複伸長により合成した(Hoら, Gene 77: 51-59 (1989))。フレームワークシャッフルしたVH遺伝子の全in vitro合成を本質的に記載の通り行った(Wu, Method Mol. Biol. 207: 197-212 (2003))。簡単に説明すると、第1のいわゆる「融合PCR」は、pfu DNAポリメラーゼ(PCR SuperMix, Invitrogen)および表5、6、7、11および69に記載のオリゴヌクレオチドのそれぞれのほぼ1pmolを用いて50〜100μl反応体積で行った。融合PCRプログラムは、94℃で20秒、50℃で30秒、72℃で30秒を5サイクル、および94℃で20秒、55℃で30秒、72℃で30秒を25サイクルから構成された。次いで第2のいわゆる「合成PCR」は、pfuウルトラDNAポリメラーゼ、「融合PCR」産物の2〜4μl、オリゴヌクレオチドDH1UEA2、DH2UEA2、DH3UEA2(表69を参照)のそれぞれのほぼ30pmolおよびビオチン化オリゴヌクレオチド5’-GCTGGTGGTGCCGTTCTATAGCC-3’(配列番号1735)のほぼ100pmolを用いて50〜100μl反応体積で行った。合成PCRプログラムは、94℃で20秒、50℃で30秒、72℃で30秒を5サイクル、および94℃で20秒、55℃で30秒、72℃で30秒を30サイクルから構成された。
キメラFabポジティブ対照(VH-EA2+VL-EA2)として用いたVH-EA2およびVL-EA2の重鎖および軽鎖遺伝子は、PCRにより、対応するpSTBlue-1ベクター(7.1節を参照)から、それぞれEA2Hfor/EA2HbackおよびEA2Lfor/EA2Lbackオリゴヌクレオチドの組合わせを用いて合成した。
EA2Hback:5’-GGAAGACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCC-3’(配列番号1883)
EA2Lfor:5’-GGTCGTTCCATTTTACTCCCACTCCGACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCC-3’(ビオチン化)(配列番号1884)
EA2Lback:5’-GATGAAGACAGATGGTGCAGCCACAGTACGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCCCTCCGAA-3’(配列番号1885)
オリゴヌクレオチドEA2HforおよびEA2LforはM13遺伝子3リーダー重複配列(太字)を含有する。オリゴヌクレオチドEA2HbackはCγ1重複配列(下線)を含有する。オリゴヌクレオチドEA2LbackはCκ重複配列(下線)を含有する。
ライブラリーD、ならびにmAb EA2のキメラFabバージョンを、M13系ファージ発現ベクターにクローニングした。このベクターは、lacZプロモーターの制御下でヒトγ1重鎖の第1定常ドメインとヒトκ軽鎖の定常ドメインを含むFabフラグメントの発現を可能にする(図2)。クローニングは、ハイブリダイゼーション変異誘発(Kunkelら, Methods Enzymol. 154:367-382 (1987))を用いて、Wuら, Methods Mol. Biol. 207: 213-233 (2003)に記載されるように行った。簡単に述べると、二本鎖PCR産物を水酸化ナトリウムにより解離させ、ストレプトアビジンコーティング磁性ビーズによりビオチン化鎖を除去した後に、目的の各種V領域に対応するマイナス一本鎖DNA(7.3.2節、7.3.3節を参照)を最終PCR産物からエタノール沈殿により精製した(Wuら, Methods Mol. Biol. 207: 197-212(2003);Wu, Methods Mol. Biol. 207: 213-233 (2003))。等モル量の次の異なるマイナス鎖:VH-EA2/VL EA2およびVH sub3/VL sub3を混合して、それぞれキメラEA2およびライブラリーDを構築した。その後、これらの異なる混合物を、それぞれ1つのパリンドロームループを含む前記ベクターの2つの領域に個別にアニールさせた。これらのループはユニークなXbaI部位を含み、これにより、消化された親テンプレートを用いて、ヒトκ定常領域および第1ヒトγ定常領域とそれぞれインフレームで融合されたVL鎖とVH鎖の両方を含有するベクターの選択が可能となる(Wu, Method Mol. Biol. 207: 197-212 (2003); Wu ら, Method Mol. Biol. 207: 213-233 (2003))。次に、合成されたDNAを、Wuら, Methods Mol. Biol. 207: 213-233 (2003)に記載されるように、XL1-Blue菌叢上でのプラーク形成またはFabフラグメントの生産のためにXL1-Blueにエレクトロポレーションした。
7.4.1 一次スクリーニング
7.4.1.1 説明
一次スクリーニングはシングルポイントELISA(SPE)からなり、これは、本質的にWuら, Methods Mol. Biol. 207: 197-212 (2003)に記載されるように、96深底ウェルプレートで増殖させて個々の組換えM13クローン(7.3.5節を参照)を感染させた、1mLの細菌培養物から調製したペリプラズム(周辺細胞質)抽出物を用いて行った。簡単に述べると、96ウェルMaxisorp Immunoplateの各ウェルに1μgのヤギ抗ヒトFab抗体をコーティングし、3% BSA/PBSを用いて37℃で2時間ブロックし、その後サンプル(ペリプラズムに発現されたFab)と共に室温で2時間インキュベートした。次に、300〜600ng/ウェルのビオチン化ヒトEphA2-Fcを室温で2時間添加した。続いて、ニュートラビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートと共に室温で40分間インキュベートした。HRP活性をテトラメチルベンジジン(TMB)基質により検出し、この反応を0.2M H2SO4で停止させた。プレートを450nmで読み取った。
7.4.1.1節に記載のようにスクリーニングしたライブラリーDからの1200クローンのうち、1つの特定のクローン(以後、4H5と呼ぶ)は有意なシグナル(OD450=3)を示した。これは、典型的には、無関係な抗体の対応するバックグラウンドシグナル(OD450=0.3)を10倍超えるシグナルに対応した。これらの条件下で、Fab EA2も3のOD450を示した。
クローン4H5を、第2の、独立した、シングルポイントELISAで、15ml細菌培養から調製した周辺質抽出物(Wu, Method Mol. Biol. 207: 197-212 (2003))および1μg/ウエルのヤギ抗-ヒトFd捕捉試薬を用いて7.4.1.1節に記載の通り再確認した。これらの条件下で、クローン4H5はほぼ30(EA2と類似)の[特異的OD450/バックグラウンドOD450]比を示した。クローン4H5をさらに、ジデオキシヌクレオチド配列決定によりABI 3000ゲノムアナライザーを用いて特徴付けた(Sanger ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 5463-5467 (1977))。DNA配列分析は、その軽鎖CDR3が単一塩基置換(GAGからGTGへ)を含有し、位置L93(Kabat番号)にて置換(EからVへ)をもたらすことを明らかにした。この突然変異を、QuickChange XL部位特異的変異誘発キット(Stratagene、La Jolla、CA)を用いて製造業者取扱説明書に従い是正した。
「是正した」クローン4H5をシングルポイントELISAで、45ml細菌培養から調製した周辺質抽出物(Wu, Method Mol. Biol. 207: 197-212 (2003))および1μg/ウエルのヤギ抗-ヒトFd捕捉試薬を用いて7.4.1.1節に記載の通り特徴付けた。これらの条件下で、「是正した」クローン4H5はほぼ11の[特異的OD450/バックグラウンドOD450]比、クローン4H5はほぼ23の[特異的OD450/バックグラウンドOD450]比、そしてEA2はほぼ15の[特異的OD450/バックグラウンドOD450]比を示した。この結果は、「是正した」クローン4H5がEphA2-Fcと良い結合を保持することを示した。クローン4H5とそのCDRL3是正したバージョンを次に二次スクリーニングにより特徴付けた(7.4.2節を参照)。それらのマウス対応物(EA2)とアラインメントした4H5とその是正したバージョンの配列を図7に示した。
7.4.2.1 説明
先に同定したヒト化クローン(7.4.1節を参照)をさらに特徴付けるために、45 ml細菌培養から調製した周辺質抽出物に発現されたFabフラグメント(Wu, 方法 Mol. Biol. 207: 197-212 (2003))を用いて二次スクリーニングを行った。さらに詳しく述べると、2つのELISAを用いた:
(i)機能性ELISA(この場合、98ウエルMaxisorp Immunoplateの個々のウエルをほぼ500ngのヒトEphA2-Fcによりコートしかつ3%BSA/PBSにより2時間37℃にてブロックした)。2倍連続希釈したサンプルを次に加え、1時間室温にてインキュベートした。次いでヤギ抗-ヒトκホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートを用いてインキュベートした。HRP活性はTMB基質を用いて検出しそして反応を0.2M H2SO4を用いて停止した。プレートを450nmで読み取った;
(ii)抗-ヒト Fab定量ELISA(これは、本質的にWu、Method Mol. Biol. 207: 197-212 (2003)に記載の通り行った)。簡単に説明すると、96ウエルBIOcoatプレート(BD Biosciences、CA)の個々のウエルを、2倍連続希釈したサンプルまたは標準(ヒト IgG Fab、25-0.39 ng/ml)を用いてインキュベートした。次いでヤギ抗-ヒトκホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートを用いてインキュベートした。HRP活性はTMB基質を用いて検出しそして反応を0.2M H2SO4を用いて停止した。プレートを450nmで読み取った。
7.4.2.1節に記載した2部の二次ELISAスクリーニングにより、Fabクローン4H5をそのCDRL3是正バージョンとお互いにおよびmAb EA2のキメラFabと、ヒトEphA2との結合について比較することが可能になる。図8に示すように、両方のフレームワークシャッフルしたFabは、mAb EA2のキメラFabと比較すると、より優れたヒトEphA2との結合を示す。そのバージョンと比較すると、クローン4H5がより優れたヒトEphA2との結合を示す事実は、CDRL3の変化が親和性増強効果を有することを示す。
7.5.1 配列分析
総合すると、1つのユニークなヒト化軽鎖(VL-4H5)と1つのユニークなヒト化重鎖(VH-4H5)は、お互いとの組合せで、ヒトEphA2-Fcとの効率的な結合を支援することがわかった。このヒト化変異体は、mAb EA2に対して、軽鎖および重鎖について、それぞれ67〜78%の範囲の高レベルの全体的なアミノ酸同一性を示した(図9)。これは、高相同性ヒトフレームワークが親キー残基を保持するらしいと思われる事実により、部分的に説明しうる。個々のフレームワークの分析は、VH-4H5の第2のフレームワークについての57%からVH-4H5の第1のフレームワークについての83%にわたる広い範囲の相違を明らかにした。
本明細書に記載の事例においては、mAb EA2の軽鎖と重鎖とを同時にヒト化したワンステップヒト化プロセス(ライブラリーD)によって、キメラ分子と比較して、ヒトEphA2-Fcと有意に優れた結合を示す1つのヒト化クローンを同定することが可能になった。この手法はまた、ヒトEphA2-Fcとさらに優れた結合親和性をもつ1つのヒト化親和性成熟クローンを単離することも可能にする。
フレームワークシャッフルしたクローン4H5および「是正した」4H5の可変領域を、M13ファージベクターをコードする対応するV領域からpfu DNAポリメラーゼを用いてPCR増幅した(7.4.1.2節を参照)。次いでこれらを個々に、ヒトサイトメガロウイルス主最初期(hCMVie)エンハンサー、プロモーターおよび5'-非翻訳領域をコードする哺乳動物発現ベクター中にクローニングした(M. Boshart、ら、1985、Cell 41:521-530)。この系において、ヒトγ1鎖はヒトκ鎖とともに分泌される(S. Johnson、ら、1997、Infect. Dis. 176:1215-1224)。色々な構築物が一過的にHEK293細胞において発現され、そしてトランスフェクション後72および144時間に収穫される。分泌された可溶ヒトIgG1を、馴らし培地から直接、1ml HiTrapタンパク質Aまたはタンパク質Gカラムで、製造業者(APBiotech、Inc.、Piscataway、NJ)の取扱説明書に従い精製した。精製したヒトIgG1(SDS-PAGEより判断して、典型的には>95%相同性)をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)に対して透析し、フラッシュ凍結して-70℃にて貯蔵した。
可溶VH-4H5/VL-4H5(または「4H5」)およびVH-4H5/VL-「是正した」4H5(または「是正した」4H5)IgGの、ならびにmAbEA2の、固定されたEphA2-Fcとの相互作用を、BIAcore 3000計器(Pharmacia Biosensor、Uppsala、Sweden)を用いて表面プラズモン共鳴検出によりモニタリングした。EphA2-Fcを、CM5センサーチップ(Pharmacia Biosensor)のデキストランマトリックスと、記載(B. Johnsson ら, 1991, Anal. Biochem. 198: 268-277)のようにアミンカップリングキットを用いて、ほぼ500 RUの表面密度にてカップリングした。IgGを、0.15M NaCl、3mM EDTAおよび0.005% P20を含有する0.01M HEPES pH 7.4で希釈した。全ての希釈は同じバッファーで行った。全ての結合実験は、25℃で、典型的には100 nM〜0.2 nMのIgG濃度にて、75μL/minの流速で実施した;データはほぼ25分間採取し、そして2つの1M NaCl、50mM NaOHの30秒パルスを用いて表面を再生した。IgGを無コートのセル上にも流し、これらのブランク試験からのセンサーグラムをEphA2-Fc-カップリングチップについて得たセンサーグラムから差し引いた。データを1:1 Langmuir結合モデルに適合させた。このアルゴリズムはkonおよびkoffの両方を計算し、これから、見かけの平衡解離定数、KDを2つの定数の比(koff/kon)として推論した。得た値を表70に示した。
抗体の可変ドメインの融点(Tm)が変性および凝集にある役割を果たすことは公知である。一般に、より高いTmはより優れた安定性とより低い凝集と相関がある。フレームワークシャッフルの方法は可変領域を改変するので、おそらく、フレームワークシャッフルした抗体のTmが変化したのであろう。キメラB233およびフレームワークシャッフルした抗体のTmは示差走査熱量計(DSC)によりVP-DSC(MicroCal、LLC)を用いて、1.0℃/minの速度で温度、25〜110℃の温度範囲にわたり測定した。8秒の濾過時間ならびに15分間の走査前恒温(pre-scan thermostating)を採用した。サンプルを、Pierce透析カセット(3.5kD)を用いて、10mMヒスチジン-HCl、pH6中に透析した。Mab濃度はA280により測定して200-400μg/mLであった。融点は、そのシステムと共に供給されたOriginソフトウエアを用いて、製造業者の取扱説明者に従い決定した。簡単に説明すると、複数のベースラインは、サンプルおよび対照セルの両方にバッファーを流して熱平衡を確立して試験した。サンプルサーモグラムからベースラインを差し引いた後に、データを濃度正規化しそしてデコンボリューション関数を用いて適合させた。いくつかの抗体は、分子内のサブドメインから生じる複数のピークをもつ複雑なプロファイルを有するが、Fabドメインの融点は無傷の抗体のDSC走査で観察される最も大きいピークを作ることが公知である。この分析の目的で、最も大きいピークの温度をFabのTmとして用いた。精製されたフラグメントとして分析すると、全ての全長IgGを作製するために用いたFcドメインは2つの主要Tmピークをほぼ67℃および 83℃に有する(図10、上段左パネル)。しかし、これらのピークは、無傷の抗体を分析するときに、Fabドメインが分子に与えるコンフォメーションと安定性の変化によって、若干シフトしうる。
本発明の多くの修飾および変更が、その精神および範囲を逸脱することなく可能であるが、このことは当業者には明らかであろう。本明細書中に引用された全ての文献は、個々の刊行物、特許または特許出願があらゆる目的のために参照することにより本明細書に組み入れられるように具体的かつ個別に示されているのと同程度に、あらゆる目的のためにその全体を参照することにより本明細書に含めるものとする。さらに、米国特許出願第60/496,367号(2003年8月18日出願)、米国特許出願第10/920,899号(2004年8月18日出願)、米国特許出願第60/662,945号(2005年3月18日出願)および米国特許出願第60/675,439号(2005年4月28日出願)は、それぞれ参照によりその全てが組み入れられる。
Claims (8)
- 抗原と免疫特異的に結合し、改善された融点(T m )を有するヒト化抗体を作製する方法であって、
(a) 改変された重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列をそれぞれ含む複数のポリヌクレオチド配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、ただしここでの該CDRは前記抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体重鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域核酸配列はヒト重鎖フレームワーク領域をコードする複数の核酸配列を含むサブバンク由来である前記ステップ;
(b) 前記複数のポリヌクレオチド配列を細胞の集団中に導入し、かつドナー軽鎖可変領域、ヒト化軽鎖可変領域および改変された軽鎖可変領域からなる群より選択される軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を該細胞中に導入するステップ、ただしここでのCDRはドナー抗体軽鎖可変領域由来である;
(c) 改変された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ;
(d) 抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ;ならびに
(e)改善された融点(T m )を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、改善がドナー抗体と比較してT m の約5℃〜20℃の増加であるステップ
を含んでなる前記方法。 - 抗原と免疫特異的に結合し、改善された融点(T m )を有するヒト化抗体を作製する方法であって、
(a) 改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む複数のポリヌクレオチド配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、ただしここでの該CDRは前記抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体軽鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域核酸配列はヒト軽鎖フレームワーク領域をコードする複数の核酸配列を含むサブバンク由来である前記ステップ;
(b) 前記複数のポリヌクレオチド配列を細胞の集団中に導入し、かつドナー重鎖可変領域、ヒト化重鎖可変領域および改変された重鎖可変領域からなる群より選択される重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を該細胞中に導入するステップ、ただしここでのCDRはドナー抗体重鎖可変領域由来である;
(c) 改変された軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ;
(d) 抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ;ならびに
(e)改善された融点(T m )を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、前記改善がドナー抗体と比較してT m の約5℃〜20℃の増加であるステップ
を含んでなる前記方法。 - 抗原と免疫特異的に結合し、改善された融点(T m )を有するヒト化抗体を作製する方法であって、
(a) 改変された重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列をそれぞれ含む複数のポリヌクレオチド配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、ただしここでの該CDRは前記抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体重鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域核酸配列はヒト重鎖フレームワーク領域をコードする複数の核酸配列を含むサブバンク由来である前記ステップ;
(b) 改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列をそれぞれ含む複数のポリヌクレオチド配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、ただしここでの該CDRは前記抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体軽鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域核酸配列はヒト軽鎖フレームワーク領域をコードする複数の核酸配列を含むサブバンク由来である前記ステップ
(c) ステップ(a)および(b)で作製したポリヌクレオチド配列を細胞の集団中に導入するステップ;
(d) 改変された重鎖可変領域および改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ;
(e) 抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ;ならびに
(f)改善された融点(T m )を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、改善がドナー抗体と比較してT m の約5℃〜20℃の増加であるステップ
を含んでなる前記方法。 - 抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体の融点(Tm)を改善する方法であって、
(a) 改変された重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列をそれぞれ含む複数のポリヌクレオチド配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、ただしここでの該CDRは前記抗原と免疫特異的に結合する前記ドナー抗体重鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域核酸配列はヒト重鎖フレームワーク領域をコードする複数の核酸配列を含むサブバンク由来である前記ステップ;
(b) 前記複数のポリヌクレオチド配列を細胞の集団中に導入しかつドナー軽鎖可変領域、改変された軽鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域からなる群より選択される軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を該細胞中に導入するステップ、ただしここでのCDRはドナー抗体軽鎖可変領域由来である;
(c) 改変された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ;
(d) 抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ;ならびに
(e)改善された融点(Tm)を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、該改善がドナー抗体と比較してTmの約5℃〜20℃の増加であるステップ
を含んでなる前記方法。 - 抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体の融点(Tm)を改善する方法であって、
(a) 改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列をそれぞれ含む複数のポリヌクレオチド配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、ただしここでの該CDRは前記抗原と免疫特異的に結合する前記ドナー抗体軽鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域核酸配列はヒト軽鎖フレームワーク領域をコードする複数の核酸配列を含むサブバンク由来である前記ステップ;
(b) 前記複数のポリヌクレオチド配列を細胞の集団中に導入しかつドナー重鎖可変領域;改変された重鎖可変領域;およびヒト化重鎖可変領域からなる群より選択される重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を該細胞中に導入するステップ、ただしここでのCDRはドナー抗体重鎖可変領域由来である;
(c) 改変された軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ;
(d) 抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ;ならびに
(e)改善された融点(Tm)を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、前記改善がドナー抗体と比較してTmの約5℃〜20℃の増加であるステップ
を含んでなる前記方法。 - 抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体の融点(Tm)を改善する方法であって、
(a) 改変された重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列をそれぞれ含む複数のポリヌクレオチド配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、ただしここでの該CDRは前記抗原と免疫特異的に結合する前記ドナー抗体重鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域核酸配列はヒト重鎖フレームワーク領域をコードする複数の核酸配列を含むサブバンク由来である前記ステップ;
(b) 改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列をそれぞれ含む複数のポリヌクレオチド配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、ただしここでの該CDRは前記抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体軽鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域核酸配列はヒト軽鎖フレームワーク領域をコードする複数の核酸配列を含むサブバンク由来である前記ステップ
(c) ステップ(a)および(b)で作製したポリヌクレオチド配列を細胞の集団中に導入するステップ;
(d) 改変された重鎖可変領域および改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ;
(e) 抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ;ならびに
(f)改善された融点(Tm)を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、前記改善がドナー抗体と比較してTmの約5℃〜20℃の増加であるステップ
を含んでなる前記方法。 - 前記フレームワーク領域サブバンクが、ヒト生殖細胞系列フレームワーク配列由来のフレームワーク領域および/または機能性ヒト抗体配列由来のフレームワーク領域を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 抗体が、配列番号1890または1892のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、配列番号1891または1893のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒトEphA2ポリペプチドに結合する抗体。
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