JP4848573B2

JP4848573B2 - Methods for removing or detoxifying free lipoteichoic acid from liquids

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Publication number: JP4848573B2
Application number: JP36402499A
Authority: JP
Inventors: 真弓福山; 敬史三和; ルミ子酒井
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 1999-12-22
Publication date: 2011-12-28
Anticipated expiration: 2019-12-22
Also published as: JP2000237586A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リポタイコ酸（以下ＬＴＡと略する）の毒素活性を失わせる（解毒）あるいは除去する材料に関するものである。特に血液中等の高濃度の蛋白質溶液中に存在するＬＴＡと結合することによってＬＴＡの毒素活性を失わせる（解毒）薬剤として、ＬＴＡを除去する浄化カラムあるいは被覆材料として好適に用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
近年ＬＴＡは、グラム陽性菌敗血症の原因と考えられ様々な研究が行われている。例えば、培養血管平滑筋細胞の一酸化窒素合成酵素を発現誘導すること（Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．,２０,Ｓ１４５−Ｓ１４７（１９９２））、ラットへの静脈内投与により血圧低下やノルアドレナリンによる昇圧反応の低下が起こること（Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｅｍａｃｏｌ．,１４４,１３１７−１３２３（１９９５））、動物に胸腔内投与することによって、胸腔内への好中球の浸潤が認められ胸膜炎病態が発症すること（特開平９−１６３８９６）、またＬＴＡとペプチドグリカンをラットに共投与すると、ショックや臓器障害が起こること（Ｊ．ＥｘｐＭｅｄ．，１８８（２），３０５−３１５（１９９８））などが報告されている。これに対して、一酸化窒素の産生が抗マウスＣＤ１４抗体（ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｎｎ，２３３（２），３７５−３７９（１９９７））あるいは、Ｎ（ｏｍｅｇａ）−ｎｉｔｒｏ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ（ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｎｎ，６５（６），２０７４−２０７９（１９９７））で抑制されること、マウスへのＬＴＡ投与によるショック死を血小板活性化因子拮抗剤が抑制すること（特開平９−２０８４９３）が報告されており、アミノグアニジンやデキサメタゾン（ＢｒＪＰｈａｒｍａｃｏｌ．１１９（７），１４１１−１４２１（１９９６））の効果も検討されている。しかし、これらは全てＬＴＡによって開始される炎症反応の後期産生物質をターゲットとしており、ＬＴＡ自身をターゲットとした医薬品の報告はない。一方、医療用材料としては、ポリミキシン−Ｂ固定化繊維が、黄色ブドウ球菌培養上清（１０％ヒト血漿添加培地で希釈）によるＴＮＦ−α産生を２０％低下させるという報告（ＡＳＡＩＯＪ，４４（１），４８−５３（１９９８））がある。しかし、培養上清には種々の毒素が含まれており、ＬＴＡの除去は確認されておらず、また効果も２０％と低い。このように、血漿のような高蛋白質溶液においてＬＴＡと高い親和性を有するような材料はこれまで知られていなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はこれら従来技術の欠点を解消しようとするものであり、血液などの高蛋白質濃度の溶液中においてもＬＴＡの毒素活性を迅速に失わせる（解毒）あるいは除去できる材料を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明においては、上記課題を解決するため、下記の構成を有する。
【０００５】
(1) ウサギ血漿中のリポタイコ酸の除去率がウサギ血漿中において６０％以上、アルブミンおよび／あるいはナトリウムの除去率が１０％以下であるリポタイコ酸除去用あるいは解毒用材料材料。また、
(2)上述した材料を用いた体液浄化カラムあるいは被覆材料。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明において、ＬＴＡとは、グラム陽性菌、例えばストレプトコッカス属、ミクロコッカス属、ラクトバチルス属、スタフィロコッカス属、バチルス属、エンテロコッカス属等の細胞膜および細胞壁を構成する物質である。ストレプトコッカス属では化膿性連鎖球菌や肺炎連鎖球菌等が、スタフィロコッカス属では黄色ブドウ球菌や表皮ブドウ球菌等が挙げられる。
【０００７】
ＬＴＡは、リビトールやグリセロールがホスホジエステル結合で連結したポリマーで、これに糖やＤ−アラニンが付いている。末端に脂溶性の脂肪酸を持っているため、細胞質膜に結合し、細胞壁を貫通している（医科細菌学吉川昌之介編南江堂より）。
【０００８】
本発明の材料は、ウサギ血漿中のリポタイコ酸の除去率がウサギ血漿中において６０％以上、アルブミンおよび／あるいはナトリウムの除去率が１０％以下であり、さらに好ましくは白血球、リポタンパク質および医薬品から選ばれる少なくとも１つの除去率が１５％以下であるという特徴を有する。「アルブミンおよび／あるいはナトリウムの除去率が１０％以下」とは、アルブミン除去率が１０％であるか、ナトリウムの除去率が１０％以下であるか、アルブミン、ナトリウムのいずれの除去率も１０％以下であることを意味する。又、「白血球、リポタンパク質および医薬品から選ばれる少なくとも１つの除去率が１５％以下」とは、白血球、リボタンパク質、医薬品のうち、少なくとも１つについて、除去率が１０％以下であることを意味する。
【０００９】
ここで、リポタイコ酸の除去率、また、アルブミンおよび／あるいはナトリウムおよび／あるいは白血球および／またはリポタンパク質および／あるいは医薬品の除去率の測定法としては種々考えられるが、測定法の違い、例えば吸着体と被吸着液との容積比や被吸着液中の夾雑物濃度や反応時間、撹拌の有無等により除去率が変動すると考えられる。本発明における除去率の測定を以下に示す。
【００１０】
ウサギ血漿とは、１０週令のニュージーランドホワイトウサギ（雄）から採血した、総蛋白濃度が４．８〜５．８ｇ／ｄｌで白血球数４５００〜６５００／ｍｍ３、ヘマトクリット値４０〜４３％、ナトリウム濃度が１３０〜１４０ｍｍｏｌ／ｌ、かつリポタイコ酸に対する抗体がない血漿である。ウサギよりヘパリン（５Ｕ／ｍｌ）を用いて採血し、１５００Ｇ、１０分間遠心分離後の血漿を除去率の測定に用いた。吸着体３５ｍｇを血漿０．５ｍｌ中に添加し、反応温度は３７℃、反応時間は２時間、旋回撹拌の条件において吸着を行った。吸着前後における目的物質の濃度を測定し、下式（１）を用いて除去率を計算した。
【００１１】
（Ｃ０−Ｃ）／Ｃ０・・・・・・・（１）式
ここで、Ｃ０は目的物質の吸着前の溶液中の初期濃度、Ｃは目的物質の吸着後の溶液中の濃度である。
【００１２】
ここでは、血液成分のバラツキの少ないウサギ血漿を用いたが、ヒト、イヌ、マウス、ウシ、ヒツジ等の哺乳動物の血漿を用いても同様の除去率が得られる。
【００１３】
本発明において、水素結合形成可能な官能基としては特に限定はなく、例えば、尿素結合、チオ尿素結合、アミド基、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、アルデヒド基、メルカプト基などが挙げられるが、尿素結合、チオ尿素結合、アミド結合、アミノ基および水酸基から選ばれる少なくとも一つ有することが好ましい。水素結合形成可能な基に続く構造としては特に限定はなく、プロパン、ヘキサン、オクタン、ドデカンなどの脂肪族化合物やシクロヘキサン、シクロペンタンのような脂環族化合物を用いることができるが、親和性の高さを考慮するとベンゼン、ナフタレン、アントラセン等の芳香族化合物がより好ましく用いられる。ブロモヘプタン、クロロシクロヘキサン、メチルベンゼン、クロロベンゼン、ニトロベンゼン、ジフェニルメタン、クロロナフタレン等の誘導体も好適に用いられる。また、水素結合形成可能な基を二つ以上有することがより好ましく、さらには、異なる官能基であることが好ましい。特に尿素結合、チオ尿素結合あるいはアミド結合に続く構造として例えば、アミノ基、水酸基、カルボキシル基等の水素結合形成可能な官能基をさらに有する構造が好ましく用いられる。例えばアミノ基を有する構造としては、アミノヘキサン、モノメチルアミノヘキサン、ジメチルアミノヘキサン、アミノオクタン、アミノドデカン、アミノジフェニルメタン、１−（３−アミノプロピル）イミダゾール、３−アミノ−１−プロペン、アミノピリジン、アミノベンゼンスルホン酸、トリス（２−アミノエチル）アミン等や、より好ましくは、ジアミノエタン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ジプロピレントリアミン、ポリエチレンイミン、Ｎ’−メチル−２,２’ジアミノジエチルアミン、Ｎ−アセチルエチレンジアミン、１,２−ビス（２−アミノエトキシエタン）等のようなアミノ基を複数有する化合物（ポリアミンと言うことがある）が用いられる。また、水酸基を有する構造としては、ヒドロキシプロパン、２−エタノールアミン、１,３ジアミノ-２-ヒドロキシプロパン、ヒドロキシブタノン、ヒドロキシ酪酸、ヒドロキシピリジン等や、グルコース、グルコサミン、ガラクトサミン、マルトース、セルビオース、スクロース、アガロース、セルロース、キチン、キトサン等の単糖、オリゴ糖、多糖等の糖質あるいはそれらの誘導体を用いることができる。さらに、カルボキシル基を有する構造としては例えば、β−アラニン、ｎ−カプロン酸、イソ酪酸、γ−アミノ−β−ヒドロキシ酪酸等を用いることができる。最も好ましくは、本発明材料は尿素、チオ尿素あるいはアミド基に続く構造として芳香族化合物と水素結合形成可能な化合物の両方を有することができる。
【００１４】
さらに、尿素結合、チオ尿素結合、アミド結合を分子構造内に複数個有するような、ポリ尿素、ポリチオ尿素、ポリアミドも本発明材料として用いることができる。この場合にも、尿素結合、チオ尿素結合、アミド結合に続く構造として上記構造のいずれをも用いることができるが、最も好ましくは、水酸基、アミノ基やカルボキシル基を有する化合物（糖質あるいはその誘導体を含む）のような水素結合形成可能な基と芳香族化合物の両方を用いることができる。
【００１５】
また、本発明材料としては、モノマ、オリゴマ、ポリマのいずれでも良いため、上記構造あるいはその一部が重合されているものも本発明材料に含まれる。すなわち、上記構造あるいはその一部として、ナイロン、ポリメチルメタクリレート、ポリスルホン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニルアルコール、ポリテトラフルオロエチレンなどの合成高分子や、セルロース、コラーゲン、キチン、キトサンおよびそれらの誘導体を含む天然高分子などが好適に用いられる。つまり、単独重合、共重合あるいはブレンドされたこれら合成高分子や天然高分子などに、水素結合形成可能な基を導入することが好適に行われる。さらに、金属、セラミックス、ガラスなどの無機材料を適当な高分子で被覆したものも好適に用いられる。本発明における担体とは本発明材料を固定する支持体を指すので、例えば上記に挙げたような合成高分子や天然高分子などがある。
【００１６】
本発明材料は一般に公知の方法で合成することができる。例えば脂肪族化合物や芳香族化合物に尿素結合あるいはチオ尿素結合を導入する場合には、イソシアネート化合物あるいはイソチオシアネート化合物とアミノ化合物とを反応させる方法を用いることができる。また、脂肪族化合物や芳香族化合物にアミド基を導入する場合には、例えば酸、酸塩化物あるいは酸無水物とアミノ化合物とを反応させる方法を用いることができる。アミノ化合物とイソシアネート化合物、イソチオシアネート化合物、酸、酸塩化物あるいは酸無水物の混合比は任意に選択でき、通常、イソシアネート化合物、イソチオシアネート化合物、酸、酸塩化物あるいは酸無水物１モルに対して０．１〜１０モルのアミノ化合物が好ましく用いられる。イソシアネート化合物あるいはイソチオシアネート化合物としては例えば、エチルイソシアネート、ステアリルイソシアネート、n-ブチルイソシアネート、ｉｓｏ−ブチルイソシアネート、n-プロピルイソシアネート、メチルイソチオシアネート、エチルイソチオシアネート、n-ブチルイソチオシアネート、ベンジルイソチオシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート、シクロヘキシルイソシアネート、シクロヘキシルイソチオシアネート、シクロヘキシルジイソシアネート等の脂肪族イソシアネート化合物あるいはイソチオシアネート化合物のいずれをも用いることができるが、より好ましくはフェニルイソシアネート、クロロフェニルイソシアネート、フルオロフェニルイソシアネート、ブロモフェニルイソシアネート、ニトロフェニルイソシアネート、トリルイソシアネート、メトキシフェニルイソシアネート、1-ナフチルイソシアネート、4,4'ジフェニルメタンジイソシアネート、3,3',5,5'テトラエチル4,4'ジイソシアナトジフェニルメタン、フェニルイソチオシアネート、クロロフェニルイソチオシアネート、フルオロフェニルイソチオシアネート、ニトロフェニルイソチオシアネート、トリルイソチオシアネート、メトキシフェニルイソチオシアネート、1-ナフチルイソチオシアネート、等の芳香族イソシアネート化合物あるいはイソチオシアネート化合物が用いられる。酸塩化物としては例えば、イソバレリルクロライド、ステアロイルクロライド、シクロヘキサンカルボニルクロライド、６−クロロニコチン酸クロライド等の脂肪族酸塩化物のいずれをも用いることができるが、より好ましくはベンゾイルクロライド、３,４−ジクロロベンゾイルクロライド、ニトロベンゾイルクロライド、４−クロロベンゾイルクロライド、４−トルオイルクロライド、ベンゾ−［ｂ］チオフェン−２−カルボニルクロライド等の芳香族酸塩化物を用いることができる。また、酸無水物としては例えば、無水酢酸、無水コハク酸、無水フタル酸、無水安息香酸等を好ましく用いることができる。また、本発明に用いるアミノ化合物のアミノ基としては１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基のいずれでも良く、アミノ化合物としては例えば、アンモニア、ｓｅｃ−オクチルアミン、１−（３−アミノプロピル）イミダゾール、３−アミノ−１−プロペン、アミノピリジン、アミノベンゼンスルホン酸、トリス（２−アミノエチル）アミン等を好ましく用いることができる。また、尿素結合、チオ尿素結合あるいはアミド結合に加えて水素結合形成可能な基を導入できるような、ポリアミノ化合物や水酸基あるいはカルボキシル基を有するアミノ化合物も好ましく用いることができる。ポリアミノ化合物としては例えば、ジアミノエタン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ジプロピレントリアミン、Ｎ’−メチル−２、２'ジアミノジエチルアミン、ポリエチレンイミン、Ｎ−アセチルエチレンジアミン、１、２−ビス（２−アミノエトキシ）エタン等のいずれをも用いることができる。水酸基を有するアミノ化合物としては、2-エタノールアミン、3-プロパノールアミン、6-ヘキサノールアミン、1,3ジアミノ-2-ヒドロキシプロパン、２−（２−アミノエトキシ）エタノール、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、グルカミン、N-メチル1,3-ジアミノプロパノール等の脂肪族アミン、あるいは、4-アミノフェノール、ジアミノフェノール、アミノヒドロキシピリミジン、ジアミノヒドロキシピリミジン、ジアミノヒドロキシピラゾール等の芳香族アミン、あるいはセリン、チロシン等のアミノ酸類が用いられる。また、エピクロロヒドリンおよびアミノ化合物、あるいは1,3ジブロモ-2-ヒドロキシプロパンを反応させることによって水酸基のみを有する化合物あるいはアミノ基のみを有する化合物から水酸基を有するアミノ化合物を合成することも可能である。また、糖質に水素結合形成可能な基を導入する場合も上記と同様な方法を用いることができる。すなわち、キトサンやグルコサミンのようなアミノ基を有する糖質の場合には、上述したようなイソシアネート化合物、イソチオシアネート化合物、酸、酸塩化物あるいは酸無水物を反応させることができる。セルロースのようなアミノ基を有さない糖質の場合には、糖質の水酸基をエピクロルヒドリン、トレシルクロライドなどを用いて活性化させた後に、アンモニアやジアミノエタンなどと反応させてアミノ基を導入し、このアミノ基を利用して、糖質に尿素結合、チオ尿素結合、アミド結合等の水素結合形成可能な基を導入することができる。カルボキシル基を有するアミノ化合物としては例えば、β−アラニン、４−アミノ−ｎ−酪酸、γ−アミノ−β−ヒドロキシ−ｎ−酪酸、６−アミノ−ｎ−カプロン酸等を用いることができる。
【００１７】
さらに、本発明材料がオリゴマあるいはポリマの場合には、例えば、イソシアネート基、カルボキシル基あるいはスクシンイミド基等のカルボン酸の活性エステル基を有するオリゴマあるいはポリマに、水素結合形成可能な基を有する化合物のアミノ基を反応させる方法が好ましく用いられる。また、アミノ基を有するオリゴマ、ポリマ、あるいはアンモニア、ジアミノエタン、1,3ジアミノプロパン、1,3ジアミノ-2-ヒドロキシプロパン、１、２−ビス（２−アミノエトキシ）エタン、トリス（２−アミノエチル）アミン、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノールなどによりアミノ基を導入したオリゴマ、ポリマに上述したようなイソシアネート化合物、イソチオシアネート化合物、酸、酸塩化物あるいは酸無水物を反応させることも好ましい方法である。また、酸塩化物やイソシアネート化合物がアミノ基以外の水素結合形成可能な基に反応しないように、反応時間、反応温度あるいは混合比などを制御したり、保護基を用いることが好ましい。アミノ基、イソシアネート基、カルボキシル基あるいはスクシンイミド基等のカルボン酸の活性エステル基、酸塩化物基、酸無水物基などの官能基は、必要に応じてオリゴマ、ポリマに導入することができる。
【００１８】
さらに本発明材料がポリ尿素あるいはポリチオ尿素の場合には、例えばポリイソシアネート化合物あるいはポリイソチオシアネート化合物とポリアミノ化合物とを反応させる方法を用いることができる。通常、試薬の量はポリイソシアネート化合物あるいはポリイソチオシアネート化合物１モルに対して、０．１〜１０モルのポリアミンが好ましく用いられる。ポリイソシアネート化合物あるいはポリイソチオシアネート化合物としてはヘキサメチレンジイソシアネート、シクロヘキシルジイソシアネート、トリレンジイソシアネート、4,4'ジフェニルメタンジイソシアネート、3,3',5,5'テトラエチル4,4'ジイソシアナトジフェニルメタン、キシレンジイソシアネート、メチレンビス（４−フェニルイソチオシアネート）等が好適に用いられる。また、ポリアミノ化合物としてはジアミノエタン、ジアミノプロパン、1,3ジアミノ-2-ヒドロキシプロパン、Ｎ’−メチル1,3−ジアミノ-2-プロパノール、ジアミノフェノール、Ｎ，Ｎ’−ジアミノピペラジン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリエチレンイミン、ジプロピレントリアミン、Ｎ’−メチル−２、２’−ジアミノジエチルアミンなどを好ましく用いることができる。さらに、本発明材料がポリアミドの場合には、例えばポリカルボン酸とポリアミンを重縮合させる方法を用いることができる。また、ポリ尿素、ポリチオ尿素、ポリアミドのいずれにおいても、ポリイソシアネート、ポリイソチオシアネート、ポリカルボン酸などを用いずに、各々の官能基を一つずつ順次導入することによって最終的にポリ尿素、ポリチオ尿素、ポリアミドを得る方法も好ましく行われる。
【００１９】
上記すべての反応は標準的には、反応温度は０〜１５０℃、反応時間は０．１〜２４時間で行われる。また、反応溶媒は必ずしも必要ではないが、一般的には溶媒の存在下に行われる。使用しうる溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ-ブタノール、ヘキサン、アセトン、Ｎ，Ｎジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の脂肪族炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジクロロメタン、クロロホルム、クロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類等が挙げられる。反応終了後の反応液は、必要に応じ、ろ過、濃縮などの通常の後処理の後、カラムクロマトグラフィー、再結晶などの操作により、精製されることができる。また、水不溶性の材料の場合、ガラスフィルター等を用いて洗浄することも好ましい方法である。
【００２０】
本発明材料の中で水不溶性のものは、ＬＴＡ除去カラムあるいは被覆材料などとして好ましく用いられる。その形状としては特に限定はないが、カラムとして用いる場合には、ビーズ、繊維、中空繊維、糸束、ヤーン、ネット、編み地、織物等が好ましく、被覆材料の場合は、織物あるいはフィルム等の形状が好ましい。また、本材料は単独での使用のみならず、適当な材料にさらに固定化したり、他材料と混合して一つのカラムあるいは被覆材料として用いることもできる。固定化あるいは混合などの操作は、前記形状に加工する前に行っても良いし、加工した後に行っても良い。本発明の材料を用いたカラムを体外循環用カラムとして用いる場合には、体外に導出した血液を直接カラムに通しても良いし、血漿分離膜などと組み合わせて使用しても良い。
【００２１】
本発明の材料は、ＬＴＡ除去用の体液浄化カラムとして特に好適に用いられる。また、被覆材料としても好適に用いられ、敗血症ショック、感染症などの治療や予防が可能になる。
【００２２】
以下に実施例を用いて詳細に説明を加えるが、発明の内容が実施例に限定されるものではない。
【００２３】
【実施例】
（実施例１）修飾ポリスチレン繊維の作製
５０重量比の海成分（４６重量比のポリスチレンと４重量比のポリプロピレンの混合物）と５０重量比の島成分（ポリプロピレン）とからなるアメリカ特許4,661,260記載（実施例１）の海島型複合繊維（厚さ：２．６デニール、島の数：１６）を５０ｇのＮ−メチロール−α−クロロアセトアミド、４００ｇのニトロベンゼン、４００ｇの９８％硫酸、０．８５ｇのパラホルムアルデヒドの混合溶液と２０℃で１時間反応させた。そして、繊維をニトロベンゼンで洗浄し、水中に入れて反応を停止させた。その後、繊維を温水で再び洗浄することによって、クロロアセトアミドメチル化架橋ポリスチレン繊維（以下ＡＭＰＳｔ繊維と略す）を得た。
【００２４】
表１に示す試薬をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以下ＤＭＦと略す）５０ｍｌに溶解した。この溶液に、１ｇのＡＭＰＳｔ繊維（クロロ含量２ｍｍｏｌ相当）を攪拌しつつ加えた。反応は３０℃で３時間行った。その後、ＤＭＦ２００ｍｌを用いてガラスフィルター上で洗浄した。洗浄後、４−クロルフェニルイソシアネート０．１９ｇを溶解したＤＭＦ５０ｍｌの溶液中にＡＭＰＳｔ繊維を加え、２５℃で１時間、反応させた。その後、ガラスフィルター上で２００ｍｌのＤＭＦおよび２００ｍｌの蒸留水により洗浄した。
【００２５】
表１ＡＭＰＳｔ繊維との反応に用いた試薬
【００２６】
【表１】

【００２７】
実施例２キトサンビーズへの尿素基、チオ尿素基およびアミド基の導入
粒径０．１ｍｍのキトサンビーズ（富士紡（株）製、”キトパール”ＡＬ−０１）１２ｍｌ（沈殿時体積、乾燥重量は１．０ｇ）を５０ｍｌのＤＭＦ中で攪拌し、ガラスフィルターによって、ビーズと溶液の分離を行った。この操作を１回５分間、２０回繰り返し、含有水分をＤＭＦと完全に置換させた。
【００２８】
表２の試薬を１００ｍｌのＤＭＦ中に溶解させたものにビーズを徐々に添加し、攪拌しながら室温で１時間反応させた。その後、ガラスフィルターを用いて、ビーズと溶液を分離し、ビーズを５０ｍｌのＤＭＦ中で５分間攪拌することによって洗浄を行った。この洗浄操作を２０回繰り返し、未反応の試薬を完全に除去した。次いで、蒸留水による洗浄操作を同様に行い、ＤＭＦを蒸留水と置換することによって、尿素結合、チオ尿素結合、アミド結合を有するキトサンビーズを得た。
【００２９】
表２キトサンビーズとの反応に用いた試薬
【００３０】
【表２】

【００３１】
実施例３修飾ＡＭＰＳｔ繊維と修飾キトサンビーズによるＬＴＡの除去試験
実施例１で作製した修飾ＡＭＰＳｔ繊維と実施例２で作製した修飾キトサンビーズによるＬＴＡの吸着除去試験を行った。ＬＴＡは、黄色ブドウ球菌由来（シグマ社より購入）と連鎖球菌由来（シグマ社より購入）のものを用いた。また、医薬品としては抗生剤であるアルベカシン（以下ＡＲＫと略す。明治製菓（株）製）を用いた。吸着試験は、ウサギ血漿を用いて行った。抗凝固剤を用いてウサギより血液を採取した。その一部を３０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離することによって血漿を得た。この血漿に、黄色ブドウ球菌由来ＬＴＡ（以下ＬＴＡ−１と略する）と連鎖球菌由来ＬＴＡ（以下ＬＴＡ−２と略する）およびＡＲＫを各々１０μｇ／ｍｌとなるように添加した。ＬＴＡ添加血漿０．５ｍｌに対して、表１の修飾ＡＭＰＳｔ繊維を３５ｍｇ、または表２の修飾キトサンビーズ０．１ｍｌ（沈殿時体積）を添加し、３７℃で２時間振とうした。２時間反応後の溶液中のＬＴＡ濃度を酵素免疫学的測定法を用いて測定した。また、この時のアルブミン濃度をＢＣＧ法を用いて、ナトリウムイオン濃度を電極法を用いて、リポタンパク質である高密度リポタンパク質（以下ＨＤＬと略す。）の濃度をリンタングステン酸・Ｍｇ沈殿法により測定した。また、白血球に対する吸着能の測定には抗凝固剤を用いてウサギより採取した血液を遠心分離せずに用いた。この血液０．８mlに対して、表１の修飾ＡＭＰＳｔ繊維を３５ｍｇ、または表２の修飾キトサンビーズ０．１ｍｌ（沈殿時体積）を添加し、３７℃で２時間振とうした。
２時間反応後の溶液中の白血球数を血球計測器（日本光電社製）を用いて測定した。この結果を表３に示す。この結果から、尿素結合あるいはアミド基を有する材料は特異的にＬＴＡを吸着することが示された。
【００３２】
表３修飾ＡＭＰＳｔ繊維と修飾キトサンビーズによるＬＴＡとアルブミンおよび／あるいはナトリウムの除去試験
【００３３】
【表３】

【００３４】
実施例４修飾ＡＭＰＳｔ繊維による培地中からのＬＴＡ除去試験−サイトカイン産生量による評価
実施例１で作製した修飾ＡＭＰＳｔ繊維（ａ）によるＬＴＡの除去をサイトカイン産生量によって測定した。ＲＰＭＩ１６４０培地に、ＬＴＡ−１を１０μｇ／ｍｌになるように添加した。このＬＴＡ添加培地０．５ｍｌに対して、修飾ＡＭＰＳｔ繊維（ａ）を３５ｍｇ添加し、３７℃で２時間振盪した。また、ヒト末梢血単核球（以下ＰＢＭＣと略する）浮遊液を作製するため、抗凝固剤を用いて健常人より血液を採取し、生食で２倍に希釈したものをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＮｙｃｏｍｅｄＰｈａｒｍａ社製）に重層し、２０００ｒｐｍ、２０分間室温で遠心した。ＰＢＭＣを採取し、遠心操作によって３回洗浄後、１０％牛胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、細胞数を３．０＊１０⁶個／ｍｌに調製した。調製したＰＢＭＣ浮遊液１００μｌに２時間反応後のＬＴＡ添加培地１００μｌを加え１３時間培養後、培養上清中のＩＬ−８およびＴＮＦ−α濃度を酵素免疫学的手法を用いて測定した。この結果を表４に示す。表４に示す通り、修飾ＡＭＰＳｔ繊維（ａ）を用いることにより、ＬＴＡが除去されサイトカインのような生物活性が著しく低減されることが示された。
【００３５】
表４培地中からのＬＴＡ除去によるサイトカイン産生量の変化
【００３６】
【表４】

【００３７】
実施例５修飾ＡＭＰＳｔ繊維による血漿中からのＬＴＡ除去試験−サイトカイン産生量による評価
実施例４と同様の実験をヒト血漿を用いて行った。血漿は実施例３と同様の方法で作製した。この血漿に、ＬＴＡ−１を１０μｇ／ｍｌとなるように添加したものを除去試験に用いた。この結果を表５に示す。修飾ＡＭＰＳｔ繊維（ａ）は、ヒト血漿のような高蛋白質溶液中においてもＬＴＡと高い親和性を有し、ＬＴＡによるサイトカイン産生量を効率よく低下させることが示された。
【００３８】
表５ヒト血漿中からのＬＴＡ除去によるサイトカイン産生量の変化
【００３９】
【表５】

【００４０】
実施例６修飾ＡＭＰＳｔ繊維によるＬＴＡ除去試験−循環法
実施例１の修飾ＡＭＰＳｔ繊維（ａ）を用いて、ＬＴＡの循環方法による除去試験を行った。各繊維１ｇをカラムに充填し、これに実施例３の方法で作製したウサギ血漿１０ｍｌを３７℃において１ｍｌ／ｍｉｎで６０分間循環させた時のＬＴＡ濃度を表６に示す。体外循環のような流動条件下においても、ＬＴＡ吸着能があることが示された。
【００４１】
表６修飾ＡＭＰＳｔ繊維によるＬＴＡ除去試験−循環法
【００４２】
【表６】

【００４３】
【発明の効果】
本発明により、血漿などの高蛋白質濃度の溶液中においてもＬＴＡを迅速に解毒あるいは除去できる、水素結合形成可能な官能基を含む材料が提供された。本発明の材料を用いて、血液、血漿などの体液や医薬品中に存在するＬＴＡの毒素活性を失わせる（解毒）ことができるので、敗血症ショック、感染症などの治療や予防が可能になる。また、この材料の中で水不溶性であるものを用いて、血液、血漿などの体液や医薬品中からＬＴＡを効率的に除去できるので、これにより、ＬＴＡ除去カラムや被覆材料を構成することで、敗血症ショック、感染症などの治療や予防が可能になる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a material that loses (detoxifies) or removes the toxin activity of lipoteichoic acid (hereinafter abbreviated as LTA). In particular, it is suitably used as a purification column or coating material for removing LTA as a drug that loses the toxin activity of LTA by binding to LTA present in a high concentration protein solution such as blood (detoxification).
[0002]
[Prior art]
In recent years, LTA is considered to be a cause of Gram-positive septicemia and various studies have been conducted. For example, expression of nitric oxide synthase in cultured vascular smooth muscle cells is induced (J. Cardiovasc. Pharmacol., 20, S145-S147 (1992)). (Br. J. Phaemacol., 144, 1317-1323 (1995)), and pleural inflammation is observed when neutrophil infiltration into the thoracic cavity is observed in animals. (JP-A-9-163896) and reports that shock and organ damage occur when LTA and peptidoglycan are co-administered to rats (J. Exp Med., 188 (2), 305-315 (1998)). Yes. In contrast, the production of nitric oxide is anti-mouse CD14 antibody (Biochem Biophys Res Communn, 233 (2), 375-379 (1997)) or N (mega) -nitro-L-argineline methyl ester (Infect Immunn). , 65 (6), 2074-2079 (1997)), and that platelet activating factor antagonists suppress the death of shock caused by LTA administration to mice has been reported (JP-A-9-208493). The effects of aminoguanidine and dexamethasone (Br J Pharmacol. 119 (7), 1411-1421 (1996)) have also been studied. However, these all target late-stage products of the inflammatory response initiated by LTA, and there are no reports of drugs targeting LTA itself. On the other hand, as a medical material, polymyxin-B-immobilized fiber has been reported to reduce TNF-α production by S. aureus culture supernatant (diluted with 10% human plasma-supplemented medium) by 20% (ASAIO J, 44 ( 1), 48-53 (1998)). However, various toxins are contained in the culture supernatant, removal of LTA has not been confirmed, and the effect is as low as 20%. Thus, a material having a high affinity with LTA in a high protein solution such as plasma has not been known so far.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention is intended to eliminate these disadvantages of the prior art, and an object of the present invention is to provide a material that can quickly lose (detoxify) or remove the toxin activity of LTA even in a solution with a high protein concentration such as blood. And
[0004]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the present invention has the following configuration.
[0005]
(1) A material for removing or detoxifying lipoteichoic acid having a removal rate of lipoteichoic acid in rabbit plasma of 60% or more and a removal rate of albumin and / or sodium of 10% or less in rabbit plasma. Also,
(2) A body fluid purification column or coating material using the above-described material.
[0006]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present invention, LTA is a substance that constitutes cell membranes and cell walls of Gram-positive bacteria, such as Streptococcus, Micrococcus, Lactobacillus, Staphylococcus, Bacillus, Enterococcus. Streptococcus genus includes Streptococcus pyogenes and Streptococcus pneumoniae, and Staphylococcus genus includes Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis.
[0007]
LTA is a polymer in which ribitol or glycerol is linked by a phosphodiester bond, and is accompanied by sugar or D-alanine. Because it has a fat-soluble fatty acid at the end, it binds to the cytoplasmic membrane and penetrates the cell wall (from Nanedo, edited by Masanosuke Yoshikawa, Department of Medical Bacteriology).
[0008]
The material of the present invention has a removal rate of lipoteichoic acid in rabbit plasma of 60% or more and a removal rate of albumin and / or sodium of 10% or less in rabbit plasma, more preferably selected from leukocytes, lipoproteins and pharmaceuticals. The at least one removal rate is 15% or less. “Albumin and / or sodium removal rate is 10% or less” means that albumin removal rate is 10%, sodium removal rate is 10% or less, and both albumin and sodium removal rates are 10%. It means the following. Further, “at least one removal rate selected from leukocytes, lipoproteins and pharmaceuticals is 15% or less” means that at least one of white blood cells, riboproteins and pharmaceuticals has a removal rate of 10% or less. To do.
[0009]
Here, there are various methods for measuring the removal rate of lipoteichoic acid and the removal rate of albumin and / or sodium and / or leukocytes and / or lipoproteins and / or pharmaceuticals. It is considered that the removal rate varies depending on the volume ratio between the adsorbed liquid and the adsorbed liquid, the concentration of impurities in the adsorbed liquid, the reaction time, the presence or absence of stirring, and the like. The measurement of the removal rate in this invention is shown below.
[0010]
Rabbit plasma was collected from a 10-week-old New Zealand white rabbit (male) with a total protein concentration of 4.8 to 5.8 g / dl, a white blood cell count of 4500 to 6500 / mm3, a hematocrit value of 40 to 43%, and a sodium concentration. Is plasma having no antibody against lipoteichoic acid and 130-140 mmol / l. Blood was collected from rabbits using heparin (5 U / ml), and plasma after centrifugation at 1500 G for 10 minutes was used for measurement of removal rate. 35 mg of the adsorbent was added to 0.5 ml of plasma, and the reaction temperature was 37 ° C., the reaction time was 2 hours, and adsorption was performed under the condition of swirling stirring. The concentration of the target substance before and after the adsorption was measured, and the removal rate was calculated using the following formula (1).
[0011]
(C0-C) / C0 (1) formula
Here, C0 is the initial concentration in the solution before adsorption of the target substance, and C is the concentration in the solution after adsorption of the target substance.
[0012]
Here, rabbit plasma with little variation in blood components was used, but similar removal rates can be obtained using plasma of mammals such as humans, dogs, mice, cows and sheep.
[0013]
In the present invention, the functional group capable of forming a hydrogen bond is not particularly limited, and examples thereof include a urea bond, a thiourea bond, an amide group, an amino group, a hydroxyl group, a carboxyl group, an aldehyde group, and a mercapto group. It is preferable to have at least one selected from a bond, a thiourea bond, an amide bond, an amino group and a hydroxyl group. The structure following the group capable of forming a hydrogen bond is not particularly limited, and aliphatic compounds such as propane, hexane, octane and dodecane and alicyclic compounds such as cyclohexane and cyclopentane can be used. Considering the height, aromatic compounds such as benzene, naphthalene and anthracene are more preferably used. Derivatives such as bromoheptane, chlorocyclohexane, methylbenzene, chlorobenzene, nitrobenzene, diphenylmethane, chloronaphthalene and the like are also preferably used. Moreover, it is more preferable to have two or more groups capable of forming a hydrogen bond, and it is more preferable that they are different functional groups. In particular, as a structure following a urea bond, a thiourea bond or an amide bond, for example, a structure further having a functional group capable of forming a hydrogen bond such as an amino group, a hydroxyl group and a carboxyl group is preferably used. For example, as a structure having an amino group, aminohexane, monomethylaminohexane, dimethylaminohexane, aminooctane, aminododecane, aminodiphenylmethane, 1- (3-aminopropyl) imidazole, 3-amino-1-propene, aminopyridine, Aminobenzenesulfonic acid, tris (2-aminoethyl) amine, etc., more preferably diaminoethane, diethylenetriamine, triethylenetetramine, tetraethylenepentamine, dipropylenetriamine, polyethyleneimine, N′-methyl-2,2 ′ A compound having a plurality of amino groups (sometimes referred to as polyamine) such as diaminodiethylamine, N-acetylethylenediamine, 1,2-bis (2-aminoethoxyethane) is used. Examples of the structure having a hydroxyl group include hydroxypropane, 2-ethanolamine, 1,3-diamino-2-hydroxypropane, hydroxybutanone, hydroxybutyric acid, hydroxypyridine, glucose, glucosamine, galactosamine, maltose, cellobiose, sucrose, Monosaccharides such as agarose, cellulose, chitin, and chitosan, saccharides such as oligosaccharides and polysaccharides, or derivatives thereof can be used. Furthermore, as the structure having a carboxyl group, for example, β-alanine, n-caproic acid, isobutyric acid, γ-amino-β-hydroxybutyric acid and the like can be used. Most preferably, the material of the present invention can have both an aromatic compound and a compound capable of forming a hydrogen bond as a structure following a urea, thiourea or amide group.
[0014]
Furthermore, polyurea, polythiourea and polyamide having a plurality of urea bonds, thiourea bonds and amide bonds in the molecular structure can also be used as the material of the present invention. In this case, any of the above structures can be used as a structure following a urea bond, a thiourea bond, or an amide bond, but most preferably a compound having a hydroxyl group, an amino group or a carboxyl group (a carbohydrate or a derivative thereof) Both groups capable of forming hydrogen bonds such as and aromatic compounds can be used.
[0015]
In addition, since the material of the present invention may be any of a monomer, an oligomer, and a polymer, the material of the present invention includes those in which the above structure or a part thereof is polymerized. That is, natural structures including synthetic polymers such as nylon, polymethyl methacrylate, polysulfone, polystyrene, polyethylene, polyvinyl alcohol, polytetrafluoroethylene, cellulose, collagen, chitin, chitosan and derivatives thereof as the above structure or a part thereof. Polymers are preferably used. That is, it is preferable to introduce a group capable of forming a hydrogen bond into such a synthetic polymer, natural polymer, or the like that is homopolymerized, copolymerized or blended. Furthermore, what coat | covered inorganic materials, such as a metal, ceramics, and glass with a suitable polymer | macromolecule, is used suitably. The carrier in the present invention refers to a support on which the material of the present invention is fixed, and examples thereof include synthetic polymers and natural polymers as mentioned above.
[0016]
The material of the present invention can be synthesized by a generally known method. For example, when a urea bond or a thiourea bond is introduced into an aliphatic compound or an aromatic compound, a method of reacting an isocyanate compound or an isothiocyanate compound with an amino compound can be used. Moreover, when introducing an amide group into an aliphatic compound or an aromatic compound, for example, a method of reacting an acid, acid chloride or acid anhydride with an amino compound can be used. The mixing ratio of the amino compound and the isocyanate compound, isothiocyanate compound, acid, acid chloride or acid anhydride can be arbitrarily selected, and is usually based on 1 mol of the isocyanate compound, isothiocyanate compound, acid, acid chloride or acid anhydride. 0.1 to 10 mol of amino compound is preferably used. Examples of the isocyanate compound or isothiocyanate compound include ethyl isocyanate, stearyl isocyanate, n-butyl isocyanate, iso-butyl isocyanate, n-propyl isocyanate, methyl isothiocyanate, ethyl isothiocyanate, n-butyl isothiocyanate, benzyl isothiocyanate, hexa Any of aliphatic isocyanate compounds or isothiocyanate compounds such as methylene diisocyanate, cyclohexyl isocyanate, cyclohexyl isothiocyanate, and cyclohexyl diisocyanate can be used, but more preferably phenyl isocyanate, chlorophenyl isocyanate, fluorophenyl isocyanate, bromophenyl isocyanate, nitrophenyl isocyanate Isocyanate, tolyl isocyanate, methoxyphenyl isocyanate, 1-naphthyl isocyanate, 4,4 'diphenylmethane diisocyanate, 3,3', 5,5 'tetraethyl 4,4' diisocyanatodiphenylmethane, phenyl isothiocyanate, chlorophenyl isothiocyanate, fluorophenyl Aromatic isocyanate compounds or isothiocyanate compounds such as isothiocyanate, nitrophenyl isothiocyanate, tolyl isothiocyanate, methoxyphenyl isothiocyanate, and 1-naphthyl isothiocyanate are used. As the acid chloride, for example, any of aliphatic acid chlorides such as isovaleryl chloride, stearoyl chloride, cyclohexanecarbonyl chloride, 6-chloronicotinic acid chloride can be used, and more preferably benzoyl chloride, 3, Aromatic acid chlorides such as 4-dichlorobenzoyl chloride, nitrobenzoyl chloride, 4-chlorobenzoyl chloride, 4-toluoyl chloride, benzo- [b] thiophene-2-carbonyl chloride can be used. As the acid anhydride, for example, acetic anhydride, succinic anhydride, phthalic anhydride, benzoic anhydride and the like can be preferably used. The amino group of the amino compound used in the present invention may be any of primary amino group, secondary amino group, and tertiary amino group. Examples of amino compounds include ammonia, sec-octylamine, 1- (3- Aminopropyl) imidazole, 3-amino-1-propene, aminopyridine, aminobenzenesulfonic acid, tris (2-aminoethyl) amine and the like can be preferably used. Further, polyamino compounds and amino compounds having a hydroxyl group or a carboxyl group that can introduce a group capable of forming a hydrogen bond in addition to a urea bond, a thiourea bond or an amide bond can also be preferably used. Examples of the polyamino compound include diaminoethane, diethylenetriamine, triethylenetetramine, tetraethylenepentamine, dipropylenetriamine, N′-methyl-2, 2′diaminodiethylamine, polyethyleneimine, N-acetylethylenediamine, 1,2-bis ( Any of 2-aminoethoxy) ethane and the like can be used. Examples of amino compounds having a hydroxyl group include 2-ethanolamine, 3-propanolamine, 6-hexanolamine, 1,3 diamino-2-hydroxypropane, 2- (2-aminoethoxy) ethanol, and 2- (2-aminoethyl). Amino) Aliphatic amines such as ethanol, glucamine, N-methyl 1,3-diaminopropanol, or aromatic amines such as 4-aminophenol, diaminophenol, aminohydroxypyrimidine, diaminohydroxypyrimidine, diaminohydroxypyrazole, or serine Amino acids such as tyrosine are used. It is also possible to synthesize an amino compound having a hydroxyl group from a compound having only a hydroxyl group or a compound having only an amino group by reacting epichlorohydrin and an amino compound, or 1,3 dibromo-2-hydroxypropane. is there. In addition, when a group capable of forming a hydrogen bond is introduced into a saccharide, the same method as described above can be used. That is, in the case of a carbohydrate having an amino group such as chitosan or glucosamine, an isocyanate compound, an isothiocyanate compound, an acid, an acid chloride or an acid anhydride as described above can be reacted. In the case of carbohydrates such as cellulose that do not have an amino group, the hydroxyl group of the carbohydrate is activated using epichlorohydrin, tresyl chloride, etc., and then reacted with ammonia or diaminoethane to introduce the amino group. By using this amino group, a group capable of forming a hydrogen bond such as a urea bond, a thiourea bond, and an amide bond can be introduced into the carbohydrate. Examples of amino compounds having a carboxyl group include β-alanine, 4-amino-n-butyric acid, γ-amino-β-hydroxy-n-butyric acid, 6-amino-n-caproic acid, and the like.
[0017]
Further, when the material of the present invention is an oligomer or polymer, for example, an amino group of a compound having a group capable of forming a hydrogen bond with an oligomer or polymer having an active ester group of a carboxylic acid such as an isocyanate group, a carboxyl group or a succinimide group. A method of reacting a group is preferably used. Further, oligomers or polymers having amino groups, or ammonia, diaminoethane, 1,3 diaminopropane, 1,3 diamino-2-hydroxypropane, 1,2-bis (2-aminoethoxy) ethane, tris (2-amino) It is also possible to react the above-mentioned isocyanate compound, isothiocyanate compound, acid, acid chloride or acid anhydride with an oligomer or polymer having an amino group introduced by ethyl) amine, 2- (2-aminoethylamino) ethanol or the like. This is the preferred method. In addition, it is preferable to control the reaction time, reaction temperature, mixing ratio, or the like, or to use a protecting group so that the acid chloride or isocyanate compound does not react with a group capable of forming a hydrogen bond other than an amino group. Functional groups such as active ester groups of carboxylic acids such as amino groups, isocyanate groups, carboxyl groups or succinimide groups, acid chloride groups and acid anhydride groups can be introduced into the oligomers and polymers as required.
[0018]
Further, when the material of the present invention is polyurea or polythiourea, for example, a method of reacting a polyisocyanate compound or polyisothiocyanate compound with a polyamino compound can be used. Usually, the amount of the reagent is preferably 0.1 to 10 mol of polyamine with respect to 1 mol of the polyisocyanate compound or polyisothiocyanate compound. Polyisocyanate compounds or polyisothiocyanate compounds include hexamethylene diisocyanate, cyclohexyl diisocyanate, tolylene diisocyanate, 4,4 'diphenylmethane diisocyanate, 3,3', 5,5 'tetraethyl 4,4' diisocyanatodiphenylmethane, xylene diisocyanate, Methylene bis (4-phenylisothiocyanate) or the like is preferably used. Polyamino compounds include diaminoethane, diaminopropane, 1,3 diamino-2-hydroxypropane, N′-methyl 1,3-diamino-2-propanol, diaminophenol, N, N′-diaminopiperazine, diethylenetriamine, triethylene. Ethylenetetramine, tetraethylenepentamine, polyethyleneimine, dipropylenetriamine, N′-methyl-2, 2′-diaminodiethylamine and the like can be preferably used. Further, when the material of the present invention is polyamide, for example, a method of polycondensation of polycarboxylic acid and polyamine can be used. Also, in any of polyurea, polythiourea, and polyamide, the polyurea, polythiothiocyanate, and polythiol are finally introduced by sequentially introducing each functional group without using polyisocyanate, polyisothiocyanate, polycarboxylic acid, etc. A method of obtaining urea or polyamide is also preferably performed.
[0019]
All the above reactions are typically carried out at a reaction temperature of 0 to 150 ° C. and a reaction time of 0.1 to 24 hours. In addition, a reaction solvent is not necessarily required, but it is generally performed in the presence of a solvent. Solvents that can be used include aliphatic hydrocarbons such as methanol, ethanol, isopropyl alcohol, n-butanol, hexane, acetone, N, N dimethylformamide, and dimethyl sulfoxide, and aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene, and xylene. Halogenated hydrocarbons such as dichloromethane, chloroform and chlorobenzene, and ethers such as diethyl ether, tetrahydrofuran and dioxane. The reaction solution after completion of the reaction can be purified by operations such as column chromatography and recrystallization after usual post-treatment such as filtration and concentration, if necessary. In the case of a water-insoluble material, washing with a glass filter or the like is also a preferable method.
[0020]
Among the materials of the present invention, those insoluble in water are preferably used as LTA removal columns or coating materials. The shape is not particularly limited, but when used as a column, beads, fibers, hollow fibers, yarn bundles, yarns, nets, knitted fabrics, woven fabrics, etc. are preferable. Shape is preferred. Further, the present material can be used not only alone, but also can be further fixed to an appropriate material, or mixed with other materials to be used as one column or coating material. Operations such as immobilization or mixing may be performed before processing into the shape, or may be performed after processing. When a column using the material of the present invention is used as a column for extracorporeal circulation, blood derived outside the body may be directly passed through the column, or may be used in combination with a plasma separation membrane or the like.
[0021]
The material of the present invention is particularly preferably used as a body fluid purification column for removing LTA. Further, it is also suitably used as a coating material, and treatment and prevention of septic shock, infectious diseases and the like are possible.
[0022]
Hereinafter, the present invention will be described in detail using examples, but the content of the invention is not limited to the examples.
[0023]
【Example】
(Example 1) Production of modified polystyrene fiber
Sea-island type composite fiber (thickness) described in US Pat. No. 4,661,260 (Example 1) consisting of 50 parts by weight sea component (mixture of 46 parts by weight polystyrene and 4 parts by weight polypropylene) and 50 parts by weight island component (polypropylene) Is 2.6 denier, the number of islands: 16) is mixed with 50 g of N-methylol-α-chloroacetamide, 400 g of nitrobenzene, 400 g of 98% sulfuric acid, 0.85 g of paraformaldehyde and 20 ° C. for 1 hour. Reacted. The fiber was then washed with nitrobenzene and put into water to stop the reaction. Thereafter, the fiber was washed again with warm water to obtain a chloroacetamidomethylated crosslinked polystyrene fiber (hereinafter abbreviated as AMPSt fiber).
[0024]
The reagents shown in Table 1 were dissolved in 50 ml of N, N-dimethylformamide (hereinafter abbreviated as DMF). To this solution, 1 g of AMPSt fiber (corresponding to a chloro content of 2 mmol) was added with stirring. The reaction was carried out at 30 ° C. for 3 hours. Then, it wash | cleaned on the glass filter using 200 ml of DMF. After washing, AMPSt fibers were added to a solution of 50 ml of DMF in which 0.19 g of 4-chlorophenyl isocyanate was dissolved, and reacted at 25 ° C. for 1 hour. Thereafter, it was washed with 200 ml of DMF and 200 ml of distilled water on a glass filter.
[0025]
Table 1 Reagents used for reaction with AMPSt fibers
[0026]
[Table 1]

[0027]
Example 2 Introduction of urea group, thiourea group and amide group into chitosan beads
Stir 12 ml of chitosan beads (Fujibo Co., Ltd., “Chitopearl” AL-01) (volume during precipitation, dry weight 1.0 g) in 50 ml of DMF, and use a glass filter to And the solution were separated. This operation was repeated 20 times for 5 minutes once to completely replace the contained water with DMF.
[0028]
Beads were gradually added to those obtained by dissolving the reagents in Table 2 in 100 ml of DMF, and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour with stirring. Thereafter, the beads and the solution were separated using a glass filter, and washing was performed by stirring the beads in 50 ml of DMF for 5 minutes. This washing operation was repeated 20 times to completely remove unreacted reagents. Subsequently, washing operation with distilled water was performed in the same manner, and DMF was replaced with distilled water to obtain chitosan beads having urea bonds, thiourea bonds, and amide bonds.
[0029]
Table 2 Reagents used for reaction with chitosan beads
[0030]
[Table 2]

[0031]
Example 3 LTA removal test using modified AMPSt fibers and modified chitosan beads
The adsorption removal test of LTA with the modified AMPSt fiber produced in Example 1 and the modified chitosan beads produced in Example 2 was conducted. LTA used was derived from Staphylococcus aureus (purchased from Sigma) and streptococcus (purchased from Sigma). Moreover, arbekacin (hereinafter abbreviated as ARK; manufactured by Meiji Seika Co., Ltd.), which is an antibiotic, was used as a medicine. The adsorption test was performed using rabbit plasma. Blood was collected from rabbits using anticoagulants. A part of the solution was centrifuged at 3000 rpm for 15 minutes to obtain plasma. To this plasma, S. aureus-derived LTA (hereinafter abbreviated as LTA-1), streptococcus-derived LTA (hereinafter abbreviated as LTA-2) and ARK were added at 10 μg / ml. To 0.5 ml of LTA-added plasma, 35 mg of the modified AMPSt fiber shown in Table 1 or 0.1 ml of modified chitosan beads shown in Table 2 (volume during precipitation) was added and shaken at 37 ° C. for 2 hours. The LTA concentration in the solution after the reaction for 2 hours was measured using an enzyme immunoassay. The albumin concentration at this time is determined by BCG method, the sodium ion concentration is determined by electrode method, and the concentration of high density lipoprotein (hereinafter abbreviated as HDL) is determined by phosphotungstic acid / Mg precipitation method. It was measured. In addition, blood collected from rabbits using an anticoagulant was used for the measurement of the ability to adsorb leukocytes without centrifugation. To 0.8 ml of this blood, 35 mg of the modified AMPSt fiber shown in Table 1 or 0.1 ml of the modified chitosan beads shown in Table 2 (volume during precipitation) was added and shaken at 37 ° C. for 2 hours.
The white blood cell count in the solution after the reaction for 2 hours was measured using a blood cell counter (manufactured by Nihon Kohden Co., Ltd.). The results are shown in Table 3. From this result, it was shown that a material having a urea bond or an amide group specifically adsorbs LTA.
[0032]
Table 3 Removal test of LTA and albumin and / or sodium with modified AMPSt fibers and modified chitosan beads
[0033]
[Table 3]

[0034]
Example 4 LTA Removal Test from Medium Using Modified AMPSt Fiber-Evaluation Based on Cytokine Production
Removal of LTA by the modified AMPSt fibers (a) prepared in Example 1 was measured by the amount of cytokine produced. LTA-1 was added to RPMI1640 medium at 10 μg / ml. 35 mg of the modified AMPSt fiber (a) was added to 0.5 ml of this LTA-added medium and shaken at 37 ° C. for 2 hours. In addition, in order to prepare a human peripheral blood mononuclear cell (hereinafter abbreviated as PBMC) suspension, blood was collected from a healthy person using an anticoagulant and diluted 2-fold with saline to obtain Lymphoprep (Nycomed Pharma). And centrifuged at 2000 rpm for 20 minutes at room temperature. PBMCs were collected, washed three times by centrifugation, and the number of cells was 3.0 * 10 using RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum. ⁶ Per unit / ml. 100 μl of LTA-added medium after reaction for 2 hours was added to 100 μl of the prepared PBMC suspension, and after culturing for 13 hours, the concentrations of IL-8 and TNF-α in the culture supernatant were measured using an enzyme immunological technique. The results are shown in Table 4. As shown in Table 4, it was shown that by using the modified AMPSt fibers (a), LTA was removed and biological activities such as cytokines were significantly reduced.
[0035]
Table 4 Changes in cytokine production by removing LTA from the medium
[0036]
[Table 4]

[0037]
Example 5 LTA Removal Test from Plasma Using Modified AMPSt Fiber-Evaluation Based on Cytokine Production
The same experiment as in Example 4 was performed using human plasma. Plasma was prepared in the same manner as in Example 3. What added LTA-1 to this plasma so that it might become 10 microgram / ml was used for the removal test. The results are shown in Table 5. It was shown that the modified AMPSt fiber (a) has a high affinity with LTA even in a high protein solution such as human plasma, and efficiently reduces the amount of cytokine produced by LTA.
[0038]
Table 5 Changes in cytokine production by removing LTA from human plasma
[0039]
[Table 5]

[0040]
Example 6 LTA Removal Test with Modified AMPSt Fiber-Circulation Method
Using the modified AMPSt fiber (a) of Example 1, a removal test was conducted by an LTA circulation method. Table 6 shows LTA concentrations when 1 g of each fiber was packed in a column and 10 ml of rabbit plasma prepared by the method of Example 3 was circulated at 37 ° C. at 1 ml / min for 60 minutes. It was shown that LTA adsorbing ability was present even under flow conditions such as extracorporeal circulation.
[0041]
Table 6 LTA removal test with modified AMPSt fiber-circulation method
[0042]
[Table 6]

[0043]
【The invention's effect】
The present invention provides a material containing a functional group capable of forming a hydrogen bond, which can rapidly detoxify or remove LTA even in a high protein concentration solution such as plasma. Since the LTA toxin activity present in body fluids such as blood and plasma and pharmaceuticals can be lost (detoxification) using the material of the present invention, it is possible to treat and prevent septic shock, infectious diseases and the like. Moreover, since LTA can be efficiently removed from bodily fluids such as blood and plasma and pharmaceuticals using a material that is insoluble in water, thereby constituting an LTA removal column and a coating material, Treatment and prevention of septic shock, infection, etc. become possible.

Claims

A material having at least one functional group capable of forming a hydrogen bond selected from the group consisting of a urea bond, a thiourea bond, an amide bond and an amino group, and
At least one compound selected from the group consisting of an isocyanate compound, an isothiocyanate compound, an acid, an acid chloride, an acid anhydride, and an amino compound;
A synthetic polymer selected from the group consisting of nylon, polymethyl methacrylate, polysulfone, polystyrene, polyethylene and polyvinyl alcohol, or a natural polymer selected from the group consisting of cellulose, collagen, chitin, chitosan and derivatives thereof;
Materials obtained by reacting,
A method of removing or detoxifying free lipoteichoic acid from a liquid by allowing the liquid containing free lipoteichoic acid to pass through a column packed with or adding the material to the liquid containing free lipoteichoic acid .

The material comprises a compound selected from the group consisting of tetraethylenepentamine, ethylenediamine, 1,2-bis (2-aminoethoxy) ethane and 1,3-diamino-2-hydroxypropane, and 4-chlorophenyl isocyanate. a fiber obtained by reacting a chloroacetamide methylated crosslinked polystyrene fibers, the process of claim 1.

The material, 4,4'-diphenylmethane diisocyanate, and isothiocyanate 4-chlorophenyl and 4-chlorobenzoyl chloride is selected from the group consisting of chloride compound, a bead obtained by reacting chitosan beads, according to claim 1, wherein the method of.

It said liquid is blood or plasma, any one method according to claim 1-3.