JP4870941B2 - High molecular compound - Google Patents
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本発明は、ヘッド−テイル型の高分子化合物に関する。詳しくは、本発明は、薬物運搬システム(DDS)等の分野において有用な核酸類と安定に複合体形成する部位（テイル部）と、複合体の保護層としての機能及びpH低下により状態変化する機能を有する部位（ヘッド部）とを有する新規な高分子化合物に関する。 The present invention relates to a head-tail type polymer compound. Specifically, in the present invention, the site (tail part) that stably forms a complex with nucleic acids useful in the field of drug delivery system (DDS), etc., the function as a protective layer of the complex, and the state change due to pH reduction The present invention relates to a novel polymer compound having a functional part (head part).
最近、医薬品医療の分野において、薬物や遺伝子の体内分布を時間的又は空間的に正確に制御することによって、「必要なとき（timing）に、必要な部位(location)で、必要な薬物治療(action)」を最小限の副作用で達成する高精度ターゲティング治療に対する関心が高まっている。この治療法を首尾よく達成するためには、ナノスケールで精密設計された高機能化薬物運搬体の開発が最も重要な課題となっている。なかでも、最近は治療用遺伝子DNAを運搬するための安全性に優れた高分子材料が盛んに開発されている。 Recently, in the field of pharmaceutical medicine, by precisely controlling the distribution of drugs and genes in time or space, "the necessary drug treatment at the necessary location (timing) ( There is growing interest in high-precision targeting therapies that achieve "action" "with minimal side effects. In order to successfully achieve this treatment, the development of highly functional drug carriers precisely designed at the nanoscale has become the most important issue. In particular, polymer materials excellent in safety for carrying therapeutic gene DNA have been actively developed recently.
これまでに、DNAなどの核酸類がアニオン性であることから、カチオン性の脂質や高分子などの化合物と水溶液中での静電相互作用によって複合体形成させ、運搬体として利用することが試みられてきた（非特許文献１参照）。
カチオン性高分子では、その性質から大別して２つのタイプの高分子に関して遺伝子運搬体（ベクター）としての利用が検討されてきた。１つは、カチオン性を示す官能基（アミノ基）が生理的pH条件下（pH 7.4）でイオン化しているものであり、ポリリシンやポリアルギニンが代表的である。このようなタイプのカチオン性高分子は、DNAと強固な複合体を形成することが特徴である。このタイプのカチオン性高分子は、血清蛋白質などの電解質が共存する条件においても安定に存在するというベクターとしての利点を有するが、一方で核酸類が機能発現するためには最終的に核酸類は複合体から放出されなければならないが、放出しにくいという欠点にもなっている。 Cationic polymers are roughly classified into two types according to their properties, and their use as gene carriers (vectors) has been studied. One is a functional group (amino group) having a cationic property ionized under physiological pH conditions (pH 7.4), and polylysine and polyarginine are typical. This type of cationic polymer is characterized by forming a strong complex with DNA. This type of cationic polymer has the advantage of being a vector that exists stably even in the presence of electrolytes such as serum proteins. On the other hand, in order for nucleic acids to function, Although it must be released from the composite, it also has the disadvantage of being difficult to release.
もうひとつのタイプは、カチオン性を示す官能基の一部または多くが生理的pH条件下においてイオン化していないものであり、ポリエチレンイミンやポリアミドアミンデンドリマーが代表的で、これらは分子内に１級アミノ基だけでなく、２級・３級アミノ基を有しており、これらが生理的pH条件下でイオン化していない官能基となっている。このタイプのカチオン性高分子は、エンドソーム、リソソームと呼ばれる細胞内のpHが低い部位に取り込まれた際に、pH低下を抑制するプロトンスポンジ効果と呼ばれる効果を示すことが特徴である。このタイプのカチオン性高分子は、血清蛋白質が存在しない培養細胞系ではプロトンスポンジ効果によって、比較的高い遺伝子発現を示すが、血清蛋白質を共存させると、発現は低下する。これは、イオン化していないカチオン性を示す官能基が存在するために核酸類との複合体が、血清蛋白質が共存するために解離してしまうためである。 The other type is one in which some or many of the cationic functional groups are not ionized under physiological pH conditions, such as polyethyleneimine and polyamidoamine dendrimers, which are primary in the molecule. It has not only amino groups but also secondary and tertiary amino groups, which are functional groups that are not ionized under physiological pH conditions. This type of cationic polymer is characterized by exhibiting an effect called a proton sponge effect that suppresses a decrease in pH when it is taken into a site of low pH in cells called endosomes and lysosomes. This type of cationic polymer shows a relatively high gene expression due to the proton sponge effect in a cultured cell system in which no serum protein is present, but the expression decreases when the serum protein coexists. This is because a complex with a nucleic acid is dissociated due to the coexistence of serum proteins due to the presence of functional groups that are not ionized and exhibit cationic properties.
しかしながら、２つのタイプのカチオン性高分子のベクターとしての利点と欠点は相反するものであり、２つのタイプの利点を組み合わせたベクターの開発が有効であるが、２つの利点を発揮しうるカチオン性高分子は開発されていない。すなわち、核酸類と強固な複合体を形成する機能とプロトンスポンジ効果を発現する機能を併せ持つカチオン性の高分子化合物の開発が望まれていた。 However, the advantages and disadvantages of the two types of cationic polymers as vectors are contradictory, and the development of a vector that combines the advantages of the two types is effective. No polymer has been developed. That is, it has been desired to develop a cationic polymer compound having both a function of forming a strong complex with nucleic acids and a function of developing a proton sponge effect.
そこで、本発明は、血清蛋白質等の電解質が共存する状態においても安定な遺伝子ベクターとして利用することができる高分子化合物を提供することを目的とする。
また、本発明は、核酸類と強固な複合体を形成する機能ととともに、プロトンスポンジ効果を発現する機能を併せ持つ薬物運搬体として、カチオン性の高分子化合物を提供することを目的とする。
Therefore, an object of the present invention is to provide a polymer compound that can be used as a stable gene vector even in the presence of an electrolyte such as a serum protein.
Another object of the present invention is to provide a cationic polymer compound as a drug carrier having a function of forming a strong complex with nucleic acids and a function of developing a proton sponge effect.
すなわち、上記課題を解決するためになされた本発明の高分子化合物は、分子量が２５０〜７５００００である直鎖状のポリリシンと、世代が０．５〜４．５であるポリアミドアミンデンドロンとを有するヘッド−テイル型高分子化合物であり、化学式（１）で表されるようにしている。 That is, the polymer compound of the present invention made to solve the above problems has a linear polylysine having a molecular weight of 250 to 750,000 and a polyamidoamine dendron having a generation of 0.5 to 4.5. heads - a tail type polymer compound, so that formula (1).
本発明によれば、強固な複合体を形成するカチオン性高分子とプロトンスポンジ効果を発現するカチオン性高分子とからなる高分子とが結合した化合物を得ることができ、優れた薬物運搬体とすることができる。これにより、生体内で分解されやすい荷電性薬物を安定化して体内に投与することができる。 According to the present invention, it is possible to obtain a compound in which a cationic polymer that forms a strong complex and a polymer that consists of a cationic polymer that expresses the proton sponge effect are combined. can do. Thereby, the chargeable drug which is easily decomposed in the living body can be stabilized and administered into the body.
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。上記の通り、本発明は、強固な複合体を形成するカチオン性高分子部位（テイル部）とプロトンスポンジ効果を発現するカチオン性高分子部位（ヘッド部）からなる高分子化合物を提供するものである。
本発明における高分子化合物は、ヘッド部、テイル部ともに各種のものが本発明に包含される。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail. As described above, the present invention provides a polymer compound comprising a cationic polymer portion (tail portion) that forms a strong complex and a cationic polymer portion (head portion) that expresses the proton sponge effect. is there.
Various polymer compounds in the present invention include both the head portion and the tail portion.
ヘッド部としては、例えばポリアミドアミンデンドロン、ポリアミドアミンデンドリマー等の3級アミノ基を有する分岐状高分子（デンドリマー）、又はそれらの誘導体由来の各種のセグメント等が例示される。 Examples of the head portion include branched polymers having a tertiary amino group (dendrimer) such as polyamide amine dendron and polyamide amine dendrimer, and various segments derived from derivatives thereof.
テイル部としては、例えば荷電性側鎖を有するポリアミノ酸、より具体的には、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン等が、あるいはポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、ポリビニルイミダゾール等が挙げられる。さらに、これらのポリアミノ酸の誘導体由来のセグメント等が例示されている。 Examples of the tail portion include polyamino acids having a charged side chain, more specifically, polylysine, polyarginine, polyhistidine and the like, or polyethyleneimine, polyvinylamine, polyallylamine, polyvinylimidazole and the like. Furthermore, segments derived from derivatives of these polyamino acids are exemplified.
これらのヘッド部とテイル部を有する高分子化合物としては、例えば、その代表的構造として、次式（Ｉ）で示されるポリアミドアミンデンドロンのヘッド部とポリリシンをテイル部とする高分子化合物が挙げられる。
（Ｉ）
Examples of the polymer compound having the head part and the tail part include, as a typical structure, a polymer compound having a head part of polyamidoamine dendron represented by the following formula (I) and a polylysine as the tail part. .
(I)
上記高分子化合物は、まず、片末端に保護基の導入されたエチレンジアミンに対して過剰量のアクリル酸メチルをマイケル付加反応により、その後、エチレンジアミンをエステルアミド交換反応させるという過程を繰り返すことによって、ヘッド部であるポリアミドアミンデンドロンを得ることができる。このヘッド部のポリアミドアミンデンドロンの世代数は、0.5から4.5まで0.5世代ごとに可変である。次に、ポリアミドアミンデンドロンの保護基を酸処理によって除去した後、ε−ベンジルオキシカルボニル L−リシン無水物を重合させる。この重合によって得られる部位の分子量は約250〜750000まで可変である。この高分子化合物を酸処理して脱ベンジルオキシカルボニル化を行うことにより、ヘッド部としてポリアミドアミンデンドロンをテイル部としてポリリシンを有する高分子化合物を得ることができる。 The above polymer compound first repeats the process of subjecting an ethylene diamine having a protective group introduced at one end to an excessive amount of methyl acrylate by a Michael addition reaction, followed by an ester amide exchange reaction of ethylene diamine. Part of polyamidoamine dendron can be obtained. The number of generations of polyamidoamine dendrons in the head portion is variable from 0.5 to 4.5 every 0.5 generations. Next, after removing the protecting group of the polyamidoamine dendron by acid treatment, ε-benzyloxycarbonyl L-lysine anhydride is polymerized. The molecular weight of the site obtained by this polymerization is variable from about 250 to 750,000. By subjecting this polymer compound to acid treatment and debenzyloxycarbonylation, a polymer compound having polylysine as a head portion and polyamidine as a tail portion can be obtained.
本発明において、上記高分子化合物と静電的に複合体形成できる薬物としては、特にその種類に限定されるものではない。ここで、「薬物」とは、前記荷電性セグメントとは反対の荷電性を有する低分子又は高分子物質を意味し、例えばペプチドホルモン、タンパク質、酵素、核酸（DNA又はRNA）等の高分子性薬物が例示される。反対荷電とは、分子の一方が正に、他方が負に帯電していることを意味し、複数の異なる帯電状態の官能基を有する分子の場合は、pHを変化させることによって分子全体としての帯電状態の正、負を変化させる場合も含む。同じ荷電を有する場合は、反対荷電を有する官能基を有する化合物を反応させ、分子の帯電状態を変化させる処理をすることにより、一方の分子を他方の分子に対して反対荷電にすることができる。 In the present invention, the drug capable of forming an electrostatic complex with the above polymer compound is not particularly limited to the type. Here, “drug” means a low-molecular or high-molecular substance having a chargeability opposite to that of the charged segment, for example, a high molecular weight such as peptide hormone, protein, enzyme, nucleic acid (DNA or RNA), etc. Drugs are exemplified. Opposite charge means that one of the molecules is positively charged and the other is negatively charged. In the case of a molecule having a plurality of differently charged functional groups, the pH of the molecule is changed to change the molecule as a whole. This includes the case where the positive and negative charge states are changed. When they have the same charge, one molecule can be made oppositely charged with respect to the other molecule by reacting a compound having a functional group with opposite charge and changing the charged state of the molecule. .
例えば、上記式（Ｉ）により示される高分子化合物にプラスミドDNAやアンチセンスオリゴDNA等の核酸類を複合体形成させる場合には、高分子化合物の水溶液を適切な混合比、イオン強度及びｐＨ等の条件に設定し、高分子化合物の水溶液に上記核酸類水溶液を混合すればよい。 For example, when a nucleic acid such as plasmid DNA or antisense oligo DNA is complexed to the polymer compound represented by the above formula (I), an aqueous solution of the polymer compound is mixed with an appropriate mixing ratio, ionic strength, pH, etc. The above nucleic acid aqueous solution may be mixed with an aqueous solution of a polymer compound.
以上の通り、本発明のヘッド−テイル型の高分子化合物は、安定なDNA等の荷電物質と複合体形成することができる。このため、生体内で分解されやすい荷電性薬物を安定化して体内投与することができる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は実施例に限定されるものではない。
As described above, the head-tail polymer compound of the present invention can form a complex with a stable charged substance such as DNA. For this reason, the chargeable drug which is easily degraded in the living body can be stabilized and administered in the body.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to the examples.
〔実施例１〕
ポリアミドアミンデンドロンとポリリシンからなるヘッド−テイル型高分子化合物の酸塩基滴定
ポリアミドアミンデンドロンとポリリシンからなるヘッド−テイル型高分子化合物（ポリアミドアミンデンドロン世代数3.5、ヘッド−テイル型高分子化合物１本鎖当たり重合度70のポリリシン）を0.05M塩酸に溶解した後、0.01M水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによって滴定した。
[Example 1]
Acid-base titration of head-tail type polymer compound consisting of polyamidoamine dendron and polylysine Head-tail type polymer compound consisting of polyamidoamine dendron and polylysine (polyamideamine dendron generation number 3.5, head-tail type polymer compound single chain Polylysine having a degree of polymerization of 70) was dissolved in 0.05M hydrochloric acid, and then titrated by adding a 0.01M aqueous sodium hydroxide solution dropwise.
得られた酸塩基滴定曲線図を図２に示す。ヘッド−テイル型高分子化合物が、二つの独立した脱プロトン過程を示すことが確認された。また、テイル部は生理的pH(7.4)ではほぼすべてプロトン化しており複合体形成可能な状態であることが確認された。ヘッド部は、生理的pH（7.4）では、ほとんどプロトン化しておらず、プロトンスポンジ効果を発現できる状態であることが確認された。 The obtained acid-base titration curve is shown in FIG. It was confirmed that the head-tail type polymer compound exhibits two independent deprotonation processes. In addition, it was confirmed that the tail part was almost protonated at physiological pH (7.4) and was in a state capable of forming a complex. It was confirmed that the head portion was hardly protonated at physiological pH (7.4) and was in a state where the proton sponge effect could be expressed.
〔実施例２〕
ポリアミドアミンデンドロンとポリリシンからなるヘッド−テイル型高分子化合物とプラスミドDNAからの複合体調製
ポリアミドアミンデンドロンとポリリシンからなるヘッド−テイル型高分子化合物（ポリアミドアミンデンドロン世代数3.5、ヘッド−テイル型高分子化合物１本鎖当たり重合度70のポリリシン）をトリス緩衝液（塩濃度10mM、pH7.4）に、プラスミドDNAをトリス緩衝液に溶解した後、この各々の溶液を種々混合比で混合した。ポリリシンとプラスミドDNA、ポリアミドアミンデンドロンとプラスミドDNAについても同様に混合した。
得られた混合溶液について、DNA可視化色素としてエチジウムブロミドを含有したアガロースゲル電気泳動を行った。また、ルミノイメージアナライザーUV-LAS1000mini（富士写真フィルム社）により画像解析を行い、複合体形成していないDNA量を定量した。
[Example 2]
Preparation of head-tail type polymer compound consisting of polyamidoamine dendron and polylysine and plasmid DNA Head-tail type polymer compound consisting of polyamidoamine dendron and polylysine (polyamideamine dendron generation number 3.5, head-tail type polymer) Polylysine having a polymerization degree of 70 per compound chain was dissolved in Tris buffer (
The obtained mixed solution was subjected to agarose gel electrophoresis containing ethidium bromide as a DNA visualization dye. In addition, image analysis was performed with a lumino image analyzer UV-LAS1000mini (Fuji Photo Film Co., Ltd.), and the amount of DNA not forming a complex was quantified.
ヘッド−テイル型高分子化合物の結果を図３に示す。ヘッド−テイル型高分子化合物と混合していないプラスミドDNAについては、DNAのバンドのみが検出される。ヘッド−テイル型高分子化合物の混合比が増加するに伴い、DNAのバンドが消失していくことが確認され、ヘッド−テイル型高分子化合物とプラスミドDNAが複合体形成することが確認された。 The results of the head-tail type polymer compound are shown in FIG. For plasmid DNA not mixed with the head-tail type polymer compound, only the DNA band is detected. It was confirmed that the DNA band disappeared as the mixing ratio of the head-tail type polymer compound increased, and that the head-tail type polymer compound and the plasmid DNA formed a complex.
複合体形成していないDNA量を定量した結果を図４に示す。図４において、ヘッド−テイル型高分子化合物（◆）、ポリリシン（■）、ポリアミドアミンデンドロン（▲）である。縦軸は複合体形成していないDNAの比率、横軸は混合された高分子化合物量である。ヘッド−テイル型高分子化合物とポリリシンについては、高分子化合物の混合比が増加するに従い、複合体形成していないDNA量が減少し、最終的にはすべてのDNAと複合体形成していることが確認された。ポリアミドアミンデンドロンの混合によっては、複合体形成していないDNA比率には変化が生じないことが確認された。
以上のことから、ヘッド−テイル型高分子化合物は、テイル部でDNAと複合体形成し、ヘッド部はプロトンスポンジ効果を発現できる複合体であることが確認された。
The result of quantifying the amount of DNA not forming a complex is shown in FIG. In FIG. 4, a head-tail type polymer compound (♦), polylysine (■), and polyamide amine dendron (▲). The vertical axis represents the ratio of DNA not forming a complex, and the horizontal axis represents the amount of polymer compound mixed. As for the head-tail type polymer compound and polylysine, the amount of uncomplexed DNA decreases as the polymer compound mixing ratio increases, and finally all DNA is complexed. Was confirmed. It was confirmed that the mixing ratio of the polyamidoamine dendron does not change the ratio of DNA not forming a complex.
From the above, it was confirmed that the head-tail type polymer compound was complexed with DNA at the tail portion, and the head portion was a complex capable of expressing the proton sponge effect.
本発明の高分子化合物は、血清蛋白質等の電解質が共存する状態においても安定な遺伝子ベクターとして利用することができる。 The polymer compound of the present invention can be used as a stable gene vector even in the presence of electrolytes such as serum proteins.
Claims (1)
世代が０．５〜４．５であるポリアミドアミンデンドロンとを有するヘッド−テイル型高分子化合物であり、下記化学式（１）で表されることを特徴とする高分子化合物。
A head-tail type polymer compound having a polyamidoamine dendron having a generation of 0.5 to 4.5, and represented by the following chemical formula (1):
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