JP4846947B2

JP4846947B2 - Made-to-order immune activation composition containing functional food or specific components thereof

Info

Publication number: JP4846947B2
Application number: JP2001357113A
Authority: JP
Inventors: 英樹白銀
Original assignee: Kobayashi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Kobayashi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2000-11-24
Filing date: 2001-11-22
Publication date: 2011-12-28
Anticipated expiration: 2021-11-22
Also published as: JP2002249444A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、被検体の免疫活性を効果的に増強させることができる、1またはそれ以上の機能性食品からなる処方物を含む、個々の被検体に適合したオーダーメイド免疫活性化組成物に関する。本発明はまた、抑制された被検体の免疫活性を効果的に増強させることができる、1またはそれ以上の機能性食品からなる処方物からなる処方物をスクリーニングする方法に関する。本発明はさらに、これらの方法により得られた処方物調製物にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
機能性食品とは、食物がもつ機能のうち、生体防御、バイオリズム、疾病予防および回復、神経系機能の制御、老化抑制などの機能が特に高められた食品をいう。具体的な機能性食品としては、これまでに、例えばエイコサペンタエン酸（EPA）、ドコサヘキサエン酸（DHA）、CPP、タウリン、各種オリゴ糖、シャークカートリッジ、ラクトフェリンなどの従来の食品中の特定成分をはじめ、甲殻類などの動物由来抽出物、エキナセアなどの植物由来抽出物、キャベツの発酵物や味噌などの植物発酵物、酵母やキノコなどの真核微生物由来抽出物、納豆菌などの原核微生物由来抽出物など、もしくはその食品の複合物からの抽出物に、次々と機能性が見出され、また、熟したバナナなど食品そのものにも栄養学的要素以外の機能が見出されてきている。
【０００３】
これらの機能性食品の機能は、それを適用する被検体の全身状態、性別、年齢、体重などの条件により、大きく異なることが知られている。そのため、一般的に特定の機能性食品と特定の機能の調節との間に関連性が示唆されていたとしても、被検体によっては効果を生じない場合がありうるし、一方これまでは特定の機能性食品と特定の機能の調節との間には何ら関連性がないとされていたとしても、被検体によっては顕著な効果を生じる場合がありうる。
【０００４】
このような機能性食品を一般的知見に基づいて適用したのでは、その適用の結果、望ましくない効果が生じるだけでなく、目的の効果を達成するために非常に多種類の機能性食品を試行しなければならず、効率的ではなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明においては、特定の効果を必要とする被検体に機能食品を適用する場合に、望まない効果を生ずることなく、そしてより効率的に機能を発揮することができる機能性食品またはその特定成分を選択または処方することを含む、当該1またはそれ以上の機能性食品からなる処方物を含むオーダーメイドの免疫活性化組成物を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明においてはまた、特定の効果を必要とする被検体に機能食品を適用する場合に、望まない効果を生ずることなく、そしてより効率的に機能を発揮することができる1またはそれ以上の機能性食品からなる処方物を選択または処方するためのスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【０００７】
本発明においてはさらに、上述したスクリーニング方法により選択または処方した処方物調製物を提供することも目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、被検体の免疫活性を効果的に増強させることができる1またはそれ以上の機能性食品からなる処方物を含む、個々の被検体に適合したオーダーメイド免疫活性化組成物を調製する。
【０００９】
より具体的には、本発明によれば、
i）被検体血液サンプルを採取すること；
ii）前記被検体血液サンプルを1またはそれ以上の機能性食品からなる処方物とともに培養すること；
iii）前記処方物により誘導される免疫活性分子のmRNAまたはタンパク質の増加を、複数の処方物について比較すること；そして
iv）前記比較により、特定の免疫活性分子を活性化させる、被検体に適合した処方物を選択すること；
により、個々の被検体に適合したオーダーメイド免疫活性化組成物を調製することができる。
【００１０】
本発明の一態様においては、以下の工程：
v）前記被検体に適合した複数の処方物を調剤すること；
をさらに含む工程により、上述した個々の被検体に適合したオーダーメイド免疫活性化組成物を調製することができる。
【００１１】
本発明において機能性食品という場合、機能性食品そのものまたはその特定成分のことをいう。また、本発明の機能性食品には、従来から知られている機能性食品またはその特定成分であっても、これまでは機能が十分に解析されていなかった新規の機能性食品またはその特定成分であってもよい。本発明の機能性食品の例としては、熟したバナナなど食品そのもの、甲殻類などの動物由来抽出物、エキナセアなどの植物由来抽出物、キャベツの発酵物や味噌などの植物発酵物、酵母やキノコなどの真核微生物由来抽出物、納豆菌などの原核微生物由来抽出物など、もしくはその食品の複合物からの抽出物などの組成物の他、エイコサペンタエン酸（EPA）、ドコサヘキサエン酸（DHA）、CPP、タウリン、各種オリゴ糖、シャークカートリッジ、ラクトフェリンなどの食品中に含まれる特定成分などが含まれるが、これらのものには限定されない。
【００１２】
本発明の前記工程iv）においてはさらに、被検体に適合した処方物を2種類以上選択してもよい。本発明のオーダーメイド免疫活性化組成物を投与するに際して、このように選択した複数の処方物を別個に被検体に対して投与してもよく、あるいは投与する前に複数の処方物を混合してから被検体に投与してもよい。
【００１３】
前記工程iii）において検出する免疫活性分子は、一般的に免疫活性化物質により刺激する際に増加または減少して、免疫活性の刺激または抑制に関与することができる分子であればよい。本発明においては、たとえば、前記免疫活性分子としては、IFNγ、インターロイキン類、SURVIVIN、MTAP、そしてGAPDHからなる群から選択される分子である。好ましくは、前記免疫活性分子はIFNγ、SURVIVIN、そしてMTAPである。
【００１４】
前記免疫活性分子の検出は、その分子をコードするDNAの一次転写産物であるmRNAまたは発現産物であるタンパク質を検出することにより行うことが好ましい。
【００１５】
免疫活性分子の検出をmRNAを検出することにより行う場合には、ノザンハイブリダイゼーション法もしくはPCR法を含む方法を使用することが好ましい。より具体的には、mRNAを、ノザンハイブリダイゼーション法、RT-PCR法、ノザンハイブリダイゼーションと標識抗体法との組合せからなる方法などの方法により検出するが、これらの方法には限定されない。
【００１６】
免疫活性分子の検出をタンパク質を検出することにより行う場合には、標識抗体法を使用することが好ましい。より具体的には、タンパク質を、酵素免疫アッセイ法（EIA）、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ELISA）、蛍光標識抗体法などの応用的な方法や組合せにより検出するが、これらの方法には限定されない。
【００１７】
本発明において「検出」とは、定性的な検出のみならず、定量的、半定量的な検出も含まれる概念をいう。
本発明において、処方物には、1またはそれ以上の機能性食品が含まれているものの他、後に混ぜ合わせるために別途包装された機能性食品やその特定成分であってもよく、または処方箋に記載されたものも含む概念をいう。すなわち、ある場合には処方物中に機能性食品またはその特定成分が1種類のみを含むものであってもよく、別の場合にはそれら複数種類の機能性食品またはその特定成分を2種類以上含んでいてもよい。さらに、複数種類の処方物を比較する場合、1種類のみの機能性食品またはその特定成分を含む処方物どうしで比較しても、1種類のみの機能性食品またはその特定成分を含む処方物と2種類以上の機能性食品またはその特定成分を含む処方物とを比較しても、あるいは2種類以上の機能性食品またはその特定成分を含む処方物どうしで比較してもよい
本発明においては、処方物中に含まれる機能性食品またはその特定成分の構成が異なる、少なくとも2種類の処方物を調製して、試験を行うことを特徴とする。ある処方物中に含まれる機能性食品またはその特定成分が別の処方物中に含まれていても、全体の構成が異なっている限り、本発明おいてはそれらの処方物を使用することができる。
【００１８】
本発明において「調剤」とは、1またはそれ以上の機能性食品やその特定成分に加え、これら以外の担体を混合する行為またはそのようにして調製した製剤をいう。ここで「担体」には、当該技術分野において既知の適当な賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着香料、着色剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などが含まれるが、これらに限定されない。また、「製剤」には、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、溶液剤、シロップ剤などが含まれるが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明においてオーダーメイド免疫活性化組成物の「調製」とは、選択した1またはそれ以上の機能性食品またはその特定成分を処方すること、または調剤することをいう。
【００２０】
本発明によれば、抑制された被検体の免疫活性を効果的に増強させることができる1またはそれ以上の機能性食品もしくはその特定成分からなる処方物をスクリーニングする方法が提供される。
【００２１】
より具体的には、本発明によれば、
i）被検体血液サンプルを採取すること；
ii）前記被検体血液サンプルを1またはそれ以上の機能性食品からなる処方物とともに培養すること；
iii）前記処方物により誘導される免疫活性分子のmRNAまたはタンパク質の増加を、複数の処方物について比較すること；そして
iv）前記比較により、特定の免疫活性分子を活性化させる、被検体に適合した処方物を選択すること；
を含む方法により、抑制された被検体の免疫活性を活性化させる1またはそれ以上の機能性食品もしくはその特定成分からなる処方物をスクリーニングする。
【００２２】
本発明のスクリーニング方法における1またはそれ以上の機能性食品もしくはその特定成分からなる処方物は、上記に定義した通りである。したがって、本発明の機能性食品には、従来から知られている機能性食品またはその特定成分であっても、これまでは機能が十分に解析されていなかった新規の機能性食品またはその特定成分であってもよい。本発明の機能性食品の例としては、熟したバナナなど食品そのもの、甲殻類などの動物由来抽出物、エキナセアなどの植物由来抽出物、キャベツの発酵物や味噌などの植物発酵物、酵母やキノコなどの真核微生物由来抽出物、納豆菌などの原核微生物由来抽出物など、もしくはその食品の複合物からの抽出物などの組成物の他、エイコサペンタエン酸（EPA）、ドコサヘキサエン酸（DHA）、CPP、タウリン、各種オリゴ糖、シャークカートリッジ、ラクトフェリンなどの食品中に含まれる特定成分などが含まれるが、これらのものには限定されない。
【００２３】
本発明のスクリーニング方法における免疫活性分子も、上記に定義した通りであり、免疫活性分子を測定するための方法として、mRNAまたはタンパク質を検出することにより行うことが望ましい点も上述したとおりである。すなわち、本発明の好ましい態様においては、前記免疫活性分子は、IFNγ、SURVIVIN、MTAP、そしてGAPDHからなる群から選択される分子である。最も好ましくは、前記免疫活性分子はIFNγである。また、すなわち、前記免疫活性分子の検出は、その分子をコードするDNAの一次転写産物であるmRNAまたは発現産物であるタンパク質を検出することにより行うことが好ましく、免疫活性分子の検出をmRNAを検出することにより行う場合には、ノザンハイブリダイゼーション法もしくはPCR法を含む方法を、免疫活性分子の検出をタンパク質を検出することにより行う場合には標識抗体法を、それぞれ使用することが好ましい。
【００２４】
本発明の一態様においては、前記工程ii）において被検体血液サンプルを上述した処方物とともに培養する際に、処方物に加えて免疫活性促進剤を含んでいてもよい。本発明において免疫活性促進剤とは、直接的にまたは間接的に免疫細胞の増殖亢進、リンホカインやサイトカインの産生亢進、異物や細菌への貪食能、抗ガン細胞殺機能、もしくは抗体産生の増大などの免疫機能の増大に関与することができる既知の剤をいう。本発明の工程ii）においては、被検体血液サンプル中の細胞を活性化し、上述した特定の免疫活性分子の発現を起こしやすくするために前記免疫活性促進剤を添加する。
【００２５】
前記免疫活性促進剤としては、マイトジェンもしくは免疫活性を促進させる機能を有することが既知である機能性食品またはその特定成分が含まれる。ここで好ましいマイトジェンには、フィトヘムアグルチニン（PHA）、コンカナバリンA（ConA）、ポークウィードマイトジェン（PWM）、リポ多糖（LPS）、BCG、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体（PPD）が含まれるが、これらには限定されない。本発明において特に好ましいマイトジェンはBCGである。
【００２６】
本発明はさらに、上記のスクリーニング方法により、被検体の免疫活性を増強することがわかった処方物調製物にも関する。
本発明の免疫活性化組成物もしくはスクリーニング方法中で使用される機能性食品または機能性食品中の特定成分とは、食物がもつ機能のうち、生体防御、バイオリズム、疾病予防および回復、神経系機能の制御、老化抑制、恒常性維持機能（ホメオスタシス）などの生理的、心理的薬理機能が特に高められた食品もしくは上記機能を達成するために必須のその食品中に含まれる特定成分をいうが、これらには限定されない。
【００２７】
【発明の実施の形態】
本発明においては、被験者から静脈血をヘパリン含有採血管に採取し、これを試験に用いた。
【００２８】
機能性食品のサンプル液としては、蒸留水2 mLに対して機能性食品の原末500 mgを添加し、これをよく攪拌する。攪拌した後、3000 rpmにて10分間遠心分離し、上清を回収して、機能性食品のサンプル液とした。
【００２９】
上述したように被験者から採取した全血液1 mLを、1時間以内に培養プレート中に移した。この全血1 mLに対して150μLの上述した機能性食品のサンプル液を添加した。
【００３０】
次いで、このサンプル液を添加した全血を37℃において18時間培養し、細胞中で発現した免疫活性分子のmRNAをノザンハイブリダイゼーション法、PCR法などを使用することにより、または培養液中に放出された免疫活性分子を標識抗体法などを使用することにより、それぞれ検出する。
【００３１】
ノザンハイブリダイゼーション法は、mRNAを検出するために当該技術分野において既知の方法であり、例えばMolecular Cloning, A Laboratory Manual（Sambrookら、2 nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) NY, USA）中に記載されている方法に従って行うことができる。
【００３２】
PCR法は、mRNAから作成されたcDNAを使用して、特定の遺伝子配列を指数的に増幅するための当業者に周知の方法であり、同様にMolecular Cloning, A Laboratory Manual（Sambrookら、上述）、PCR Protocols（Innisら編、Academic Press, Inc., (1990) CA, USA）などに記載されている方法に従って行うことができ、さらにはリアルタイムPCR法などの応用的PCR法（改訂PCR Tips、真木寿治ら、細胞工学別冊、秀潤社、1999）にしたがって行うこともできる。本発明においては、PCR法を利用する方法として、たとえばRT-PCR法などを使用することもできる。
【００３３】
標識抗体法は、免疫活性分子に対して特異的に結合することができる標識化抗体を使用して、例えば上述したように、EIA法、ELISA法、WB法、蛍光抗体法などの方法により行うことができる。
【００３４】
【実施例】
以下の実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲を実施例に記載したものと同じものに限定することを意図するものではない。
【００３５】
実施例１：サンプルに対する被検体血液中 IFN γ濃度の変化
本実施例においては、疾病症状を有さない健常なヒトから無作為に選択した、4名の被験者から、ヘパリン含有採血管に血液を採取し、これを用いて本発明の方法に基づいて有用な1またはそれ以上の機能性食品からなる処方物を探索する実験を行った。
【００３６】
サンプル液としては、ウコン（春うっちん粉、多幸山薬草本舗）またはキナコ（丹波黒豆きなこ、日伸産業株式会社）のサンプル液を使用した。ウコンまたはキナコのサンプル液は、蒸留水2 mLに対してウコンまたはキナコの原末500 mgを添加し、これをよく攪拌する。攪拌した後、3000 rpmにて10分間遠心分離し、上清を回収して、ウコンまたはキナコサンプル液とした。
【００３７】
上述した被験者から採取した全血液を1 mLを、1時間以内に培養プレート中に移した。この全血1 mLに対して150μLの上述したウコンまたはキナコのサンプル液を添加した。
【００３８】
次いで、このサンプル液を添加した全血を37℃において18時間培養し、この培養液中に放出されたIFNγを、細胞性免疫活性測定用試薬インターフェロンγテスト（和光純薬、大阪、日本）を使用したELISA法により検出した。IFNγ検出のためのELISA法は、製造者が作成したプロトコールにしたがって行った。
【００３９】
ELISA法を用いた検出により得られた結果を以下の表１に示す。なお、陰性対照の血液培養中では、IFNγは検出されなかった。
【００４０】
【表１】

【００４１】
上述の表に記載したように、被験者ごとにそれぞれの機能性食品に対するIFNγ産生量が大きく異なっていた。この結果、例えば被験者Aでは、IFNγの増強のためウコンを単独で使用することが好ましいことが明らかになった。また、被験者CおよびDでは、IFNγの増強のためウコンおよびキナコを組み合わせて使用することがより好ましいことが明らかになった。一方、被験者Bでは、IFNγの増強のためにはウコンまたはキナコ以外の機能性食品を別途探索する必要があることが明らかになった。
【００４２】
実施例２：サンプルに対する被検体血液中 IFN γの mRNA 発現量の変化
本実施例においては、疾病症状を有さない健常なヒトから無作為に選択した、５名の被験者からヘパリン含有採血管に血液を採取し、これを用いて本発明の方法に基づいて有用な１またはそれ以上の機能性食品からなる処方物を検索する実験を行った。
【００４３】
サンプルとしては、ウコン（春うっちん粉、多幸山薬草本舗製）またはシイタケ菌糸体抽出物（（株）長岡L・E・M研究所製）を使用した。ウコンまたはシイタケ菌糸体抽出物のサンプル液は、蒸留水2 mLに対してウコンまたはシイタケ菌糸体抽出物の原末500 mgを添加し、これをよく攪拌した後、3000 rpmにて10分間遠心分離し、上清を回収することにより調製した。
【００４４】
上述した被験者から採取した全血液1 mLを、1時間以内に培養プレート中に移した。この全血1 mLに対して、150μＬの上述したウコンまたはシイタケ菌糸体抽出物のサンプル液を添加した。
【００４５】
次いで、このサンプル液を添加した全血に、IFNγのmRNA発現を増強する目的で、リポ多糖（SIGMA社製 LPS E.coli)を最終20 ng/mLとなるように添加した。その後、37℃において１時間培養を行った。培養後、QIAamp RNA Blood Mini kit（QIAGEN社製 RNA抽出キット）を、キット製造者が作成したプロトコールに従い総RNAを抽出した。Superscript II（Life Technologies製）を用いて逆転写反応を行い、cDNAを合成した後、ABI PRISM7700 RealTimePCR機（Applied Biosystems社製）を用いて、GAPDHのmRNAを内部標準遺伝子としてINFγ/GAPDH比を測定することにより、IFNγのmRNA量を測定した。RT-PCR法に基づき測定したINFγのmRNA量の結果を、INFγ/GAPDH比として以下の表２に示す。
なお、陰性対象の血液培養ではIFNγのmRNAは検出されなかった。
【００４６】
【表２】

【００４７】
上述の表に記載したように、被験者ごとにそれぞれの機能性食品に対するIFNγ産生量が大きく異なっていた。この結果、例えば被験者AおよびEでは、IFNγの増強のためにはウコンを単独で使用することが好ましいことが明らかになった。また、被験者Dでは、IFNγの増強のためウコンおよびシイタケ菌糸体抽出物を組み合わせて使用することがより好ましいことが明らかになった。一方、被験者BおよびCでは、IFNγの増強のためにはウコンまたはシイタケ菌糸体抽出物だけでは十分とはいえず、これら以外の機能性食品も別途探索する必要があることが明らかになった。
【００４８】
実施例３：サンプル添加による血液培養上清中の IFN γ濃度変化（ in vitro ）と、サンプル経口摂取による被験者血液中 IFN γ濃度変化（ in vivo ）との比較
本実施例においては、疾病症状を有さない健常なヒトから無作為に選択した、5名の被験者からヘパリン含有採血管に血液を採取し、これを用いて本発明の方法に基づいて有用な１またはそれ以上の機能性食品からなる処方物を検索する実験を行った。
【００４９】
サンプルとしては、ウコン（春うっちん粉、多幸山薬草本舗製）またはシイタケ菌糸体抽出物（（株）長岡L・E・M研究所製）を使用した。ウコンまたはシイタケ菌糸体抽出物のサンプル液は、蒸留水2 mLに対してウコンまたはシイタケ菌糸体抽出物の原末500 mgを添加し、これをよく攪拌した後、3000 rpmにて10分間遠心分離し、上清を回収することにより調製した。
【００５０】
上述した被験者から採取した全血液1 mLを、１時間以内に培養プレート中に移した。この全血1 mLに対して、150μＬの上述したウコンまたはシイタケ菌糸体抽出物のサンプル液を添加した。
【００５１】
次いで、このサンプル液を添加した全血に、IFNγのmRNA発現を増強する目的で、リポ多糖（SIGMA社製 LPS E.coli)を最終20 ng/mLとなるように添加した。その後、37℃において１時間培養を行った。培養後、QIAamp RNA Blood Mini kit（QIAGEN社製 RNA抽出キット）を、キット製造者が作成したプロトコールに従い総ＲＮＡを抽出した。Superscript II（Life Technologies製）を用いて逆転写反応を行い、cDNAを合成した後、ABI PRISM7700 RealTimePCR機（Applied Biosystems社製）を用いて、GAPDHのmRNAを内部標準遺伝子としてINFγ/GAPDH比を測定することにより、IFNγのmRNA量を測定した。
【００５２】
in vivo実験群においては、それぞれの被検体に対して上述したシイタケ菌糸体抽出物を2週間にわたり200 mgの毎日1回、経口投与した後、それぞれの被検体の血液サンプルをヘパリン添加チューブ中に採取して使用した。採取した全血液1 mLを、1時間以内に培養プレート中に移した。IFNγのmRNA発現を増強する目的で、リポ多糖（SIGMA社製 LPS E.coli)を最終20 ng/mLとなるように添加した。その後、３７℃において１時間培養を行った。培養後、QIAamp RNA Blood Mini kit（QIAGEN社製 RNA抽出キット）を、キット製造者が作成したプロトコールに従い総ＲＮＡを抽出した。Superscript II（Life Technologies製）を用いて逆転写反応を行い、cDNAを合成した後、ABI PRISM7700 RealTimePCR機（Applied Biosystems社製）を用いて、GAPDHのmRNAを内部標準遺伝子としてINFγ/GAPDH比を測定することにより、IFNγのmRNA量を測定した。
【００５３】
RT-PCR法を用いた検出により得られた結果について、in vitroおよびin vivo以下の表３に、またこの実験の解析結果を図1に、それぞれ示す。
【００５４】
【表３】

【００５５】
上述の表に記載したように、被験者ごとにそれぞれのシイタケ菌糸体に対するIFNγのmRNA発現量は、in vitroおよびin vivoの間でも大きく異なっていた。しかしながら、この結果を解析したところ、図1に示すように、in vitroにおけるデータとin vivoにおけるデータは、ほぼ直線上に位置していることがわかり、すなわち正の相関関係を有していることが明らかになった。
【００５６】
このことから、in vitroにおいて血液細胞を活性化する処方物の能力とin vivoにおける同様に効果を発揮できる能力とがほぼ対応している。このことから、in vitroにおいて特定の被検体に対して効果を発揮した処方物は、in vivoにおいても免疫活性を増強するために使用することができることが推測されることが明らかになった。
【００５７】
【発明の効果】
本発明のスクリーニング方法を使用することにより、特定の免疫活性分子を増強することができる機能性食品もしくは機能性食品中の特定成分を、被検体ごとにオーダーメイドで選択または処方することができる。さらに、本発明のスクリーニング方法により選択または処方された機能性食品もしくは機能性食品中の特定成分を含む、被検体に対して特定の機能を選択的に発揮することができるオーダーメイド免疫活性化組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、シイタケ菌糸体抽出物を用いてin vivoにおいて免疫活性を増強することができるかどうかをin vitroにおいて調べた場合に、in vitroのデータとin vivoのデータとが正の相関関係を有することを示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a tailor-made immune activation composition adapted to an individual subject, comprising a formulation comprising one or more functional foods that can effectively enhance the immune activity of the subject. The present invention also relates to a method of screening a formulation comprising a formulation comprising one or more functional foods that can effectively enhance a suppressed subject's immune activity. The invention further relates to formulation preparations obtained by these methods.
[0002]
[Prior art]
Functional food refers to food with particularly enhanced functions such as biological defense, biorhythm, disease prevention and recovery, control of nervous system functions, and aging suppression among the functions of food. Specific functional foods include, for example, specific ingredients in conventional foods such as eicosapentaenoic acid (EPA), docosahexaenoic acid (DHA), CPP, taurine, various oligosaccharides, shark cartridges, and lactoferrin. Extracts from animals such as crustaceans, plant-derived extracts such as echinacea, plant fermented products such as cabbage and miso, eukaryotic microorganism-derived extracts such as yeast and mushrooms, prokaryotic microorganism-derived extracts such as natto Functionality has been found one after another in extracts from food products and food products, and functions other than nutritional elements have been found in food products such as ripe bananas.
[0003]
It is known that the functions of these functional foods vary greatly depending on conditions such as the general condition, sex, age, and weight of the subject to which the functional food is applied. Therefore, even if a link between a specific functional food and a specific function is generally suggested, it may not be effective depending on the subject. Even if there is no relationship between the sex food and the regulation of a specific function, there may be a significant effect depending on the subject.
[0004]
Applying such functional foods based on general knowledge will not only produce undesirable effects as a result of the application, but also try a very wide variety of functional foods to achieve the desired effects. Had to be done and was not efficient.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
In the present invention, when a functional food is applied to a subject that requires a specific effect, the functional food or a specific component thereof can exhibit a function more efficiently without causing an undesirable effect. It is an object of the present invention to provide a bespoke immunostimulatory composition comprising a formulation consisting of the one or more functional foods.
[0006]
In the present invention, when a functional food is applied to a subject that requires a specific effect, one or more functions that can exhibit the function more efficiently without causing an undesirable effect. It aims at providing the screening method for selecting or prescribing the formulation which consists of sex food.
[0007]
Another object of the present invention is to provide a formulation preparation selected or prescribed by the screening method described above.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present invention prepares a tailor-made immune activation composition suitable for an individual subject, comprising a formulation comprising one or more functional foods that can effectively enhance the immune activity of the subject. .
[0009]
More specifically, according to the present invention,
i) taking a blood sample of the subject;
ii) culturing the subject blood sample with a formulation comprising one or more functional foods;
iii) comparing the increase in mRNA or protein of the immunoactive molecule induced by said formulation for a plurality of formulations; and
iv) by the comparison, selecting a formulation that is compatible with the subject that activates a particular immunoactive molecule;
As a result, a tailor-made immune activation composition suitable for each subject can be prepared.
[0010]
In one embodiment of the present invention, the following steps:
v) dispensing a plurality of formulations suitable for the subject;
By the process further including the above, a tailor-made immune activation composition suitable for the individual subject described above can be prepared.
[0011]
In the present invention, the term “functional food” refers to the functional food itself or a specific component thereof. In addition, the functional food of the present invention includes a novel functional food or a specific component thereof that has not been sufficiently analyzed until now, even if it is a conventionally known functional food or a specific component thereof. It may be. Examples of the functional food of the present invention include foods such as ripe bananas, animal-derived extracts such as crustaceans, plant-derived extracts such as echinacea, plant fermented products such as cabbage fermented products and miso, yeast and mushrooms. In addition to compositions such as extracts from eukaryotic microorganisms such as extracts from prokaryotic microorganisms such as Bacillus natto, or extracts from complex food products, eicosapentaenoic acid (EPA), docosahexaenoic acid (DHA), Specific components contained in foods such as CPP, taurine, various oligosaccharides, shark cartridges, and lactoferrin are included, but not limited thereto.
[0012]
In step iv) of the present invention, two or more types of formulations suitable for the subject may be selected. In administering the tailor-made immune activation composition of the present invention, a plurality of formulations thus selected may be administered separately to a subject, or a plurality of formulations may be mixed before administration. May then be administered to the subject.
[0013]
The immunologically active molecule to be detected in the step iii) may be any molecule that can increase or decrease in general when stimulated with an immunostimulatory substance and participate in stimulation or suppression of immune activity. In the present invention, for example, the immunoactive molecule is a molecule selected from the group consisting of IFNγ, interleukins, SURVIVIN, MTAP, and GAPDH. Preferably, the immune active molecule is IFNγ, SURVIVIN, and MTAP.
[0014]
The immunologically active molecule is preferably detected by detecting mRNA, which is a primary transcription product of DNA encoding the molecule, or protein, which is an expression product.
[0015]
When detecting immunologically active molecules by detecting mRNA, it is preferable to use a method including Northern hybridization or PCR. More specifically, mRNA is detected by a method such as Northern hybridization, RT-PCR, or a method comprising a combination of Northern hybridization and a labeled antibody method, but is not limited to these methods.
[0016]
When detecting immunologically active molecules by detecting proteins, it is preferable to use a labeled antibody method. More specifically, proteins are detected by applied methods and combinations such as enzyme immunoassay (EIA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and fluorescently labeled antibody method, but these methods are limited. Not.
[0017]
In the present invention, “detection” refers to a concept including not only qualitative detection but also quantitative and semi-quantitative detection.
In the present invention, the formulation may be one containing one or more functional foods, a functional food packaged separately for later mixing, or a specific component thereof, or a prescription. A concept that includes what is described. That is, in some cases, the formulation may contain only one type of functional food or a specific component thereof, and in other cases, two or more types of these multiple types of functional food or specific components thereof may be included. May be included. In addition, when comparing multiple types of formulations, only one type of functional food or a formulation containing the specific component is compared with a formulation containing only one type of functional food or the specific component. In the present invention, which may be compared with two or more types of functional foods or formulations containing specific components thereof, or may be compared between two or more types of functional foods or formulations containing specific components thereof, It is characterized in that at least two types of formulations differing in the composition of the functional food contained in the formulation or specific components thereof are prepared and tested. Even if a functional food contained in one formulation or a specific component thereof is contained in another formulation, these formulations may be used in the present invention as long as the overall composition is different. it can.
[0018]
In the present invention, the “preparation” refers to an act of mixing one or more functional foods or specific components thereof and a carrier other than these or a preparation prepared as such. Here, “carrier” includes suitable excipients, binders, disintegrants, lubricants, flavoring agents, coloring agents, solubilizing agents, suspending agents, coating agents and the like known in the art. However, it is not limited to these. “Formulations” include, but are not limited to, tablets, capsules, powders, granules, solutions, syrups and the like.
[0019]
In the present invention, “preparation” of a custom-made immune activation composition refers to formulating or dispensing one or more selected functional foods or specific components thereof.
[0020]
According to the present invention, there is provided a method of screening a formulation comprising one or more functional foods or specific components thereof that can effectively enhance the immune activity of a suppressed subject.
[0021]
More specifically, according to the present invention,
i) taking a blood sample of the subject;
ii) culturing the subject blood sample with a formulation comprising one or more functional foods;
iii) comparing the increase in mRNA or protein of the immunoactive molecule induced by said formulation for a plurality of formulations; and
iv) by the comparison, selecting a formulation that is compatible with the subject that activates a particular immunoactive molecule;
And screening a formulation comprising one or more functional foods or specific components thereof that activate the suppressed immune activity of the subject.
[0022]
The formulation comprising one or more functional foods or specific components thereof in the screening method of the present invention is as defined above. Therefore, the functional food of the present invention includes a novel functional food or a specific component thereof that has not been sufficiently analyzed so far, even though it is a conventionally known functional food or a specific component thereof. It may be. Examples of the functional food of the present invention include foods such as ripe bananas, animal-derived extracts such as crustaceans, plant-derived extracts such as echinacea, plant fermented products such as cabbage fermented products and miso, yeast and mushrooms. In addition to compositions such as extracts from eukaryotic microorganisms such as extracts from prokaryotic microorganisms such as Bacillus natto, or extracts from complex food products, eicosapentaenoic acid (EPA), docosahexaenoic acid (DHA), Specific components contained in foods such as CPP, taurine, various oligosaccharides, shark cartridges, and lactoferrin are included, but not limited thereto.
[0023]
The immunologically active molecule in the screening method of the present invention is also as defined above. As described above, the method for measuring the immunoactive molecule is preferably performed by detecting mRNA or protein. That is, in a preferred embodiment of the present invention, the immunologically active molecule is a molecule selected from the group consisting of IFNγ, SURVIVIN, MTAP, and GAPDH. Most preferably, the immunologically active molecule is IFNγ. In other words, the detection of the immunologically active molecule is preferably performed by detecting the mRNA that is the primary transcription product or the protein that is the expression product of the DNA encoding the molecule, and the detection of the immunoactive molecule is detected by the mRNA. It is preferable to use a method including Northern hybridization or PCR, and a labeled antibody method when detecting an immunologically active molecule by detecting a protein.
[0024]
In one aspect of the present invention, when the subject blood sample is cultured with the above-mentioned formulation in the step ii), an immune activity promoter may be included in addition to the formulation. In the present invention, the immune activity promoter means directly or indirectly increased proliferation of immune cells, increased production of lymphokines and cytokines, phagocytic ability to foreign bodies and bacteria, anti-cancer cell killing function, increased antibody production, etc. Refers to known agents that can be involved in the increase of immune function. In step ii) of the present invention, the above-mentioned immune activity promoter is added in order to activate cells in the subject blood sample and facilitate the expression of the above-mentioned specific immune active molecule.
[0025]
Examples of the immune activity promoter include mitogens or functional foods known to have a function of promoting immune activity or specific components thereof. Preferred mitogens include phytohemagglutinin (PHA), concanavalin A (ConA), pokeweed mitogen (PWM), lipopolysaccharide (LPS), BCG, and purified protein derivatives (PPD) of tuberculin. It is not limited to. A particularly preferred mitogen in the present invention is BCG.
[0026]
The invention further relates to a formulation preparation that has been found to enhance the immune activity of a subject by the screening method described above.
The functional food used in the immunostimulatory composition or screening method of the present invention or the specific component in the functional food includes biological defense, biorhythm, disease prevention and recovery, nervous system function among the functions of food. This refers to foods with particularly enhanced physiological and psychological pharmacological functions such as control of aging, suppression of aging, and homeostasis maintenance function (homeostasis) or specific ingredients contained in the foods essential for achieving the above functions, It is not limited to these.
[0027]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present invention, venous blood was collected from a subject into a heparin-containing blood collection tube and used for the test.
[0028]
As a functional food sample solution, add 500 mg of functional food bulk to 2 mL of distilled water and stir well. After stirring, the mixture was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected to obtain a functional food sample solution.
[0029]
1 mL of whole blood collected from the subject as described above was transferred into the culture plate within 1 hour. 150 μL of the functional food sample solution described above was added to 1 mL of this whole blood.
[0030]
Next, whole blood to which this sample solution has been added is cultured at 37 ° C. for 18 hours, and mRNA of immunologically active molecules expressed in the cells is released by using the Northern hybridization method, PCR method or the like, or into the culture solution. The immunologically active molecules thus detected are detected by using a labeled antibody method or the like.
[0031]
Northern hybridization is a method known in the art for detecting mRNA, such as Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook et al., 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) NY, USA ) In accordance with the method described in the above.
[0032]
PCR is a method well known to those skilled in the art for exponentially amplifying specific gene sequences using cDNA generated from mRNA, as well as Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook et al., Supra). , PCR Protocols (Edited by Innis et al., Academic Press, Inc., (1990) CA, USA) and the like, and also applied PCR methods (revised PCR Tips, It can also be performed according to Toshiharu Maki et al., Cell Engineering Supplement, Shujunsha, 1999). In the present invention, as a method using the PCR method, for example, the RT-PCR method can be used.
[0033]
The labeled antibody method is performed by using a labeled antibody that can specifically bind to an immunologically active molecule by a method such as the EIA method, ELISA method, WB method, or fluorescent antibody method as described above. be able to.
[0034]
【Example】
The following examples are intended to illustrate the present invention more specifically, and are not intended to limit the scope of the present invention to the same as described in the examples.
[0035]
Example 1: In the change <br/> embodiment of the subject blood IFN gamma concentration for samples were randomly selected from healthy human having no illness symptoms, from 4 subjects, adopted containing heparin An experiment was conducted in which blood was collected in a blood vessel and used to search for a formulation comprising one or more functional foods useful based on the method of the present invention.
[0036]
As the sample solution, a sample solution of turmeric (Spring Uchin powder, Takoyama Yakusa Honpo) or Kinako (Tamba Kuromame Kinoko, Nissin Sangyo Co., Ltd.) was used. Add 500 mg of turmeric or quinako bulk powder to 2 mL of distilled water and stir well. After stirring, the mixture was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected to obtain a turmeric or quinako sample solution.
[0037]
1 mL of whole blood collected from the subject described above was transferred to the culture plate within 1 hour. 150 μL of the above-described turmeric or kinaco sample solution was added to 1 mL of this whole blood.
[0038]
Next, whole blood to which this sample solution was added was cultured at 37 ° C. for 18 hours, and the IFNγ released in this culture solution was subjected to interferon γ test for measuring cellular immune activity (Wako Pure Chemicals, Osaka, Japan). It was detected by the ELISA method used. The ELISA method for IFNγ detection was performed according to the protocol prepared by the manufacturer.
[0039]
The results obtained by detection using the ELISA method are shown in Table 1 below. In the negative control blood culture, IFNγ was not detected.
[0040]
[Table 1]

[0041]
As described in the above table, the IFNγ production amount for each functional food was greatly different for each subject. As a result, it became clear that, for example, subject A preferably uses turmeric alone to enhance IFNγ. In addition, it became clear that subjects C and D preferably used a combination of turmeric and kinaco for enhancing IFNγ. On the other hand, in subject B, it became clear that it was necessary to separately search for functional foods other than turmeric or kinaco to enhance IFNγ.
[0042]
Example 2: In the change <br/> embodiment of mRNA expression level of the subject blood IFN gamma for samples were randomly selected from healthy human having no illness symptoms, heparin from 5 subjects An experiment was conducted in which blood was collected in the containing blood collection tube and used to search for a formulation comprising one or more useful functional foods based on the method of the present invention.
[0043]
As a sample, turmeric (Spring Uchin powder, manufactured by Takoyama Yakusa Honpo) or Shiitake mycelium extract (produced by Nagaoka L.E.M Laboratory) was used. The sample solution of turmeric or shiitake mycelium extract is added to 500 mL of turmeric or shiitake mycelium extract powder to 2 mL of distilled water, and this is stirred well and then centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes. And the supernatant was collected.
[0044]
1 mL of whole blood collected from the subject described above was transferred into the culture plate within 1 hour. To 1 mL of this whole blood, 150 μL of the sample solution of turmeric or shiitake mycelium extract described above was added.
[0045]
Subsequently, lipopolysaccharide (LPS E. coli manufactured by SIGMA) was added to the whole blood to which this sample solution had been added in order to enhance mRNA expression of IFNγ to a final concentration of 20 ng / mL. Then, it culture | cultivated at 37 degreeC for 1 hour. After culturing, total RNA was extracted from a QIAamp RNA Blood Mini kit (RNA extraction kit manufactured by QIAGEN) according to the protocol prepared by the kit manufacturer. Perform reverse transcription using Superscript II (Life Technologies), synthesize cDNA, and then measure INFγ / GAPDH ratio using GAPDH mRNA as internal standard gene using ABI PRISM7700 RealTimePCR machine (Applied Biosystems) Thus, the amount of IFNγ mRNA was measured. The results of the mRNA amount of INFγ measured based on the RT-PCR method are shown in Table 2 below as the INFγ / GAPDH ratio.
In addition, IFNγ mRNA was not detected in blood cultures of negative subjects.
[0046]
[Table 2]

[0047]
As described in the above table, the IFNγ production amount for each functional food was greatly different for each subject. As a result, it became clear that, for example, subjects A and E preferably use turmeric alone to enhance IFNγ. In addition, it was revealed that it is more preferable to use a combination of turmeric and shiitake mycelium extract in subject D for enhancing IFNγ. On the other hand, in subjects B and C, it was revealed that turmeric or shiitake mycelium extract alone is not sufficient for enhancing IFNγ, and other functional foods need to be searched separately.
[0048]
Example 3: IFN gamma concentration change in blood culture supernatant by sample addition and (in vitro), by the sample ingestion Comparative <br/> present embodiment the subjects blood IFN gamma concentration change (in vivo) is One or more blood samples collected from 5 subjects, randomly selected from healthy humans without disease symptoms, into heparin-containing blood collection tubes, which are useful based on the methods of the present invention An experiment was conducted to search for formulations consisting of functional foods.
[0049]
As a sample, turmeric (Spring Uchin powder, manufactured by Takoyama Yakusa Honpo) or Shiitake mycelium extract (produced by Nagaoka L.E.M Laboratory) was used. The sample solution of turmeric or shiitake mycelium extract is added to 500 mL of turmeric or shiitake mycelium extract powder to 2 mL of distilled water, and this is stirred well and then centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes. And the supernatant was collected.
[0050]
1 mL of whole blood collected from the subjects described above was transferred into the culture plate within 1 hour. To 1 mL of this whole blood, 150 μL of the sample solution of turmeric or shiitake mycelium extract described above was added.
[0051]
Subsequently, lipopolysaccharide (LPS E. coli manufactured by SIGMA) was added to the whole blood to which this sample solution had been added in order to enhance mRNA expression of IFNγ to a final concentration of 20 ng / mL. Then, it culture | cultivated at 37 degreeC for 1 hour. After culturing, total RNA was extracted from a QIAamp RNA Blood Mini kit (QIAGEN RNA extraction kit) according to the protocol created by the kit manufacturer. Perform reverse transcription using Superscript II (Life Technologies), synthesize cDNA, and then measure INFγ / GAPDH ratio using GAPDH mRNA as internal standard gene using ABI PRISM7700 RealTimePCR machine (Applied Biosystems) Thus, the amount of IFNγ mRNA was measured.
[0052]
In the in vivo experimental group, the above-mentioned shiitake mycelium extract was orally administered to each subject at 200 mg once daily for 2 weeks, and then each subject's blood sample was placed in a heparinized tube. Collected and used. 1 mL of collected whole blood was transferred into the culture plate within 1 hour. For the purpose of enhancing IFNγ mRNA expression, lipopolysaccharide (LPS E. coli manufactured by SIGMA) was added to a final concentration of 20 ng / mL. Then, it culture | cultivated at 37 degreeC for 1 hour. After culturing, total RNA was extracted from a QIAamp RNA Blood Mini kit (QIAGEN RNA extraction kit) according to the protocol created by the kit manufacturer. Perform reverse transcription using Superscript II (Life Technologies), synthesize cDNA, and then measure INFγ / GAPDH ratio using GAPDH mRNA as internal standard gene using ABI PRISM7700 RealTimePCR machine (Applied Biosystems) Thus, the amount of IFNγ mRNA was measured.
[0053]
The results obtained by detection using the RT-PCR method are shown in Table 3 below in vitro and in vivo, and the analysis results of this experiment are shown in FIG.
[0054]
[Table 3]

[0055]
As described in the above table, the mRNA expression level of IFNγ for each shiitake mycelium for each subject was greatly different between in vitro and in vivo. However, when this result was analyzed, as shown in FIG. 1, it was found that the in vitro data and the in vivo data are located almost on a straight line, that is, have a positive correlation. Became clear.
[0056]
From this, the ability of the formulation to activate blood cells in vitro and the ability to exert the same effect in vivo almost correspond. From this, it has been clarified that it is speculated that a formulation that exerts an effect on a specific subject in vitro can be used to enhance immune activity also in vivo.
[0057]
【The invention's effect】
By using the screening method of the present invention, a functional food capable of enhancing a specific immunologically active molecule or a specific component in the functional food can be selected or prescribed for each subject. Furthermore, a custom-made immune activation composition capable of selectively exerting a specific function on a subject, including the functional food selected or prescribed by the screening method of the present invention or a specific component in the functional food Things can be provided.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows that in vitro data and in vivo data are correct when investigating in vitro whether shiitake mycelium extract can enhance immune activity in vivo. It is a figure which shows having a correlation.

Claims

The following steps:
i) taking a blood sample of the subject;
ii) culturing the subject blood sample with a formulation selected from the group consisting of turmeric, mushroom, shiitake mycelium extract, and mixtures thereof;
iii) comparing the increase in IFNγ mRNA or protein induced by said formulation for a plurality of formulations selected from the group consisting of turmeric, mushroom, shiitake mycelium extract, and mixtures thereof;
iv) by said comparison, selecting a formulation adapted to the subject that activates IFNγ;
A custom-made immune activation composition suitable for an individual subject, comprising a formulation selected from the group consisting of turmeric, mushroom, shiitake mycelium extract, and mixtures thereof, prepared by:

The following steps:
v) dispensing said plurality of formulations adapted to the subject;
2. The customized immune activation composition according to claim 1, which is prepared by a process further comprising:

IFNγ is detected by detecting mRNA by a method selected from the group consisting of Northern hybridization, PCR, or a method comprising a combination of Northern hybridization and a labeled antibody method. A composition according to 1.

The composition according to claim 1 or 2, wherein IFNγ is detected by detecting a protein by a labeled antibody method.

The following steps:
i) taking a blood sample of the subject;
ii) culturing the subject blood sample with a formulation selected from the group consisting of turmeric, mushroom, shiitake mycelium extract, and mixtures thereof;
iii) comparing the increase in IFNγ mRNA or protein induced by said formulation for a plurality of formulations selected from the group consisting of turmeric, quinako, shiitake mycelium extract, and mixtures thereof. And
iv) by said comparison, selecting a formulation adapted to the subject that activates IFNγ;
A method for screening a formulation selected from the group consisting of turmeric, mushroom, shiitake mycelium extract, and a mixture thereof that activates the immune activity of a subject.

6. The detection of IFNγ is performed by detecting mRNA by a method selected from the group consisting of a Northern hybridization method, a PCR method, a method consisting of a combination of a Northern hybridization method and a labeled antibody method, the method of.

6. The method according to claim 5, wherein IFNγ is detected by detecting a protein by a labeled antibody method.

The method according to any one of claims 5 to 7, wherein the culture in the step ii) is performed under a condition further containing an immune activity promoter.

Immune activity promoters from Mycobacterium tuberculosis protein, LPS, phytohemaglutinin (PHA), concanavalin A (ConA), pokeweed mitogen (PWM), lipopolysaccharide (LPS), BCG, purified protein derivative (PPD) of tuberculin 9. The method of claim 8, wherein the method is a mitogen selected from the group consisting of:

10. A formulation preparation obtained by the method according to any one of claims 5-9.