JP4996791B2 - エンドトキシン吸着体、及びそれを用いたエンドトキシンの除去方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エンドトキシン吸着体、及びそれを用いたエンドトキシンの除去方法に関する。更に詳しくは、排除限界分子量をコントールしたエンドトキシン吸着体およびそれを用いたエンドトキシンの除去方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エンドトキシンは細菌の菌体成分中にある毒性物質の総称であり、菌が死滅する際に遊離してくるものである。エンドトキシンの構造成分はリポポリサッカライドであり、医薬品の生産プロセス中に生息する細菌が菌体内に生産し、死滅することによって、医薬品に混入する。エンドトキシンの除去方法としては、従来から、活性炭やイオン交換体による吸着体、膜やメンブレンフィルター等を使う濾過法、高温・高圧処理または酸、アルカリを使う分解法が知られている。いずれの方法も一長一短があり、工業的に用いるには問題があった。例えば、医薬品製造におけるエンドトキシンの除去は、本来の医薬品の安定性維持の面から、過酷な条件下で行う事ができなかったり、存在するエンドトキシンの量がごく微量であるため、実験室的には吸着がうまく行えても、実際の工業スケールでは満足に吸着が行えなかったり、吸着体に医薬品そのものが吸着されたりして決して満足の行くものではなかった。
【０００３】
これに対して近年、工業的にも満足の行くエンドトキシンの吸着を可能にすべく、いくつかの吸着体が提案されている。特公平６−１６８４３号公報には、側鎖及び／または主鎖の末端に、脂肪族基及び／またはアリール基を有する修飾基を含むポリアミノ酸より構成される吸着体が開示され、特開平１−１２７０３９号公報には、ポリアミノ酸球状粒子を担体とし、これにイミダゾール誘導体を結合させた吸着体が開示されている。
【０００４】
また、日本化学会誌 No.8, P726 〜730 (1994)には、ポリエチレンイミンをセルロ−ス繊維に橋かけ剤を用いて固定化した吸着剤のエンドトキシン吸着能の研究結果が報告されている。
【０００５】
さらに、J. LIQ. CHROM. & REL. TECHNOL., 23(12), 1887-1902 (2000)には、Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドをＮ−プロピレンアクリルアミド、Ｎ、Ｎ'−ブチレン−ビス−メタクリルアミド（ＢＢＭＡ）、ジビニルベンゼンを架橋剤として用いたエンドトキシン吸着体の吸着能の研究結果が報告されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらの吸着体にはエンドトキシン含有医薬品や血液などのように蛋白等を高濃度で含む溶液から、エンドトキシンのみを除去するには選択性が不足しており、本来吸着されるべきではない酸性蛋白質などがエンドトキシンとともに吸着されてしまうという問題点があった。
【０００７】
本発明者らは、前述の従来の問題点に鑑み、鋭意検討を重ねた。その結果、特定の基材に特定の塩基性物質を橋かけ剤を介して結合した排除限界分子量が制御された吸着体であれば、エンドトキシンの選択吸着能力が高く、この吸着体を用いれば、エンドトキシンを含有する医薬品や血液などの高濃度の蛋白等を含む液体から、高い選択性でエンドトキシンを除去することが可能であることを見いだし、この知見に基づいて本発明を完成した。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は下記から構成される。
【０００９】
（１）基材に、橋かけ剤を介して塩基性物質が結合した排除限界分子量が多糖類で６０００以下であるエンドトキシン吸着体。
【００１０】
（２）基材が、セルロ−ス、アガロ−ス、キトサン、キチン、デンプン、マンナンの中から選ばれる多糖類、該多糖類の誘導体もしくはアクリルアミド、メタアクリルアミド、アクリル酸、アクリル酸エステル、メタアクリル酸、メタアクリル酸エステル、酢酸ビニル、塩化ビニル、スチレンもしくはアリル化合物の中から選ばれるモノマ−の重合体やこれらのモノマ−の２種以上の共重合体である前記第１項記載のエンドトキシン吸着体。
【００１１】
（３）基材が、セルロ−ス、アガロ−ス、キトサン、キチン、デンプン、マンナンの中から選ばれる多糖類、該多糖類の誘導体もしくはアクリル酸、アクリル酸エステル、メタアクリル酸、メタアクリル酸エステル、酢酸ビニル、塩化ビニル、スチレンもしくはアリル化合物の中から選ばれるモノマ−の重合体やこれらのモノマ−の２種以上の共重合体である前記第１項記載のエンドトキシン吸着体。
【００１２】
（４）基材がセルロ−スもしくはその誘導体である前記第１項記載のエンドトキシン吸着体。
【００１３】
（５）基材が、糖類で排除限界分子量６０００以下の多孔性セルロ−スもしくはその誘導体である前記第１項〜第４項のいずれか１項記載のエンドトキシン吸着体。
【００１４】
（６）基材が排除限界分子量２０００以下の多孔性セルロ−スもしくはその誘導体である前記第１項〜第４項のいずれか１項記載のエンドトキシン吸着体。
【００１５】
（７）塩基性物質がε−ポリ−Ｌ−リジン、α−ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−ヒスチジン、ポリ−アルギニン、ポリ−トリプトファン、ポリオルニチン、ポリ-２，4ジアミノブチリックアシッド、ポリ−２，３ジアミノプロピオン酸、プロタミン、ポリアリルアミン、アリルアミンとジアリルアミン共重合物、ポリジアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリミキシン、ストレプトマイシン、アミカシン、カナマイシンから選ばれた１種以上である前記第１項記載のエンドトキシン吸着体。
【００１６】
（８）塩基性物質が、ε−ポリ−Ｌ−リジンもしくはα−ポリ−Ｌ−リジンである前記第１項記載のエンドトキシン吸着体。
【００１７】
（９）橋かけ剤が、ヘキサメチレンジイソシアネ−ト、ｍ−キシレンジイソシアネ−ト、トルエン−２，４−ジイソシアネ−ト、ジグリシジルエ−テル、エピクロヒドリンおよびハロゲン化エピクロヒドリンの中から選ばれる１種以上の橋かけ剤である前記第１項記載のエンドトキシン吸着体。
【００１８】
（１０）前記第１項〜第９項のいずれか１項記載のエンドトキシン吸着体を用いることを特徴とするエンドトキシンの除去方法。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のエンドトキシン吸着体に用いる基材としては、セルロース、アガロース、キトサン、キチン、デンプン、マンナンなどの多糖類とその誘導体や、アクリルアミド類、メタアクリルアミド類、アクリル類、メタアクリル類、ビニル類、アリル類またこれらの誘導体などのモノマ−類の重合体や該モノマ−類の２種以上の共重合体を挙げることができ、好ましくはセルロース、アガロース、キトサン、キチン、デンプン、マンナンなどの多糖類とその誘導体や、アクリル類、メタアクリル類、ビニル類、アリル類またこれらの誘導体などのモノマ−類の重合体や該モノマ−類の２種以上の共重合体が挙げられる。なかでも、セルロ−スもしくはその誘導体が好ましく、より好ましくは糖類で排除限界分子量が６０００以下の多孔性セルロ−スもしくはその誘導体、特に好ましくは糖類で排除限界分子量が２０００以下の多孔性セルロ−スもしくはその誘導体である。
【００２０】
本発明のエンドトキシン吸着体は、排除限界分子量が制御された吸着体であり、基材に橋かけ剤を介して塩基性物質が結合した吸着体、特に塩基性物質を水不溶性担体の基材に橋かけ剤を介して結合させた吸着体が製造の容易さの点から好ましい。
【００２１】
排除限界分子量とは吸着剤が有する細孔に入り込めない大きさの分子量のことであり、その測定方法はカラムに吸着剤を充填して分子量既知の物質を流しその溶出位置から求めることができる。分子量既知の物質としては、糖類では単糖、２糖、オリゴ糖、プルランなどがあり、合成分子ではポリエチレングリコールやポリエチレンオキサイドが挙げられる。また、球状タンパク質も排除限界分子量を求める分子量既知の物質として使用される。排除限界分子量は測定した分子量既知物質の系列によって異なる値になる場合が普通であるが、これは分子形態が線状であったり球状であったりする事が原因である。そのため、糖類で測定された排除限界分子量はタンパク質で測定した値とは異なる。
【００２２】
水不溶性担体とは、担体を構成する成分が非水溶性、水溶性の物質を架橋反応などの処理を行うことにより水不溶性とした物質からなる担体であり、具体的には、前記基材と同様のアガロース、デキストラン、セルロース、キトサン、キチン、デンプン、マンナンなど多糖類ゲルとその架橋物およびポリビニルアルコール、ポリアクリルアミドなどの合成高分子を挙げることができる。
【００２３】
また、本発明に用いる基材の形状は、球状粒子、中空糸状、膜状など、いずれでもよく、特に限定されるものではないが、中でも球状粒子である場合には、製造、取り扱いが容易であり本発明に好ましく使用することができる。
【００２４】
中空糸状の基材とは、内部に連続または不連続の空洞を持つ繊維状の基材をいい、紡糸液に発泡剤を添加、または特殊な口金などを用いて内部に空洞を形成させたものである。
【００２５】
膜状の基材とは、市販のメンブランフィルターのように平板状で多孔を有し、一定の範囲の排除限界分子量を持つもののことである。
【００２６】
多孔性セルロース粒子やアガロース粒子、キトサン粒子などは商業的に製造されており入手が容易であり本発明に好ましく使用することができる。また特にセルロース粒子は機械的強度が強く工業的な規模での吸着剤として利用が可能であり特に本発明に好ましく使用することができる。
【００２７】
かかる基材の製造方法は特に限定されるものではないが、球状セルロース粒子の場合を例に説明する。
例えば、特開昭５３−８６７４９号に記載のように、セルロース酢酸エステルを有機溶媒中に溶解し、この溶液を水性媒体中に懸濁させることによってセルロース酢酸エステルを球状化し、次いで有機溶媒を蒸発させてセルロースエステル粒子を得、これをケン化後、セルロース粒子とすることによって、本発明に好ましい、多孔性球状セルロース粒子を得ることができる
【００２８】
本発明に用いる基材は、好ましくは排除限界分子量は、糖類で６０００以下であり、特に好ましくは、糖類で２０００以下の多孔性を有する基材である。
【００２９】
本発明に用いる塩基性物質は、ε−ポリ−Ｌ−リジン、α−ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−ヒスチジン、ポリ−アルギニン、ポリ−トリプトファン、ポリオルニチン、ポリ-２，4ジアミノブチリックアシッド、ポリ−２，３ジアミノプロピオン酸などの側鎖に塩基性基を持つアミノ酸の縮合物、プロタミン、ポリアリルアミン、アリルアミンとジアリルアミン共重合物、ポリジアリルアミン、ポリビニルアミンなどの合成高分子化合物、ポリミキシン、ストレプトマイシン、アミカシン、カナマイシンなどの塩基性抗生物質から選ばれた１種以上を挙げることができる。
【００３０】
本発明の塩基性物質として好ましく使用できる塩基性基を持つアミノ酸の縮合物としては、ε−ポリ−Ｌ−リジンがあげれらる。該ε−ポリ−Ｌ−リジンは、ストレプトマイセス族の微生物を培養することにより生産されるもので、有機合成で製造されるα−ポリ−Ｌ−リジンに比較して安価に製造できる利点がある。該ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法としては特公昭５９−２０３５９号に記述されている方法を例示することができる。すなわち、ストレプトマイセスアルブラスをグリセロ−ル、硫酸アンモニウム酵母エキス等を含む培養液で培養後、分離、精製することにより得られる。
【００３１】
塩基性物質と基材との結合は、反応性の官能基を有する橋かけ剤を介して行えばよく、公知の方法を用いて行えばよい。その中でも、塩基性物質に含まれる１級〜３級のアミノ基と基材との結合は、該反応性の官能基を有する橋かけ剤としてエポキシ化合物を用いるとリガンドである塩基性物質と、基材とが強固に共有結合することから、得られる吸着体をエンドトキシンの除去に使用しても、リガンドである塩基性物質の離脱が起こりにくく好ましい。
【００３２】
該エポキシ化合物を用いて、塩基性物質と基材とを結合させる方法として、具体的には、基材を、ビスオキシランやエピクロルヒドリンと反応させてエポキシ基を導入し、このエポキシ基と塩基性物質の１級〜３級のアミノ基を反応させる方法や、基材のジオール部分を過よう素酸で酸化して形成されたアルデヒド基に塩基性物質の１級アミノ基を還元的に固定化する方法や、基材をエピクロルヒドリンでエポキシ化後、アミノ化して無水コハク酸と反応させてカルボキシル基を導入し、もしくはエポキシ化後、アミノカルボン酸類を反応させてカルボキシル基を導入し、この末端カルボキシル基と塩基性物質の１級アミノ基を縮合させる方法や、前記の方法で得られた、カルボキシル基を導入した基材とＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて活性タイプ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化物）として塩基性物質のアミノ基と結合させる方法を挙げることができる。
【００３３】
塩基性物質の橋かけ反応に用いる橋かけ剤としては、特に限定されないが、ヘキサメチレンジイソシアネ−ト、ｍ−キシレンジイソシアネ−ト、トルエン−２，４−ジイソシアネ−ト等の２官能性の化合物、ジグリシジルエ−テル等の２個のエポキシ基を有する化合物やエピクロヒドリンおよびハロゲン化エピクロヒドリンの中から選ばれる１種以上の橋かけ剤をあげることができる。なかでもエピクロヒドリンを橋かけ剤に用いると反応が容易であり好ましい。該橋かけ反応の反応方法や反応条件は、使用する橋かけ剤毎に好ましいものを選択すべきであるが、一般的には不活性の分散媒中で撹拌しながら行うか、もしくは水溶液中で塩基性物質と橋かけ剤とを懸濁重合させることにより行うことができる。その際の橋かけ剤の添加量も特に限定されないが１〜１００モル％、好ましくは５〜５０モル％、より好ましくは２〜１０モル％である。
【００３４】
発明のエンドトキシン吸着体を用いて、エンドトキシンを含む液体からエンドトキシンを選択除去する方法は特に限定されるものではないが、血液中のエンドトキシンの除去や、医薬品の最終工程など、高濃度の蛋白成分など含む溶液からエンドトキシンを除去する際に特に有効である。その際の具体的な形態は、特に限定されるものではなく、本発明のエンドトキシン吸着体を適当な緩衝液で洗浄した後、エンドトキシンを含む溶液中に添加し攪拌した後、吸着体をろ別等により分離除去するバッチ法、また、本発明のエンドトキシン吸着体をカラムに充填し、適当な緩衝液で洗浄した後エンドトキシンを含む医薬品や血液などの目的物溶液を通液させ、素通り画分を回収する事により分離除去するカラム法などを挙げることができる。また、カラム法の場合、精製の最終プロセスに組み込んで行う形態がより好ましい。
【００３５】
血液中のエンドトキシンを除去する際には、患者の体内から取り出された血液、或いは血球と分離された血漿成分を、患者の体内に戻す直前に、本発明のエンドトキシン吸着体を充填したカラムに通し、該血液若しくは該血漿成分中のエンドトキシンが取り除かれた状態の血液を患者の体内に戻す体外循環治療の形態であることが好ましい。
【００３６】
【実施例】
以下、本発明について実施例及び比較例を用いて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３７】
排除限界分子量の測定法
測定用試料を内径０．８ｃｍ、長さ３０ｃｍのカラムに充填して純水を流して平衡化させたのち、５ｍｇ/ｍｌの濃度で純水に溶解した糖類の分子量標準を１０μＬ注入する。流速は１ｍｌ/ｍｉｎで検出は視差屈折計を使用し溶出液量を求めて各標準の分子量と溶出位置のグラフを作成し排除限界分子量を求める。
【００３８】
実施例１
排除限界分子量が糖類でおよそ１０００の球状セルロース粒子100g（湿重量）を、200mlの純水に懸濁させ、撹拌しながら３０℃に昇温させた後、該懸濁液に２０％ＮａＯＨ溶液６０mlを加え、１時間撹拌した。次いでエピクロロヒドリン６０ｇを加え、２時間撹拌し反応させた。反応終了後、ろ過し、中性まで水洗した。このようにして得られたエポキシ活性化セルロース粒子100g（湿重量）に純水９０ｍｌ、ε−ポリ−Ｌ−リジン２５％溶液（チッソ株式会社製、平均分子量4、700）３０ｍｌを加え、４５℃で２時間撹拌し反応させた。反応終了後水洗し、エンドトキシン吸着体（以下「粒子A」）を得た。
【００３９】
比較例１
排除限界分子量が糖類でおよそ１００００の球状セルロース粒子を使用する以外は実施例１に準拠してエンドトキシン吸着体（以下「粒子Ｂ」）を得た。
【００４０】
比較例２
排除限界分子量が糖類でおよそ２００００００の球状セルロース粒子を使用する以外は実施例１に準拠してエンドトキシン吸着体（以下「粒子Ｃ」）を得た・
【００４１】
１．エンドトキシン選択除去実験
１０ｍｌの三角フラスコに実施例と比較各例で調製したエンドトキシン吸着体を０．２ｇ（湿重量）を量り入れ、大腸菌由来のエンドトキシン（ＬＰＳ：和光純薬製）１００ｎｇ/ｍｌと牛血清アルブミン（ＢＳＡ）５００μｇ／ｍｌを含んだリン酸緩衝液ｐＨ７（イオン強度を食塩で調整した）２ｍｌを加え３０℃で２時間振盪した。振盪終了後、上澄みをサンプリングし０．４５μｍのメンブランフィルターでろ過した液についてエンドトキシン濃度を測定した。エンドトキシンの測定は市販のキット（リムルスＥＳ−IIテスト和光、和光純薬製）を用いて行った。
ポアサイズの大きい粒子Ｃ（比較例２で得られた粒子）はイオン強度が低いとＢＳＡを顕著に吸着する傾向があり、エンドトキシンは除去できなかった。比較例１で得られた粒子ＢはＢＳＡの吸着が粒子Ｃより緩和されるが、イオン強度が０．２以下ではまだＢＳＡの吸着量が７０％近くあり、エンドトキシンの除去はできない。実施例１で得られた粒子Ａはイオン強度が低くても殆どＢＳＡの吸着が見られずエンドトキシンの選択除去が可能あった。
【００４２】
２．吸着剤の排除限界分子量の測定
粒子Ａ、Ｂ、Ｃの排除限界分子量を前記の排除限界分子量の測定法を用いて測定し、その結果を図２に示した。この図２から分かるように、粒子Ａは６０００以上の分子が溶出体積が変化しない事から６０００以上の分子量のものは拡散不可能と測定され、グラフに示された直線交点から排除限界分子量はおよそ２０００程度と測定された。同様に粒子Ｂはおよそ４８０００、粒子Ｃはおよそ２００００００と測定された。
【００４３】
【発明の効果】
本発明の吸着体は、エンドトキシンの吸着能力が高く、エンドトキシンを含有する高濃度の蛋白溶液や血液等から、高い選択性でエンドトキシンを除去することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例、比較各例で得られた吸着体を用いて、ＢＳＡとエンドトキシンとの吸着性の比較を示した図。
【図２】実施例、比較各例で得られた吸着体の排除限界分子量の測定結果を示した図。

Claims (8)

1. 基材に、橋かけ剤を介してε−ポリ−Ｌ−リジンが結合した排除限界分子量が糖類で６０００以下であるエンドトキシン吸着体。
2. 基材が、セルロ−ス、アガロ−ス、キトサン、キチン、デンプン、マンナンの中から選ばれる多糖類、該多糖類の誘導体もしくはアクリルアミド、メタアクリルアミド、アクリル酸、アクリル酸エステル、メタアクリル酸、メタアクリル酸エステル、酢酸ビニル、塩化ビニル、スチレンもしくはアリル化合物の中から選ばれるモノマ−の重合体やこれらのモノマ−の２種以上の共重合体である請求項１記載のエンドトキシン吸着体。
3. 基材が、セルロ−ス、アガロ−ス、キトサン、キチン、デンプン、マンナンの中から選ばれる多糖類、該多糖類の誘導体もしくはアクリル酸、アクリル酸エステル、メタアクリル酸、メタアクリル酸エステル、酢酸ビニル、塩化ビニル、スチレンもしくはアリル化合物の中から選ばれるモノマ−の重合体やこれらのモノマ−の２種以上の共重合体である請求項１記載のエンドトキシン吸着体。
4. 基材がセルロ−スもしくはその誘導体である請求項１記載のエンドトキシン吸着体。
5. 基材が、糖類で排除限界分子量６０００以下の多孔性セルロ−スもしくはその誘導体である請求項１〜請求項４のいずれか１項記載のエンドトキシン吸着体。
6. 基材が、糖類で排除限界分子量２０００以下の多孔性セルロ−スもしくはその誘導体である請求項１〜請求項４のいずれか１項記載のエンドトキシン吸着体。
7. 橋かけ剤が、ヘキサメチレンジイソシアネ−ト、ｍ−キシレンジイソシアネ−ト、トルエン−２，４−ジイソシアネ−ト、ジグリシジルエ−テル、エピクロヒドリンおよびハロゲン化エピクロヒドリンの中から選ばれる１種以上の橋かけ剤である請求項１記載のエンドトキシン吸着体。
8. 請求項１〜７のいずれか１項記載のエンドトキシン吸着体を用いることを特徴とするエンドトキシンの除去方法。

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